Σχεδιασμός και μελέτη αναστολέων των DEDD αποαδενυλασών με βάση τη προσομοίωση μοριακής δυναμικής του ενεργού κέντρου της ριβονουκλεάσης PNLDC1

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ι ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ-ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑΣ Σχεδιασμός και μελέτη αναστολέων των DEDD αποαδενυλασών με βάση τη προσομοίωση μοριακής δυναμικής του ενεργού κέντρου της ριβονουκλεάσης PNLDC1 ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΗΛΙΑΣ ΣΚΕΠΑΡΝΙΑΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ 2015

2

3 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Με την ολοκλήρωση της εκπόνησης της διπλωματικής μου εργασίας, στα πλαίσια του μεταπτυχιακού προγράμματος «Βασικές Ιατρικές Επιστήμες», θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους εκείνους των οποίων οι υποδείξεις, η βοήθεια και η υποστήριξη υπήρξαν πολύτιμες για την διεκπεραίωση αυτής της εργασίας. Πρώτον από όλους, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή μου, Κωνσταντίνο Σταθόπουλο, για την άρτια καθοδήγησή του καθ όλη τη διάρκεια της συγκεκριμένης διατριβής και την άψογη συνεργασία. Η παρουσία του ως Καθηγητής αλλά και ως άνθρωπος ήταν καθοριστική για μένα σε όλη την πορεία μου ως μέλος της ερευνητικής του ομάδας και δε ξεχάσω την πάντα γεμάτη αγάπη αντιμετώπισή του. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τα άλλα δύο μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής. Τον Καθηγητή Διονύσιο Δραΐνα, για τη προθυμία του να με συμβουλεύσει για οποιοδήποτε πειραματικό ζήτημα καθώς και για την φιλική και άψογη συνεργασία. Τον Καθηγητή Γεώργιο Σπυρούλια ο οποίος δέχθηκε να είναι μέλος της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής και για τη βοήθειά του κάθε φορά που χρειαζόμουν την πλήρως καταρτισμένη επιστημονική του άποψη. Δεν θα ήθελα να παραλείψω να ευχαριστήσω όλους τους καθηγητές, που πλαισιώνουν τον τομέα της Βιολογικής Χημείας, του τμήματος της Ιατρικής, τον κ. Δημήτρη Καλπαξή, τον κ. Γεώργιο Ντίνο και την κα. Κωνσταντίνα Νίκα, όπως επίσης και την Κατερίνα Γραφανάκη για την συνεργασία και τις φιλικές συμβουλές τους. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω τον συνεργάτη μου στο εργαστήριο και φίλο Δημήτριο Αναστασάκη για την αμέριστη βοήθειά του τόσο σε επιστημονικό όσο και σε προσωπικό επίπεδο. Η συμβολή του ήταν καθοριστική για την ολοκλήρωση αυτής της εργασίας αλλά και για την εργαστηριακή μου εκπαίδευση. Η φιλία που δημιουργήθηκε μεταξύ μας είναι πολύτιμη για μένα και θα με συντροφεύει σε όλα μου τα βήματα εντός και εκτός του εργαστηριακού χώρου. Οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ στη διδάκτορα Μαρία Αποστολίδη για τις πολύτιμες συμβουλές της, όπως επίσης την υποψήφια διδάκτορα Γεωργία Κουρνούτου, την Παρθένα Κωνσταντινίδου, τον Αθανάσιο Σόκατ αλλά και τα υπόλοιπα μέλη του Εργαστηρίου Βιολογικής Χημείας για την βοήθεια και την ευχάριστη συνεργασία. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στο Εργαστήριο Φυσιολογίας και συγκεκριμένα στον Αναπλ. Καθ. κ. Σταύρο Ταραβήρα, και στην υποψήφια διδάκτορα Αλεξάνδρα Κανέλλου για την πολύτιμη βοήθειά τους στα πειράματα με τα εμβρυικά βλαστικά κύτταρα ποντικού (Ε-14). Ευχαριστώ πολύ τους φίλους μου Αλέξανδρο, Βαγγέλη, Σταύρο και Φοίβο που ήταν πάντα κοντά μου και με στήριζαν. Ευχαριστώ, επίσης, πολύ την Πατρούλα για την κατανόηση, το ενδιαφέρον και όλη της τη βοήθεια. Τέλος, ένα μεγάλο ευχαριστώ στην οικογένειά μου, τη γιαγιά μου Βασιλική, την αδελφή μου Βασιλεία και τους γονείς μου Κατερίνα και Νίκο, για την υποστήριξη, την εμπιστοσύνη, το διαρκές ενδιαφέρον και τη συμπαράσταση όλα αυτά τα χρόνια.

4 Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας στα πλαίσια του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών Bασικές Ιατρικές Επιστήμες του Τμήματος Ιατρικής, του Πανεπιστημίου Πατρών. ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Καθηγητής Κωνσταντίνος Σταθόπουλος (Επιβλέπων Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) 2. Καθηγητής Διονύσιος Δραΐνας (Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) 3. Καθηγητής Γεώργιος Σπυρούλιας (Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών)

5 Περιεχόμενα 5 Πίνακας περιεχομένων Πίνακας περιεχομένων... 5 Περίληψη... 8 Abstract Εισαγωγή Το σύγχρονο δόγμα της Μοριακής Βιολογίας Θεωρία του κόσμου RNA Ο ρόλος του mrna στη γονιδιακή έκφραση Το mrna παράγεται κατά την διαδικασία της μεταγραφής Το 5 άκρο των mrnas προστατεύεται από την καλύπτρα Το 3 άκρο των mrnas πολυαδενυλιώνεται Τα ιντρόνια των mrnas απομακρύνονται με την διαδικασία του ματίσματος Μηχανισμοί ελέγχου της ποιότητας του mrna Nonsense-mediated decay Non-stop decay No-Go decay Ανακύκλωση των μορίων mrna Αποικοδόμηση εξαρτώμενη από αποαδενυλίωση Αποικοδόμηση εξαρτώμενη από την αφαίρεση της καλύπτρας Αποικοδόμηση μέσω ενδονουκλεοτιδικής διάσπασης Αποαδενυλίωση Κατάταξη και βιολογική λειτουργία αποαδενυλασών Απορρύθμιση αποαδενυλασών και πιθανός ρόλος στην καρκινογένεση Λειτουργία της PARN στη σταθεροποίηση του γονιδιώματος Αναστολή της αποαδενυλίωσης Σκοπός Σκοπός της Μεταπτυχιακής Διατριβής Υλικά και Μέθοδοι Υλικά Χημικά Ένζυμα-Πρωτεΐνες Χημικές Ενώσεις Βακτηριακά Στελέχη-Πλασμιδιακοί Φορείς Θρεπτικά Μέσα Θρεπτικά υλικά για την καλλιέργεια βακτηρίων... 49

6 Περιεχόμενα Για την καλλιέργεια ανθρώπινων κυτταρικών σειρών Διαλύματα ιαλύματα για ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων ιαλύματα για απομόνωση πρωτεΐνης Διαλύματα για ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου Διαλύματα στοκ για πήκτωμα ακρυλαμιδίου ιαλύματα για βαφή του gel Διάλυμα για αναδιάλυση κρυστάλλων φορμαζάνης (MTT buffer) Μέθοδοι Μέθοδος εικονικής διαλογής για εύρεση αναστολέων DEDD τύπου αποαδενυλασών Έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών Ομογενοποίηση κυττάρων Χρωματογραφία συγγένειας Ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτικό πήκτωμα SDS/πολυακρυλαμιδίου Χρωματογραφία μοριακής διήθησης In vitro αποαδενυλίωση παρουσία συνθετικού ολιγοριβονουκλεοτιδίου Σήμανση ολιγονουκλεοτιδίου στο 5 άκρο τους με γ - 32 Ρ - ΑΤΡ Προσδιορισμός ενεργότητας αποαδενυλασών Έλεγχος δραστικότητας των πιθανών αναστολέων και Βιοχημικές αναλύσεις Υπολογισμός του IC 50 των ενώσεων Πειράματα κινητικής ανάλυσης ιατήρηση και καλλιέργεια κυτταρικών σειρών Απόψυξη κυττάρων Ανακαλλιέργεια Φύλαξη κυττάρων Προσδιορισμός της κυτταρικής βιωσιμότητας μέσω της μεθόδου ΜΤΤ Ανάλυση κυτταρικού κύκλου με χρήση κυτταρομετρίας ροής Αποτελέσματα Ιn silico ανάλυση και επιλογή αναστολέων Έκφραση και καθαρισμός ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών Προσδιορισμός ενεργότητας των ανασυνδυασμένων ενζύμων Screening των δραστικών ενώσεων και υπολογισμός του IC Μελέτη της μεταβολής των κινητικών σταθερών Μέθοδος MTT για έλεγχο κυτταρικής βιωσιμότητας... 76

7 Περιεχόμενα 7 7. Ανάλυση του κυτταρικού κύκλου καρκινικών κυττάρων A549 μετά από επώαση με τις δραστικές ενώσεις Ανάλυση του κυτταρικού κύκλου εμβρυικών βλαστικών κυττάρων μετά από επώαση με τις δραστικές ενώσεις Συζήτηση Βιβλιογραφία... 92

8 Περίληψη-Abstract 8 Περίληψη-Abstract

9 Περίληψη-Abstract 9 Περίληψη Η ακριβής ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης απαιτεί συνεχή έλεγχο της μοίρας των μορίων mrna σχεδόν σε κάθε στάδιο του κύκλου ζωής τους. Η poly(α) ουρά παίζει καθοριστικό ρόλο στην ωρίμανση των ευκαρυωτικών μορίων mrna, και αποτελεί τον κύριο ρυθμιστή για τον έλεγχο της μεταγραφής, την επεξεργασία, τον έλεγχο της ποιότητας, τη μεταφορά, τη μετάφραση, την αποσιώπηση και την αποικοδόμηση αυτών. Η βράχυνση της poly(α) ουράς συνοδεύεται από την μεταφραστική σίγαση ή την αποικοδόμηση των μορίων mrna και καταλύεται από ποικίλες αποαδενυλάσες που εμφανίζουν 3'-5' δράση εξωνουκλεάσης. Όλες οι γνωστές αποαδενυλάσες ανήκουν είτε στην DEDD (το όνομά της προκύπτει από τα συντηρημένα αμινοξέα του ενεργού κέντρου των ενζύμων που ανήκουν σε αυτήν) ή στην exonuclease- endonuclease-phosphatase (EEP) υπεροικογένεια. Η πιο καλά μελετημένη, DEDD τύπου αποαδενυλάση, είναι η εξαρτώμενη από την καλύπτρα poly(α)- εξειδικευμένη ριβονουκλεάση (PARN). Προηγούμενη εργασία από την ομάδα μας, έχει εντοπίσει ένα νέο ένζυμο με δράση αποαδενυλάσης που κωδικοποιείται από το pnldc1, ένα παράλογο γονίδιο του parn. Μελέτες σε έμβρυα ποντικού έδειξαν ότι η έκφραση του pnldc1 μπορούσε να ανιχνευθεί μόνο σε όρχεις και σε βλαστικά κύτταρα υποδεικνύοντας ένα πιθανό ρόλο κατά την ανάπτυξη. Επιπλέον, η έκφρασή του μειώνεται όσο τα κύτταρα διαφοροποιούνται. Οι μηχανισμοί πίσω από την ενεργοποίηση της αποαδενυλίωσης ρυθμίζονται αυστηρά και σχετίζονται με διάφορες κυτταρικές συνθήκες, όπως είναι η ανάπτυξη, η επιτήρηση μορίων mrna, η απόκριση σε βλάβη στο γενετικό υλικό, η διαφοροποίηση των κυττάρων και ο καρκίνος. Επιπλέον, η αναστολή αυτών των ενζύμων έχει προταθεί ως μια νέα αντικαρκινική στρατηγική, με βάση το γεγονός ότι πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα απαιτούν συνεχή παραγωγή και ανακύκλωση συγκεκριμένων μορίων mrna κατά τη διάρκεια του κυτταρικού τους κύκλου. Σε αυτή τη μελέτη εντοπίσαμε νέες χημικές ενώσεις οι οποίες αναστέλλουν ειδικά DEDD τύπου αποαδενυλάσες και μελετήσαμε την επίδρασή τους σε καρκινικά και βλαστικά κύτταρα. Με βάση τη διαθέσιμη δομή της τροποποιημένης hparn πραγματοποιήσαμε προσομοίωση μοριακής δυναμικής του ενεργού κέντρου της PNLDC1 ακολουθούμενη από υψηλής απόδοσης εικονικής διαλογής (high throughput virtual screening) η οποία επέτρεψε την επιλογή και το σχεδιασμό των εν δυνάμει αναστολέων για τις δύο αποαδενυλάσες. Αναλύθηκε in silico η βιβλιοθήκη των ενώσεων και ταυτοποιήθηκαν ισχυροί αναστολείς και για τα δύο ένζυμα των οποίων η δραστικότητα ελέγχθηκε τόσο in vitro όσο και in vivo. Πραγματοποιήθηκαν όλες οι κινητικές αναλύσεις αυτών των ενώσεων και υπολογίστηκαν οι

10 Περίληψη-Abstract 10 IC 50 τιμές τους in vitro. Είναι ενδιαφέρον ότι, η ένωση ASN_ αναστέλλει ειδικά την PNLDC1, ενώ η ASN_ ενεργοποιεί την PARN. Σε επόμενο βήμα, ελέγθηκε η κυτταρική βιωσιμότητα με την μέθοδο ΜΤΤ. Τέλος, ανάλυση του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι οι ενώσεις αυτές προκαλούν αναστολή του κυτταρικού κύκλου σε Α549 και βλαστικά κύτταρα κατά τη φάση G0/G1. Οι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν ήταν κάτω από αυτές των τοξικών επιπέδων των ενώσεων. Συνολικά, στην παρούσα μελέτη προτείνουμε ότι αυτές οι χημικές ενώσεις αλληλεπιδρούν με DEDD τύπου αποαδενυλάσες και επηρεάζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό.

11 Περίληψη-Abstract 11 Abstract Accurate regulation of gene expression requires constant control of mrnas fate in almost every stage of its lifecycle. The poly(a) tail plays a crucial role in mature eukaryotic mrnas, providing widespread means of controlling transcription, processing, quality control, transport, translation, silence, and decay. Shortening of poly(a) tails is accompanied with translational silencing or mrna degradation and is catalyzed by diverse deadenylases that exhibit 3-5 exonuclease activity. All known deadenylases belong to either the DEDD or the exonuclease endonuclease phosphatase (EEP) superfamilies. The most well studied DEDD type deadenylase is Poly(A)-specific Ribonuclease (PARN) which is a cap-interacting and poly(a)-specific 3 -exoribonuclease. Previous work from our group has identified a novel enzyme with deadenylase activity encoded by pnldc1, a parn paralog gene. Studies in mouse embryos showed that pnldc1 expression is detectable only in testis and placental stem cells indicating a possible role during development. Furthermore, its expression fades away along differentiation. The mechanisms underlying deadenylation activation are highly regulated and associated with cellular conditions such as development, mrna surveillance, DNA damage response, cell differentiation and cancer. In addition, inhibition of these enzymes has been proposed as a novel anti-proliferative strategy, based on the fact that proliferating cells require constant production and turnover of specific mrnas during the cell cycle. In this study, we identified novel chemical compounds that are able to inhibit DEDD deadenylases in a specific way and we studied their effects on cancer or stem cells. Based on the available structure of a truncated hparn form we performed molecular dynamical simulations of the active site of PNLDC1 followed by high throughput virtual screening, which allowed the selection and design of putative modulators for both deadenylases. The compound library was analyzed in silico and verified both in vitro and in vivo after identification of strong inhibitors of both enzymes. We performed all the kinetic analyses of these compounds and the IC 50 was assessed in vitro. Interestingly, the compound ASN_ specifically inhibits PNLDC1, whereas ASN_ activates PARN. In a next step, we have determin the cell viability by MTT method. Finally, cell cycle analysis by flow cytometry revealed that these compounds cause cell cycle arrest on A549 and stem cells at the G0/G1 phase. The concentrations that we used were below the toxic levels of the compounds. Overall, in this study we propose that these chemical compounds are able to interact with DEDD deadenylases and affect cell proliferation.

12 Εισαγωγή 12 Εισαγωγή

13 Εισαγωγή 13 Εισαγωγή 1. Το σύγχρονο δόγμα της Μοριακής Βιολογίας Κάθε κύτταρο, και κατ' επέκταση κάθε οργανισμός, κατασκευάζει τις δομές του και πραγματοποιεί τις λειτουργίες του σύμφωνα με μια σειρά πληροφοριών, που έχει κληρονομήσει από τους προγόνους του. Οι πληροφορίες αυτές είναι καταγραμμένες στην αλληλουχία των αζωτούχων βάσεων του DNA, του μορίου δηλαδή που αποτελεί το γενετικό υλικό των κυττάρων. Η λειτουργία του DNA ως γενετικού υλικού είναι δυνατή, λόγω της ικανότητας του μορίου αυτού να παράγει ακριβή αντίγραφά του, έτσι ώστε η γενετική πληροφορία να μεταβιβάζεται αναλλοίωτη από κύτταρο σε κύτταρο και από γενιά σε γενιά. Επίσης, καθορίζει την παραγωγή των διάφορων ειδών RNA και, μέσω αυτών, των πρωτεϊνών. Η ανακάλυψη της διπλής έλικας του DNA από τους Crick και Watson (Νobel 1962) οδήγησε στην διατύπωση του κεντρικού δόγματος της μοριακής βιολογίας. Σύμφωνα με αυτό, το DNA είναι το μόριο που περιέχει τη γενετική πληροφορία, η οποία ρέει από το DNA στο RNA. Το τελευταίο συμμετέχει στην αποκωδικοποίηση της πληροφορίας και οδηγεί στην πρωτεϊνοσύνθεση. Έως το 1970 οι επιστήμονες πίστευαν στην καθολικότητα του δόγματος της Μοριακής Βιολογίας. Εκείνη τη χρονιά οι David Baltimore και Howard Temin ανακάλυψαν ότι ορισμένοι ιοί, οι οποίοι διαθέτουν RNA ως γενετικό υλικό, μπορούν, με πρότυπο αυτό, να συνθέτουν DNA. Την τελευταία δεκαπενταετία έγιναν διάφορες ανακαλύψεις που εδραίωσαν το RNA ως ένα βιολογικό καταλύτη. Αυτές ήταν, η ανακάλυψη ότι ορισμένα μόρια RNA μεσολαβούν ώστε να επιτευχθεί η δική τους διάσπαση με αποτέλεσμα την ωρίμανσή τους από ολιγομερή σε μονομερή, ενώ κάποια άλλα μόρια RNA μπορούσαν να προάγουν την διάσπαση και άλλων υποστρωμάτων-rna, όπως στην περίπτωση του αυτοωριμαζόμενου πυρηνικού ριβοσωμικού RNA (ribosomal RNA) εσωνίου του πρωτοζώου Tetrahymena thermophila (1) και των καταλυτικών ιδιοτήτων διάσπασης από το μόριο RNA της ριβονουκλεάσης-ρ (RNase P) (2). Το RNA λοιπόν είναι το πρώτο γνωστό μόριο με διπλό ρόλο, δηλαδή να μπορεί να αποθηκεύει γενετική πληροφορία, όπως επίσης και να καταλύει χημικές αντιδράσεις. Έχει την ικανότητα να αποκτά πολύπλοκες τριτοταγείς δομές, που πιστεύεται ότι είναι το κλειδί της καταλυτικής του ενεργότητας και παρά την ομοιότητά του με το DNA, η 2' υδροξυλομάδα της ριβόζης προσδίδει στο μόριο του RNA μια εξέχουσα ικανότητα να συμμετέχει σε καταλυτικές αντιδράσεις. Η ανακάλυψη καταλυτικών μορίων RNA, ή ριβοενζύμων όπως ονομάστηκαν, είχε ως αποτέλεσμα την αναθεώρηση μιας από τις μέχρι τότε παγιωμένες

14 Εισαγωγή 14 αντιλήψεις της Βιοχημείας, ότι δηλαδή όλα τα ένζυμα είναι πρωτεΐνες, καθώς επίσης και την επαναφορά στο επιστημονικό προσκήνιο της θεωρίας του κόσμου του RNA. Αυτό οδηγεί στην αναδιατύπωση του κεντρικού δόγματος της Βιολογίας. Έτσι στη σύγχρονη διατύπωσή του περιλαμβάνεται η αμφίδρομη πορεία της γενετικής πληροφορίας από το RNA στο DNA καθώς και η ικανότητα του RNA να αντιγράφεται (Εικόνα 1). Εικόνα 1: Το κεντρικό δόγμα της μοριακής βιολογίας. Η αρχική διατύπωση και η τροποποιημένη μορφή του κεντρικού δόγματος, όπου το RNA εμφανίζεται ως ένα μόριο ικανό να αντιγράφει τον εαυτό του, να αποθηκεύει και ταυτόχρονα να μεταφέρει τη γενετική πληροφορία, ενώ πλέον η σχέση μετατροπής του DNA σε RNA είναι αμφίδρομη. 1.1 Θεωρία του κόσμου RNA Το RNA φέρει όλα τα απαραίτητα χαρακτηριστικά ώστε να αποτελεί το πρώτο βιολογικό μόριο που εμφανίστηκε πριν το DNA ως πρωτογενές γενετικό υλικό, και φυσικά πριν τις πρωτεΐνες ως λειτουργικό μόριο, όπως προτείνει η θεωρία του «RNA κόσμου», η οποία αρχικά διατυπώθηκε από τον Walter Gilbert το Σύμφωνα με τη θεωρία αυτή, το πρώτο βιολογικό σύστημα ήταν μια αρχέγονη δεξαμενή (primordial pool) που περιείχε RNA μόρια με ικανότητα αντιγραφής και καταλυτική δραστικότητα σύνθεσης των μεταβολιτών που ήταν αναγκαίοι για τη σύνθεση των RNA μορίων από την πρώτη ύλη του περιβάλλοντος. Στην πορεία της εξέλιξης και μέσω αντίστροφης μεταγραφής δημιουργήθηκε το DNA, το οποίο ως σταθερότερο και λιγότερο επιρρεπές σε μεταλλάξεις μόριο σε σχέση με το RNA, επιλέχτηκε ως το γενετικό υλικό των οργανισμών. Στην συνέχεια, καθώς αυξήθηκε η ποικιλότητα σε διαειδικό αλλά και ενδοειδικό επίπεδο, οι πρωτεΐνες ανέλαβαν τις περισσότερες από τις ενζυμικές λειτουργίες των αρχέγονων μορίων. Η μεγάλη ποικιλία πλευρικών ομάδων που διαθέτουν οι πρωτεΐνες τις καθιστά πιο αποτελεσματικούς βιοκαταλύτες. Ο σύγχρονος κόσμος του RNA περιλαμβάνει RNA μόρια ικανά να συμμετέχουν σε μια πληθώρα κυτταρικών διεργασιών από την πρωτεϊνοσύνθεση, την γονιδιακή ρύθμιση, την κατάλυση βιοχημικών αντιδράσεων μέχρι και την συμμετοχή στην προστασία των

15 Εισαγωγή 15 οργανισμών από παράγοντες μόλυνσης. Η επιστημονική κοινότητα συνεχώς ανακαλύπτει καινούριες κατηγορίες RNA μορίων τα οποία όπως διαπιστώνεται παίζουν ρόλο σε κρίσιμες βιολογικές διεργασίες. 2. Ο ρόλος του mrna στη γονιδιακή έκφραση Το RNA είναι ένα μόριο κεντρικής σημασίας για τη γονιδιακή έκφραση. Αρχικά χαρακτηρίστηκε ως ενδιάμεσο προϊόν της πρωτεϊνοσύνθεσης, όμως από τότε έχουν ανακαλυφθεί πολλά μόρια RNA με ποικίλους δομικούς και λειτουργικούς ρόλους σε όλα τα στάδια της γονιδιακής έκφρασης. Τα κυριότερα και καλύτερα μελετημένα είδη μορίων RNA είναι το rrna (ribosomal RNA), το mrna (messenger RNA) και το trna (transfer RNA), τα οποία συμμετέχουν στη διαδικασία βιοσύνθεσης των πρωτεϊνών. Το rrna μαζί με ένα πλήθος πρωτεϊνών σχηματίζει τα ριβοσώματα, που αποτελούν τα οργανίδια στα οποία πραγματοποιείται η πρωτεϊνοσύνθεση. Το μόριο αυτό εκτός από δομικό παίζει και καταλυτικό ρόλο στη διαδικασία αυτή. Το mrna μεταφέρει τη γενετική πληροφορία μιας πρωτεϊνικής αλληλουχίας από τον πυρήνα στα ριβοσώματα προκειμένου να συντεθεί. Το trna μεταφέρει ενεργοποιημένα αμινοξέα στο ριβόσωμα για τον σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού, όπως καθορίζεται από το εκμαγείο mrna. Υπάρχει τουλάχιστον ένα είδος trna για κάθε ένα από τα 20 αμινοξέα. Εκτός από τα παραπάνω είδη RNA που αναφέρθηκαν και τα οποία αποτελούν το μεγαλύτερο μέρος του ολικού RNA του κυττάρου, υπάρχουν κι άλλα είδη λειτουργικού RNA, τα οποία αποτελούν το «μη κωδικοποιόν RNA» (non coding RΝΑ) και είναι υπεύθυνα για ποικίλες λειτουργίες του κυττάρου, όπως η αντιγραφή των χρωμοσωμάτων και η ρυθμισή της, η τροποποίηση του RNA, η σταθερότητα και η μετάφραση του mrna, ή ακόμα και η αποδόμηση και χωροθέτησή του (3). Τα μόρια αυτά χωρίζονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες γνωστές ως small και long noncoding RNAs (sncrnas και lncrnas αντίστοιχα). Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν τα short interfering RNAs (sirnas), micrornas (mirnas) και PIWIinteracting RNAs (pirnas) τα οποία έχει δειχθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο σε μονοπάτια που οδηγούν σε γονιδιακή αποσιώπηση καθώς και στην προστασία του γονιδιώματος ενάντια σε ιούς και τρανσποζόνια. Επίσης, με βάση το πρότυπο ιστοειδικής έκφρασης, του υποκυττάριου εντοπισμού αλλά και της αναπτυξιακής ρύθμισης των lncrnas ενισχύεται η άποψη ότι τα τελευταία εμπλέκονται σε μεταγραφική και μέτα-μεταγραφική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης (4).

16 Εισαγωγή Το mrna παράγεται κατά την διαδικασία της μεταγραφής To mrna χαρακτηρίστηκε αρχικά ως ένα ασταθές μόριο που μεταφέρει την πληροφορία από των πυρήνα στα ριβοσώματα (5). Κατά την μεταγραφή παράγεται ένα μονόκλωνο μόριο RNA, όμοιο στην αλληλουχία με μία από τις αλυσίδες του δίκλωνου DNA, ενώ η μετάφραση μετατρέπει τη νουκλεοτιδική αλληλουχία του mrna στην αλληλουχία αμινοξέων που αποτελούν μια πρωτεΐνη. Ένα μόριο mrna δε μεταφράζεται σε ολόκληρο το μήκος του, αλλά περιέχει τουλάχιστον μία κωδική περιοχή (coding region), η οποία σχετίζεται με μια πρωτεϊνική αλληλουχία μέσω του γενετικού κώδικα: κάθε νουκλεοτιδική τριπλέτα (κωδικόνιο) της κωδικής περιοχής αντιστοιχεί σε ένα αμινοξύ. Μόνο η μία αλυσίδα του δίκλωνου DNA μεταγράφεται σε αγγελιαφόρο RNA. Η μία αλυσίδα του DNA η οποία κατευθύνει τη σύνθεση του mrna δημιουργώντας ζεύγη συμπληρωματικών βάσεων αποκαλείται αλυσίδα-μήτρα (template strand) ή μη- νοηματική αλυσίδα (antisense strand). Ο όρος «μη-νοηματική» χρησιμοποιείται γενικά για την περιγραφή μιας αλληλουχίας του DNA ή RNA που είναι συμπληρωματική με το mrna ενώ η αλυσίδα του DNA που φέρει την ίδια αλληλουχία με το mrna (με εξαίρεση την αντικατάσταση του καταλοίπου Τ με το κατάλοιπο U) ονομάζεται κωδική αλυσίδα (coding strand). Η διαδικασία της μεταγραφής γενικά χωρίζεται σε τρία μέρη. Την έναρξη, που αναφέρεται στην αναγνώριση μίας ειδικής αλληλουχίας του DNA από την RNA πολυμεράση και την εκκίνηση σχηματισμού δεσμών. Την επιμήκυνση, που αφορά καθαυτή τη σύνθεση της αλυσίδας RNA και τον τερματισμό, που τελικά οδηγεί στην απελευθέρωση της αρτιγενούς αλυσίδας του μεταγράφου. Στους ευκαρυώτες η μεταγραφή γίνεται με το συνήθη τρόπο, ξεκινώντας με τη δημιουργία ενός μεταγράφου με 5' τριφωσφορικό άκρο. Ωστόσο, το 3' άκρο δημιουργείται με αποκοπή του μεταγράφου και όχι με τερματισμό της μεταγραφής σε μια προκαθορισμένη θέση. Τα RNA αντίγραφα των αλληλουχιών του DNA πρέπει να τροποποιηθούν προκειμένου να καταστούν ώριμα, λειτουργικά μόρια. Τα περισσότερα ευκαρυωτικά μόρια mrna έχουν ξεχωριστά δομικά στοιχεία που προστίθενται στον πυρήνα από ενζυμικά συστήματα διαφορετικά από την RNA πολυμεράση. Το 5' άκρο του RNA τροποποιείται αμέσως μετά την εμφάνιση του, εξαιτίας της προσθήκης μιας «καλύπτρας». Η τριφωσφορική ομάδα του αρχικού μεταγράφου αντικαθίσταται από ένα νουκλεοτίδιο που προστίθεται με αντίθετο προσανατολισμό (3'>5'), «σφραγίζοντας» με αυτόν τον τρόπο το άκρο. Το 3' άκρο τροποποιείται εξαιτίας της προσθήκης μιας σειράς νουκλεοτιδίων αδενυλικού οξέος [πολυαδενυλικό οξύ ή poly(α)] αμέσως μετά την αποκοπή του. Τα ώριμα mrna είναι βραχύτερα από τα πρωτογενή μετάγραφά τους, τα οποία μπορούν να εμπεριέχουν

17 Εισαγωγή 17 πρόσθετες τελικές και εσωτερικές αλληλουχίες. Οι μη κωδικοποιούσες αλληλουχίες που απαντώνται εντός του pre-mrna μορίου, αλλά δεν υπάρχουν στα ώριμα mrna μόρια, καλούνται παρεμβαλλόμενες αλληλουχίες ή εσόνια. Οι παραμένουσες αλληλουχίες ονομάζονται εξόνια. Το γενικό μοντέλο για την επεξεργασία των μορίων mrna φαίνεται παρακάτω (Εικόνα 2). Η επεξεργασία αυτή, όπως έχει αναφερθεί, περιλαμβάνει έναν αριθμό μοριακών αντιδράσεων, το σύνολο των οποίων πρέπει να έρθει εις πέρας με απόλυτη πιστότητα. Μετά την ολοκλήρωσή τους, το ώριμο πλέον μόριο mrna, εξάγεται στο κυτταρόπλασμα όπου αλληλοεπιδρά με τα ριβοσώματα προκειμένου να ξεκινήσει η μετάφραση. Αξίζει να σημειωθεί πως το μεγαλύτερο μέρος της πληροφορίας είναι συμμεταγραφικό. Εικόνα 2: Σχηματική αναπαράσταση της σύνθεσης και της ωρίμανσης μορίων mrna. 2.2 Το 5 άκρο των mrnas προστατεύεται από την καλύπτρα Όπως στα προκαρυωτικά κύτταρα, έτσι και στους ευκαρυώτες, η μεταγραφή συνήθως αρχίζει με A ή G. Ωστόσο, το τριφωσφορικό 5 άκρο της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας RNA τροποποιείται αμέσως. Αρχικά ελευθερώνεται μία φωσφορική ομάδα με υδρόλυση. Στη συνέχεια, το διφωσφορικό πλέον 5 άκρο προσβάλει το α-άτομο του φωσφόρου μιας GTP για

18 Εισαγωγή 18 να σχηματιστεί ένας πολύ ασυνήθης 5-5 τριφωσφορικός σύνδεσμος. Η προσθήκη της G στο 5' άκρο καταλύεται από ένα πυρηνικό ένζυμο, τη γουανιδυλο-τρανσφεράση. Το νέο κατάλοιπο G, που προστίθεται στο άκρο του RΝΑ, έχει το αντίστροφο προσανατολισμό από όλα τα άλλα νουκλεοτίδια. Αυτό το διακριτό άκρο ονομάζεται κάλυμμα ή καλύπτρα (cap) και αποτελεί υπόστρωμα για αρκετές αντιδράσεις μεθυλίωσης (Εικόνα 3). Η προσθήκη της καλύπτρας γίνεται περίπου όταν το μήκος του pre-mrna είναι νουκλεοτίδια (6). Εικόνα 3: Σχηματική απεικόνιση της δομής της καλύπτρας. Η καλύπτρα ασφαλίζει το 5 άκρο του mrna και μπορεί να μεθυλιωθεί σε αρκετές θέσεις. Οι τύποι των καλυπτρών διακρίνονται από το πλήθος των μεθυλιώσεων που έχουν συμβεί. Η πρώτη μεθυλίωση γίνεται σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς και αποτελείται από την προσθήκη μιας μεθυλομάδας στη θέση 7 της ακραίας γουανίνης από την S-αδενοσυλομεθειονίνη. Μια καλύπτρα που έχει μόνο αυτή τη μεθυλομάδα ονομάζεται καλύπτρα 0 (cap 0). Στους μονοκύτταρους ευκαρυώτες, η αντίδραση σταματά σε αυτό το σημείο. Το ένζυμο που ευθύνεται για την τροποποίηση αυτή λέγεται 7-μεθυλο-τρανσφεράση της γουανίνης. Για τον σχηματισμό της καλύπτρας 1 (cap 1) προστίθεται άλλη μία μεθυλομάδα στο 2 -Ο της ριβόζης του πρωταρχικού νουκλεοτιδίου του mrna. Αυτή η αντίδραση καταλύεται από την 2 -Ο μεθυλοτρανσφεράση. Αυτός ο τύπος καλύπτρας είναι ο κύριος τύπος σε όλους τους ευκαρυώτες εκτός από τους μονοκύτταρους οργανισμούς. Επιπλέον μεθυλίωση στο δεύτερο νουκλεοτίδιο, πάλι στο 2 -Ο της ριβόζης δίνει γένεση στην καλύπτρα 2 (cap 2) και η τροποποίηση αυτή λαμβάνει χώρα στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 4). Αυτό το πρότυπο μεθυλίωσης παρατηρείται σε μικρό ποσοστό ειδών και στα είδη αυτά αντιπροσωπεύει το 10-15% των συνολικών mrna (6).

19 Εισαγωγή 19 Εικόνα 4: Δομή και σύνθεση διαφόρων μορφών καλύπτρας [S-adenosylmethionine (AdoMet)]. Η καλύπτρα παίζει έναν σημαντικό ρόλο τόσο στη βιοσύνθεση των μορίων mrna όσο και στη σταθερότητά τους προστατεύοντάς τα από τη δράση φωσφατασών και νουκλεασών. Είναι αναγκαία για να πραγματοποιηθεί με μεγάλη απόδοση η συναρμογή, η εξαγωγή των ωρίμων μορίων mrna από τον πυρήνα και η μετάφρασή τους από τα ευκαρυωτικά συστήματα σύνθεσης πρωτεϊνών. 2.3 Το 3 άκρο των mrnas πολυαδενυλιώνεται Τα τελευταία χρόνια, το ενδιαφέρον για το 3 'άκρο των μορίων mrna έχει ανανεωθεί. Το γεγονός αυτό οφείλεται στην αναγνώριση ότι το 3 άκρο τους υπόκεινται σε εκτεταμένη ρύθμιση (τόσο στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα) και παίζει σημαντικό ρόλο μέσα στο κύτταρο αλλά και στην ιστοειδική έκφραση γονιδίων. Επιπλέον, υπάρχουν αυξανόμενες

20 Εισαγωγή 20 ενδείξεις ότι οι καθολικές αλλαγές στο μήκος της 3' UTR περιοχής σχετίζονται με αλλαγές στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και στη διαφοροποίηση. Γίνεται, λοιπόν, αντιληπτό ότι αλλαγές στο μήκος της poly(a) ουράς είναι κρίσιμες σε διάφορες αναπτυξιακές πορείες (7,8). Με εξαίρεση τα μόρια mrna των ιστονών, τα 3 άκρα όλων των μορίων mrna υφίστανται ενδονουκλεολυτική διάσπαση και προσθήκη καταλοίπων αδενίνης (7). Τα κατάλοιπα αυτά σχηματίζουν μία δομή γνωστή ως poly(a) ουρά η οποία έχει μήκος περίπου 250 βάσεις σε ανθρώπινα κύτταρα και αποτελεί ένα από τα κυριότερα χαρακτηριστικά των μορίων mrna καθώς παίζει σημαντικό ρόλο στα στάδια του κύκλου ζωής τους. Στο πυρήνα, η διάσπαση και πολυαδενυλίωση του 3 άκρου των μορίων mrna είναι απαραίτητες για τον τερματισμό της μεταγραφής, την απελευθέρωση των μεταγράφων, και των εξαγωγή τους στο κυτταρόπλασμα (9). Στο κυτταρόπλασμα η poly(a) ουρά προστατεύει τα μόρια mrna από αποικοδόμηση και ενισχύει τη μετάφρασή τους (10). Η προσθήκη της poly(a) ουράς στο 3' άκρο λαμβάνει χώρα μέσω δύο στενά συνδεδεμένων βημάτων. Το πρώτο βήμα είναι η ενδονουκλεολυτική διάσπαση του premrna για να δημιουργηθεί ένα ελεύθερο 3' υδροξύλιο το οποίο αποτελεί το υπόστρωμα για το δεύτερο βήμα, την πολυαδενυλίωση. Οι παραπάνω διαδικασίες εξαρτώνται από πολλαπλά cis-δρώντα στοιχεία και την αναγνώριση αυτών από ειδικά προσδεδενόμενες πρωτεΐνες στο RNA, γνωστές ως RNA binding proteins (11). Στους ανώτερους ευκαρυώτες, οι περισσότερες θέσεις ενδονουκλεοτιδικής διάσπασης και πολυαδενυλίωσης (ποσοστό >90%) διακρίνονται μέσω μιας εξανουκλεοτιδικής αλληλουχίας που βρίσκεται νουκλεοτίδια ανοδικά των δύο θέσεων (hexanucleotide polyadenylation signal, PAS). Η πιο κοινές αλληλουχίες είναι οι AAUAAA και AUUAAA, στον άνθρωπο και στον ποντικό, όμως, έχουν βρεθεί πάνω από δέκα διαφορετικές (11). Μία ακόμα περιοχή που σηματοδοτεί τις δύο παραπάνω θέσεις είναι αυτή του DSE (downstream sequence element). To DSE βρίσκεται βάσεις καθοδικά του σημείου πολυαδενυλίωσης και αποτελείται κυρίως από περιοχές πλούσιες σε U ή/και UG. Τέλος, έχει χαρακτηριστεί και μία ακόμα περιοχή, γνωστή ως USE (upstream sequence element) η οποία κατά κύριο λόγο βρίσκεται ανοδικά του PAS και αποτελείται από την αλληλουχία UGUA. Αυτά τα cis στοιχεία αναγνωρίζονται από δύο μεγάλα πρωτεϊνικά σύμπλοκα τα οποία διαθέτουν και πολλές υπομονάδες. Η υπομονάδα μεγέθους 160 kda CPSF (cleavage and polyadenylation specificity factor) έχει δειχθεί να αλληλοεπιδρά με το AAUAAA μοτίβο, αλλά είναι πιθανό οι άλλες τρείς υπομονάδες (CPSF-110, CPSF-73, CPSF-30) να συνεισφέρουν στην ειδικότητα και στην ισχύ της πρόσδεσης. Το DSE αποτελεί την θέση αλληλεπίδρασης με τον CstF (cleavage stimulatory factor) μέσω της υπομονάδας μεγέθους 64kDa. Η πρόσδεση του

21 Εισαγωγή 21 CstF kai CPSF φαίνεται να είναι συνεργατική στο ότι η πρόσδεση του CstF στο DSE ενισχύει την συγγένεια που έχει ο CPSF για το εξαμερές και αντιστρόφως. Δύο επιπλέον παράγοντες είναι απαραίτητοι για να κατευθύνουν το κόψιμο του pre-mrna, ο CFI και ο CFII (cleavage factor I and II). Η poly(a) πολυμεράση μαζί με τον CPSF κατευθύνει την προσθήκη των καταλοίπων αδενοσίνης. Να σημειωθεί ότι και η poly(a) πολυμεράση είναι απαραίτητη για να γίνει σωστά το κόψιμο του pre-mrna κατά την μεταγραφή. Καθώς επιμηκύνεται η poly(a) ουρά η PABPΙΙ (poly(a) binding protein ΙΙ) προσδένεται σε αυτή και ενισχύει την καταλυτική δράση της poly(a) πολυμεράσης. Ένα μονομερές ΡΑΒΡ των -70 ΚDa συνδέεται σε κάθε βάσεις της ουράς poly(a) και με έναν άγνωστο μηχανισμό η ίδια η PABP II τερματίζει τον πολυμερισμό όταν η πολύ(α) ουρά έχει μήκος κατάλοιπα. Έτσι, ένα κοινό χαρακτηριστικό σε πολλούς ή στους περισσότερους ευκαρυώτες είναι ότι το 3' άκρο του mrna αποτελείται από μία αλληλουχία poly(a), η οποία είναι προσδεμένη σε μία μεγάλη πρωτεϊνική μάζα (Εικόνα 5) (12-14). Εικόνα 5: Μοντέλο αποκοπής και πολυαδενυλίωσης των pre-mrna στους ευκαρυώτες. Ο σχηματισμός αυτού του συμπλόκου μπορεί να ευθύνεται για κάποιες από τις επιδράσεις της poly(a) στις ιδιότητες του mrna. Η poly(a) συνήθως σταθεροποιεί το mrna.

22 Εισαγωγή 22 Η ικανότητα της poly(a) να προστατεύει το mrna από την αποικοδόμηση απαιτεί τη σύνδεση της με την ΡΑΒΡ. Η παρουσία της poly(a) ουράς συνεισφέρει στην αποδοτικότητα της ευκαρυωτικής μετάφρασης. Εκτός της πρόσδεσης στο 5 άκρο των ευκαρυωτικών mrnas, οι παράγοντες έναρξης της μετάφρασης αλληλοεπιδρούν και με το 3 άκρο του μεταγράφου. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις διαμεσολαβούνται αρχικά από τον παράγοντα eif4g, ο οποίος προσδένεται κατευθείαν στο 3 άκρο του mrna αλλά και στο 5 μέσω της PABP που καλύπτει την poly(a) ουρά. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις έχουν ως αποτέλεσμα το mrna να παίρνει μία κυκλική μορφή με τα 5 και 3 άκρα του μεταγράφου να βρίσκονται σε μεγάλη εγγύτητα (Εικόνα 6). Αυτές οι αλληλεπιδράσεις ενισχύουν πολλά βήματα την έναρξης της μετάφρασης. Η αφαίρεση της poly(a) αναστέλλει την έναρξη της μετάφρασης in vitro και η μείωση της ΡΑΒΡ έχει το ίδιο αποτέλεσμα στο ζυμομύκητα in vivo. Αυτές οι επιδράσεις μπορεί να εξαρτώνται από την πρόσδεση της ΡΑΒΡ στο σύμπλοκο έναρξης, στο 5' άκρο του mrna. Σε μερικές περιπτώσεις, τα mrna αποθηκεύονται σε μη πολυαδενυλιωμένη μορφή και η poly(a) προστίθεται όταν είναι απαραίτητη η μετάφραση τους. Σε άλλες περιπτώσεις, τα poly(a) mrna αποαδενυλιώνονται, με συνέπεια τη μείωση της μετάφρασης τους (13). Εικόνα 6: Το mrna παίρνει μία κυκλική μορφή με τα 5 και 3 άκρα του μεταγράφου να βρίσκονται σε μεγάλη εγγύτητα. 2.4 Τα ιντρόνια των mrnas απομακρύνονται με την διαδικασία του ματίσματος Η απομάκρυνση των ιντρονίων είναι ένα σημαντικό βήμα στη διαδικασία παραγωγής του mrna σε όλους τους ευκαρυώτες. Οι 5 και 3 θέσεις ματίσματος καθώς και η αλληλουχία διακλάδωσης αναγνωρίζονται από τα συστατικά της συσκευής του ματίσματος, τα οποία βρίσκονται σε ένα μεγάλο σύμπλοκο. Συνήθως στα άκρα των ιντρονίων υπάρχουν στο 5 άκρο ένα δινουκλεοτίδιο -GU και στο 3 άκρο ένα AG. Το σύμπλοκο φέρνει κοντά τις 5 και 3 θέσεις συναρμογής πριν συμβεί οποιαδήποτε αντίδραση, γεγονός που ερμηνεύει γιατί το

23 Εισαγωγή 23 έλλειμα οποιασδήποτε από αυτές τις θέσεις μπορεί να εμποδίσει την έναρξη της αντίδρασης. Το σύμπλοκο συναρμολογείται διαδοχικά πάνω στο pre-mrna και έχουν αναγνωριστεί αρκετά από τα ενδιάμεσα στάδια της δημιουργίας του, διαχωρίζοντας κλάσματα που περιέχουν σύμπλοκα διαφορετικών μεγεθών. Το μάτισμα λαμβάνει χώρα μόνο μετά τη δημιουργία όλων των συστατικών του συμπλόκου (15). Σε κάθε αντίδραση τρανσεστεροποίησης ένας φωσφοδιεστερικός δεσμός ανταλλάσσεται με κάποιον άλλον. Από την στιγμή δεν αλλάζει ο αριθμός των φωσφοδιεστερικών δεσμών δεν καταναλώνεται ενέργεια κατά το μάτισμα. Το συνολικό αποτέλεσμα είναι τα δύο εξώνια να ενώνονται και το ιντρόνιο να απομακρύνεται σαν μία θηλιά. Το σύμπλοκο του ματίσματος περιλαμβάνει τόσο πρωτεΐνες όσο και μόρια RNA. Τα μόρια αυτά που συμμετέχουν στο μάτισμα είναι μικρά πυρηνικά RNA και απαντώνται ως ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σύμπλοκα. Τόσο ο πυρήνας όσο και το κυτταρόπλασμα των ευκαρυωτικών κυττάρων περιέχουν πολλά διακριτά είδη μικρών μορίων RNA. Αυτά ποικίλλουν σε μέγεθος από 100 έως 300 βάσεις σε ανώτερους ευκαρυώτες, ενώ φτάνουν έως και 1000 βάσεις στο ζυμομύκητα. Η αφθονία τους κυμαίνεται αξιοσημείωτα, από μόρια ανά κύτταρο έως συγκεντρώσεις πολύ μικρές για να ανιχνευτούν με άμεσο τρόπο. Εκείνα που εντοπίζονται αποκλειστικά στον πυρήνα καλούνται μικρά πυρηνικά RNA (small nuclear RNA ή snrna), ενώ αυτά που απαντώνται στο κυτταρόπλασμα καλούνται μικρά κυτταροπλασματικά RNA (small cytoplasmic RNA ή scrna). Στη φυσιολογική τους κατάσταση υπάρχουν ως ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σύμπλοκα (snrnp και scrnp). Υπάρχει επίσης μια ομάδα μικρών RNA που συναντώνται στον πυρηνίσκο, ονομάζονται μικρά RNA του πυρηνίσκου (small nucleolar RNA, snorna) και εμπλέκονται στην επεξεργασία του ριβοσωμικού RNA. Τα snrnp που εμπλέκονται στη συναρμογή είναι τα U1, U2, U4, U5 και U6 και σχηματίζουν, μαζί με αρκετές επιπρόσθετες πρωτεΐνες, ένα μεγάλο σύμπλοκο, που αποκαλείται σωμάτιο ματίσματος (spliceosome). Το σύμπλοκο αυτό σχηματίζεται πάνω στο άθικτο πρόδρομο RNA και έχει μέγεθος ανάλογο με αυτό των ριβοσωμάτων. Η συναρμολόγηση ξεκινάει με το ζευγάρωμα βάσεων μεταξύ των U1 και U2 snrnas, ως συστατικά των U1 και U2 snrnps, με pre-mrna. Στην συνέχεια το ζευγάρωμα βάσεων μεταξύ των snrnas των U4 και U6 snrnps σχηματίζει ένα σύμπλοκο το οποίο συνδέεται με το U5 snrnp. Το U4/U6/U5 σύμπλοκο στην συνέχεια συνδέεται με μέσω πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων με το αρχικό σύμπλοκο αποτελούμενα από το pre-mrna με τα U1 και U2 snrnps για να σχηματίσει τελικά το σωμάτιο ματίσματος (15). Μετά τη σύνθεση και την

24 Εισαγωγή 24 ωρίμανσή του, το mrna, εξάγεται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα με τη μορφή ενός ριβονουκλεοπρωτεϊνικού συμπλόκου (Εικόνα 7). Εικόνα 7: Ο σχηματισμός του συμπλόκου ματίσματος και η έξοδος του mrna στο κυτταρόπλασμα ως ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό συμπλόκο. 3. Μηχανισμοί ελέγχου της ποιότητας του mrna Κάθε βήμα στην παραγωγή ενός ώριμου μεταγράφου παρέχει δυνατότητες εισαγωγής λαθών. Για την ομαλή λειτουργία του κυττάρου θα πρέπει να εξασφαλίζεται η πιστότητα της μεταγραφής και της μετάφρασης. Για να επιτευχθεί αυτό, το κύτταρο έχει αναπτύξει την ικανότητα να εντοπίζει τα ελαττωματικά μετάγραφα και να τα αποικοδομεί, προφυλάσσοντας τον εαυτό του από πιθανές τοξικές πρωτεΐνες που θα μπορούσαν να παραχθούν. Ο έλεγχος της ωρίμανσης του mrna συμβαίνει στον πυρήνα, ενώ οι πορείες ελέγχου που αναφέρονται παρακάτω σχετίζονται με την μετάφραση και ανιχνεύουν ελαττωματικά ριβονουκλεϊνικά σύμπλοκα στο κυτταρόπλασμα (16).

25 Εισαγωγή Nonsense-mediated decay Το καλύτερα μελετημένο μονοπάτι επιτήρησης των μεταγράφων είναι αυτό της μηνοηματικής διαμεσολαβούμενης αποικοδόμησης (Nonsense-mediated decay ή NMD). Το μονοπάτι αυτό στοχεύει σε mrna μόρια που περιέχουν μια πρόωρη αλληλουχία τερματισμού (premature termination codons ή PTCs) και τα οποία αναγνωρίζονται και αποικοδομούνται (Εικόνα 8). Η πρόωρη αλληλουχία τερματισμού μπορεί να προκύψει από σημειακές μεταλλάξεις, μετατοπίσεις αναγνωστικού πλαισίου, ελαττωματική ωρίμανση του μεταγράφου, προβληματική έναρξη της μετάφρασης και εκτενή 3 αμετάφραστη περιοχή (17). Εικόνα 8: Nonsense-mediated decay. Στην διαδικασία αυτή τα mrna που περιέχουν µια πρόωρη αλληλουχία τερµατισµού αναγνωρίζονται και αποικοδοµούνται. Τα μετάγραφα αυτά θα οδηγούσαν στην παραγωγή ελαττωματικής πρωτεΐνης. Το μονοπάτι αυτό έχει βρεθεί σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς ενώ τα κυριότερα συστατικά του NMD συμπλόκου UPF1, UPF2 και UPF3, είναι διατηρημένα. Ωστόσο, το NMD μονοπάτι δεν είναι μόνο ένα μέρος του συστήματος ελέγχου του κυττάρου που εμποδίζει την παραγωγή ελαττωματικών πρωτεϊνών. Τα κύτταρα των θηλαστικών βασίζονται στο μονοπάτι

26 Εισαγωγή 26 αυτό για τη δυναμική προσαρμογή των μεταγράφων και των πρωτεϊνών τους σε ποικίλες φυσιολογικές συνθήκες (18). 3.2 Non-stop decay Παρομοίως, σε μια διαδικασία που αναφέρεται ως αποικοδόμηση μη τερματισμού (nonstop decay ή NSD) τα mrna μόρια στα οποία δεν υπάρχει αλληλουχία τερματισμού αναγνωρίζονται και αποικοδομούνται ταχύτατα με κατεύθυνση 3-5 από το κυτταροπλασματικό εξώσωμα (19,20). Εικόνα 9: Non-stop decay. Τα mrna στα οποία δεν υπάρχει αλληλουχία τερµατισµού αναγνωρίζονται και αποικοδοµούνται ταχύτατα µε κατεύθυνση 3 5 από το κυτταροπλασµατικό εξώσωµα. Τα μετάγραφα αυτά μπορούν να προκύψουν από θραύση των μορίων αλλά και από την απουσία ενός, εντός πλαισίου, κωδικονίου τερματισμού, γεγονότα που επιτρέπουν την συνέχιση της μετάφρασης προς την poly(a) ουρά και κατά συνέπεια την παραγωγή ελαττωματικών πρωεϊνών. Επιπρόσθετα, η πρόωρη πολυαδενυλίωση μπορεί να συμβάλει σημαντικά στην παραγωγή υποστρωμάτων που τελικά θα αποικοδομηθούν από το συγκεκριμένο μονοπάτι (Εικόνα 9). Τέλος, αξίζει να σημειωθεί πως το NSD διευκολύνει την απελευθέρωση των mrna μορίων από το ριβόσωμα (16).

27 Εισαγωγή No-Go decay Ο τελευταίος μηχανισμός επιτήρησης των mrna μορίων είναι το μονοπάτι της no-go αποικοδόμησης (no-go decay ή NGD). Το μονοπάτι αυτό ανακαλύφθηκε σχετικά πρόσφατα στη ζύμη με αποτέλεσμα να μην έχει μελετηθεί εκτενώς. Κατά την διαδικασία αυτή παρατηρείται ακινητοποίηση του ριβοσώματος στο ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης λόγω σχηματισμού ειδικής δευτεροταγούς δομής στο ελαττωματικό mrna. Ως αποτέλεσμα πυροδοτείται η διαμεσολαβούμενη από ενδονουκλεάσες αποικοδόμηση του mrna και η απελευθέρωση του ριβοσώματος (16). Τα ριβοσώματα απελευθερώνονται και τα παραγόμενα τμήματα RNA αποικοδομούνται από το εξώσωμα και την Xrn1. Οι διαδικασίες παρουσιάζονται σχηματικά παρακάτω (Εικόνα 10). Εικόνα 10: No-go decay. Κατά την διαδικασία αυτή ανιχνεύονται ριβοσώµατα τα οποία έχουν κολλήσει πάνω σε ένα mrna µε αποτέλεσµα να διασπάται το mrna µόριο µε ενδονουκλεοτιδική διάσπαση κοντά στο σηµείο αυτό. 4. Ανακύκλωση των μορίων mrna Ένα από τα πολλά στάδια της γονιδιακής έκφρασης που υπόκεινται σε ρύθμιση είναι αυτό της μεταγραφής. Η επεξεργασία και η σταθερότητα του μεταγράφου, καθώς και ο ρυθμός της μετάφρασής του βρίσκονται κάτω από λεπτή ρύθμιση. Επομένως, δεν προκαλεί έκπληξη το γεγονός ότι πολλοί μηχανισμοί και κυτταρικοί παράγοντες είναι αφοσιωμένοι ολοκληρωτικά στη ρύθμιση του ρυθμού αποικοδόμησης του mrna. Η παραγωγή λειτουργικών RNAs είναι εγγυημένη από την αφαίρεση ελαττωματικών μορίων από το μηχανισμό ελέγχου ποιότητας. Η σταθερότητα κάποιων mrnas μπορεί να επηρεαστεί άμεσα από υποκινητές και μεταγραφικούς παράγοντες οι οποίοι είναι υπεύθυνοι για την παραγωγή τους, κάτι που μπορεί να επιτευχθεί με την στρατολόγηση συγκεκριμένων ρυθμιστών σταθερότητας στο μετάγραφο καθώς αυτό παράγεται. Κατά την διάρκεια των τελευταίων

28 Εισαγωγή 28 πέντε ετών, τα περισσότερα από τα ένζυμα που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση του mrna έχουν ταυτοποιηθεί και ξεκινάει η διαλεύκανση της σύνθετης ρύθμισης που καθορίζει την πορεία και τον ρυθμό της αποικοδόμησης του mrna (16). 4.1 Αποικοδόμηση εξαρτώμενη από αποαδενυλίωση Το mrna, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, κατά την έξοδό του στο κυτταρόπλασμα έχει τη μορφή ενός κλειστού βρόγχου. Διαθέτει δύο διακριτές δομές, την 5 καλύπτρα μεθυλο-γουανοσίνης και την poly(a) ουρά. Αυτές οι δύο δομές αλληλεπιδρούν με τους κυταροπλασματικούς παράγοντες eif4e και poly(a) binding protein (PABP) αντίστοιχα, για να προστατεύσουν το μετάγραφο από εξωνουκλεάσες και για να ενισχύσουν, όπως είπαμε, την έναρξη της μετάφρασης. Για να ξεκινήσει η αποικοδόμηση μία από αυτές τις δομές πρέπει είτε να αποδεσμευτεί ή το mrna να κοπεί με ενδονουκλεοτιδική διάσπαση. Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς η πλειοψηφία των mrna μορίων αποικοδομείται με ένα μονοπάτι που ξεκινάει από την βράχυνση της poly(a) ουράς. Το πρώτο βήμα στο μονοπάτι της αποικοδόμησης είναι μοναδικό από την άποψη ότι είναι αντιστρεπτό. Μετάγραφα που δέχονται ένα ειδικό σήμα μπορεί να επαναδενυλιωθούν και να επιστρέψουν στα πολυσώματα. Από την άλλη εάν ένα μετάγραφο πρέπει να καταστραφεί, θα ακολουθήσει μία από τις δύο παρακάτω πορείες (Εικόνα 11). Είτε αφαιρείται η 5 καλύπτρα, γεγονός που επιτρέπει την εξωνουκλεοτιδική διάσπαση από την XRN1 εξώσωμα. εξωριβονουκλεάση, είτε το 3 άκρο δέχεται επίθεση από το Εικόνα 11: Αποικοδόμηση εξαρτώμενη από αποαδενυλίωση.

29 Εισαγωγή 29 Αυτές οι δύο πορείες δεν είναι όμως απαραίτητα ανεξάρτητες. Στον Saccharomyces cerevisiae αποσιωπώντας συστατικά του 3 ή 5 μονοπατιού το μεταγραφόσωμα επηρεάζεται ελάχιστα, γεγονός που υποδηλώνει πλεονασμό των μηχανισμών αποικοδόμησης (21,22). 4.2 Αποικοδόμηση εξαρτώμενη από την αφαίρεση της καλύπτρας Η 5 αποικοδόμηση των mrna ξεκινάει με την αφαίρεση της καλύπτρας. Στον S.cerevisiae, το ένζυμο που αφαιρεί την καλύπτρα είναι ένα διμερές που αποτελείται από τις Dcp1 και Dcp2 πρωτεΐνες. Η Dcp2, που περιέχει μία MutT domain, προσδίδει την καταλυτική δράση (23). Εικόνα 12: Αποικοδόμηση εξαρτώμενη από την αφαίρεση της καλύπτρας. Στους ανώτερους ευκαρυώτες, υπάρχει ένα τρίτο στοιχείο γνωστό ως Hed1s ή Ge-1, το οποίο διεγείρει την αφαίρεση της καλύπτρας (24,25) (Εικόνα 12). Αφού αφαιρεθεί η καλύπτρα, η εξωριβονουκλεάση Xrn1 αποικοδομεί το RNA. Δύο μετάγραφα, άσχετα μεταξύ τους, τα RPS28B και EDC1 παρακάμπτουν το στάδιο της αποαδενυλίωσης, και αφαιρείται η καλύπτρα με έναν αυτορυθμιστικό μηχανισμό. Η πρωτεΐνη Rps28B προσδένεται στην 3 αμετάφραστη περιοχή του δικού της μεταγράφου σε μία δομή θηλιάς και στρατολογεί την Edc3, έναν προαγωγέα της αφαίρεσής της. Αυτό επιφέρει τη σύνδεση και άλλων παραγόντων αφαίρεσης της καλύπτρας και επιτρέπει την αποικοδόμηση που είναι ανεξάρτητη από την αποαδενυλίωση (26). Το EDC1 mrna του S.cerevisiae, που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη Edc1 που ρυθμίζει την αφαίρεση της καλύπτρας, επίσης αποικοδομείται με πορείες ανεξάρτητες της αποαδενυλίωσης. Στην περίπτωση αυτή η αποαδενυλίωση φαίνεται να προλαμβάνεται από την αλληλεπίδραση της poly(a) ουράς και μία περιοχή πολύ(u) που βρίσκεται στο 3 UTR. Αυτό το ενδομοριακό ζευγάρωμα βάσεων εμποδίζει την πρόσβαση των αποαδενυλασών. Ο μηχανισμός αυτός είναι ένας μηχανισμός ανατροφοδοτικής ρύθμισης όπου το προϊόν της μετάφρασης αποικοδομεί το μετάγραφό του. Η αφαίρεση του EDC1

30 Εισαγωγή 30 mrna απαιτεί την παρουσία υπομονάδων του συμπλόκου CCR4 NOT γεγονός που υποδηλώνει συσχέτιση μεταξύ αφαίρεσης της καλύπτρας και αποαδενυλίωσης. 4.3 Αποικοδόμηση μέσω ενδονουκλεοτιδικής διάσπασης Πιθανότατα ο πιο αποδοτικός τρόπος αποικοδόμησης ενός mrna είναι μέσω ενδονουκλεοτιδικής διάσπασης, η οποία θα δώσει δύο θραύσματα που είναι ευάλωτα σε εξωνουκλεάσες. Τα τελευταία χρόνια έχουν χαρακτηριστεί διάφορες κυτταρικές ενδονουκλεάσες που στοχεύουν mrna συμπεριλαμβανομένου των PMR1, IRE1 και κάπως απροσδόκητα το ένζυμο επεξεργασίας του ριβοσωμικού RNA (RNase MRP). Επιπλέον ενδονουκλεάσες φαίνεται να εμπλέκονται στην αποικοδόμηση ελαττωματικών mrnas ενώ τα sirnas ξεκινούν την αποικοδόμηση μέσω ενδονουκλεοτιδικής διάσπασης όπου εμπλέκεται η Argonaute protein-2 (Ago2). Εικόνα 13: Αποικοδόμηση μέσω ενδονουκλεοτιδικής διάσπασης. 5. Αποαδενυλίωση Η poly(a) ουρά, όπως έχει ήδη αναφερθεί, παίζει καθοριστικό ρόλο στην ωρίμανση του mrna. Αποτελεί κύριος ρυθμιστής της μεταγραφής, της επεξεργασίας, του ελέγχου της ποιότητας, της μεταφοράς, της μετάφρασης, της αποσιώπησης και της αποικοδόμησης των μορίων mrna (27). Οι poly(a) ουρές των mrnas έχουν ένα αρχικό μήκος νουκλεοτιδίων στη ζύμη και περίπου 250 νουκλεοτιδίων στα θηλαστικά. Αυτές οι μακριές ουρές έχουν σταθεροποιητικό ρόλο καθώς κατά την ζωή των mrnas στο κυτταρόπλασμα οι ουρές σταδιακά αποικοδομούνται από το 3 άκρο (28). Αποικοδόμηση όμως του κυρίως mrna δεν λαμβάνει χώρα μέχρι οι ουρές να κοντύνουν μέχρι ένα συγκεκριμένο κατώφλι. Ο ρυθμός με τον οποίο κονταίνουν οι ουρές εξαρτάται από κάθε mrna ανάλογα με τα cis

31 Εισαγωγή 31 στοιχεία που φέρει (29), κάτι που δείχνει ότι η αποαδενυλίωση είναι αυτή που καθορίζει τον χρόνο ημιζωής των μορίων mrna (28-30). Στο κύτταρο, η αποικοδόμηση του mrna συνήθως ξεκινάει από τη βράχυνση της poly(a) ουράς. Η αποαδενυλίωση είναι το σημαντικότερο στάδιο που καθορίζει το ρυθμό της αποικοδόμησης και την μεταφραστική αποσιώπηση του mrna (Εικόνα 14). Το γεγονός αυτό καθιστά την αποαδενυλίωση ως το κυριότερο σημείο ελέγχου για τις δύο αυτές διαδικασίες. Εικόνα 14: Η αποικοδόμηση των περισσότερων μορίων mrna ξεκινά με το μονοπάτι της αποαδενυλίωσης. Η διαδικασία της αποαδενυλίωσης καταλύεται από μαγνησιοεξαρτώμενα ένζυμα που υδρολύουν το mrna με κατεύθυνση 3-5, παράγοντας 5 -AMP. Οι poly(a) ουρές είναι το κυριότερο υπόστρωμα των ενζύμων αυτών, ωστόσο, έχει δειχθεί ότι αρκετές αποαδενυλάσες μπορούν να αποικοδομούν και άλλα μόρια RNA in vitro (19). Από τη στιγμή που η poly(a) ουρά έχει αφαιρεθεί από το mrna, άλλα υδρολυτικά ένζυμα ξεκινούν τη διάσπαση του. 5.1 Κατάταξη και βιολογική λειτουργία αποαδενυλασών Λαμβάνοντας υπόψιν την ετερογένεια των αποαδενυλασών, συνεπάγεται ότι υπάρχουν πολλαπλοί μηχανισμοί αποαδενυλίωσης. Τα κύτταρα, για να ρυθμίσουν επιλεκτικά τη μοίρα ενός υποσυνόλου μορίων RNA στρατολογούν μία συγκεκριμένη αποαδενυλάση με κάποιες καταλυτικές ιδιότητες καθώς και πρωτεΐνες που προσδένονται σε αυτή. Περαιτέρω μελέτες είναι απαραίτητες για να ταυτοποιηθούν όλες οι δραστικές αποαδενυλάσες και να

32 Εισαγωγή 32 διευκρινιστεί ο βιολογικός τους ρόλος. εν είναι ακόμη πλήρως κατανοητό το πλεονέκτημα της ύπαρξης τόσων πολλών αποαδενυλασών. Είναι πιθανόν ειδικές αποαδενυλάσες να στοχεύουν σε διακριτές ομάδες mrna με αποτέλεσμα να ελέγχεται κάθε ομάδα από τη δράση ενός ενζύμου. Από την άλλη διάφορες αποαδενυλάσες μπορούν να δρουν στο ίδιο mrna με διακριτές αλλά αλληλοεπικαλυπτόμενες δράσεις. Στο ζυμομύκητα υπάρχουν τουλάχιστον τέσσερις τύποι ριβονουκλεασών (CCR4, CAF1, PAN2, και ANGEL) οι οποίες είναι πολύ συντηρημένες σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς (29). Σε εξελικτικά ανώτερους οργανισμούς, ο αριθμός αυτός αυξάνεται, παραδείγματος χάριν έχουν βρεθεί τουλάχιστον πέντε οικογένειες ορθόλογων της CCR4 του ζυμομύκητα, ωστόσο, η δράση πολλών από αυτών δεν έχει αποδειχθεί (31-33). Μελέτες των περιοχών με δράση ριβονουκλεάσης των ενζύμων αυτών, έχουν δείξει ότι όλες οι γνωστές αποαδενυλάσες ανήκουν σε μία από της δύο ομάδες, την DEDD ή την exonuclease endonuclease phosphatase (EEP) οικογένεια (Πίνακας 1). Οι DEDD νουκλεάσες ονομάστηκαν έτσι εξαιτίας των συντηρημένων καταλυτικών αμινοξικών καταλοίπων Asp και Glu τα οποία είναι διάσπαρτα σε τρία μοτίβα εξωνουκλεάσης που δεσμεύουν ιόντα μαγνησίου (34). Μέλη της ομάδας αυτής περιλαμβάνουν τις οικογένειες της POP2, της poly(a) εξειδικευμένης ριβονουκλεάσης (PARN), την CAF1Z, και την PAN2. Ένα πέμπτο κατάλοιπο (His or Tyr) διαχωρίζει την οικογένεια αυτή στους DEDDh ή DEDDy, υποοικογένειες αντίστοιχα. Οι νουκλεάσες της EEP οικογένειας περιέχουν πέντε συντηρημένα μοτίβα μέσα στο ενεργό κέντρο με πέντε πολύ συντηρημένα κατάλοιπα NEDDH (35). Τα μέλη της ομάδας αυτής περιλαμβάνουν την CCR4, την Nocturinin, την ANGEL και την 2 phosphodiesterase (2 PDE) (36). Εικόνα 15: Σχηματική αναπαράσταση των επικρατειών διαφόρων αποαδενυλασών.

33 Εισαγωγή 33 Πίνακας 1: Κατάταξη όλων των γνωστών αποαδενυλασών στις δύο κύριες οικογένειες. Ανάμεσα σε όλες τις αποαδενυλάσες η CAF1 είναι η μικρότερη αφού αποτελείται μόνο από την περιοχή νουκλεάσης. Όλες η άλλες φαίνεται να περιέχουν τουλάχιστον μία επιπρόσθετη περιοχή. Η PARN είναι μοναδική από την άποψη ότι διαθέτει δύο επιπλέον επικράτειες με τις οποίες δεσμεύει poly(a), τις R3H και RRM (Εικόνα 15). Διαθέτει επίσης μία CTD (C-terminal domain) που φαίνεται να ευθύνεται για την αλληλεπίδραση της PARN CBP80 (cap binding protein-80). Φαίνεται επίσης ότι και οι δύο επικράτειες που αναφέρθηκαν παραπάνω είναι απαραίτητες για την καταλυτική δράση της PARN (37). Τέλος μία άλλη μοναδική ιδιότητα της PARN είναι ότι μπορεί να αλληλεπιδρά απευθείας με την 5 καλύπτρα. Φυσικά αυτή η αλληλεπίδραση ανταγωνίζεται όλους τους υπόλοιπους παράγοντες που προσδένονται στην

34 Εισαγωγή 34 καλύπτρα. Δηλαδή φαίνεται πως η PARN είναι μία αποαδενυλάση που εξαρτάται από την ύπαρξη δομής καλύπτρας (38). Άλλο ένα ενδιαφέρον βιοφυσικό χαρακτηριστικό είναι το ότι πολλές αποαδενυλάσες σχηματίζουν ομο- ή ετεροολιγομερή ενδοκυτταρικά αν και τουλάχιστον οι PARN, CCR4 και CAF1 μπορούν να αποαδενυλιώσουν in vitro χρησιμοποιώντας καθαρές ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες. Η PARN υπάρχει κυρίως ως διμερές σε διάλυμα, αν και δεν μπορεί να αποκλεισθεί η ύπαρξη ολιγομερών μεγαλύτερης τάξης. Φυσικά αυτές οι αλληλεπιδράσεις μπορούν να είναι πιο περίπλοκες λόγω των μη καταλυτικών επικρατειών κάτι που προσφέρει ευελιξία στη ρύθμιση διαφόρων διαδικασιών στις οποίες παίρνουν μέρος οι αποδενυλάσες (29). Τέλος, μέσω βιοπληροφορικής ανάλυσης έχουν προβλεφθεί νέες αποαδενυλάσες όπως η Poly(A)-specific ribonuclease (PARN)-like domain containing 1 (PNLDC1), η οποία μελετάται από το εργαστήριό μας και η μελέτη αυτή οδήγησε στην παρούσα διπλωματική εργασία, και η ANGEL1. Το γονίδιο pnldc1 εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 6 και ο υποκινητής περιέχει CpG νησίδες και υπερμεθυλιώνεται σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα του αναπνευστικού επιθηλίου και περιφερικά κύτταρα αίματος (39) ενώ σε μία πρόσφατη μελέτη φαίνεται ότι η υπεύθυνη de novo μεθυλοτρανσφεράση για την αποσιώπηση του γονιδίου είναι η DMNT3B. Οι αποαδενυλάσες ελέγχουν πάρα πολλές λειτουργίες τόσο σε κυτταρικό όσο και σε επίπεδο οργανισμού, όπως έχει δειχθεί από πειράματα γενετικής και RNA παρεμβολής. Μερικά από τα ένζυμα αυτά είναι απολύτως απαραίτητα για την βιωσιμότητα των οργανισμών, ενώ μεταλλάγματα των ενζύμων αυτών συσχετίζονται με συγκεκριμένους φαινοτύπους. Στα μετάζωα, τα φυτά και τους μύκητες διατάραξη της φυσιολογικής λειτουργίας των αποαδενυλασών επιφέρει ένα εύρος φαινοτύπων ενώ για την βιωσιμότητα του ζυμομύκητα φαίνεται ότι καμία αποαδενυλάση δεν είναι απολύτως απαραίτητη. Παρόλο που η αποαδενυλίωση δεν αναστέλλεται με μεταλλάξεις στα γονίδια pan2 ή ccr4, μπλοκάρεται σε διπλά μεταλλάγματα pan2 και ccr4. Τα διπλά μεταλλάγματα είναι βιώσιμα γεγονός που υποδεικνύει ότι άλλα μονοπάτια αποικοδόμησης του mrna συμπληρώνουν την αποαδενυλίωση, ωστόσο, ο ρυθμός είναι πολύ πιο αργός (40). Όπως έχει ήδη αναφερθεί, οι αποαδενυλάσες ρυθμίζοντας το μήκος της poly(a) ουράς των μορίων mrna καθορίζουν και τη μοίρα των μορίων αυτών. Έτσι, σχετίζονται με σχεδόν όλες τις κυτταρικές διεργασίες αλλά και με τον αναπτυξιακό έλεγχο. Οι χαρακτηρισμένες φυσιολογικές δράσεις των αποαδενυλασών περιλαμβάνουν, εκτός τον άλλων, τη μηνοηματικά διαμεσολαβούμενη αποικοδόμηση, τον έλεγχο της ποιότητας του RNA, την ωρίμανση των RNA καθώς και την μεταφορά αυτών, την καταστολή της μετάφρασης, την αποσιώπηση των mrnas από mi- και pi-rnas, τη ρύθμιση της μεταγραφής, την απόκριση

35 Εισαγωγή 35 στις βλάβες του DNA, στο στρες και στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, την ωρίμανση των γαμετικών κυττάρων και ανάπτυξη, την διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό, τον κιρκάδιο ρυθμό, τον έλεγχο του μεταβολισμού, την οστεογένεση και κ.α. Όλες αυτές οι λειτουργίες εξαρτώνται αποκλειστικά από τους ρυθμιστές που στρατολογούν ή διώχνουν αποαδενυλάσες από τα mrnas στόχους (27,41,42). 5.2 Απορρύθμιση αποαδενυλασών και πιθανός ρόλος στην καρκινογένεση Διάφορες αποαδενυλάσες όπως η PARN του A. thaliana και X. laevis, η CCR4 της D. melanogaster και η CCF-1 του C. elegans, είναι κρίσιμες στην εμβρυογένεση (43-46). Άλλες αποαδενυλάσες είναι απαραίτητες για την γονιμότητα των οργανισμών. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί το γεγονός ότι Cnot7-knockout ποντίκια, παρόλο που είναι βιώσιμα χωρίς σωματικά ελαττώματα, εμφανίζουν ελαττωματική σπερματογένεση και κατ επέκταση τα αρσενικά είναι στείρα (47,48). Επίσης, η CCR4 από την D. melanogaster και η CCF-1 από τον C. elegans παίζουν σημαντικό ρόλο στη γαμετογένεση τόσο ώστε μεταλλάγματά τους να επιφέρουν στειρότητα (49,50). Η σημαντικότητα των αποαδενυλασών φαίνεται και από το ρόλο τους στην φυσιολογία των οργανισμών. Στο παράδειγμα που αναφέρθηκε παραπάνω αξίζει να σημειωθεί ότι τα Cnot7-knockout ποντίκια έχουν αυξημένη μάζα οστών (51). Επίσης, μετά από διατάραξη της φυσιολογικής λειτουργίας της Nocturnin του ποντικού παρατηρείται αντίσταση σε παχυσαρκία προκαλούμενη από την δίαιτα κάτι το οποίο οφείλεται σε μη σωστό έλεγχο του μεταβολισμού. Και όπως έχει δειχθεί από ερευνητικές αναφορές τα ποντίκια αυτά παίρνουν πιο δύσκολα βάρος παρόλο που συμπεριφέρονται και τρέφονται φυσιολογικά (52). Οι αποαδενυλάσες ελέγχουν την ανάπτυξη ακόμη και σε επίπεδο κυττάρου. Μεταλλάγματα της CCR4 της D. melanogaster προκαλούν ελαττωματικό κυτταρικό κύκλο, όπως επίσης και μεταλλάγματα των POP2 και CCR4 στον ζυμομύκητα (53). Σε κυτταρικές σειρές, αποσιώπηση της POP2 επιφέρει διαταραχή στον έλεγχο της κυτταρικής μάζας. Στα θηλαστικά υπερέκφραση της CNOT7 ή της CAF1Z ή μείωση της έκφρασης της CNOT6L, προκαλεί μειωμένη κυτταρική αύξηση (40,54). Αυτά τα παράξενα ευρήματα παρέχουν μία πρώτη ματιά όσον αφορά στη συσχέτιση των αποαδενυλασών με την εμφάνιση παθολογικών φαινοτύπων. Έως τώρα είναι δύσκολο να διακρίνει κανείς άμεσες ή έμμεσες επιπτώσεις. Για παράδειγμα ο φαινότυπος που προκαλείται από διαταραχή της ρύθμισης του γονιδίου της Nocturnin μπορεί να οφείλεται σε διατάραξη πολλών mrna ή μόνο αυτών που εμπλέκονται στον μεταβολισμό. Η ταυτοποίηση των συγκεκριμένων mrna στόχων των οποίων η

36 Εισαγωγή 36 απορρύθμιση είναι υπεύθυνη για τους φαινοτύπους που περιεγράφηκαν προηγουμένως κρίνεται απαραίτητη. Έχει δειχθεί ότι η αύξηση της αποικοδόμησης ογκοκατασταλτικών mrna μπορεί να προκαλέσει καρκίνο, ενώ αυξημένη ανακύκλωση των mrna μορίων απαιτείται σε ταχέως διαιρούμενα κύτταρα (55,56). Ένα μεγάλο ποσοστό από τις παραπάνω μελέτες έχει ως κύριο στόχο του τους παράγοντες σταθεροποίησης του mrna. Η μείωση αυτών των παραγόντων μπορεί να προκαλέσει μείωση της έκφρασης ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Παράλληλα, συνεχής λειτουργία των mirna μορίων που στοχεύουν ογκοκατασταλτικά γονίδια μπορεί επίσης να συμβάλλει στην πρόκληση καρκίνου. Παραπάνω αναλύθηκε το πώς πειράματα γενετικής και RNAi έχουν επιδείξει ένα ευρύ πεδίο στη γονιμότητα, στην κυτταρική ανάπτυξη αλλά και σε άλλες βιολογικές λειτουργίες. Λίγες μελέτες έχουν επικεντρωθεί στον άμεσο ρόλο των ενζύμων αυτών στον καρκίνο. Η αποαδενυλάση CCR4b του συμπλόκου CCR4b NOT επάγει την κυτταρική αύξηση σε σειρές ινοβλαστών ως πρώτο-ογκογονίδιο (57). Σε φυσιολογικές συνθήκες το ένζυμο αυτό ρυθμίζει τα επίπεδα του p27kip1 mrna, ενός ογκοκατασταλτικού που αναστέλλει κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες και προάγει τον κυτταρικό θάνατο. Επιπλέον, όταν από τα κύτταρα λείπει το ένζυμο αυτό τα επίπεδα του p27kip1 αυξάνονται και αναστέλλεται η ανάπτυξη των κυττάρων. Η CCR4b αναστέλλεται in vitro από την TOB πρωτεΐνη η οποία αναστέλλει των πολλαπλασιασμό (58). Ωστόσο δεν υπάρχει καμία μελέτη με αλλαγή των επιπέδων της CCR4b σε όγκους, ενώ δεν υπάρχουν μελέτες που να σχετίζουν μία πλεονάζουσα δράση του ενζύμου με τα επίπεδα ογκοκατασταλτικών γονιδίων σε καρκινικές σειρές. Η PARN από την άλλη δρα ογκοκατασταλτικά με το να στοχεύει τα mrna των αυξητικών παραγόντων IL-8 και VEGF. Μεταλλάγματα της RNA προσδενόμενης πρωτεΐνης TTP τα οποία δεν μπορούν πλέον να στρατολογήσουν την PARN έχουν βρεθεί σε μεταστατικά γλοιοκύτταρα (59,60). Επίσης η PARN και το σύμπλοκο εξωσώματος στρατολογούνται από τις KSRP και DHAU με αποτέλεσμα να μειώνουν τα επίπεδα c-jun και upa, τα οποία αυξάνονται στον καρκίνο (61,62). Ωστόσο, η δράση αυτή αφορά στην επίδραση της PARN σε συγκεκριμένα mrna και τη διατάραξη της λειτουργίας της από τους ρυθμιστές της. Από την άλλη η PARN έχει βρεθεί αυξημένη σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα όπου η αποσιώπησή της αναστέλλει τον κυτταρικό κύκλο στη φάση G0/G1 μέσω σταθεροποίηση των p53 και p21 (63). Μια άλλη μελέτη εστιάζει στην αλληλεπίδραση της PARN με την CUG-BP η οποία τη στρατολογεί για να αποσταθεροποιήσουν τα c-fos και TNFalpha mrnas (64).

37 Εισαγωγή Λειτουργία της PARN στη σταθεροποίηση του γονιδιώματος Πρόσφατες μελέτες αποδεικνύουν τη σύνδεση της PARN με την απόκριση των κυττάρων στις βλάβες του DNA οι οποίες προκαλούνται από υπεριώδη ακτινοβολία. Προτείνεται ότι σε φυσιολογικές συνθήκες η CBP80 αλληλεπιδρά με την πυρηνική PARN αναστέλλοντας την δράση της. Όπως όμως έχει αναφερθεί η δράση της PARN είναι ανταγωνιστική της πολυαδενυλίωσης. Πράγματι, το σύμπλοκο CBC διεγείρει την πολυαδενυλίωση των pre-mrnas αυξάνοντας την σταθερότητα του συμπλόκου RNA/CstF με αποτέλεσμα τα mrna να πολυαδενυλιώνονται και να ωριμάζουν κανονικά. Βλάβες προκαλούμενες από υπεριώδη ακτινοβολία όμως μπλοκάρουν την ολίσθηση του RNAP II CstF. Στο σημείο αυτό το BRCA1/BARD1 σύμπλοκο προκαλεί την ουβικιτινιλίωση της RNAP II και η PARN προσδένεται στο σύμπλοκο. Η πολυαδενυλίωση αναστέλλεται και ενεργοποιείται η αποαδενυλίωση από την PARN προκαλώντας μείωση στα γενικά επίπεδα του mrna (65). Πρόσφατες μελέτες συνδέουν την PARN με ασθένειες που σχετίζονται με την σταθερότητα των χρωμοσωμάτων και το μήκος των τελομερών. Πιο συγκεκριμένα, έχουν βρεθεί μεταλλάξεις που επηρεάζουν την δραστικότητα του ενζύμου σε ασθενείς με οικογενή πνευμονική ίνωση. Οι μεταλλάξεις αυτές συνδέονται με κοντύτερα τελομερή. Ο μηχανισμός με τον οποίο οι μεταλλάξεις προκαλούν το φαινόμενο αυτό δεν είναι εξακριβωμένος ωστόσο τα H/ACA snornas, στην ωρίμανση των οποίων εμπλέκεται η PARN, σχετίζονται με την σειρά τους με την ωρίμανση των GAR1, NHP2 και NOP10 pre-mrnas. Μεταλλάξεις αυτών έχουν συνδεθεί με την συγγενή δυσκεράτωση μία ασθένεια στην οποία παρατηρούνται επίσης ελαττωματικά τελομερή (66,67). Πράγματι, πρόσφατη μελέτη συνδέει άμεσα μεταλλάξεις της PARN με την συγγενή δυσκεράτωση παρόλο που οι ερευνητές δεν συνδέον την PARN με τα τελομερή μέσω των H/ACA snornas και των GAR1, NHP2 και NOP10 πρωτεϊνών (Εικόνα 16). Μεταλλάξεις σε ένα αλληλόμορφο έχουν βρεθεί να ευθύνονται για ορισμένες περιπτώσεις αναπτυξιακών και μαθησιακών διαταραχών ενώ σε μία περίπτωση όπου και τα δύο αλληλόμορφα είχαν διαφορετικού είδους μεταλλάξεις ο ασθενής έπασχε από και από σοβαρή ανεπάρκεια του μυελού των οστών και κεντρική υπομυελίνωση (68).

38 Εισαγωγή 38 Εικόνα 16: Διάγραμμα της πρωτεΐνης PARN που δείχνει τις λειτουργικά περιοχές της πρωτεΐνης και την επίδραση των μεταλλάξεων που έχουν προσδιοριστεί σε διάφορες περιπτώσεις της συγγενής δυσκεράτωσης. 5.4 Αναστολή της αποαδενυλίωσης Είναι γνωστό ότι η αποαδενυλίωση αποτελεί ένα καθοριστικό βήμα για την διαφοροποίηση και όπως έχει δειχθεί είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων. Επιπρόσθετα, η αναστολή των αποαδενυλασών έχει προταθεί σαν μία αντικαρκινική στρατηγική καθώς ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων απαιτεί συνεχή και ελεγχόμενη ανακύκλωση των μορίων mrna. Επιπρόσθετα, ο έλεγχος της διαδικασίας αυτής θα ήταν ένα καλό εργαλείο για την αντιμετώπιση ασθενειών που οφείλονται στη μη σωστή ρύθμισή της και αναφέρθηκαν παραπάνω (56). Η PARN πρωτεΐνη έχει δειχθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στη διάρκεια της ωρίμανσης των ωοκυττάρων, στην εμβρυογένεση, στην πρώιμη ανάπτυξη καθώς και στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, αλλά επίσης και σε διαδικασίες όπως η ωρίμανση των snornas. Το ένζυμο συμμετέχει επίσης στη μη-νοηματικά διαμεσολαβούμενη αποικοδόμηση του mrna (nonsense-mediated decay) και στη ρύθμιση της κυτταροπλασματικής πολυαδενυλίωσης. Η PARN δεν ρυθμίζεται με μεθυλίωση αλλά από έναν μηχανισμό με cis στοιχεία και trans παράγοντες. Παρά το γεγονός ότι έχουν αναφερθεί διάφορες στρατηγικές που ρυθμίζουν την διαδικασία της αποαδενυλίωσης in vitro, κυρίως επικεντρώνονται σε αλληλεπιδράσεις της PARN με βοηθητικούς παράγοντες της πρωτεΐνης αυτής (64,69-72) και την καλύπτρα (73).

39 Εισαγωγή 39 Εικόνα 17: Γραφική απεικόνιση της ρύθμισης της PARN πρωτείνης. Λίγα πράγματα είναι γνωστά σχετικά με μόρια ρυθμιστές των αποαδενυλασών. Εξαίρεση αποτελούν μελέτες που αφορούν την αναστολή της PARN από αμινογλυκάνες (74) αλλά και από νουκλεοτίδια και συνθετικά τους ανάλογα (75,76). Επίσης, είναι γνωστό ότι έχουν συντεθεί μόρια τα οποία δρουν ως αναστολείς της ανθρώπινης ριβονουκλεάσης Caf1 (77). Η παρούσα διπλωματική εργασία έχει ως στόχο το σχεδιασμό και τη μελέτη αναστολέων της οικογένειας των DEDD αποαδενυλασών. Οι ενώσεις προσδιορίστηκαν με τη χρήση μίας νέας τεχνικής που ονομάζεται Virtual Screening ή VS, και χρησιμοποιείται στην αυτόματη αξιολόγηση πολύ μεγάλων βιβλιοθηκών ενώσεων με τη χρήση προγραμμάτων ηλεκτρονικών υπολογιστών. Οι ενώσεις επιλέγονται με βάση τη δομή τους και προβλέπεται η πιθανή αλληλεπίδρασή τους με το ενεργό κέντρο του ενζύμου. Δεδομένου ότι η ακρίβεια της μεθόδου έχει αυξηθεί, το VS έχει γίνει αναπόσπαστο μέρος της διαδικασίας ανακάλυψης φαρμάκων.

40 Σκοπός 40 Σκοπός

41 Σκοπός Σκοπός της Μεταπτυχιακής Διατριβής Τα τελευταία χρόνια έχει γίνει σημαντική πρόοδος πάνω στην αποαδενυλίωση. Όλα όσα περιεγράφηκαν παραπάνω δίνουν σαφή εικόνα για το πόσο σημαντική είναι η διαδικασία αυτή για διάφορες βιολογικές διεργασίες. Η ερευνητική μας ομάδα μελετά μία νέα, DEDD τύπου αποαδενυλάση, την PNLDC1, η οποία φαίνεται να έχει σημαντικό ρόλο στην διαδικασία της διαφοροποίησης. Έχουμε δείξει ότι η συγκεκριμένη αποαδενυλάση εκφράζεται στα αρχικά στάδια της διαφοροποίησης και συγκεκριμένα σε βλαστικά κύτταρα ποντικού. Επίσης, μελέτες του εργαστηρίου μας έχουν δείξει ότι η κύρια DEDD τύπου αποαδενυλάση, PARN, υπερεκφράζεται σε κυτταρική σειρά του καρκίνου του πνεύμονα. Τέλος, σε συνεργασία με το εθνικό κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών, Δημόκριτος, πραγματοποιήσαμε προσομοίωση μοριακής δυναμικής του ενεργού κέντρου της PNLDC1 χρησιμοποιώντας την κρυσταλλική δομή της ανθρώπινης PARN (PDB ID 2A1R). Το αποτέλεσμα ήταν ότι παρουσιάζουν 30% ομολογία καθώς τα 90 από τα 303 κατάλοιπα του ενεργού κέντρου είναι όμοια. Αξίζει να αναφερθεί πως εκτός από τα καταλυτικά αμινοξέα της PNLDC1, ένας αριθμός από κατάλοιπα τα οποία είναι υπεύθυνα για την αλληλεπίδραση με RNA μόρια είναι συντηρημένα και στην PARN (Εικόνα 22). Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η εύρεση νέων χημικών ενώσεων που θα αναστέλλουν ειδικά DEDD τύπου αποαδενυλάσες με σκοπό την μελέτη της επίδρασής τους τόσο in vitro όσο και στις παραπάνω κυτταρικές σειρές. Έτσι, οι ενώσεις που θα προκύψουν από in silico σάρωση βιβλιοθηκών (πρόκειται για ισχυρούς προσδέτες στο ενεργό κέντρο των παραπάνω ενζύμων) θα χρησιμοποιηθούν για in vitro πειράματα αποαδενυλίωσης παρουσία τόσο της PNLDC1 όσο και της PARN. Στην συνέχεια, θα πραγματοποιηθεί κινητική ανάλυση των ενώσεων και με τις δύο αποαδενυλάσες. Τέλος, οι ενώσεις αυτές θα χρησιμοποιηθούν για τον έλεγχο της επίδρασής τους στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα A549 αλλά και σε εμβρυικά βλαστικά κύτταρα ποντικού E-14 (ESC s E-14). Η παραπάνω μελέτη παρέχει μία νέα προσέγγιση για την ανάπτυξη νέων αποτελεσματικών αναστολέων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν in vitro αλλά και in vivo.

42 Υλικά και Μέθοδοι 42 Υλικά και Μέθοδοι

43 Υλικά και Μέθοδοι 43 Υλικά 1. Χημικά 2-mercaptoethanol Serva Acetic acid MERK Acrylamide Sigma A8887 Acrylamide 2X Serva S10675 Agarose Biorad Ammonium persulfate Serva S13375 Ammonium sulfate Serva Ampicillin sodium salt Applichem AO Bioquant protein Merck HC Boric acid Merck Chloroform Merck 1,02445,1000 Coomassie G250 Fluka Coomassie R250 Panreac DEPC Research Organics 2106D Dialysis Tubing Sigma D-9777 DMEM Biosera 9574 EDTA Serva S Ethanol 99% denatured Applichem A Ethanol Abs Merck 1,00983,2511 FBS Biosera S1810/50 Glutamine - L Merck Glycerol Duchefa G Glycine Merck HEPES Sigma H-3375 Hydrochloric acid Merck Imidazole Alfa A10221 IPTG Duchefa

44 Υλικά και Μέθοδοι 44 Kanamycin sulfate Serva Lysozyme Fluka Magnesium chloride hexahydrate Merck Methanol Chem-lab CL Methanol p.a. Panreac Methylene-bisacrylamide Serva Na2HPO4. 2H2O Merck 6580 NEA Biochrom 1206A Ni-NTA Agarose Macherey-Nagel N-N methylane bis-acrylamide Serva PBS (Phosphate Buffer) Takara T900 Peptone Merck Peptone Enzymatic Digest Sigma Phenol Merck 1,00206,1000 Phenol equilibrated, stabilized Applichem A Phenylmethylsulfonyl-fluoride Serva Polyethylene glycol Serva Precipitation Inactiv. Buffer RNASES Propidium iodide Ambion Sigma P4170 Protein Ladder NEB P7703S SDS Serva Sodium acetate trihydrate Merck Sodium Chloride Sigma TEMED Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide Research Organics Sigma T9281 M2128 Tris Duchefa T Tris ultrapure Applichem A Triton-X-100 Trypsin EDTA 10X Merck Biosera XC-T Tryptic Soy broth Biolife Yeast extract Sigma 70161

45 Υλικά και Μέθοδοι 45 Urea Sigma U Ένζυμα-Πρωτεΐνες 0,1% BSA TAKARA A1301A Buffer A PNK Fermentas Buffer B PNK Fermentas PNK Fermentas Protein Ladder ( kda) NEB P7703S Recimbinant Rnase Inhibitor TAKARA 2313A T4 Polynoucleotide kinase TAKARA 2021A 3. Χημικές Ενώσεις No. ID Number Formula Mol. Weight 1 ASN C23H20F4 N6 O3 S 536,5 2 ASN C28 H32 Cl N7 O5 S2 646,1 3 ASN C26 H29 N7 O2 471,5 4 ASN C31 H34 N8 O3 566,6

46 Υλικά και Μέθοδοι 46 5 ASN C28 H30 F3 N7 O 537,5 6 ASN C27 H24 Cl N3 O4 489,9 7 ASN C27 H32 N4 O2 444,5 8 ASN C29 H24 N4 O3 S 508,5 9 ASN C29 H24 N4 O2 S 492,6 10 ASN C27 H26 Cl F N2 O3 S 513,0 11 ASN C29 H22 Cl2 N4 O2 529,4

47 Υλικά και Μέθοδοι ASN C32 H30 F N3 O4 539,6 Πίνακας 2: Βασικά χαρακτηριστικά των χημικών ενώσεων που χρησιμοποιήθηκαν στη παρούσα διπλωματική εργασία. Η δομή των ενώσεων πραγματοποιήθηκε με το πρόγραμμα ChemDraw Ultra. Οι ενώσεις αυτές αναδιαλύθηκαν σε 100% DMSO με τελική συγκέντρωση 100mM και φυλάσσονται στους -20 Ο C. 4. Βακτηριακά Στελέχη-Πλασμιδιακοί Φορείς Dh5a: Χρωμοσωμικός γενότυπος fhua2 lac(del)u169 phoa glnv44 Φ80' lacz(del)m15 gyra96 reca1 rela1 enda1 thi-1 hsdr17. Αυτό το στέλεχος E. coli μετασχηματίζεται με μεγάλη απόδοση και ο γενότυπός του προσδίδει διάφορα χαρακτηριστικά που είναι πολύ χρήσιμα για μεθόδους ανασυνδυασμένου DNA. Για παράδειγμα η μετάλλαξη enda1 απενεργοποιεί μία ενδοκυτταρική ενδονουκλεάση που αποικοδομεί πλασμιδιακό DNA σε διάφορες μικροπαρασκευαστικές μεθόδους. Rosetta (DE3): Χρωμοσωμικός γενότυπος F - - ompt hsds B (r B m - B ) gal dcm (DE3) prare (Cam R ). Αυτό το βακτηριακό στέλεχος είναι παράγωγο των BL21. Είναι σχεδιασμένα ώστε να ενισχύσουν την έκφραση ευκαρυωτικών πρωτεϊνών που περιέχουν κωδικόνια που δεν χρησιμοποιούνται συχνά στο E. coli. Παρέχουν trnas για τα κωδικόνια AGG, AGA, AUA, CUA, CCC, GGA. Το DE3 υποδεικνύει ότι το στέλεχος αυτό είναι λυσογόνο του φάγου λdh3 και έτσι έχει ενσωματωμένο στο χρωμόσωμα ένα αντίγραφο του γονιδίου της Τ7 RNA πολυμεράσης υπό τον έλεγχο του υποκινητή του lacuv5. Τέτοια στελέχη είναι κατάλληλα για την παραγωγή πρωτεϊνών από γονίδια κλωνοποιημένα σε φορείς pet μέσω επαγωγής από IPTG. pet-28b: Πρόκειται για πλασμιδιακό φορέα μεγέθους 5368 bp (Novagen), ο οποίος διαθέτει το γονίδιο που προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό Καναμυκίνη (Εικόνα 18). Χρησιμοποιείται για την κλωνοποίηση και έκφραση γονιδίων μέσω της Τ7 RNA πολυμεράσης. Στο πλασμίδιο pet-28b μετά τον προαγωγέα της Τ7 RNA πολυμεράσης υπάρχει ο πολυσυνδέτης (polylinker), όπου βρίσκονται όλες οι θέσεις αναγνώρισης και κοπής από τα ένζυμα περιορισμού (Εικόνα 18). Η μεταγραφή σταματά από ένα κωδικόνιο λήξης αμέσως μετά τα νουκλεοτίδια που κωδικοποιούν τις έξι ιστιδίνες.

48 Υλικά και Μέθοδοι 48 Εικόνα 18: Τα κυριότερα στοιχεία και ο χάρτης του πλασμιδιακού φορέα pet28. pet-33: Ο φορέας pet33 προέρχεται από τον φορέα pet28 περιέχοντας μία αλληλουχία 15bp που κωδικοποιεί το πεπτίδιο που αναγνωρίζεται και φωσφορυλιώνεται από την πρωτεινική κινάση Α (protein kinase A, PKA). Πρόκειται για πλασμιδιακό φορέα μεγέθους 5383bp όπου και αυτός χρησιμοποιείται για την κλωνοποίηση και έκφραση γονιδίων μέσω της Τ7 RNA πολυμεράσης. Οι πρωτεΐνες που εκφράζονται από αυτόν το φορέα μπορούν εύκολα να απομονωθούν με τη χρήση χρωματογραφίας συγγένειας.

49 Υλικά και Μέθοδοι Θρεπτικά Μέσα 5.1 Θρεπτικά υλικά για την καλλιέργεια βακτηρίων Υγρό θρεπτικό μέσο (LB Broth) 0.5% v/w yeast extract, 1% v/w tryptone, 0.5% v/w NaCl, ph 7.2 Στερεό θρεπτικό μέσο (LB Agar) 0.5% v/w yeast extract, 1% v/w tryptone, 0.5% v/w NaCl, ph Για την καλλιέργεια ανθρώπινων κυτταρικών σειρών Πλήρες θρεπτικό υλικό κυτταροκαλλιεργειών: DMEM high glucose stable glutamine, 5-10% fetal bovine serum (FBS), 1x penicillin-streptomycin ιάλυμα ψύξης: FBS, 10% DMSO 6. Διαλύματα 6.1 ιαλύματα για ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων ΤΑΕ (50x) Ρυθμιστικό διάλυμα για την ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωμα αγαρόζης: Tris base 24.2% w/v, Οξικό οξύ 5.71% v/v, EDTA 50 mm, ph 8.6 ΤΒΕ (10x) για την ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (Running buffer) 890 mm Tris, 890 mm boric acid, 20 mm EDTA Ρυθμιστικό διάλυμα Loading buffer for IVT (2x) για την ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου: 90% formamide, 0.5% EDTA, 0.1% xylene cyanol and 0.1% bromphenol blue Ακρυλαμίδιο 70% v/w acrylamide / bis-acrylamide (19/1) σε ddh 2 Ο 6.2 ιαλύματα για απομόνωση πρωτεΐνης ιάλυμα λύσης (Lysis byffer): (5% TRIS-HCl ph M, 5% KCl 2 M, 10% glycerol 50%, 0.4% PMSF 0.2 M, 0.015% Merca/nol, 0.2% Triton, 0.1% imidazole 4 M). Τα υλικά Triton X-100, mercapto-ethanol, lysozyme, PMSF στο διάλυμα λύσης τα προσθέτουμε λίγο πριν διαλύσουμε τα κύτταρα. ιάλυμα έκπλυσης στήλης (Wash buffer): (5% Tris-HCl ph M, 5% KCl 2 M, 10% Glycerol 50%, 0.5% imidazole 4 M)

50 Υλικά και Μέθοδοι 50 ιάλυμα έκλουσης (Elution buffer): (5% Tris-HCl ph M, 5% KCl 2 M, 10% Glycerol 50%, 3.75% imidazole 4 M) Διάλυμα διαπίδυσης/αποθήκευσης της πρωτεΐνης (Dialysis buffer): (20 mm Hepes ph 7.5, 100 mm NaCl, 1.5 mm MgCl 2, 0.1 mm DTT, 10% glycerol) 6.3 Διαλύματα για ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 2x Sample Buffer: 90 mm Tris HCl ph 6.8, 20% γλυκερόλη, 2% SDS, 0.02% bromo- phenol blue, 0.1 M DTT Running buffer (10x): Ρυθμιστικό διάλυμα για την ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου: Tris base 1,5 % w/v, Γλυκίνη 7.2% v/v, SDS 0.5%, ph Διαλύματα στοκ για πήκτωμα ακρυλαμιδίου Ρυθμιστικό διάλυμα TRIS- HCl ph 8.8, 1.5M Ρυθμιστικό διάλυμα TRIS- HCl ph 6.8, 0.5M SDS 10% v/w Ακρυλαμίδιο 30% v/w acrylamide/bis- acrylamide (29/1) σε ddh 2 Ο Ανάλογα με την συσκευή και την περιεκτικότητα ακρυλαμιδίου που θα χρειαστούμε θα αναζητούμε τους πίνακες για την αναλογία των διαλυμάτων στοκ που θα πρέπει να αναμείξουμε και προσθέτουμε στο τέλος τους καταλύτες APS 20% και TEMED. 6.5 ιαλύματα για βαφή του gel ιάλυμα χρώσης: 1gr/L Coomassie Brilliant Blue, 48% μεθανόλη, 10% οξικό οξύ. ιάλυμα αποχρωματισμού (Destain solution): 45% μεθανόλη, 10% οξικό οξύ. 6.6 Διάλυμα για αναδιάλυση κρυστάλλων φορμαζάνης (MTT buffer) MTT buffer: 0.1% NP-40, 4mM HCl, 100% Acid Isopropanol

51 Υλικά και Μέθοδοι 51 Μέθοδοι 1. Μέθοδος εικονικής διαλογής για εύρεση αναστολέων DEDD τύπου αποαδενυλασών Για να διευκολυνθεί η ανακάλυψη πιθανών αναστολέων των DEDD αποαδενυλασών χρησιμοποιήσαμε υπολογισμούς μοριακής σύνδεσης με βάση την κρυσταλλογραφική δομή του τομέα νουκλεάσης της hparn από την ηλεκτρονική βάση δεδομένων PDB ID 2A1R. Αρχικά, δημιουργήσαμε μια in silico βάση δεδομένων από μικρά μόρια των οποίων η δομή προσομοιάζει με αυτή γνωστών φαρμάκων και τα οποία είναι διαθέσιμα προς πώληση. Η βάση αυτή αποτελείται από ενώσεις της Asinex (Platinum Collection Library) και από ενώσεις της ChemBridge (Combined DiverSet Library). Ο σκοπός της δημιουργίας της συγκεκριμένης βάσης δεδομένων είναι η ενίσχυση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων των μορίων, ενώ συγχρόνως επιτρέπεται η εξερεύνηση των διαθέσιμων χώρων (ποικιλομορφία) εφαρμόζοντας μια σειρά από φίλτρα (π.χ. Lipinski s rule of 5) και αφαιρώντας ανεπιθύμητες χημικές ομάδες (π.χ. Michael acceptors, epoxides κλπ). Συνολικά, περίπου ενώσεις αξιολογήθηκαν in silico με το πρόγραμμα AutoDock VINA (78) και οι προβλεπόμενες διαμορφώσεις κατατάχθηκαν με βάση την προβλεπόμενη ελεύθερη ενέργεια πρόσδεσης. Ένα υποσύνολο των κορυφαίων διαμορφώσεων (1000 σύμπλοκα, 0,5%) ελέγχθηκε προκειμένου να προσδιοριστούν πιθανοί αναστολείς που αλληλεπιδρούν με τα καταλυτικά υπολείμματα. Ένας αριθμός 12 πιθανών αναστολέων επιλέχθηκε και αγοράστηκε από την αντίστοιχη εταιρεία για in vitro αξιολόγηση. 2. Έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών Σε 5ml LB Broth με αντιβιοτικό σε τελική συγκέντρωση 0.1mg/ml, εμβολιάζονται κύτταρα BL21 (DE3) Rosetta, που περιέχουν τον επιθυμητό, ανασυνδυασμένο, πλασμιδιακό φορέα και επωάζονται για 12-14h στους 37 Ο C υπό ανάδευση (210 rpm). Ακολουθεί μεταφορά 2.5ml της προ-καλλιέργειας σε 2lt από φρέσκο θρεπτικό μέσο LB broth με αντιβιοτικό (τα πλασμίδια pet28-33 προσδίδουν ανθεκτικότητα στην καναμυκίνη). Στην συνέχεια, πραγματοποιείται μέτρηση της οπτικής απορρόφησης στα 600nm (OD600) και επώαση στους 37 Ο C υπό ανάδευση μέχρι η OD600 να φτάσει περίπου το 0,6 που αντιστοιχεί στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης. Προσθέτουμε 0,1-1 mm IPTG (0,1 M) (Isopropyl β-d-1- thiogalactopyranoside). Το IPTG δρα ως επαγωγέας της έκφρασης του γονιδίου της Τ7 RNA πολυμεράσης της οποίας ο προαγωγέας στο πλασμίδιο που χρησιμοποιείται για την κλωνοποίηση του γονιδίου, βρίσκεται μπροστά από τον polylinker. Η έκφραση του γονιδίου

52 Υλικά και Μέθοδοι 52 αυτού στα κύτταρα του E. coli αναστέλλεται από τον καταστολέα LacIQ. Το IPTG δεσμεύει και απομακρύνει τον καταστολέα από το DNA επιτρέποντας έτσι την έκφραση της Τ7 RNA πολυμεράσης, η οποία με τη σειρά της θα αναγνωρίσει τον προαγωγέα της στο πλασμίδιο και θα μεταγράψει τα γονίδια που βρίσκονται μετά από αυτόν, που στη συγκεκριμένη περίπτωση είναι τα γονίδια pnldc1 και parn. Μετά την προσθήκη του IPTG συνεχίζεται η επώαση της καλλιέργειας σε θερμοκρασία 20 Ο C μέχρι η OD600 να φτάσει περίπου το 1,2. Τέλος, φυγοκεντρούνται οι καλλιέργειες στις 5000 rpm για 15min στους 4 Ο C, αφαιρείται το υπερκείμενο και το ίζημα αποθηκεύεται στους -80 Ο C. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη μπορεί να συντίθεται είτε σε διαλυτή μορφή είτε μόριά της να συσσωματώνονται και να σχηματίζουν αδιάλυτα έγκλειστα σωμάτια (inclusion bodies). Η φύση της πρωτεΐνης, το είδος των βακτηρίων και των πλασμιδιακών φορέων που χρησιμοποιούνται αλλά και οι συνθήκες της καλλιέργειας και της επαγωγής της έκφρασης των επιθυμητών γονιδίων καθορίζουν το βαθμό των έγκλειστων σωματίων. 2.1 Ομογενοποίηση κυττάρων Το ίζημα κυττάρων που έχει αποθηκευτεί στους -80 Ο C επωάζονται σε πάγο μέχρι να ξεπαγώσει. Σε αυτό προστίθενται 20ml διαλύματος λύσης ανά 1gr κυττάρων. Το διάλυμα λύσης περιέχει από 2 έως 10 mm ιμιδαζόλιο, το οποίο προκαλεί μείωση της μη ειδικής πρόσδεσης πρωτεϊνών με ιστιδίνες κατά τη χρωματογραφία καθώς ανταγωνίζεται κατάλοιπα ιστιδινών για την πρόσδεση στη στήλη. Στο κυτταρικό διάλυμα προστίθεται λυσοζύμη σε τελική συγκέντρωση 1mg/mL, ώστε να διευκολυνθεί η λύση των κυτταρικών τοιχωμάτων. Ακολουθεί αναδιάλυση των κυττάρων με τη χρήση vortex ανά τακτά χρονικά διαστήματα. Στην συνέχεια, η ομογενοποίηση επιτυγχάνεται με τη χρήση της συσκευής υπερήχων με 10 χτυπήματα (bursts) σε ισχύ W, διάρκειας 30sec το καθένα, στον πάγο. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 5000 rpm για 30min στους 4 o C ώστε να έχουμε ένα πρώτο διαχωρισμό από τις μεμβράνες. Έπειτα, πραγματοποιείται φυγοκέντρηση στα g για 60min στους 4 o C. Το υπερκείμενο αποτελεί το εκχύλισμα των διαλυτών πρωτεϊνών. Το ίζημα αποτελείται από, μεμβράνες, βακτηριακά τοιχώματα, DNA και αδιάλυτα έγκλειστα σωμάτια. 2.2 Χρωματογραφία συγγένειας Το υπερκείμενο το οποίο συλλέγεται σε ένα αποστειρωμένο σωλήνα Falcon των 50ml αναμειγνύεται με επαναιωρημένα σφαιρίδια Ni-NTA αγαρόζης και επωάζεται για 1h σε περιστρεφόμενο ρότορα στους 4 o C. Στα σφαιρίδια κατακρατείται η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη μέσω σύνδεσης των ιστιδινών που περιέχει με τα άτομα του νικελίου (Εικόνα 19).

53 Υλικά και Μέθοδοι 53 Ακολούθως το εναιώρημα πακετάρεται σε στήλη με τη ροή που προκαλείται από την δύναμη της βαρύτητας. Το διάλυμα που διέρχεται της στήλης συλλέγεται (flow-through). Εφόσον μεταφερθεί όλο το μείγμα υπερκειμένου-σφαιριδίων και έχει πακεταριστεί η στήλη, πραγματοποιείται καλό ξέπλυμα της στήλης με το διάλυμα έκπλυσης (Wash buffer) ώστε να απομακρυνθούν όσες πρωτεΐνες έχουν προσδεθεί μη ειδικά. Για την ανάκτηση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης, χρησιμοποιείται διάλυμα βαθμίδωσης συγκέντρωσης ιμιδαζολίου ( mm) συνολικού όγκου 9mL, όπου η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη εκλούεται στα 250 mm ιμιδαζολίου. Το ιμιδαζόλιο δεσμεύεται στα ακινητοποιημένα ιόντα νικελίου και ανταγωνίζεται τα κατάλοιπα ιστιδίνης της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης στη δέσμευση. Κατά την έκλουση συλλέγονται κλάσματα κάθε 0.5ml. Συλλέγονται 10 κλάσματα (E1,E2,..), τα δύο τελευταία εκλούονται σε τελική συγκέντρωση ιμιδαζολίου 400 mm. Το αποτέλεσμα της διαδικασίας πιστοποιείται με SDS/PAGE ηλεκτροφόρηση και η ποσοτικοποίηση της συγκέντρωσης της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης με τη μέθοδο Bradford. Εικόνα 19: Αλληλεπίδραση μεταξύ γειτονικών καταλοίπων ιστιδίνης σε ουρά ιστιδινών με άτομο νικελίου του υλικού Ni-NTA. Με μπλε χρώμα αναπαρίσταται η πεπτιδική αλυσίδα όπου διακρίνονται οι δακτύλιοι ιμιδαζολίου των ιστιδινών, οι οποίοι δεσμεύονται από τον χηλικό προσροφητή του νικελίου, το νιτριλο-οξικό οξύ. 2.3 Ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτικό πήκτωμα SDS/πολυακρυλαμιδίου Η προετοιμασία των δειγμάτων πριν φορτωθούν στην πηκτή περιλαμβάνει την προσθήκη του ρυθμιστικού διαλύματος Loading Dye (2x) και τη θέρμανση των δειγμάτων στους 98 ο C, για 5min. Τα δείγματα ηλεκτροφορούνται σε αποδιατακτικό πήκτωμα SDS/πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE). Το ανώτερο μέρος του πηκτώματος (πήκτωμα πακεταρίσματος, stacking gel) είναι περιεκτικότητας 4% σε ακρυλαμίδιο και έχει ph 6.8. Η περιεκτικότητα του κατώτερου μέρους του πηκτώματος (πήκτωμα διαχωρισμού, separating gel) εξαρτάται από το εύρος μοριακών βαρών των πρωτεϊνών για το οποίο το πήκτωμα επιθυμούμε να έχει την μέγιστη διαχωριστική ικανότητα, ενώ το ph είναι 8.8. Για τον

54 Υλικά και Μέθοδοι 54 βέλτιστο διαχωρισμό πρωτεϊνών με μοριακά βάρη από 20 έως 90 kda το διαχωριστικό πήκτωμα πρέπει να είναι 10%, ενώ για εύρος 10 έως 20 kda η περιεκτικότητα πρέπει να είναι 16%. Οι διαστάσεις του πηκτώματος είναι 7cm x 9cm x 1mm και η ηλεκτροφόρηση γίνεται στα 120V για 2hrs. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης αφαιρούμε το πήκτωμα διαχωρισμού και το φέρουμε σε διάλυμα χρώσης (staining solution) Coomassie Brilliant Blue. Το διάλυμα θερμαίνεται ελαφρώς για 10min και στη συνέχεια το πήκτωμα κατεργάζεται με διάλυμα αποχρωματισμού 1h υπό ανάδευση για την εμφάνιση των πρωτεϊνικών ζωνών (destaining solution). Κάθε μισή με μια ώρα είναι απαραίτητη η ανανέωση του διαλύματος. Στο τέλος της διαδικασίας είναι ευδιάκριτες οι ζώνες των πρωτεϊνών, εξαιτίας της μπλε χρωστικής Coomasie Brilliant Blue, ενώ είναι δυνατός και ο προσδιορισμός του μοριακού βάρους των πρωτεϊνικών τμημάτων μέσω της σύγκρισης των ζωνών με τους μάρτυρες μοριακού βάρους. Τα κλάσματα που περιέχουν σε μεγαλύτερη συγκέντρωση και καθαρότητα το εκάστοτε ανασυνδυασμένο πολυπεπτίδιο τοποθετούνται σε μεμβράνη διαπίδυσης και ακολουθεί συμπύκνωση χρησιμοποιώντας πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG ). Μετά το πέρας της συμπύκνωσης η μεμβράνη διαπίδυσης τοποθετείτε σε κατάλληλο διάλυμα (dialysis buffer) υπό ανάδευση στους 4 ο C με σκοπό την απομάκρυνση της πρωτεΐνης από διάλυμα που περιέχει ιμιδαζόλιο και ταυτόχρονα τη μεταφορά της σε διάλυμα κατάλληλο για αποθήκευση στους -20 ο C. Η συγκέντρωση της καθαρής ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης προσδιορίζεται με την μέθοδο Bradford. 2.4 Χρωματογραφία μοριακής διήθησης Μετά τη διαπίδυση ακολουθεί το δεύτερο στάδιο καθαρισμού. Το στάδιο αυτό περιλαμβάνει τη χρωματογραφία μοριακής διήθησης (size exclusion chromatography) σε στήλη Superdex /300 GL (GE Healthcare). Στη χρωματογραφία μοριακής διήθησης οι πρωτεΐνες μετακινούνται διαμέσου ενός πορώδους υλικού και διαχωρίζονται ανάλογα με το μέγεθός τους. Τα μικρότερα μόρια παγιδεύονται στους πόρους του υλικού της στήλης και διανύουν μεγαλύτερη απόσταση μέχρι την έξοδο από αυτήν. Έτσι οι πρωτεΐνες μεγαλύτερου μεγέθους που δεν εισέρχονται στους πόρους του υλικού, εκλούονται πρώτες από τη στήλη της μοριακής διήθησης και ακολουθούν οι μικρότερες. Η έξοδος της στήλης συνδέεται με ένα φασματοφωτόμετρο UV. Για κάθε κλάσμα που εξέρχεται από τη στήλη δίδεται η απορρόφηση στα 280nm. Έτσι τα διάφορα κλάσματα που περνούν από τη στήλη αναπαρίστανται σε ένα γράφημα χρόνου-απορρόφησης.

55 Υλικά και Μέθοδοι 55 Τα κλάσματα που συλλέγονται από τη διαδικασία της χρωματογραφίας μοριακής διήθησης ηλεκτροφορούνται σε αποδιατακτικό πήκτωμα SDS/πολυακρυλαμιδίου για την ανίχνευση του εκάστοτε επιθυμητού πολυπεπτιδίου και τον έλεγχο της καθαρότητας. Τα δείγματα καθαρής ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης διατηρούνται στους -20 C. 3. In vitro αποαδενυλίωση παρουσία συνθετικού ολιγοριβονουκλεοτιδίου 3.1 Σήμανση ολιγονουκλεοτιδίου στο 5 άκρο τους με γ - 32 Ρ - ΑΤΡ Για να επιτευχθεί η σήμανση του ολιγονουκλεοτιδίου προηγείται μια αντίδραση αποφωσφορυλίωσης και έπειτα ακολουθεί η κύρια αντίδραση. Το υπόστρωμα που χρησιμοποιήθηκε είναι το RNA oligo Ν9Α15 (GUCCGCCCCAAAAAAAAAAAAAAA). Για την αντίδραση αποφωσφορυλίωσης αναμιγνύουμε τα εξής συστατικά (Πίνακας 3): Αντιδραστήριο 10x Antarctic Phosphatase ρυθμ. δ/μα RNA μετάγρ. (1pmol/μL) Antarctic Phosphatase (5 U/μl) RNasin (10 U/μL) ddh 2 O μέχρι Ποσότητα 2 μl 10 μl 1 μl 1 μl 20 μl Πίνακας 3: Μίγμα της αντίδρασης της αποφωσφορυλίωσης. Ο τελικός όγκος της αντίδρασης είναι 20 μl. Κατά την αντίδραση σήμανσης στο 5 άκρο του ολιγονουκλεοτιδίου με ραδιενεργό φωσφόρο, χρησιμοποιούνται 5 10 pmol υποστρώματος. Τα μl του ραδιενεργού νουκλεοτιδίου που χρησιμοποιούνται εξαρτώνται από τη συγκέντρωσή του, η οποία προσδιορίζεται από τα χαρακτηριστικά του συγκεκριμένου αντιδραστηρίου. Για παράδειγμα, αν χρησιμοποιείται ραδιενεργό ΑΤΡ 3000 Ci/mmol και 10 μci/μl, η συγκέντρωση του ραδιενεργού νουκλεοτιδίου είναι 3,67 pmol/μl, αν είναι 6000 Ci/mmol και 10μCi/μL η συγκέντρωση είναι 1,67 pmol/μl, ενώ αν είναι 7000 Ci/mmol και 150 μci/μl η συγκέντρωση είναι 25 pmol/μl. Σε κάθε περίπτωση πάντως η αναλογία ραδιενεργού νουκλεοτιδίου:μόρια RNA μεταγράφων πρέπει να είναι τουλάχιστον 1:1 ή να υπάρχει σε περίσσεια το ραδιενεργό νουκλεοτίδιο. Το μίγμα της αντίδρασης σήμανσης περιλαμβάνει (Πίνακας 4):

56 Υλικά και Μέθοδοι 56 Αντιδραστήριο Ποσότητα 10x T4 PNK ρυθμ. δ/μα 2 μl Αποφωσφορ. RNA μετάγρ. (1pmol/μL) 10 μl γ- 32 Ρ-ΑΤΡ (6000 Ci/mmol, 10 μci/μl) 6 μl RNasin (10 U/μL) 1 μl T4 Polynucleotide Kinase (10 U/μL) 1 μl ddh 2 O μέχρι 20 μl Πίνακας 4: Μίγμα της αντίδρασης της φωσφορυλίωσης με την οποία πραγματοποιείται η σήμανση του ολιγοριβονουκλεοτιδίου. Ο τελικός όγκος της αντίδρασης είναι 20 μl. Το μίγμα επωάζεται στους 37 o C για 1h και τερματίζεται με την προσθήκη 1μL EDTA 200 mm ph=8 (C τελ =10mM). Στη συνέχεια στην αντίδραση προστίθενται 5μL διαλύματος φορτώματος RNA και η αντίδραση ηλεκτροφορείται σε αποδιατακτικό PAGE 8M Urea. Οι διαστάσεις του πηκτώματος είναι 20x20 cm ενώ η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται στα 30 ma. Τα προϊόντα της αντίδρασης οπτικοποιούνται με αυτοραδιογραφία και ακολουθείται η διαδικασία έκλουσης του ραδιενεργού RNA μεταγράφου πλήρους μήκους από το πήκτωμα. Η μπάντα στην οποία αντιστοιχεί το μετάγραφο κόβεται και τοποθετείται σε διάλυμα έκλουσης O/N στους 4 ο C υπό ελαφριά ανακίνηση. Τέλος, πραγματοποιείται EtoH Precipitation για καθαρισμό του σημασμένου μορίου και αναδιάλυσή του σε DEPC H Προσδιορισμός ενεργότητας αποαδενυλασών O προσδιορισμός της ενεργότητας έγινε χρησιμοποιώντας το παραπάνω ραδιενεργά σεσημασμένο υπόστρωμα. Οι συνθήκες της αντίδρασης ήταν οι εξής: 20 mm HEPES ph 7.5, 75 mm NaCl, 1.5 mm MgCl 2, 37 o C. Η κάθε αντίδραση ετοιμάστηκε σύμφωνα με τις παρακάτω ποσότητες (Πίνακας 5): Αντιδραστήριο Ανασυνδυασμένο ένζυμο Ραδιενεργά σημασμένο RNA RNasin (10 U/μL) Reaction buffer μέχρι Ποσότητα 2 μm 20 cps 1 μl 20 μl Πίνακας 5: Η παραπάνω αντίδραση πραγματοποιείται περισσότερες από μία φορές για διάφορους χρόνους ώστε να ελέγχεται η πορεία της αντίδρασης. Οι αντιδράσεις σταματούν με την προσθήκη 2μl EDTA 0.5M και τοποθέτηση των δειγμάτων στον πάγο. Αφού συλλεχθούν όλες οι αντιδράσεις γίνεται απομόνωση των νουκλεικών οξέων με φαινόλη και στη συνέχεια ηλεκτροφορούνται σε πήκτωμα

57 Υλικά και Μέθοδοι 57 πολυακρυλαμιδίου 30% χρησιμοποιώντας ως αποδιατακτικό μέσο ουρία 8 M. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται στα 15 ma για περίπου 2.5hrs. 4. Έλεγχος δραστικότητας των πιθανών αναστολέων και Βιοχημικές αναλύσεις Για τον έλεγχο της δραστικότητας των χημικών ενώσεων που επιλέχθηκαν πραγματοποιήθηκε αντίδραση στην οποία προστέθηκε συγκέντρωση του εκάστοτε πιθανού αναστολέα 1mM. Η αντίδραση αυτή έγινε με βάση τον παραπάνω πίνακα (Πίνακας 5) και σαν control χρησιμοποιήθηκε αντίδραση χωρίς αναστολέα αλλά με την ίδια συγκένρωση DMSO. 4.1 Υπολογισμός του IC 50 των ενώσεων Για τον υπολογισμό της δόσης του φαρμάκου που εμφανίζεται το 50% της δραστικότητάς του (IC 50 ) ετοιμάζονται αντιδράσεις ξεκινώντας από μηδενική συγκέντρωση αναστολέα μέχρι και 200 μm. Όλες οι αντιδράσεις θα περιέχουν την ίδια συγκέντρωση DMSO. Αρχικά, προστίθενται ο αναστολέας, το DMSO, το buffer της αντίδρασης και το ένζυμο και ακολουθεί προεπώαση για 10min στους 37 o C. Έπειτα, προστίθεται το σημασμένο υπόστρωμα με το RNasin. Η αντίδραση πραγματοποιείται στους 37 o C και ο χρόνος εξαρτάται από το κάθε ένζυμο. Για την PNLDC1 είναι 30min ενώ για την PARN 5min. Τέλος, προστίθενται 2μl EDTA 0.5M και τοποθέτηση των δειγμάτων στον πάγο. Όπως και παραπάνω ακολουθεί απομόνωση των νουκλεικών οξέων με φαινόλη και ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 30% χρησιμοποιώντας ως αποδιατακτικό μέσο ουρία 8 M για περίπου 2.5hrs. Το πήκτωμα αφαιρείται και επωάζεται για εμφάνιση όλο το βράδυ κάτω από πλάκα φωτοδιεγειρόμενου φθορισμού. Τα αποτελέσματα της αντίδρασης γίνονται ορατά με αυτοραδιογραφία μέσω Phosphorimager FLA 3000 (FUJIFILM) και ποσοτικοποιούνται με το πρόγραμμα PCBAS/AIDA (Raytest). 4.2 Πειράματα κινητικής ανάλυσης Πραγματοποιήθηκαν πειράματα κινητικής ανάλυσης ενζύμου, φροντίζοντας να πληρούνται οι απαραίτητες προϋποθέσεις, ώστε οι ενζυμικές αντιδράσεις να περιγράφονται από το πρότυπο Michaelis-Menten. Έτσι, ο χρόνος αντίδρασης πρέπει να βρίσκεται στο γραμμικό τμήμα της χρονοκαμπύλης της επώασης του ενζύμου, ώστε να ισχύει U 0 =U αρχ (όταν η αντίδραση πραγματοποιείται με U 0, μόνο το 5% του υποστρώματος έχει μετατραπεί σε προϊόν), και η συγκέντρωση του υποστρώματος πρέπει να είναι μεγαλύτερη από εκείνη του ενζύμου, ώστε το υπόστρωμα να βρίσκεται σε περίσσεια.

58 Υλικά και Μέθοδοι 58 Αρχικά προετοιμάστηκαν οι αραιώσεις του «ψυχρού» υποστρώματος Ν9Α15. Πραγματοποιήθηκαν έτσι ώστε 1μl από κάθε αραίωση στην αντίδραση να ρυθμίζει κατάλληλα την συγκέντρωση (στη παρούσα μελέτη 100, 200, 400 και 800 nm αντίστοιχα). Έπειτα αραιώθηκαν οι ενώσεις έτσι ώστε να μπορούν να προστεθούν με κατάλληλη συγκέντρωση στις αντιδράσεις (οι συγκεντρώσεις αυτές κυμαίνονται από 0 έως και 80μM). Η συγκέντρωση του DMSO είναι η ίδια σε όλες τις αντιδράσεις. Όπως και προηγουμένως αρχικά προστίθενται ο αναστολέας, το DMSO, το buffer της αντίδρασης και το ένζυμο. Πριν την προσθήκη του υποστρώματος, το μίγμα της αντίδρασης προεπωάζεται για 10min στους 37 o C. Η αντίδραση τερματίζεται με την προσθήκη 2μl EDTA 0.5 M. Τέλος, πραγματοποιείται ηλεκτροφόρηση και αυτοραδιογραφία όπως αναφέρθηκε παραπάνω. 5. ιατήρηση και καλλιέργεια κυτταρικών σειρών 5.1 Απόψυξη κυττάρων Ένα δοχείο κατάψυξης κυττάρων (cryovial) που περιέχει 10 7 περίπου κύτταρα μεταφέρεται παγωμένο κατευθείαν σε υδατόλουτρο στους 37 o C μέχρι να τηχθεί όλο το θρεπτικό υλικό που περιέχει τα κύτταρα. Η απότομη αύξηση της θερμοκρασίας απαιτείται για να ελαχιστοποιηθεί ο χρόνος παραμονής των κυττάρων σε θερμοκρασίες όπου υπάρχει μία μικρή κινητικότητα των μορίων αλλά η φυσιολογική λειτουργεία πολλών συστατικών να οδηγήσουν σε καταστροφή του κυττάρου. Τα κύτταρα μεταφέρονται σε 15ml falcon με 5ml PBS και φυγοκεντρούνται σε 1000 g για 5min. Το υπερκείμενο αφαιρείται και έτσι απομακρύνεται το DMSO από τα κύτταρα. Ακολουθεί αναδιάλυση σε θρεπτικό μέσο και μεταφορά των κυττάρων σε φλάσκα 75cm 2 (Τ75 flask) ή σε τρυβλίο 100 mm ειδικό για κυτταροκαλλιέργειες σε τελικό όγκο θρεπτικού 12ml. Η καλλιέργεια διατηρείται σε επωαστικό θάλαμο με 37 C και 5% CO2. Την επόμενη μέρα αφαιρείται το θρεπτικό και συμπληρώνεται με φρέσκο θρεπτικό μέσο κυτταροκαλλιεργειών. Αυτό γίνεται για να απομακρυνθούν όλα τα νεκρά κύτταρα τα οποία δρουν αρνητικά στην ανάπτυξη των ζωντανών κυττάρων τα οποία διακρίνονται εύκολα αφού προσκολλώνται στο πυθμένα του τρυβλίου ή της φλάσκας. 5.2 Ανακαλλιέργεια Όταν τα κύτταρα καλύψουν από 80 έως 100% την επιφάνεια της φλάσκας πριν αρχίσουν και δημιουργούν διπλοστοιβάδες πρέπει να αποκολληθούν, να αραιωθούν και να στρωθούν στη φλάσκα σε ποσότητα τέτοια ώστε να καλύπτεται το 10 έως το 20% της επιφάνειας

59 Υλικά και Μέθοδοι 59 (αραίωση 1/10 ή 1/5). Για κύτταρα τα οποία προσκολλώνται ισχυρά στο πλαστικό μέσω εξωκυττάριων γλυκοπρωτεϊνών είναι απαραίτητη η επεξεργασία με θρυψίνη. Στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα από καρκίνο του πνεύμονα (Α549) καθώς και εμβρυικά κύτταρα ποντικού (Ε-14). Για να δράσει η θρυψίνη πρέπει να ξεπλυθούν τα κύτταρα δύο φορές με PBS για να απομακρυνθεί κάθε ίχνος θρεπτικού. Προστίθεται διάλυμα θρυψίνης 1x τόσο ώστε να καλυφθεί όλη η επιφάνεια της φλάσκας (2-3ml). Ακολουθεί επώαση στους 37 o C μέχρι να αποκολληθούν τα κύτταρα (αποκτούν στρογγυλή μορφή όταν τα παρατηρήσουμε στο ανάστροφο μικροσκόπιο). Προστίθεται φρέσκο θρεπτικό μέσο το οποίο απενεργοποιεί την θρυψίνη και τα κύτταρα αποκολλώνται με ελαφρό πιπετάρισμα. Το εναιώρημα κυττάρων φυγοκεντρείται και αναδυαλύεται σε θρεπτικό. Έπειτα μεταφέρουμε το 1/5 σε νέα φλάσκα και σε τελικό όγκο 12ml πλήρες θρεπτικού. Ακολουθεί επώαση των κυττάρων σε 37 C και 5% CO Φύλαξη κυττάρων Όταν τα κύτταρα καλύπτουν το 70% της επιφάνειας αποκολλώνται και αναδιαλύονται. Τα κύτταρα μεταφέρονται σε 15ml falcon και φυγοκεντρούνται σε 1000 g για 5 λεπτά. Αφαιρείται το υπερκείμενο, αναδιαλύονται σε 1ml διάλυμα ψύξης (90% FBS και 10% DMSO) και μεταφέρονται σε ειδικά φιαλίδια τα οποία χρησιμοποιούνται για πάγωμα (cryovials). Κατά το πάγωμα των κυττάρων ιδανικά η θερμοκρασία πρέπει να μειώνεται με ρυθμό 1 o C/λεπτό. Αυτό αποτρέπει το σχηματισμό μικροκρυστάλλων νερού στο εσωτερικό των κυττάρων τα οποία δημιουργούν βλάβες. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιείται δοχείο το οποίο απομονώνει τα φιαλίδια από τον περιβάλλοντα χώρο του καταψύκτη καθώς περιέχει ισοπροπανόλη η οποία παρουσιάζει μικρότερη θερμική αγωγιμότητα από το νερό. Ιδανικά τα κύτταρα τοποθετούνται με το δοχείο σε κατάψυξη -80 o C και την επομένη μέρα μεταφέρονται από το δοχείο αυτό σε δοχείο υγρού αζώτου που φέρει θήκες για τοποθέτηση φιαλιδίων. Εάν τα κύτταρα παραμείνουν στους -80 o C θα πρέπει να ξεπαγώσουν σε διάστημα όχι περισσότερα από ένα χρόνο καθώς μειώνεται δραματικά η βιωσιμότητα των κυττάρων. 5.4 Προσδιορισμός της κυτταρικής βιωσιμότητας μέσω της μεθόδου ΜΤΤ Η αρχή της μεθόδου βασίζεται στην διάσπαση της ουσίας ΜΤΤ (3-(4,5-Dimethylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), η οποία αποτελεί ένα άλας κίτρινου χρώματος, από τα μιτοχονδριακά ένζυμα μεταβολικά ενεργών κυττάρων. Η διάσπαση του ΜΤΤ έχει ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό κρυστάλλων φορμαζάνης, μωβ χρώματος. Η διαλυτοποίηση

60 Υλικά και Μέθοδοι 60 των κρυστάλλων φορμαζάνης και ο προσδιορισμός της οπτική πυκνότητας του διαλύματος συμβάλλει άμεσα, στον προσδιορισμό της μεταβολικής ενεργότητας των κυττάρων και έμμεσα, στον προσδιορισμό της κυτταρικής βιωσιμότητας. Η τιμή της οπτικής απορρόφησης του διαλύματος των κρυστάλλων φορμαζάνης είναι ανάλογη του αριθμού των ζωντανών κυττάρων. Σε τρυβλίο 96 βοθρίων (96-well plate) επιστρώνονται κύτταρα με επικάλυψη 10% εώς 20% της επιφάνειας. Την επόμενη μέρα, αφαιρείται το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο και προστίθεται ίσος όγκος φρέσκου θρεπτικού μέσου, το οποίο περιέχει και τη συνθετική χημική ένωση, σε επιθυμητές συγκεντρώσεις. Να σημειωθεί ότι τα βοθρία που βρίσκονται στην εξωτερική πλευρά του τρυβλίου δεν λαμβάνονται υπόψη στις μετρήσεις. Ωστόσο επιστρώνονται και αυτά με κύτταρα και προστίθεται πλήρες θρεπτικό. Έπειτα από 24ώρες επώασης, αφαιρείται το θρεπτικό που περιέχει τις υπό μελέτη ενώσεις και προστίθεται νέο με ποσότητα διαλύματος ΜΤΤ (5mg/ml σε 1Χ PBS) ίση με το 1/10 του συνολικού όγκου του θρεπτικού μέσου. Τα κύτταρα επωάζονται για 4ώρες, στους 37 C προστατευμένα από το φως. Τέλος, και ενώ έχουν σχηματιστεί οι κρύσταλλοι φορμαζάνης, το υπερκείμενο αφαιρείται και προστίθεται MTT buffer ώστε να αναδιαλυθούν οι κρύσταλλοι. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν στη συσκευή Molecular Devices SpectraMax 250 σε μήκος κύματος 495nm (Εικόνα 20). Εικόνα 20: Προσδιορισμός της κυτταρικής βιωσιμότητας μέσω της μεθόδου ΜΤΤ.

61 Υλικά και Μέθοδοι Ανάλυση κυτταρικού κύκλου με χρήση κυτταρομετρίας ροής Με την κυτταρομετρία ροής μετριέται το ποσοστό των κυττάρων που βρίσκονται σε κάθε φάση του κύκλου (ανάλυση του κυτταρικού κύκλου) καθώς και το ολικό περιεχόμενο σε DNA ενός κυτταρικού πληθυσμού (DNA πλοειδία). Η ανάλυση του κυτταρικού κύκλου περιλαμβάνει τον προσδιορισμό του ποσοστού των κυττάρων στη φάση ηρεμίας (GO/G1), στη φάση σύνθεσης DNA (S) και στη φάση μίτωσης (G2/M). Σε τρυβλίο 6 βοθρίων (6-well plate) επιστρώνονται κύτταρα με επικάλυψη 20% της επιφάνειας και αφήνονται να προσκολληθούν. Την επόμενη ημέρα, απομακρύνεται το θρεπτικό μέσο και αντικαθιστάτε με νέο το οποίο περιέχει τη συνθετική χημική ένωση στην κατάλληλη συγκέντρωση. Πραγματοποιείται επώαση των κυττάρων για 24 ώρες. Μετά την επώαση με τη συνθετική χημική ένωση, τα κύτταρα μονιμοποιούνται σε 70% παγωμένη αιθανόλη και φυλάσσονται για τουλάχιστον 16h σε καταψύκτη -20 C. Έπειτα, πραγματοποιούνται 2 πλύσεις με 1Χ PBS και ακολουθεί προσθήκη 2μg/ml ιωδιούχου προπιδίου (Propidium Iodide) και 100μg/ml RNAse A. Το ιωδιούχο προπίδιο αποτελεί ένα φθορίζων μόριο το οποίο έχει την ικανότητα να παρεμβάλλεται ανάμεσα στις βάσεις του DNA (αλλά και του RNA) και για το λόγο αυτό χρησιμοποιείται για τη σήμανση νουκλεϊκών οξέων. Το ένζυμο RNAse A χρησιμοποιείται για να απομακρύνει το RNA από τα δείγματά μας. Για την ανάλυση του DNA περιεχομένου των κυττάρων χρησιμοποιήθηκε κυτταρομετρητής της εταιρείας Becton Dickinson BD και τα δεδομένα αναλύθηκαν μέσω του λογισμικού FlowJo V (Εικόνα 21). Εικόνα 21: Φάσεις του κυτταρικού κύκλου (Α). Γράφημα που απεικονίζεται το ποσοστό των κυττάρων κάθε φάσης του κυτταρικού κύκλου έπειτα από χρώση ιωδιούχου προπιδίου (Β).

62 Αποτελέσματα 62 Αποτελέσματα

63 Αποτελέσματα Ιn silico ανάλυση και επιλογή αναστολέων Βασιζόμενοι στην ήδη υπάρχουσα κρυσταλλική δομή της PARN (PDB ID 2A1R) πραγματοποιήθηκε προσομοίωση μοριακής δυναμικής του ενεργού κέντρου της PNLDC1 (Εικόνα 22). Το αποτέλεσμα έδειξαν ότι οι δύο πρωτεΐνες παρουσιάζουν 30% ομολογία καθώς τα 90 από τα 303 κατάλοιπα του ενεργού κέντρου είναι όμοια. Αξίζει να αναφερθεί πως εκτός από τα καταλυτικά αμινοξέα της PNLDC1, ένας αριθμός από κατάλοιπα τα οποία είναι υπεύθυνα για την αλληλεπίδραση με RNA μόρια είναι συντηρημένα και στην PARN. Εικόνα 22: Σύγκριση ανάμεσα στο ενεργό κέντρο της hparn (αριστερά) και της hpnldc1 (δεξιά) με ένα δεσμευμένο τρινουκλεοτίδιο αδενοσίνης όπως καθορίζεται από την ηλεκτρονική βάση δεδομένων PDB ID 2A1R. Τα άτομα της πλευρικής αλυσίδας της πρωτεΐνης εμφανίζονται με άνθρακες κυανού χρώματος ενώ το RNA με ανοιχτό πορτοκαλί. Τα άτομα αζώτου απεικονίζονται με μπλε, του οξυγόνου με κόκκινο και το φωσφόρου με ανοιχτό καφέ χρώμα. Έπειτα, μετά από in silico σάρωση βιβλιοθήκης χημικών ενώσεων καταλήξαμε σε δώδεκα ισχυρούς προσδέτες για περεταίρω μελέτη. Ο βιοχημικός χαρακτηρισμός και η κινητική ανάλυση που πραγματοποιήθηκαν φανέρωσαν πέντε δραστικές ενώσεις. Πρόκειται για τις ενώσεις ASN , ASN , ASN , ASN και ASN Η δομή των ενώσεων αυτών και η αλληλεπίδρασή τους με το ενεργό κέντρο DEDD αποαδενυλασών φαίνεται στην παρακάτω εικόνα (Εικόνα 23). Η ένωση ASN φαίνεται να αλληλεπιδρά σε μία αλλοστερική θέση και όχι στο ενεργό κέντρο (Εικόνα 24).

64 Αποτελέσματα 64 ASN ASN ASN ASN Εικόνα 23: Μοριακά μοντέλα του ενεργού κέντρου της hparn σε σύμπλοκο με τους 4 αναστολείς: ASN , ASN , ASN και ASN Τα κατάλοιπα ασπαρτικού και ιστιδινών φαίνονται με στύλους άνθρακα κυανού χρώματος ενώ οι αναστολείς με πορτοκαλί. Τα άτομα οξυγόνου αναπαρίστανται με κόκκινο, του αζώτου με μπλε, του θείου με κίτρινο και του φθορίου με ροζ.

65 Αποτελέσματα 65 ASN Εικόνα 24: Η χημική ένωση ASN φαίνεται να αλληλεπιδρά αλλοστερικά με το ένζυμο και όχι στο ενεργό κέντρο. 2. Έκφραση και καθαρισμός ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών Για να επιτευχθεί η απομόνωση των πρωτεϊνών hpnldc1 και hparn ήταν απαραίτητη η επαγωγή της έκφρασης των γονιδίων. Έτσι, καθίσταται δυνατός ο καθαρισμός των δύο πρωτεϊνών με τη χρήση χρωματογραφίας συγγένειας καθώς και η ανίχνευσή τους μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου. Για το σκοπό αυτό παρασκευάστηκαν 3lt θρεπτικού υλικού (2lt για την hpnldc1 και 1lt για την hparn), τα οποία εμβολιάστηκαν με τα μετασχηματισμένα κύτταρα E. coli BL21 (DE3) Rosetta. Ακολούθησε επώαση στους 37 Ο C μέχρι τα κύτταρα να βρίσκονται στην εκθετική φάση ανάπτυξης (OD 600 = ). Τότε προστέθηκε 0.5mM IPTG και πραγματοποιήθηκε επώαση των κυττάρων στους 20 Ο C μέχρι η OD600 να είναι περίπου 1.2. Μετά το πέρας της διαδικασίας τα κύτταρα φυλάσσονται στους -80 Ο C. Έπειτα, ακολούθησε ομογενοποίηση των κυττάρων με υπερήχους και απομόνωση των πρωτεϊνικών στόχων με χρωματογραφία συγγένειας Ni-NTA (Εικόνα 25, Α). Επιλέχθηκαν τα κλάσματα με τη μεγαλύτερη συγκέντρωση και πραγματοποιήθηκε συμπύκνωσή και διαπίδυση τους σε κατάλληλο διάλυμα (dialysis buffer). Το αποτέλεσμα αυτής της διαδικασίας φαίνεται παρακάτω (Εικόνα 25, Β).

66 Αποτελέσματα 66 A B Εικόνα 25: Στις διαδρομές 1 έως και 4 φαίνονται τα δείγματα Input (δείγμα από κλάσμα των διαλυτών πρωτεϊνών πριν την πρόσδεσή τους στη στήλη), Flow Through (δείγμα από κλάσμα πρωτεϊνών οι οποίες δεν έχουν δεσμευτεί στη στήλη), Wash I και II αντίστοιχα (δείγματα από κλάσματα πρωτεϊνών που έχουν δεσμευτεί στη στήλη μη ειδικά). Από την διαδρομή 5 μέχρι το τέλος είναι τα κλάσματα έκλουσης για κάθε πρωτεΐνη (hpnldc1 66kDa, hparn 74kDa) (Α). Στην διαδρομή 1 παρατηρείται η hpnldc1 ενώ στην 2 η hparn μετά τη διαδικασία της συμπύκνωσης (Β). Επειδή η καθαρότητα της πρωτεΐνης δεν είναι η επιθυμητή (>95%) πραγματοποιήθηκε χρωματογραφία μοριακής διήθησης (size exclusion chromatography) σε στήλη Superdex /300 GL (GE Healthcare). Με βάση το χρωματογράφημα που προκύπτει από τη μέτρηση της οπτικής απορρόφησης στα 280 nm συλλέγονται τα πιθανά κλάσματα που έχουν την επιθυμητή πρωτεΐνη και η ανίχνευσή τους πραγματοποιείται με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (Εικόνα 26). Παρατηρείται πως οι δύο ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες έχουν επιθυμητά επίπεδα καθαρότητας για περεταίρω in vitro μελέτες. Τα κλάσματα που συλλέγονται αποθηκεύονται στους 4 Ο C μέχρι να ελεγχθεί η δραστικότητα του καθενός ξεχωριστά. Η ποσοτικοποίηση της συγκέντρωσης κάθε κλάσματος πραγματοποιείται με τη μέθοδο Bradford και με τη βοήθεια πρότυπης καμπύλης που κατασκευάζεται με γνωστές συγκεντρώσεις BSA.

67 Αποτελέσματα 67 Εικόνα 26: Αριστερά φαίνονται τα χρωματογραφήματα για τις δύο πρωτεΐνες και δεξιά οι πηκτές πολυακρυλαμιδίου. 3. Προσδιορισμός ενεργότητας των ανασυνδυασμένων ενζύμων Πραγματοποιήθηκε σήμανση του RNA oligo Ν9Α15 (GUCCGCCCCAAAAAAAAAAAAAAA) όπως αναφέρεται στο κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι και συγκεκριμένα στην ενότητα 3.1. Η διαδικασία αυτή πραγματοποιείται με σκοπό το παραπάνω ολιγοριβουνοκλεοτίδιο να χρησιμοποιηθεί για αντίδραση αποαδενυλίωσης in vitro. Μετά τη πραγματοποίηση των αντιδράσεων, όπως αυτές περιεγράφηκαν, ακολουθεί ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτικό PAGE 8M Urea. Οι διαστάσεις του πηκτώματος είναι 20x20 cm ενώ η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται με 30 ma. Ακολούθησε αυτοραδιογραφία με σκοπό την οπτικοποίηση και την έκλουση του ραδιενεργά σημασμένου ολιγοριβονουκλεοτιδίου (Εικόνα 27). N9A15 Εικόνα 27: Αριστερά φαίνεται αναπαράσταση της ηλεκτροφόρησης. Δεξιά το φιλμ αυτοραδιογραφίας στο οποίο απεικονίζεται το ραδιενεργά σημασμένο ολιγοριβοωουκλεοτίδιο N9A15.

68 Αποτελέσματα 68 Με τη χρήση του σημασμένου ολιγοριβονουκλεοτιδίου και πραγματοποιώντας την αντίδραση που αναφέρθηκε και αφορά το προσδιορισμό ενεργότητας των αποαδενυλασών (Πίνακας 5) ελέγχθηκαν τα κλάσματα που απομονώθηκαν από τη χρωματογραφία μοριακής διήθησης. Εικόνα 28: Έλεγχος της δράσης των κλασμάτων από απομονώθηκαν από τη χρωματογραφία μοριακής διήθησης. Παρατηρούμε ότι τα κλάσματα Ε1 και Ε2 της πρωτεΐνης PARN και τα κλάσματα Ε2 και Ε3 της πρωτεΐνης PNLDC1 είναι αυτά με την καλύτερη δραστικότητα. Τα κλάσματα 4, 5 της πρωτεΐνης PNLDC1 και 1, 2 της πρωτεΐνης PARN παρουσιάζουν καλύτερη ενεργότητα. Τα κλάσματα αυτά συμπυκνώθηκαν με τη βοήθεια μεμβράνης διαπίδυσης και PEG και έπειτα ακολούθησε διαπίδυση Ο/Ν στους 4 Ο C σε διάλυμα στο οποίο θα πραγματοποιηθεί η αντίδραση (dialysis buffer). 4. Screening των δραστικών ενώσεων και υπολογισμός του IC 50 Οι 12 ενώσεις που αγοράστηκαν (Πίνακας 2) αναδιαλύθηκαν σε 100% DMSO και φυλάχθηκαν στην κατάψυξη, -20 Ο C. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε έλεγχος της δραστικότητας των ενώσεων με μία υψηλή συγκέντρωση, 500 μm. Οι συνθήκες αντίδρασης ήταν αυτές που περιγράφηκαν παραπάνω. Να σημειωθεί ότι έγινε προ-επώαση του αναστολέα με το ένζυμο πριν την προσθήκη του υποστρώματος και ότι ο χρόνος αντίδρασης ήταν 30 min για την PNLDC1 ενώ 2 min για την PARN. Παρατηρείται πως 5 ενώσεις από τις 12 συνολικά εμφανίζουν δραστικότητα. Οι ASN , ASN και ASN στοχεύουν και τα δύο ένζυμα αναστέλλοντας τη δράση τους. Η ASN φαίνεται, in vitro τουλάχιστον, να προκαλεί αναστολή μόνο της PNLDC1 και τέλος, ενδιαφέρον αποτέλεσε το γεγονός ότι η ASN στοχεύει μόνο την PARN προκαλώντας ενεργοποίηση του ενζύμου (Εικόνα 29).

69 Αποτελέσματα 69 Εικόνα 29: In vitro δοκιμασία αποαδενυλίωσης με ραδιενεργά σημασμένο ολιγοριβονουκλεοτίδιο και για τα δύο ένζυμα παρουσία και μη αναστολέα. Η αντιδράσεις αναλύθηκαν σε πηκτή ακρυλαμιδίου με αποδιατακτικές συνθήκες και η οπτικοποίηση έγινε μέσω Phosphorimager FLA 3000 (FUJIFILM). Ως IC 50 ορίζουμε το μέτρο της αποτελεσματικότητας μιας ουσίας στην αναστολή συγκεκριμένης βιολογικής ή βιοχημικής λειτουργίας. Η τιμή αυτή αποτελεί δείκτη του κατά πόσο ένα συγκεκριμένο φάρμακο είναι ικανό για να αναστείλει μία βιολογική διεργασία ή κάποιο ρυθμιστή αυτής κατά το ήμισυ. Σύμφωνα με το FDA, το IC 50 αντιπροσωπεύει τη συγκέντρωση του φαρμάκου που απαιτείται για 50% αναστολή in vitro. Εικόνα 30: Διαγράμματα για τον υπολογισμό του IC 50 των ενώσεων με την αποαδενυλάση PARN. Για τη δημιουργία τους έγινε χρήση του προγράμματος GraphPad Prism 6. Με το βελάκι φαίνεται η ενεργοποίηση που προκαλεί η ένωση ASN στην PARN σε χαμηλές συγκεντρώσεις (1 μm).

70 Αποτελέσματα 70 Ο υπολογισμός του για κάποιο φάρμακο μπορεί να πραγματοποιηθεί κατασκευάζοντας μία καμπύλη δόσης-απόκρισης. Στη παρούσα εργασία ετοιμάζονται αντιδράσεις ξεκινώντας από μηδενική συγκέντρωση αναστολέα μέχρι και 200 μm. Ακολουθεί ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτικό PAGE 8M Urea, ανάλυση και ποσοτικοποίηση των ζωνών μέσω Phosphorimager FLA 3000 (FUJIFILM) και του προγράμματος PCBAS/AIDA (Raytest) αντίστοιχα. Η επεξεργασία των δεδομένων έγινε με το GraphPad Prism 6 και τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται (Εικόνα 30, Εικόνα 31) προέκυψαν από τρία, ανεξάρτητα μεταξύ τους, πειράματα. Εικόνα 31: Διαγράμματα για τον υπολογισμό του IC 50 των ενώσεων με την αποαδενυλάση PNLDC1. Για τη δημιουργία τους έγινε χρήση του προγράμματος GraphPad Prism 6. Οι τιμές IC 50 των υπό μελέτη ενώσεων που προέκυψαν από τα παραπάνω πειράματα συγκεντρώθηκαν στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 6). Παρατηρείται ότι η ένωση ASN εμφανίζει την καλύτερη δραστικότητα και στις δύο αποαδενυλάσες. Η ένωση ASN φαίνεται ότι προκαλεί ενεργοποίηση της PARN σε μικρές συγκεντρώσεις (περίπου 1 μm) ενώ όσο η συγκέντρωσή της αυξάνεται η αντίδραση φαίνεται να μην επηρεάζεται. Τέλος, παρατηρήθηκε ότι σε όλες τις ενώσεις η τιμή IC 50 είναι μεγαλύτερη για την PNLDC1 από ότι για την PARN. Ωστόσο, αυτό μπορεί να οφείλεται και στο γεγονός ότι η PNLDC1 είναι ένα πολύ πιο αργό ένζυμο, όπως έχουν φανερώσει μελέτες από το εργαστήριό μας, και για

71 Αποτελέσματα 71 το λόγο αυτό ο χρόνος αντίδρασης είναι μεγαλύτερος. Αυτό έχει σαν συνέπεια να υπάρχει μεγαλύτερο ποσοστό τυχαίας υδρόλυσης του υποστρώματος και για αυτό να παρατηρούνται τα συγκεκριμένα αποτελέσματα. 5. Μελέτη της μεταβολής των κινητικών σταθερών Για τα πειράματα κινητικών αναλύσεων οι ενζυμικές αντιδράσεις περιγράφονται από το πρότυπο Michaelis-Menten. Σύμφωνα με αυτό ο χρόνος αντίδρασης πρέπει να βρίσκεται στο γραμμικό τμήμα της χρονοκαμπύλης της επώασης του ενζύμου, ώστε να ισχύει U 0 =U αρχ. Η πειραματική διαδικασία περιεγράφηκε στο κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι και τα αποτελέσματα προέκυψαν από αυτοραδιογραφία μέσω Phosphorimager FLA 3000 (FUJIFILM) και ποσοτικοποίηση με το πρόγραμμα PCBAS/AIDA (Raytest). Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με τη χρήση του προγράμματος GraphPad Prism 6 και Excel Microsoft Office Ο χρόνος αντίδρασης για την PARN είναι 5 ενώ για την PNLDC1 30 λεπτά στους 37 o C. Παρακάτω παρουσιάζονται τα διαγράμματα Michaelis menten και Lineweaver Burk τόσο για την PARN όσο και για την PNLDC1. Οι ενώσεις στις οποίες πραγματοποιήθηκε κινητική ανάλυση με την PNLDC1 είναι οι ASN , ASN , ASN και ASN Εικόνα 32: Κινητική ανάλυση της ένωσης ASN με τη πρωτεΐνη PNLDC1 (διαγράμματα Michaelis menten και Lineweaver Burk). Η τιμή K i που προκύπτει από το διάγραμμα διπλού αντιστρόφου (Lineweaver Burk) είναι μm.

72 Αποτελέσματα 72 Εικόνα 33: Κινητική ανάλυση της ένωσης ASN με τη πρωτεΐνη PNLDC1 (διαγράμματα Michaelis menten και Lineweaver Burk). Η τιμή Ki που προκύπτει από το διάγραμμα διπλού αντιστρόφου (Lineweaver Burk) είναι μm. Εικόνα 34: Κινητική ανάλυση της ένωσης ASN με τη πρωτεΐνη PNLDC1 (διαγράμματα Michaelis menten και Lineweaver Burk). Η τιμή Ki που προκύπτει από το διάγραμμα διπλού αντιστρόφου (Lineweaver Burk) είναι μm. Εικόνα 35: Κινητική ανάλυση της ένωσης ASN με τη πρωτεΐνη PNLDC1 (διαγράμματα Michaelis menten και Lineweaver Burk). Η τιμή Ki που προκύπτει από το διάγραμμα διπλού αντιστρόφου (Lineweaver Burk) είναι μm.

73 Αποτελέσματα 73 Εικόνα 36: Η αντίδραση ενός συναγωνιστικού αναστολές που αντιδρά με ένα ελεύθερο ένζυμο. Οι παραπάνω ενώσεις φαίνεται ότι προκαλλούν συναγωνιστική αναστολή καθώς τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η Vmax δεν αλλάζει. Έτσι στα γραφήματα διπλού αντιστρόφου οι γραμμές της ταχύτητας τόσο κατά την παρουσία αναστολέα όσο και κατά την απουσία αυτού τέμνονται στον άξονα ψ. Η παρουσία όμως του αναστολέα έχει ως αποτέλεσμα να γίνει πιο αργή η αντίδραση σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις υποστρώματος. Μόνο αν η συγκέντρωση αυτή είναι πολύ μεγαλύτερη από την νέα Km (Km app ) προκύπτει η Vmax. Παρακάτω φαίνεται το κινητικό σχήμα της συναγωνιστικής αναστολής. Οι τιμές K i παρουσιάζονται μαζί με αυτές των IC 50 στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 6). Στην συνέχεια, παρουσιάζονται τα αποτελέσματα που προέκυψαν έπειτα από μελέτη με τη ριβονουκλεάση PARN και τις ενώσεις ASN , ASN , ASN και ASN Εικόνα 37: Κινητική ανάλυση της ένωσης ASN με τη πρωτεΐνη PARN (διαγράμματα Michaelis menten και Lineweaver Burk). Η τιμή Ki που προκύπτει από το διάγραμμα διπλού αντιστρόφου (Lineweaver Burk) είναι 5.26 μm.

74 Αποτελέσματα 74 Εικόνα 38: Κινητική ανάλυση της ένωσης ASN με τη πρωτεΐνη PARN (διαγράμματα Michaelis menten και Lineweaver Burk). Η τιμή Ki που προκύπτει από το διάγραμμα διπλού αντιστρόφου (Lineweaver Burk) είναι μm. Εικόνα 39: Κινητική ανάλυση της ένωσης ASN με τη πρωτεΐνη PARN (διαγράμματα Michaelis menten και Lineweaver Burk). Εικόνα 39: Κινητική ανάλυση της ένωσης ASN με τη πρωτεΐνη PARN (διαγράμματα Michaelis menten και Lineweaver Burk). Η τιμή Ki που προκύπτει από το διάγραμμα διπλού αντιστρόφου (Lineweaver Burk) είναι μm.

75 Αποτελέσματα 75 Τα αποτελέσματα και αυτών των ενώσεων δείχνουν συναγωνιστική αναστολή του εν λόγου ενζύμου. Να σημειωθεί ότι η ένωση ASN προκαλεί, όπως έχει ήδη αναφερθεί, ενεργοποίηση της ριβονουκλεάσης PARN (Εικόνα 41). Από την ανάλυση φαίνεται ότι η ταχύτητα της αντίδρασης αυξάνεται κατά πολύ καθώς είναι σχεδόν η διπλάσια. Αντίθετα, στην τιμή της Km παρατηρείται μία μικρή μείωση από σε μm. Οι παραπάνω αναλύσεις φανερώνουν νέους ρυθμιστές της δράσης των ενζύμων PNLDC1 και PARN οι οποίοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως βάση για περαιτέρω μελέτες και ανάπτυξη ακόμη πιο ισχυρών ενώσεων. Ακολουθεί ένας πίνακας στον οποίο φαίνονται οι τιμές IC 50 και K i για κάθε ένωση σε σχέση με κάθε ένζυμο (Πίνακας 6). ID Number IC 50 PNLDC1 K i PNLDC1 IC 50 PARN K i PARN ASN μm μm 4 μm 5.26 μm ASN μm μm No Effect No Effect ASN μm μm 1 μm μm ASN No Effect No Effect Act/on Act/on ASN μm μm 16 μm μm Πίνακας 6: Απεικόνιση των τιμών IC 50 και K i των υπό μελέτη ενώσεων και για τις δύο DEDD τύπου αποαδενυλάσες.

76 Αποτελέσματα Μέθοδος MTT για έλεγχο κυτταρικής βιωσιμότητας Κρίθηκε σκόπιμο να ελεγχθεί η επίδραση των παραπάνω ενώσεων οι οποίες in vitro φανέρωσαν δραστικότητα, στην κυτταρική βιωσιμότητα και με αυτόν τον τρόπο να καθοριστεί η κατάλληλη χρησιμοποιούμενη συγκέντρωση για περαιτέρω in vivo μελέτες. Για την πραγματοποίηση ελέγχου της κυτταροτοξικότητας χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος MTT όπως ήδη έχει αναφερθεί, η οποία επιτρέπει τον προσδιορισμό της κυτταρικής βιωσιμότητας μέσω υπολογισμού της μεταβολικής ενεργότητας. Ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα A549, επωάστηκαν για 24 με αυξανόμενες συγκεντρώσεις των ενώσεων από 1 μέχρι και 200 μm (1 μm, 5 μm, 10 μm, 25 μm, 50 μm, 100 μm και 200 μm). Το επί τις εκατό ποσοστό της κυτταρικής βιωσιμότητας υπολογίσθηκε με βάση την τιμή της απορρόφησης στα 495 nm. Ως 100% κυτταρική βιωσιμότητα ορίστηκε η τιμή της απορρόφησης, στο ίδιο μήκος κύματος, για κύτταρα που επωάστηκαν μόνο με DMSO και με βάση αυτήν έγινε κανονικοποίηση των τιμών απορρόφησης των κυττάρων που επωάστηκαν με τις ενώσεις. Οι μετρήσεις προέκυψαν από τη συσκευή Molecular Devices SpectraMax 250 και αναλύθηκαν στο πρόγραμμα GraphPad Prism 6. Τα αποτελέσματα φαίνονται στα παρακάτω γραφήματα (Εικόνα 44). Εικόνα 44: Διαγράμματα απεικόνισης της κυτταρικής βιωσιμότητας μετά από επώαση των κυττάρων με τις υπό μελέτη ενώσεις σε διάφορες συγκεντρώσεις. Παρατηρείται πως οι ενώσεις ASN και ASN είναι αυτές που προκαλούν μεγαλύτερη κυτταροτοξικότητα σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες από 100 μm (A). Στο διάγραμμα (B) αναπαρίστανται οι ενώσεις ASN , ASN και ASN οι οποίες φαίνεται να εμφανίζουν περιορισμένη κυτταροτοξικότητα. Οι χημικές ενώσεις ASN , ASN και ASN παρουσίασαν περιορισμένου βαθμού κυτταροτοξικότητα. Αντίθετα, οι ενώσεις ASN και ASN φαίνεται ότι εμποδίζουν τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε υψηλές συγκεντρώσεις (μεγαλύτερες από 100 μm). Τα αποτελέσματα προέκυψαν από τρία ανεξάρτητα μεταξύ τους πειράματα.

77 Αποτελέσματα Ανάλυση του κυτταρικού κύκλου καρκινικών κυττάρων A549 μετά από επώαση με τις δραστικές ενώσεις Θέλοντας να ελέγξουμε τη δράση των συγκεκριμένων ενώσεων in vivo και να μελετήσουμε τις συνέπειες της αναστολής της διαδικασίας της αποαδενυλίωσης προχωρήσαμε σε ανάλυση του κυτταρικού κύκλου των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων A549 μετά από επώαση με τους παραπάνω αναστολείς. Ο διαχωρισμός των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια κυτταρομετρητή ροής (FACS), με βάση την ποσότητα του γενετικού τους υλικού. Τα κύτταρα τα οποία βρίσκονται στη G1 φάση χαρακτηρίζονται από διπλοειδή ποσότητα γενετικού υλικού (2N), ενώ τα κύτταρα τα οποία έχουν περάσει από τη φάση S, έχουν αντιγράψει το γενετικό τους υλικό και βρίσκονται στην G2/M φάση, χαρακτηρίζονται από διπλάσια ποσότητα γενετικού υλικού (4N). Η συγκεντρώσεις των αναστολέων που πραγματοποιήθηκε η διαδικασία ήταν 50 και 100 μm. Όπως προέκυψε από το πείραμα με τη μέθοδο MTT οι συγκεντρώσεις αυτές δεν προκαλούν αυξημένα επίπεδα κυτταροτοξικότητας. Παρακάτω φαίνονται τα αποτελέσματα από πειράματα κυτταρομετρίας ροής έπειτα από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο. Κάθε ανάλυση έχει προέλθει από μέτρηση κυττάρων. Εικόνα 45: Απεικόνιση του προφίλ του κυτταρικού κύκλου των καρκινικών κυττάρων A549 έπειτα από επώαση με DMSO και χρώση με ιωδιούχο προπίδιο. Παρατηρούμε ότι στην G1 φάση βρίσκεται περίπου το 48% των κυττάρων, στην S φάση το 23% και τέλος στην G2/M το 15%. Στην συνέχεια ακολουθούν προφίλ του κυτταρικού κύκλου των καρκινικών κυττάρων A549 για κάθε μία ένωση τόσο για συγκέντρωση 50 όσο και 100 μm. Τα αποτελέσματα αναπαρίστανται και με τη μορφή γραφήματος. Για όλα τα παρακάτω έχει πραγματοποιηθεί στατιστική ανάλυση και το p value για κάθε γράφημα είναι <

78 Αποτελέσματα 78 Εικόνα 46: Προφίλ κυτταρικού κύκλου των καρκινικών κυττάρων A549 έπειτα από επώαση με την ένωση ASN και γραφική απεικόνιση των αποτελεσμάτων σε σχέση με control κύτταρα που έχουν επωαστεί μόνο με DMSO (p<0.0001). Παρατηρούμε ότι η ένωση ASN προκαλεί σημαντική αύξηση (από τα 50 κιόλας μm) του ποσοστού των κυττάρων που βρίσκονται στην G0/G1 φάση (από 48% στο 63%) και μείωση κυρίως αυτών που βρίσκονται στην S (από 23% στο 13%) φάση αλλά και αυτών στην G2/M (από 14% στο 10%). Τα συγκεκριμένα αποτελέσματα προτείνουν ότι η παραπάνω ένωση προκαλεί αναστολή της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου κατά το στάδιο μετάβασης G1/S. Η παρατήρηση αυτή ενισχύεται και από τα προηγούμενα in vitro αποτελέσματα αναστολής της PARN, και πιθανόν πολλών άλλων DEDD αποαδενυλασών, καθώς βιβλιογραφικά είναι γνωστό πως αποσιώπηση της PARN προκαλεί επίσης αναστολή της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου κατά το στάδιο μετάβασης G1/S (63). Η ίδια παρατήρηση προκύπτει και από τα αποτελέσματα της ανάλυσης του κυτταρικού κύκλου μετά από επώαση των κυττάρων με τις ενώσεις ASN και ASN με τη διαφορά ότι δε παρατηρείται μείωση της φάσης G2/M.

79 Αποτελέσματα 79 Εικόνα 47: Προφίλ κυτταρικού κύκλου των καρκινικών κυττάρων A549 έπειτα από επώαση με τις ενώσεις ASN και ASN καθώς και γραφική απεικόνιση των αποτελεσμάτων σε σχέση με control κύτταρα που έχουν επωαστεί μόνο με DMSO (p<0.0001).

80 Αποτελέσματα 80 Η ένωση ASN προκαλεί το ίδιο αποτέλεσμα με τις δύο προηγούμενες αλλά στη υψηλότερη συγκέντρωση που χρησιμοποιήθηκε (100 μm). Στις εικόνες που ακολουθούν φαίνεται η ανάλυση των αποτελεσμάτων της κυτταρομετρίας ροής από τις ενώσεις ASN και ASN οι οποίες όμως δεν φαίνεται να έχουν δραστικότητα in vivo. Εικόνα 45: Προφίλ κυτταρικού κύκλου των καρκινικών κυττάρων A549 έπειτα από επώαση με την ένωση ASN και γραφική απεικόνιση των αποτελεσμάτων σε σχέση με control κύτταρα που έχουν επωαστεί μόνο με DMSO (p<0.0001).

81 Αποτελέσματα 81 Εικόνα 46: Προφίλ κυτταρικού κύκλου των καρκινικών κυττάρων A549 έπειτα από επώαση με την ένωση ASN και γραφική απεικόνιση των αποτελεσμάτων σε σχέση με control κύτταρα που έχουν επωαστεί μόνο με DMSO (p<0.0001). Τα παραπάνω αποτελέσματα φανερώνουν ότι οι ενώσεις ASN , ASN και ASN είναι πιθανόν, μέσω της αναστολής DEDD τύπου αποαδενυλασών, να χρησιμοποιηθούν πέρα από τον έλεγχο και τη ρύθμιση της λειτουργίας των συγκεκριμένων ενζύμων και ως μία αντικαρκινική στρατηγική καθώς εμποδίζουν την αντιγραφή και κατά συνέπεια την ομαλή λειτουργία του κυττάρου. Περαιτέρω έλεγχος της δράσης των ενώσεων αυτών σε ανθρώπινα φυσιολογικά κύτταρα κρίνεται αναγκαίος για να διερευνηθεί η ενδεχόμενη επιλεκτική δράση τους έναντι των καρκινικών κυττάρων.

82 Αποτελέσματα Ανάλυση του κυτταρικού κύκλου εμβρυικών βλαστικών κυττάρων μετά από επώαση με τις δραστικές ενώσεις Οι παραπάνω ενώσεις δοκιμάστηκαν in vivo και σε εμβρυικά βλαστικά κύτταρα ποντικού (E-14). Μελέτες από το εργαστήριό μας έχουν δείξει ότι τα κύτταρα αυτά εκφράζουν την PNLDC1, η οποία δε φαίνεται να εκφράζεται σε διαφοροποιημένα κύτταρα. Ένα άλλο χαρακτηριστικό των κυττάρων αυτών είναι ότι ο κυτταρικός κύκλος τους έχει μικρή διάρκεια, 11 με 16 ώρες, η οποία αποδίδεται στη βραχυμένη G1 φάση της οποίας η διάρκεια υπολογίζεται στις 2 ώρες. Η λειτουργική σημασία της διάρκειας αυτής εξηγείται από το γεγονός ότι τα κύτταρα αυτά επιτελούν δύο κύριες για αυτά διαδικασίες, αυτοανανέωση και ταχύ πολλαπλασιασμό. Η πειραματική διαδικασία που ακολουθήθηκε ήταν η ίδια με αυτήν που πραγματοποιήθηκε και με τα κύτταρα A549. Οι συγκεντρώσεις φαρμάκων με τα οποία έγινε η επώαση των κυττάρων ήταν 50 και 100 μm. Τα αποτελέσματα φανέρωσαν δύο ενώσεις οι οποίες φαίνεται να επηρεάζουν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Αυτές είναι οι ASN και ASN Εικόνα 47: Απεικόνιση του προφίλ του κυτταρικού κύκλου εμβρυικών βλαστικών κυττάρων ποντικού (E-14) έπειτα από επώαση με DMSO και χρώση με ιωδιούχο προπίδιο. Παρατηρούμε ότι στην G1 φάση βρίσκεται περίπου το 18% των κυττάρων, στην S φάση το 30% και τέλος στην G2/M το 25%.

83 Αποτελέσματα 83 Εικόνα 48: Προφίλ κυτταρικού κύκλου των E-14 έπειτα από επώαση με τις ενώσεις ASN και ASN καθώς και γραφική απεικόνιση των αποτελεσμάτων σε σχέση με control κύτταρα που έχουν επωαστεί μόνο με DMSO (p<0.0001).

84 Αποτελέσματα 84 Τα παραπάνω αποτελέσματα φανερώνουν ότι οι ενώσεις ASN και ASN προκαλούν αύξηση του αριθμού των κυττάρων που βρίσκονται στην S φάση του κυτταρικού κύκλου και συγχρόνως μείωση της φάσης G2/M σε σχέση με κύτταρα που επωάστηκαν μόνο με DMSO. Οι υπόλοιπες ενώσεις που φανέρωσαν δραστικότητα in vitro δε φαίνεται να επηρεάζουν σε μεγάλο βαθμό τα E-14 κύτταρα. Παρακάτω φαίνεται η ανάλυση των αποτελεσμάτων που προέκυψαν έπειτα από επώαση των κυττάρων με την ένωση ASN Εικόνα 49: Προφίλ κυτταρικού κύκλου των καρκινικών κυττάρων A549 έπειτα από επώαση με την ένωση ASN και γραφική απεικόνιση των αποτελεσμάτων σε σχέση με control κύτταρα που έχουν επωαστεί μόνο με DMSO (p=0.0002). Παρατηρούμε ότι υπάρχει μία τάση αύξησης της S φάσης. Λαμβάνοντας υπόψη ότι δε συνοδεύεται από μείωση της G2/M και ότι τα κύτταρα αυτά, όπως έχει ήδη αναφερθεί, έχουν αυξημένα ποσοστά S φάσης εξ αιτίας της μικρής διάρκειας της G1 φάσης δεν μπορούμε να είμαστε σίγουροι για το αν προκαλεί αλλαγή στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Στην συνέχεια απεικονίζονται τα αποτελέσματα με τις ενώσεις ASN και ASN

85 Αποτελέσματα 85 Εικόνα 50: Προφίλ κυτταρικού κύκλου των E-14 έπειτα από επώαση με τις ενώσεις ASN (p=0.0009) και ASN (p=0.001) καθώς και γραφική απεικόνιση των αποτελεσμάτων σε σχέση με control κύτταρα που έχουν επωαστεί μόνο με DMSO.

86 Συζήτηση 86 Συζήτηση

87 Συζήτηση 87 Συζήτηση Η γονιδιακή έκφραση στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς ρυθμίζεται έτσι ώστε να παρέχει τη κατάλληλη απάντηση στις βιολογικές ανάγκες. Η μεταγραφή αποτελεί κύριο στάδιο ελέγχου της παραπάνω διαδικασίας. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν πως η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης επιτελείται από μηχανισμούς που απαντώνται σε όλες τις κρίσιμες βιολογικές διεργασίες (αντιγραφή, μεταγραφή και μετάφραση). Είναι λοιπόν ξεκάθαρο ότι η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης ελέγχεται στενά σε όλα τα στάδια της ροής της γενετικής πληροφορίας. Το RNA κατέχει μία ξεχωριστή θέση στη διαδικασία αυτή καθώς RNA μόρια παίζουν σημαντικό ρόλο σε μηχανισμούς γονιδιακής έκφρασης (79) (Εικόνα 48). Εικόνα 48: Σχηματική απεικόνιση της ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης κυρίως στο επίπεδο της μεταγραφής. Το mrna είναι το μόριο εκείνο του οποίου ο κύκλος ζωής θα καθορίσει σε μεγάλο βαθμό την γονιδιακή έκφραση. Τα σημεία ελέγχου ξεκινούν από το στάδιο ωρίμανσης μέχρι και το στάδιο αποικοδόμησης των mrnas. Η αποικοδόμηση συνήθως ξεκινά από τη βράχυνση της poly(a) ουράς με τη διαδικασία της αποαδενυλίωσης. Γίνεται λοιπόν αντιληπτό πως η αποαδενυλίωση ελέγχει τη ρύθμιση της αποικοδόμησης και της αποσιώπισης του mrna και κατά συνέπεια παίζει σημαντικό ρόλο στην ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης.

88 Συζήτηση 88 Οι αποαδενυλάσες είναι εξωριβονουκλεάσες εξαρτώμενες από μαγνήσιο που υδρολύουν το mrna με κατεύθυνση από το 3 άκρο προς το 5, παράγοντας 5 -AMP. Ανάλογα με τα αμινοξικά κατάλοιπα του ενεργού κέντρου όλες οι αποαδενυλάσες χωρίζονται σε δύο κύριες ομάδες, την DEDD και την EEP. Η ερευνητική μας ομάδα έχει επικεντρώσει τη μελέτη της σε DEDD τύπου αποαδενυλάσες και συγκεκριμένα σε μία νέα ανθρώπινη αποαδενυλάση, την PNLDC1. Η πρωτεΐνη αυτή παρουσιάζει ομολογία με την πιο καλά χαρακτηρισμένη, DEDD τύπου αποαδενυλάση, PARN. Η έκφραση της PNLDC1 ελέγχεται αυστηρά από μία μεθυλοτρανσφεράση, την DNMT3b (39) και αποτελέσματα από το εργαστήριό μας δείχνουν ότι η έκφρασή της επάγεται από κύτταρα έπειτα από χορήγηση του απομεθυλιωτικού παράγοντα 5 -Aza-Deoxycytidine. Επίσης, το γονίδιο αυτό εκφράζεται σε εμβρυικά βλαστικά κύτταρα (E-14) και σε ιστό όρχεων ποντικού. Η έκφραση αυτή όμως φαίνεται να χάνεται κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης. Τέλος, θα πρέπει να αναφερθεί πως αποτελέσματα του εργαστηρίου μας που αφορούν την PARN, δείχνουν ότι υπερεκφράζεται στον καρκίνο του πνεύμονα. Τα αποτελέσματα αυτά προκύπτουν από μελέτη ανθρώπινων ιστών αλλά και από ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα όπως είναι τα κύτταρα A549, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία. Όσον αφορά στην PNLDC1, τα όσα γνωρίζουμε για τη δράση και το ρόλο της προέρχονται από μελέτες προς δημοσίευση από το εργαστήριό μας. Αντίθετα, το αντίκτυπο της PARN στην γονιδιακή έκφραση έχει μελετηθεί πρόσφατα. Έχει δειχθεί ότι σε μυοβλάστες ποντικού ότι μετά από αποσιώπηση της PARN προκαλείται σταθεροποίηση 40 μορίων mrna, συμπεριλαμβανομένων των παραγόντων που απαιτούνται για την κυτταρική μετανάστευση και προσκόλληση (80,81). Πολλές μελέτες έχουν ως στόχο τη διαλεύκανση του ρόλου της PARN στον καρκίνο. Υπάρχει συσχετισμός της με γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο, έχει δειχθεί ότι ενεργοποιείται από τον όγκο καταστολέα BARD1 και έχει προταθεί ότι θα μπορούσε να ενεργήσει ως ένα ογκοκατασταλτικό (65,82). Στην οξεία λευχαιμία, η έκφραση της PARN αυξάνεται και το καθεστώς φωσφορυλίωσής της μεταβάλλεται υποδηλώνοντας μια πιθανή χρήση ως βιοδείκτη (83). Πρόσφατες μελέτες που αφορούν περιπτώσεις γαστρικού καρκίνου επικεντρώνονται στη μελέτη της έκφρασης της PARN χρησιμοποιώντας τις κυτταρικές σειρές ΜΚΝ28 και AGS. Αποσιώπηση της PARN οδηγεί σε αναστολή του πολλαπλασιασμού και της της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου μέσω υπερέκφρασης του p21 (Εικόνα 51). Αν και οι δύο κυτταρικές σειρές ήταν γαστρικής προέλευσης, φανέρωσαν ετερογένεια στην έκφραση του mrna p21 προτείνοντας αντισταθμιστική υπερέκφραση άλλων αποαδενυλασών, ή σταθεροποίησή του ίδιου λόγω της αποσιώπισης (63). Τέλος, πρόσφατα έχει γίνει γνωστή η συμμετοχή της PARN στον καρκίνο του πνεύμονα και

89 Συζήτηση 89 συγκεκριμένα σε ασθενείς με καρκίνωμα πλακώδων κυττάρων (squamous cell carcinoma, SCC) (84). Είναι γνωστό ότι η αποαδενυλίωση αποτελεί ένα καθοριστικό βήμα για την διαφοροποίηση ενώ φαίνεται να εμπλέκεται και να συσχετίζεται με διαφόρους τύπους κακρίνου. Επιπρόσθετα, η αναστολή των αποαδενυλασών έχει προταθεί σαν μία αντικαρκινική στρατηγική καθώς ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων απαιτεί συνεχή και ελεγχόμενη ανακύκλωση των μορίων mrna. Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν ο προσδιορισμός νέων αναστολέων των DEDD αποαδενυλασών και η μελέτη της δράσης τους τόσο in vitro όσο και in vivo. Βασιζόμενοι στην ήδη υπάρχουσα κρυσταλλική δομή της PARN (PDB ID 2A1R) πραγματοποιήσαμε προσομοίωση μοριακής δυναμικής του ενεργού κέντρου της PNLDC1. Έπειτα, μετά από in silico σάρωση βιβλιοθήκης χημικών ενώσεων καταλήξαμε σε δώδεκα ισχυρούς προσδέτες τους οποίους και μελετήσαμε. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι 5 από αυτούς εμφανίζουν δραστικότητα in vitro. Συγκεκριμένα, οι 2 στοχεύουν και τα δύο ένζυμα αναστέλλοντάς τα και από μία από τις ενώσεις βρέθηκε να προκαλεί αναστολή της PNLDC1 και ενεργοποίηση της PARN, αντίστοιχα. Τα IC 50 και Ki που υπολογίστηκαν φανερώνουν ότι οι συγκεκριμένοι αναστολείς δρουν σε αρκετά χαμηλές συγκεντρώσεις σε σχέση με τους ήδη γνωστούς αναστολείς που έχουν βρεθεί μέχρι τώρα (76) (Εικόνα 49). Οι χαμηλές τιμές για την K i είναι επιθυμητές έτσι, ώστε να μη χρειάζονται μεγάλες ποσότητες αναστολέων, για να αναστείλουν τη δράση του ενζύμου. Αξίζει να σημειωθεί ότι δεν υπάρχουν μέχρι τώρα μελέτες για εύρεση αναστολέων των DEDD αποαδενυλασών γενικότερα παρά μόνο για συγκεκριμένες αποαδενυλάσες. Εικόνα 49: Δομή αναλόγων νουκλεοτιδίων τα οποία έχει δειχθεί πως αναστέλουν τη δράση της PARN.

90 Συζήτηση 90 Αποτελέσματα από αυτή τη μελέτη φανέρωσαν ότι η ένωση ASN (Πίνακας 2) δρα ως ενεργοποιητής της PARN. Εκτενής μελέτη της συγκεκριμένης ένωσης ίσως οδηγήσει σε ένα αποτελεσματικό φάρμακο για ασθένειες οι οποίες προκαλούνται από μη σωστή λειτουργία του συγκεκριμένου ενζύμου. Το αποτέλεσμα αυτό ενισχύεται από το γεγονός ότι η ένωση αυτή φαίνεται να έχει παρόμοια δομή με την καλύπτρα. Βιβλιογραφικά δεδομένα τονίζουν πως η PARN πρόκειται για ένα ένζυμο το οποίο είναι εξαρτώμενο από την καλύπτρα. Έτσι, πραγματοποιήθηκαν μελέτες για το πώς αυτή μπορεί να επηρεάζει τη PARN, οι οποίες έδειξαν τα παρακάτω: Η καλύπτρα (α) αυξάνει το ποσοστό αποαδενυλίωσης αν παρέχεται in cis (β) αναστέλλει την επεξεργασιμότητα της PARN εάν παρέχεται σε υψηλή συγκέντρωση in trans (γ) διεγείρει την αποαδενυλίωση εάν παρέχεται σε χαμηλή συγκέντρωση in trans και (δ) αυξάνει την δυνατότητα επεξεργασιμότητας της PARN όταν παρέχεται in cis (85). Έχει αποδειχθεί ότι η θέση του καταλυτικού κέντρου του ενζύμου και η θέση πρόσδεσης του cap είναι διαφορετικές (85,86) (Εικόνα 50). Να τονισθεί ότι όταν η ένωση ASN προστίθεται σε υψηλές συγκεντρώσεις (ελέγχθηκαν συγκεντρώσεις μέχρι 500 μm) δε παρατηρείται αναστολή της δράσης του ενζύμου. Εικόνα 50: In silico μοντέλα τα οποία δείχνουν την αλληλεπίδραση του RRM της PARN με την καλύπτρα. Στην συνέχεια, οι ενώσεις που είχαν επίδραση στις υπό εξέταση ριβονουκλεάσες μελετήθηκαν περεταίρω in vivo. Η επιλογή των κυτταρικών σειρών έγινε με βάση τα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας όπως αυτά αναφέρθηκαν πιο πάνω. Παρατηρήθηκε πως 3 από τις ενώσεις αυτές (ASN , ASN και ASN ) φαίνεται να προκαλούν αναστολή της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου και κατά συνέπεια του κυτταρικού πολλαπλασιασμού στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά A549 από καρκίνο του πνεύμονα και 2 από αυτές (ASN και ASN ) στα εμβρυικά βλαστικά κύτταρα E-14. Η διαφορά έγκειται στο ότι