ΔΙΕΙΣΔΥΤΙΚΕΣ ΑΣΠΕΡΓΙΛΛΩΣΕΙΣ: ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΚΑΙ ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ

Transcript

1 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική Περίοδος Β, Τόμος 15, Τεύχος 4, σελ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΕΙΣ ΔΙΕΙΣΔΥΤΙΚΕΣ ΑΣΠΕΡΓΙΛΛΩΣΕΙΣ: ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΚΑΙ ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ Τ-Α. ΒΥΖΑΝΤΙΑΔΗΣ Οι ασπεργιλλώσεις αποτελούν το σημαντικότερο ποσοστό των εν τω βάθει λοιμώξεων από νηματοειδείς μύκητες. Στη σύγχρονη εργαστηριακή πρακτική φαίνεται ότι η συνδυαστική προσέγγιση με τη χρησιμοποίηση φαινοτυπικών, ορολογικών και μοριακών τεχνικών προσφέρει σαφώς καλύτερα διαγνωστικά αποτελέσματα και έγκαιρη, τεκμηριωμένη και αποτελεσματικότερη θεραπευτική αντιμετώπιση. Κοινή είναι η διαπίστωση, σε διεθνές επίπεδο, για τις ασπεργιλλώσεις, πως υπάρχει ανάγκη τυποποίησης των μεθόδων, των οδηγιών και των πρωτοκόλλων μεταξύ των μυκητολογικών εργαστηρίων. Καθώς υπάρχουν κενά ακόμα στην επιλογή και αξιολόγηση των καταλληλότερων μεθοδολογιών, χρειάζεται περαιτέρω έρευνα σε αυτόν τον τομέα. Ταυτόχρονα με τη χρήση και την αξιολόγηση των νέων τεχνικών χρειάζεται περισσότερη προσπάθεια στην εκπαίδευση του ιατρικού και λοιπού επιστημονικού προσωπικού σε θέματα της ταυτοποίησης με ακρίβεια, της άμεσης μικροσκόπησης, της επιλογής και χρήσης των κατάλληλων θρεπτικών υλικών καθώς και αξιολόγηση της κλινικής ωφέλειας και της ανταπόδοσης του κόστους από την εφαρμογή της μιας ή της άλλης μεθοδολογίας. (Λέξεις ευρετηρίου: ασπεργιλλώσεις, εργαστηριακή διάγνωση, παρακολούθηση). Εισαγωγή Το 2008 δημοσιεύθηκαν τα αναθεωρημένα κριτήρια-ορισμοί για τις διεισδυτικές μυκητιάσεις από την ομάδα των EORTC/MSG (European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Α Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Ιατρική Σχολή, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης. Group). Τα κριτήρια αυτά προτάθηκαν ως οδηγός για τον ορισμό της διάγνωσης μιας διεισδυτικής μυκητίασης ως πιθανής ή αποδεδειγμένης 1. Στο κείμενο αυτό, γενικά για τις διεισδυτικές μυκητιάσεις, τα μικροβιολογικά-μυκητολογικά κριτήρια, που όταν υπάρχουν κατατάσσουν τη διάγνωση ως πιθανή, είναι τα άμεσα και τα έμμεσα. Στα άμεσα περιλαμβάνονται η ανεύρεση μυκητιακών στοιχείων με την άμεση μικροσκόπηση στα πτύελα, στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, στις βρογχικές εκκρίσεις και στην αναρρόφηση υλικού από τους παραρρίνιους κόλπους ή

2 Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 4, η ανάπτυξη ενός νηματοειδούς μύκητα σε καλλιέργεια, όπως τα είδη των Aspergillus, Fusarium, Zygomycetes και Scedosporium. Στα έμμεσα περιλαμβάνονται η ανεύρεση αντιγόνων ή συστατικών του κυτταρικού τοιχώματος για την α- σπεργίλλωση το αντιγόνο γαλακτομαννάνης στο πλάσμα, στον ορό, στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό, ενώ γενικά για τις διεισδυτικές μυκητιάσεις (εκτός των κρυπτοκοκκιάσεων και ζυγομυκητιάσεων) η (1,3)-β-D-γλυκάνη στον ορό. Ως αποδεδειγμένη από μικροβιολογικής άποψης θεωρείται μια διεισδυτική μυκητιακή λοίμωξη όταν υπάρχει παρουσία μύκητα (νηματοειδούς ή ζυγομύκητα) στη μικροσκόπηση υλικού που έχει ληφθεί με α- ναρρόφηση με βελόνα ή με βιοψία από φυσιολογικά στείρα περιοχή σε συνδυασμό με αντίστοιχη εικόνα νέκρωσης του ιστού σε παθολογοανατομικό παρασκεύασμα. Επίσης, όταν υπάρχει α- νάπτυξη μύκητα σε καλλιέργεια υλικού που προέρχεται από φυσιολογικά στείρα περιοχή και έχει ληφθεί με αποστειρωμένο τρόπο. Ακόμα, όταν αναπτύσσονται στην καλλιέργεια αίματος νηματοειδείς μύκητες όπως οι μύκητες του γένους Fusarium, ή ζυγομύκητες όπως τα είδη Candida και τα είδη Cryptococcus και Trichosporon. Η α- νάπτυξη ασπεργίλλων στην καλλιέργεια αίματος είναι δύσκολη και σπάνια και όταν συμβαίνει συνήθως θεωρείται επιμόλυνση. Έτσι σε μεγάλη 10ετή μελέτη στις Η.Π.Α. αναφέρεται ότι α- πομονώθηκαν μόλις 37 στελέχη ασπεργίλλων σε καλλιέργειες αίματος και συσχετίσθηκε με κλινική ασπεργίλλωση μόνο το 34% των απομονωθέντων στελεχών 2. Ορολογικά, η ανίχνευση του αντιγόνου του κρυπτοκόκκου στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό παρέχει επιβεβαίωση διάγνωσης. Όλα αυτά τα κριτήρια βέβαια αντιμετωπίζονται στο πλαίσιο της κλινικής ένδειξης και σε συνδυασμό με τα παθολογοανατομικά, κυτταρολογικά και ακτινολογικά ευρήματα. Όσον αφορά στις μοριακές μεθόδους παρόλο που υπήρχε η ελπίδα, ότι μετά τη δημοσίευση 3 των πρώτων κριτηρίων το 2002, θα είχαν εντωμεταξύ βελτιωθεί πολύ, ώστε να περιληφθούν τα αποτελέσματά τους στους καινούργιους ορισμούς, δεν συμπεριλήφθηκαν τελικά, καθώς θεωρήθηκε ότι δεν είχαν ακόμα αποδεκτά επίπεδα τυποποίησης και κυρίως κλινικής αξιολόγησης 1,3. Με αφορμή και οδηγό τις παραπάνω κατευθύνσεις μπορεί να γίνει η καταγραφή των σύγχρονων και απαραίτητων διαγνωστικών στόχων, γενικά για τις διεισδυτικές μυκητιάσεις, αλλά και ειδικότερα για τις ασπεργιλλώσεις, που είναι και το θέμα της συγκεκριμένης ανασκόπησης. Ταυτόχρονα μπορούν να φανούν και οι δυνατότητες που υπάρχουν στην προσέγγιση αυτών των στόχων. Διεθνώς, η προσπάθεια που γίνεται συνολικά αποσκοπεί συνδυαστικά και βάσει κριτηρίων να προσεγγιστεί ταχύτερα και με μεγαλύτερα ποσοστά επιτυχίας η διάγνωση και τεκμηρίωση της μυκητιακής λοίμωξης. Με δεδομένο την ύπαρξη ποικίλων προβλημάτων στην προσπάθεια διάγνωσης, αξιολόγησης και θεραπείας των μυκητιακών λοιμώξεων και ιδίως των απειλητικών για τη ζωή και, καθώς ήταν γνωστό ότι ήδη περίπου 30 εκατομμύρια βρετανικές λίρες ξοδεύονταν στα νοσοκομεία κάθε χρόνο για αντιμυκητιακή θεραπεία 4 και ό- χι πάντα με τον καλύτερο τρόπο, η Βρετανική Ε- ταιρεία Ιατρικής Μυκητολογίας το 2003 διαπίστωνε, μεταξύ άλλων, ότι οι ακολουθούμενες μεθοδολογίες και οι επιδόσεις των βρετανικών μικροβιολογικών εργαστηρίων σχετικά με τη μυκητολογία απείχαν αρκετά από το ιδεώδες 5,6. Έ- τσι πρότεινε οδηγίες για όλο το εύρος των ιατρικών ειδικοτήτων που εμπλέκονται στη φροντίδα των ασθενών με διεισδυτική μυκητιακή λοίμωξη. Πολύ σημαντικό τμήμα των οδηγιών αυτών είναι και οι συστάσεις που αφορούν στη μικροβιολογική διάγνωση και παρακολούθηση των παραπάνω λοιμώξεων 5. Ειδικά όσον αφορά τους α- σπεργίλλους πρότεινε ότι όλα τα κλινικά στελέχη ασπεργίλλων πρέπει να ταυτοποιούνται μέχρι είδους με παραπομπή σε ειδικό εργαστήριο, αν είναι απαραίτητο. Ενδεικτικό της πολύ σημαντικής συμβολής της σωστής αναγνώρισης είναι το γεγονός ότι όλοι οι μεταμοσχευμένοι ασθενείς ή οι βαριά ουδετεροπενικοί, που παρουσιάζουν καινούργια θετική καλλιέργεια με ασπέργιλλο ή άλλο νηματοειδή μύκητα, πρέπει ιδανικά να λά-

3 176 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία βουν κατάλληλη αντιμυκητιακή θεραπεία εντός έξι ωρών, καθώς η πρώιμη διάγνωση και η κατάλληλη θεραπεία είναι σημαντικές για τη μείωση της θνητότητας 5. Επιπλέον οι ασθενείς με διεισδυτική ασπεργίλλωση χρειάζονται παρατεταμένη νοσηλεία της οποίας το κόστος μπορεί να ανέρχεται μέχρι και ευρώ συνεπώς υπάρχουν σημαντικοί ιατρικοί και κοινωνικοοικονομικοί λόγοι για τους οποίους είναι απαραίτητη η έγκαιρη και ακριβής εργαστηριακή διάγνωση 7. Άμεση μικροσκόπηση Η μικροσκόπηση του κλινικού δείγματος είναι απαραίτητη καθώς η διαγνωστική επιτυχία αυξάνεται συγκριτικά με μόνη την καλλιέργεια. Σε διάφορες κατηγορίες ασθενών, και ιδίως των ανοσοκατεσταλμένων, η μικροσκόπηση του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος π.χ., φαίνεται ότι επιφέρει βελτίωση της πιθανότητας διάγνωσης πάνω από 20% 5,8,9. Η συμπύκνωση του δείγματος με φυγοκέντρηση, όπου είναι δυνατό, και κατόπιν η μικροσκόπηση και η καλλιέργεια υλικού από το ίζημα, βοηθούν στην προσπάθεια ανίχνευσης του μύκητα. Σημαντικό πλεονέκτημα της μικροσκόπησης είναι η ταχύτητα. Καθώς π.χ. η καθυστερημένη διάγνωση μιας πνευμονικής μυκητιακής λοίμωξης από νηματοειδή μύκητα μπορεί να είναι μοιραία, η γρήγορη έκδοση ενός θετικού αποτελέσματος μικροσκόπησης μέσα σε 2-4 ώρες είναι πολύ σημαντική 5. Μπορεί να βοηθήσει στη διάκριση μεταξύ νηματοειδών μυκήτων που παρουσιάζουν υφές με διαφράγματα ή όχι. Διαφράγματα διαθέτουν πολλοί νηματοειδείς μύκητες. Οι πιο συνηθισμένοι στα κλινικά δείγματα, είναι υφομύκητες των γενών Aspergillus, Fusarium και Scedosporium, των οποίων οι υφές είναι σταδιακά διχοτομούμενες (χαρακτηριστικά στους ασπεργίλλους με γωνία 45 ), με παράλληλα τοιχώματα και χωρίς παρουσία χρωστικής. Χωρίς διαφράγματα εμφανίζονται μύκητες της τάξης Mucorales όπως οι Rhizomucor spp., Rhizopus spp., Mucor spp., Absidia spp. και Cunninghamella bertholetiae, των οποίων οι υφές είναι πολύ ευρείες, χωρίς παράλληλα τοιχώματα και οι διακλαδώσεις τους είναι ακανόνιστες και συχνά σε ορθές γωνίες. Άλλο πολύ τυπικό χαρακτηριστικό είναι οι κονιδιακές κεφαλές των α- σπεργίλλων. Το όφελος της μικροσκοπικής αναγνώρισης είναι σημαντικό καθώς η διεισδυτική α- σπεργίλλωση μπορεί να θεραπευτεί με αζόλες ό- πως η ιτρακοναζόλη, η βορικοναζόλη και η ποζακοναζόλη, οι Mucorales όμως μπορούν να αντιμετωπισθούν κυρίως με αμφοτερικίνη Β, αν και φαίνεται πως έχει δράση και η ποζακοναζόλη. Α- κόμα οι λοιμώξεις από ζυγομύκητες συχνά βελτιώνονται ή και θεραπεύονται με τη χειρουργική ε- ξαίρεση του προσβεβλημένου ιστού 5. Έχει επικρατήσει το δείγμα να μικροσκοπείται άμεσα αυτούσιο, αν είναι υγρό ή με την προσθήκη φυσιολογικού ορού ή με λευκό Calcofluor με τη χρησιμοποίηση μικροσκοπίου φθορισμού στα 420 nm. Μπορούν ακόμα να χρησιμοποιηθούν γαλακτοφαινόλη-κυανού του βάμβακος ή κυανό του μεθυλενίου. Το διάλυμα ΚΟΗ 10%- 20%, με ή χωρίς επώαση στους 56 C, είναι πολύ χρήσιμο, ειδικά σε στερεά δείγματα, όπως τμήματα ιστών από βιοψίες. Επίσης το Calcofluor ή το Blankophor μπορούν να συνδυαστούν με ΚΟΗ. Το Blankophor, σε αντίθεση με το Calcofluor, δεν κρυσταλλώνει σε αλκαλικό ph και μπορεί να διατηρηθεί σε διάλυμα εργασίας μέχρι και ένα χρόνο στο ψυγείο, προστατευμένο από το φως 10. Τα μικροσκοπικά κριτήρια, αν και ίσως λιγότερο ευαίσθητα από τα κλινικά, όσον αφορά στη διάγνωση της μυκητιακής νόσου, είναι πολύ σημαντικά για την αντικειμενική διάγνωση. Η ευαισθησία της άμεσης μικροσκόπησης εξαρτάται από την ποιότητα και το είδος του δείγματος, την ποιότητα του μικροσκοπίου και την εμπειρία του μικροσκοπιστή 11. Η μικροσκόπηση σε αυτό το στάδιο και αργότερα στην αρχική ταυτοποίηση του μύκητα, γίνεται με τον μικρής μεγέθυνσης αντικειμενικό φακό ( 10) ή με τον μεγαλύτερης ( 40), για λεπτομερέστερη εξέταση. Τόσο από την εμπειρία του εργαστηρίου μας όσο και άλλων, προκύπτει ότι ο καταδυτικός φακός ( 100) μπορεί να είναι πολύ χρήσιμος και να αποκαλύψει σημαντικά στοιχεία που αλλιώς μπορεί να διαφύγουν 12.

4 Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 4, Φαινοτυπική και μοριακή ταυτοποίηση και διάγνωση Η ακριβής ταυτοποίηση των ιατρικά σημαντικών μυκήτων είναι μια από τις σπουδαιότερες εργασίες του εργαστηρίου κλινικής μυκητολογίας 13. Η ταυτοποίηση στο επίπεδο του είδους ή τουλάχιστον του γένους είναι απαραίτητη για την ορθή και έγκαιρη θεραπεία, τη γνώση και την κατανόηση της παθογένειας και της εξέλιξης της μυκητιακής λοίμωξης, την ανίχνευση πιθανής αντοχής στους αντιμυκητιακούς παράγοντες και την ανίχνευση των αιτίων των νοσοκομειακών λοιμώξεων. Ταυτόχρονα είναι επίσης σημαντικό να αναγνωρίσει κανείς ότι πολλά στελέχη μυκήτων που αναπτύσσονται στα κλινικά δείγματα δεν αντιπροσωπεύουν νόσο. Για το λόγο αυτό, είναι κάθε φορά απαραίτητο να α- ναγνωρίζεται η ύπαρξη ή όχι της κλινικής σχέσης των στελεχών που απομονώνονται Οι ασπέργιλλοι είναι πολύ διαδεδομένοι στη φύση και είναι πιθανό να επιμολύνουν τα κλινικά δείγματα και τα θρεπτικά υλικά. Ο καθορισμός ενός στελέχους που αναπτύσσεται σε μια καλλιέργεια ως κλινικά σημαντικού είναι ορισμένες φορές δύσκολος, ειδικά όταν η μικροσκόπηση του δείγματος είναι αρνητική 15. Η πλειοψηφία των κλινικά σημαντικών ταυτοποιήσεων, ιδίως για τους νηματοειδείς μύκητες, γίνεται φαινοτυπικά με τη χρήση μορφολογικών κριτηρίων 16. Είναι α- λήθεια ότι οι περισσότερες από τις μεθοδολογίες που χρησιμοποιούνται για τη φαινοτυπική αυτή ταυτοποίηση βασίζονται στην εμπειρία και όχι σε συγκριτικές μελέτες Η ακριβής όμως φαινοτυπική ταυτοποίηση έχει γίνει όλο και πιο δύσκολη στην εποχή μας, καθώς οι πρόοδοι στη φυλογενετική ταξινομική έχουν αποκαλύψει την ύπαρξη διαφορετικών «κρυφών» ειδών μεταξύ μορφολογικά πανομοιότυπων στελεχών. Έτσι για παράδειγμα διάφορα νέα είδη ασπεργίλλων έχουν τώρα αναγνωρισθεί και δημοσιευθεί ως είδη της γενικότερης ομάδας Fumigati που περιλαμβάνει και τον ευκαιριακά παθογόνο μύκητα για τον άνθρωπο, τον Aspergillus fumigatus 16. Διαφορετικά είδη του ίδιου γένους μυκήτων μπορεί να έχουν διαφορετική απόκριση στα διάφορα αντιμυκητιακά φάρμακα. Οι ασπέργιλλοι είναι ανθεκτικοί στη φλουκοναζόλη. Ο Aspergillus terreus αντιπροσωπεύει περίπου το 3 με 6% ό- λων των περιπτώσεων διεισδυτικής ασπεργίλλωσης και είναι ανθεκτικός στην αμφοτερικίνη Β, ενώ και ο Aspergillus nidulans δεν ανταποκρίνεται στην αμφοτερικίνη το ίδιο καλά με τον A. fumigatus. Επίσης έχουν αναφερθεί κλινικά στελέχη A. fumigatus με αντοχή στις καινούργιες τριαζόλες Ο Aspergillus niger είναι λιγότερο πιθανό να προκαλέσει πνευμονική νόσο από τον Aspergillus fumigatus στους ασθενείς με λευχαιμία και έτσι αν ανιχνευθεί στην καλλιέργεια του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος είναι πιο πιθανό να είναι αποικιστής παρά αίτιο της διεισδυτικής λοίμωξης, αν και η διάκριση αυτή δεν είναι απόλυτη Έχει φανεί από μελέτες στο παρελθόν ότι η υποκείμενη νόσος είναι καθοριστικός παράγοντας για την αξιολόγηση της σημασίας μιας θετικής καλλιέργειας με ασπέργιλλο σε δείγματα εκκρίσεων του αναπνευστικού συστήματος (πτύελα και τραχειοβρογχικές εκκρίσεις). Η διαγνωστική ειδικότητα και η πιθανότητα κλινικής α- ξιολόγησης της απομόνωσης ασπεργίλλων α- πό τα παραπάνω δείγματα αυξάνει όσο αυξάνει και ο βαθμός της ανοσοκαταστολής των ασθενών. Έτσι στους μη ανοσοκατεσταλμένους η α- πομόνωση αυτή σπανίως είναι ενδεικτική διεισδυτικής πνευμονικής ασπεργίλλωσης. Η παρουσία χρόνιας πνευμονικής νόσου και το κάπνισμα κάνουν τον αποικισμό πιο πιθανό. Επίσης σπάνια σχετίζεται με διεισδυτική ασπεργίλλωση σε ασθενείς με συμπαγείς καρκίνους (και απουσία ουδετεροπενίας). Στους ανοσοκατεσταλμένους, αλλά μη ουδετεροπενικούς, μεταμοσχευμένους ή υπό κορτικοθεραπεία ή πάσχοντες από λέμφωμα, η απομόνωση ασπεργίλλου σε δείγματα από το αναπνευστικό είναι σημαντικός παράγοντας επαγρύπνησης. Στους ουδετεροπενικούς ασθενείς ή σε αυτούς που πάσχουν από λευχαιμία (εκτός της χρόνιας λεμφογενούς) η απομόνωση ασπεργίλλου από τις εκκρίσεις του αναπνευστικού είναι ουσιαστικά διαγνωστική διεισ-

5 178 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία δυτικής πνευμονικής ασπεργίλλωσης 22. Η απομόνωση ειδών ασπεργίλλου από δείγματα του κατώτερου αναπνευστικού και μάλιστα πτυέλων και τραχειοβρογχικών εκκρίσεων έχει σημαντική θετική προγνωστική αξία ανάλογα με την ομάδα κινδύνου: 82% για τους μεταμοσχευμένους μυελού των οστών, 72% για τους ασθενείς με αιματολογικές κακοήθειες, 56% για τους μεταμοσχευμένους συμπαγών οργάνων και 63% για τους ασθενείς υπό κορτικοθεραπεία. Η λήψη των δειγμάτων αυτών και η αποστολή στο εργαστήριο για καλλιέργεια πρέπει να γίνεται επαναλαμβανόμενα, τουλάχιστο τρεις φορές, και ό- σο το δυνατό πιο γρήγορα, μόλις υπάρξει υποψία λοίμωξης, καθώς έτσι αυξάνεται η πιθανότητα έ- γκαιρης ανίχνευσης διεισδυτικής πνευμονικής α- σπεργίλλωσης 23. Είναι δυνατόν να παρατηρείται σχετικά μικρή ανάπτυξη αποικιών ασπεργίλλων στις καλλιέργειες μολυσμένων ιστών και αυτό γιατί συχνά έχει ήδη ξεκινήσει η αντιμυκητιακή αγωγή ή γιατί ίσως ο μύκητας που έχει προσαρμοσθεί και αναπτύσσεται στον ιστό δεν μπορεί γρήγορα να προσαρμόσει το μεταβολισμό του στις συνθήκες της καλλιέργειας in vitro 22,24. Επίσης φαίνεται ότι η ευρεία προφυλακτική και θεραπευτική χρήση της αμφοτερικίνης Β και διαφόρων αζολών πιθανώς έχει οδηγήσει, (τουλάχιστο σε ορισμένα κέντρα) σε συχνότερη εμφάνιση περισσότερο ανθεκτικών ειδών από τον κυρίαρχο παλαιότερα Aspergillus fumigatus 24. Η καλλιέργεια ειδικά για μύκητες, με τη χρήση των κατάλληλων μυκητολογικών θρεπτικών υλικών και των αντίστοιχων συνθηκών επώασης, είναι σαφώς ευνοϊκότερη για την ανάπτυξη των ασπεργίλλων από τη συνήθη καλλιέργεια για μικρόβια και μύκητες σε κοινά μικροβιολογικά υλικά 23. Είναι πάντα ε- πιθυμητή η επιβεβαίωση των πιθανών μικροσκοπικών ευρημάτων, με την ανάπτυξη σε καλλιέργεια οπότε υπάρχει και η δυνατότητα οριστικής ταυτοποίησης. Παρά την ύπαρξη ειδικών μορφολογικών χαρακτηριστικών στη μικροσκόπηση των ασπεργίλλων, η προσπάθεια αναγνώρισής τους μόνο από τη μικροσκόπηση, πιθανόν να μη δίνει σωστό αποτέλεσμα 15. Υλικά που συχνότερα χρησιμοποιούνται είναι το Sabouraud s glucose agar (συνήθως με χλωραμφενικόλη) και το malt extract agar σε διάφορες συγκεντρώσεις (2%, 3% ή 4%). Η cycloheximide (actidione) χρησιμοποιείται για την καταστολή των γρήγορα αναπτυσσόμενων σαπροφυτικών μυκήτων, ι- δίως στις επιφανειακές μυκητιάσεις, αλλά δεν είναι γενικής χρήσης, καθώς μπορεί παθογόνοι μύκητες, όπως οι ασπέργιλλοι και οι ζυγομύκητες, να ανασταλούν. Για την οριστική ταυτοποίηση των ασπεργίλλων η ανακαλλιέργεια σε κάποιο λιγότερο πλούσιο θρεπτικό υλικό, κυρίως στο Czapek Dox agar, που είναι το υλικό εκλογής για την ταυτοποίηση των ασπεργίλλων, θα επιτρέψει την πλουσιότερη σπορογένεση και τη συγκριτική ανάπτυξη όλων των μορφολογικών τους χαρακτηριστικών. Κατόπιν με τη χρησιμοποίηση ειδικών αλγορίθμων ταυτοποίησης (κλείδες) θα γίνει δυνατή η οριστική αναγνώριση του είδους στις περισσότερες περιπτώσεις κλινικών στελεχών. Η εμπειρία δείχνει ότι είναι χρήσιμη τακτική, ιδίως για λόγους μείωσης του χρόνου, να χρησιμοποιούνται ταυτόχρονα υλικά αρχικής καλλιέργειας και ταυτοποίησης, όπως π.χ. Sabouraud s glucose agar, malt extract agar και Czapek Dox agar. Η θερμοκρασία επώασης των αρχικών καλλιεργειών στις ασπεργιλλώσεις, ό- πως και για τους περισσότερους ευκαιριακά παθογόνους μύκητες, είναι 30 C, ενώ η επώαση ταυτόχρονα και στους 35 ως 37 C είναι χρήσιμη για τη διαφορική διάγνωση με την εμφάνιση ή μη διαφόρων μορφολογικών χαρακτηριστικών, τον αποκλεισμό της ύπαρξης ενός δίμορφου μύκητα στο κλινικό δείγμα και τη γρηγορότερη α- νάπτυξη 25. Συνήθως αναπτύσσονται πλήρως μέσα σε περίπου επτά με δέκα ημέρες. Όλες οι καλλιέργειες πρέπει να ελέγχονται δύο με τρεις φορές εβδομαδιαίως και να γίνονται οι κατάλληλες ανακαλλιέργειες 25,26. Ήδη από το 1965 οι Raper και Fennell σημείωναν πως όταν μελετούμε τους ασπεργίλλους είναι σημαντικό να κατανοούμε: 1) ότι στελέχη του ιδίου είδους μπορεί να διαφέρουν μεταξύ τους, 2) τα είδη μπορεί να ποικίλλουν μέσα σε μια ομάδα ειδών και 3) οι διάφορες ομά-

6 Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 4, δες μπορεί να αλληλεπικαλύπτονται μέσα στο ί- διο γένος 27. Υπάρχουν δυσκολίες στη φαινοτυπική ταυτοποίησή τους που αφορούν: α) στα μη σταθερά φαινοτυπικά χαρακτηριστικά, όπως η παραγωγή ασκοσπορίων ή το χρώμα των αποικιών, που είναι εξαρτώμενο από τις περιβαλλοντικές συνθήκες (σύσταση του θρεπτικού υλικού, θερμοκρασία επώασης, ηλικία των αποικιών) ή το σχήμα και η εμφάνιση των κονιδιακών κεφαλών και των κονιδιογόνων κυττάρων που μεταβάλλονται με την ηλικία της αποικίας, β) στους άτυπους φαινοτύπους των ασπεργίλλων που α- ναπτύσσονται σε καλλιέργειες κλινικών δειγμάτων, γ) στα αλληλεπικαλυπτόμενα μορφολογικά χαρακτηριστικά μεταξύ των ειδών σε μια ομάδα-τομέα (section) ειδών, π.χ. ομοιότητες μεταξύ διαφορετικών μελών της ομάδας-τομέα (section) των Fumigati, δ) στη χρησιμοποίηση διαφόρων μη συνηθισμένων θρεπτικών υλικών και ε) στην αναγκαιότητα ύπαρξης ειδικά εκπαιδευμένου προσωπικού για την ταυτοποίηση που είναι κοπιώδης και χρονοβόρος 28. Παρόλ αυτά το 2003 η Αμερικανική Εταιρεία Μικροβιολογίας διαπίστωνε ότι το 89% των εργαστηρίων που ασχολούνταν με τις μυκητιακές λοιμώξεις στις Η.Π.Α. πραγματοποιούσαν μόνο καλλιέργειες, 16% χρησιμοποιούσαν και ορολογικές μεθόδους, ενώ λιγότερο από 5% χρησιμοποιούσαν μοριακές τεχνικές 29. Συνεπώς με δεδομένη την εξάρτηση από τις φαινοτυπικές μεθόδους για τη διάγνωση και ταυτοποίηση των ασπεργίλλων, αλλά και των άλλων, νηματοειδών κυρίως μυκήτων, μεγάλη προσπάθεια πρέπει να καταβληθεί στην έρευνα για την αξιολόγηση των μεθόδων αυτών και τη βελτίωση της διαγνωστικής αξίας τους με την τυποποίηση των υλικών και των τεχνικών, καθώς και στη στρατηγική εκπαίδευσης του εργαστηριακού προσωπικού 28. Το γένος των ασπεργίλλων αρχικά είχε διαχωριστεί σε υπογένη και ομάδες (groups) 27. Στην εποχή μας το γένος έχει διαχωριστεί σε 7 υπογένη τα οποία χωρίζονται σε διάφορους τομείς (sections) αντί ομάδες (groups). Οι τομείς αυτοί αποτελούνται από διάφορα συγγενικά είδη 30. Τα κλινικά μικροβιολογικά εργαστήρια βασίζονται και θα συνεχίσουν να βασίζονται πολύ στη μορφολογική ταυτοποίηση των διαφόρων κλινικών στελεχών, αλλά καθώς υπάρχουν μια σειρά προβλημάτων που ήδη αναφέρθηκαν παραπάνω και κυρίως γιατί το ταχύ και ολοκληρωμένο αποτέλεσμα μπορεί να είναι εξαιρετικά σημαντικό για τους ασθενείς υψηλού κινδύνου, καταβάλλεται διεθνώς προσπάθεια για την κατάλληλη επιλογή και εφαρμογή μοριακών μεθόδων ταυτοποίησης. Φαίνεται ότι η ταυτοποίηση των ειδών μέσω της σύγκρισης προσδιορισμού αλληλουχίας των βάσεων (comparative sequencing) του DNA είναι πολλά υποσχόμενη στα θέματα της ταχύτητας, της ευκολίας, της αντικειμενικότητας και της οικονομίας 31. Διεθνώς αρκετά εργαστήρια μυκητολογίας χρησιμοποιούν ήδη και προσπαθούν να αξιολογήσουν μοριακές μεθόδους είτε για την άμεση ανίχνευση στο κλινικό υλικό είτε για την ταυτοποίηση μυκήτων που αναπτύσσονται σε καλλιέργειες κλινικών δειγμάτων, συμπληρωματικά προς τις μορφολογικές μεθόδους ή και προσπαθώντας να υποκαταστήσουν τις τελευταίες όταν υπάρχει μεγάλη καθυστέρηση στο αποτέλεσμα. Οι πιο διαδεδομένοι μυκητιακοί γονιδιακοί στόχοι για τις μοριακές προσεγγίσεις βρίσκονται στο ριβοσωμιακό DNA (rdna). Εκεί περιέχονται ισχυρά διατηρημένες περιοχές, που χωρίζονται από άλλες περισσότερο μεταβλητές που παρουσιάζουν ειδικές του είδους αλληλουχίες. Αυτές όλες οι περιοχές είναι ιδεώδεις για το σχεδιασμό «οικουμενικών» (πανμυκητιακών) εκκινητών (primers) ή ειδικών για το γένος ή το είδος. Ένα άλλο σημαντικό πλεονέκτημα είναι ότι οι αλληλουχίες αυτού του DNA είναι αυτές που βρίσκονται πιο συχνά στις δημόσιας χρήσης βάσεις αλληλουχιών. Γενικά η οργάνωση των γονιδίων του rdna περιλαμβάνει το γονίδιο της SSU (small subunit) περιοχής (18S rdna), το γονίδιο της 5.8S περιοχής και το γονίδιο της LSU (large subunit) περιοχής (28S rdna). Ανάμεσα στις παραπάνω περιοχές βρίσκονται οι ITS (internal transcribed spacer) περιοχές, η ITS1 μεταξύ της 18S και της 5.8S περιοχής και η ITS2 μεταξύ της 5.8S και της 28S περιοχής. Ανεξάρτητα από αυτές τις ομάδες υπάρ-

7 180 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία χει και γονίδιο της 5S rdna περιοχής με την ΝTS (nontranscribed spacer). Τόσο οι περιοχές D1 και D2 της LSU όσο και η 18S, αλλά και πιο πρόσφατα οι περιοχές ITS1 και ITS2 έχουν χρησιμοποιηθεί εκτενώς με πληθώρα εκκινητών και για τους ασπεργίλλους. Η περιοχή 18S έχει χρησιμοποιηθεί επιτυχώς για την αναγνώριση μεταξύ διαφορετικών γενών παθογόνων μυκήτων 32. Οι ταχύτερα εξελισσόμενες περιοχές ITS1 και ITS2, με τη μεγαλύτερη μεταβλητότητα και τη μεγαλύτερη καταλληλότητα για την ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους και στελέχους, έχουν ευρέως μελετηθεί και φαίνεται πως υπάρχει ένας διεθνής «προσανατολισμός» προς τη χρήση αυτών των περιοχών, τουλάχιστον για την αναγνώριση των ιατρικά σημαντικών μυκήτων, τόσο για τις εν τω βάθει όσο και για τις επιφανειακές μυκητιάσεις 28, Φαίνεται όμως πως οι περιοχές αυτές δεν είναι αρκετές για την αναγνώριση και το διαχωρισμό μεταξύ διαφόρων ειδών που απαρτίζουν κοινούς τομείς (sections) ιατρικά σημαντικών ειδών, όπως π.χ. ο Aspergillus lentulus και οι Neosartorya pseudofischeri και udagawae στoν τομέα (section) των Fumigati. Επίσης παρουσιάζουν προβλήματα στο διαχωρισμό πολύ κοντινών ειδών όπως ο Aspergillus fumigatus και ο Αsperglllus lentulus 13,41,42. Παρόλα αυτά μπορούν να αναγνωρίσουν σημαντικά και συνηθέστερα είδη παθογόνων μυκήτων όπως οι Aspergillus terreus, flavus και fumigatus και έτσι είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν στα μυκητολογικά εργαστήρια για αυτό το σκοπό 13,43. Το 2008 δημοσιεύτηκε ένα πολύ σημαντικό άρθρο, ως πρόταση μιας διεθνούς ομάδας εργασίας στο πλαίσιο της ISHAM (International Society for Human and Animal Mycology), για τη μοριακή ταυτοποίηση των κυριότερων παθογόνων νηματοειδών μυκήτων, δηλαδή των Aspergillus, Fusarium και Mucorales 41. Οι συγγραφείς κάνουν σαφές ότι προσεγγίζουν τον όρο ταυτοποίηση από τη σκοπιά της κλινικής χρησιμότητας και όχι της ταξινομικής κατηγοριοποίησης. Τους ενδιαφέρει ο τρόπος με τον οποίο ένα εργαστήριο κλινικής μικροβιολογίας θα μπορέσει να ταυτοποιήσει ένα παθογόνο μύκητα, γρήγορα και με ακρίβεια, ώστε να προσφέρει την α- ναγκαία πληροφόρηση στον κλινικό ιατρό, ο- ποίος θα τη χρησιμοποιήσει για να αποφασίσει και να καθοδηγήσει τη θεραπεία του αρρώστου. Προτείνουν τη χρήση της ITS περιοχής ως πιο κατάλληλης για τη διαγνωστική αυτή προσέγγιση καθώς είναι πανμυκητιακή και μπορεί να πολλαπλασιασθεί αξιόπιστα για τους περισσότερους μύκητες, ενώ ταυτόχρονα οι περισσότερες βιβλιοθήκες αλληλουχιών περιέχουν μεγάλο αριθμό πληροφοριών από αυτή την περιοχή. Παρά το ότι αναγνωρίζουν τα προβλήματα που αναφέρθηκαν παραπάνω και επιπλέον ότι στις βάσεις δεδομένων υπάρχουν λάθη στις μυκητιακές αλληλουχίες ως και 20%, υποστηρίζουν ένθερμα τη χρησιμοποίηση της συγκεκριμένης περιοχής 41,42, έτσι ώστε μέσω των κλινικά χρήσιμων ταυτοποιήσεων σε επίπεδο γένους ή είδους, να προαχθεί διαγνωστικά ο ρόλος της μοριακής προσέγγισης. Επίσης να ενισχυθεί σταδιακά η α- κρίβεια των πληροφοριών που υπάρχουν και να μπορέσει να υπάρξει ένας κοινός τόπος μελέτης και περαιτέρω ανάπτυξης αυτής της μεθοδολογίας στο εργαστήριο κλινικής μυκητολογίας. Είτε το εργαστήριο χρησιμοποιεί φαινοτυπικές μεθόδους ταυτοποίησης των στελεχών των ασπεργίλλων, είτε μοριακές, που κυρίως βασίζονται στον προσδιορισμό της αλληλουχίας των περιοχών ITS, προτείνεται να αναφέρονται τα είδη και ειδικά αυτά που ανήκουν στους τομείς (sections) των Fumigati, Flavi, Nidulantes, Usti και Terrei, ως σύμπλεγμα ειδών (species complex), π.χ. Aspergillus fumigatus complex ή Aspergillus flavus complex 31,41. Χρησιμοποιείται δηλαδή η λέξη complex ως εναλλακτική της λέξης section. Ο όρος complex καθορίζει τη θέση ενός στελέχους μέσα σε ένα κοινό σύμπλεγμα ειδών (species complex), αλλά δεν ταυτοποιεί α- παραίτητα το ακριβές είδος του στελέχους μέσα στο σύμπλεγμα. Aν υπάρχουν κλινικοί ή επιδημιολογικοί λόγοι περαιτέρω ταυτοποίησης, ώστε να αναγνωρισθούν ακριβώς τα επιμέρους είδη μέσα στο σύμπλεγμα (complex), τότε θα πρέπει να γίνει επιπλέον προσδιορισμός της αλληλουχίας του DNA με τη χρησιμοποίηση κάποιου γο-

8 Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 4, νιδιακού τόπου κωδικοποίησης πρωτεϊνών 28,31,41. Υπάρχει π.χ. ανάγκη να καθορισθούν ακριβώς το είδος του A. terreus (ανθεκτικός στην αμφοτερικίνη) σε σχέση με τον A. fumigatus ή διάφορα είδη μέσα στο A. fumigatus complex, όπως ο A. lentulus (χαμηλότερη ευαισθησία στην αμφοτερικίνη), ενώ υπάρχει μικρότερο ενδιαφέρον για τον ακριβή καθορισμό του είδους μέσα στους A. Usti 41,44,45. Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι η σύγκριση προσδιορισμού αλληλουχίας των γονιδίων που κωδικοποιούν την παραγωγή της καλμοδουλίνης, της rodlet A και ιδίως της β-τουμπουλίνης μπορεί να ταυτοποιήσει τα επιμέρους είδη 16,31, Το 2006, μια κοινή ομάδα εργασίας από το Ηνωμένο Βασίλειο και την Ιρλανδία δημοσίευσε τα αποτελέσματα μιας από τις πρώτες πολυκεντρικές μελέτες αξιολόγησης των μεθόδων PCR που χρησιμοποιούνταν ήδη στις δύο αυτές χώρες για την ανίχνευση των μυκήτων Candida και Aspergillus στα κλινικά δείγματα 47. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ενώ για την Candida οι μέθοδοι, αν και διαφορετικές μεταξύ τους, ήταν α- πόλυτα συγκρίσιμες και είχαν πολύ καλή ευαισθησία, για τον Αspergillus τα αποτελέσματα ή- ταν περισσότερο ποικίλα. Η πρόταση της ομάδας οδηγούσε περισσότερο προς τη χρήση αυτοματοποιημένων συστημάτων για την ενίσχυση του DNA (real-time PCR), με απώτερο στόχο την τυποποίηση της εργασίας και τη μεγαλύτερη αξιοπιστία του αποτελέσματος. Στο άρθρο αυτό δε γινόταν συζήτηση για το αποτρεπτικό συχνά κόστος των αυτοματοποιημένων μεθοδολογιών. Τονίστηκε πάντως ότι, ειδικά για τον ασπέργιλλο πρέπει να γίνουν συγκριτικές διεργαστηριακές μελέτες με διαφορετικό πρωτόκολλο PCR για να βρεθεί η καλύτερη. Πολύ ενδιαφέρουσα πρόταση για το μέλλον, η οποία είναι ή- δη σε αρχική αξιολόγηση, είναι η χρησιμοποίηση μιας πανμυκητιακής μεθόδου PCR σε συνδυασμό με προσδιορισμό αλληλουχίας DNA, καθώς μάλιστα ο αριθμός των περιπτώσεων λοιμώξεων και από άλλους μύκητες είναι αυξανόμενος. Αυτό θα μπορούσε να επιφέρει χαμηλότερη ευαισθησία καθώς μεγαλώνει η ποικιλότητα του γονιδιακού στόχου με σκοπό την κάλυψη περισσότερων γενών μυκήτων. Θα μπορούσε όμως να γίνει συνδυασμός και με ειδικές του γένους ή του είδους μεθόδους PCR, ώστε να εξασφαλιστεί το διαγνωστικό αποτέλεσμα 47. Η ευρεία αποδοχή της μοριακής διάγνωσης των διεισδυτικών ασπεργιλλώσεων βρίσκει εμπόδια στην έλλειψη τυποποίησης και στην περιορισμένη γνώση της πορείας της νόσου 48. Για το λόγο αυτό, αλλά και με την εμπειρία της παραπάνω μελέτης δημιουργήθηκε στο πλαίσιο της ISHAM η ομάδα εργασίας της EAPCRI (European Aspergillus PCR Initiative), που έχει σκοπό την ανάπτυξη και την εφαρμογή τυποποιημένης μεθοδολογίας εκχύλισης και ενίσχυσης του DNA των ασπεργίλλων στα κλινικά δείγματα, την αξιολόγηση των πληροφοριών, τη συγκριτική μελέτη και την εκτίμηση των αποτελεσμάτων, μέσω της κλινικής εφαρμογής, έτσι ώ- στε στο μέλλον οι μοριακές μέθοδοι να περιληφθούν πιθανώς στα επόμενα αναθεωρημένα διαγνωστικά κριτήρια για τις διεισδυτικές μυκητιάσεις 48. Προτείνουν όμως, την PCR ασπεργίλλου στο αίμα ως δοκιμασία ελέγχου (screening test) και όχι ως επιβεβαιωτική, με απώτερο στόχο να διασφαλιστεί η μέγιστη δυνατή ευαισθησία και να επιτευχθεί η μέγιστη αρνητική προγνωστική αξία, καθώς είναι το σημαντικότερο στην κλινική πρακτική. Επίσης προβαίνουν σε συγκεκριμένες προτάσεις, επισημαίνοντας ότι η εκχύλιση είναι καθοριστικότερος παράγοντας για την αποτελεσματικότητα της PCR του ασπεργίλλου, α- πό την ίδια την ενίσχυση του DNA 48. Ορολογική διάγνωση και παρακολούθηση Από όσα αναφέρονται στο άρθρο των EORTC/MSG, σχετικά με τις διεισδυτικές α- σπεργιλλώσεις, φαίνεται ότι περιλαμβάνονται στα αναθεωρημένα προτεινόμενα διαγνωστικά κριτήρια, εκτός από τη μικροσκόπηση και την καλλιέργεια, και άλλες εξετάσεις όπως ο έλεγχος για το αντιγόνο (γαλακτομαννάνη) ασπεργίλλου στον ορό, αλλά και στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και το εγκεφαλονωτιαίο υγρό 1. Η ε-

9 182 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία ξέταση αυτή μπορεί να συμβάλει σημαντικά στη διάγνωση των συγκεκριμένων μυκητιάσεων, καθώς μπορεί οι καλλιέργειες για διάφορους λόγους να είναι αρνητικές, ενώ επιπλέον είναι και πολύ πιο χρονοβόρες. Επίσης με τη συχνή παρακολούθηση του τίτλου μπορεί να επιτευχθεί ο έ- λεγχος της απόκρισης στη θεραπεία και η έγκαιρη ανίχνευση μιας πιθανής υποτροπής. Ο προσδιορισμός της γαλακτομαννάνης του ασπεργίλλου βασίζεται σε μια ευαίσθητη ανοσοενζυμική μέθοδο που ειδικά στους ουδετεροπενικούς ασθενείς φαίνεται πως έχει ευαισθησία % και ειδικότητα 86-99%. Στους μη ουδετεροπενικούς παρουσιάζει χαμηλότερη ειδικότητα Όταν γίνονται συνεχόμενοι επαναλαμβανόμενοι προσδιορισμοί, ένα θετικό αποτέλεσμα φαίνεται πως προηγείται της αποδεδειγμένης διάγνωσης 6-14 ημέρες 52. Το όριο εκτίμησης της θετικότητας (cutoff) για τη μέθοδο της γαλακτομαννάνης του ασπεργίλλου στον ορό αποτέλεσε θέμα έντονου επιστημονικού διαλόγου. Αρχικά είχε τεθεί στο 1,5, αλλά όταν τελικά μειώθηκε στο 0,5 φάνηκε ότι βελτιώθηκε πάρα πολύ η διαγνωστική αξία της μεθόδου, με σημαντική βελτίωση της ευαισθησίας. Επίσης συστήνεται η μέτρηση σε περισσότερα του ενός δείγματα (δύο την εβδομάδα), ενώ η ανίχνευση δύο συνεχόμενων θετικών δειγμάτων με τιμή 0,5 οδηγεί σε ειδικότητα μέχρι 97,5% και θετική προγνωστική αξία 87,5% η ολική ευαισθησία διατηρείται στο 92,1% και η αρνητική προγνωστική αξία στο 98,5% 1,53. Μια άλλη παράμετρος που έχει περιληφθεί στα αναθεωρημένα κριτήρια διάγνωσης είναι ο προσδιορισμός της (1,3)-β-D-γλυκάνης, η οποία είναι ένα συστατικό του κυτταρικού τοιχώματος πολλών παθογόνων μυκήτων, εκτός των ζυγομυκήτων και των κρυπτοκόκκων, και μπορεί να χρησιμοποιηθεί όχι μόνο για τις ασπεργιλλώσεις αλλά και ως πανμυκητιακός δείκτης. Η ευαισθησία αυτής της χρωματομετρικής μεθόδου αναφέρεται ότι είναι % και η ειδικότητα % Φαίνεται ότι ένα θετικό αποτέλεσμα μπορεί να προηγείται της οριστικής αποδεδειγμένης διάγνωσης, σύμφωνα με τα κριτήρια των EORTC/MSG, με διάμεση τιμή τις τρεις ημέρες για τη διεισδυτική ασπεργίλλωση και 14 για τη διεισδυτική καντιντίαση, μετά την έναρξη του πυρετού 57. Έλεγχος της ευαισθησίας και παρακολούθηση των φαρμακευτικών επιπέδων Αν και ο Aspergiluus fumigatus είναι ο πιο συνηθισμένος νηματοειδής μύκητας που απαντάται στις διεισδυτικές μυκητιάσεις, τα τελευταία χρόνια υπάρχει συνεχώς αυξανόμενη κλινική εμφάνιση πολλών άλλων γενών και ειδών ευκαιριακών νηματοειδών μυκήτων και μεταξύ αυτών και πολλών άλλων ειδών ασπεργίλλων. Ο Aspergillus terreus είναι ένας από αυτούς. Όπως ήδη αναφέρθηκε είναι ανθεκτικός στην αμφοτερικίνη Β. Αντοχή στα πολυένια εμφανίζεται συχνότερα και σε άλλα είδη ασπεργίλλων, όπως ο flavus, αλλά ακόμα και στον fumigatus που παραδοσιακά ήταν ο πιο ευαίσθητος 16,58,59. Συχνά τέτοιοι ασπέργιλλοι, αρχικά ταυτοποιημένοι ως A. fumigatus, είναι στην πραγματικότητα A. lentulus 16. Έχουν αναφερθεί κλινικά στελέχη A. fumigatus πολυανθεκτικά στις αζόλες (ιτρακοναζόλη, βορικοναζόλη και ποζακοναζόλη) και μάλιστα με συσχέτιση με την κλινική εικόνα 60,61. Για τον fumigatus, ελάχιστες ανασταλτικές πυκνότητες (MIC) >2 μg/ml για τη βορικοναζόλη, >0,5 για την ποζακοναζόλη και >2 μg/ml για την ιτρακοναζόλη θεωρούνται αυξημένες και ενδεικτικές αντοχής 62. Υπάρχουν ακόμα αναφορές για αντοχή στις εχινοκανδίνες (MIC >16 μg/ml) σε λοιμώξεις από ασπέργιλλο 63. Ο Aspergillus calidustus είναι ένα νέο αναδυόμενο είδος, προηγουμένως ταυτοποιούμενο ως Aspergillus ustus που τώρα αποτελεί μέλος του Aspergillus ustus complex. Παρουσιάζει ΜIC >4 μg/ml σε όλες τις τριαζόλες (ιτρακοναζόλη, βορικοναζόλη, ποζακοναζόλη και ραβουκοναζόλη) 64,65. Ο έλεγχος της ευαισθησίας των μυκήτων στα διάφορα αντιμυκητιακά φάρμακα είναι συχνά απαραίτητος, ειδικά στις εν τω βάθει μυκητιάσεις. Παρόλα αυτά δεν είναι αυτονόητη η διενέργειά του καθώς υπάρχουν τεχνικές δυσκολί-

10 Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 4, ες (ιδίως για τους νηματοειδείς μύκητες) ενώ για αρκετά φάρμακα και για τους περισσότερους μύκητες δεν υπάρχουν ακόμα καθορισμένα κριτήρια αξιολόγησης των ορίων ευαισθησίας. Τα βιβλιογραφικά δεδομένα και η εμπειρία είναι σημαντικά βοηθήματα στην εκτίμηση της MIC ως ενδεικτικού αποτελέσματος ευαισθησίας ή α- ντοχής του μύκητα. Μέθοδοι που κυρίως χρησιμοποιούνται διεθνώς για τον έλεγχο της ευαισθησίας των ασπεργίλλων είναι οι μέθοδοι των μικροαραιώσεων, όπως προτείνονται από το CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute) των Η.Π.Α. με την οδηγία Μ38-Α2 και από την EUCAST (European Committee for Antibiotic Susceptibility Testing) με την οδηγία για τους νηματοειδείς μύκητες (E. DEF 9.1), καθώς και ε- μπορικές τυποποιημένες μέθοδοι, όπως οι ταινίες διαβαθμισμένης πυκνότητας Ε-test (ΑΒ Biodisk, Solna, Sweden) και η μέθοδος μικροαραιώσεων Sensititre YeastOne (TREK Diagnostic Systems). Επίσης γίνεται προσπάθεια αξιολόγησης των δίσκων διάχυσης στο άγαρ. Πέρα από τον παραπάνω έλεγχο, αν και δεν περιλαμβάνεται στις διαγνωστικές δοκιμασίες, πολύ σημαντική τα τελευταία χρόνια αναδεικνύεται η παρακολούθηση των θεραπευτικών φαρμακευτικών επιπέδων (TDM-Therapeutic Drug Monitoring) διαφόρων αντιμυκητιακών φαρμάκων, κυρίως στον ορό των ασθενών, αλλά και σε άλλα βιολογικά υγρά. Σκοπός της παρακολούθησης είναι να γίνει μεγαλύτερη η πιθανότητα θεραπευτικής επιτυχίας και να ελαχιστοποιηθεί η πιθανότητα τοξικής δράσης. Να δημιουργηθεί δηλαδή ένα πλαίσιο εξατομίκευσης της θεραπείας. Απαραίτητο είναι να μπορούν να διακριθούν και να μελετηθούν τόσο η μητρική ουσία όσο και οι πιθανοί μεταβολίτες της. Οι μεταβολίτες αυτοί μπορεί να έχουν σημαντική συμμετοχή στην αποτελεσματικότητα ή την τοξικότητα του φαρμάκου συνολικά. Γενικά, για να έχει κλινική αξία και λόγο να πραγματοποιηθεί η παρακολούθηση των θεραπευτικών φαρμακευτικών επιπέδων, πρέπει να υπάρχει ακριβής, γρήγορη και ανταποδοτική του κόστους της μέθοδος, μεταβαλλόμενη σχέση μεταξύ δόσης του φαρμάκου και συγκεντρώσεων και συγκεκριμένη σχέση μεταξύ συγκεντρώσεων του φαρμάκου στο αίμα και τοξικότητας ή θεραπευτικής επιτυχίας 66. Φάρμακα που χρησιμοποιούνται ευρέως στις διεισδυτικές ασπεργιλλώσεις για την προφύλαξη και τη θεραπεία, για τα οποία θεωρείται ότι υπάρχει ανάγκη παρακολούθησης των επιπέδων τους είναι τρεις τριαζόλες: η ιτρακοναζόλη, η βορικοναζόλη και η ποζακοναζόλη. Σε ορισμένες χώρες, όπως η Μεγάλη Βρετανία, η μέτρηση της ιτρακοναζόλης σε εβδομαδιαία βάση, τείνει να γίνει καθιερωμένη πρακτική, είτε επιτόπου σε εξειδικευμένα κέντρα είτε με παραπομπή στα εργαστήρια αναφοράς. Η ιτρακοναζόλη είναι αποτελεσματική για την προφύλαξη και τη θεραπεία των ασπεργιλλώσεων και συνιστάται να μετράται στους ασθενείς που υπάρχει υποψία χαμηλής απορρόφησης, αναμένονται πιθανές αλληλεπιδράσεις με άλλα φάρμακα και όταν υπάρχει πιθανή θεραπευτική αποτυχία ή έχει συμβεί υποτροπή της λοίμωξης. Μεγάλη μεταβλητότητα των συγκεντρώσεων της ιτρακοναζόλης στον ορό έχει περιγραφεί σε διάφορες κατηγορίες ασθενών 67. Για τις νεότερες τριαζόλες βορικοναζόλη και ποζακοναζόλη υπάρχουν ενδείξεις ότι η μέτρηση των επιπέδων είναι χρήσιμη λόγω ποικίλης βιοδιαθεσιμότητας και προς αποφυγή επιπλοκών. Η βορικοναζόλη είναι φάρμακο πρώτης γραμμής για τη θεραπεία των διεισδυτικών μυκητιάσεων. Παρουσιάζεται όμως μεταβλητότητα των συγκεντρώσεών της μεταξύ ασθενών υπό την ίδια δοσολογία 67. Η ποζακοναζόλη χρησιμοποιείται για τη θεραπεία εκρίζωσης σε ασθενείς με διεισδυτική ασπεργίλλωση και για την προφύλαξη ουδετεροπενικών ασθενών και ληπτών μοσχευμάτων αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. Επίσης παρουσιάζεται σημαντική μεταβλητότητα των επιπέδων της μεταξύ των ασθενών 67. Υπάρχουν διάφορες μέθοδοι για τη μέτρηση των συγκεντρώσεων των αντιμυκητιακών φαρμάκων. Οι μικροβιολογικές μέθοδοι είναι απλούστερες και φθηνότερες, αλλά οι αναλυτικές προσφέρουν μεγαλύτερη ευαισθησία και επαναληψιμότητα επιπλέον επιτρέπουν τον προσδιορισμό των επιμέρους μεταβολιτών 68. Από τις μη μικροβιολογικές

11 184 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία μεθόδους, διάφορες έχουν χρησιμοποιηθεί όπως η αέριος-υγρή χρωματογραφία, φθορισμομετρικές τεχνικές, ενζυματικές, ανοσοενζυμικές, υγρή χρωματογραφία υψηλής ευκρίνειας (HPLC) και πιο πρόσφατα υγρή χρωματογραφία σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας. Η μέθοδος που έχει επικρατήσει, λόγω της σχετικά εύκολης ε- φαρμογής της, αλλά κυρίως λόγω της μεγάλης ευαισθησίας και ακρίβειάς της είναι η HPLC, ε- νώ η φασματομετρία μάζας προσφέρει ακόμα μεγαλύτερη ευαισθησία, αλλά με πολύ μεγαλύτερο κόστος. Συμπέρασμα Καθώς στους ασπεργίλλους υπάρχει σημαντική μεταβλητότητα μεταξύ των ειδών, η ταυτοποίηση του είδους πρέπει να βασίζεται σε συστήματα που να έχουν δημιουργηθεί βάσει σημαντικού αριθμού για το κάθε είδος. Συνδυασμός μεθόδων πρέπει να χρησιμοποιείται με την αξιοποίηση μορφολογικών και μοριακών μεθόδων. Δημόσιας πρόσβασης, ευρείας έκτασης βάσεις αξιολογημένων αλληλουχιών DNA ασπεργίλλων πρέπει να δημιουργηθούν ταυτόχρονα με την παράλληλη αξιολόγηση και χρήση των μοριακών μεθόδων. Επιτακτική είναι συνολικά η ανάγκη τυποποίησης των μεθόδων, των οδηγιών και των πρωτοκόλλων μεταξύ των μυκητολογικών εργαστηρίων. Καθώς υπάρχουν κενά α- κόμα στην επιλογή και αξιολόγηση των καταλληλότερων φαινοτυπικών και άλλων μεθοδολογιών, χρειάζεται περαιτέρω έρευνα σε αυτόν τον τομέα. Χρειάζεται επίσης περισσότερη προσπάθεια στην εκπαίδευση ιατρικού και λοιπού επιστημονικού προσωπικού στα θέματα της ακριβούς ταυτοποίησης, της άμεσης μικροσκόπησης, της επιλογής και χρήσης των κατάλληλων θρεπτικών υλικών καθώς και της κλινικής ωφέλειας και της ανταπόδοσης του κόστους από την ε- φαρμογή της μιας ή της άλλης τεχνικής. Σε πολλές κλινικές περιπτώσεις η γρήγορη απόφαση για την κατάλληλη θεραπεία είναι συχνά περισσότερο σημαντική από την άμεση ταυτοποίηση του είδους ενός συγκεκριμένου στελέχους. Αλλά και η ταυτοποίηση του είδους μπορεί να δώσει σημαντικές πληροφορίες για την κατάλληλη επιλογή της θεραπείας. Ταυτόχρονα όμως διάφορα στελέχη ενός είδους μπορεί να διαφέρουν ως προς την ευαισθησία τους στα αντιμυκητιακά φάρμακα. Η ταυτοποίηση του είδους είναι επίσης χρήσιμη για την πρόγνωση της πορείας της νόσου, τον εντοπισμό των νοσοκομειακών λοιμώξεων, την επιδημιολογία και διάφορα νομικά θέματα. Σε αυτές τις περιπτώσεις η ακρίβεια της ταυτοποίησης είναι πιο σημαντική από την ταχύτητα. Από τα περίπου 200 είδη ασπεργίλλων που υπάρχουν στη φύση, περίπου 40 έχουν αναφερθεί ως αίτιο μυκητίασης. Τα πιο συχνά είδη στις ασπεργιλλώσεις του ανθρώπου είναι οι A. fumigatus, A. flavus, A. terreus και A. niger. Συγχρόνως όμως, είναι και εκείνοι που αναφέρεται πιο συχνά ότι αναπτύσσονται σε καλλιέργειες υ- λικών από το περιβάλλον 69. Τα είδη των ασπεργίλλων που προκαλούν ασπεργιλλώσεις δεν περιορίζονται μέσα σε ελάχιστους ταξινομικούς τομείς του γένους, αλλά είναι πολύ πιο διάσπαρτα. Οι ασπεργιλλώσεις είναι απόλυτα ευκαιριακές λοιμώξεις και θεωρητικά οποιοδήποτε είδος ασπεργίλλου θα μπορούσε να προκαλέσει νόσο, κάτω από τις κατάλληλες συνθήκες. Αυτό που έ- χει πολύ μεγάλη σημασία για τον άρρωστο είναι η δυνατότητα γρήγορης διάγνωσης της πιθανής μυκητίασης και η εξακρίβωση των φαρμάκων που είναι αποτελεσματικά για το συγκεκριμένο λοιμογόνο στέλεχος. Στη σύγχρονη πρακτική δεν υπάρχουν αξιολογημένες μεθοδολογικές προσεγγίσεις που να μην επηρεάζονται από μεταβολές στο επίπεδο της ταυτοποίησης και ά- ρα η ταυτοποίηση και ό,τι συνεπάγεται αυτή (εκπαίδευση, αξιολόγηση, τυποποίηση) είναι απαραίτητα στην κλινική πράξη. Διεύθυνση επικοινωνίας: Τιμολέων-Αχιλλέας Βυζαντιάδης Επίκουρος Καθηγητής Ιατρικής Σχολής Α Εργαστήριο Μικροβιολογίας Ιατρική Σχολή Α.Π.Θ Θεσσαλονίκη

12 Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 4, Summary Laboratory diagnosis and follow-up of invasive aspergilloses T-A. VYZANTIADIS 1st Department of Microbiology, Medical School, Aristotle University of Thessaloniki The last years there has been an increasing incidence of invasive aspergilloses in the immunocompromised patients. It is the most common among the invasive mycoses due to moulds. Simultaneously, despite the important progress and the constant awareness of the scientific community, there are still problems concerning the laboratory diagnosis and follow-up. Internationally, there is an effort for combined and evidence-based diagnostic approach in order to provide quicker and more efficient diagnosis. This will help to timely and efficient pre-emptive treatment. According to the contemporary laboratory practice, it seems that the combined approach of phenotypic, serological and molecular techniques could offer better results. In an international level, common is the belief (and not only for aspergilloses) that there is a need for standardisation of methods, guidelines and protocols used by the mycology laboratories. As there are still gaps in the choice and evaluation of the more appropriate methodologies, further research is need at this field. Also, simultaneously to the evaluation and use of the modern techniques, further effort is need on the training of medical and other scientific personnel on the issues of exact identification, direct microscopy, choice of the culture media, clinical value and cost effectiveness by the application of one or other methodology. (Key words: Aspergilloses, laboratory diagnosis, follow-up). ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. De Pauw B, Walsh TJ, Donnelly JP, et al. European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group; National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group (EORTC/ MSG) Consensus Group. Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer/ Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group (EORTC/ MSG) Consensus Group. Clin Infect Dis 2008, 46(12): Kontoyiannis DP, Sumoza D, Tarrand JJ, et al. Significance of aspergillemia in patients in patients with cancer: a 10-year study. Clin Infect Dis 2002, 31: Ascioglu S, Rex JH, de Pauw B, et al. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clin Infect Dis 2002, 34: Kibbler CC, Hamilton A. Medical mycology in the UK: time to stop the dry rot. Commun Dis Public Health 2000, 3: Denning DW, Kibbler CC, Barnes RA. British Society for Medical Mycology proposed standards of care for patients with invasive fungal infections. The Lancet Infectious Diseases 2003, 3: Barnes RA, Denning DW, Evans EGV, et al for the British Society for Antimicrobial Chemotherapy and Denning DW, Evans EGV, Kibbler CC, et al for the British Society for Medical Mycology. Fungal infections: a survey of laboratory services for diagnosis and treatment. CDR Rev 1996, 6: R Tong KB, Lau CJ, Murtagh K, et al. The economic impact of aspergillosis: analysis of hospital expenditures across patient subgroups. Int J Infect 2009, 13: Levy H, Horak DA, Tegtmeier BR, at al. The value of bronchoalveolar lavage and bronchial washings in the diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis. Respir Med 1992, 86: Pagano L, Pagliari G, Basso A, et al. The role of bronchoalveolar lavage in the microbiological diagnosis of pneumonia in patients with haema-

13 186 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία pulmonary aspergillosis. J Clin Microbiol 1980, 11: Yu VL, Muder RR, Poorsattar A. Significance of isolation of Aspergillus from the respiratory tract in diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis. Am J Med 1986, 81: Horvath JA, Dummer S. The use of respiratorytract cultures in the diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis. Am J Med 1996, 100: Tarrand JJ, Lichterfeld M, Warraich I, et al. Diagnosis of invasive septate mold infections. A correlation of microbiological culture and histologic or cytologic examination. Am J Clin Pathol 2003, 119: Brandt ME, Warnock DW. Laboratory aspects of medical mycology, p. 3-22, in: Dismukes WE, Pappas PG, Sobel JD. Clinical Mycology. New York, USA: Oxford University Press, Evans EGV, Richardson MD. Medical mycology: a practical approach. Oxford, England: IRL Press, Raper BK, Fennell DI. The Genus Aspergillus. Baltimore MD, USA: The Williams and Wilkins Company, Balajee SA, Marr KA. Phenotypic and genotypic identification of human pathogenic aspergilli. Future Microbiol 2006, 1(4): American Society for Microbiology. Washington, DC: Getting the work done! Clinical microbiology workforce issues; [Powerpoint presentations for ASM s May 2004 General Meeting, New Orleans; cited 2004 June 23]. Available from: = Gams W, Christensen M, Onions AH, et al. Infrageneric taxa of Aspergillus. In: Samson RA, Pitt JI. Advances in Penicillium and Aspergillus systematics. New York: Plenum Press, 1985, Balajee SA, Houbraken J, Verweij PE, et al. Aspergillus species identification in the clinical setting. Studies in Mycology 2007, 59: Einsele H, Hebart H, Gottfried R. Detection and identification of fungal pathogens in blood by using molecular probes. J Clin Microbiol 1997, 35 (6): Kanbe T. Molecular approaches in the diagnosis of dermatophytosis Mycopathologia 2008, 166 (5-6): Leaw SN, Chang HC, Sun HF, et al. Identification of medically important yeast species by setological malignancies. Ann Intern Med 1997, 29: Ruchel R, Schaffrinski M. Versatile fluorescent staining of fungi in clinical specimens by using the optical brightener Blankophor. J Clin Microbiol 1999, 37: Glenn DR, Goodman NL. Laboratory diagnosis, p , in: Merz WG, Hay RJ. Topley and Wilson s Microbiology & Microbial infections, Medical Mycology, 10th ed. London, England: ASM Press, de Hoog GS, Guarro J, Gene J, Figueras MJ. Atlas of Clinical Fungi, 2nd ed., Centraalbureau voor Schimmelcultures / Universitat Rovira i Virgili, Balajee SA, Sigler L, Brandt ME. DNA and the classical way: identification of medically important molds in the 21st century. Med Mycol 2007, 45(6): Perfect JR, Cox GM, Lee JY, Kauffman CA, de Repentigny L, Chapman SW, Morrison VA, Pappas P, Hiemenz JW, Stevens DA Mycoses Study Group. The impact of culture isolation of Aspergillus species: a hospital-based survey of aspergillosis. 2001, 33(11): McClenny N. Laboratory detection and identification of Aspergillus species by microscopic observation and culture: the traditional approach. Medical Mycology 2005, 43: S125-S Balajee SA, Gribskov JL, Hanley E, et al. Aspergillus lentulus sp. nov., a new sibling species of A. fumigatus. Eukaryot Cell 2005, 4(3): Sutton DA, Sanche SE, Revankar SG, et al. In vitro amphotericin B resistance in clinical isolates of Aspergillus terreus, with a head-to-head comparison to voriconazole. J Clin Microbiol 1999, 37: Herbrecht R, Denning DW, Patterson TF, et al. Randomised comparison of voriconazole and amphotericin B in primary therapy of invasive aspergillosis. N Engl J Med 2002, 347: Segal BH, DeCarlo ES, Kwon-Chung KJ, et al. Aspergillus nidulans infection in chronic granulomatous disease. Medicine 1998, 77: Moore CB, Sayers N, Mosquero J, et al. Antifungal drug resistance in Aspergillus. J Infect 2000, 41: Nalesnik MA, Myerowitz RL, Jenkins R, et al. Significance of Aspergillus species isolated from respiratory secretions in the diagnosis of invasive

14 Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 4, quence analysis of the internal transcribed spacer regions. J Clin Microbiol 2006, 44: Chen YC, Eisner JD, Kattar MM, et al. Polymorphic internal transcribed spacer region 1 DNA sequences identify medically important yeasts. J Clin Microbiol 2001, 39 (11): Chen YC, Eisner JD, Kattar MM, et al. Identification of medically important yeasts using PCR-based detection of DNA sequence polymorphisms in the internal transcribed spacer 2 region of the rrna genes. J Clin Microbiol 2000, 38 (6): Henry T, Iwen PC, Hinrichs SH. Identification of aspergillus species using internal transcribed spacer regions 1 and 2. J Clin Microbiol 2000, 38 (4): Borman AM, Linton CJ, Miles SJ, et al. Molecular identification of pathogenic fungi. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2008, 61 (suppl 1): i7-i Arabatzis M, Bruijnesteijn van Coppenraet LE, Kuijper EJ, et al. Diagnosis of common dermatophyte infections by a novel multiplex real-time polymerase chain reaction detection/identification scheme. Br J Dermatol 2007, 157(4): Kardjeva V, Summerbell R, Kantardjiev T, et al. Forty-eight-hour diagnosis of onychomycosis with subtyping of Trichophyton rubrum strains. J Clin Microbiol 2006, 44(4): Balajee SA, Borman AM, Brandt ME, et al. Sequence-Based Identification of Aspergillus, Fusarium, and Mucorales Species in the Clinical Mycology Laboratory: Where Are We and Where Should We Go from Here? J Clin Microbiol 2009, 47 (4): Nilsson RH, Ryberg M, Kristiansson E, et al Taxonomic reliability of DNA sequences in public sequence databases: a fungal perspective. PLoS One 2006, 1: e Hinrikson HP, Hurst SF, Lott TJ, et al. Assessment of ribosomal large-subunit D1-D2, internal transcribed spacer 1, and internal transcribed spacer 2 regions as targets for molecular identification of medically important Aspergillus species. J Clin Microbiol 2005, 43: Alcazar-Fuoli L, Mellado E, Alastruey-Izquierdo A, et al. Aspergillus section Fumigati: antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification. Antimicrob Agents Chemother 2008; 52: Varga J, Houbraken J, Van Der Lee HA, et al. Aspergillus calidoustous sp. nov., causative agent of human infections previously assigned to Aspergillus ustus. Eukaryot Cell 2008, 7: Hong SB, Go SJ, Shin HD, et al. Polyphasic taxonomy of Aspergillus fumigatus and related species. Mycologia 2005, 97: White PL, Barton R, Guiver M, et al. A consensus on fungal polymerase chain reaction diagnosis? A United Kingdom-Ireland evaluation of polymerase chain reaction methods for detection of systemic fungal infections. J Mol Diagn 2006, 8: White PL, Bretagne S, Klingspor L, et al. Aspergillus PCR: One Step Closer to Standardization. J Clin Microbiol 2010, 48(4): Maertens J, Verhaegen J, Lagrou K, et al. Screening for circulating galactomannan as a noninvasive diagnostic tool for invasive aspergillosis in prolonged neutropenic patients and stem cell transplantation recipients: a prospective validation. Blood 2001, 97: Rohrlich P, Sarfati J, Mariani P, et al. Prospective sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for serum galactomannan : early predictive value and clinical use in invasive aspergillosis. Pediatr Infect Dis J 1996, 15: Ulusakarya A, Chachaty E, Vantelon JM, et al. Surveillance of Aspergillus galactomannan antigenemia for invasive aspergillosis by enzymelinked immunosorbent assay in neutropenic patients treated for haematological malignancies. Hemato J 2000, 1: Maschmeyer G, Calandra T, Singh N, Wiley J, Perfect J. Invasive mould infections: a multi-disciplinary update. Med Mycol. 2009, 47(6): Maertens JA, Klont R, Masson C, et al. Optimization of the cutoff value for the Aspergillus double-sandwich enzyme immunoassay. Clin Infect Dis 2007, 44(10): Miyazaki T, Kohno S, Mitsutake K, et al. Plasma (1-3)-beta D-glucan and fungal antigenemia in patients with candidemia, aspergillosis and cryptococcosis. J Clin Microbiol 1995, 33: Obayashi T, Yoshida M, Mori T, et al. Plasma (1-3)-beta D-glucan measurement in diagnosis of invasive deep mycosis and fungal febrile episodes. Lancet 1995, 345: Yasa K, Goto H, Iguchi M, et al. Evaluation of the diagnostic value of the measurement of

15 188 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία (1-3)-beta D-glucan in patients with pulmonary aspergillosis. Respiration 1996, 63: Senn L, Robinson JO, Schmidt S, et al. 1,3-Beta- D-glucan antigenemia for early diagnosis of invasive fungal infections in neutropenic patients with acute leukemia. Clin Infect Dis Mar 15, 46(6): Lass-Flörl C. The changing face of epidemiology of invasive fungal diseases in Europe. Mycoses 2009, 52: Lass-Flörl C, Alastruey-Izquiderdo A, Cuenca- Estrella M, et al. In vitro activities of various antifungal drugs against Aspergillus terreus: Global assessment using the methodology of the European committee on antimicrobial susceptibility testing. Antimicrob Agents Chemother 2009, 53: Snelders E, van der Lee H, Kuijper J et al. Emergence of azole resistance in Aspergillus fumigatus and spread of a single resistance mechanism. Plos Med 2009, 5: e van der Linden J, Jansen R, Bresters D et al. Azole-resistant central nervous system aspergillosis. Clin Infect Dis 2009, 48: Verweij PE, Howard SJ, Melchers WJ, et al. Azole-resistance in Aspergillus: proposed nomenclature and breakpoints. Drug Resist Updat 2009, 12(6): Ruchel R, Perske C, Glass B, et al. A case of pulmonary aspergillosis with lack of response to caspofungin. Rev Iberoam Micol 2006, 23: Alastruey-Izquierdo A, Cuesta I, Houbraken J, et al. In vitro activity of nine antifungal agents against clinical isolates of Aspergillus calidoustus. Med Mycol 2010, 48(1): Varga J, Houbraken J, Van Der Lee HA, et al. Aspergillus calidoustus sp. nov., causative agent of human infections previously assigned to Aspergillus ustus. Eukaryot Cell 2008, 7(4): Andes D, Pascual A, Marchetti O. Antifungal therapeutic drug monitoring: established and emerging indications. Antimicrob Agents Chemother 2009, 53(1): Hope WW, Billaud EM, Lestner J, et al. Therapeutic drug monitoring for triazoles. Curr Opin Infect Dis 2008, 21(6): Warnock DW, Turner A, Burke J. Comparison of high performance liquid chromatographic and microbiological methods for determination of itraconazole. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 1988, 21: Klich MA. Biogeography of Aspergillus species in soil and litter. Mycologia 2002, 94: Υποβλήθηκε: 16/09/2010 Εγκρίθηκε: 09/11/2010 ΣΩΣΤΕΣ ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΣΤΙΣ ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΤΟΥ ΠΡΟΗΓΟΥΜΕΝΟΥ ΤΕΥΧΟΥΣ Ερώτηση 1η: Ερώτηση 2η: Ερώτηση 3η: Ερώτηση 4η: Γ. PCR στο ΕΝΥ Δ. Noro-ιός προκαλεί συχνότερα μεγάλες επιδημίες Β. Η ανίχνευση του πυρηνικού οξέος* του ιού με RT-PCR Γ. Αντιγόνο του ιού στις βλάβες με άμεσο ανοσοφθορισμό * Στην 3η ερώτηση του προηγούμενου τεύχους, από τυπογραφικό λάθος, αναφέρεται «ανίχνευση του DNA αντί RNA του ιού»

16 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική Περίοδος Β, Τόμος 15, Τεύχος 4, σελ ΜΕΛΕΤΕΣ ΕΜΒΟΛΙΑΣΜΟΣ ΕΝΑΝΤΙ ΤΟΥ ΙΟΥ Α (Η1Ν1) ΣΤΟ ΝΟΜΟ ΦΩΚΙΔΑΣ Η. ΠΕΡΥΣΙΝΑΚΗΣ 1, Π. ΒΑΣΙΛΟΠΟΥΛΟΣ 2, Π. ΠΝΕΥΜΑΤΙΚΟΥ 3, Ν. ΖΑΠΑΝΙΩΤΗΣ 3, Π. ΤΣΙΑΧΡΗΣ 3, Π. ΔΗΜΟΛΙΑΝΗΣ 3, Ε. ΠΑΠΟΥΛΙΑ 3 Στη μελέτη που ακολουθεί, καταγράφεται η ανταπόκριση των κατοίκων του Νομού Φωκίδας στον εμβολιασμό που έγινε σύμφωνα με τις οδηγίες του Π.Ο.Υ. για την αντιμετώπιση τυχόν πανδημίας γρίπης από τον ιό Α (Η1Ν1). Ο εμβολιασμός έγινε στο διάστημα από 17/11/2009 έως 5/1/2010. Συμπεραίνεται ότι οι κάτοικοι της περιοχής δεν επείσθησαν από τις σχετικές ομιλίες, τα Μ.Μ.Ε. και τα έντυπα τα οποία διανεμήθηκαν και το ποσοστό των εμβολιασθέντων υπήρξε ιδιαίτερα χαμηλό (1,01%). (Λέξεις ευρετηρίου: Η1Ν1, πανδημία, εμβολιασμός, ΜΜΕ και γρίπη). Την εμφάνιση και την τυποποίηση τον Μάρτιο του 2009 του νέου ιού της γρίπης Α (Η1Ν1) 1-3 ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (ΠΟΥ) 4 αντιμετώπισε αρχικά με προσπάθειες περιορισμού της εξάπλωσής του και στη συνέχεια με οδηγίες για προστασία των νοσηλευομένων, καθώς και μαζικό εμβολιασμό των επίνοσων ατόμων με έμφαση σε εκείνα υψηλού κινδύνου. Στις 16 Νοεμβρίου του 2009 ξεκίνησε πανελλαδικά η διαδικασία εμβολιασμού σε όλα τα νοσοκομεία και κέντρα υγείας της χώρας. Προτεραιότητα είχαν τα παιδιά άνω των έξι μηνών, αλλά και ενήλικοι με χρόνια προβλήματα υγείας, οι 1 Χειρουργική Κλινική, Γ.Ν. Άμφισσας 2 Φυλακές Μαλανδρίνου 3 Μικροβιολογικό Τμήμα, Γ.Ν. Άμφισσας έγκυες γυναίκες που βρίσκονταν στο 2ο και 3ο τρίμηνο της κύησης, οι εργαζόμενοι σε χώρους με παιδιά ηλικίας κάτω των έξι μηνών και οι ε- παγγελματίες υγείας. Στο πλαίσιο αυτό, την ίδια χρονική περίοδο ξεκίνησε το πρόγραμμα εμβολιασμού και στο νομό Φωκίδας, ενώ παράλληλα οι κάτοικοι διαμόρφωσαν γνώμη από τα μέσα μαζικής ενημέρωσης, κυρίως την τηλεόραση, από ειδικές ομιλίες στις σχολικές κοινότητες 5 και τα νοσοκομεία 6, και από ενημερωτικά έντυπα που αναρτήθηκαν ή διανεμήθηκαν. Σκοπός αυτής της μελέτης ήταν η καταγραφή της ανταπόκρισης των κατοίκων του νομού Φωκίδας στην εκστρατεία του ΠΟΥ και του Κέντρου Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων (ΚΕ- ΕΛΠΝΟ) 7 για προληπτικό εμβολιασμό έναντι του ιού Α (Η1Ν1).

17 190 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Αριθμός ατόμων Διάγραμμα 1. Ηλικιακή κατανομή του συνόλου των εμβολιασθέντων Ηλικία σε έτη Πληθυσμός και μέθοδος Την ευθύνη της οργάνωσης του εμβολιασμού σε τοπικό επίπεδο ανέλαβε η επιτροπή νοσοκομειακών λοιμώξεων του Γ.Ν. Άμφισσας με βάση τις οδηγίες του ΚΕΕΛΠΝΟ. Έγινε επιτροπή γρίπης και συνεργεία εμβολιασμού. Λειτούργησαν τρία εμβολιαστικά κέντρα στις βασικές μονάδες Δημόσιας Υγείας του νομού, ειδικότερα στο Νοσοκομείο Άμφισσας και στα Κέντρα Υγείας Ιτέας και Λιδορικίου. Επιπλέον εμβολιαστική ομάδα κάλυψε τις ανάγκες των κρατουμένων στις φυλακές ανδρών υψίστης ασφαλείας του Μαλανδρίνου, με επί τόπου εμβολιασμό. Η έναρξη του εμβολιασμού πραγματοποιήθηκε στις 17/11/2009. Το 1ο δεκαήμερο εμβολιάστηκαν ομάδες υψηλού κινδύνου και στη συνέχεια εμβολιάζονταν όσοι προσέρχονταν με βάση το αναρτημένο πρόγραμμα ωρών και ημερών. Κάθε υποψήφιος απαντούσε σε σχετικό ερωτηματολόγιο του ΚΕΕΛΠΝΟ που αφορούσε δημογραφικά στοιχεία και καταγραφή παραγόντων κινδύνου. Αποτελέσματα Εμβολιάστηκαν συνολικά 605 άτομα, 493 α- πό το γενικό πληθυσμό και 112 κρατούμενοι. Ο γενικός πληθυσμός του νομού Φωκίδας, σύμφωνα με την απογραφή του 2009, είναι άτομα, διαμορφώνοντας έτσι το ποσοστό εμβολιασμού στο 1,01%. Οι εμβολιασθέντες κρατούμενοι αποτελούσαν το 22% του συνόλου των κρατουμένων στις Φυλακές Μαλανδρίνου. Είχε προηγηθεί εμβολιασμός για την κοινή γρίπη σε ποσοστό 17%. Η κατανομή των εμβολιασθέντων του γενικού πληθυσμού βάσει του φύλου ήταν 287 άνδρες και 206 γυναίκες. Ο μέσος όρος ηλικίας των εμβολιασθέντων του γενικού πληθυσμού του νομού ήταν 61,9 έ- τη, με εύρος ηλικιών 1-96, ενώ των κρατουμένων 37,3 έτη, με εύρος Στο Διάγραμμα 1 φαίνεται αναλυτικά η ηλικιακή κατανομή του συνόλου των εμβολιασθέντων. Η χρονική κατανομή της προσέλευσης καταγράφεται στο Διάγραμμα 2. Εξαιρέθηκαν οι Αριθμός ατόμων Διάγραμμα 2. Χρονική κατανομή της προσέλευσης ατόμων για εμβολιασμό (εξαιρούνται οι κρατούμενοι). 17/11/ /11/2009 1/12/2009 8/12/ /12/ /12/ /12/2009 5/1/2010 Χρόνος σε εβδομάδες

18 Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 4, Διάγραμμα 3. Ποσοστά προσέλευσης ανά εμβολιαστικό κέντρο. κρατούμενοι, καθώς δεν είχαν δυνατότητα επιλογής του χρόνου εμβολιασμού τους. Παρατηρήθηκε κορύφωση του αριθμού των εμβολιασθέντων την 3η εβδομάδα μετά την έναρξη του εμβολιασμού, δηλαδή από 30/11/2009 και συγκεκριμένα στις 4/12/2009. Από τους επαγγελματίες υγείας ανταποκρίθηκαν μόνο 21 άτομα που υπολείπονται κατά πολύ των 76 που εμβολιάστηκαν για την κοινή γρίπη το φθινόπωρο του 2009, ενώ καμία έγκυος γυναίκα δεν εμβολιάσθηκε στην περιοχή μας. Στο Διάγραμμα 3 φαίνεται η προσέλευση α- νά εμβολιαστικό κέντρο. Ποσοστό 52,6% των εμβολιασθέντων ατόμων δεν είχε ειδικές ενδείξεις εμβολιασμού, ε- νώ το 47,6% ανήκε σε ομάδες υψηλού κινδύνου με επιμέρους παράγοντες κινδύνου, όπως φαίνονται στους Πίνακες 1 και 2. Συμπέρασμα - Συζήτηση Η εμφάνιση των πρώτων κρουσμάτων της νέας γρίπης στην Ελλάδα, οδήγησε στην ανάγκη Πίνακας 1. Αριθμός ατόμων και ομάδες που εμβολιάσθηκαν. Γενικού πληθυσμού 493 Κρατούμενοι 112 Σύνολο 605 Με ειδικές ενδείξεις 287 Χωρίς ειδικές ενδείξεις 318 Σύνολο 605 του μέσου πολίτη για αυξημένη πληροφόρηση. Η άποψη των ειδικών ότι δεν μπορεί κανείς με α- σφάλεια να γνωρίζει την εξέλιξη της πανδημίας, θεωρήθηκε από το κοινό ως ένδειξη αδυναμίας και όχι γνώσης. Η αύξηση των κρουσμάτων, των παρενεργειών και των πρώτων θανάτων έτυχαν ιδιαίτερης δημοσιότητας και είχε ως συνέπεια την εμφάνιση αντιδράσεων που έφθαναν στα όρια πανικού. Όμως η καθυστερημένη έλευση του πανδημικού κύματος στην Ελλάδα αποφόρτισε τη μαζική ψυχολογία, ενώ ταυτοχρόνως επηρέασε αρνητικά την προσέλευση για εμβολιασμό. Ο εμβολιασμός αποτέλεσε το επίκεντρο ιδιότυπης αντιπαράθεσης απόψεων από τα Μ.Μ.Ε. Αβάσιμες πληροφορίες, αρνητισμός συντηρούμενος από τα Μ.Μ.Ε. αλλά και ανακριβής πληροφόρηση από το διαδίκτυο, δαιμονοποίηση του εμβολίου οδήγησε σε ανεπαρκή ανταπόκριση στον εμβολιασμό 8. Ο πληθυσμός της Φωκίδας ανταποκρίθηκε στην καμπάνια των φορέων Υγείας για εμβολιασμό έναντι της γρίπης Α (Η1Ν1) με το εξαιρετικά χαμηλό ποσοστό του 1,01% που υπολείπεται Πίνακας 2. Αριθμός ατόμων (και % συχνότητα) με ε- πιμέρους ειδικές ενδείξεις, που εμβολιάσθηκαν. Ειδικές ενδείξεις Αριθ. (%) Αιματολογικές διαταραχές 10 3,5 Αιμοδότες 1 0,30 Ανοσοκατασταλμένοι 13 4,5 Άτομα που φροντίζουν βρέφη 5 1,7 Επαγγελματίες υγείας 21 7,3 Μεταβολικές διαταραχές 12 4,2 Νευρολογικά νοσήματα 10 3,5 Σακχαρ. διαβήτης 39 13,6 Χρ. ηπατικές διαταραχές 5 1,7 Χρ. νεφρικές διαταραχές 14 4,9 Χρ. αναπνευστικά νοσήματα 58 20,2 Χρ. καρδιαγγειακά νοσήματα 80 27,9 Κρατούμενοι φυλακών ,0 Σύνολο 287

19 192 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία σημαντικά του απαιτούμενου για την προστασία έναντι της πανδημίας (60%), ενώ συνολικά στον ελλαδικό χώρο την αντίστοιχη χρονική περίοδο, σύμφωνα με στατιστικά στοιχεία του ΚΕΕΛ- ΠΝΟ εμβολιάστηκαν άτομα, ποσοστό που αντιστοιχεί στο 3,2% του πληθυσμού 9. Κυρίως ανταποκρίθηκαν οι άνω των εξήντα ετών οι οποίοι είναι εξοικειωμένοι με τους εμβολιασμούς και ιδιαίτερα με εκείνο της κοινής γρίπης, ενώ δεν παρατηρήθηκε ανάλογη ανταπόκριση από παιδιά. Οι κρατούμενοι με μικρότερο Μ.Ο. ηλικίας, είχαν την ίδια συμμετοχή με εκείνη προς το εμβόλιο για την κοινή γρίπη. Όσοι αποφάσισαν τον εμβολιασμό προσήλθαν τις ημέρες κορύφωσης της προσπάθειας του ΚΕΕΛΠΝΟ και της επικαιρότητας του θέματος, δηλαδή το πρώτο δεκαπενθήμερο του Δεκεμβρίου 2009 και σταμάτησαν εντελώς μετά το πρώτο δεκαήμερο του Ιανουαρίου Η προσέλευση ανά εμβολιαστικό κέντρο αντανακλά την πληθυσμιακή κατανομή. Η ειδική ομάδα με την καλύτερη ανταπόκριση ήταν εκείνη των κρατουμένων και ακολούθησαν όσοι είχαν επιβαρυντικούς παράγοντες από το καρδιαγγειακό σύστημα, χρόνια αναπνευστικά προβλήματα και σακχαρώδη διαβήτη. Σύμφωνα με τηλεφωνική έρευνα που πραγματοποίησε το Πανεπιστήμιο Αθηνών 10, σχετικά με το σύνδρομο γρίπης, συνολικά εκτιμήθηκε ότι το 17,3% του πληθυσμού είχε ήδη μολυνθεί από τον ιό της νέας γρίπης από την 35η εβδομάδα έως την 52η εβδομάδα του Παρατηρήθηκε επίσης χαμηλό ποσοστό όσον αφορά την πρόθεση εμβολιασμού. Το μεγαλύτερο ποσοστό πρόθεσης εμβολιασμού παρατηρήθηκε τις πρώτες εβδομάδες (35η έως 38η) και έφτασε μόλις το 24%, ενώ υπήρξε μια σημαντική αύξηση του α- ριθμού των ατόμων που ήταν σαφώς αρνητικοί απέναντι στον εμβολιασμό καθώς περνούσαν οι εβδομάδες. Σύμφωνα με τους ερευνητές, ο βασικότερος λόγος μη εμβολιασμού ήταν η πεποίθηση του κόσμου ότι το εμβόλιο δεν ήταν ασφαλές. Αύξηση παρουσίασε τις τελευταίες εβδομάδες το ποσοστό των ατόμων που αιτιολογεί την αρνητική πρόθεση με το επιχείρημα ότι η γρίπη αποτελεί ήπια νόσο καθώς και ότι δεν ανήκει στις ομάδες που προτείνονται για εμβολιασμό. Ως εκ τούτου, μέχρι την 52η εβδομάδα, είχε εμβολιαστεί μόλις το 3,3% του συνόλου των ατόμων χωρίς χρόνια νοσήματα, ενώ το αντίστοιχο ποσοστό για τα ά- τομα με χρόνια νοσήματα έφτανε το 11,8%. Επίσης, ενδιαφέρον παρουσιάζει η ανταπόκριση του πληθυσμού στον εμβολιασμό για την κοινή γρίπη έως τη 52η εβδομάδα που έφτασε το 16,9%, σαφώς μεγαλύτερο σε σύγκριση με το α- ντίστοιχο ποσοστό εμβολιασμού για τη νέα γρίπη. Η έρευνά μας έδειξε ότι οι κάτοικοι του νομού Φωκίδας δεν πείσθηκαν να εμβολιαστούν και συνεπώς ότι κινδυνεύουν από τον ιό Α (Η1Ν1), αντανακλώντας τη γενικότερη στάση που τήρησε ο πληθυσμός ολόκληρης της Ελλάδος. Καθοριστικοί παράγοντες για τη στάση αυτή ήταν τα αντιφατικά μηνύματα των ΜΜΕ και της ιατρικής κοινότητας, ο φόβος παρενεργειών από το νέο εμβόλιο και η ηπιότητα της νόσου. Ο κίνδυνος ωστόσο είναι ακόμα υπαρκτός και, ενόψει της παρασκευής του νέου εμβολίου κατά της γρίπης Α(Η1Ν1) για την περίοδο , οι υπεύθυνοι οργανισμοί Υγείας θα πρέπει να τεκμηριώσουν την απειλή του κινδύνου από το λοιμογόνο παράγοντα και να μελετήσουν πιο επισταμένα τους παράγοντες που ευαισθητοποιούν και κινητοποιούν τις κοινωνίες για να ανταποκριθούν σε παγκόσμιες προσπάθειες ελέγχου πανδημιών όπως αυτή 11. Διεύθυνση Επικοινωνίας: κ. Ε. Παπούλια Διευθύντρια Μικροβιολογικού Τμήματος Γ.Ν. Άμφισσας

20 193 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 4, Summary The efficacy of vaccine campaign against A(H1N1) virus H. PERISINAKIS 1, P. VASILOPOULOS 2, P. PNEUMATIKOU 3, N. ZAPANIOTIS 3, P. TSAXRIS 3, P. DIMOLIANIS 3, E. PAPOULIA 3 1 Dept. of Surgery and Microbiology Dept. 3 General Hospital of Amfissa Greece The immunization campaign against pandemic influenza A(H1N1) started in Fokida prefecture, population in line with national campaign, on November 16th 2009, following the instructions of the World Health Organization. The population correspondence rate in Fokida (1,01%) was considerably lower than the national average (3,2%) and below the threshold against pandemic protection (60%). The majority of the correspondents came from elderly people (above 60yo), while 47% of the vaccinated population reported special medical indications. The population concerns on the vaccine safety was the main reason for the high levels of abstinence, further stiffened by the contradictory stance of the medical community and media, and the mildness of disease. [Key words: immunization, campaign, influenza, A(H1N1) virus]. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. ΒΙΚΙΠΑΙΔΕΙΑ. Γρίπη Η1Ν1 %CE%AF%CF%80%CE%B7_%CE%971%CE% 9D1, 28 Ιουνίου, Αντωνιάδης Α, Καρτάλη Σ, Λεγάκης ΝΣ, Μανιάτης Α, Τσελέντης Ι. Ιατρική Μικροβιολογία 3η Έκδοση, Πασχαλίδης, Αθήνα (2005) ΤΟΜΟΣ ΙΙ, Κεφ. 36, σσ Tortora GJ, Funke BR, Case CL. Eισαγωγή στη Μικροβιολογία. Επιμέλεια: Α. Τσακρής, Πασχαλίδης Αθήνα (2009) ΤΟΜΟΣ ΙΙ, Κεφ. 24, σσ WHO (2009) World Health Organization. Global Alert and Report. html, 10 August, HEALTH VIEW. Πληροφορίες για ταξιδιώτες σχετικά με τη γρίπη από τον νέο ιό Η1Ν1. CE%B5%CE%BB%CF%80%CE%BD%CE%BF,1 Μαΐου, Υπουργείο Παιδείας, Διά Βίου Μάθησης και Θρησκευμάτων. Ενημέρωση για τη νέα γρίπη Α(Η1Ν1), Οδηγίες για τη νέα γρίπη 25 Νοεμβρίου, Nοσοκομεία. Νέα Γρίπη Α (Η1Ν1). Ερωτήσεις και απαντήσεις για τα εμβόλια κατά του Η1Ν1 h t t p : / / w w w. n o s o k o m i a. g r / w e b / i n d e x. php?option=com_content&task=view&id=370&i temid=203, 15 Νοεμβρίου, Παππάς Γ. Ψυχοκοινωνικές παράμετροι της πανδημίας Η1Ν1. Δελτίο Ελληνικής Μικροβιολογικής Εταιρείας, Νοέμβριος-Δεκέμβριος 2009, σ.σ ΚΕΕΛΠΝΟ (2009) Κέντρο Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων. ΔΕΛΤΙΑ ΤΥΠΟΥ ΣΧΕΤΙΚΑ ΜΕ ΤΟΝ ΕΜΒΟΛΙΑΣΜΟ 26 Φεβρουαρίου, ΤΜΗΜΑ ΥΓΙΕΙΝΗΣ ΚΑΙ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ. ΤΗΛΕΦΩΝΙ- ΚΗ ΕΡΕΥΝΑ ΓΡΙΠΩΔΟΥΣ ΣΥΝΔΡΟΜΗΣ 14 Ιανουαρίου, Tsiodras S, Sypsa V, Hatzakis A. The vaccination campaign against 2009 pandemic influenza A(H1N1) and its continued importance in view of the uncertainty surrounding the risk associated with the pandemic. Υποβλήθηκε: 19/9/2010 Εγκρίθηκε: 9/11/2010