ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΑΕΙΦΟΡΙΚΗΣ ΓΕΩΡΓΙΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ. ΓΚΟΥΝΤΗ ΒΑΣΙΛΙΚΗ Γεωπόνος

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΑΕΙΦΟΡΙΚΗΣ ΓΕΩΡΓΙΚΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΓΚΟΥΝΤΗ ΒΑΣΙΛΙΚΗ Γεωπόνος ΕΝΑΛΛΑΚΤΙΚΕΣ ΜΟΡΦΕΣ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗΣ ΤΟΥ ΠΑΡΑΣΙΤΙΚΟΥ ΑΚΑΡΕΟΣ Varroa destructor ΤΗΣ ΜΕΛΙΣΣΑΣ Apis mellifera ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2010 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1

2 Πρόλογος. 3 Εισαγωγή. 4 Υλικά και Μέθοδοι. 10 Εφαρµογή των σκευασµάτων Apiguard και Exomite Apis Ανάλυση µελιού για υπολείµµατα θυµόλης µετά την εφαρµογή των σκευασµάτων Apiguard και Exomite Apis.. 14 Χρήση παγίδων κηφηνόγονου. 18 Στατιστική επεξεργασία Αποτελέσµατα-Συζήτηση Εφαρµογή των σκευασµάτων Apiguard και Exomite Apis Ανάλυση µελιού για υπολείµµατα θυµόλης µετά την εφαρµογή των σκευασµάτων Apiguard και Exomite Apis.. 32 Χρήση παγίδων κηφηνόγονου. 34 Συµπεράσµατα 41 Βιβλιογραφία Παράρτηµα

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στα πλαίσια του µεταπτυχιακού Αειφορικής Γεωργικής Ανάπτυξης, της Γεωπονικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης. Η ενασχόληση µου και το ενδιαφέρον µου µε τον τοµέα της µελισσοκοµίας ξεκίνησε σε προπτυχιακό επίπεδο, µε την παρακολούθηση του µαθήµατος της Μελισσοκοµίας του επιβλέποντα καθηγητή µου κ. Ανδρέα Θρασυβούλου. Αρχικά µέσα από τις διαλέξεις του µαθήµατος, αλλά και αργότερα από συζητήσεις µε επαγγελµατίες µελισσοκόµους συνειδητοποίησα πως ένα από τα σηµαντικότερα προβλήµατα σε επίπεδο παρασιτικών ασθενειών της µέλισσας αποτελεί το άκαρι Varroa destructor. Η βαρροϊκή ακαρίαση αποτελεί επίσης την µοναδική ασθένεια της µέλισσας, εναντίων της οποίας επιτρέπεται η χρήση εγκεκριµένων φαρµακευτικών σκευασµάτων, τόσο χηµικών όσο και βιολογικών. Στα πλαίσια της ανάγκης ανάπτυξης της γεωργίας προς µια αειφορική κατεύθυνση και της ελαχιστοποίησης της χρήσης χηµικών σκευασµάτων αποφάσισα να ασχοληθώ µε την διερεύνηση εναλλακτικών µορφών αντιµετώπισης του παρασιτικού ακάρεως Varroa destructor. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τα άτοµα που συνέβαλαν, σε µικρό ή µεγάλο βαθµό στην εκπόνηση της παρούσας διατριβής. Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα της µεταπτυχιακής µου διατριβής κ. Ανδρέα Θρασυβούλου, για την ανάθεση του θέµατος, την καθοδήγηση και την διαρκή µεταβίβαση των γνώσεων του καθ όλη την διάρκεια του µεταπτυχιακού αλλά και νωρίτερα για την ευκαιρία που έδωσε σε µένα, αλλά και σε πλήθος άλλων φοιτητών να γνωρίσουν και να αγαπήσουν τη µελισσοκοµία, τόσο ως επιστήµη, όσο και ως ασχολία. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω την λέκτορα κ. Χρύσα Τανανάκη για την βοήθειά της στην πραγµατοποίηση του υπολειµµατικού ελέγχου στο µέλι. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω τον διδάκτορα Μελισσοκοµίας Αλέξανδρο Παπαχριστοφόρου για την συνεχή υποστήριξή του και τις χρήσιµες συµβουλές στην συγγραφή του κειµένου. 3

4 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Κατά τη διάρκεια των τελευταίων τριών δεκαετιών το εκτοπαρασιτικό άκαρι Varroa destructor (Anderson and Trueman, 2000) εξελίχθηκε στον πλέον σηµαντικό εχθρό της µέλισσας Apis mellifera (De Jong, 1997; Spivak, 1999). Το άκαρι πρωτοεµφανίστηκε στην Ευρώπη στην περιοχή της Βουλγαρίας κατά το έτος Το 1978 επισηµάνθηκε για πρώτη φορά στην περιοχή της Ορεστιάδας, µε πιθανότερη την εισαγωγή του εντός των ελληνικών συνόρων από την περιοχή της Βουλγαρίας ή της Γιουγκοσλαβίας (Υφαντίδης και Θρασυβούλου, 1978). Η πολιτεία οριοθέτησε τη χώρα σε δυο τµήµατα, µολυσµένο και µη, µέτρο που όπως απεδείχθη στην πορεία δεν µπόρεσε να καταστεί ικανό να περιορίσει την προσβολή. Το άκαρι αποτελεί παράσιτο τόσο των ακµαίων ενήλικων µελισσών, όσο και του γόνου. Με στόχο την αναπαραγωγή, η βαρρόα εισέρχεται στα εργατικά κελιά και στα κηφηνοκέλια προτού αυτά σφραγισθούν (Camazine, 1986; Ifantidis,1988; Boot et al., 1999) και τρέφεται µε την αιµολέµφο του ξενιστή της. Έχει αποδειχθεί πως η εισαγωγή του ακάρεος στα κελιά που περιέχουν ασφράγιστο γόνο γίνεται κυρίως παθητικά, δηλαδή µέσω µίας παραµάνας εργάτριας πάνω στην οποία αυτό παρασιτεί (Boot and Calis, 1990; Ifantidis). Είναι γνωστό πως το άκαρι έχει την ικανότητα να διακρίνει την ηλικία και τις αρµοδιότητες των µελισσών που παρασιτεί. Έτσι, εγκαταλείπει σύντοµα τις συλλέκτριες αλλά και τις προσφάτως εκκολαπτόµενες µέλισσες µε σκοπό να παρασιτήσει νεαρές παραµάνες µέλισσες που θα εξασφαλίσουν και την εισαγωγή του στα κελιά του γόνου (Hoppe and Ritter, 1988; Steiner, 1993). Αξίζει να σηµειωθεί πως η προσβολή του κηφηνογόνου είναι συχνότερη από την αντίστοιχη του εργατικού γόνου και αυτό µπορεί να οφείλεται σε διάφορους παράγοντες, όπως ελκυστικές ουσίες(conte Le et al., 1989), ευνοϊκότερες θερµοκρασίες (Conte Le and Arnold, 1988; Conte Le et al., 1990), αλλά και η µεγαλύτερη συχνότητα επισκέψεων των µελισσών στον κηφηνογόνο (Υφαντίδης, 1995). Οι βαριά προσβεβληµένες µέλισσες, εφόσον εκκολαφθούν, παρουσιάζουν απώλεια βάρους, δυσµορφία και περιορισµένη διάρκεια ζωής. Επιπλέον έχει αποδεχθεί πως το άκαρι λειτουργεί ως φορέας ασθενειών (Ball, 1994) κυρίως ιολογικών (Ball and Allen, 1988). Συνήθως οι µέλισσες στερούνται της ικανότητας να πετάξουν λόγω του συνδρόµου του ιού της δυσµορφίας των φτερών Deformed Wing Virus syndrome (DWV) που µεταδίδεται µέσω του ακάρεος( Ball, 1989; Bowen-Walker et al., 1999) Εάν τα µελίσσια δε λάβουν θεραπεία η θνησιµότητα τους προσεγγίζει το 100% και οι αποικίες µπορεί να καταρρεύσουν µέσα σε µερικά χρόνια (Sammataro et al., 1998; Ball, 1994). Ως αποτέλεσµα, η έρευνα κατά τη διάρκεια των τελευταίων τριάντα ετών έχει στραφεί στον έλεγχο καταπολέµηση της προσβολής από βαρρόα. Πολλά φαρµακευτικά σκευάσµατα και µέθοδοι έχουν δοκιµασθεί σε εργαστηριακές συνθήκες και σε συνθήκες αγρού. Χηµικές µέθοδοι καταπολέµησης Οι χηµικές ουσίες ήταν µεταξύ των πρώτων που δοκιµάστηκαν και εφαρµόστηκαν ενάντια του ακάρεος (Ritter, 1988; Wienands, 1988). Οι ουσίες fluvalinate, coumaphos, bromopropylate, amitraz, flumethrin σε πολλά σκευάσµατα και µε 4

5 διάφορους τρόπους έχουν εφαρµοστεί ευρέως σε παγκόσµια κλίµακα (Klepsh et al., 1983; Ritter, 1985; Koeniger and Chmielewski, 1986; Koeniger and Fuchs, 1988; Borneck and Merle, 1989). Η απλή και εύκολη εφαρµογή και το χαµηλό κόστος ήταν οι κύριοι λόγοι που οδήγησαν στην ευρεία χρήση χηµικών µεθόδων καταπολέµησης. Οι χηµικές θεραπείες έχουν καταστήσει εφικτό έναν πολύ αποτελεσµατικό έλεγχο της βαρροάτωσης. Πάραυτα, καµία από τις ουσίες που έχει εφαρµοστεί έως τώρα δεν µπορεί να εξαλείψει πλήρως τα ακάρεα (Sampson and Martin, 1999), ούτε να τα εµποδίσει από το να εξαπλωθούν (Cavalloro, 1998), διότι η θεραπεία µε τα περισσότερα ακαρεοκτόνα είναι αποτελεσµατική µόνο απουσία σφραγισµένου γόνου. Τέτοιες συνθήκες απουσίας κλειστού γόνου λαµβάνουν χώρα µόνο κατά το φθινόπωρο και το χειµώνα και συνήθως απουσιάζουν τελείως στις θερµότερες περιοχές. Επιπλέον, πολλά από τα σκευάσµατα µπορούν να εφαρµοστούν πάνω από µια συγκεκριµένη θερµοκρασία, και αυτό είναι δύσκολο να συνδυαστεί µε την απουσία σφραγισµένου γόνου (Milani and Barbattini, 1989). Επιπροσθέτως, η βαρρόα είναι πολύ ικανή στο να αναπτύξει ανθεκτικότητα σχεδόν σε κάθε ακαρεοκτόνο που εφαρµόζεται στο µελισσοκοµείο (Lodesani et al., 1995; Trouiller, 1998; Hillesheim, 1996; Elzen et al., 1998; Mozes-Koch et al., 2000; Elzen and Westervelt, 2002; Mutinelli and Baggio, 2004). Οι µελισσοκοµικές τεχνικές που είναι πιθανόν να οδηγήσουν σε ανθεκτικότητα του παρασίτου είναι, µεταξύ άλλων, οι ταινίες καπνισµού, η µακροχρόνια παραµονή ακαρεοκτόνων φαρµάκων µέσα στο µελίσσι και η χρήση ενός µόνο είδους σκευάσµατος ή η εφαρµογή µιας µόνο µεθόδου ενάντια του ακάρεος. Είναι γνωστή η παρουσία ανθεκτικών ακάρεων στο Amitraz (Elzen et al., 2000). Ακάρεα µε ανθεκτικότητα στα πυρεθροειδή αναφέρθηκαν για πρώτη φορά στην Ιταλία (Sprefico et al., 1993) ενώ η ανθεκτικότητα στο coumaphos περιγράφηκε επίσης στην Ιταλία (Spreafico et al., 2001) και στις ΗΠΑ. Στη χώρα µας διαπιστώθηκε η ανθεκτικότητα της βαρρόα στο fluvalinate, λόγω συνεχούς χρήσης του σκευάσµατος Μαυρίκ (Θρασυβούλου κ συν., 1998). Η εκδήλωση της ανθεκτικότητας του ακάρεος προκάλεσε µεγάλη ανησυχία καθώς το εύρος των δραστικών ουσιών-σκευασµάτων µε ακαρεοκτόνο δράση είναι περιορισµένο και έτσι το πρόβληµα δεν µπορεί να λυθεί µε εναλλαγή των χηµικών ουσιών που χρησιµοποιούνται ενάντια στη βαρρόα. Εκτός από την ανάπτυξη ανθεκτικότητας η συνεχής εφαρµογή χηµικών σκευασµάτων για την καταπολέµηση του ακάρεος είχε ως αποτέλεσµα την επιβάρυνση των προϊόντων κυψέλης και ειδικότερα του µελιού µε υπολείµµατα των φαρµάκων αυτών. Μεταξύ των ακαρεοκτόνων ουσιών τρεις είναι οι πιο συχνά ανιχνεύσιµες: το bromopropylate που περιέχεται στα Folbex VA Neu, το coumaphos στα Perizin, Asuntol και το fluvalinate στα Apistan, Mavrik (Wallner, 1999). Αυτές οι χηµικές ουσίες είναι λιπόφιλες και προσροφόνται στο κερί, µέσω του οποίου µε τη διαδικασία της διάχυσης µεταφέρονται στο µέλι (Bogdanov et al., 1998; Wallner, 1999). Ο χρόνος παραµονής τους στο µέλι ποικίλλει από 1 έως 18 µήνες (Θρασυβούλου). Εναλλακτικές µορφές καταπολέµησης του ακάρεος Τα µειονεκτήµατα των χηµικών µεθόδων καταπολέµησης του ακάρεος, καθώς και η γενικότερη τάση της γεωργίας και της κτηνοτροφίας για στροφή σε εναλλακτικές 5

6 µορφές καταπολέµησης των παρασίτων, φιλικές προς το περιβάλλον, οδήγησαν τους ερευνητές αλλά και τους επαγγελµατίες και ερασιτέχνες µελισσοκόµους, στην εξεύρεση ήπιων µορφών καταπολέµησης του ακάρεος. Στα πλαίσια µιας ολοκληρωµένης διαχείρισης του παρασίτου σκοπός παύει να είναι η ολοκληρωτική εξάλειψη αλλά η συγκράτηση του πληθυσµού του ακάρεος σε επίπεδα ανεκτά από τις µέλισσες, που δεν επηρεάζουν την παραγωγή. Α. Βιοτεχνικές µέθοδοι Η αναπαραγωγική συµπεριφορά του ακάρεος, δίνει την δυνατότητα εφαρµογής µη χηµικών µέτρων για την καταπολέµησή του. Όπως αναφέρθηκε και νωρίτερα, το άκαρι προτιµάει να αναπαράγεται στον κηφηνογόνο σε σχέση µα τον εργατικό γόνο. Τα ακάρεα που αναπαράγονται σε κηφηνογόνο δίνουν κατά µέσο όρο 2.2 µε 2.6 θηλυκούς απογόνους, ενώ εκείνα που παρασιτούν σε εργατικό γόνο δίνουν 1.3 µε 1.4 θηλυκούς απογόνους ανά ξενιστή (Schultz, 1984; Fuchs and Langenbach, 1989). Έτσι, το ακάρι βρίσκεται συχνότερα σε γόνο κηφήνων παρά σε εργατικό (Grobov, 1977; Sulimanovic et al., 1982; Issa and Goncalves, 1984; Schulz, 1984; Fuchs, 1990, 1992; Boot et al., 1991; Calderone and Kuenen, 2001). Ακόµη µια προσέγγιση της διαφοράς προσβολής εργατικών και κηφηνοκελιών από βαρρόα µέσω χρήσης µαθηµατικών µοντέλων δείχνει πως από κηφηνοκέλια θα προκύψουν όσα ακάρεα θα προέκυπταν από 1000 εργατικά κελιά (Wilkinson et al., 2002). Με την αφαίρεση του κηφηνογόνου από ένα µελίσσι είναι δυνατή η µείωση του συνολικού αριθµού των ακάρεων που βρίσκονται στην κυψέλη. Η διαδικασία αποµάκρυνσης του κηφηνογόνου απαιτεί τη δηµιουργία ειδικών πλαισίων, την καταστροφή-αφαίρεση των κελιών µε κηφηνογόνο (µε την απαραίτητη διαδικασία επαναχτισίµατος των κηρυθρών από τις µέλισσες) και την τήρηση µικρών χρονικών ορίων µεταξύ των αποµακρύνσεων (Santas and Lazarakis, 1984; Rozenkranz and Engels, 1985; Marletto et al., 1990, 1991; Charriere et al., 2003). Η µέθοδος αυτή φαίνεται να είναι αποτελεσµατική (Calderone, 2005), όµως πολλές µελέτες δείχνουν πως δεν είναι επαρκής για την καταπολέµηση του παρασίτου και επιβάλλεται να αποτελεί κοµµάτι µιας ολοκληρωµένης διαχείρισης ενάντια της βαρρόα σε συνδυασµό µε την εφαρµογή ήπιων σκευασµάτων, όπως το φορµικό οξύ (Charriere et al., 1998). Οι µέσοι όροι του λόγου ακάρεων ανά µέλισσα διαφέρει σηµαντικά µεταξύ µελισσιών που δέχτηκαν την µεταχείριση της αφαίρεσης του κηφηνογόνου και µελισσιών που δεν αφαιρούνταν κηφηνογόνος (Calderone, 2005). Αξίζει να αναφερθεί µια τεχνική που εφαρµόσθηκε από επαγγελµατία µελισσοκόµο στην Αµερική (Oliver, 2007). Είναι γνωστό πως οι µέλισσες όταν χτίζουν πάνω σε οδηγό φύλλου κηρύθρας, µετατρέπουν σχεδόν το 4% των κελιών σε κηφηνοκέλια. Αυτό κάνει την διαδικασία αφαίρεσης του κηφηνογόνου ιδιαίτερα δύσκολη και χρονοβόρα. Ο συγκεκριµένος µελισσοκόµος δηµιούργησε ένα πλαίσιο µε διαφορετική διάταξη που στο πάνω του κοµµάτι(1/3 του συνολικού ύψους) φέρει φύλλο κηρύθρας, ενώ το υπόλοιπο, που χωρίζεται µε ένα οριζόντιο τµήµα ξύλου, αφήνεται για να χτιστεί από τις µέλισσες. Οι µέλισσες αποθηκεύουν µέλι στο πάνω τµήµα του πλαισίου, ενώ στο υπόλοιπο κοµµάτι παρατηρήθηκε ότι χτίζουν αποκλειστικά κηφηνοκέλια. Με αυτό τον τρόπο, ο µελισσοκόµος έχει τη δυνατότητα της γρήγορης και εύκολης αφαίρεσης του τµήµατος των κηφηνοκελιών από το πλαίσιο, το οποίο επανατοποθετείται στην κυψέλη, ώστε οι µέλισσες να ξαναχτίσουν τα κοµµάτι που αφαιρέθηκε. 6

7 Η εφαρµογή µη χηµικών µεθόδων είναι γενικά επίπονη διεργασία και πολλές φορές µε ποικίλη αποτελεσµατικότητα, που εξαρτάται από τις καιρικές συνθήκες (κυρίως το θερµοκρασιακό εύρος), την δυναµικότητα των µελισσιών, την παρουσία ή όχι γόνου και την δραστηριότητα των µελισσιών (Calderone et al., 1997; Nanetti et al., 2003). Β. Φυσικά προϊόντα Πολλά φυσικά προϊόντα έχουν χρησιµοποιηθεί ενάντια της βαρρόα. Οργανικά οξέα όπως το φορµικό οξύ, το γαλακτικό οξύ και το οξαλικό οξύ είναι µεταξύ των πιο χρησιµοποιούµενων στην εφαρµοσµένη µελισσοκοµία (Kunzler et al., 1979; Kramer, 1982; Kraus and Berg, 1994; Imdorf et al., 1995; Nanetti et al., 2003). Εκτός των οργανικών οξέων η έρευνα τα τελευταία χρόνια έχει στραφεί στην αποτελεσµατικότητα των αιθέριων ελαίων ενάντια του ακάρεος. Τα αιθέρια έλαια είναι φυτικά παράγωγα που βρίσκονται σε διάφορα µέρη και όργανα του φυτού και µπορεί να λειτουργούν είτε ως παράγοντες προσέλκυσης εντόµων επικονιαστών είτε ως απωθητικές ουσίες παρέχοντας προστασία από φυτοφάγα έντοµα και ακάρεα. Μεγάλος αριθµός αιθέριων ελαίων έχει δοκιµασθεί για την ακαρεοκτόνο δράση τους (Imdorf et al., 1999) τόσο εργαστηριακά όσο και µε πειράµατα στον αγρό (Hoppe, 1990; Sidorov, 1977; Shutov, 1989). Τα αποτελέσµατα έδειξαν πως υπάρχουν αιθέρια έλαια µε ακαρεοκτόνο δράση αλλά και άλλα που δρουν ως προσελκυστικά των παρασίτων, αυξάνοντας τον βαθµό προσβολής των µελισσιών (Bunsen, 1991). Πέραν όµως της δράσης των αιθέριων ελαίων ενάντια του ακάρεος σηµαντική έρευνα έχει διεξαχθεί και για την επίδρασή τους στις ενήλικες µέλισσες και στο γόνο, καθώς και τυχόν αναστάτωση του µελισσιού από την διαταραχή της ισορροπίας των οσµών που προκαλείται από την εισαγωγή τους στην κυψέλη (Kraus, 1990). Η εφαρµογή των αιθέριων ελαίων στην κυψέλη µπορεί να γίνει µε παθητική εξάτµιση, ψεκασµό διαλύµατος είτε υποκαπνισµό. Από τα αιθέρια έλαια που έχουν δοκιµασθεί, ακαρεοκτόνο δράση φάνηκε να έχουν η ευκαλυπτόλη και η θυµόλη. Από αυτά, η θυµόλη είναι η πιο ευρέως διαδεδοµένη ουσία (Sidorov et al., 1977; Smirnov, 1978; Mikityuk, 1983; Mladan et al., 1985) και έχει µελετηθεί τόσο που ήδη στο εµπόριο κυκλοφορούν αρκετά σκευάσµατα µε αυτήν ως δραστική ουσία. Πέραν της ακαρεοκτόνου δράσης είναι γνωστές και άλλες ιδιότητες της θυµόλης. Έχει προταθεί η δράση της ενάντια της ασκοσφαίρωσης Ascosphaera apis (Colin et al., 1989) αλλά και ενάντια άλλων παθογόνων οργανισµών που προκαλούν προβλήµατα στις µέλισσες (Kostecki, 1976; Grobov et al., 1981). Επιπλέον, κάποια φυτικά εκχυλίσµατα και ειδικότερα η κρυσταλλική θυµόλη παρουσιάζουν επαρκή βαρροοκτόνο δράση και οι µελισσοκόµοι τείνουν να χρησιµοποιούν παρασκευάσµατα που βασίζονται στη θυµόλη (Colin, 1990; Chiesa, 1991; Gal et al., 1992). Από τα σκευάσµατα που κυκλοφορούν στο εµπόριο µε βάση τη θυµόλη, ευρέως γνωστά είναι τα ApiLife Var, Apiguard ενώ πρόσφατα δοκιµάστηκε ένα νέο προϊόν µε την ονοµασία Exomite Apis. Το σκεύασµα Apilife Var έχει τη µορφή ταµπλετών βερµικουλίτη εµποτισµένων µε ένα µίγµα αιθερίων ελαίων, θυµόλης (76%), ευκαλυπτόλης (16.4%), µενθόλης (3.8%) και καµφοράς (3.8%). Είναι εύκολο στην εφαρµογή, η οποία γίνεται µε εισαγωγή της 7

8 ταµπλέτας στην κυψέλη, και η αποτελεσµατικότητά του ποικίλλει ανάλογα των κλιµατικών συνθηκών, από 66 έως 99% (Stanghellini and Raybold, 2004; Ellis et al., 2001; Imdorf et al., 1999). Το προϊόν Apiguard έχει ως δραστική ουσία αποκλειστικά την θυµόλη. Διατίθεται υπο τη µορφή γέλης µε την ιδιότητα της αργής αποδέσµευσης της δραστικής ουσίας στο περιβάλλον (παθητική εξάτµιση) και φέρεται σε µεταλλικά δισκία των 50gr (θυµόλη 25%). Διάφορες τιµές αποτελεσµατικότητας έχουν βρεθεί για το εν λόγω σκεύασµα, που κυµαίνονται από 74 έως 99% (Trouiler, 2004), αν και έχουν δηµοσιευθεί εργασίες όπου η αποτελεσµατικότητα του Apiguard βρέθηκε να έχει χαµηλότερη τιµή (Coffey, 2007; Baggio et al., 2004; Mattila and Ottis, 1999). Η παραλλακτικότητα αυτή στην αποτελεσµατικότητα του σκευάσµατος αποδεικνύει πως το θερµοκρασιακό εύρος παίζει σηµαντικό ρόλο στην εξάτµιση της δραστικής ουσίας διαµέσων της γέλης, επηρεάζοντας έτσι την καταπολέµηση. Το νέο σκεύασµα Exomite Apis της εταιρίας Exosect αποτελεί ένα σύστηµα καταπολέµησης της βαρρόα, καθώς απαρτίζεται από έναν διανεµητή µε τη µορφή δίσκου που τοποθετείται στην είσοδο της κυψέλης και το σκεύασµα Entostat µε τη µορφή σκόνης πατενταρισµένης τεχνολογίας. Η σκόνη αυτή φέρει υψηλό ηλεκτροστατικό φορτίο, που σε συνδυασµό µε τον ηλεκτρικά φορτισµένο εξωσκελετό των µελισσών, κολλάει στο σώµα τους και βρίσκεται έτσι σε συνεχή επαφή. Η σκόνη τοποθετείται στον διανεµητή µπροστά από την είσοδο της κυψέλης, έτσι κάθε µέλισσα που εισέρχεται στην κυψέλη υποχρεούται να περάσει από τον διανεµητή, προσκολλώντας την ειδική σκόνη και µεταφέροντάς τη πάνω στο σώµα της. Στην προσπάθεια του εντόµου να καθαριστεί, λόγω του ηλεκτροστατικού φορτίου, η σκόνη δεν αποµακρύνεται από το σώµα, απλά ανακατανέµεται σε αυτό. Και πάλι η θυµόλη είναι η µοναδική δραστική ουσία του προϊόντος αυτού, όπως και του Apiguard, όµως το Exomite Apis φέρει κατά 60% λιγότερη θυµόλη από τα άλλα παρόµοια προϊόντα που κυκλοφορούν στο εµπόριο. Η εταιρία παραγωγής ισχυρίζεται πως λόγω της συνεχούς παραµονής και επαφής της ηλεκτροστατικής σκόνης πάνω στις µέλισσες, λιγότερη ποσότητα δραστικής ουσίας απαιτείται, ώστε το προϊόν να είναι αποτελεσµατικό. Ελάχιστη έρευνα έχει διεξαχθεί παγκοσµίως για την αποτελεσµατικότητα του Exomite Apis, και όπου έχει γίνει αυτό, δεν υπάρχουν στοιχεία δηµοσιευµένων εργασιών. Εξαίρεση αποτελούν δύο δηµοσιευµένες εργασίες που εκπονήθηκαν η µία στην Ιρλανδία (Coffey, 2007) και η δεύτερη στη Φλόριντα των Ηνωµένων Πολιτειών (Burns et al, 2005). Στην πρώτη εργασία η αποτελεσµατικότητα του συστήµατος Exomite Apis βρέθηκε πολύ χαµηλή, αγγίζοντας µόλις το 28%, ενώ η θεωρητική εκτίµηση της αποτελεσµατικότητας είναι 80% (Coffey, 2007). Η εξήγηση της χαµηλής αποτελεσµατικότητας στην εργασία αυτή ήταν πως ένα µεγάλο ποσοστό της σκόνης αποµακρύνθηκε από την κυψέλη µέσα σε λίγες ώρες µετά την χορήγηση. Στην δεύτερη εργασία όπου το πειραµατικό µέρος διεξήχθη στις Η.Π.Α. χρησιµοποιήθηκε το σύστηµα µε τον διανεµητή µε τη διαφορά πως ερευνήθηκε, εκτός από την σκόνη Entostat και η αποτελεσµατικότητα της ζάχαρης σε σκόνη αλλά και της κρυσταλλικής θυµόλης. Τα αποτελέσµατα έδειξαν να µην υπάρχει στατιστικώς σηµαντική διαφορά µεταξύ της ζάχαρης και της ηλεκτροστατικά 8

9 φορτισµένης σκόνης Entostat, ενώ η κρυσταλλική θυµόλη διέφερε σηµαντικά από τις προηγούµενες εφαρµογές. Υπολείµµατα θυµόλης στο µέλι Έρευνες απέδειξαν πως η θυµόλη αφήνει υπολείµµατα στο µέλι ( Bogdanov et al, 1998). Σύµφωνα µε τον Ευρωπαϊκό κανονισµό Νº 2377/90 η θυµόλη ανήκει στην οµάδα II όπου υπάγονται τα µη τοξικά κτηνιατρικά φάρµακα, οπότε δεν είναι απαραίτητη η θέσπιση κατώτατου ορίου υπολειµµάτων. Τα αιθέρια έλαια όµως είναι ουσίες µε έντονη οσµή και ακόµη και πολύ µικρές ποσότητες µπορούν να αλλοιώσουν τη γεύση του µελιού, παρόλο που η θυµόλη απαντάται ως φυσικό συστατικό στο µέλι από άνθη φλαµουριάς(tilia spp) (Bogdanov et al, 1998).Το όριο στο οποίο γίνεται αντιληπτή η ύπαρξη θυµόλης στο µέλι µε την αίσθηση της γεύσης είναι µεταξύ 1.1 και 1.6mg/kg (Bogdanov et al, 1998), γι αυτό και η Ελβετία όρισε ως κατώτερο επιτρεπτό όριο υπολειµµάτων τα 0.8mg/kg. Όταν η θυµόλη χρησιµοποιείται ως ακαρεοκτόνο σε περιόδους που δεν υπάρχει νεκταροέκκριση, τότε τα υπολείµµατα στο µέλι ποικίλλουν από 0.02 έως 0.48 mg/kg (Bogdanov et al, 1998; Lodesani et al, 1992; Mutinelli et al, 1993; Tushaus 1993).Εντούτοις, όταν η θυµόλη χρησιµοποιείται σε περιόδους νεκταροέκκρισης υπάρχει σοβαρός κίνδυνος τα υπολείµµατα να υπερβούν το κατώτατο όριο, προσδίδοντας χαρακτηριστική οσµή στο µέλι. Ερευνητικό αντικείµενο Οι µέχρι σήµερα συµβατικές µέθοδοι καταπολέµησης του παρασιτικού ακάρεος Varroa destructor παρουσιάζουν τα µειονεκτήµατα ανάπτυξης ανθεκτικότητας και υπολειµµάτων στα προϊόντα κυψέλης. Παράλληλα δεν συµβαδίζουν µε τη γενικότερη στροφή της γεωργίας προς µια κατεύθυνση αειφορικής διαχείρισης και ελάχιστης χρήσης χηµικών σκευασµάτων, που θα περιορίζεται στο απολύτως απαραίτητο. Μέθοδοι εναλλακτικής αντιµετώπισης του ακάρεος έχουν δοκιµαστεί παγκοσµίως, είτε µέσω βιοτεχνικών µεθόδων, είτε µε τη χρήση φυσικά παραγόµενων προϊόντων. Η αποτελεσµατικότητα των µεθόδων αυτών διαφοροποιείται από περιοχή σε περιοχή καθώς επηρεάζεται σε µεγάλο βαθµό από τις κλιµατικές συνθήκες. Η παρούσα διατριβή αποσκοπεί στο να ερευνήσει α) Την βιοτεχνική µέθοδο καταπολέµησης του ακάρεος που βασίζεται στην διαδικασία αποµάκρυνσης του κηφηνογόνου ανά τακτά χρονικά διαστήµατα. β)την αντιµετώπιση του ακάρεος µε την χρήση φυσικών σκευασµάτων που έχουν ως δραστική ουσία το αιθέριο έλαιο θυµόλη. Δοκιµάστηκε για πρώτη φορά στην Ελλάδα το σκεύασµα Exomite Apis και µελετήθηκε τόσο η αποτελεσµατικότητά του εναντίον του ακάρεως της βαρρόα, όσο και οι επιπτώσεις που προκαλεί στις µέλισσες και τα προϊόντα τους. Τα αποτελέσµατα συγκρίθηκαν µε το εγκεκριµένο σκεύασµα Apiguard. 9

10 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Α) Εφαρµογή των σκευασµάτων Apiguard και Exomite Apis Η έρευνα πραγµατοποιήθηκε στο Εργαστήριο Μελισσοκοµίας, του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης το οποίο βρίσκεται στην περιοχή Θέρµης Θεσσαλονίκης. Αρχικός διαχωρισµός των πειραµατικών µελισσιών: Η έρευνα εφαρµόστηκε σε 45 µελίσσια τα οποία χωρίστηκαν σε τρεις ισοδύναµες πειραµατικές οµάδες: Μάρτυρας, Apiguard, Exomite-Apis. Τα µελίσσια που αποτελούσαν τις πειραµατικές οµάδες ήταν ισοδύναµης προσβολής και παρόµοιας δυναµικότητας (εικόνα 1). Για τον διαχωρισµό των µελισσιών στις τρεις οµάδες, συλλέχτηκαν 300 µέλισσες από 3 διαφορετικά πλαίσια από κάθε µελίσσι και υπολογίστηκε η επί τοις εκατό προσβολή από βαρρόα. Τρία δείγµατα των 200 σφραγισµένων εργατικών κελιών από 3 διαφορετικά πλαίσια σε κάθε µελίσσι ανοίχτηκαν επίσης ώστε να υπολογιστεί η επί τοις εκατό προσβολή του γόνου από βαρρόα. Με βάση τα αποτελέσµατα αυτά, τα µελίσσια χωρίστηκαν σε 3 οµάδες µε ισοδύναµη διακύµανση προσβολής από βαρρόα, ώστε στην κάθε οµάδα να αντιστοιχεί από ελαφριά έως βαριά προσβολή. Η κάθε οµάδα αποτελούνταν από 15 µελίσσια. Εικόνα 1. Μελίσσια των τριών οµάδων του πειράµατος Τα µελίσσια εγκαταστάθηκαν σε κυψέλες εξοπλισµένες µε κινητή βάση παρατήρησης που απαγορεύει την αποµάκρυνση των νεκρών ακάρεων από τις µέλισσες, βοηθώντας έτσι την καταµέτρησή τους (εικόνα 2). Μια κενή κυψέλη τοποθετήθηκε στην είσοδο 10

11 κάθε πειραµατικού µελισσιού, ώστε να καταµετρώνται οι νεκρές µέλισσες που αποµακρύνονταν από το µελίσσι. Εικόνα 2. Κυψέλη του πειραµατικού µελισσιού, µε κινητή βάση παρατήρησης και κενή κυψέλη στην είσοδο Καταµέτρηση νεκρών ακάρεων: Οι µετρήσεις πραγµατοποιούνταν κάθε 24 ώρες από την έναρξη του πειράµατος (εικόνα 3). Εικόνα 3. Καθαρισµός της κινητής βάσης µετά την καταµέτρηση των ακάρεων 11

12 Ακολουθήθηκε η εξής διαδικασία: Τα νεκρά ακάρεα µετρούνταν κάθε 24 ώρες, ξεκινώντας 2 ηµέρες πριν την πρώτη επέµβαση (ηµέρα -2) και τελειώνοντας 15 ηµέρες µετά την δεύτερη εφαρµογή (ηµέρα 28). Οι µετρήσεις πραγµατοποιούνταν στην ξύλινη κινητή βάση καταµέτρησης που βρισκόταν κάτω από το µεταλλικό πλέγµα στο πάτωµα της κυψέλης. Οι βάσεις αποµακρύνονταν σε καθηµερινή βάση και αφού καταµετρούνταν τα νεκρά ακάρεα, καθαρίζονταν και επιστρέφονταν στις κυψέλες. Καταµέτρηση νεκρών µελισσών: Οι νεκρές µέλισσες µετρούνταν ανά 24ωρο, ξεκινώντας 2 µέρες πριν την πρώτη εφαρµογή και τελειώνοντας 15 ηµέρες µετά την δεύτερη εφαρµογή (ηµέρα 28). Οι παγίδες νεκρών µελισσών (τα άδεια πατώµατα) αποµακρύνονταν, οι µέλισσες καταµετρούνταν, οι βάσεις τους καθαρίζονταν και επανατοποθετούνταν καθηµερινά (εικόνα 4). Εικόνα 4. Κενός όροφος στην είσοδο της κυψέλης για την διευκόλυνση της καταµέτρησης των νεκρών µελισσών Εφαρµογή Exomite Apis Για την εφαρµογή του Exomite Apis χρησιµοποιήθηκε συσκευασία του σκευάσµατος σε σκόνη (εικόνα 5). Κάθε συσκευασία περιείχε µια δόση εφαρµογής 20gr. Δε χρησιµοποιήθηκε το σύστηµα µε τον διανοµέα στην είσοδο της κυψέλης, αλλά ο περιέκτης ανοίχθηκε και το περιεχόµενό του διασκορπίστηκε πάνω από την επιφάνεια των πλαισίων της γονοφωλιάς διασφαλίζοντας πως όλη η περιοχή του γόνου καλύφθηκε. Η διαδικασία επαναλήφθηκε 14 ηµέρες µετά την πρώτη εφαρµογή. Κάθε συσκευασία περιείχε 20 gr σκόνης Entostat TM µε 6% θυµόλη και 0.5%αδρανές σιλικονούχο υλικό. Apiguard 12

13 Ένα δισκίο περιεκτικότητας 25 gr γέλης Apiguard τοποθετήθηκε στην κορυφή των πλαισίων µε γόνο σε κάθε µελίσσι (εικόνα 6). Τα δισκία αντικαταστάθηκαν 14 ηµέρες µετά την αρχική τοποθέτησή τους. Εικόνα 5. Εφαρµογή του σκευάσµατος Exomite Apis Εικόνα 6. Εφαρµογή του σκευάσµατος Apiguard Αποτελεσµατικότητα Η αποτελεσµατικότητα προσδιορίστηκε ως ο λόγος Α / Α+Β x100 Όπου Α ο συνολικός αριθµός των νεκρών ακάρεων κατά τη διάρκεια της θεραπείας και Β ο αριθµός των ακάρεων που επέζησαν µετά την θεραπεία. 13

14 Τα επιζήσαντα ακάρεα υπολογίστηκαν θανατώνοντας ολόκληρο τον πληθυσµό του µελισσιού κατά τη διάρκεια της νύχτας, καίγοντας θειάφι και στη συνέχεια µετρώντας τα ακάρεα στις νεκρές µέλισσες και µέσα στον κλειστό γόνο. Ηµερήσιο θερµοκρασιακό εύρος Το µέσο θερµοκρασιακό εύρος καθώς και η ανώτερη και η κατώτερη θερµοκρασία στα πειραµατικά µελισσοκοµεία, καταγράφονταν ηµερησίως από τον µετεωρολογικό σταθµό που βρίσκεται στο πανεπιστηµιακό αγρόκτηµα ( Ακολουθήθηκε το παρακάτω χρονοδιάγραµµα: Έλεγχος γόνου και βασίλισσας των µελισσιών αρχικά 3-4/10 και τελικά 5-6/11 Καταµέτρηση νεκρών ακάρεων σε καθηµερινή βάση από τις 5/10 έως και τις 2/11 Καταµέτρηση νεκρών µελισσών σε καθηµερινή βάση από τις 5/10 έως και τις 4/11 Εφαρµογή θεραπείας Apiguard και Exomite Apis έγινε δυο φορές µε ένα µεσοδιάστηµα 14 ηµερών, στις 7/10 και στις 20/10 Θανάτωση των µελισσιών ώστε να γίνει πλήρης καταγραφή του ποσοστού προσβολής από βαρρόα στις µέλισσες στις 5-6/11 Κατά τις ηµεροµηνίες 6/10, 18/10 και 31/10 συλλέχθηκε µέλι από πέντε µελίσσια κάθε οµάδας και αναλύθηκε µε τη µέθοδο της αέριας χρωµατογραφίας για τυχόν υπολείµµατα θυµόλης άνω των επιτρεπτών ορίων. Β) Ανάλυση µελιού για υπολείµµατα θυµόλης µετά την εφαρµογή των σκευασµάτων Apiguard και Exomite Apis Αντιδραστήρια Όλα τα αντιδραστήρια που χρησιµοποιήθηκαν για την ανάλυση ήταν αναλυτικής καθαρότητας (analytical reagent grade) (>99%). Η θυµόλη αγοράστηκε από την εταιρία Fluka (Γερµανία) και τα µητρικά διαλύµατα παρασκευάστηκαν σε ακετόνη καθαρότητας αέριου χρωµατογράφου (GC grade acetone), που αγοράστηκε από την εταιρία Merck (Γερµανία). Το στυρένιο της εταιρίας Aldrich (Γερµανία) χρησιµοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο και το µητρικό του διάλυµα παρασκευάστηκε σε ακετόνη σε συγκέντρωση 50µg/l. Το υπερκάθαρο νερό που χρησιµοποιήθηκε σε όλα τα πειράµατα παράχθηκε από τη συσκευή Millipore Simplicity 185 system (εικόνα 7). Όργανα Το σύστηµα Purge & Trap (O.I.Analytical, 4500) συνδεδεµένο µε έναν αυτόµατο δειγµατολήπτη (O.I.4552) χρησιµοποιήθηκε για την αποµόνωση των αερίων ενώσεων. Τα αποµονωµένα αντιδραστήρια συλλέχθηκαν σε µια παγίδα (Tenax TA, 100mg) και οι ενώσεις που εκχειλίσθηκαν διαχωρίστηκαν σε τριχοειδή στήλη HP- 5MS (30m x 0.25mm, df=0.25mm) χρησιµοποιώντας το µοντέλο αέριου χρωµατογράφου Agilent Η ανίχνευση πραγµατοποιήθηκε χρησιµοποιώντας φασµατογράφο µάζας Agilent 5973, ενώ τα δεδοµένα επεξεργάστηκαν µε το 14

15 πρόγραµµα ChemStation. Τα όργανα που χρσιµοποιήθηκαν παρουσιάζονται στις εικόνες 8-9. Εικόνα 7. H συσκευή Millipore Simplicity 185 system για την παραγωγή υπερκάθαρου νερού 15

16 Εικόνα 8. Το σύστηµα Purge & Trap (O.I.Analytical, 4500) συνδεδεµένο µε αυτόµατο δειγµατολήπτη (O.I.4552) Εικόνα 9. Το µοντέλο αέριου χρωµατογράφου Agilent Υπολογισµός θυµόλης 10gr από κάθε δείγµα µελιού ζυγίστηκαν και αραιώθηκαν σε 7gr υπερκάθαρου νερού. Τα διαλύµατα µεταφέρθηκαν σε γυάλινους υποδοχείς του συστήµατος εκχύλισης 16

17 χωρητικότητας 25ml, όπου προστέθηκαν 25µl του διαλύµατος εσωτερικού προτύπου και τα µείγµατα οµογενοποιήθηκαν χρησιµοποιώντας την συσκευή vortex. Στη συνέχεια τα διαλύµατα µεταφέρθηκαν στο σύστηµα Autosampler- Purge & Trap για την εκχύλιση της θυµόλης. Η αποµόνωση της θυµόλης επιτεύχθηκε κάτω από τις ακόλουθες συνθήκες: Ροή εκχύλισης (He): 30ml/min Χρόνος εκχύλισης: 40min Θερµική εκκρόφηση: 180 Cº Χρόνος εκκρόφησης: 7min Ο διαχωρισµός πραγµατοποιήθηκε µε το ακόλουθο θερµοκρασιακό πρόγραµµα: Αρχική θερµοκρασία: 40ºC (5min) Εν συνεχεία, αύξηση στους 120 ºC µε ταχύτητα 8 ºC/min και στους 280ºC µε ταχύτητα 15 ºC/min. Ως φέρον αέριο χρησιµοποιήθηκε το Ήλιο (He) µε ροή 1ml/min. Η ανίχνευση των διαχωρισµένων συστατικών πραγµατοποιήθηκε σε φασµατογράφο µάζας. Οι θερµοκρασίες ιονισµού και τετραπόλου ήταν 230 ºC και 150 ºC αντίστοιχα. Το δυναµικό ιονισµού ήταν στα 70eV. Για τον ποσοτικό προσδιορισµό δηµιουργήθηκε µια καµπύλη αναφοράς 6 σηµείων, σε δείγµα διαλύµατος ισογλυκόζης επιµολυσµένο µε γνωστές συγκεντρώσεις θυµόλης. Τα διαλύµατα που χρησιµοποιήθηκαν για την δηµιουργία της καµπύλης αναφοράς παρασκευάστηκαν ως εξής: 10g ισογλυκόζης (χωρίς ανιχνεύσιµα ποσά θυµόλης) ζυγίστηκαν και αραιώθηκαν µε 7g υπερκάθαρου νερού. Στη συνέχεια σε αυτά τα διαλύµατα προστέθηκαν ποσότητες ακετονικών διαλυµάτων θυµόλης συγκεκριµένων συγκεντρώσεων, έτσι ώστε οι τελικές συγκεντρώσεις στα διαλύµατα να είναι 0.001, 0.2, 0.7, 1,5, 2.3 και 3 mg/g. Αυτά τα διαλύµατα αναλύθηκαν στις ίδιες συνθήκες εκχύλισης και χρωµατογραφικού προσδιορισµού µε τα δείγµατα µελιού. Η γραµµικότητα ήταν µεταξύ και 3 mg/g µελιού και η καµπύλη αναφοράς που βρέθηκε ήταν η εξής: y= x Με ικανοποιητική τιµή για το R 2 (0.9925). Το όριο ποσοτικοποίησης ήταν 0.001mg/kg. Συλλογή δειγµάτων Καθώς τα υπολείµµατα είναι άνισα διασκορπισµένα µεταξύ των πλαισίων µέσα στην κυψέλη, τα δείγµατα συλλέχτηκαν µε τον εξής τρόπο: Κοµµάτια κηρύθρας κόπηκαν µε µαχαίρι. από όλα τα πλαίσια της κάθε κυψέλης που έφεραν µέλι. Το µέλι αποσπάστηκε από αυτά τις κηρύθρες µε στάλαξης δια µέσω ενός λεπτού πλέγµατος στο εργαστήριο. Τα δείγµατα συλλέχτηκαν κατά τις ηµέρες 0, 12 και 24 του πειράµατος. 17

18 Γ) Χρήση παγίδων κηφηνόγονου 1. Παγίδα Oliver Χρησιµοποιήθηκαν κηφηνοπαγίδες Oliver (2007), που είχαν την εξής µορφή: Στο ανώτερο 1/3 του πλαισίου τοποθετείται έτοιµος οδηγός κηρύθρας, στην συνέχεια παρεµβάλλεται ένα οριζόντιο τµήµα ξύλου, που τέµνει το πλαίσιο σε 2 τµήµατα, όπου το κάτω τµήµα (που αποτελεί και τα υπόλοιπα 2/3 του πλαισίου) αφήνεται να χτιστεί ελεύθερα από τις µέλισσες. Σύµφωνα µε την παραπάνω έρευνα, το τµήµα που θα χτιστεί από τις µέλισσες θα φέρει αποκλειστικά κηφηνοκέλια, ενώ στο ανώτερο 1/3 θα αποθηκεύεται µέλι (εικόνα 10). Το πείραµα διεξήχθει στο Αγρόκτηµα του Αριστοτέλειου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, τον Ιούνιο του Στόχος ήταν ο έλεγχος της αποτελεσµατικότητας της µεθόδου χρήσης κηφηνοπαγίδων του συγκεκριµένου τύπου αλλά και η δυνατότητα εφαρµογής της σε περιβαλλοντικές συνθήκες στην Ελλάδα. Αρχικά εγκαταστάθηκαν 27 πειραµατικές κυψέλες όµοιας δυναµικότητας σε πληθυσµό και γόνο. Στη συνέχεια υπολογίστηκε ο βαθµός προσβολής των µελισσών από βαρρόα και σε κάθε µελίσσι τοποθετήθηκε µια παγίδα κηφηνογόνου, όπως περιγράφηκε παραπάνω. Εικόνα 10. Κηφηνοπαγίδα βάσει του άρθρου του Oliver R. (2007) 2. Παγίδα µε κηφηνοκηρύθρα Στο δεύτερο πείραµα για την καταπολέµηση της βαρρόα µε την αφαίρεση κηφηνογόνου χρησιµοποιήθηκαν παρόµοιες κηφηνοπαγίδες µε τις εξής τροποποιήσεις:. Στη θέση του κάτω τµήµατος του πλαισίου, αντί να µείνει κενό για να χτιστεί από τις µέλισσες, τοποθετήθηκε οδηγός φύλλου κηρύθρας, µε κηφηνοκέλια (αποτυπώµατα κελιών µεγαλύτερων σε διατοµή από τα εργατικά) (εικόνα 11). Έτσι οι µέλισσες χτίζοντας πάνω στο έτοιµο φύλλο, αναγκάστηκαν να δηµιουργήσουν αποκλειστικά κηφηνοκέλια. 18

19 Εικόνα 11. Διαφορά οδηγών φύλλου κηρύθρας µε εργατικά κελιά (πάνω) και µε κηφηνοκέλια (κάτω) Η έρευνα πραγµατοποιήθηκε στο Αγρόκτηµα του Αριστοτέλειου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, όπου τοποθετήθηκαν 30 πειραµατικές κυψέλες. Οι κυψέλες χωρίστηκαν σε δύο οµάδες, όπου οι 15 από αυτές δεν δέχτηκαν καµία επέµβαση και χρησιµοποιήθηκαν ως µάρτυρες, ενώ στις υπόλοιπες 15 προστέθηκε η παγίδα κηφηνογόνου που περιγράφηκε παραπάνω. Κατά την διάρκεια του καλοκαιριού έγιναν 6 αφαιρέσεις παγίδων κηφηνογόνου στην οµάδα των µελισσιών µε τις κηφηνοπαγίδες κατά τις ηµεροµηνίες 20/5/09, 4/6/09, 30/6/09, 25/7/2009, 15/8/09 και 10/9/09. Κατά την αφαίρεση της παγίδας, το κοµµάτι µε τα σφραγισµένα κηφηνοκέλια δεν κόβονταν αλλά το κάθε κελί ανοιγόταν ξεχωριστά και αφαιρούνταν ο γόνος που περιείχε (εικόνα 12). Σε κάθε αφαίρεση καταγράφονταν ο συνολικός αριθµός κελιών που ανοίγονταν καθώς και ο αριθµός των βαρρόα που βρίσκονταν εντός των κελιών (εικόνα 13). Η οµάδα του µάρτυρα δε δέχτηκε καµία επέµβαση, αλλά επιθεωρούνταν τακτικά για τυχόν προβλήµατα. Μετά το τέλος και της τελευταίας αφαίρεσης των παγίδων, έγινε ακόµη ένας υπολογισµός του ποσοστού προσβολής στις 2 οµάδες, και συγκρίθηκαν τα αρχικά µε τα τελικά ποσοστά προσβολής. 19

20 Εικόνα 12. Άνοιγµα κελιών µε λαβίδα και αποµάκρυνση του κηφηνογόνου Εικόνα 13. Ανοιγµένο κελί όπου διακρίνεται ο προσβεβληµένος από βαρρόα κηφηνόγονος 20

21 Στατιστική επεξεργασία Η ανάλυση των αποτελεσµάτων πραγµατοποιήθηκε µε το στατιστικό λογισµικό GraphPad InStat v.3. Για την σύγκριση των αποτελεσµάτων χρησιµοποιήθηκε είτε Ανάλυση Παραλλακτικότητας (One-way Analysis of variance - ANOVA) είτε Unpaired t test. Οι συγκρίσεις των µέσων όρων στην ANOVA πραγµατοποιήθηκαν µε το κριτήριο Tukey (παραµετρικές µέθοδοι) ή µε το κριτήριο Dunn (µη παραµετρικές µέθοδοι). Συγκεκριµένα, στο πείραµα της εφαρµογής των σκευασµάτων Apiguard και Exomite Apis, µε παραµετρικές µεθόδους αναλύθηκαν τα αποτελέσµατα από την οµαδοποίηση των µελισσιών βάσει της προσβολής από βαρρόα, από την αποτελεσµατικότητα των σκευασµάτων και από την µεταβολή του πληθυσµού µετά την εφαρµογή των σκευασµάτων. Επίσης, στο πείραµα µε τη χρήση παγίδων κηφηνογόνου, µε παραµετρικές µεθόδους αναλύθηκαν τα αποτελέσµατα από τον αριθµό και το ποσοστό εργατικών κελιών και κηφηνοκελιών στην κηφηνοπαγίδα που χτίστηκαν χωρίς φύλλο κηρύθρας, από τον αρχικό βαθµό προσβολής από βαρρόα του τελικού πειράµατος, από τον αρχικό και τελικό βαθµό προσβολής από βαρρόα µεταξύ των δυο οµάδων και από την αύξηση του ποσοστού προσβολής των δυο οµάδων. Στο πείραµα της εφαρµογής των σκευασµάτων Apiguard και Exomite Apis µε µη παραµετρικές µεθόδους αναλύθηκαν τα αποτελέσµατα από τη µέση ηµερήσια θνησιµότητα µελισσών, από τη συνολική θνησιµότητα µελισσών και από τη µεταβολή του γόνου µετά το πέρας της θεραπείας. Επίσης, στο πείραµα µε τη χρήση παγίδων κηφηνογόνου, µε µη παραµετρικές µεθόδους αναλύθηκαν τα αποτελέσµατα από τα ποσοστά προσβολής από βαρρόα στην κηφηνοπαγίδα σε βάθος χρόνου. 21

22 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Α) Εφαρµογή των σκευασµάτων Apiguard και Exomite Apis Τα ποσοστά προσβολής των µελισσιών από βαρρόα πριν την έναρξη της εφαρµογής των σκευασµάτων µετρήθηκαν και παρατίθενται στον πίνακα 1. Τα µελίσσια οµαδοποιήθηκαν έτσι ώστε οι τρεις πειραµατικές οµάδες να είναι ισοδύναµης προσβολής. Πίνακας 1. Οµαδοποίηση µελισσιών βάσει της προσβολής τους από βαρρόα (σε ενήλικες µέλισσες και γόνο) Αριθµός Οµάδα Α (Exomite Apis) Οµάδα Β (Apiguard) Οµάδα Γ (Μάρτυρας) µελισσιού Προσβολή από βαρρόα % Προσβολή από βαρρόα % Προσβολή από βαρρόα % * * * * * * 12.9 Άθροισµα Μέσος όρος 20.6a** 18.3a 17.1a SD * Το µελίσσι λιποτάχτησε κατά την διάρκεια ή αµέσως µετά την εφαρµογή των σκευασµάτων ** Στατιστικά σηµαντικές διαφορές µεταξύ των µέσων όρων υποδεικνύονται µε διαφορετικό γράµµα 1. Θνησιµότητα ακάρεων Κατά τη διάρκεια της περιόδου πριν την θεραπεία (3 ηµέρες) η µέση ηµερήσια φυσική πτώση των ακάρεων στα πειραµατικά µελίσσια που δέχτηκαν τη θεραπεία του Exomite Apis και του Apiguard ήταν 13.3±3.8 και 27.38±4.1 αντιστοίχως, ενώ στα πειραµατικά µελίσσια που χρησιµοποιήθηκαν ως µάρτυρας ήταν 16.2±3.8. Η στατιστική επεξεργασία έδειξε πως δεν υπήρχαν σηµαντικές διαφορές µεταξύ της µέσης ηµερήσιας φυσικής πτώσης των ακάρεων κατά τις 3 πρώτες ηµέρες (P=0.0457). 22

23 Το ποσοστό των ακάρεων τα οποία βρέθηκαν νεκρά στη βάση της κυψέλης, χωρίς προηγούµενη θεραπευτική αγωγή ήταν 2.8% για την οµάδα Α, 4.9% για την οµάδα Β και 3.2% για την οµάδα Γ, του συνολικού αριθµού ακάρεων που βρέθηκαν κατά τη διάρκεια του πειράµατος. Η αρχική εκτίµηση της πτώσης των ακάρεων κατά την περίοδο πριν την εφαρµογή των θεραπειών δεν έδειξε σηµαντικές διαφορές µεταξύ των µέσων αριθµών των τριών οµάδων P= (One-Way ANOVA F=0.3103, df=44 ). Πίνακας 2. Μέση θνησιµότητα ακάρεων κατά την περίοδο θεραπείας Αριθµός ακάρεων που έπεσαν Οµάδα Α (Exomite Apis) Οµάδα Β (Apiguard) Οµάδα Γ (Control) Προ θεραπείας 399 (2.8%) 1150 (4.9%) 731 (3.2%) Κατά τη θεραπεία 8433 (58.7%) (62.2%) 9237 (40.3%) Επιζήσαντα ακάρεα 5526 (38.5%) 7737 (32.9%) (56.5%) Σύνολο (100%) (100%) (100%) Ο συντελεστής διακύµανσης για τον µέσο όρο της πτώσης ακάρεων κατά τη διάρκεια της θεραπείας για τις οµάδες Α, Β και Γ ήταν 84.5%, 70,4% και 91.2% αντιστοίχως. Στο σχήµα 1 παρουσιάζονται γραφικά οι διαφορές στη µέση ηµερήσια πτώση των ακάρεων µεταξύ των τριών οµάδων. Φαίνεται πως στα µελίσσια της οµάδας που δέχτηκαν την θεραπεία του Exomite Apis, καθηµερινά καταµετρούνταν περίπου ισάριθµα ακάρεα µε τα µελίσσια της οµάδας που δε δέχτηκε καµία θεραπεία, εκτός από δυο ηµεροµηνίες, στις 8/10 και στις 21/10, οι οποίες ήταν οι αµέσως επόµενες ηµέρες της εφαρµογής. Τις ηµεροµηνίες εκείνες, τα µελίσσια της οµάδας του Exomite Apis παρουσίασαν µέγιστο στην πτώση ακάρεων, ρίχνοντας κατά µέσο όρο 154,4 και 97,7 ακάρεα αντιστοίχως. Αντιθέτως, στα µελίσσια της οµάδας που δέχτηκε τη θεραπεία µε το σκεύασµα Apiguard δεν παρουσίασαν κάποιο µέγιστο στην πτώση ακαρέων, καθηµερινά όµως έριχναν µεγαλύτερο αριθµό ακάρεων από την οµάδα του µάρτυρα. Από την συνολική εικόνα προκύπτει ότι ενώ το σκεύασµα Apiguard δρούσε καθ όλη την διάρκεια της θεραπείας των 4 εβδοµάδων, το σκεύασµα Exomite Apis είχε δράση την ηµέρα εφαρµογής του καθώς και την εποµένη, ενώ τις υπόλοιπες ηµέρες κατά την διάρκεια της θεραπείας, δεν παρατηρούνταν δράση του φαρµάκου, αφού ο αριθµός των νεκρών ακάρεων που έπεφταν στον πυθµένα της κυψέλης, ήταν παρόµοιος µε την φυσική πτώση. 23

24 Σχήµα 1. Μέση ηµερήσια πτώση ακάρεων για τις τρεις πειραµατικές οµάδες (Μάρτυρας, Exomite Apis, Apiguard) Αποτελεσµατικότητα Στον πίνακα 3 παρουσιάζεται αποτελεσµατικότητα των Exomite Apis και Apiguard ενάντια του ακάρεος βαρρόα. Οι διαφορές µεταξύ των δύο φαρµακευτικών αγωγών µε το µάρτυρα ήταν σηµαντικές P= αλλά τα δυο σκευάσµατα δεν παρουσίασαν σηµαντικές διαφορές µεταξύ τους (One-Way ANOVA F=7,318, df=38 ). Οι εφαρµογές του Exomite Apis έδωσαν µέσο όρο αποτελεσµατικότητας 56.71%. Αυτή η τιµή ήταν µεγαλύτερη από εκείνη που αναφέρεται από τον Reed et al (2005) και Coffey (2007) -49.2% και 28% αντιστοίχως. Οι διαφορές µπορούν να αποδοθούν στη µέθοδο εφαρµογής. Στην παρούσα έρευνα η σκόνη Entostat εφαρµόστηκε µε τη µέθοδο της επίπασης πάνω από τα πλαίσια, έτσι ώστε ολόκληρη η περιοχή να καλύπτεται από το σκεύασµα, ενώ στις προηγούµενες έρευνες χρησιµοποιήθηκε ένας διανεµητής µε τη µορφή δίσκου στην είσοδο της κυψέλης. Η αποτελεσµατικότητα στα µελίσσια µε αριθµό 3, 5, 8, 11 και 12 δε δίνεται καθώς τα πέντε αυτά µελίσσια λιποτάκτησαν κατά τη διάρκεια του πειράµατος. Όπως δείχνει και ο πίνακας 5 η απόκλιση διακύµανση ποικίλλει από 34.9% έως 85.1% µεταξύ των µελισσιών που χρησιµοποιήθηκαν σε αυτό το πείραµα. Η θεραπεία µε το σκεύασµα Apiguard έδωσε αποτελεσµατικότητα παρόµοια µε το Exomite Apis, µε µέσο όρο 59.92%. Και πάλι η διακύµανση µεταξύ των µελισσιών ήταν από 35.3% έως 97.8%. Η αποτελεσµατικότητα του σκευάσµατος Apiguard στην παρούσα έρευνα βρέθηκε χαµηλότερη από εκείνη που αναφέρεται στην εργασία των Mattila and Ottis (2000) που ήταν 76% και υψηλότερη από την αναφερόµενη 53.05% στην εργασία των Gregorc and Planinc (2005). 24

25 Πίνακας 3. Αποτελεσµατικότητα % των σκευασµάτων Exomite Apis και Apiguard εναντίον του ακάρεος βαρρόα. Αριθµός µελισσιού Οµάδα Α (Exomite Apis) Οµάδα Β (Apiguard) Οµάδα Γ (Μάρτυρας) 1 53,84 91,92 13, ,17 78,54 33,85 3 -* 32,68 26, ,04 39,33 34, ,73 21, ,55 97,71 25, ,88 33,3 27, ,49 54, ,77 63,5 66, ,81 68,48 23, ,61 54, ,6 16, ,56 52,97 38, ,85 33,04 45, ,62-55,8 Μέσος όρος 56,71a** 59,92a 35,81b SD 16,32 21,37 16,002 * Το µελίσσι λιποτάχτησε κατά την διάρκεια ή αµέσως µετά την εφαρµογή των σκευασµάτων ** Στατιστικά σηµαντικές διαφορές µεταξύ των µέσων όρων υποδεικνύονται µε διαφορετικό γράµµα Ο συντελεστής διακύµανσης για την αποτελεσµατικότητα στις οµάδες Α, Β και Γ ήταν αντιστοίχως 28.7%, 35.7% και 44.7%. Μια εξήγηση για τη µεγάλη παραλλακτικότητα που παρατηρήθηκε στις εφαρµογές των δυο σκευασµάτων θα µπορούσε να είναι η θερµοκρασία κατά τη διάρκεια της θεραπείας που ήταν πολύ κοντά στους 15ºC (Σχήµα 2). Είναι γνωστό πως η αποτελεσµατικότητα της θυµόλης εξαρτάται από την εξάτµιση και οι θερµοκρασίες κοντά στους 15ºC είναι οριακές. Τις ηµέρες της θεραπείας (7/10 και 20/10) οι µέσες θερµοκρασίες ήταν 17.5ºC και 16.8ºC, οι ελάχιστες 10.4ºC και 11.7ºC και οι µέγιστες 25.6ºC και 23.2ºC αντιστοίχως. Η µέση σχετική υγρασία κυµάνθηκε από 58.3% έως 91.2% (Σχήµα 3). 25

26 Σχήµα 2. Περιβάλλουσες θερµοκρασίες κατά την περίοδο της θεραπείας στο Αγρόκτηµα του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Σχήµα 3. Σχετική υγρασία κατά την περίοδο της θεραπείας στο Αγρόκτηµα του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Η φυσική πτώση των ακάρεων στα µελίσσια της οµάδας του µάρτυρα έδειξε µεγάλη διακύµανση, από 14.9% έως 68.3%. Τα ακάρεα που έπεφταν στα µελίσσια της οµάδας του µάρτυρα δεν παρατηρήθηκαν στο στερεοσκόπιο, οπότε δεν µπορεί να διαπιστωθεί εάν κάποια µελίσσια αυτοκαθαρίζονταν από την βαρρόα λόγω ενστίκτου ή εάν η πτώση των ακάρεων ήταν τυχαίο γεγονός. 26

27 Επίδραση στα µελίσσια Θνησιµότητα στις µέλισσες Ο πίνακας 4 δείχνει την µέση ηµερήσια θνησιµότητα των µελισσών σε κάθε οµάδα. Όπως φαίνεται, το σκεύασµα Exomite Apis προκάλεσε σηµαντικά υψηλότερη θνησιµότητα στις µέλισσες, ενώ η θνησιµότητα που προκάλεσε το σκεύασµα Apiguard δεν διέφερε από εκείνη στα µελίσσια µάρτυρες (P= Non Parametric One-Way ANOVA with Kruskal Wallis correction for ties KW= ). Πίνακας 4. Μέση ηµερήσια θνησιµότητα µελισσών Αριθµός µελισσιού Οµάδα Α (Exomite Apis) Οµάδα Β (Apiguard) Οµάδα Γ (Μάρτυρας) * Μέσος όρος 10.34a** 3.47b 2.87b SD * Το µελίσσι λιποτάχτησε κατά την διάρκεια ή αµέσως µετά την εφαρµογή των σκευασµάτων ** Στατιστικά σηµαντικές διαφορές µεταξύ των µέσων όρων υποδεικνύονται µε διαφορετικό γράµµα Η υψηλότερη θνησιµότητα παρατηρήθηκε µια µέρα µετά την πρώτη εφαρµογή των σκευασµάτων (8/10) όπου ο µέσος όρος των νεκρών µελισσών που µετρήθηκαν µπροστά από τις κυψέλες ήταν 171 και 21 για τα σκευάσµατα Exomite Apis και Apiguard αντιστοίχως. Αυτός ο αριθµός µειώθηκε κατά την δεύτερη εφαρµογή (21/10) σε 52 και 1.5 νεκρές µέλισσες. Στο σχήµα 4 παρουσιάζεται γραφικά ο µέσος όρος των νεκρών µελισσών που καταµετρούνταν ηµερησίως µπροστά από την είσοδο κάθε κυψέλης για κάθε οµάδα. 27

28 Σχήµα 4. Μέσος όρος νερών µελισσών για τις τρεις πειραµατικές οµάδες (Μάρτυρας, Exomite Apis, Apiguard) Επίδραση στο γόνο και τον πληθυσµό Στον πίνακα 5 παρατίθεται ο συνολικός αριθµός κελιών µε γόνο και ο συνολικός αριθµός πλαισίων πληθυσµού πριν και µετά την θεραπεία σε κάθε οµάδα. Όπως φαίνεται και από τα νούµερα, στην οµάδα Α παρατηρήθηκε µεγαλύτερη µείωση στο γόνο σε σχέση µε την οµάδα Β. Πίνακας 5. Συνολικός αριθµός κελιών µε γόνο πριν και µετά την θεραπεία ΓΟΝΟΣ (αριθµός κελιών) Θεραπεία Πριν Μετά ( 2-4/10/2008) (4-6/11/2008) Διαφορά Οµάδα Α (Exomite Apis) % Οµάδα Β (Apiguard) % Οµάδα Γ (Μάρτυρας) % ΠΛΗΘΥΣΜΟΣ (αριθµός πλαισίων) Οµάδα Α (Exomite Apis) % Οµάδα Β (Apiguard) % Οµάδα Γ (Μάρτυρας) % 28

29 Στον πίνακα 6 παρουσιάζεται η σύγκριση της µεταβολής γόνου και πληθυσµού ανάµεσα στις τρεις οµάδες. Πίνακας 6. Μεταβολή του γόνου και του πληθυσµού των τριών οµάδων µετά το πέρας της θεραπείας, εκφρασµένη σε ποσοστό % ΓΟΝΟΣ ΠΛΗΘΥΣΜΟΣ α/α Μελισσιού Οµάδα Α (Exomite Οµάδα Α (Exomite Οµάδα Β (Apiguard) Οµάδα Γ (Μάρτυρας) Οµάδα Β (Apiguard) Οµάδα Γ (Μάρτυρας) Apis) Apis) * Μέσος όρος a** ab b a** a -8.42a SD * Το µελίσσι λιποτάχτησε κατά την διάρκεια ή αµέσως µετά την εφαρµογή των σκευασµάτων ** Στατιστικά σηµαντικές διαφορές µεταξύ των µέσων όρων υποδεικνύονται µε διαφορετικό γράµµα Τα στοιχεία του πίνακα 6 προήλθαν από τους πίνακες 20, 21 και 22 του παραρτήµατος. Αξιοσηµείωτο είναι το γεγονός πως η οµάδα Γ παρουσίασε αύξηση του ποσοστού του γόνου µετά την περίοδο της θεραπείας των δυο άλλων οµάδων. Φαίνεται πως η θυµόλη καθυστερεί την ωοτοκία. Σύµφωνα µε προσωπική παρατήρηση του Coffey (2007) όταν η θυµόλη χορηγήθηκε αρχικά, η ωοτοκία της βασίλισσας περιορίστηκε προσωρινά. Ο Grobov et al (1981) αναφέρει πως σε θερµοκρασίες υψηλότερες των 27 ºC οι βασίλισσες διακόπτουν την ωοτοκία επίσης. Τέλος, υπάρχουν αναφορές για άλλα θεραπευτικά σκευάσµατα µε βάση την θυµόλη, που είχαν αρνητική επίδραση στην ωοτοκία της βασίλισσας, όπως το Thymovar (Baggio et al. 2004). Όµως, η επεξεργασία των αποτελεσµάτων έδειξε ότι η µείωση του γόνου δεν διέφερε σηµαντικά ανάµεσα στα µελίσσια της οµάδας Γ και στα µελίσσια της οµάδας Β, αλλά παρουσίασε σηµαντικές διαφορές ανάµεσα στα µελίσσια της οµάδας Γ και της οµάδας Α P= (Non Parametric One-Way ANOVA with Kruskal Wallis correction for ties KW= 7.300). Ο πληθυσµός των τριών οµάδων παρουσίασε µείωση. Συγκριτικά η οµάδα Γ παρουσίασε τη µικρότερη µείωση από τις οµάδες Α και Β.Ωστόσο οι διαφορές στην 29

30 µεταβολή της δυναµικότητας του πληθυσµού µεταξύ των τριών οµάδων δεν ήταν σηµαντικές P=0.0707(One-Way ANOVA F=2.853, df=38 ). Η διεγερτική τροφοδότηση κατά την διάρκεια της επέµβασης µπορεί να βοηθήσει στην διατήρηση του πληθυσµού και του γόνου σε ικανοποιητικά επίπεδα. Λιποταξία Ο πληθυσµός ενός µελισσιού εγκαταλείπει την κυψέλη όταν δέχεται συνεχή ανησυχία από κάποιον παράγοντα (Winston, 1987). Το φαινόµενο της λιποταξίας παρατηρήθηκε σε πέντε από τα δεκαπέντε µελίσσια της οµάδας Α καθώς και σε ένα από τα µελίσσια της οµάδας Β. Τα µελίσσια που λιποτάχτησαν είχαν τα υψηλότερα ποσοστά αρχικής προσβολής από βαρρόα συγκριτικά µε τα υπόλοιπα. Πιο συγκεκριµένα, τα µελίσσια της οµάδας Α που λιποτάχτησαν είχαν µέσο όρο ποσοστού αρχικής προσβολής 39.5%, ενώ ο συνολικός µέσος όρος του ποσοστού αρχικής προσβολής ήταν 20.6%. Αντιστοίχως, το µελίσσι που λιποτάχτησε στην οµάδα Β είχε αρχική προσβολή 38.8%, µε µέσο όρο ποσοστού αρχικής προσβολής για την οµάδα Β συνολικά 18.3%. Τα µελίσσια που λιποτάχτησαν, καθώς και τα αρχικά ποσοστά προσβολής δίνονται στον πίνακα 1. Τα πιο πάνω παρέχουν ενδείξεις πως η µεγάλη ένταση της ασθένειας σε συνδυασµό µε την διατάραξη τους από την εφαρµογή των σκευασµάτων µπορεί να οδηγήσει τα µελίσσια στη λιποταξία. Ο παράγοντας αυτός θα µπορούσε να αποτελέσει αντικείµενο µελλοντικής έρευνας µε τη χρήση ενός µεγάλου αριθµού µελισσιών, ο οποίος θα µπορούσε να παράσχει αξιόπιστα αποτελέσµατα για πιθανή συσχέτιση αρχικής προσβολής-εφαρµογής σκευάσµατος-λιποταξίας. Διατάραξη µελισσιών Πέραν της λιποταξίας, που αποτελεί ακραία αντίδραση ενός µελισσιού σε κάποιον αρνητικό παράγοντα (ενόχληση), η εφαρµογή του σκευάσµατος Exomite Apis είχε σαν αποτέλεσµα την γενική διατάραξη των µελισσιών (εικόνα 14). 30

31 Εικόνα 14. Διατάραξη των µελισσιών µετά την εφαρµογή του σκευάσµατος Exomite Apis Την στιγµή της επίπασης της σκόνης προκλήθηκε µεγάλη ανησυχία µε αποτέλεσµα ο πληθυσµός των µελισσιών να εξέρχεται της κυψέλης (εικόνα 15). Το φαινόµενο διήρκησε για µερικές ώρες, ενώ µετά φάνηκε να επανέρχεται σε φυσιολογικές συνθήκες. Σε τρία από τα µελίσσια της οµάδας του Exomite Apis οι εργάτριες θανάτωσαν τις βασίλισσες τους, προφανώς λόγω της διατάραξης της ισορροπίας των οσµών εντός της κυψέλης (εικόνα 16). Εικόνα 15. Έξοδος των µελισσών από την κυψέλη µετά την εφαρµογή του σκευάσµατος Exomite Apis 31

32 Εικόνα 16. Εργάτριες θανατώνουν την βασίλισσά τους στην είσοδο της κυψέλης Β) Ανάλυση µελιού για υπολείµµατα θυµόλης µετά την εφαρµογή των σκευασµάτων Apiguard και Exomite Apis Τα αποτελέσµατα παρουσιάζονται αναλυτικά στον πίνακα 7. Σε κανένα µελίσσι δεν ανιχνεύτηκε θυµόλη πριν την πρώτη εφαρµογή. Επίσης δεν ανιχνεύτηκε θυµόλη σε κανένα µελίσσι της οµάδας Γ, καθ όλη τη διάρκεια του πειράµατος. Πίνακας 7. Υπολείµµατα θυµόλης στο µέλι (mg/kg). Αριθµός Ηµέρα συλλογής δειγµάτων κυψέλης Οµάδα Α (Exomite Apis) 1 M.A M.A M.A. M.A M.A. M.A M.A. M.A Οµάδα Β (Apiguard) 1 M.A M.A. M.A M.A M.A. M.A M.A Οµάδα Γ (Μάρτυρας) 1 M.A. M.A. M.A. 2 M.A. M.A. M.A. 3 M.A. M.A. M.A. 4 M.A. M.A. M.A. 5 M.A. M.A. M.A. 32

33 M.A.: Μη ανιχνεύσιµες συγκεντρώσεις Στις επιµέρους τιµές τα υπολείµµατα θυµόλης δεν ξεπέρασαν το όριο που γίνεται αντιληπτό µε τη γεύση (2mg/kg) στα µελίσσια της οµάδας Α, ενώ αυτό το όριο ξεπεράστηκε στο µελίσσι 5 της οµάδας Β(εικόνα 17). Το ανώτερο επιτρεπτό όριο των 0.8mg/kg βάσει της ελβετικής νοµοθεσίας ξεπεράστηκε στο µελίσσι 5 της οµάδας Β, 12 ηµέρες µετά την πρώτη εφαρµογή. Σε 24 ηµέρες µετά την πρώτη εφαρµογή το όριο αυτό ξεπεράστηκε στο µελίσσι 2 της οµάδας Α και στα µελίσσια 4 και 5 της οµάδας Β. Οι µέσες τιµές των υπολειµµάτων θυµόλης 24 ηµέρες µετά την πρώτη εφαρµογή των σκευασµάτων ήταν mg/kg για τα µελίσσια που δέχτηκαν το σκεύασµα Exomite Apis και mg/kg για τα µελίσσια που δέχτηκαν το Apiguard. Η µέση τιµή των υπολειµµάτων θυµόλης στο µέλι µετά την εφαρµογή του σκευάσµατος Exomite Apis βρίσκονταν εντός των ορίων των τιµών υπολειµµάτων θυµόλης που έχουν βρεθεί στο µέλι µετά την χρήση άλλων σκευασµάτων µε δραστική ουσία την θυµόλη (Bogdanov et al 1998), ενώ οι τιµές των υπολειµµάτων στο µέλι µετά την εφαρµογή του σκευάσµατος Apiguard τις υπερέβαιναν. Η µέση τιµή των υπολειµµάτων στο µέλι το οποίο συλλέχθηκε από την οµάδα που δέχτηκε την θεραπεία µε το σκεύασµα Apiguard ήταν υψηλότερη από την ανάλογη µέση τιµή η οποία αναφέρεται στην εργασία του Trouiller (2004). Η αξιοσηµείωτη διακύµανση στις τιµές των υπολειµµάτων από µελίσσι σε µελίσσι αποδίδεται στο διαφορετικό δυναµικό πληθυσµού και γονοφωλιάς µεταξύ των µελισσιών. Τα µεγέθη αυτών των δυο παραγόντων επηρεάζουν τη σχετική υγρασία, την θερµοκρασία και την ροή του αέρα εντός των µελισσιών επηρεάζοντας έτσι και την εξάτµιση της θυµόλης. Εικόνα 17. Χρωµατογράφηµα µελιού επιβαρυµένου µε θυµόλη 33

34 Γ) Χρήση παγίδων κηφηνογόνου 1. Παγίδα Oliver Οι αρχικές τιµές προσβολής και ο αρχικός αριθµός πλαισίων και γόνου παρουσιάζεται στον πίνακα 8. Πίνακας 8. Αρχικές τιµές προσβολής, αρχικός αριθµός πλαισίων, γόνου και πληθυσµού Μελίσσι Πλαίσια Πληθυσµός (πλαίσια Γόνος (πλαίσια µε Προσβολή από Βαρρόα% καλυµµένα µε µέλισσες) γόνο) Τα µελίσσια έχτισαν τις παγίδες του κηφηνογόνου, όµως, αντίθετα µε τα αποτελέσµατα Oliver (2007), δε φάνηκε να χτίζουν αποκλειστικά κηφηνοκέλια στο κάτω τµήµα του πλαισίου της παγίδας. Τα ποσοστά κηφηνοκελιών εργατικών κελιών βρέθηκε να ποικίλλουν, ενώ κατά τη διάρκεια του καλοκαιριού παρατηρήθηκαν µετατροπές από κηφηνοκέλια σε εργατικά κελιά, ανάλογα µε τις ανάγκες του κάθε µελισσιού. 34

35 Στον πίνακα 9 δίνονται οι αριθµοί και τα αντίστοιχα ποσοστά των κηφηνοκελιών, των εργατικών κελιών αλλά και των βασιλικών κελιών, όπου αυτά υπήρχαν, που χτίστηκαν κατά την διάρκεια του καλοκαιριού του 2008 και µετρήθηκαν στο τέλος του πειράµατος, τις 6 Οκτωβρίου 2008 Πίνακας 9. Αριθµός και ποσοστό εργατικών κελιών και κηφηνοκελιών στην κηφηνοπαγίδα που κτίστηκαν χωρίς φύλλο (οδηγό) κηρήθρας. Μελίσσι Εργατικά κελιά Κηφηνοκέλια Βασιλικά κελιά (68.8%) 896 (31.2%) (15.7%) 1920 (84.3%) (29.45%) 3016 (70.5%) 2 (0.05%) (33%) 1088 (66.5%) 6 (0.5%) (100%) (69.2%) 640 (30.8%) (61.8%) 832 (38.2%) (100%) (59.4%) 704 (40.4%) 1 (0.2%) (100%) (100%) (23.8%) 1856 (76.2%) (41.2%) 1024 (58.6%) 1 (0.2%) (99.1%) 14 (0.9%) (100%) (91%) 256 (9%) (100%) (100%) (12.6%) 1856 (87.2%) 1 (0.06%) Mean (42.41%)a* (57.47%)a * Στατιστικά σηµαντικές διαφορές µεταξύ των µέσων όρων υποδεικνύονται µε διαφορετικό γράµµα Στον πίνακα 9 συµπεριλαµβάνονται µόνο 19 µελίσσια, ενώ το πείραµα αρχικά ξεκίνησε µε 27 µελίσσια. Τα µελίσσια που δεν αναγράφονται στον πίνακα 9 δεν έχτισαν καθόλου στο πλαίσιο µε την παγίδα κηφηνογόνου. Όπως φαίνεται και από τους πίνακες, οι µέλισσες δεν έχτισαν αποκλειστικά κηφηνοκέλια στο πλαίσιο-παγίδα, παρά µόνο στα µελίσσια 10, 14, 15 και 18, ενώ στα µελίσσια 5 και 8 βρέθηκαν να υπάρχουν µόνο κελιά εργατικού γόνου. Στα µελίσσια 3, 4, 9, 13, 14 και 19 βρέθηκαν σε διαφορετικά ποσοστά και βασιλικά κελιά, ως αποτέλεσµα ορφάνιας ή έναρξης σµηνουργίας. Η στατιστική επεξεργασία έδειξε πως οι µέλισσες δεν παρουσιάζουν προτίµηση στο είδος των κελιών που θα χτίσουν, εργατικά ή κηφηνοκέλια P= (Unpaired t-test t=1.232, df=36). Αξίζει να σηµειωθεί ότι στα µελίσσια 5, 8 και 11 ο συνολικός αριθµός κελιών που χτίστηκαν ήταν πολύ µικρός. Αυτό πρακτικά σήµαινε πως οι µέλισσες δεν κατάφεραν να χτίσουν ολόκληρο το κενό τµήµα του πλαισίου της παγίδας αλλά ένα πολύ µικρό της κοµµάτι (εικόνα 18). 35

36 Τέλος, η τελική αυτή αναλογία του είδους των κελιών δεν ήταν και αυτή που παρατηρήθηκε αρχικά κατά το πρώτο χτίσιµο της κηρύθρας, αλλά οι µέλισσες τροποποιούσαν την αναλογία αυτή βάση των αναγκών τους. Στην αρχή του πειράµατος παρατηρήθηκαν περισσότερα κηφηνοκέλια, τα οποία µε την πάροδο του χρόνου µειώνονταν ώστε να µετατραπούν σταδιακά σε κελιά εργατικού γόνου. Πολλές δε ήταν και οι περιπτώσεις όπου οι µέλισσες δεν άφηναν τη βασίλισσα να ωοτοκήσει στα κελιά της κηφηνοπαγίδας, αλλά προτιµούσαν, λόγω έλλειψης χώρου, να αποθηκεύουν µέλι ή και γύρη. Εικόνα 18. Μισοχτισµένο τµήµα πλαισίου της κηφηνοπαγίδας Ένα ακόµη πρόβληµα που παρατηρήθηκε ήταν, πως όταν το κάτω τµήµα του πλαισίου της κηφηνοπαγίδας κόβονταν και αποµακρυνόταν, οι µέλισσες καθυστερούσαν να το ξαναχτίσουν. Σε µερικές περιπτώσεις το τµήµα αυτό έµεινε άχτιστο ή µισοχτισµένο καθ όλη την διάρκεια του καλοκαιριού. Από αυτές τις παρατηρήσεις φαίνεται πως η παγίδευση της βαρρόα µέσω του κηφηνογόνου µε την συγκεκριµένη παγίδα δεν είναι κατάλληλη για τις συνθήκες της χώρας µας. Έτσι η ιδέα της παγίδας Oliver θεωρήθηκε µη εφαρµόσιµη και εγκαταλείφθηκε και αντί αυτής χρησιµοποιήθηκε η παγίδα µε κηφηνοκηρύθρα. 36