Ministerstvo pôdohospodárstva Slovenskej republiky. Ročník XXXVI 10. september 2004 Čiastka 22 V Ý N O S

Transcript

1 VESTNÍK Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky Ročník XXXVI 10. september 2004 Čiastka 22 O b s a h: 100. Výnos Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky č. 2136/ z 23. augusta 2004, ktorým sa mení a dopĺňa výnos Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky zo 7. októbra 1997 č. 1497/3/ , ktorým sa ustanovujú požiadavky na uvádzanie doplnkových látok do obehu, na ich zloženie, skúšanie a hodnotenie a bližšie požiadavky biologického overovania krmív, v znení neskorších predpisov 101. Výnos Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky z 23. augusta 2004 č. 2145/ , ktorým sa mení a dopĺňa výnos Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky zo 7. októbra 1997 č. 1497/4/ o úradnom odbere vzoriek a o laboratórnom skúšaní a hodnotení krmív v znení výnosu Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky z 12. februára 2003 č. 149/2/ V Ý N O S Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky č. 2136/ z 23. augusta 2004, ktorým sa mení a dopĺňa výnos Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky zo 7. októbra 1997 č. 1497/3/ , ktorým sa ustanovujú požiadavky na uvádzanie doplnkových látok do obehu, na ich zloženie, skúšanie a hodnotenie a bližšie požiadavky biologického overovania krmív, v znení neskorších predpisov Ministerstvo pôdohospodárstva Slovenskej republiky podľa 22 písm. b) zákona Národnej rady Slovenskej republiky č. 184/1993 Z.z. o krmivách ustanovuje: Čl. I Výnos Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky zo 7. októbra 1997 č. 1497/3/ 1

2 , ktorým sa ustanovujú požiadavky na uvádzanie doplnkových látok do obehu, na ich zloženie, skúšanie a hodnotenie a bližšie požiadavky biologického overovania krmív, v znení výnosu 31. z januára 2002 č.39/3/ a výnosu z 9. februára 2004 č.150/ sa mení a dopĺňa takto: 1. V prílohe č. 5 sa za bod 15 všeobecnej časti pripájajú body 16 až 20, ktoré znejú: 16. Výrobca, ktorého podnik je na území tretej krajiny, k žiadosti o uvádzanie krmiva do obehu predloží kontrolnému ústavu potvrdenie, že a) jeho podnik sa nachádza v zozname podnikov povolených Európskou komisiou alebo b) má zástupcu pôsobiaceho aspoň v jednom členskom štáte Európskej únie a v tomto členskom štáte je aj zapísaný do zoznamu schválených alebo registrovaných výrobcov a sprostredkovateľov krmív. 17. Ak zástupca výrobcu podľa bodu 16 písm. b) pôsobí na území Slovenskej republiky alebo chce pôsobiť na území Slovenskej republiky k žiadosti o zápis do registra predloží písomné vyhlásenie, v ktorom sa zaviaže, že a) podnik, ktorého zastupuje spĺňa požiadavky podľa bodu 1 alebo 2 a b) vedie evidenciu krmív, ktoré uvádza do obehu, podľa požiadaviek osobitnej časti tejto prílohy. 18. V zápise do registra podľa bodu 17 sa popri mene, obchodnom mene, adrese alebo sídle výrobcu uvádza aj meno, obchodné meno, adresa alebo sídlo zástupcu. 19. Na vydávanie osvedčenia o zápise zástupcu do registra, o zrušení zápisu v registri alebo o úpravu zápisu v registri sa vzťahujú požiadavky uvedené v bodoch 10 až Register výrobcov a sprostredkovateľov sa v súlade s bodom 15 zasiela Európskej komisii a ostatným členským štátom buď úplný register alebo len jeho časť.. 2. V prílohe č. 6 sa dopĺňa táto veta: Smernica Komisie 98/51/ES z 9. júla 1998, ustanovujúca určité opatrenia pre vykonávanie smernice rady 95/69/ES ustanovujúcej podmienky a opatrenia pre schvaľovanie a registráciu určitých podnikov a sprostredkovateľov pôsobiacich v sektore krmív (Ú. v. ES L 208, ).. Čl. II Tento výnos nadobúda účinnosť 15. septembra Zsolt Simon, v. r minister 2

3 101 V Ý N O S Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky z 23. augusta 2004 č. 2145/ , ktorým sa mení a dopĺňa výnos Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky zo 7. októbra 1997 č. 1497/4/ o úradnom odbere vzoriek a o laboratórnom skúšaní a hodnotení krmív v znení výnosu Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky z 12. februára 2003 č. 149/2/ Ministerstvo pôdohospodárstva Slovenskej republiky podľa 22 písm. b) zákona Národnej rady Slovenskej republiky č. 184/1993 Z. z. o krmivách (ďalej len zákon ) ustanovuje: Čl. I Výnos Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky zo 7. októbra 1997 č.1497/4/ o úradnom odbere vzoriek a o laboratórnom skúšaní a hodnotení krmív v znení výnosu Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky z 12. februára 2003 č. 149/2/ sa mení a dopĺňa takto: 1. Za 4 sa vkladá nový 4a, ktorý znie: Týmto výnosom sa preberajú právne akty Európskych spoločenstiev a Európskej únie uvedené v prílohe č Príloha č. 3 znie: Úradné metódy skúšania krmiva Príloha č. 3 k výnosu č. 1497/4/ Všeobecné ustanovenia týkajúce sa analytických metód 1. Príprava vzoriek na analýzu 1.1. Pri úradnom odbere vzoriek sa pripravia aspoň tri konečné vzorky, približne v rovnakom množstve, ktoré sa zabalia a zapečatia podľa prílohy č. 1 a aspoň jedna z nich sa zasiela do analytického laboratória Vzorky odobraté na úradnú kontrolu musia byť na analýzu pripravené tak, aby navážené množstvá, ktoré sú uvedené v analytických metódach, boli homogénne a reprezentatívne konečné vzorky Všetky potrebné kroky pracovného postupu sa musia vykonať takým spôsobom, aby sa v čo možno najväčšej miere zamedzilo kontaminácii vzorky a zmenám v jej zložení. Mletie, premiešanie a preosievanie treba vykonať čo možno najrýchlejšie s minimálnym vystavením vzorky účinkom vzduchu a svetla. Mlynčeky a drviče, u ktorých je predpoklad, že by mohli vzorky zahrievať, by sa nemali používať. Ručné mletie sa odporúča v prípade krmív obzvlášť citlivých na zohriatie. Treba dbať aj na to, aby zdrojom kontaminácie stopovými prvkami nebol samotný prístroj Ak sa príprava nedá vykonať bez významných zmien v obsahu vlhkosti vzorky, obsah vlhkosti sa stanoví pred prípravou a po príprave podľa metódy uvedenej v časti A1. 3

4 2. Postup pri príprave vzorky Konečná vzorka sa dôkladne premieša, buď mechanicky, alebo ručne. Vzorka sa rozdelí na dve rovnaké časti (tam, kde je to vhodné, by sa mala použiť metóda kvartácie). Jedna z dvoch častí sa uchová vo vhodnej čistej a suchej nádobe so vzduchotesným uzáverom a druhá časť alebo reprezentatívna časť z nej o hmotnosti najmenej 100 g sa upraví nižšie uvedeným spôsobom Krmivá, ktoré sa môžu drviť Ak nie je v analytických metódach ustanovené inak, po pomletí sa celá vzorka podľa potreby preoseje cez sito so štvorcovými okami o strane 1 mm (v súlade s odporúčaním technickej normy 2) ). Zabráni sa príliš jemnému rozomletiu. Preosiata vzorka sa premieša a vloží do vhodnej čistej, suchej nádoby so vzduchotesným uzáverom. Bezprostredne pred navažovaním množstva určeného na analýzu sa znovu premieša Krmivá, ktoré sa môžu mlieť po vysušení Ak nie je v analytických metódach ustanovené inak, vzorka sa vysuší tak, aby sa obsah vlhkosti v nej znížil na 8 až 12 %, v súlade s postupom na predsušenie opísaným v bode 4.3. metódy na stanovenie vlhkosti uvedenej v časti A1. Ďalej sa postupuje podľa časti Tekuté alebo polotekuté krmivá Vzorka sa vloží do vhodnej čistej, suchej nádoby so vzduchotesným uzáverom. Bezprostredne pred navažovaním množstva určeného na analýzu sa dôkladne premieša Ostatné krmivá Vzorky, ktoré sa nedajú pripraviť v súlade s jedným z vyššie uvedených postupov, by sa mali pripraviť akýmkoľvek iným postupom, ktorým sa zabezpečí, že množstvá navážené na analýzu budú homogénne a reprezentatívne konečné vzorky Skladovanie vzoriek Vzorky sa musia skladovať pri teplote, ktorá nespôsobí zmeny v ich zložení. Vzorky určené na analýzu vitamínov alebo látok obzvlášť citlivých na svetlo by sa mali skladovať v nádobách z hnedého skla. 3. Požiadavky na chemikálie a prístroje 3.1. Ak nie je v analytických metódach ustanovené inak, tak všetky chemikálie musia byť čistoty p.a.. Pri stanovovaní stopových prvkov sa čistota chemikálií musí kontrolovať slepým pokusom. V závislosti na dosiahnutých výsledkoch sa môže požadovať ďalšie prečistenie chemikálií Akýkoľvek krok pracovného postupu zahŕňajúci prípravu roztokov, riedenie, preplachovanie alebo premývanie, uvedený v analytických metódach bez uvedenia použitého rozpúšťadla alebo riediacej kvapaliny znamená, že sa musí použiť voda. Všeobecne platí, že voda musí byť demineralizovaná alebo destilovaná. V osobitných prípadoch, ktoré sú uvedené v analytických metódach, voda musí byť špeciálne prečistená Vzhľadom na zariadenie bežných kontrolných laboratórií sa v analytických metódach uvádzajú len špeciálne prístroje, alebo také, ktoré vyžadujú iné ako bežné používanie. Musia byť čisté, najmä vtedy, keď sa stanovujú veľmi malé množstvá. 4. Použitie analytických metód a vyjadrenie výsledkov 4.1. Vo všeobecnosti je ustanovená samostatná analytická metóda na stanovenie každej látky v krmivách. Ak sa uvádza niekoľko metód, v protokole o analýze musí byť uvedená metóda použitá v kontrolnom laboratóriu Výsledky uvádzané v protokole o analýze predstavujú priemernú hodnotu získanú najmenej z dvoch paralelných stanovení vykonaných z dvoch navážiek vzorky a musia sa vyznačovať uspokojivou opakovatelnosťou Výsledok sa vyjadrí spôsobom uvedeným v analytickej metóde na vhodný počet platných číslic a podľa potreby sa koriguje na obsah vlhkosti v konečnej vzorke pred prípravou. 2) STN ISO 565 4

5 Časť A Stanovenie vlhkosti Časť A 1 Stanovenie vlhkosti krmiva (metóda podľa smernice1971/393/ehs) 1. Predmet metódy Táto metóda umožňuje stanovenie vlhkosti v krmivách. Nezahŕňa analýzu kŕmnych surovín pochádzajúcich z mlieka, analýzu minerálnych látok a zmesí pozostávajúcich prevážne z minerálnych látok, analýzu živočíšnych tukov a olejov a rastlinných tukov a olejov, ani analýzu olejnatých semien a olejnatého ovocia. 2. Podstata metódy Vzorka sa vysuší za špecifikovaných podmienok, ktoré sa líšia podľa druhu krmiva. Úbytok hmotnosti sa stanoví vážením. V prípade tuhých krmív, ktoré majú vysoký obsah vlhkosti, je potrebné ich predsušenie. 3. Prístroje 3.1. mlynček z materiálu, ktorý neabsorbuje vlhkosť, ľahko sa čistí, umožňuje rýchle mletie bez toho, aby vznikalo zahrievanie, čo najviac zamedzuje kontaktu s okolitým vzduchom a spĺňa požiadavky uvedené v bodoch a (napr. kladivkové alebo vodou chladené mikromlynčeky, rozoberateľné kužeľové mlynčeky, nízkootáčkové mlynčeky alebo mlynčeky s ozubenými kolesami); 3.2. analytické váhy s presnosťou na 0,5 mg; 3.3. suché vysúšačky z nekorodujúcich kovov alebo zo skla s vrchnákmi umožňujúcimi vzduchotesné uzatvorenie; s pracovným povrchom, na ktorom možno rozprestrieť skúšobnú vzorku vo vrstve približne 0,3 g/m 2 ; 3.4. elektricky vyhrievaná izotermická sušiareň (±1 o C), primerane vetraná, s možnosťou rýchlej regulácie teploty. Pri sušení obilnín, múky, krúpov a šrotu musí mať sušiareň takú tepelnú výkonnosť, aby sa jej teplota nastavená na 131 o C, po vložení najväčšieho počtu skúšobných vzoriek na súčasné sušenie, vrátila na pôvodnú hodnotu do 45 min. Vetranie sušiarne musí byť také, aby bol rozdiel medzi výsledkami sušenia najväčšieho počtu vzoriek bežnej pšenice počas dvoch hodín a výsledkami získanými po štvorhodinovom sušení pšenice menší ako 0,15 %; 3.5. regulovateľná elektricky vyhrievaná vákuová sušiareň vybavená olejovou pumpou a mechanizmom, ktorý buď privádza horúci suchý vzduch alebo sušiacu látku (napr. oxid vápenatý); 3.6. exsikátor s hrubou perforovanou kovovou alebo porcelánovou platňou obsahujúci účinnú sušiacu látku. 4. Pracovný postup Postupy opísané v tomto bode sa musia vykonať ihneď po otvorení balíčkov so vzorkami. Analýza sa musí vykonať aspoň dvakrát. 5

6 4.1. Príprava Krmivá, okrem krmív podľa bodov a Odoberte aspoň 50 g vzorky. Ak je potrebné, pomeľte alebo rozdrvte ju takým spôsobom, aby sa zamedzilo akejkoľvek odchýlke v obsahu vlhkosti (pozri 6) Obilniny a obilné krúpy Odoberte aspoň 50 g vzorky. Pomeľte ju na častice, z ktorých najmenej 50 % prepadne sitom o veľkosti ôk 0,5 mm a zvyšok na site s okrúhlymi okami o veľkosti 1 mm bude najviac 10 % Krmivá tekuté, pastovité, krmivá prevažne zložené z olejov a tukov Odoberte približne 25 g vzorky, odvážte s presnosťou na 10 mg, pridajte potrebné množstvo bezvodého piesku odváženého s presnosťou na 10 mg a miešajte, až kým nezískate homogénny produkt Sušenie Krmivá, okrem krmív podľa bodov a Odvážte vysúšačku (3.3) s vrchnákom s presnosťou na 0,5 mg. Do odváženej vysúšačky navážte s presnosťou na 1 mg približne 5 g vzorky a rovnomerne ju rozložte. Vložte vysúšačku s odklopeným vrchnákom do sušiarne predhriatej na teplotu 103 C, a to čo najrýchlejšie, aby sa zamedzilo neželanému poklesu teploty. Vzorka sa suší štyri hodiny, ktoré sa počítajú od času, kedy sa teplota v sušiarni vráti na 103 C. Položte na vysúšačku vrchnák, vyberte ju z pece, v exsikátore ju nechajte vychladnúť za 30 až 45 min (3.6) a odvážte s presnosťou na 1 mg. Krmivá zložené prevažne z olejov a tukov sušte v sušiarni ešte ďalších 30 min pri teplote 130 C. Rozdiel medzi dvoma váženiami nesmie presiahnuť 0,1 % vlhkosti Obilniny, múky, krúpy a šroty Odvážte vysúšačku (3.3) s vrchnákom s presnosťou na 0,5 mg. Do odváženej vysúšačky navážte s presnosťou na 1 mg približne 5 g pomletej vzorky a rovnomerne ju rozložte. Vložte vysúšačku s odklopeným vrchnákom do sušiarne predhriatej na teplotu 130 C, a to čo najrýchlejšie, aby sa zamedzilo neželanému poklesu teploty. Nechajte vzorku sušiť dve hodiny, ktoré sa počítajú od času, keď sa teplota vráti na hodnotu 130 C. Na vysúšačku položte vrchnák, vyberte ju z pece, nechajte ju v exsikátore (3.6) vychladnúť za 30 až 45 min a odvážte s presnosťou na 1 mg Kŕmne zmesi obsahujúce viac ako 4 % sacharózy alebo laktózy: kŕmne suroviny, ako je svätojánsky chlieb, hydrolyzované obilninové produkty, slad, sušené repné rezky, šťavy z rýb a cukru; kŕmne zmesi obsahujúce viac ako 25 % minerálnych solí vrátane vody z kryštalizácie. Navážte vysúšačku (3.3) s vrchnákom s presnosťou na 0,5 mg. Do odváženej vysúšačky navážte s presnosťou na 1 mg približne 5 g vzorky a rovnomerne ju rozložte. Vložte vysúšačku s odklopeným vrchnákom do vákuovej sušiarne (3.6) predhriatej na teplotu medzi 80 C až 85 C, a to čo najrýchlejšie, aby sa zamedzilo neželanému poklesu teploty. 6

7 4.3. Predsušenie Nastavte tlak na 100 torrov a nechajte pri tomto tlaku sušiť štyri hodiny, buď pod prúdom horúceho suchého vzduchu alebo použite sušiaci prostriedok (približne 300 g na 20 vzoriek). Pri použití sušiacej látky odpojte vákuové čerpadlo, hneď, ako sa dosiahne predpísaný tlak. Čas sušenia počítajte od momentu, keď sa teplota v sušiarni vráti na hodnotu od 80 C do 85 C. Opatrne vráťte sušiareň na atmosferický tlak. Potom ju otvorte, ihneď položte na vysúšačku vrchnák, vyberte ju zo sušiarne, nechajte v exsikátore (3.6) vychladnúť za 30 až 45 min a odvážte s presnosťou na 1 mg. Sušte ďalších 30 min vo vákuovej sušiarni pri teplote od 80 C do 85 C a prevážte. Rozdiel medzi dvoma váženiami nesmie presiahnuť 0,1 % vlhkosti Krmivá, okrem krmív podľa bodu Tuhé krmivá s vysokým obsahom vlhkosti, ktoré spôsobujú problémy pri mletí, sa musia predsušiť podľa tohto postupu: Navážte 50 g nepomletej vzorky s presnosťou na 10 mg vo vhodnej vysúšačke (napr. hliníková platňa o veľkosti 20 x 12 cm s 0,5 cm rámom). Lisované alebo granulované krmivá sa môžu v prípade potreby rozdrviť nahrubo. Nechajte sušiť v sušiarni pri teplote od 60 C do 70 C, až kým sa vlhkosť nezníži na 8 % až 12 %. Vyberte zo sušiarne, nechajte vychladnúť za 1 h nezakryté v laboratórnom prostredí a odvážte s presnosťou na 10 mg. Potom ihneď pomeľte podľa návodu v bode a sušte tak, ako je uvedené v bodoch alebo podľa druhu krmiva Obilniny 5. Výpočet výsledkov Obilné zrná s vlhkosťou vyššou ako 17 % sa musia predsušiť, a to týmto postupom: Navážte 50 g nepomletých zŕn s presnosťou na 10 mg vo vhodnej vysúšačke (napr. hliníková platňa o veľkosti 20 x 12 cm s 0,5 cm rámom). Nechajte sušiť v sušiarni 5 až 7 min pri teplote 130 C. Vyberte zo sušiarne, nechajte vychladnúť dve hodiny nezakryté v laboratórnom prostredí a odvážte s presnosťou na 10 mg. Potom ihneď pomeľte podľa postupu v bode a vysušte tak, ako je uvedené v bode Obsah vlhkosti X v percentách zo vzorky sa vypočíta podľa vzorca 5.1. Sušenie bez predsušenia 100 (E m), E v ktorom je E počiatočná hmotnosť skúšobnej vzorky v gramoch, m hmotnosť suchej skúšobnej vzorky v gramoch. 7

8 5.2. Sušenie s predsušením, v ktorom je E pôvodná hmotnosť skúšobnej vzorky v gramoch, M hmotnosť vzorky po predsušení v gramoch, M hmotnosť vzorky po drvení alebo mletí v gramoch, m hmotnosť vysušenej skúšobnej vzorky v gramoch Opakovateľnosť Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť 0,2 % vlhkosti. 6. Pozorovanie Ak vzorku treba upraviť mletím a ak sa zdá, že táto úprava zmení obsah vlhkosti produktu, výsledky analýzy zložiek krmív sa musia upraviť na základe obsahu vlhkosti vzorky v jej pôvodnom stave. 8

9 Časť A 2 Stanovenie vlhkosti v živočíšnych a rastlinných tukoch a olejoch (metóda podľa smernice 1973/46/EHS) 1. Predmet metódy Táto metóda umožňuje stanoviť obsah vody a prchavých látok v živočíšnych a rastlinných tukoch a olejoch. 2. Podstata metódy Vzorka sa vysuší na konštantnú hmotnosť pri teplote 103 C. Úbytok hmotnosti sa stanoví vážením. 3. Prístroje 3.1. miska s plochým dnom, z nehrdzavejúceho materiálu, o priemere 8 až 9 cm a výške približne 3 cm; 3.2. ortuťový teplomer so spevnenou guľôčkou a s vyrovnávacou rúrkou na hornom konci, s delenou stupnicou od približne 80 C najmenej do 110 C a o dĺžke približne 10 cm; 3.3. pieskový kúpeľ alebo elektrická vyhrievacia platňa; 3.4. exsikátor, obsahujúci účinné vysušovadlo; 3.5. analytické váhy. 4. Pracovný postup Navážte s presnosťou na 1 mg približne 20 g zhomogenizovanej vzorky do suchej, odváženej misky (3.1), v ktorej sa nachádza teplomer (3.2). Zohrievajte na pieskovom kúpeli alebo elektrickej vyhrievacej platni (3.3), za trvalého miešania teplomerom tak, aby teplota dosiahla hodnotu 90 C za približne 7 min. Znížte intenzitu ohrevu, pozorujúc frekvenciu s akou stúpajú bubliny z dna misky. Teplota nesmie presiahnuť hodnotu 105 C. Pokračujte v miešaní, stierajúc dno misky, kým sa neprestanú tvoriť bubliny. S cieľom zabezpečiť úplné odstránenie vlhkosti, niekoľkokrát znovu zohrejte na teplotu 103 C ±2 C, pričom medzi jednotlivými zohriatiami ochlaďte na 93 C. Potom nechajte vychladnúť na laboratórnu teplotu v exsikátore (3.4) a odvážte. Túto operáciu opakujte dovtedy, kým úbytok hmotnosti medzi dvomi následnými váženiami nebude menší ako 2 mg. Poznámka: Nárast hmotnosti vzorky po opakovanom zohriatí znamená oxidáciu tuku, v takomto prípade vypočítajte výsledok z váženia vykonaného bezprostredne predtým, ako začala hmotnosť stúpať. 9

10 5. Výpočet Obsah vlhkosti, ako percento vzorky sa vypočíta podľa vzorca, v ktorom je M o hmotnosť skúšobnej vzorky v gramoch, M 1 hmotnosť misky v gramoch s obsahom pred zohrievaním, M 2 hmotnosť misky v gramoch s obsahom po zohriatí. Výsledky menšie ako 0,05 % sa musia vyjadriť ako menej ako 0,05 %. 6. Opakovateľnosť Rozdiel vo vlhkosti medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť 0,05 % absolútnych. 10

11 Časť B Dusíkaté látky Časť B1 Stanovenie dusíkatých látok (metóda podľa smernice 1993/28/EHS) 1. Predmet metódy Táto metóda umožňuje stanoviť obsah dusíkatých látok na základe obsahu dusíka, stanoveného metódou podľa Kjeldahla. 2. Podstata metódy Vzorka sa mineralizuje kyselinou sírovou v prítomnosti katalyzátora. Kyslý roztok sa zalkalizuje roztokom hydroxidu sodného. Amoniak sa oddestiluje a zachytí v odmeranom množstve kyseliny sírovej, ktorej prebytok sa titruje štandardným roztokom hydroxidu sodného. 3. Chemikálie 3.1. síran draselný; 3.2. katalyzátor: oxid meďnatý CuO alebo pentahydrát síranu meďnatého, CuSO 4. 5H 2 O; 3.3. granulovaný zinok; 3.4. kyselina sírová, ρ 20 = 1,84 g/ml; 3.5. kyselina sírová c(½ H 2 SO 4 ) = 0,5 mol/l; 3.6. kyselina sírová c(½ H 2 SO 4 ) = 0,1 mol/l; 3.7. indikátor metylčerveň. Rozpustite 300 mg metylčervene v 100 ml etanolu, σ = % (v/v); 3.8. roztok hydroxidu sodného (môže sa použiť technicky čistý) δ = 40 g/100 ml (m/v: 40 %); 3.9. roztok hydroxidu sodného c = 0,25 ml/l; roztok hydroxidu sodného c = 0,1 mol/l; granulovaná pemza premytá kyselinou chlorovodíkovou a vyžíhaná; acetanilid (bod topenia = 114 o C, N = 10,36 %); sacharóza (bez dusíka). 4. Prístroj Prístroj vhodný na vykonanie mineralizácie, destilácie a titrácie podľa Kjeldahlovej metódy. 5. Pracovný postup 5.1. Mineralizácia Navážte 1 g vzorky s presnosťou na 0,001 g a vzorku preneste do mineralizačnej banky. Pridajte 15 g síranu draselného (3.1.), vhodné množstvo katalyzátora (3.2) (0,3 až 0,4 g oxidu meďnatého alebo 0,9 až 1,2 g pentahydrátu síranu meďnatého), 25 ml kyseliny sírovej (3.4) a niekoľko granúl pemzy (3.11) a premiešajte. Banku najskôr mierne zahrievajte, ak je potrebné, obsah 11

12 občas premiešajte, až kým hmota zuhoľnatie a kým sa prestane tvoriť pena; potom zahrievajte intenzívnejšie, až kým kvapalina nedosiahne trvalý var. Zahrievanie je primerané vtedy, keď vriaca kyselina kondenzuje na stenách banky. Zabráňte prehriatiu stien banky a zachytávaniu organických častíc na nich. Keď sa roztok vyčíri a získa svetlozelenú farbu, pokračujte vo vare ešte ďalšie dve hodiny, potom nechajte vychladnúť Destilácia 5.3. Titrácia Opatrne pridajte dostatočné množstvo vody, aby sa sírany úplne rozpustili. Nechajte vychladnúť a potom pridajte niekoľko granúl zinku (3.3). Do zachytávacej banky destilačného prístroja pridajte presne 25 ml kyseliny sírovej (3.5) alebo (3.6) v závislosti od predpokladaného obsahu dusíka. Pridajte niekoľko kvapiek indikátora metylčervene (3.7). Pripojte mineralizačnú banku na chladič destilačného prístroja a ponorte koniec chladiča do kvapaliny nachádzajúcej sa v zachytávacej banke do hĺbky najmenej 1 cm (pozri poznámku 8.3). Pomaly nalejte 100 ml roztoku hydroxidu sodného (3.8) do mineralizačnej banky bez straty amoniaku (pozri poznámku 8.1). Banku zahrievajte až do úplného predestilovania amoniaku. Titrujte prebytočnú kyselinu sírovú v zachytávacej banke roztokom hydroxidu sodného (3.9) alebo (3.10) v závislosti od koncentrácie použitej kyseliny sírovej, až do dosiahnutia bodu ekvivalencie Slepý pokus Na potvrdenie toho, že chemikálie neobsahujú dusík, vykonajte slepý pokus (mineralizácia, destilácia a titrácia) použitím 1 g sacharózy (3.13) namiesto vzorky. 6. Výpočet výsledkov Obsah dusíkatých látok sa vypočíta podľa vzorca v ktorom je V o objem (ml) NaOH (3.9 alebo 3.10) použitého pri slepom pokuse, V 1 objem (ml) NaOH (3.9 alebo 3.10) použitého pri titrácii vzorky, c koncentrácia (mol/l) hydroxidu sodného (3.9 alebo 3.10), m hmotnosť (g) vzorky., 12

13 7. Validácia metódy 7.1. Opakovateľnosť Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť 0,2 % v absolútnej hodnote, pre obsahy dusíkatých látok menšie ako 20 %; 1,0 % z vyššej hodnoty, pre obsahy dusíkatých látok od 20 % do 40 %; 0,4 % v absolútnej hodnote, pre obsahy dusíkatých látok väčšie ako 40 % Správnosť 8. Poznámky Vykonajte analýzu (mineralizácia, destilácia a titrácia) 1,5 až 2,0 g acetanilidu (3.12) v prítomnosti 1 g sacharózy (3.13); na 1 g acetanilidu sa spotrebuje 14,80 ml kyseliny sírovej (3.5). Návratnosť musí byť najmenej 99 % Prístroj môže byť jednoduchý, poloautomatický alebo automatický. Ak prístroj vyžaduje prenos medzi krokom mineralizácie a destilácie, musí sa vykonať bez strát. Ak banka destilačného prístroja nie je opatrená prikvapkávacím lievikom, hydroxid sodný pridajte bezprostredne pred pripojením banky na chladič, pričom kvapalinu lejte tak, aby pomaly stekala po stene banky Ak mineralizát stuhne, zopakujte stanovenie s použitím väčšieho množstva kyseliny sírovej (3.4) než je určené vyššie Ak ide o produkty s nízkym obsahom dusíka môže byť podľa potreby objem kyseliny sírovej (3.6) pridávanej do zachytávacej banky zmenšený na 10 ml alebo 15 ml a doplnený na 25 ml vodou. 13

14 Časť B 2 Stanovenie stráviteľných dusíkatých látok in vitro (metóda podľa smernice 1972/199/EHS) 1. Predmet metódy Táto metóda umožňuje stanoviť frakciu stráviteľných dusíkatých látok rozpustných pepsínom a kyselinou chlorovodíkovou za definovaných podmienok. Je použiteľná na všetky krmivá. 2. Podstata metódy Vzorka sa zahrieva 48 h pri teplote 40 C v roztoku pepsínu v kyseline chlorovodíkovej. Suspenzia sa prefiltruje a obsah dusíka vo filtráte sa stanoví metódou na stanovenie dusíkatých látok. 3. Chemikálie 3.1. kyselina chlorovodíková, d: 1,125; ,075 N kyselina chlorovodíková; 3.3. pepsín, 2,0 j./mg; aktivita pepsínu je definovaná v metóde uvedenej v časti B 11 tejto prílohy a musí sa stanoviť touto metódou; 3.4. približne 0,2 % (m/v) čerstvo pripravený roztok pepsínu v kyseline chlorovodíkovej (3.2); aktivita: 400 j./l; 3.5. protipeniaca emulzia napr. silikónový olej; 3.6. všetky chemikálie uvedené v bode 3 v metóde uvedenej v časti B 1 na stanovenie dusíkatých látok. 4. Prístroje 4.1. vodný kúpeľ alebo termostat nastavený na teplotu 40 C ±1 C; 4.2. Kjeldahlov prístroj na mineralizáciu a titráciu. 5. Pracovný postup 5.1. Príprava roztoku (pozri poznámku 8.2) Navážte 2 g vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte do 500 ml odmernej banky. Pridajte 450 ml roztoku pepsínu v kyseline chlorovodíkovej, (3.4) vopred zohriatého na 40 C a premiešajte, aby sa zabránilo vzniku hrudiek. Skontroluje, či je ph suspenzie menšie ako 1,7. Banku vložte do vodného kúpeľa alebo do termostatu (4.1) a nechajte ju tam 48 h. Po 8, 24 a 32 h obsah banky premiešajte. Po 48 h pridajte 15 ml kyseliny chlorovodíkovej (3.1), ochlaďte na 20 C, doplňte na objem vodou a prefiltrujte Mineralizácia 250 ml filtrátu premiestnite do banky destilačného prístroja (4.2). Pridajte chemikálie potrebné na mineralizáciu, uvedené v druhej vete bodu 5.1 metódy na stanovenie dusíkatých látok. Premiešajte a priveďte do varu. Ak sa tvorí pena, pridajte niekoľko kvapiek protipeniacej 14

15 emulzie (3.5). Pokračujte v intenzívnom vare až do takmer úplného odparenia vody. Znížte intenzitu zahrievania a opatrne odstráňte posledné zvyšky vody. Keď sa roztok vyčíri a odfarbí (alebo je svetlozelený, ak sa použil katalyzátor na báze medi), varte ďalšiu hodinu a nechajte vychladnúť 5.3. Destilácia a titrácia Pokračujte postupom uvedeným v bode 5.2 a 5.3 metódy na stanovenie dusíkatých látok Slepý pokus Vykonajte slepý pokus rovnakým postupom, ale bez vzorky, ktorá sa má analyzovať. 6. Výpočet výsledkov Odpočítajte objem kyseliny sírovej spotrebovaný pri slepom pokuse od objemu spotrebovaného na skúšobnú vzorku. 1 ml 0,1 N kyseliny sírovej odpovedá 1,4 mg dusíka. Množstvo dusíka vynásobte faktorom 6,25. Výsledok vyjadrite ako percento vzorky. 7. Opakovateľnosť Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných v tej istej vzorke nesmie presiahnuť 0,4 v absolútnej hodnote, pre obsahy menšie ako 20 %, 2,0 % relatívnych, pre obsahy nie menšie ako 20 % a nie väčšie ako 40 %, 0,8 v absolútnej hodnote, pre obsahy väčšie ako 40 %. 8. Poznámky 8.1. Hodnoty získané touto metódou nemajú žiadne priame spojenie so stráviteľnosťou in vivo Produkty s obsahom oleja alebo tuku vyšším ako 10 % sa musia najskôr odtučniť extrakciou petroléterom (bod varu: 40 C až 60 C) V osobitných prípadoch hodnotenia krmiva, ak nejde o stanovenie výživnej hodnoty, možno na výpočet dusíkatých látok použiť presnejšie prepočítavacie faktory, a to 5,75, ak ide o obilniny a mlynské krmivá, 6,00, ak ide o živočíšne múčky, 6,37, ak ide o mlieko a mliečne výrobky a 5,61, ak ide o želatínu. Prepočítavací faktor treba vždy uviesť. 15

16 Časť B 3 Stanovenie bielkovín a amidov 1. Predmet metódy Táto metóda skúšania krmiva sa vzťahuje na stanovenie bielkovín a amidov v krmivách. 2. Podstata metódy Bielkoviny sa stanovia metódou podľa Barnsteina. Ľahko rozpustné zlúčeniny dusíka sa vyextrahujú horúcou vodou a vyzrážajú sa síranom meďnatým. Po filtrácii sa v zrazenine stanoví obsah dusíkatých látok metódou podľa Kjeldahla. Amidy sa stanovia odčítaním obsahu bielkovín od obsahu dusíkatých látok. 3. Chemikálie a skúšobné pomôcky 3.1. laboratórna odstredivka s kyvetami o objeme 100 ml; 3.2. síran meďnatý, pentahydrát, roztok, ktorý sa pripravuje zo 60 g kryštalického síranu meďnatého doplneného vodou na objem 1000 ml; 3.3. hydroxid sodný, roztok 1,25 %; 3.4. ostatné pomôcky a chemikálie, ako sú uvedené v časti B1 bod č Pracovný postup stanovenia bielkovín Do kadičky o objeme 400 ml sa naváži 1 g až 2 g vzorky s presnosťou na 0,001 g a zaleje sa 100 ml vody. Obsah kadičky sa varí počas 2 min, pridá sa 25 ml roztoku síranu meďnatého a pomaly za stáleho miešania 25 ml roztoku hydroxidu sodného. Potom sa kadička doplní horúcou vodou a po usadení jej obsahu sa zrazenina dekantuje, filtruje cez bezdusíkatý filter a premýva horúcou vodou až do dosiahnutia negatívnej reakcie filtrátu na meď. V zrazenine na filtri sa stanoví obsah dusíkatých látok podľa časti B1. V škrobnatých krmivách, v ktorých zmazovatelý škrob sťažuje filtráciu, možno škrobnatú časť oddeliť pred filtráciou dvojnásobným odstredením alebo možno použiť namiesto varenia počas 2 min zahrievanie počas 30 min vo vodnom kúpeli pri teplote 60 C. 5. Výpočet výsledkov 5.1. Výpočet obsahu bielkovín Obsah bielkovín v krmive v % sa vypočíta, rovnako ako obsah dusíkatých látok, podľa časti B Výpočet obsahu amidov Obsah amidov v krmive v % sa vypočíta odčítaním množstva bielkovín v krmive v % od množstva dusíkatých látok v krmive v %. 16

17 Časť B 4 Stanovenie močoviny (metóda podľa smernice 1971/250/EHS) 1. Predmet metódy Táto metóda umožňuje stanoviť obsah močoviny v krmivách. 2. Podstata metódy Vzorka sa rozmieša vo vode s číriacim činidlom. Suspenzia sa prefiltruje. Obsah močoviny vo filtráte sa stanoví po pridaní 4-dimetylaminobenzaldehydu (4-DMAB) zmeraním absorbancie pri vlnovej dĺžke 420 nm. 3. Chemikálie 3.1. roztok 4-dimetylaminobenzaldehydu: rozpustite 1,6 g 4-DMAB p.a. v 100 ml 96 % etanolu a pridajte 10 ml kyseliny chlorovodíkovej p.a. (d: 1,19). Toto činidlo sa môže používať najviac dva týždne; 3.2. Carrezovo činidlo I: rozpustite vo vode 21,9 g dihydrátu octanu zinočnatého, Zn(CH 3 COO) 2. 2H 2 O a 3 g ľadovej kyseliny octovej. Doplňte vodou na objem 100 ml; 3.3. Carrezovo činidlo II: rozpustite vo vode 10,6 g trihydrátu ferokyanidu draselného K 4 Fe (CN) 6. 3H 2 O. Doplňte vodou na objem 100 ml; 3.4. aktívne uhlie p.a., ktoré neabsorbuje močovinu (musí sa skontrolovať); ,1 % roztok (w/v) močoviny p.a. 4. Prístroje 4.1. trepačka približne ot/min; 4.2. skúmavky: 160 x 16 mm so zábrusovými zátkami; 4.3. spektrofotometer. 5. Pracovný postup 5.1. Analýza vzorky Navážte 2 g vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte spolu s 1 g aktívneho uhlia (3.4) do 500 ml odmernej banky. Pridajte 400 ml vody a 5 ml Carrezovho činidla I (3.2) a II (3.3). Miešajte 30 min v trepačke. Doplňte na požadovaný objem vodou, premiešajte a prefiltrujte. Odoberte 5 ml číreho bezfarebného filtrátu do skúmaviek so zábrusovými zátkami, pridajte 5 ml roztoku 4-DMAB (3.1) a premiešajte. Skúmavky vložte do vodného kúpeľa o teplote 20 C. Po 15 min zmerajte absorbanciu roztoku vzorky spektrofotometrom pri 420 nm. Porovnajte so slepým pokusom z použitých chemikálií Kalibračná krivka Odoberte objemy 1, 2, 4, 5 a 10 ml roztoku močoviny (3.5), vložte do 100 ml odmerných baniek a doplňte na požadovaný objem vodou. Odoberte 5 ml z každého roztoku, pridajte 17

18 5 ml roztoku 4-DMAB (3.1) do každého z nich, premiešajte a zmerajte absorbanciu vyššie uvedeným postupom porovnaním s kontrolným roztokom obsahujúcim 5 ml 4-DMAB a 5 ml vody bez obsahu močoviny. Urobte kalibračnú krivku. 6. Výpočet výsledkov Množstvo močoviny vo vzorke stanovte z kalibračnej krivky. Výsledok vyjadrite ako percento vzorky. 7. Poznámky 7.1. Ak obsah močoviny presahuje 3 %, zmenšite množstvo vzorky na 1 g alebo pôvodný roztok zrieďte tak, aby sa v 500 ml nenachádzalo viac ako 50 mg močoviny Ak obsah močoviny je nízky, zväčšujte množstvo vzorky dovtedy, kým je filtrát ešte stále číry a bezfarebný Ak vzorka obsahuje jednoduché dusíkaté zlúčeniny ako sú aminokyseliny, absorbancia sa musí merať pri 435 nm. 18

19 Časť B 5 Stanovenie amoniaku I. Mikrodifúzna metóda (metóda podľa smernice 1971/393/EHS) 1. Predmet metódy Táto metóda umožňuje stanovenie obsahu prchavých dusíkatých látok v krmivách vyjadrených ako amoniak. 2. Podstata metódy Vzorka sa extrahuje vodou a získaný roztok sa prečistí a prefiltruje. Prchavé dusíkaté látky sú vytesnené mikrodifúziou použitím roztoku uhličitanu draselného, zachytené v roztoku kyseliny boritej a stitrované kyselinou sírovou. 3. Chemikálie % (w/v) roztok kyseliny trichlóroctovej; 3.2. indikátor: rozpustite 33 mg brómkrezolovej zelene a 65 mg metylčervene v 100 ml 95 % - 96 % (v/v) etanolu; 3.3. roztok kyseliny boritej: v odmernej banke o objeme 1 l rozpustite 10 g kyseliny boritej p.a. v 200 ml 95 % - 96 % (v/v) etanolu a 700 ml vody. Pridajte 10 ml indikátora (3.2). Premiešajte a keď je to potrebné, upravte farbu roztoku na svetločervenú pridaním roztoku hydroxidu sodného. V 1 ml tohto roztoku sa zachytí najviac 300 µg NH 3 ; 3.4. nasýtený roztok uhličitanu draselného: rozpustite 100 g uhličitanu draselného p.a. v 100 ml vriacej vody. Nechajte vychladnúť a prefiltrujte; 3.5. kyselina sírová 0,02 N. 4. Prístroje 4.1. mixér (trepačka): približne 35 ot/min až 40 ot/min; 4.2. sklenené alebo plastové Conwayove misky (pozri diagram); 4.3. mikrobyrety delené na 1/100 ml. 5. Pracovný postup Navážte 10 g vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte ju do 200 ml odmernej banky, do ktorej pridáte 100 ml vody. Miešajte 30 min v trepačke. Pridajte 50 ml roztoku kyseliny trichlóroctovej (3.1), doplňte vodou na celkový objem, dôkladne pretrepte a prefiltrujte cez skladaný filter. Pipetou vkvapnite 1 ml roztoku kyseliny boritej (3.3) do strednej časti Conwayovej misky a 1 ml filtrátu vzorky do medzikružia misky. Čiastočne prikryte vazelínou natretým vrchnákom. Rýchlo prikvapnite 1 ml nasýteného roztoku uhličitanu draselného (3.4) do medzikružia misky a vzduchotesne uzatvorte vrchnákom. Opatrne otáčajte misku v horizontálnej polohe tak, aby sa zmiešali obe činidlá. Nechajte inkubovať aspoň 4 h pri izbovej teplote alebo 1 h pri teplote 40 C. 19

20 Prchavé látky v roztoku kyseliny boritej stitrujte mikrobyretou (4.3) s 0,02 N kyseliny sírovej (3.5). Použitím rovnakého postupu vykonajte slepú skúšku, ale bez vzorky na analýzu. 6. Výpočet výsledkov 1 ml 0,02 N roztoku H 2 SO 4 zodpovedá 0,34 mg amoniaku. Vyjadrite výsledok ako percentá zo vzorky. 7. Opakovateľnosť Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke nesmie presiahnuť: 10 % v relatívnej hodnote pri obsahoch amoniaku nižších ako 1,0 %, 0,1 % v absolútnej hodnote pri obsahoch amoniaku 1,0 % alebo vyšších. 8. Pozorovanie Ak obsah amoniaku vo vzorke presiahne 0,6 %, zrieďte počiatočný filtrát. 20

21 CONWAYOVA MISKA Mierka 1/1 Pôdorys misky Prierez vrchnáka S 2 S 3 «Prierez misky S S 1 Pôdorys vrchnáka zo zabrúseného skla 21

22 II. Destilačná metóda 1. Predmet metódy Táto metóda umožňuje stanovenie obsahu prchavých dusíkatých látok, vyjadrených ako amoniak, v rybej múčke prakticky neobsahujúcej močovinu. Je uplatniteľná len na vzorky s obsahom amoniaku menším ako 0,25 %. 2. Podstata metódy Vzorka sa extrahuje vodou a získaný roztok sa prečistí a prefiltruje. Prchavé dusíkaté látky sú vytesnené pri bode varu pridaním oxidu horečnatého a zachytené v určitom množstve kyseliny sírovej, ktorej nadbytok je spätne stitrovaný roztokom hydroxidu sodného. 3. Chemikálie % (w/v) roztok kyseliny trichlóroctovej; 3.2. oxid horečnatý, p.a.; 3.3. emulzia proti peneniu (napr.silikón); 3.4. kyselina sírová, roztok 0,1 N; 3.5. hydroxid sodný, roztok 0,1 N; 3.6. metylčerveň, roztok 0,3 % (w/v) v 95 % až 96 % (v/v) etylalkohole. 4. Prístroje 4.1. mixér (trepačka): približne 35 ot/min až 40 ot/min; 4.2. Kjeldahlov destilačný prístroj. 5. Pracovný postup Navážte 10 g vzorky s presnosťou na 1 mg a vložte ju do 200 ml odmernej banky, do ktorej pridáte 100 ml vody. Miešajte 30 min v trepačke. Pridajte 50 ml roztoku kyseliny trichlóroctovej (3.1), doplňte vodou na celkový objem, dôkladne pretrepte a prefiltrujte cez skladaný filter. Vezmite určité množstvo čistého filtrátu vhodného na predpokladaný obsah prchavých dusíkatých látok (100 ml je obvykle vhodný objem). Zrieďte na 200 ml a pridajte 2 g oxidu horečnatého (3.2) a niekoľko kvapiek emulzie proti peneniu (3.3). Roztok musí reagovať na lakmusový papier zásadito, v opačnom prípade pridajte trochu oxidu horečnatého (3.2). Oddestilujte približne 150 ml roztoku v Kjeldahlovom prístroji a potom destilát obsahujúci presne odmeraný objem (25 až 50 ml) 0,1 N roztoku kyseliny sírovej (3.4) zachyťte do Erlenmeyerovej banky. Počas destilácie sa vyhýbajte prehriatiu stien banky. Varte roztok kyseliny sírovej 2 min, ochlaďte ju a spätnou titráciou 0,1 N roztokom hydroxidu sodného (3.5) za prítomnosti indikátora metylčervene (3.6) stitrujte nadbytok kyseliny sírovej. Použitím rovnakého postupu vykonajte slepú skúšku, ale bez vzorky na analýzu. 22

23 6. Výpočet výsledkov 1 ml 0,1 N roztoku H 2 SO 4 zodpovedá 1,7 mg amoniaku. Vyjadrite výsledok ako percentá zo vzorky. 7. Opakovateľnosť Rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke nesmie v relatívnych hodnotách prekročiť 10 % amoniaku. 23

24 Časť B 6 Stanovenie aktivity ureázy v sójových produktoch (metóda podľa smernice 1971/250/EHS) 1. Predmet metódy Táto metóda umožňuje odhadnúť aktivitu ureázy v produktoch pochádzajúcich zo sóje a zistiť, či tieto produkty boli dostatočne dlho tepelne upravené. 2. Podstata metódy Aktivita ureázy sa odhadne podľa množstva amoniakálneho dusíka uvoľneného v 1 g produktu za minútu pri teplote 30 C z roztoku močoviny. 3. Chemikálie ,1 N kyselina chlorovodíková; ,1 N roztok hydroxidu sodného; ,05 M fosforečnanový tlmivý roztok, obsahujúci v 1000 ml 4,45 g dihydrátu fosforečnanu disodného (Na 2 HPO 4.2H 2 O) a 3,40 g dihydrogénfosforečnanu draselného (KH 2 PO 4 ); 3.4. čerstvo pripravený tlmivý roztok močoviny, obsahujúci 30,0 g močoviny v 1000 ml tlmivého roztoku (3.3), ph 6,9-7,0. 4. Prístroje 4.1. potenciometrický titračný prístroj alebo vysoko citlivý ph meter (0,02 ph) s magnetickým miešadlom; 4.2. vodný kúpeľ s termostatom nastaveným na presne 30 C; 4.3. skúmavky so zábrusovými zátkami, 150 x 18 mm. 5. Pracovný postup Zomeľte približne 10 g vzorky (napríklad v kávovom mlynčeku) tak, aby prešla cez sito s otvormi o veľkosti 0,02 mm. Navážte 0,2 g pomletej vzorky s presnosťou na 1 mg, vložte do skúmavky so zábrusovou zátkou a pridajte 10 ml tlmivého roztoku močoviny (3.4). Okamžite zazátkujte a intenzívne pretrepávajte. Skúmavku vložte do vodného kúpeľa nastaveného presne na teplotu 30 C a intenzívne pretrepávajte. Skúmavku vložte do vodného kúpeľa nastaveného presne na teplotu 30 C a nechajte ju tam presne 30 min. Potom ihneď pridajte 10 ml 0,1 N kyseliny chlorovodíkovej (3.1), rýchlo ochlaďte na 20 C a obsah skúmavky preneste kvantitatívne do titračnej nádoby, skúmavku vypláchnite dvakrát 5 ml vody. Pomocou sklenej elektródy (4.1) okamžite a rýchlo titrujte 0,1 N roztokom hydroxidu sodného (3.2) do hodnoty ph 4,7. Vykonajte slepý pokus takto: 0,2 g vzorky navážené s presnosťou na 1 mg vložte rýchlo do skúmavky so zábrusovou zátkou, pridajte 10 ml 0,1 N kyseliny chlorovodíkovej (3.1) a potom pridajte 10 ml tlmivého roztoku močoviny 24

25 (3.4). Skúmavku ihneď ochlaďte v ľadovej vode a nechajte ju ponorenú 30 min. Za podmienok uvedených vyššie, preneste obsah skúmavky do titračnej nádobky a titrujte 0,1 N roztokom hydroxidu sodného (3.2) do hodnoty ph 4,7. 6. Výpočet výsledkov Aktivita uerázy sa vypočíta podľa vzorca, 1. v ktorom je a ml 0,1 N roztoku hydroxidu sodného spotrebovaného na vzorku, b ml 0,1 N roztoku hydroxidu sodného spotrebovaného na slepý pokus, E hmotnosť vzorky v g. 7. Poznámky 7.1. Táto metóda je vhodná na aktivitu ureázy do 1 mg N/g/min pri 30 C. V produktoch s väčšou aktivitou sa môže veľkosť vzorky zmenšiť na 50 mg Produkty obsahujúce viac ako 10 % tukových zložiek sa musia najskôr odtučniť za studena. 25

26 Časť B 7 Stanovenie aminokyselín (metóda podľa smernice 1998/64/ES) 1. Predmet metódy Táto metóda slúži na stanovenie voľných (syntetických a prírodných) a celkových (viazaných peptidickou väzbou a voľných) aminokyselín v krmivách použitím analyzátora aminokyselín. Je použiteľná pre nasledovné aminokyseliny: cysteín (cystín), metionín, lyzín, treonín, alanín, arginín, kyselina asparágová, kyselina glutámová, glycín, histidín, izoleucin, leucín, fenylalanín, prolín, serín, tyrozín a valín. Táto metóda nie je schopná rozlišovať soli aminokyselín ani D a L formy aminokyselín. Nie je vhodná na stanovenie tryptofánu alebo hydroxyanalógov aminokyselín. 2. Podstata metódy 2.1. Voľné aminokyseliny Voľné aminokyseliny sa extrahujú zriedenou kyselinou chlorovodíkovou. Spolu vyextrahované dusíkové makromolekuly sa vyzrážajú kyselinou sulfosalicylovou a odstránia sa filtráciou. Prefiltrovaný roztok sa upraví na hodnotu ph 2,20. Aminokyseliny sa oddelia pomocou iónovo -výmennou chromatografiou a stanovia sa reakciou s ninhydrínom pomocou fotometrickej detekcie pri 570 nm Celkové aminokyseliny Zvolený postup závisí od toho, ktoré aminokyseliny sa majú stanovovať. Cysteín (cystín) a metionín sa musia pred hydrolýzou oxidovať na kyselinu cysteovú a na metionín sulfón. Tyrosín sa musí stanoviť v hydrolyzátoch neoxidovaných vzoriek. Všetky ostatné aminokyseliny uvedené v bode 1 sa dajú stanoviť v oxidovanej aj v neoxidovanej vzorke. Oxidácia sa vykoná pri 0 0 C zmesou kyseliny permravčej a fenolu. Prebytočné oxidačné činidlo sa rozloží pomocou disiričitanu disodného.oxidovaná alebo neoxidovaná vzorka sa hydrolyzuje 23 h kyselinou chlorovodíkovou (c = 6 mol/l). Hydrolyzát sa upraví tak, aby hodnota ph bola 2,20. Aminokyseliny sa oddelia iónovo-výmennou chromatografiou a stanovia sa reakciou s ninhydrínom pomocou fotometrickej detekcie pri 570 nm, ak ide o prolín pri 440 nm. 3. Chemikálie Musí sa použiť dvakrát destilovaná voda alebo voda ekvivalentnej kvality, o vodivosti < 10 µs peroxid vodíka, w = 30 %; 3.2. kyselina mravčia, w = 98 % až 100 %; 3.3. fenol; 3.4. disiričitan disodný; 3.5. hydroxid sodný; 3.6. dihydrát kyseliny 5 sulfosalicilovej; 26

27 3.7. kyselina chlorovodíková, hustota približne 1,18 g/ml; 3.8. dihydrát citranu trisodného; ,2 -tiodietanol (tiodiglykol); chlorid sodný; ninhydrín; petroléter, rozmedzie bodu varu 40 C až 60 C; norleucin, alebo iná zlúčenina vhodná na použitie ako vnútorný štandard; plynný dusík (<10 ppm kyslíka); oktanol; aminokyseliny; štandardné látky uvedené v bode 1. Čisté zlúčeniny, ktoré neobsahujú žiadnu kryštalizačnú vodu.pred použitím ich sušte vo vákuu jeden týždeň nad P 2 O 5 alebo H 2 SO 4 ; kyselina cysteová; metionín sulfón; roztok hydroxidu sodného, c = 7,5 mol/l.ň Rozpustite 300 g NaOH (3.5) vo vode a doplňte na 1 l; roztok hydroxidu sodného, c = 1 mol/l. Rozpustite 40 g NaOH (3.5) vo vode a doplňte na 1 l; roztok kyseliny mravčej a fenolu. Zmiešajte 889 g kyseliny mravčej (3.2) so 111 g vody a pridajte 4,73 g fenolu (3.3); hydrolyzačná zmes, c = 6 mol HCl/l obsahujúcej 1g fenolu /l. Pridajte 1 g fenolu (3.3) k 492 ml HCl (3.7) a doplňte vodou na 1 l; extrakčná zmes, c = 0,1 mol HCl/l obsahujúcej 2 % tiodiglykolu. Vezmite 8,2 ml HCl (3.7), zrieďte s cca 900 ml vody, pridajte 20 ml tiodiglykolu (3.9) a doplňte vodou na 1 l ( 3.7 a 3.9 nezmiešavajte priamo); kyselina 5-sulfosalicilová, β = 6 %. Rozpustite 60 g kyseliny 5-sulfosalicilovej (3.6) vo vode a doplňte vodou na 1 l; oxidačná zmes kyseliny permravčej a fenolu. Zmiešajte 0,5 ml peroxidu vodíka (3.1) s 4,5 ml roztoku kyseliny mravčej s fenolom (3.19) v malej kadičke. Inkubujte 1 h pri teplote 20 C až 30 0 C, aby sa vytvorila kyselina permravčia a pred pridaním do vzorky ochlaďte v ľadovom vodnom kúpeli (15 min). Upozornenie: Vystríhajte sa kontaktu s pokožkou a používajte pri práci ochranný odev; citranový tlmivý roztok, c = 0,2 mol Na + /l, ph 2,20. Rozpustite 19,61 g citranu sodného (3.8), 5 ml tiodiglykolu (3.9), 1 g fenolu (3.3) a 16,50 ml HCl (3.7) v približne 800 ml vody, ph upravte na 2,20. Doplňte vodou na 1 l; elučné tlmivé roztoky, pripravené v súlade s podmienkami pre používaný analyzátor (4.9); ninhydrínové činidlo, pripravené v súlade s podmienkami pre používaný analyzátor (4.9); štandardné roztoky aminokyselín. Tieto roztoky sa musia skladovať pri teplote nižšej ako 5 0 C; zásobný štandardný roztok aminokyselín (3.16.1), c = 2,5 µmol/ml, každá v kyseline chlorovodíkovej. Sú k dispozícii aj komerčné prípravky; zásobný štandardný roztok kyseliny cisteovej a metionín sulfónu, c = 1,25 µmol/ml. Rozpustite 0,2115 g kyseliny cisteovej (3.16.2) a 0,2265 g metionín sulfónu (3.16.3) v citranovom tlmivom roztoku (3.24) v odmernej banke o objeme 1 l a doplňte po značku citranovým tlmivým roztokom. Skladujte pri teplote pod 5 0 C najviac 12 mesiacov. Tento roztok sa nepoužije, ak zásobný štandardný roztok (3.27.1) obsahuje kyselinu cisteovú a metionín sulfón; 27

28 4. Prístroje zásobný štandardný roztok vnútorného štandardu, napr. norleucín, c = 20 µmol/ml. Rozpustite 0,6560 g norleucinu (3.13) v citranovom tlmivom roztoku (3.24) v odmernej banke a doplňte na 250 ml citranovým tlmivým roztokom. Skladujte pri teplote pod 5 0 C najviac 6 mesiacov; kalibračný roztok štandardných aminokyselín určený na použitie s hydrolyzátmi, c = 5 nmol/50 µl kyseliny cisteovej a metionín sulfónu a c = 10 nmol/50 µl ostatných aminokyselín. Rozpustite 2,2 g chloridu sodného (3.10) v 100 ml kadičke s 30 ml citranového tlmivého roztoku.(3.24). Pridajte 4,00 ml zásobného štandardného roztoku aminokyselín (3.27.1), 4,00 ml zásobného štandardného roztoku kyseliny cisteovej a metionín sulfónu (3.27.2) a ak sa používa, aj 0,50 ml zásobného štandardného roztoku vnútorného štandardu (3.27.3). Hydroxidom sodným (3.18) upravte ph na 2,20. Preneste kvantitatívne do 50 ml odmernej banky, doplňte po značku citranovým tlmivým roztokom (3.24) a premiešajte. Skladujte pri teplote pod 5 0 C najviac do 3 mesiacov. Pozri taktiež poznámky 9.1; kalibračný roztok štandardných aminokyselín určený na používanie s hydrolyzátmi pripravenými podľa odseku a pre používanie s extraktmi (5.2). Kalibračný roztok sa pripraví v súlade s bodom s vynechaním chloridu sodného. Skladujte pri teplote nižšej ako 5 0 C najviac 3 mesiace ml alebo 250 ml banka s guľatým dnom opatrená spätným chladičom; ml sklená fľaša z borosilikátového skla so skrutkovým uzáverom s gumovou/teflónovou podložkou (napr. Duran, Schott) určená na použitie v sušiarni; 4.3. sušiareň s nútenou ventiláciou a regulátorom teploty s presnosťou vyššou ako (5 ±2) 0 C; 4.4. ph meter s presnosťou na tri desatinné miesta; 4.5. membránový filter (0,2 µm); 4.6. odstredivka; 4.7. rotačná vákuová odparka; 4.8. mechanická trepačka alebo magnetické miešadlo; 4.9. analyzátor aminokyselín alebo zariadenie na HPLC s iónovo-výmennou kolónou, zariadenie na ninhydrín, postkolónová derivatizačná jednotka a fotometrický detektor. Kolóna je plnená sulfónovanými polystyrénovými živicami schopnými oddeľovať jednotlivé aminokyseliny od seba a od ostatných materiálov pozitívnych na ninhydrín. Prietok pre tlmivý roztok a ninhydrín je zabezpečovaný čerpadlami, s prietokom stálym na ±0,5 %, počas ktorého sa vykoná aj kalibrácia pomocou štandardu aj analyzovanie vzorky. U niektorých analyzátorov aminokyselín možno použiť procesy hydrolýzy, v ktorých má hydrolyzát koncentráciu sodíka c = 0,8 mol/l a obsahuje všetku zvyšnú kyselinu mravčiu z oxidačného kroku. Iné zase nezabezpečujú uspokojivé oddelenie niektorých aminokyselín, ak hydrolyzát obsahuje prebytočnú kyselinu mravčiu a/alebo vysoké koncentrácie sodíkových iónov. V takomto prípade sa objem kyseliny zmenší odparením na približne 5 ml po hydrolýze a pred upravením ph.odparenie musí prebehnúť pod vákuom pri teplote najviac 40 0 C. 28

29 5. Pracovný postup 5.1. Príprava vzorky Vzorka sa pomelie tak, aby prepadla cez sito o veľkosti ôk 0,5 mm. Vzorky s vysokým obsahom vlhkosti sa musia pred mletím vysušiť vzduchom pri teplote najviac 50 0 C alebo vymraziť. Vzorky s vysokým obsahom tuku sa musia pred mletím extrahovať petroléterom (3.12) Stanovenie voľných aminokyselín v krmivách a v premixoch Odvážte s presnosťou na 0,2 mg príslušné množstvo (1-5 g) pripravenej vzorky (5.1) do Erlenmayerovej banky a pridajte 100,0 ml extrakčnej zmesi (3.21). Zmes trepte 60 min použitím mechanickej trepačky alebo magnetického miešadla (4.8). Nechajte sediment usadiť a pomocou pipety preneste 10,0 ml roztoku nad sedimentom do 100 ml kadičky. Pridajte 5,0 ml roztoku kyseliny sulfosalicilovej (3.22) za stáleho miešania a pomocou magnetického miešadla miešajte ešte 5 min. Kalný roztok prefiltrujte alebo odstreďte s cieľom odstrániť všetky zrazeniny. Preneste 10,0 ml výsledného roztoku do 100 ml kadičky a ph upravte na 2,20 použitím roztoku hydroxidu sodného (3.18), preneste do odmernej banky vhodného objemu použitím citranového tlmivého roztoku (3.24) a doplňte po značku tlmivým roztokom (3.24). Ak sa používa vnútorný štandard, pridajte 1,00 ml vnútorného štandardu (3.27.3) na každých 100 ml konečného roztoku a doplňte po značku tlmivým roztokom (3.24). Ďalší postup je chromatografia v súlade s bodom 5.4. Ak sa extrakty neanalyzujú v ten istý deň, musia sa skladovať pri teplote pod 5 0 C Stanovenie celkových aminokyselín Oxidácia Navážte s presnosťou na 0,2 mg 0,1 g až 1 g pripravenej vzorky (5.1) do ml banky s guľatým dnom (4.1) na otvorenú hydrolýzu ( ) alebo ml banky s guľatým dnom (4.1), ak sa vyžaduje nízka koncentrácia sodíka ( ), alebo ml fľaše opatrenej skrutkovým uzáverom (4.2) na uzavretú hydrolýzu ( ). Navážené množstvo vzorky musí mať obsah dusíka cca 10 mg a obsah vlhkosti nesmie presiahnuť 100 mg. Vložte banku/fľašu do ľadového vodného kúpeľa a ochlaďte na 0 0 C, pridajte 5 ml oxidačnej zmesi (3.23) a zamiešajte použitím sklenej špachtle s ohnutým hrotom. Utesnite banku/fľašu v ktorej sa nachádza špachtľa vzduchotesnou fóliou, vložte ľadový 29