STANOVENIE KONCENTRÁCIE Fe 2+ IÓNOV V SÉRE POMOCOU ANALYTICKEJ KRIVKY

Transcript

1 FYZIKÁLNO CHEMICKÉ METÓDY LABORATÓRNE CVIČENIE Č.1 STANOVENIE KONCENTRÁCIE Fe 2+ IÓNOV V SÉRE POMOCOU ANALYTICKEJ KRIVKY Roztok batofenantrolínu tvorí s iónmi Fe 2+ stabilný, červeno sfarbený komplex, vhodný na spektrofotometrické stanovenie s absorpčným maximom pri 535 nm. Meranie absorbancie reakčných zmesí vzniknutých pridaním batofenantrolínu do roztokov iónov Fe 2+ s rôznou známou koncentráciou (štandardných roztokov) umožní zostrojenie analytickej krivky závislosti A 535 od koncentrácie Fe 2+ iónov. Neznámu koncentráciu Fe 2+ iónov je potrebné odčítať z tejto krivky. Podmienkou je, aby sa pri analytickom postupe dodržali úplne rovnaké podmienky, t.j. vzorka aj štandardné roztoky sa spracovávajú paralelne. SO 3 Na 2+ SO 3 Na N N N Fe N N SO 3 Na Železnatý chelát dvojsodnej soli batofenantrolíndisulfónovej kyseliny N SO 3 Na SO 3 Na SO 3 Na Reagencie a pomôcky batofenantrolín (kyselina 4,7difenyl1,10fenantrolín3,6disulfónová) c = 0,46 mmol.l 1, octan sodný c = 2 mol.l 1, štandardný roztok Fe 2+ (síran železnatoamónny) c = 18 µmol.l 1, spektrofotometer. Postup Štandardný roztok železnatej soli známej koncentrácie (c = 18 µmol.l 1 ) sa riedi vodou podľa pracovnej tabuľky, pričom sa takto pripravujú roztoky rôznych, ale známych, koncentrácií iónov Fe 2+, za účelom zostrojenia analytickej krivky, A = f(c).

2 Koncentrácie železnatých iónov v roztokoch, ktoré sa pripravia riedením zásobného štandardného roztoku Fe 2+ (c = 18 µmol.l 1 ) vypočítame z bilančnej rovnice zrieďovania (pozri roztoky): c 1. V 1 = c 2. V 2 c 1 = 18 µmol.l 1 V 1 = 0,5; 1,0; 1,5 a 2,0 ml c 2 = x V 2 = 2,0 ml štandardné roztoky vzorka blank zásobný štand. roztok Fe 2+ (ml) H 2 O (ml) vzorka Fe 2+ (ml) činidlo (ml) 0,5 1,5 0,5 1,0 1,0 0,5 1,5 0,5 0,5 2,0 0,5 2,0 0,5 2,0 0,5 v čase od 560 minút meriame A 535 proti porovnávaciemu roztoku A 535 Fe 2+, c (µmol.l 1 ) 18 Hodnotenie a) Z vypočítaných hodnôt koncentrácií Fe 2+ iónov v jednotlivých štandardných roztokoch zostrojte analytickú krivku tak, že na os "x" nanesiete koncentráciu v µmol/l a na os "y" absorbancie príslušných roztokov Fe 2+. Ak je táto závislosť lineárna, platí v uvedenom rozsahu koncentrácií LambertovBeerov zákon. Keď zmeriate absorbanciu vzorky séra, môžete z analytickej krivky priamo odčítať koncentráciu iónov železa v sére. b) Koncentráciu iónov železa vypočítate tiež podľa nasledovného vzťahu: š. š kde A št je absorbancia štandardu, A vz absorbancia vzorky, c št je koncentrácia štandardu a c vz koncentrácia vzorky. c) Porovnáte výsledky získané odčítaním z analytickej krivky s vypočítanými hodnotami a vyhodnotíte, či koncentrácia železnatých iónov v sére je vo fyziologickom rozsahu. Výpočty Fyziologické hodnoty: c (Fe 2+ ) muži = 14,3 26 µmol.l 1 c (Fe 2+ ) ženy = 6,6 25,9 µmol.l 1

3 1,2 1,1 1 0,9 0,8 Absorbancia (535 nm) 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0, Koncentrácia Fe (µmol.l 1 ) Záver

4 BIOGÉNNE PRVKY LABORATÓRNE CVIČENIE Č.1 VPLYV IÓNOV KOVOV NA ELIMINÁCIU VOĽNÝCH RADIKÁLOV V BIOLOGICKOM MATERIÁLI V organizme sa voľné radikály, najmä radikály odvodené od kyslíka (napr. superoxidový aniónový radikál, skrátene superoxid, O 2. ), tvoria fyziologicky, ale aj za mnohých patologických podmienok. Enzým superoxiddismutáza (SOD) katalyzuje premenu superoxidu na kyslík a H 2 O 2, a tým znižuje jeho toxicitu. Niektoré nízkomolekulové koordinačné zlúčeniny, najmä tie, v ktorých ako centrálny atóm vystupuje Cu(II), Mn(III) alebo Fe(III), majú schopnosť reagovať so superoxidom, a tak jeho zvýšenú tvorbu v organizme eliminovať. Superoxid vytvorený systémom xantínxantínoxidáza (1) redukuje tetrazóliovú soľ INT (táto predstavuje detektor superoxidu) na monoformazán (2), ktorý má absorpčné maximum pri 510 nm a môžeme ho pri danej vlnovej dĺžke detegovať. SOD a Cu(II) komplex vychytávajú superoxid, a tým znižujú redukciu detektora (3, 4 a 5). XO H O. H O kyselina močová (1) O. INTH O INT&H (2) 2O. 2H *O () H O (3) O. Cu II. O CuI. (4) Cu I.O. 2H CuII.H O (5) Reagencie fosfátový tlmivý roztok, ph = 7,8 s koncentráciou 0,05 mol/l, xantín (X), c = mol/l reakčnej zmesi, xantínoxidáza (XO), 10 U/l reakčnej zmesi, tetrazóliová soľ (INT), c = 9, mol/l reakčnej zmesi, SOD, 1, g/l reakčnej zmesi, Cu(II) komplex: (2metylimidazol)(NsalicylidénLglutamáto)meďnatý komplex, [Cu(salLglu)(2metylimidazol)], g/l reakčnej zmesi.

5 Pracovný postup skúmavka tlmivý roztok ph 7,8 (ml) xantín (ml) SOD (ml) Cu(II) komplex (ml) INT (ml) 1,2 1,1 1,1 reakciu odštartovať pridaním xantínoxidázy v 20 sekundových intervaloch xantínoxidáza (ml) inkubovať 10 min pri izbovej teplote. odmerať A 510 v 20 sekundových intervaloch oproti tlmivému roztoku A 510 % redukcie INT 100 % inhibície redukcie INT 0 dismutázová aktivita (U) Hodnotenie 1. Z hodnôt nameraných absorbancií vypočítajte % redukcie INT vytvoreným superoxidom: redukcia INT superoxidom (absorbancia v skúmavke č.1) % redukcia INT superoxidom v prítomnosti SOD, resp. Cu(II) komplexu... x % 2. Z hodnôt % redukcie INT vplyvom SOD alebo Cu(II) komplexu vypočítajte % inhibície redukcie INT: % I = 100 x 3. Z hodnôt % inhibície vypočítajte pre SOD aj pre Cu(II) komplex dismutázovú aktivitu v jednotkách U: Definícia: Jedna jednotka dismutázovej aktivity U je definovaná ako schopnosť inhibovať redukciu INT na 50 % Výpočty a záver 1 U % I napr. 35 % I predstavuje dismutázovú aktivitu 0,7 U

6 ROZTOKY LABORATÓRNE CVIČENIE Č.1 PRÍPRAVA 250 ml ROZTOKU NaCl S KONCENTRÁCIOU 5 mol/l Pripravovať budeme roztok, ktorého koncentrácia je vyjadrená ako látková koncentrácia, určená podielom látkového množstva rozpustenej látky a celkového objemu roztoku. Pri výpočte použijeme vzorce: / /.1.6 Roztok pripravíme v odmernej banke s objemom 250 ml. Reagencie a pomôcky NaCl p.a.(m = 58 g/mol), odmerná banka (250 ml), lievik, laboratórna lyžica, pipeta, filtračný papier, váhy. Pracovný postup Vypočítame hmotnosť NaCl potrebnú na prípravu 250 ml roztoku s koncentráciou 5 mol/l. Vypočítané množstvo NaCl odvážime na technických váhach a prenesieme s použitím lievika do odmernej banky, rozpustíme v čiastočnom objeme destilovanej vody a následne doplníme objem vodou po značku na banke. Banku označíme štítkom s názvom látky, koncentráciou a dátumom prípravy. Výpočty a záver

7 ROZTOKY LABORATÓRNE CVIČENIE Č.2 PRÍPRAVA 100 ml ROZTOKOV NaCl S KONCENTRÁCIAMI 0,075 mol/l A mol/l RIEDENÍM ROZTOKU NaCl S KONCENTRÁCIOU 5 mol/l 1 Pre výpočet zmeny zloženia roztoku pridávaním rozpúšťadla, ak je zloženie roztoku vyjadrené látkovou koncentráciou, platí bilančná zrieďovacia rovnica: / / Rovnica vyjadruje, že pri riedení roztoku rozpúšťadlom sa mení objem roztoku a jeho koncentrácia, pričom látkové množstvo zostáva rovnaké. Z definície látkovej koncentrácie vyplýva: 0 7 / / a keďže platí: n 1 = n 2 po dosadení dostaneme: c 1.V 1 = c 2.V 2 Napr. pre prípravu objemu 100 ml roztoku s koncentráciou 0,75 mol/l riedením fyziologického roztoku (5 mol/l) destilovanou vodou platí: c 1 = 5 mol/l V 1 =? ml c 2 = 0,075 mol/l V 2 = 100 ml :.; : =,=?@.A== BC 5D 9 < =,A@ Reagencie a pomôcky roztok NaCl, c = 5 mol.l 1, dve odmerné banky objemu 100 ml, pipety, odmerný valec, lievik. Pracovný postup Vypočítame objemy fyziologického roztoku (5 mol/l) NaCl potrebného na prípravu 100 ml roztoku s koncentráciou 0,075 mol/l a 100 ml roztoku s koncentráciou mol/l. V oboch prípadoch vypočítaný objem odmeriame odmerným valcom, prelejeme do odmernej banky, doplníme destilovanou vodou po značku, uzatvoríme zátkou a dôkladne premiešame. Banku označíme štítkom s názvom látky, koncentráciou roztoku a dátumom prípravy. Výpočty a záver

8 ROZTOKY LABORATÓRNE CVIČENIE Č.3 SLEDOVANIE HYPOTONICKEJ HEMOLÝZY (OSMOTICKEJ FRAGILITY) ERYTROCYTOV V hypotonickom prostredí erytrocyty podliehajú hemolýze. Osmotická rezistencia, alebo opačne osmotická fragilita, sa skúma sledovaním odolnosti erytrocytov voči hemolýze v hypotonickom prostredí. Minimálna osmotická fragilita je určená takou koncentráciou roztoku NaCl, pri ktorej pozorujeme začínajúcu hemolýzu erytrocytov v tomto roztoku (po centrifugácii je supernatant nad sedimentom erytrocytov slaboružovo sfarbený uvoľneným hemoglobínom). Maximálna osmotická fragilita sa udáva takou koncentráciou roztoku NaCl, pri ktorej dochádza k úplnej hemolýze erytrocytov (roztok má červenú farbu a na dne skúmavky po centrifugácii nepozorujeme žiaden sediment erytrocytov podobné je pozorovanie v kontrolnej skúmavke s destilovanou vodou). Sledovanie osmotickej fragility (alebo rezistencie) má diagnostický význam. Slúži na diagnostiku, ako aj diferenciáciu hemolytických ochorení. V klinickej praxi aj vo výskume, je na označenie sledovania hypotonickej hemolýzy viac zaužívaný termín osmotická fragilita než osmotická rezistencia. Aby sme si tieto pojmy nezamieňali, treba si uvedomiť len to, že koncentrácia, ktorá udáva maximálnu osmotickú fragilitu je súčasne údajom o minimálnej osmotickej rezistencii a koncentrácia udávajúca minimálnu osmotickú fragilitu je údajom o maximálnej osmotickej rezistencii. Čím je erytrocyt osmoticky rezistentnejší (stabilnejší voči hemolýze), tým menej je osmoticky fragilný (menej citlivý voči hemolýze). Materiál a reagencie 20% suspenzia premytých erytrocytov vo fyziologickom roztoku roztoky NaCl s koncentráciami: 0,075 mol/l, mol/l a 5 mol/l. Pracovný postup Erytrocyty izolujeme z krvi odstredením (2000 ot./min, 10 min). Po oddelení plazmy odsávaním (pomocou kapiláry a vodnej vývevy) erytrocyty trojnásobne premyjeme izotonickým roztokom NaCl (20 %). Takto pripravenú suspenziu erytrocytov a roztoky NaCl rôznej koncentrácie pipetujeme do sady centrifugačných skúmaviek podľa pracovnej tabuľky. Po odstredení opatrne odpipetujeme do kyvety spektrofotometra 2 ml supernatantu a odmeriame absorbanciu pri vlnovej dĺžke 540 nm oproti vode a hodnoty zapíšeme do tabuľky. Supernatant je kvapalná časť nad sedimentom erytrocytov.

9 skúmavka erytrocyty (ml) H 2 O (ml) NaCl 0,075 mol/l (ml) NaCl mol/l (ml) NaCl 5 mol/l (ml) zmes opatrne premiešať pomocou alobalu inkubovať 15 minút vo vodnom kúpeli pri teplote 37 C centrifugovať 7 minút pri 2000 ot./min odmerať A 540 oproti vode A 540 % hemolýzy 100 Hodnotenie V skúmavkách po odstredení pozorujeme, že objem sedimentu (erytrocyty) je priamo úmerný koncentrácii roztoku NaCl. V skúmavkách s číslom 1, 2 a 3 (hypotonické prostredie) pozorujeme hemolýzu, preto má supernatant červené sfarbenie (roztok hemoglobínu). V skúmavke č. 4 je roztok NaCl izotonický s prostredím v erytrocytoch, preto za normálnych okolností (čerstvé erytrocyty, absencia hemolytického ochorenia) hemolýzu nepozorujeme. Hemolýzu vyhodnotíme kvantitatívne tak, že vypočítame percento hemolýzy pri rôznych koncentráciách NaCl. Ako 100 % hemolýzy berieme hodnotu A 540 v skúmavke s vodou (skúmavka č. 1), pretože vo vode prebehne úplná hemolýza erytrocytov. Hypotonickú hemolýzu znázornite aj graficky (stĺpcovým grafom). Je najčastejšia vrodená hemolytická anémia, genetický defekt má viac ako 200 variácii, preto neexistuje žiadny špecifický genetický test. Erytrocyty majú vrodený defekt membránových proteínov, čo spôsobuje presun vody a sodíka do erytrocytov. Erytrocytu tak strácajú bikonkávny tvar a získavajú guľatý tvar. U zdravého človeka: hemolýza začína v roztoku NaCl s koncentráciou 0,0780,086 mol/l úplná hemolýza nastáva v roztoku NaCl s koncentráciou 0,0520,057 mol/l Zvýšená osmotická fragilita je spojená s vrodenou alebo získanou sférocytózou (ochorenie, pri ktorom erytrocyty majú vrodený defekt membránových proteínov, čo spôsobuje presun vody a sodíka do erytrocytov, pričom erytrocyty strácajú bikonkávny tvar a získavajú guľatý tvar). O zníženej osmotickej fragilite hovoríme vtedy, ak k úplnej hemolýze erytrocytov v roztoku NaCl s koncentráciou 0,0520,057 mol/l nedošlo, čiže sú viac rezistentné voči hypotonickému roztoku. Znížená osmotická fragilita je spojená s chronickým ochorením pečene, anémiou z nedostatku železa, talasémiou, hyponatriémiou (koncentráciou Na + v sére <130 mmol/l) alebo kosáčikovitou anémiou po splenektómii (odstránení sleziny). Záver

10 KYSELINY A ZÁSADY. ph. TLMIVÉ ROZTOKY LABORATÓRNE CVIČENIE Č.1 MERANIE ph ROZTOKOV SILNÝCH A SLABÝCH KYSELÍN A ZÁSAD merania je uvedený v skriptách Hrnčiarová a kol. v časti alebo na našej web stránke. Reagencie a pomôcky roztok HCl c = 0,01 mol.l 1, NaOH c = 0,01 mol.l 1, CH 3 COOH c = 0,01 mol.l 1 univerzálny indikátorový ph papierik, ph meter. Pracovný postup ph roztokov uvedených v tabuľke zisťujeme pomocou univerzálneho indikátorového papierika, potenciometricky a výpočtom. Všetky roztoky majú rovnakú látkovú koncentráciu 0,01 mol/l. K(CH 3 COOH) = 1, mol/l. ph roztok univerzálny papierik potenciometricky výpočet HCl CH 3 COOH NaOH Hodnotenie Do tabuľky zapíšte hodnoty ph zistené rôznymi metódami a porovnajte presnosť prvých dvoch spôsobov merania s vypočítanými hodnotami. Záver

11 KYSELINY A ZÁSADY. ph. TLMIVÉ ROZTOKY LABORATÓRNE CVIČENIE Č.2 STANOVENIE ph TELOVÝCH A PRÍRODNÝCH TEKUTÍN Stanovenie ph čírych telových a prírodných tekutín je technicky veľmi jednoduché. V bežnej praxi stačí stanoviť ph univerzálnym indikátorovým papierikom alebo "Phan" papierikom. Indikátorové papieriky sú prúžky filtračného papiera impregnované roztokom indikátora. Po ponorení do roztoku sa sfarbia podľa ph prostredia. stanovenia ph spočíva v zmene usporiadania väzieb v molekule indikátora v závislosti od ph prostredia. Táto zmena je pozorovateľná ako zmena zafarbenia indikátorového papierika, napr. lakmusový papierik je v kyslom prostredí červený a v zásaditom modrý. Univerzálne indikátorové papieriky sú impregnované zmesou indikátorov, čo umožňuje merať ph v užšom, prípadne aj v celom rozsahu ph hodnôt. Zafarbenie papierika sa hodnotí podľa stupnice pripojenej k ph papierikom. Reagencie a pomôcky citrónová šťava, ocot, voda z vodovodu a destilovaná, mlieko univerzálny indikátorový ph papierik Pracovný postup Indikátorový papierik ponoríme do skúmanej tekutiny, ihneď vyberieme a na priloženej stupnici odčítame hodnotu ph. Hodnotenie tekutina ph namerané ph citrónová šťava 2,2 2,4 ocot 2,6 2,7 voda z vodovodu 5,5 6,0 mlieko čerstvé 6,3 6,6 sliny 6,5 7,0 destilovaná H 2 O 7,0 Namerané hodnoty zapíšte do tabuľky a porovnajte s tabuľkovými hodnotami. Záver

12 KYSELINY A ZÁSADY. ph. TLMIVÉ ROZTOKY LABORATÓRNE CVIČENIE Č.3 URČENIE KONŠTANTY KYSLOSTI SLABEJ JEDNOSÝTNEJ KYSELINY Konštanta kyslosti K a vyjadruje tendenciu kyseliny uvoľniť protón. Jej hodnotu možno vypočítať z HendersonovejHasselbalchovej rovnice (HH) alebo stanoviť experimentálne. Pri experimentálnom stanovení sa využíva potenciometrická titrácia. Pri potenciometrickej titrácii sa postupne pridáva známe množstvo činidla (KOH) k roztoku stanovovanej látky (CH 3 COOH) a sleduje sa zmena elektrického potenciálu (E). Zmena potenciálov počas reakcie je meraná kontinuálne pomocou dvoch elektród, indikačnej a referenčnej. Najčastejšie sa používa sledovanie zmeny ph od množstva spotrebovaného činidla pri titrácii (V = f(ph)). Výsledkom grafického znázornenia nameraných hodnôt je sigmoidálna krivka (obr. 1), z ktorej je možné stanoviť bod ekvivalencie a stredný bod titrácie. V bode ekvivalencie je počet molov činidla ekvivalentný počtu molov stanovovanej látky. Je to bod, v ktorom sa celá kyselina reakciou s hydroxidom premení na jej konjugovanú zásadu. V strednom bode titrácie je počet molov kyseliny a jej konjugovanej zásady rovnaký. Tento bod nastane po pridaní polovičného ekvivalentu hydroxidu k 1 ekvivalentu kyseliny. Keďže pridávaním silnej zásady do roztoku slabej kyseliny vzniká zmes slabej kyseliny a jej konjugovanej zásady, ph vznikajúceho roztoku sa môže vyjadriť HH rovnicou pre výpočet ph tlmivého roztoku. V strednom bode titrácie potom platí: ph = pk a + log (1:1) = pk a + 0 = pk a Ak ph = pk a, slabá kyselina je na 50 % disociovaná a na 50 % nedisociovaná. Reagencie a pomôcky roztoky mol.l 1 kyselina octová a mol.l 1 KOH, byreta, pipeta, titračná banka, phmeter, elektromagnetická miešačka, milimetrový papier. [K CH3 COOH = 1, mol.l 1 ]. Pracovný postup Do titračnej banky napipetujte 20 ml roztoku kyseliny octovej a doplňte vodou na objem cca 75 ml. Za stáleho miešania pomocou elektromagnetickej miešačky postupne pridávajte z byrety do kyseliny roztok KOH podľa tabuľky a zaznamenávajte namerané hodnoty ph.

13 V KOH (ml) ph V KOH (ml) 18 18, , , ph Hodnotenie 1. Zo získaných hodnôt zostrojte graf závislosti hodnoty ph od množstva pridaného KOH. Z grafu určte množstvo (ml) KOH potrebného na úplnú neutralizáciu kyseliny. Pri polovičnej spotrebe roztoku hydroxidu je [CH 3 COO ] = [CH 3 COOH] a hodnota ph v tomto bode sa rovná hodnote pk a pre kyselinu octovú. 2. Vypočítajte hodnotu K a pre kyselinu octovú a porovnajte ju s údajmi v literatúre. ph ph = pk 4 a 2 Stredný bod titrácie Ekvivalentný bod V KOH (ml) Obr. 1. Určenie konštanty kyslosti (pk a ) slabej jednosýtnej kyseliny z titračnej krivky Záver

14 BIOCHEMICKY VÝZNAMNÉ REAKCIE ORGANICKÝCH ZLÚČENÍN LABORATÓRNE CVIČENIE Č.1 STANOVENIE KONCENTRÁCIE MOČOVINY V SÉRE A V MOČI Močovina tvorí s diacetylmonooxímom v silne kyslom prostredí za prítomnosti tiosemikarbazidu a iónov Fe 3+ červeno sfarbený komplex vhodný na spektrofotometrické stanovenie pri 525 nm. Reagencie štandardný roztok močoviny (20 mmol.l 1 ); roztok činidla, ktorý obsahuje diacetylmonooxím (5 mmol.l 1 ), tiosemikarbazid (0,9 mmol.l 1 ), H 2 SO 4 (0,9 mol.l 1 ) a Fe 3+ (25 µmol.l 1 ), vzorky séra a 100x riedeného moču. Pracovný postup štandardný roztok močoviny (ml) sérum (ml) moč (100x riedený) (ml) H 2 O (ml) činidlo (ml) štandardný roztok 0,01 2 vzorka séra 0,01 2 premiešať, 10 min zahrievať vo vriacom vodnom kúpeli, ochladiť a odmerať A 525 oproti blanku A 525 vzorka moča 0,01 2 blank 0,01 2 koncentrácia močoviny (mmol.l 1 ) 20 množstvo močoviny (mmol/24 hod.) Hodnotenie Vypočítajte koncentráciu močoviny v sére a v moči (pri výpočte koncentrácie v moči výsledok vynásobte zriedením moča). Vypočítajte množstvo vylúčenej močoviny za 24 hodín (pri zadaní diurézy objemu moča vylúčeného za 24 hodín) a hodnoty porovnajte s fyziologickými hodnotami. Fyziologické hodnoty: c (sérum) = 2,5 8,3 mmol.l 1 c (moč) = mmol.l 1 n = mmol/24 hod) Výpočty a záver

15 BIOCHEMICKY VÝZNAMNÉ REAKCIE ORGANICKÝCH ZLÚČENÍN LABORATÓRNE CVIČENIE Č.2 DÔKAZ PRÍTOMNOSTI KETOLÁTOK V MOČI (LEGALOVA SKÚŠKA) Acetón a kyselina acetoctová poskytujú citlivú reakciu s nitroprusidom sodným v alkalickom prostredí za vzniku červeno sfarbeného produktu. Kyselina βhydroxymaslová pozitívnu nitroprusidovú reakciou neposkytuje a obyčajne sa v moči nedokazuje. Pozitívnu nitroprusidovú reakciu poskytuje aj kreatinín prítomný v moči. Prítomnosť kreatinínu od ketolátok odlíšime prídavkom kyseliny octovej do reakčnej zmesi. Vznik fialového sfarbenia po okyslení kyselinou octovou je dôkazom ketonúrie, odfarbenie červeného roztoku poukazuje na reakciu kreatinínu. Reagencie nitroprusid sodný Na 2 [Fe(CN) 5 NO].2H 2 O (c = 0,2 mol.l 1 ), NaOH (w = 10 %), CH 3 COOH (w = 98 % ), čerstvý moč 1 a 2. Pracovný postup K 2 ml vzorky moču v skúmavke pridáme niekoľko kvapiek čerstvého roztoku nitroprusidu sodného. Roztok zalkalizujeme niekoľkými kvapkami NaOH. Do skúmavky s pozitívnou reakciou (vznik červeného reakčného produktu) pridáme 1 ml koncentrovanej kyseliny octovej. Hodnotenie Vyhodnoťte prítomnosť ketolátok vo vzorkách moča na základe nitroprusidovej reakcie. Záver

16 SACHARIDY LABORATÓRNE CVIČENIE Č.1 DÔKAZ PRÍTOMNOSTI GLUKÓZY V MOČI Dôkaz prítomnosti glukózy v moči je založený na jej redukčných vlastnostiach. Najprv uskutočníme v moči orientačnú Fehlingovu skúšku (a), pretože táto reakcia nie je špecifická len pre glukózu. Skúška je pozitívna aj s inými redukujúcimi sacharidmi a inými látkami s redukčnými vlastnosťami. Reakcia je pozitívna, ak sa redukujú komplexne viazané ióny Cu 2+ na Cu 1+ a vznikne žltočervená až červená zrazenina oxidu meďného (Cu 2 O). V prípade pozitívnej Fehlingovej skúšky urobíme v uvedenom moči špecifický dôkaz prítomnosti glukózy diagnostickým prúžkom GlukoPHAN (b). Diagnostické prúžky sú určené k rýchlemu a špecifickému dôkazu, ako aj semikvantitatívnemu stanoveniu glukózy v moči. Ich indikačná zóna obsahuje enzýmy glukózaoxidázu a peroxidázu so špeciálnym chromogénnym systémom, ktorý sa v prítomnosti glukózy oxiduje na produkt zelenej farby. Táto enzýmová reakcia je špecifická len pre glukózu. Reagencie roztoky Fehling I (CuSO 4.5H 2 O) a Fehlihg II (vínan sodnodraselný), roztok glukózy (w = 1 %), čerstvý moč 1 a 2, diagnostické prúžky GlukoPHAN. Pracovný postup a) Fehlingova skúška K objemu 2 ml vyšetrovaného moču sa pridá rovnaký objem Fehlingovho činidla, ktorý sa pripravuje zmiešaním roztokov Fehling I a Fehling II v pomere 1:1 v osobitnej skúmavke. Reakčná zmes sa zahrieva cca 3 minúty vo vriacom vodnom kúpeli. Reakcia je pozitívna, ak vznikne žltočervená až červená zrazenina oxidu meďného (Cu 2 O), ktorá sa usadí na dne skúmavky. Citlivosť tejto reakcie je približne 10 mmol/l. Redukčné skúšky je potrebné robiť v čerstvom, nezakalenom moči. Ak moč obsahuje bielkoviny, musí sa pred skúškou deproteinovať. b) Dôkaz a semikvantitatívne stanovanie glukózy diagnostickými prúžkami "GlukoPHAN". Do čistej skúmavky nalejeme čerstvý moč. Dôkaz vykonáme len v tom moči, v ktorom bola dokázaná prítomnosť redukujúcej látky Fehlingovou skúškou. Diagnostický prúžok GlukoPHAN sa na chvíľu (12 sek) namočí do vyšetrovaného moču. Po jeho vytiahnutí sa test hodnotí po troch minútach porovnaním intenzity vzniknutého sfarbenia s farebnou stupnicou na štítku. Test zachytí vznikom zeleného sfarbenia prítomnosť zvýšeného množstva glukózy približne od koncentrácie 2 mmol/l.

17 Hodnotenie V prípade pozitívnej redukčnej skúšky sa presvedčte, či redukujúcou látkou je glukóza, a to špecifickou skúškou pomocou prúžkov GlukoPHAN. Výsledky zapíšte do pripravenej tabuľky a porovnajte s fyziologickými hodnotami (0 1,4 mmol.l 1 ). Fehlingova skúška GlukoPHAN glukóza (mmol.l 1 l) moč 1 moč 2 Záver

18 SACHARIDY LABORATÓRNE CVIČENIE Č.2 OXIDÁCIA GLUKÓZY VZDUŠNÝM KYSLÍKOM Oxidácia glukózy vzdušným kyslíkom na kyselinu glukónovú prebieha za bežných podmienok veľmi pomaly. Na zvýšenie rýchlosti danej reakcie použijeme metylénovú modrú, pretože pôsobí ako sprostredkovateľ prenosu vodíka a zároveň slúži ako indikátor reakcie. Metylénová modrá v oxidovanom stave má modré sfarbenie a redukciou sa mení na bezfarebnú leukoformu (MMH 2 ). Daný systém predstavuje model oxidačnoredukčného systému, v ktorom je metylénová modrá akceptorom vodíkov (hydrogenuje sa) a glukóza donorom vodíkov (dehydrogenuje sa). Spätnú oxidáciu metylénovej modrej zabezpečuje vzdušný O 2, preto je v konečnom dôsledku kyslík zodpovedný za následnú opätovnú oxidáciu glukózy v tomto systéme. H HO H H H C C C C C O OH H OH OH CH 2 OH modré sfarbenie MM H 2 O 2 Reagencie H HO H H COOH C C C C OH H OH OH CH 2 OH MMH 2 bezfarebná forma roztok metylénovej modrej, NaOH (2,5 mol.l 1 ) a glukóza (c = 0,5 %). Pracovný postup K 1 ml roztoku glukózy v skúmavke pridajte niekoľko kvapiek metylénovej modrej a 23 kvapky roztoku NaOH. Reakčnú zmes zahrievajte vo vriacom vodnom kúpeli. Pozorujte odfarbenie metylénovej modrej. Po ochladení a trepaním skúmavky na vzduchu (prebieha oxidácia metylénovej modrej) sa obnoví modré sfarbenie metylénovej modrej, ktoré sa po zohriatí opäť stratí. Záver O 2

19 SACHARIDY LABORATÓRNE CVIČENIE Č.3 ENZÝMOVÉ STANOVENIE KONCENTRÁCIE GLUKÓZY V SÉRE Glukóza sa katalyticky oxiduje vzdušným kyslíkom účinkom glukózaoxidázy na peroxid vodíka a kyselinu glukónovú. Vytvorený peroxid vodíka sa stanovuje reakciou, ktorú katalyzuje peroxidáza. V tejto reakcii peroxid vodíka oxiduje vhodný donor vodíka 3 metylfenol, ktorý kopuluje so 4aminofenazónom na farebný produkt. Množstvo vzniknutého farebného produktu je úmerné koncentrácii glukózy (stanoví sa spektrofotometricky). Metóda je určená na stanovenie koncentrácie glukózy v biologickom materiáli v krvi, v sére a v moči. H H HO H H C C C C C OH OH H OH CH 2 OH αdglukopyranóza COOH H C OH glukózaoxidáza O + O 2 + H 2 O HO C H + H 2 O 2 H H C C OH OH CH 2 OH kys. Dglukónová OH +H 2 O 2 CH 3 O N CH 3 N 3metylfenol O peroxidáza H 2 N CH 3 4aminofenazón CH 3 oxidácia substrátu + 2 H 2 O

20 Reagencie Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta súprava BIOLATEST na stanovenie koncentrácie glukózy obsahuje: fosforečnanový tlmivý roztok (40 mol.l 1 ), glukózaoxidázu (160 µkat.l 1 ), peroxidázu (16 µkat.l 1 ), 3 metylfenol (0,010 mol.l 1 ), 4aminofenazón (0,001 mol.l 1 ), štandardný roztok glukózy (0,010 mol.l 1 ). Pracovný postup Pri stanovení koncentrácie glukózy v krvi alebo hemolytickom sére je potrebné biologický materiál najprv deproteinovať. Analyzované vzorky séra sú pre účely praktického cvičenia už deproteinované a koncentrácia glukózy sa stanoví podľa postupu uvedenom v pracovnej tabuľke: vzorka séra štandardný roztok blank sérum (ml) štandardný roztok glukózy (ml) H 2 O (ml) činidlo (ml) 0,02 2 0,02 2 0,02 2 A 498 premiešať a inkubovať minút pri izbovej teplote alebo 15 minút vo vodnom kúpeli pri 37 C do 40 minút od skončenia inkubácie odmerať A 498 proti blanku koncentrácia glukózy (mmol.l 1 ) 10 Výpočet koncentrácie glukózy: š E7C F33GH.H 7 I Hodnotenie Koncentrácia glukózy v krvi sa prostredníctvom hormónov udržiava v konštantnom intervale. Pri rôznych patologických stavoch sa mení, preto zistenie hodnoty koncentrácie glukózy v sére, tzv. glykémie, má dôležitý diagnostický význam (napr. pri diabete). Fyziologické hodnoty: sérum 4,2 6,1 mmol.l 1 celá krv 3,3 5,6 mmol.l 1 Záver

21 LIPIDY LABORATÓRNE CVIČENIE Č.1 STANOVENIE KONCENTRÁCIE LIPIDOV V SÉRE Lipidy krvného séra (vrátane neesterifikovaných mastných kyselín) po kyslej hydrolýze koncentrovanou kyselinou sírovou reagujú s vanilínom a kyselinou trihydrogénfosforečnou za vzniku červeného zafarbenia, ktorého intenzita je úmerná množstvu celkových lipidov v sére Reagencie a pomôcky Súprava BIOLATEST "CELKOVÉ LIPIDY": Činidlo (vanilín, c = 10 mmol.l 1, H 3 PO 4, c= 11,5 mol.l 1 ). Štandardný roztok celkových lipidov (8 g.l 1 ). Kyselina sírová (konc.). Sérum, vodný kúpeľ, spektrofotometer, kahan, skúmavky. Pozor!! Činidlo a kyselina sírová sú silné žieraviny. Pracovný postup vzorka séra štandardný roztok blank sérum (ml) štandardný roztok lipidov (ml) koncentrovaná H 2 SO 4 (ml) 0,02 1,50 0,02 1,50 premiešať a zohrievať v tenkostenných skúmavkách 10 minút vo vriacom vodnom kúpeli obsah skúmaviek (hydrolyzát) ochladiť pod prúdom studenej vody a zo získaného hydrolyzátu odpipetovať do suchých skúmaviek: hydrolyzát (ml) H 2 SO 4 (ml) činidlo (ml) 0 1,50 0 1,50 0 1,50 A 530 premiešať, nechať stáť 1020 min a merať A 530 vzorky a štandardu proti blanku celkové lipidy (g.l 1 ) 8

22 Hodnotenie Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta Z absorbancie vzorky a štandardu vypočítame obsah celkových lipidov v sére podľa vzťahu: / JK L JK L šm./ šm N.D 7. Fyziologické hodnoty: sérum: 4 8 g.l 1 (nalačno) Výpočet a záver

23 LIPIDY LABORATÓRNE CVIČENIE Č.2 STANOVENIE KONCENTRÁCIE MALONDIALDEHYDU V SÉRE Lipoperoxidy prítomné v sére hydrolyzujú v zriedenej kyseline trihydrogenfosforečnej. Malondialdehyd (MDA), jeden z konečných produktov peroxidácie lipidov, reaguje s kyselinou tiobarbiturovou (TBA) za tvorby produktu červenoružovej farby, ktorý je vhodný na spektrofotometrické stanovenie. Ako štandard sa používa 1,1,3,3 tetraetoxypropán (TEP), ktorý po hydrolýze uvoľňuje stechiometrické množstvo MDA. Reakcia nie je špecifická. Reagencie a pomôcky H 3 PO 4, c = 0,44 mol.l 1, kyselina tiobarbiturová (TBA), c = 42 mmol.l 1 štandardný roztok tetraetoxypropánu (TEP), c = 100 µmol.l 1, sérum pacienta, kontrolné sérum od zdravého darcu vodný kúpeľ, spektrofotometer Pracovný postup vzorka séra kontrolné sérum štandardný roztok blank sérum (ml) štandardný roztok (ml) dest. H 2 O (ml) H 3 PO 4 (ml) TBA (ml) 0 0,40 0,75 0,25 0 0,40 0,75 0,25 0 0,40 0,75 0,25 0,50 0,75 0,25 skúmavky zakryť alobalom a zahrievať 20 minút vo vodnom kúpeli pri 90 C ochladiť a merať A 532 vzorky a štandardu proti blanku A 532 MDA (µmol.l 1 ) 100

24 Hodnotenie Univerzita Komenského Bratislava, Lekárska fakulta Koncentráciu malondialdehydu v krvnom sére kontroly a pacienta vypočítame podľa vzťahu: / JK L JK L šm./ šm μ5pd.d 7. Porovnáme koncenrácie malondialdehydu vo vzorke krvného séra od zdravého darcu a chorého darcu. Výpočet a záver

25 AMINOKYSELINY LABORATÓRNE CVIČENIE Č.1 SEPARÁCIA AMINOKYSELÍN TENKOVRSTVOVOU CHROMATOGRAFIOU (TLC) TLC je chromatografická metóda. Jej princípom je rozdelenie jednotlivých zložiek vzorky na základe rozdielneho charakteru adsorbčných síl zložiek vzorky medzi pohyblivú mobilnú fázu (rozpúšťadlo) a pevnú stacionárnu fázu (tenkú vrstvu) chromatografického systému. Stacionárna fáza je tvorená tenkou vrstvou jemnozrnného adsorbentu, ktorý je buď voľne sypaný alebo vhodne fixovaný na podložke (hliníková fólia, sklenená platnička). Mobilná fáza, tzv. vyvíjacia sústava, je zmes organických rozpúšťadiel. V dôsledku rôznej afinity jednotlivých zložiek vzorky k adsorbentu dochádza k deleniu vzorky na jednotlivé zložky. Detekcia rozdelených zložiek sa uskutočňuje postrekom vhodným detekčným činidlom a zložky sa charakterizujú podľa ich retenčných faktorov. Reagencie a pomôcky roztoky aminokyselín: leucín, lyzín, glycín, glutamát, ich zmes a vzorky neznámych aminokyselín (w = 1%) silufolová platňa, chromatografická komora rozprašovač s roztokom ninhydrínu v acetóne (w = 0,4) vyvíjacia sústava: nbutanol kyselina octová voda (4:1:5) Postup Vzorky známych aminokyselín (leucín, lyzín, glycín, glutamát), ich zmes a vzorky neznámych aminokyselín sa nanesú vo forme malej škvrny (cca 1020 µl) na tenkú vrstvu silufolovej platne. Platňa sa vysuší a vloží do komory nasýtenej parami vyvíjacej sústavy. Komora sa uzatvorí a zmes zložiek na platni sa nechá deliť, kým čelo rozpúšťadla dosiahne vzdialenosť 12 cm od vrchného okraja platne. Platňu vyberieme, obyčajnou ceruzkou označíme čelo rozpúšťadla a vysušíme v sušiarni pri 100 C. Vzorky detegujeme postrekom roztokom ninhydrínu, ktorý reaguje s aminokyselinami za vzniku farebných škvŕn podľa reakcie: Obrysy vzniknutých škvŕn obkreslíme a označíme stred škvrny.

26 Hodnotenie Z polohy škvŕn aminokyselín vypočítame hodnoty retenčného faktora R f podľa vzorca Q R S T kde b je vzdialenosť stredu škvrny od štartu, a je vzdialenosť čela rozpúšťadla od štartovacej čiary. Hodnoty retenčných faktorov zapíšeme do tabuľky. Zhodnosť R f známych aminokyselín (štandardov) s R f pre neznámu vzorku určuje príslušnú aminokyselinu v neznámej vzorke. Identifikované aminokyseliny v neznámej vzorke zapíšeme do tabuľky Tabuľka: R f hodnoty vybraných aminokyselín Aminokyselina Hodnota R f (tabuľková) Leucín 0,61 Lyzín 0,09 Glycín 7 Glutamát 0,22 Hodnoty R f vzorka č.1 vzorka č.2 vzorka č.3 vzorka č.4 Výpočet a záver

27 AMINOKYSELINY LABORATÓRNE CVIČENIE Č.2 SEPARÁCIA HEMOGLOBÍNU OD HEXAKYANOŽELEZITANU DRASELNÉHO GÉLOVOU CHROMATOGRAFIOU Gélová chromatografia je metóda založená na delení látok podľa veľkosti molekúl pri prechode cez napučaný gél, ktorý predstavuje sito s určitou veľkosťou pórov. V sklenej kolóne na stĺpci Sephadexu G 100 sa delia látky s molekulovou hmotnosťou do cca Molekuly delenej zmesi väčšie ako vnútorné póry gélových častíc nemôžu difundovať do vnútra týchto častíc a preto zostávajú v intersticiálnej kvapaline, sú ňou unášané a vytekajú z kolóny ako prvé. V póroch sú zadržiavané molekuly s menšou veľkosťou, čím sa ich pohyb cez kolónu spomaľuje a preto vytekajú z kolóny neskôr. Ako prvý bude eluovať hemoglobín a za ním hexakyanoželezitan draselný. Účinnosť separácie oboch zložiek posudzujeme na základe elučného diagramu, ktorý získame meraním absorbancie eluátu pri 420 nm. Hodnota absorbancie je súčasne aj mierou koncentrácie delených látok v zachytávanom eluáte. Reagencie a pomôcky nabobtnaný Sephadex G 100 roztok hemoglobínu (w = 2 %), roztok K 3 [Fe(CN) 6 ] (w = 2 %) chromatografická kolóna, kalibračné skúmavky, spektrofotometer Postup Kolónu naplnenú napučaným Sephadexom G 100 premyjeme destilovanou vodou. Pred zahájením delenia zmesi necháme odtiecť destilovanú vodu nad Sephadexom až na úroveň povrchu gélu. Potom špičkou pipety opatrne nanesieme na povrch stĺpca gélu 0,2 ml zmesi roztoku hemoglobínu a hexokyanoželezitanu draselného (1:1). Zmes necháme krátko vsiaknuť do kolóny a opatrne pridáme vodu, aby povrch gélu nepraskol a nezvíril sa. Napojíme zásobník vody tak, aby voda neustále pretekala kolónou. Pozorujeme delenie zmesi na dve zložky. Pozor! Povrch kolóny musí byť STÁLE prekrytý vodou!! Ako prvý začne z kolóny vytekať hemoglobín (hnedočervený pruh), ako druhý hexokyanoželezitan draselný (žltý pruh). Eluáty jednotlivých zložiek zachytávame vo frakciách po 1,5 ml do kalibovaných skúmaviek (1015 frakcií), až kým jednotlivé zložky nevytečú z kolóny. Po vytečení oboch komponentov premyjeme kolónu destilovanou vodou. V jednotlivých frakciách eluátu zmeriame absorbanciu pri 420 nm proti destilovanej vode. Hodnoty absorbancie a príslušných elučných objemov zapíšeme do tabuľky.

28 Hodnotenie Z nameraných hodnôt zostrojíme graf závislosti absorbancie od elučného objemu. Graf obsahuje dva maximá prvé maximum zodpovedá maximálnej koncentrácii hemoglobínu v daných frakciách, a druhé maximálnej koncentrácii hexokyanoželezitanu draselného v zodpovedajúcich frakciách. Určíme, v ktorých frakciách je čistý hemoglobín a čistý K 3 [Fe(CN) 6 ]. Podľa tvaru krivky vyhodnotíme účinnosť delenia. Záver

29 ENZÝMY I LABORATÓRNE CVIČENIE Č.1 STANOVENIE MICHAELISOVEJ KONŠTANTY LAKTÁTDEHYDROGENÁZY Laktátdehydrogenáza (LDH) katalyzuje reakciu Pri rôznych koncentráciách substrátu (laktátu) uvedená reakcia prebieha rôznou rýchlosťou, ktorá je úmerná množstvu vytvoreného produktu (pyruvátu). Pyruvát reaguje v alkalickom prostredí s činidlom 2,4dinitrofenylhydrazínom (DNFH) za vzniku hnedooranžového 2,4 dinitrofenylhydrazónu pyruvátu, ktorý je vhodný na spektrofotometrické stanovenie. Reagencie a pomôcky komerčná súprava na stanovenie LDH roztok laktátu (c = 3 mmol.l 1 ) v tlmivom roztoku TRISHCl tlmivý roztok TRISHCl (c =0,05 mol.l 1, ph 8,5), na riedenie laktátu, na porovnávací roztok roztok 2,4dinitrofenylhydrazínu (DNFH) (w = 0,02%): 200 mg DNFH sa rozpustí v 100 ml HCl (c = 1 mol.l 1 ), zohreje sa do rozpustenia a po ochladení sa doplní destilovanou vodou do 1000 ml roztok NaOH (c = mol.l 1 ) spektrofotometer, vodný kúpeľ Pracovný postup Podľa riediacej tabuľky pripravíme rôzne pracovné koncentrácie substrátu (laktátu) skúmavka štandard laktátu (ml) 2,0 1,5 1,0 0,5 tlmivý roztok (ml) 0,5 1,0 1,5 Koncentrácia laktátu (mmol.l 1 ) 3,0 2,2 1,5 0,75

30 Z takto pripravených pracovných roztokov substrátu (laktátu) ďalej pipetujeme podľa nasledujúcej schémy skúmavka blank laktát (ml) 0,4 0,4 0,4 0,4 (rôzne koncentrácie pracovných roztokov) (3 mm) (2,2 mm) (1,5 mm) (0,75 mm) tlmivý roztok, ph=8,5 (ml) 0,4 LDH (pridávať v 30 sek intervaloch) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Výsledná koncentrácia [S] v reakčnej zmesi (mmol.l 1 ) 2,0 1,5 1,0 0,5 0 inkubovať 5 min pri teplote 37 C DNFH 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 premiešať a nechať stáť 10 min pri izbovej teplote NaOH premiešať a nechať stáť 5 min pri izbovej teplote zmerať A 505 proti blanku A 505 Hodnotenie Hodnoty absorbancie sú úmerné množstvu vytvoreného produktu (pyruvátu) v enzýmovej reakcii, preto sa rýchlosť reakcie môže vynášať do grafu priamo v hodnotách absorbancie. Výsledky zaznamenáme do tabuľky. Z hodnôt v tabuľke zostrojíme na milimetrový papier grafickú závislosť podľa MichaelisMentenovej a LineweaverBürkovej rovnice. Z oboch grafov odčítame K m pre LDH a porovnáme. skúmavka výsledná koncentrácia [S] v reakčnej zmesi (mmol.l 1 ) rýchlosť reakcie v (A 505 ) 2,0 1,5 1,0 0,5 1/[S] 0,5 0,67 1,0 2,0 1/V (= 1/A 505 ) Výpočet 1/K m = hodnota z grafu K m =? (mmol.l 1 ) Záver

31 ENZÝMY II LABORATÓRNE CVIČENIE Č.1 SLEDOVANIE VPLYVU AKTIVÁTOROV A INHIBÍTOROV NA AKTIVITU ENZÝMU. STANOVENIE AKTIVITY ARGINÁZY V HOMOGENÁTE PEČENE. Argináza I katalyzuje posledný krok cyklu močoviny (urey), v ktorom je arginín hydrolyticky štiepený za vzniku ornitínu a močoviny: Mierou aktivity arginázy je množstvo vytvorenej močoviny. Koncentráciu močoviny stanovíme reakciou s diacetylmonoxímom v silne kyslom prostredí za prítomnosti tiosemikarbazidu a železitých iónov, pri ktorej vzniká červený komplex vhodný na spektrofotometrické stanovenie. Cyklus tvorby močoviny predstavuje sled biochemických reakcií, pri ktorých dochádza k odstraňovaniu toxického amoniaku uvoľneného pri degradácii bielkovín. Argináza I je homotrimerický proteín lokalizovaný v cytoplazme hepatocytov, kde každá podjednotka obsahuje aktívne miesto a dva ióny Mn 2+. Aktivátormi enzýmu sú Mn 2+, Mg 2+, Ca 2+, Ni 2+ a Co 2+. V ich neprítomnosti sa aktivita enzýmu znižuje. Medzi kompetitívne inhibítory patrí Lornitín a Llyzín, ktoré súťažia s arginínom o väzbu v aktívnom mieste enzýmu. Vysoká koncentrácia substrátu potláča inhibičný účinok kompetitívneho inhibítora. Nekompetitívnymi inhibítormi arginázy sú monoaminokyseliny. Reagencie a pomôcky súprava BIOLATEST na stanovenie močoviny tlmivý roztok TRISHCl (c = 0,05 mol.l 1, ph 9,7) aktivátor MnCl 2 v tlmivom roztoku ph 9,7 (c = mol.l 1 ) inhibítor Llyzín vo vode (w = 1%) homogenát hovädzej pečene ako zdroj arginázy (w = 5 %) Larginín v TRISHCl tlmivom roztoku (c = 0,05 mol.l 1, ph 9,7) štandardný roztok močoviny (c = 8,3 mmol.l 1 ) zriedený roztok H 2 SO 4 : do 100 ml odmernej banky sa dá 60 ml destilovanej vody a 10 ml koncentrovanej kyseliny sírovej, po ochladení sa doplní destilovanou vodou po značku

32 zásobný roztok činidla sa pripraví rozpustením 1 tablety zo súpravy v 50 ml destilovanej vody (pri izbovej teplote je roztok stabilný niekoľko týždňov), pracovný roztok činidla: 1 ml zásobného roztoku činidla a 1 ml zriedenej kyseliny sírovej (pripravuje sa čerstvý roztok) roztok kyseliny trichlóroctovej (TCA) (w = 5 %) vodný kúpeľ, varič, centrifúga, spektrofotometer Pracovný postup skúmavka blank tlmivý roztok ph 9,7 (ml) homogenát pečene (zdroj arginázy) (ml) aktivátor (roztok MnCl 2 ) (ml) inhibítor (Llyzín) (ml) substrát (Larginín) (ml) štandardný roztok močoviny (8,3 mmol.l 1 ) (ml) 1,0 0,2 0,4 0,2 1,4 0,2 0,2 0,4 0,2 0,2 0,8 0,2 1,6 0,2 1,6 0,2 inkubovať 5 minút pri 37 C TCA (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 supernatant (ml) pracovný roztok činidla (ml) centrifugovať 5 minút pri 3000 ot/min 2,0 2,0 2,0 2,0 zmes zohriať 10 min vo vriacom vodnom kúpeli, ochladiť v studenej vode a do 15 min zmerať A 525 proti blanku 2,0 A 525 Hodnotenie Namerané absorbancie a vypočítané výsledky zaznačíme do tabuľky 1 2 Skúmavka E + MnCl 2 E MnCl 2 3 E + I A 525 c (mmol.l 1 ) močoviny v homogenáte/5 min aktivita arginázy (µkat/l) špecifická aktivita arginázy (µkat/g tkaniva) Aktivita (%) 100 Inhibícia (%) 0

33 Aktivita enzýmu je definovaná ako aktivita, ktorá premení 1 mol substrátu za sekundu. Pretože argináza premení 1 mol arginínu na 1 mol močoviny (viď rovnicu reakcie), jej aktivitu môžeme vypočítať z množstva vzniknutého produktu močoviny. Koncentráciu močoviny vypočítame z nameraných absorbancií a známej koncentrácie štandardného roztoku podľa vzorca / JK L JK L šm E/ šm F55PD.D 7 UP5PNV0áMWI Získaná koncentrácia zodpovedá koncentrácii premeneného substrátu arginínu (mmol.l 1 homogenátu). Množstvo premeneného arginínu (mmol.l 1 ) za 5 minút sa prepočíta na množstvo arginínu premeneného za 1 sekundu. Prepočtom sa získa aktivita enzýmu (mkat/l). Z aktivity arginázy v 5 % homogenáte pečene vypočítame aktivitu 1 g tkaniva (mkat/g tkaniva). Vplyv aktivátora a inhibítora na aktivitu arginázy sa posúdi na základe výpočtu aktivity a inhibície enzýmu. Za 100 % aktivitu enzýmu sa považuje hodnota aktivity enzýmu s aktivátorom a bez inhibítora (skúmavka č.1). Aktivitu (A%) môžeme vypočítať priamo z absorbancií, pretože tieto sú úmerné množstvu premeneného substrátu. Inhibíciu (%) vypočítame podľa vzťahu I (%) = 100 A (%) Výpočet a záver