Mελέτη της έκφρασης και ρύθμισης του θερμοεπαγόμενου γονιδίου hsp27 στη μεσογειακή μύγα, Ceratitis capitata

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Mελέτη της έκφρασης και ρύθμισης του θερμοεπαγόμενου γονιδίου hsp27 στη μεσογειακή μύγα, Ceratitis capitata Διατριβή Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης Κοτσιλίτη Ελένη Βιολόγος Πάτρα, 2012

2 ~ 2 ~

3 ~ 3 ~ Αντί προλόγου Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας του Τομέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης του τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών κατά το χρονικό διάστημα Η ανάθεση και η επίβλεψη της εργασίας έγινε από τον καθηγητή κ. Αναστάσιο Μίντζα, τον οποίο ευχαριστώ θερμά για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε, τη συνεχή ενθάρρυνση, το ενδιαφέρον, για την άψογη συνεργασία μας και για τη συμπαράστασή του καθ όλη τη διάρκεια πραγματοποίησης αυτής της εργασίας. Θέλω επίσης να ευχαριστήσω τα μέλη της εξεταστικής μου επιτροπής, τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Φλυτζάνη και την λέκτορα κα. Μαργιωλάκη Ειρήνη για την ευγένεια τους και τη διάθεση τους να με βοηθήσουν όποτε τους χρειάστηκα. Ευχαριστώ παλαιότερα και νέα μέλη του εργαστηρίου για το ευχάριστο και φιλικό κλίμα και ιδιαίτερα ευχαριστώ την υποψήφια διδάκτωρ Ιωάννα Γεώργα για την πολύτιμη βοήθεια της τόσο σε επιστημονικό όσο και σε προσωπικό επίπεδο. Τέλος, ευχαριστώ την οικογένεια μου εκφράζοντας απέραντη ευγνωμοσύνη για την υποστήριξη και την αγάπη τους. Ευχαριστώ την αδερφή μου, Εύη, για την υπομονή της, την στήριξη της και το γέλιο της.

4 ~ 4 ~ Περιεχόμενα Περίληψη... 8 Εισαγωγή Α. Θερμοεπαγόμενες Πρωτεΐνες Ιστορικά Στοιχεία Απόκριση στο Θερμικό Στρες και Πρωτεόσταση Γενικότερος ρόλος των Hsps: Μοριακοί Συνοδοί (molecular chaperons) Παράγοντες που επάγουν τη σύνθεση των θερμοεπαγόμενων πρωτεϊνών Οικογένειες των θερμοεπαγόμενων πρωτεϊνών Η οικογένεια Hsp Η οικογένεια Hsp Η οικογένεια Hsp Η οικογένεια Hsp Η οικογένεια των μικρών θερμοεπαγόμενων πρωτεϊνών (shps) Η υπεροικογένεια των α-shsps Τα υποστρώματα των shsps Το αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρο των shsps Ο ολιγομερισμός των shsps Τα μικρά θερμοεπαγόμενα γονίδια στο έντομο Drosophila melanogaster Έκφραση των shsps κατά την ανάπτυξη της Drosophila Ενδοκυτταρικός εντοπισμός της Hsp Το γονίδιο hsp27 της μεσογειακής μύγας Ceratitis capitata (Cchsp27) Το γονίδιο hsp23 της μεσογειακής μύγας Ceratitis capitata (Cchsp23) Ρύθμιση της μεταγραφής των θερμοεπαγόμενων γονιδίων Ο μεταγραφικός παράγοντας του θερμικού στρες (Heat Shock Factor, HSF) Στοιχεία απόκρισης στο θερμικό στρες (Heat Shock Elements, HSEs) Ρύθμιση του γονίδιου hsp27 (HSPB1) στον άνθρωπο Β. Έντομα Έκδυση και Μεταμόρφωση Ορμονικός έλεγχος της μεταμόρφωσης των εντόμων Ορμόνες Εκδυστεροειδή και Εκδυσόνη Ο υποδοχέας της εκδυσόνης (EcR) Στοιχεία απόκρισης στην εκδυσόνη (EcREs)... 38

5 ~ 5 ~ Ορμονικός έλεγχος στα φαινόμενα της έκδυσης και μεταμόρφωσης Επίπεδα EcR και εκδυσόνης στη D. melanogaster και C. capitata Εκδυσόνη και το γονίδιο hsp Το έντομο Ceratitis capitata Γενικά στοιχεία Ταξινόμηση Συνώνυμα Κύκλος ζωής Γενετική της Ceratitis capitata Οικονομική σημασία και Βιολογικός έλεγχος Οι επιπτώσεις της επίδρασης χαμηλής θερμοκρασίας (cold shock) στα έντομα Antifreeze proteins, AFPs Cold shock στη Drosophila melanogaster Γ. Δημιουργία διαγονιδιακών εντόμων Το μεταθετό στοιχείο piggybac Διαγονιδιακά έντομα Υλικά και Μέθοδοι Καλλιέργεια του εντόμου Ceratitis capitata Συγχρονισμός καλλιέργειας Ανατομία προνυμφών, νυμφών και ενήλικων ατόμων C. capitata Επωάσεις ιστών in vitro παρουσία εκδυσόνης Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Ολιγονουκλεοτίδια αλληλουχίες έναρξης (primers) Καθαρισμός του PCR προϊόντος Φωτομέτρηση DNA Ηλεκτροφόρηση DNA σε πήκτωμα αγαρόζης Απομόνωση DNA από πήκτωμα αγαρόζης Αποφωσφορυλίωση γραμμικού πλασμιδιακού DNA Αντίδραση σύνδεσης μορίων DNA Προετοιμασία δεκτικών κυττάρων (competent cells) για χημικό μετασχηματισμό Δημιουργία δεκτικών κυττάρων με χρήση χλωριούχου ρουβιδίου (RbCl 2 ) Μετασχηματισμός βακτηριακών κυττάρων με πλασμιδιακό DNA Μετασχηματισμός σε NEB10B δεκτικά κύτταρα (C3019H), ~10 9 αποικίες / μg πλασμιδίου Μετασχηματισμός σε RbCl 2 δεκτικά κύτταρα, ~10 8 αποικίες / μg πλασμιδίου... 68

6 ~ 6 ~ 11. Απομόνωση πλασμιδιακού (ανασυνδυασμένου) DNA Απομόνωση ολικού RNA με τη χρήση του διαλύματος Tripure Isolation Reagent (Roche) Εκτίμηση συγκέντρωσης ολικού RNA Ηλεκτροφόρηση RNA Επεξεργασία δειγμάτων ολικού RNA με DNase Ι Τεχνική 3 RACE (Rapid amplification of cdna ends) RT-PCR με το πλήρες σύστημα αντιδραστηρίων OneStep RT-PCR (Qiagen) Real-Time qpcr Σύνθεση ολικού cdna με το πλήρες σύστημα αντιδραστηρίων PrimeScript TM RT Reagent Kit (Perfect Real Time) της εταιρείας TAKARA Two-step Real-Time PCR με το πλήρες σύστημα αντιδραστηρίων KAPA SYBR FAST qpcr Kit της εταιρείας KAPA BIOSYSTEMS Απομόνωση ολικής πρωτεΐνης Ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών SDS-PAGE Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών Ανοσοτύπωμα (Western blot Analysis) Γενετικός μετασχηματισμός της μεσογειακής μύγας Ceratitis capitata και κατασκευή της ομόζυγης διαγονιδιακής σειράς hsp27-gfp Διεξαγωγή ενέσεων στα έμβρυα της C. capitata και ομοζύγωση των διαγονιδιακών σειρών Σκοπός Μεταπτυχιακής Διατριβής Αποτελέσματα Έκφραση του γονιδίου Cchsp27 κατά την ανάπτυξη Έκφραση του γονιδίου Cchsp27 στον εγκέφαλο, στις ωοθήκες και στους όρχεις Έκφραση του γονιδίου Cchsp27 στους σιελογόνους αδένες Επίδραση της ορμόνης εκδυσόνης στην έκφραση του γονιδίου Cchsp27 στους ιστούς της μεσογειακής μύγας α. Επίδραση της ορμόνης εκδυσόνης στην έκφραση του γονιδίου Cchsp27 στους σιελογόνους αδένες β. Επίδραση της ορμόνης εκδυσόνης στην έκφραση του γονιδίου Cchsp27 στις ωοθήκες γ. Επίδραση της ορμόνης εκδυσόνης στην έκφραση του γονιδίου Cchsp27 στους όρχεις Δημιουργία και χαρακτηρισμός διαγονιδιακού στελέχους που εκφράζει την υβριδική πρωτεΐνη Hsp27-GFP Επαγωγή των γονιδίων Cchsp27 και Cchsp23 σε συνθήκες ψυχρού στρες Συζήτηση Αναφορές

7 ~ 7 ~

8 ~ 8 ~ Περίληψη Η απόκριση των κυττάρων στο στρες συνδέεται με την επαγωγή μιας ομάδας πρωτεϊνών που ονομάζονται θερμοεπαγόμενες πρωτεΐνες (Hsps). Οι πρωτεΐνες αυτές ανήκουν στην κατηγορία των κυτταρικών συνοδών μορίων (chaperons) και προστατεύουν τα κύτταρα από τη μετουσίωση και συσσωμάτωση των πρωτεϊνών τους. Οι περισσότερες Hsps συντίθενται και σε φυσιολογικές συνθήκες και παίζουν σημαντικούς ρόλους στην ορθή αναδίπλωση, μεταφορά και αποικοδόμηση των πρωτεϊνών του κυττάρου. Οι Hsps κατηγοριοποιούνται σε διακριτές οικογένειες σύμφωνα με τα μοριακά τους βάρη. Από τις οικογένειες αυτές η οικογένεια των μικρών Hsps (shsps), με μοριακά βάρη12-43 kda, χαρακτηρίζονται από την παρουσία μιας πολύ συντηρημένης επικράτειας της α-κρυσταλλίνης στο καρβoξυτελικό τους άκρο. Μία από τις πιο καλά μελετημένες shsps είναι η Hsp27. Η Hsp27, εκτός από το κύριο ρόλο της ως μοριακού συνοδού, εμπλέκεται και σε άλλες κυτταρικές λειτουργίες όπως η διαφοροποίηση, η απόπτωση, ο σχηματισμός του κυτταροσκελετού και η ρύθμιση της οξειδωτικής ισορροπίας των κυττάρων. Από τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας φάνηκε ότι το γονίδιο Cchsp27 εκφράζεται κάτω από φυσιολογικές συνθήκες κατά την ανάπτυξη της μεσογειακής μύγας και ότι η έκφραση του ρυθμίζεται στα διάφορα αναπτυξιακά στάδια του εντόμου. Πειράματα στον εγκέφαλο, στις ωοθήκες και στους όρχεις ενηλίκων ατόμων έδειξαν ότι στον εγκέφαλο των αρσενικών ατόμων το Cchsp27 mrna παρουσιάζει σημαντικά υψηλότερα επίπεδα έκφρασης συγκριτικά με τον εγκέφαλο των θηλυκών ατόμων. Ακόμη παρατηρήθηκαν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του Cchsp27 mrna στους όρχεις από ότι στις ωοθήκες. Τα αποτελέσματα από την έκφραση του γονιδίου στους σιελογόνους αδένες προνυμφών έδειξαν υψηλά επίπεδα έκφρασης στους σιελογόνους αδένες 24 ώρες πριν την εκτίναξη των προνυμφών, ενώ σταδιακά η έκφραση μειώνεται μέχρι το στάδιο της εκτινασσόμενης προνύμφης. Η έκφραση του Cchsp27 mrna αυξάνεται στο στάδιο του λευκού προβομβυκίου ενώ στη συνέχεια σταδιακά μειώνεται. Ύστερα από την καλλιέργεια σιελογόνων αδένων παρουσία εκδυσόνης φάνηκε ότι συμβαίνει καταστολή της έκφρασης γονιδίου σε υψηλές συγκέντρωσης της ορμόνης, ενώ παρατηρείται επαγωγή σε συγκέντρωση 10-6 M. Σε ότι αφορά στην καλλιέργεια ωοθηκών και όρχεων παρουσία εκδυσόνης, παρατηρήθηκε μέγιστη επαγωγή του Cchsp27 γονιδίου στις ωοθήκες στα νεοεκκολαπτόμενα θηλυκά, ενώ μέγιστη επαγωγή στους όρχεις παρατηρήθηκε στα αρσενικά άτομα δύο ημερών. Ακολούθως, δημιουργήθηκε ένα διαγονιδιακό στέλεχος που φέρει το υβριδικό γονίδιο hsp27- GFP υπό τον έλεγχο της ευρύτερης 5 περιοχής του hsp27 γονιδίου, με σκοπό την μελλοντική μελέτη της κυτταρικής και ενδοκυτταρικής κατανομής της πρωτεΐνης Hsp27 κατά την ανάπτυξη της μεσογειακής μύγας. Τέλος, μελετήθηκε η έκφραση των γονιδίων Cchsp27 και Cchsp23 σε συνθήκες ψυχρού στρες. Και τα δύο γονίδια έδειξαν σημαντική έκφραση αυξανόμενου χρόνου επώασης στους 0 ο C, με το Cchsp27 να παρουσιάζει υψηλότερα επίπεδα έκφρασης σε σχέση με το Cchsp23.

9 ~ 9 ~ Εισαγωγή

10 ~ 10 ~ Εισαγωγή Α. Θερμοεπαγόμενες Πρωτεΐνες Ιστορικά Στοιχεία Η απόκριση στο θερμικό στρες περιγράφηκε για πρώτη φορά στο έντομο Drosophila από τον Ferrucio M. Ritossa το 1962, ο οποίος παρατήρησε ότι η αύξηση της θερμοκρασίας είχε ως αποτέλεσμα την εμφάνιση ενός νέου προτύπου χρωμοσωματικών διογκώσεων (puffs) στα πολυταινικά χρωμοσώματα των σιελογόνων αδένων του εντόμου (Ritossa, 1962). Το 1972 από τους Ashburner και Bonner αποδείχθηκε ότι οι συγκεκριμένες χρωμοσωμικές διογκώσεις αποτελούν ενεργές περιοχές αυξημένης μεταγραφής mrnas πρωτεϊνών που αργότερα χαρακτηρίστηκαν ως θερμοεπαγόμενες πρωτεΐνες (Hsps) (Ashburner & Bonner, 1979). Ο όρος θερμοεπαγόμενο γονίδιο και θερμοεπαγόμενη πρωτεΐνη δόθηκε το 1974 από τον Tissiéres ο οποίος επίσης μελετούσε την απόκριση στο θερμικό στρες στο έντομο Drosophila melanogaster (Tissiéres et al., 1974). Το , μελέτες σε άλλους οργανισμούς αποκάλυψαν ότι η αύξηση της θερμοκρασίας και άλλες στρεσογόνες καταστάσεις επάγουν την σύνθεση θερμοεπαγόμενων πρωτεϊνών σε κύτταρα πτηνών, στη ζύμη και στον πρωτόζωο Tetrahymena spp. Μέσα σε λίγα χρόνια παρόμοιες αποκρίσεις αναφέρθηκαν σε έναν μεγάλο αριθμό οργανισμών. Αντίστοιχες μελέτες οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι τα θερμοεπαγόμενα γονίδια εμφανίζουν υψηλό βαθμό συντήρησης κατά την διάρκεια της εξέλιξης, όχι μόνο σε ότι αφορά την κωδική αλληλουχία των πρωτεϊνών τους αλλά και στις ρυθμιστικές τους αλληλουχίες (Lindquist, 1986). 1. Απόκριση στο Θερμικό Στρες και Πρωτεόσταση Τα κύτταρα όλων των οργανισμών συνεχώς υφίστανται μια σειρά από βλάβες που οφείλονται είτε σε εσωτερικούς, είτε σε εξωτερικούς φυσικο-χημικούς και βιοτικούς παράγοντες. Για το λόγο αυτό, τα ζωντανά συστήματα έχουν αναπτύξει μια σειρά από στρατηγικές για την επιδιόρθωση αυτών των βλαβών και/ή για την απομάκρυνση των παραγόντων υπεύθυνων για τη βλάβη. Κυτταρικό στρες ορίζεται ως η οποιαδήποτε διαταραχή της ομοιόστασης του κυττάρου. Κεντρικό ενδιαφέρον αποτελούν εκείνοι οι περιβαλλοντικοί παράγοντες που επηρεάζουν την πρωτεόσταση (proteostasis) καθώς στην οξεία ή συνεχή διαταραχή στην διατήρηση της σταθερότητας των πρωτεϊνών αναγνωρίζονται τα κυριότερα αίτια της πρόκλησης ασθενειών (Vabulas et al., 2010). Ως πρωτεόσταση αναφέρεται ο έλεγχος της συγκέντρωσης, της αναδίπλωσης, της συγκρότησης της τεταρτοταγούς δομής και του εντοπισμού των πρωτεϊνών ενός κυττάρου (εικόνα Α1.1). Η πρωτεόσταση επηρεάζει συγκεκριμένες κυτταρικές λειτουργίες και επιτρέπει στα διαφοροποιημένα κύτταρα να αλλάζουν τη φυσιολογία τους με σκοπό την επιτυχή ανάπτυξη του οργανισμού υπό το βάρος των συνεχών εγγενών και περιβαλλοντικών προκλήσεων. Η πρωτεόσταση επηρεάζεται από το πρότυπο αναδίπλωσης των πρωτεϊνών και από ένα πλήθος ρυθμιστικών δικτύων που ελέγχουν την πρωτεϊνοσύνθεση, την αναδίπλωση, διακίνηση, συσσωμάτωση και αποδιάταξη των πρωτεϊνών (εικόνα Α1.1) (Balch et al., 2008).

11 ~ 11 ~ Εικόνα Α1.1. Ένα δίκτυο πρωτεόστασης που συγκροτείται από μονοπάτια τα οποία αναπαριστώνται με κόκκινα βέλη. Διαταραχές στην πρωτεόσταση συχνά οδηγούν σε ασθένειες. Οι ρυθμιστές της πρωτεόστασης (μωβ κύκλοι) που χειραγωγούν τα μονοπάτια/δίκτυα της πρωτεόστασης μπορούν να αποκαταστήσουν την πρωτεϊνική ομοιόσταση και κατ επέκταση να βελτιώσουν την εικόνα μιας ασθένειας που σχετίζεται με αυτά τα δίκτυα. Με πράσινο τετράγωνο απεικονίζονται φαρμακευτικοί μοριακοί συνοδοί που ενισχύουν την σωστή αναδίπλωση και διακίνηση των πρωτεϊνών (Balch et al., 2008). Οι τυπικοί στρεσογόνοι παράγοντες σχετίζονται με το θερμικό στρες (λόγω υψηλών θερμοκρασιών), το στρες κάτω από χαμηλές θερμοκρασίες, τις αλλαγές στην ωσμωτικότητα καθώς και αλλαγές στο ph. Οι πρωτεΐνες είναι δυναμικά πολυμερή που μπορούν να αφήσουν την διαλυτή διαμόρφωσή τους στο χώρο και να σχηματίσουν δομές που βρίσκονται οριακά μεταξύ της διαλυτής κατάστασης και αυτής των συσσωματωμάτων. Με την αλλαγή της θερμοκρασίας προσφέρεται στο σύστημα η κατάλληλη ενέργεια για την μετατόπιση της παραπάνω ισορροπίας σε μία κατάσταση σχεδόν πλήρους διαταραχής της αναδίπλωσης των πρωτεϊνών. Ως αποτέλεσμα είναι ο αυξημένος κίνδυνος συσσωμάτωσης τους μέσω της έκθεσης των υδρόφοβων περιοχών τους (Vabulas et al., 2010). Η απόκριση στο θερμικό στρες πρόκειται για μία κυτταρική απόκριση που βοηθά στο να διατηρείται η κυτταρική ομοιόσταση κάτω από συνθήκες στρες. Ανάμεσα στις αλλαγές που παρατηρούνται στην κυτταρική δραστηριότητα και φυσιολογία, το πιο σημαντικό γεγονός είναι η παραγωγή των υψηλά συντηρημένων θερμοεπαγόμενων πρωτεϊνών, των Hsps (Schelesinger et al., 1982). Η αυξημένη έκφραση των Hsps ρυθμίζεται σε πολλαπλά επίπεδα όπως η μεταγραφή, η σταθερότητα και αποτελεσματικότητα της μετάφρασης των hsp mrnas. Πειράματα σε διαφορετικά είδη έχουν δείξει ότι η αυξημένη έκφραση αυτών των πρωτεϊνών μπορεί να προστατεύσει τους οργανισμούς ενάντια στην επαγόμενη από το στρες βλάβη. Όταν η θερμοκρασία επανέλθει στα φυσιολογικά για τον οργανισμό επίπεδα, τα hsp γονίδια είτε σταματούν να μεταγράφονται είτε τα επίπεδα της έκφρασής τους μειώνονται, ενώ αρχίζουν να μεταγράφονται και πάλι τα υπόλοιπα γονίδια των κυττάρων. Μόνο σε δύο περιπτώσεις, στα είδη Hydra oligatis και Trematomus bernacchii δεν έχει παρατηρηθεί απόκριση στο θερμικό στρες (Katschinski, 2004). Στους περισσότερους τύπους κυτταρικού στρες παρατηρείται μείωση της μεταφραστικής δραστηριότητας. Αυτό οδηγεί σε μία σημαντική εξοικονόμηση ενέργειας, η οποία κατά κύριο λόγο καταναλώνεται στη μετάφραση και που εκτιμάται ότι είναι μεγαλύτερη του 50% της συνολικής ενέργειας του κυττάρου. Ακόμη, η απόκριση στο στρες οδηγεί σε μία επιλεκτική μετάφραση πρωτεϊνών που απαιτούνται για την επιβίωση του κυττάρου κάτω από

12 ~ 12 ~ συνθήκες στρες. Οι μελέτες που σχετίζονται με τους μηχανισμούς μετάφρασης κάτω από συνθήκες στρες σχετίζονται κυρίως με τη ρύθμιση της έναρξης της μετάφρασης (Holcik & Sonenberg, 2005). Μελέτες στη D. melanogaster έχουν δείξει ότι τα mrnas των μη-θερμοεπαγόμενων γονιδίων μεταφράζονται ελάχιστα σε υψηλές θερμοκρασίες ενώ τα hsp mrnas μεταφράζονται κανονικά τόσο σε υψηλές όσο και σε χαμηλές θερμοκρασίες. Πιο συγκεκριμένα, τα hsp mrnas παράγονται μέσα στα τέσσερα πρώτα λεπτά από την αύξηση της θερμοκρασίας, ενώ μέσα σε οχτώ με δώδεκα λεπτά αυτά τα μηνύματα έχουν υποστεί την κατάλληλη επεξεργασία, έχουν μεταφερθεί στο κυτταρόπλασμα και έχουν μεταφραστεί στις αντίστοιχες πρωτεΐνες. Η ταχύτητα και η ένταση αυτής της απόκρισης ενισχύεται έντονα από το γεγονός ότι η σύνθεση των μη-θερμοεπαγόμενων μηνυμάτων περιορίζεται ραγδαία (Lindquist, 1980). Σε ορισμένες περιπτώσεις ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης στο επίπεδο της μεταγραφής, παρατηρείται το φαινόμενο της παύσης όπου η μεταγραφή εμποδίζεται ή σταματάει κατά τη φάση της έναρξης της επιμήκυνσης. Τα γονίδια που χρησιμοποιούν αυτόν τον τύπο ελέγχου έχουν ως αποτέλεσμα μεγαλύτερη συγκέντρωση RNA πολυμεράσης στα 5 άκρα τους. Στη D. melanogaster έχουν ταυτοποιηθεί αρκετά γονίδια που εμφανίζουν μία τέτοια κατανομή της πολυμεράσης. Ανάμεσα σε αυτά συμπεριλαμβάνονται τα hsp70, hsp27 και hsp26, δομικά γονίδια αλλά και γονίδια που σχετίζονται με τον μεταβολισμό. Επομένως πρόκειται για ένα γενικευμένο φαινόμενο. Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, για το hsp70 αυτό που παρατηρείται είναι ότι η πολυμεράση ξεκινάει την μεταγραφή αλλά σταματάει νωρίς κατά την φάση της επιμήκυνσης. Η πολυμεράση σταματά σε μία περιοχή του γονιδίου κοντά στον υποκινητή και έχει προταθεί ότι η παύση αυτή είναι αποτέλεσμα αλληλεπιδράσεων με μεταγραφικούς παράγοντες που προσελκύουν την RNA πολυμεράση στο γονίδιο. Η αύξηση της θερμοκρασίας οδηγεί στην πρόσδεση του παράγοντα θερμικού στρες στα αντίστοιχα στοιχεία απόκρισης και αυτό φαίνεται να παίζει κάποιο σημαντικό ρόλο στην άρση της παύσης της μεταγραφής (Rasmussen & Lis, 1993). Φαίνεται ότι τα mrnas των μη-θερμοεπαγόμενων γονιδίων κάτω από την επίδραση υψηλών θερμοκρασιών δεν προσδένονται στα ριβοσώματα. Εν ολίγοις, το αν θα μεταφραστεί ένα mrna ή όχι παρουσία θερμικού στρες αποφασίζεται στο επίπεδο της έναρξης της μετάφρασης. Στη D. melanogaster 95 νουκλεοτίδια, που εντοπίζονται στην 5 UTR του hsp70 mrna, είναι απαραίτητα για την μετάφραση του σε υψηλές θερμοκρασίες κάτι που φαίνεται να ισχύει και για τον Xenopus leavis. Ακόμη, δεδομένα που έρχονται από μελέτες στο hsp22 mrna επιβεβαιώνουν τα παραπάνω οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι κατάλληλα σινιάλα στη 5 UTR περιοχή είναι απαραίτητα για την μετάφραση σε υψηλές θερμοκρασίες (Klemenz et al., 1985). Αν και το στρες επηρεάζει κάθε βήμα της μετάφρασης, στις περισσότερες περιπτώσεις η θερμοεπαγόμενη μεταφραστική αποσιώπηση είναι αποτέλεσμα αλλαγών στην έναρξη της μετάφρασης. Πιο συγκεκριμένα, το στρες επάγει την φωσφορυλίωση της α-υπομονάδας του παράγοντα eif2. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την καταστολή της ανταλλαγής GDP για GTP στο eif2 σύμπλοκο (εικόνα Α1.2), οπότε δεν σχηματίζεται το elf2 GTP σύμπλοκο. Η φωσφορυλίωση λοιπόν του eif2α μειώνει την μετάφραση για τα περισσότερα mrnas. Ωστόσο σε κάποιες περιπτώσεις η φωσφορυλίωση του eif2α ενισχύει την μετάφραση ελάχιστων επιλεγμένων mrnas που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που δρουν στην απόκριση του κυττάρου στο στρες και στην επανάκαμψη του όταν ο στρεσογόνος παράγοντας έχει παρέλθει (Holcik & Sonenberg, 2005).

13 ~ 13 ~ Στην εικόνα Α1.3 περιγράφεται ένα παράδειγμα επιλεκτικής μετάφρασης του μεταγραφικού παράγοντα GCN4 στη ζύμη Saccharomyces cerevisiae. Φαίνεται ότι στην 5 UTR περιοχή του GCN4 mrna υπάρχουν τέσσερα ανοδικά ανοιχτά αναγνωστικά πλαίσια (uorfs) τα οποία παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στην έναρξη της μετάφρασης ανάλογα με τα επίπεδα φωσφορυλίωσης του eif2α. Με παρόμοιο τρόπο γίνεται η ρύθμιση της μετάφρασης του παράγοντα ATF-4 στα θηλαστικά. Η επιλεκτική αυτή μετάφραση πραγματοποιείται στο επίπεδο των ριβοσωμάτων και στην ικανότητα αποτελεσματικης εκκίνησης της μετάφρασης. Ακόμη, τα ριβοσώματα μπορούν επιλεκτικά να στρατολογήσουν mrnas για μετάφραση. Η επιλεκτική αυτή ρύθμιση των συγκεκριμένων mrnas ελέγχεται από διακριτές αλληλουχίες που εντοπίζονται στην 5 και 3 UTR, καθώς και από πρωτεΐνες που προσδένονται σε αυτά τα στοιχεία. Μία σημαντική στρατηγική μεταφραστικής ρύθμισης κατά τη διάρκεια του στρες είναι η επιλεκτική στρατολόγηση mrnas διαμέσου του στοιχείου IRES (internal ribosome entry site). Η έναρξη της μετάφρασης mrnas που φέρουν IRES αλληλουχία κυρίως συμβαίνει κατά την απόκριση στο στρες και κατά την απόπτωση (Holcik & Sonenberg, 2005). Εικόνα Α1.2. Απόκριση στο στρες μέσω της φωσφορυλίωσης του ευκαρυωτικού παράγοντα έναρξης, eif2α. Πολλές στρεσογόνες καταστάσεις οδηγούν στην φωσφορυλίωση του eif2α η οποία πραγματοποιείται από τέσσερις διαφορετικές κινάσες: GCN2, PKR, HRI και PERK. Ο eif2α είναι μία υπομονάδα του eif2 συμπλόκου το οποίο μαζί με το GTP και το Met-tRNA συγκροτεί το σύμπλοκο εκείνο που μεταφέρει το εναρκτήριο trna στο ριβόσωμα. Καθώς το GTP υδρολύεται κατά την έναρξη της μετάφρασης, ο eif2 χρειάζεται να φορτωθεί ξανά το GΤP για έναν νέο κύκλο έναρξης της μετάφρασης. Η GDP-GTP ανταλλαγή καταλύεται από τον eif2β παράγοντα. Η φωσφορυλίωση του eif2α καταστέλλει αυτήν την ανταλλαγή. Τελικά αναστέλλεται η μετάφραση. Ωστόσο, παρατηρείται επιλεκτική μετάφραση μιας ομάδας mrnas που επιτρέπουν την προσαρμογή και επιβίωση του κυττάρου κάτω από συνθήκες στρες. ER, ενδοπλασματικό δίκτυο, UV, ultraviolet, (Holcik & Sonenberg, 2005). Εικόνα Α1.3. Ρυθμιστικά στοιχεία στην 5 UTR περιοχή των mrnas που σχετίζονται με την επιλεκτική μετάφραση. (a) Η μετάφραση του μεταγραφικού παράγοντα GCN4 στη ζύμη S. cerevisiae ρυθμίζεται από τέσσερα ανοδικά ανοιχτά αναγνωστικά πλαίσια (uorfs), σε χαμηλά και υψηλά επίπεδα φωσφορυλίωσης του eif2α. (b) Η μετάφραση του παράγοντα ATF-4 των θηλαστικών παρουσιάζει παρόμοια ρύθμιση με αυτή του GCN4 της ζύμης. Και στις δύο περιπτώσεις, σε υψηλά επίπεδα φωσφορυλίωσης του eif2α παρατηρείται επιλεκτική επαγωγή της έκφρασης των δύο παραγόντων. Κωδικές περιοχές: πράσινα ορθογώνια, uorfs: ροζ/μωβ ορθογώνια, AUG: κωδικόνια έναρξης, ριβοσώματα: πορτοκαλί (60S υπομονάδα, σκούρο πορτοκαλί, 40S υπομονάδα, ανοιχτό πορτοκαλί) m 7 G: cap δομή, (Holcik & Sonenberg, 2005).

14 ~ 14 ~ Ένα ακόμη αποτέλεσμα του θερμικού στρες αφορά στην σταδιακή απώλεια περισσότερο από το 80% της συνολικής κυτταροπλασματικής poly(a)+ αλληλουχίας μέσα στην πρώτη ώρα επίδρασης υψηλής θερμοκρασίας. Η απώλεια αυτή πιθανόν αναπαριστά αλλαγές στο poly(a) περιεχόμενο συγκεκριμένων mrnas (Storti et al., 1980). Την ίδια χρονιά δημοσιεύεται μία εργασία όπου γίνεται φανερό ότι προϋπάρχοντα μηνύματα είναι σταθερά μόνο όταν τα κύτταρα υπόκεινται σε θερμικό στρες σε θερμοκρασίες που τους επιτρέπουν να συνθέσουν μία σημαντική ποσότητα Hsps ή των αντίστοιχων mrnas (Lindquist, 1980). Στην ίδια εργασία αποκαλύπτεται επίσης ότι οι διαφορετικές θερμοκρασίες θερμικού στρες σχετίζονται με διαφορετικά πρότυπα σύνθεσης των Hsps και ότι σε ενδιάμεσες θερμοκρασίες οι Hsps που συντίθενται εμφανίζουν διαφορετική κινητική. Γίνεται κατανοητό ότι σε διαφορετικές θερμοκρασίες, ανάλογα με την μεταβολική κατάσταση του κυττάρου, οι Hsps είναι απαραίτητες σε διαφορετικές αναλογίες και ότι τα επίπεδα σύνθεσης τους εξαρτώνται από το ίδιο το κύτταρο (Lindquist, 1980). Στην απόκριση στο θερμικό στρες συμμετέχουν μηνύματα που σχετίζονται με την μεταφραστική μηχανή. Συγκεκριμένα, μη-θερμοεπαγόμενα κυτταρικά μηνύματα δεν αποικοδομούνται κατά την αύξηση της θερμοκρασίας αλλά διατηρούνται στο κύτταρο έτοιμα να δράσουν κατά την μετάφραση όταν τα κύτταρα ανακάμψουν ύστερα από συγκεκριμένη χρονική περίοδο, όταν η θερμοκρασία έχει επανέλθει στα φυσιολογικά επίπεδα. Στη D. melanogaster παρατηρείται η διάκριση, στο επίπεδο της μετάφρασης, ανάμεσα σε δύο πληθυσμούς μηνυμάτων που προϋπάρχουν στο κύτταρο. Ο ένας πληθυσμός αφορά στην μετάφραση κατά προτίμηση hsp mrnas κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες, ενώ ο άλλος αφορά στην μετάφραση φυσιολογικών μηνυμάτων. Στην παραπάνω διαδικασία φαίνεται ότι εμπλέκονται τρεις μηχανισμοί: συγκεκριμένα γονίδια επιλέγονται για την μεταγραφή, συγκεκριμένα μηνύματα επιλέγονται προς αποικοδόμηση, και σε συγκεκριμένες τάξεις μηνυμάτων δεν επιτρέπεται η μετάφραση (Lindquist, 1980). Στον άνθρωπο υπάρχουν πολυάριθμα παραδείγματα που δείχνουν ότι η έκφραση των Hsps μπορεί να ποικίλει ανάλογα με την περιβαλλοντική θερμοκρασία, παρά την ικανότητα για διατήρηση σταθερής εσωτερικής θερμοκρασίας. Αύξηση στη σύνθεση των Hsps παρατηρείται in vivo κατά τη διάρκεια άσκησης στον καρδιακό μυ, η οποία εξαρτάται από την περιβάλλουσα θερμοκρασία και επηρεάζει τις προσαρμογές του μυοκαρδίου (Harris & Starnes, 2001). Αλλαγές στην έκφραση της Hsp72 στα λευκοκύτταρα σχετίζονται με προσαρμογές στην άσκηση υπό συνθήκες υψηλής περιβαλλοντικής θερμοκρασίας. Η σημαντικότητα των Hsps σχετικά με τις περιβαλλοντικές προσαρμογές έχει μελετηθεί πολύ καλά στα ποικιλόθερμα ζώα. Οι μελέτες αυτές επίσης δείχνουν ότι η θερμοκρασία στην οποία ενεργοποιούνται τα hsp γονίδια σχετίζεται άμεσα με αλλαγές από τη μέση περιβαλλοντική θερμοκρασία. Στο σύνολό τους οι Hsps εξελίχθηκαν ως επαγόμενες λόγω στρες πρωτεΐνες με σκοπό τη διατήρηση της κυτταρικής ακεραιότητας (Moseley, 1997). 2. Γενικότερος ρόλος των Hsps: Μοριακοί Συνοδοί (molecular chaperons) Σχεδόν όλες οι Hsps εκφράζονται κάτω από φυσιολογικές συνθήκες αύξησης όπου και η λειτουργία τους επικεντρώνεται στην διατήρηση της ομοιόστασης των πρωτεϊνών ρυθμίζοντας τον ποιοτικό έλεγχο στην αναδίπλωση των πρωτεϊνών και βοηθώντας στη μετατόπιση τους κατά μήκος των ενδοκυτταρικών μεμβρανών (Neupert, 1997; Hartl & Hayer-Hartl, 2002; Nollen & Morimoto, 2002). Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες οι μοριακοί συνοδοί βοηθούν στη διαδικασία αναδίπλωσης και διαμερισματοποίησης των νέοσυντιθέμενων πρωτεϊνών, ενώ επίσης

15 ~ 15 ~ συμμετέχουν σε μια ποικιλία άλλων κυτταρικών λειτουργιών (Katschinski, 2004). Ως μοριακοί συνοδοί ορίζονται οι πρωτεΐνες που προσδένουν, και έτσι σταθεροποιούν τις μη σταθερές μορφές άλλων πρωτεϊνών μέσω της ελεγχόμενης πρόσδεσης και απελευθέρωσης, διευκολύνουν in vivo την απόκτηση σωστής δομής στο χώρο, τη μεταφορά σε συγκεκριμένο υποκυτταρικό διαμέρισμα, ή στην απομάκρυνση μέσω της αποδόμησης (Hartl, 1996). Οι μοριακοί συνοδοί δεν καθορίζουν την τεταρτοταγή δομή των αναδιπλωμένων πρωτεϊνών αλλά τις βοηθούν να βρουν τη δομή τους πιο αποτελεσματικά. Ωστόσο, μόνο λίγοι συμπεριφέρονται ως αληθινοί καταλύτες αυξάνοντας το ρυθμό της αναδίπλωσης των πρωτεϊνών οι οποίοι και καλούνται καταλύτες αναδίπλωσης (folding catalysts). Η πλειοψηφία των μοριακών συνοδών αποτρέπει τις μη σωστές αλληλεπιδράσεις των νέοσυντιθέμεων πρωτεϊνών και τους επιτρέπουν την αυθόρμητη αναδίπλωση. Ο μηχανισμός αυτός αυξάνει την απόδοση, αλλά όχι το ρυθμό της πρωτεϊνικής αναδίπλωσης (Hartl, 1996). Οι μοριακοί συνοδοί είναι πρωτεΐνες πανταχού παρούσες και υψηλά συντηρημένες οι οποίες πιθανότατα έχουν παίξει κάποιο κυρίαρχο ρόλο στην εξέλιξη των σύγχρονων ενζύμων (Csermely et al., 1997). Οι μοριακοί συνοδοί είναι ζωτικής σημασίας για τα κύτταρα καθ όλη τη διάρκεια της ζωής τους. Ωστόσο, είναι ακόμα περισσότερο απαραίτητοι ύστερα από περιβαλλοντικό στρες το οποίο επάγει την πρωτεϊνική βλάβη. Το στρες (θερμικό σοκ, δηλητηρίαση, σχεδόν οποιαδήποτε αιφνίδια αλλαγή στο κυτταρικό περιβάλλον) επάγει τη σύνθεση πολλών μοριακών συνοδών, τις θερμοεπαγόμενες πρωτεΐνες. Οι μοριακοί συνοδοί παίζουν ένα πολύ σημαντικό ρόλο στην αιτιολογία πολυάριθμων ασθενειών και έχουν ένα συνεχώς αυξανόμενο ρόλο στην κλινική εφαρμογή (Csermely et al., 1998). Κατά την βιοσύνθεση των πρωτεϊνών, τα νεοσυντιθέμενα πολυπεπτίδια ανέρχονται από το ριβόσωμα έχοντας τις υδρόφοβες περιοχές τους εκτεθειμένες οι οποίες τελικά θα προστατευτούν στο εσωτερικό της αναδιπλωμένης πρωτεΐνης. Οι μοριακοί συνοδοί αναγνωρίζουν τις εκτεθειμένες υδρόφοβες περιοχές των αρτιγενών πολυπεπτιδίων και έτσι αποτρέπουν τις μη κατάλληλες αλληλεπιδράσεις που θα μπορούσαν να οδηγήσουν στη δημιουργία συσσωματωμάτων. Κατά την μετάφραση, οι μοριακοί συνοδοί συνεισφέρουν στην ωρίμανση των αρτιγενών αλυσίδων είτε με το να βοηθούν στη σωστή αναδίπλωση, συγκροτώντας έτσι πολυμερή σύμπλοκα, είτε με την μετατόπιση των νεοσυντιθέμενων αλυσίδων στα διάφορα ενδοκυτταρικά οργανίδια (Voisine et al., 2010). Οι μοριακοί συνοδοί δεν προσδένονται στα υποστρώματά τους μόνο για να εμποδίσουν άμεσα τη διαμοριακή συσσωμάτωση με το να προστατεύουν τις περιοχές των μη-διαλυτών πολυπεπτιδικών αλυσίδων που αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Επιπλέον αποτρέπουν ή αντιστρέφουν την ενδομοριακή αναδίπλωση. Συγκεκριμένοι μοριακοί συνοδοί, όπως οι οικογένειες των Hsp100 και Clp έχουν τη ικανότητα να ξετυλίγουν πρωτεΐνες ή να διαταράσσουν μικρά πρωτεϊνικά συσσωματώματα με έναν ΑΤΡ-εξαρτώμενο μηχανισμό (Hartl & Hayer-Hartl, 2002). Στην εικόνα Α2.1 φαίνεται ένα γενικευμένο μοντέλο της πρωτεϊνικής αναδίπλωσης στο κυτταρόπλασμα.

16 ~ 16 ~ Εικόνα Α2.1. Αναδίπλωση των πρωτεϊνών στο κυτταρόπλασμα: Το σχήμα απεικονίζει τρία μοντέλα για την διαδικασία αναδίπλωσης νεοσυντιθέμενων πρωτεϊνών με την μεσολάβηση των μοριακών συνοδών. (Α) Βακτήρια, TF, trigger factor, N, native protein. Οι νεοσυντιθέμενες αλυσίδες πιθανόν αλληλεπιδρούν γενικά με τον TF παράγοντα ενώ το περίπου 70% της ολικής πρωτεΐνης αναδιπλώνεται ταχύτατα κατά την σύνθεση χωρίς περαιτέρω βοήθεια. Οι μεγαλύτερες αλυσίδες (περίπου το 20% της ολικής πρωτεΐνης) αλληλεπιδρούν στη συνέχεια με τα DnaK και DnaJ, του συστήματος Hsp70 και Hsp40 αντίστοιχα, και αναδιπλώνονται μέσα από έναν ή περισσότερους κύκλους φωσφορυλίωσης και αποφωσφορυλίωσης. Περίπου το 10% των αλυσίδων μεταπίπτουν στο σύστημα των μοριακών συνοδών (GroEL και GroES) για τη σωστή αναδίπλωσή τους. (Β) Αρχαία, PFD, prefoldin, NAC, nascent chain-associated complex. Μόνο ορισμένα είδη Αρχαίων φέρουν DnaK/DnaJ. (C) Ευκαρυωτικοί οργανισμοί. Όπως ο TF, το σύμπλοκο NAC πιθανόν αλληλεπιδρά γενικά με τις νεοσυντιθέμενες αλυσίδες, αλλά ο ρόλος του στην αναδίπλωση των πρωτεϊνών δεν είναι ακόμη ξεκάθαρος. Περίπου το 20% των αλυσίδων φτάνουν στην διαλυτή τους κατάσταση μέσα από μία αντίδραση στην οποία συμμετέχουν το σύμπλοκο RAC (ribosome associated complex) και οι πρωτεΐνες Hsp70 και Hsp40. Ένα μέρος αυτών των αλυσίδων μεταφέρονται στην Hsp90 για την αναδίπλωσή τους. Περίπου το 10% των αλυσίδων υποπίπτουν σε μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις στο σύστημα TRiC (chaperonin) σε μία αντίδραση η οποία καθοδηγείται από τις Hsp70 και PFD, οι οποίες και οι δύο αλληλεπιδρούν άμεσα με το TRiC. H PFD αναγνωρίζει συγκεκριμένες νεοσυντιθέμενες πρωτεΐνες, οι οποίες αποτελούν υποστρώματα του TRiC, συμπεριλαμβάνοντας την ακτίνη και την τουμπουλίνη (Vabulas et al., 2010). Οι Hsps κατατάσσονται στην οικογένεια των μοριακών συνοδών και είναι υπεύθυνες τόσο για τη διατήρηση των ανώτερων δομών άλλων πρωτεϊνών όσο και για τη σωστή διαμόρφωση τους κατά τη βιοσύνθεσή τους και τη μεταφορά τους στα οργανίδια. Η δράση τους ως μοριακοί συνοδοί οφείλεται στην ικανότητά τους να αναγνωρίζουν και να προσδένονται στις υδρόφοβες περιοχές των πρωτεϊνών οι οποίες κατά τη διάρκεια της βιοσύνθεσής τους, ή λόγω άλλων παραγόντων, είναι εκτεθειμένες (Ellis & van der Vies, 1991). Στον πίνακα Ι φαίνονται οι κύριες οικογένειες μοριακών συνοδών. Η κατηγοριοποίηση έγινε με βάση το μοριακό τους βάρος (Welch & Brown, 1996). Πίνακας Ι. Οι κυριότερες οικογένειες μοριακών συνοδών. Oνομασίες ευκαρυωτικών μοριακών Χαρακτηριστική λειτουργία μοριακού συνοδών συνοδού HSP27, κρυσταλλίνες, shsps Εμποδίζουν τη δημιουργία πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων, απελευθερώνουν τις πρωτεΐνες από τα συσσωματώματα HSP60, chaperonins Εμποδίζουν τη δημιουργία πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων, βοηθούν στην αναδίπλωση των πρωτεϊνών HSP70, GRP78, BiP Εμποδίζουν τη δημιουργία πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων HSP90, GRP94 Εμποδίζουν τη δημιουργία πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων HSP110 Διάλυση πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων

17 ~ 17 ~ 3. Παράγοντες που επάγουν τη σύνθεση των θερμοεπαγόμενων πρωτεϊνών Εκτός από την αύξηση της θερμοκρασίας, υπάρχουν και άλλοι παράγοντες οι οποίοι επάγουν τη σύνθεση των Hsps. Οι παράγοντες αυτοί αφορούν περιβαλλοντικούς παράγοντες όπως είναι η παρουσία βαρέων μετάλλων, ελευθέρων ριζών οξυγόνου, ανοξίας, καθώς και παθολογικές καταστάσεις, όπως σε περίπτωση μολύνσεων, τραυματισμού των ιστών και πυρετού και κατά τη διάρκεια έντονης άσκησης. Ακόμη, κάποια από τα μέλη της οικογένειας των Hsps, οι οποίες ονομάζονται συγγενείς θερμοεπαγόμενες πρωτεΐνες Εικόνα Α3.1. Καταστάσεις που επάγουν την απόκριση στο θερμικό στρες (Morimoto, 1998). (Heat shock cognates, HSCs) συντίθενται ιδιοσυστατικά και παίζουν ρόλο σε φυσιολογικές λειτουργίες του κυττάρου όπως, ο κυτταρικός κύκλος και η κυτταρική διαφοροποίηση (Feige & Polla, 1994). Στην εικόνα Α3.1, φαίνονται οι παράγοντες και οι συνθήκες που επάγουν τη σύνθεση των Hsps Επαγωγή των Hsps κατά την ανάπτυξη: Στη Drosophila, τα hsp26, hsp28 και hsp83 mrnas επάγονται σε υψηλά επίπεδα στα τροφοκύτταρα (nurse cells) των ωοθηκών καθώς αυτές αναπτύσσονται σε ωοκύτταρα. Τα hsp70, 68, 33 και 23 mrnas δεν συντίθενται και δεν μπορούν να επαχθούν στη συγκεκριμένη χρονική περίοδο, ακόμα και κάτω από την επίδραση θερμικού στρες. Τα hsp22, 23, 26 και 28 mrnas επάγονται στο τρίτο στάδιο ανάπτυξης της προνύμφης, στη μετάπτωση του σταδίου της πρώιμης νύμφης. Συγκεκριμένες Hsps εμφανίζονται να συντίθενται ιδιοσυστατικά στα πρώιμα έμβρυα άλλων οργανισμών, όπως για παράδειγμα σε έμβρυο ποντικού οχτώ ημερών όπου εμφανίζονται οι Hsp89 και 70 (Lindquist, 1986; Michaud et al., 1997). Άλλες περιπτώσεις επαγωγής των Hsps. Οι περισσότερες περιπτώσεις επαγωγής των Hsps, που δεν αφορούν το θερμικό στρες, στη Drosophila περιλαμβάνουν άλλες καταστάσεις στρες όπως για παράδειγμα το οξειδωτικό στρες. Τα βαρέα μέταλλα επίσης επάγουν τη σύνθεση των Hsps, όπως είναι το κάδμιο, ο ψευδάργυρος και ο χαλκός (Lindquist, 1986).

18 ~ 18 ~ 4. Οικογένειες των θερμοεπαγόμενων πρωτεϊνών Οι Hsps κατηγοριοποιούνται με βάση το μοριακό τους βάρος στις διακριτές οικογένειες Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60 και στις μικρές θερμοεπαγόμενες πρωτεΐνες, shps (Hartl & Hayer-Hartl, 2002). Στην εικόνα Α4.1 φαίνονται συνολικά οι Hsp οικογένειες. Εικόνα Α4.1. Οι οικογένειες των Hsps (Katschinski, 2004). Η οικογένεια Hsp100 Χαρακτηριστικό γνώρισμα των Hsp100 είναι η παρουσία δύο συντηρημένων περιοχών μεγέθους ~200 αμινοξέων οι οποίες περιβάλλουν μία θέση δέσμευσης για το ΑΤΡ. Το μέγεθός τους κυμαίνεται από 78 έως 100 kda, ανάλογα με το μέγεθος του τμήματος που συνδέει τις δύο συντηρημένες περιοχές (Nover & Scharf, 1997). Τα μέλη της οικογένειας απατώνται στο κυτταρόπλασμα αλλά και στα υποκυτταρικά οργανίδια του σακχαρομύκητα και των φυτών που έχουν μελετηθεί, ενώ ομόλογά τους δεν έχουν βρεθεί στο έντομο Drosophila. Οι Hsp100 σχηματίζουν δακτυλιοειδή εξαμερή, αποτελούν μοριακούς συνοδούς και σε ορισμένες περιπτώσεις έχει διαπιστωθεί ότι αντικαθιστούν το σύστημα των Hsp70/ Hsp40 (Wickner et al., 1994). Η οικογένεια Hsp90 Τα μέλη της οικογένειας Hsp90 είναι υψηλά συντηρημένες πρωτεΐνες, οι οποίες αντιπροσωπεύουν το 1-2% των ολικών πρωτεϊνών του κυττάρου. Η Hsp90 αποτελείται από τρεις δομικές επικράτειες οι οποίες χαρακτηρίστηκαν μέσω πρωτεολυτικής πέψης. Η ~25- kda NH2-τελική περιοχή συνδέεται με την ~55-kDa COOH-τελική περιοχή με έναν φορτισμένο συνδέτη (linker) ο οποίος ποικίλει σε μήκος και σύσταση ανάμεσα στα διάφορα είδη και στις ισομορφές (Richter & Buchner, 2001). Η Hsp90 στο κυτταρόπλασμα βρίσκεται σε δύο ισομορφές, όμως ομόλογες πρωτεΐνες υπάρχουν και σε υποκυτταρικά οργανίδια, όπως το ενδοπλασματικό δίκτυο (GRP94/GP96) (Sorger & Pelham, 1987) και τα μιτοχόνδρια (TRAP1 ή Hsp75) (Felts et al., 2000). Στην ενεργό της μορφή η Hsp90 είναι διμερές. Στους ανώτερους ευκαρυωτικούς έχουν εντοπιστεί ομοδιμερή α-α και β-β, αλλά και ετεροδιμερή α-

19 ~ 19 ~ β (Nemoto et al., 1996; Perdew et al., 1993). Έχουν περιγραφεί δύο ATP θέσεις πρόσδεσης, η μία εντοπίζεται στη NH2-τελική περιοχή και η άλλη στην COOH-τελική περιοχή, η οποία έχει χαρακτηριστεί ως περιοχή διμερισμού. Η πρόσδεση ΑΤΡ φαίνεται ότι πυροδοτεί το διμερισμό, αλλαγή η οποία πιστεύεται ότι είναι υπεύθυνη για την πρόσδεση με το υπόστρωμα. Η Hsp90 δρα ως ένας ATP-εξαρτώμενος μοριακός συνοδός που σχετίζεται με την αναδίπλωση και την ενεργοποίηση ενός αγνώστου αριθμού υποστρωμάτων - πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων κινασών και μεταγραφικών παραγόντων (Richter & Buchner, 2001). Τα μέλη της οικογένειας Hsp90 είναι μόρια κλειδιά στα κυτταρικά γεγονότα, όπως η αντιγραφή του DNA, η μεταγραφή του RNA, η αναδίπλωση των πρωτεϊνών, η ωρίμανση αυτών αλλά και η μετακίνηση τους κατά μήκος του ενδοπλασματικού δικτύου και των μιτοχονδριακών μεμβρανών, η πρωτεόλυση και η σηματοδότηση των κυττάρων. Ωστόσο, από μόνη της η Hsp90 δεν μπορεί να προωθήσει την αναδίπλωση ή/και την ενεργοποίηση καμιά γνωστής πρωτεΐνης. Για μια πλήρη ενεργότητα απαιτείται η συνεργασία με άλλες Hsps αλλά και μορίων που δρουν επικουρικά στη δράση μιας Hsp (co-chaperons) (Katschinski, 2004). Η οικογένεια Hsp70 Οι οικογένεια Hsp70 περιλαμβάνει υψηλά συντηρημένους μοριακούς συνοδούς που ρυθμίζουν την πρωτεϊνική αναδίπλωση κατά τη διάρκεια φυσιολογικών συνθηκών αλλά και κάτω από συνθήκες στρες (Boorstein et al., 1994). Η οικογένεια Hsp70 αποτελεί την καλύτερα μελετημένη ομάδα των θερμοεπαγόμενων πρωτεϊνών. Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς τα γονίδια των πρωτεϊνών αυτών αποτελούν πολυγονιδιακές οικογένειες των οποίων τα διάφορα μέλη εκφράζονται είτε σε φυσιολογικές συνθήκες είτε σε συνθήκες στρες (Tang et al., 2000; Wu et al., 2001). Οι Hsp70 προωθούν την αναδίπλωση των νεοσυντιθέμενων αλυσίδων στα ριβοσώματα, τη μετακίνηση των πρωτεϊνών κατά μήκος των μεμβρανών και την προστασία σε υψηλές θερμοκρασίες δια μέσου αλληλεπιδράσεων με τις εκτεθειμένες υδροφοβικές επιφάνειες των μη-αναδιπλωμένων ή μερικώς αναδιπλωμένων πρωτεϊνών. Η Hsp70 συγκροτείται από δύο επικράτειες: μία NH2-τελική με δράση ATPασης και μία COOH-τελική η οποία αποτελεί θέση πρόσδεσης των πεπτιδίων. Η τελευταία συγκροτείται από μία περιοχή δομής β-φύλλου και μία α-έλικας, ανάμεσα στις οποίες γίνεται η αλληλεπίδραση με το υπόστρωμα. Πιστεύεται ότι η πρόσδεση του ΑΤΡ στην επικράτεια με δράση ΑΤΡασης πυροδοτεί την απελευθέρωση του υποστρώματος με το να προκαλεί την α- επικράτεια να λυγίζει προς τα πάνω σε μια ευλύγιστη άρθρωση κοντά στο μέσο της μακράς έλικας που εκτίνεται πέρα από το υπόστρωμα. Και εδώ παίζουν σημαντικό ρόλο οι co-chaperons στη ρύθμιση της ενεργότητας της Hsp70 (Huang et al., 2001). Η οικογένεια Hsp60 Η οικογένεια αυτή περιλαμβάνει δύο ομάδες πρωτεϊνών: Η πρώτη ομάδα περιλαμβάνει τις πρωτεΐνες GroEL/GroES (Hsp60/Hsp10), απαντάται στα βακτήρια και στα κυτταρικά οργανίδια των θηλαστικών. Η δεύτερη ομάδα περιλαμβάνει τις TRiC/CCT, απαντάται στο κυτταρόπλασμα των ευκαρυωτικών οργανισμών και εμπλέκεται στις διαδικασίες αναδίπλωσης των πρωτεϊνών του κυτταροσκελετού, όπως είναι η ακτίνη και η τουμπουλίνη. Η Hsp60 απαντάται με τη μορφή ομοπολυμερούς συμπλόκου και παρουσιάζει ενεργότητα ΑΤΡασης, απαραίτητη για τη δράση της ως μοριακός συνοδός (Kaufman, 1999; Nover & Scharf, 1997).

20 ~ 20 ~ Η οικογένεια των μικρών θερμοεπαγόμενων πρωτεϊνών (shps) Οι shps παίζουν ένα πολύ σημαντικό ρόλο στην άμυνα των οργανισμών κατά τη διάρκεια στρεσογόνων καταστάσεων ενώ προστατεύουν τις πρωτεΐνες από τη μη αντιστρεπτή συσσωμάτωση. Οι shps απαντώνται σε αρκετά υποκυτταρικά οργανίδια όπου η ικανότητά τους να προσδένουν στις πρωτεΐνες και να τις προστατεύουν είναι μείζονος σημασίας για το δίκτυο των μοριακών συνοδών. Το μοριακό τους βάρος ποικίλει από kda ενώ συγκροτούν δυναμικά ολιγομερή. Tα shps μονομερή αποτελούνται από μία συντηρημένη επικράτεια α-κρυσταλλίνης η οποία είναι πλούσια σε β-φύλλα (β-sheet sandwich) τα οποία είναι υπεύθυνα για το σχηματισμό των διμερών (εικόνα Α4.2). Μία NH2-τελική περιοχή, η οποία ποικίλει σε μήκος και αλληλουχία, θεωρείται ότι επηρεάζει τον ολιγομερισμό όπως και την δράση των πρωτεϊνών ως μοριακών συνοδών και έρχεται σε επαφή με το ένα άκρο την επικράτειας της α-κρυσταλλίνης. Το άλλο άκρο της συντηρημένης επικράτειας της α-κρυσταλλίνης έρχεται σε επαφή με τη φορτισμένη και ευλύγιστη COOH-τελική περιοχή, η οποία σταθεροποιεί τα ολιγομερή ενώ Εικόνα Α4.2. Σχηματική απεικόνιση της δομής των Hsp27, Hsp22 και αβκρυσταλλίνης του ανθρώπου. Στο σχήμα φαίνεται η NH 2-τελική περιοχή, η COOH-τελική επικράτεια, η WDPF επικράτεια, η επικράτεια α-κρυσταλλίνης καθώς και η θέσεις φωσφορυλίωσης S (serine) και T (threonine) (Acunzo et al., 2012). βοηθά στη διαλυτότητα των shps καθώς και στη δράση αυτών ως μοριακοί συνοδοί (Sun & MacRae, 2005). Η α-κρυσταλλίνη είναι το κύριο συστατικό του φακού του ανθρώπινου οφθαλμού. Οι ισομορφές αα- και αβ-κρυσταλλίνη φαίνεται ότι προλαμβάνουν τις πρωτεΐνες από τον σχηματισμό συσσωματωμάτων. Η αα-κρυσταλλίνη εντοπίζεται αποκλειστικά στον φακό ενώ η αβ- είναι μία πρωτεΐνη που επάγεται με την αύξηση της θερμοκρασίας και εντοπίζεται και σε άλλους ιστούς (Haslbeck et al., 2005). Η αμινοξική αλληλουχία της α-κρυσταλλίνης των θηλαστικών εμφανίζει εξαιρετική ομολογία με αυτή των shsps της Drosophila (εικόνα Α4.3). Η ομόλογη περιοχή ανάμεσα στις shsps και την α-κρυσταλλίνη είναι η ίδια περιοχή για στην οποία οι shsps εμφανίζουν ομολογία μεταξύ τους (Ingolia & Craig, 1982). Εικόνα Α4.3. Σύγκριση των αμινοξικών αλληλουχιών των shsps της Drosophila και της α-κρυσταλλίνης (β2 αλυσίδα) των θηλαστικών (Ingolia & Craig, 1982). Οι shsps φωσφορυλιώνονται και αυτό οδηγεί σε μια αλλαγή της κατάστασης των συγκροτημένων ολιγομερών τους. Σε πειράματα διέγερσης λείου μυός παρατηρήθηκε η φωσφορυλίωση της Hsp20 σε κατάλοιπο σερίνης στο ΝΗ 2 -τελικό άκρο μέσα στην WDPF επικράτεια με αποτέλεσμα τον αποσυγκρότηση των ολιγομερών της συγκεκριμένης πρωτεΐνης. Θεωρείται ότι η φωσφορυλιωμένη Hsp20 αλληλεπιδρά κυρίως με την G-ακτίνη ενώ η αποφωσφορυλιωμένη της μορφή με την F-ακτίνη. Αξίζει να σημειωθεί ότι η πρωταρχική δομή των shsps κοντά στην περιοχή όπου συμβαίνει η φωσφορυλίωση είναι

21 ~ 21 ~ αρκετά συντηρημένη. Η σερίνη 15, θέση επιδεκτική φωσφορυλίωσης, εντοπίζεται στο ΝΗ 2 - τελικό άκρο της WDPF επικράτειας, ενώ οι άλλες δύο θέσεις φωσφορυλίωσης εντοπίζονται σε ποικίλα σημεία στο μόριο κοντά στην επικράτεια α-κρυσταλλίνης. Το μοτίβο WD/EPF που εντοπίζεται στο αμινοτελικό άκρο πολλών shsps, είναι υπεύθυνο για τη διατήρηση της δομής του ολιγομερούς Hsp27 καθώς και τη δραστηριότητα μοριακού συνοδού. Έχει φανεί ότι υπάρχει ομολογία ανάμεσα στα κατάλοιπα γύρω από το μοτίβο WD/EPF της Hsp27 και στο SXXFDPF μοτίβο της Hsp16.9. (Thériault et al., 2004). Η φωσφορυλίωση των Hsp25/Hsp27 οδηγεί στην αποσυγκρότηση των ολιγομερών και στην μείωση της ενεργότητας μοριακού συνοδού. Να σημειωθεί ότι στο S. cerevisiae, σε υψηλές θερμοκρασίες παρατηρείται αποσυγκρότηση των 24-μερών που συγκροτεί η Hsp26 κάτι που οδηγεί στην αύξηση της ενεργότητας μοριακού συνοδού. Αντίθετα στα θηλαστικά, σε αυξημένες θερμοκρασίες οι shsps δημιουργούν συσσωματώματα συγκροτώντας μεγάλα κοκκία διατηρώντας την ενεργότητα μοριακού συνοδού (Gusev et al., 2002). Σε αντίθεση με τις υπόλοιπες Hsps, οι shsps είναι ΑΤΡ-εξαρτώμενοι μοριακοί συνοδοί ικανοί να σχηματίζουν ολιγομερή που μπορούν να φτάσουν και τα 800 kda. Η συγκρότηση αυτών των συμπλόκων είναι αποτέλεσμα αλληλεπίδρασης των επικρατειών α-κρυσταλλίνης δύο μονομερών σχηματίζοντας ένα διμερές. Όπως αναφέρεται στην προηγούμενη παράγραφο, η δυνατότητα ολιγομερισμού και κατ επέκταση η βιολογική δράση των shsps, ρυθμίζεται από την φωσφορυλίωση. Ο ολιγομερισμός των shsps είναι απαραίτητος για την αλληλεπίδραση τους με το υπόστρωμα και την δράση μοριακού συνοδού, αν και ο ρόλος κάθε ολιγομερούς διαφέρει ανάμεσα στις shsps. Μελέτες έχουν φανερώσει ότι οι υπομονάδες της αβ-κρυσταλλίνης δεν μπορούν να αλληλεπιδράσουν με αποδιαταγμένες πρωτεΐνες και ότι οι Hsp22 και Hsp20 δεν σχηματίζουν ποτέ ομο-ολιγομερή (Acunzo et al., 2012). Στη Drosophila, οι τέσσερις shsps (Hsp22, και 27) εμφανίζουν ομοιότητα στην αμινοξική τους αλληλουχία μεγαλύτερη του 50%. Η πιο εκτενής ομολογία παρατηρείται ανάμεσα στις θέσεις 85 έως 195. Μία δεύτερη περιοχή ομολογίας παρατηρείται στα 14 πρώτα αμινοξέα και στις τέσσερις πρωτεΐνες οι οποίες δεν εμφανίζουν καμία ομοιότητα από το αμινοξύ 15 έως το αμινοξύ 84, το ίδιο ισχύει και για το COOH-άκρο. Ο πρωταρχικός ρόλος των shps είναι η πρόσδεση αυτών σε αποδιαταγμένες πρωτεΐνες όπου και αποτρέπουν τη συσσωμάτωσή τους. Οι πρωτεΐνες υποστρώματα πιστεύεται ότι είναι σε τηγμένη (molten) σφαιρική φάση, η αποδιάταξη τους είναι ημιτελής και η δευτεροταγή τους δομή παραμένει. Αν και ο τρόπος δράσης τους δεν έχει καθοριστεί πλήρως, οι shps προσδίδουν στα κύτταρα μία διαδοχικά αυξανόμενη ανεκτικότητα στη θερμότητα καθώς και σε άλλες καταστάσεις στρες. Το αποτέλεσμα είναι ότι η επιβίωση κάτω από συνθήκες στρες ενισχύεται, πιθανότατα επειδή αποτρέπεται η μη αντιστρεπτή συσσωμάτωση των αποδιαταγμένων πρωτεϊνών. Παραμένει ένα ενδιαφέρον θέμα το πώς το τελευταίο σχετίζεται με ένα ευρύ φάσμα δραστηριοτήτων των shps συμπεριλαμβανομένων τη μετάδοση σήματος, τη μορφοποίηση του κυτταροσκελετού, την απόπτωση, την καρκινική αύξηση, την ανάπτυξη, τη παθογένεια λόγω βακτηρίων και τη διάπαυση (MacRae, 2000). Στο έντομο D. melanogaster οι τέσσερις κύριες shsps (Hsp22, Hsp23, Hsp26 και Hsp27) όπως αναφέρθηκε, φέρουν σημαντικές ομολογίες στην αλληλουχία τους (Ingolia & Craig, 1982) και εκφράζονται συντονισμένα ύστερα από στρες, αλλά διαφέρουν στο αναπτυξιακό πρότυπο έκφρασης και στον ενδοκυτταρική τους εντοπισμό (Southgate et al., 1983; Michaud et al., 1997, 2002). Υπερέκφραση των παραπάνω shps επέκτειναν τη διάρκεια ζωής της Drosophila καθώς και αύξησαν την αντίσταση στο στρες των μυγών (Seong et al., 2001; Morrow et al., 2004a; Wang et al., 2004), ενώ η απουσία της Hsp22 είχε ως αποτέλεσμα την

22 ~ 22 ~ ελάττωση της διάρκειας ζωής του εντόμου (Morrow et al., 2004b). Στον άνθρωπο και στο ποντίκι έχουν βρεθεί μέχρι στιγμής δέκα shps, με κριτήριο χαρακτηρισμού τους την ύπαρξη της επικράτειας α-κρυσταλλίνης (Kappe et al., 2003). Η σύγχρονη κατηγοριοποίηση των Hsps στον άνθρωπο περιλαμβάνει τις παρακάτω ομάδες: HSPH (παλαιότερο όνομα, Hsp110), HSPC (Hsp90), HSPA (Hsp70), HSPD/E (Hsp60/Hsp10) και CCT (TRiC), DNAJ (Hsp40), και HSPB (shsps) (Mymrikov et al., 2011). Η υπεροικογένεια των α-shsps Η α-κρυσταλλίνη έγινε γνωστή το 1894, από τον ερευνητή Mörner, ως μία μεγάλη δομική πρωτεΐνη στο φακό του οφθαλμού των σπονδυλωτών. Το 1982 βρέθηκε ότι οι shsps της Drosophila μοιράζονται εντυπωσιακές ομοιότητες στην αλληλουχία τους με την α- κρυσταλλίνη (εικόνα Α4.3) αντικατοπτρίζοντας ένα κοινό εξελικτικό πρόγονο (Ignolia et al., 1982). Η αβ-κρυσταλλίνη (ABCRY) ή HspB5, είναι μία πρωτεΐνη 175 αμινοξέων και μοριακής μάζας 22 kda, η οποία ανήκει στις α-κρυσταλλίνες. Οι τελευταίες αποτελούν υποομάδα των κρυσταλλινών, μιας πρωτεϊνικής οικογένειας που περιλαμβάνει τις α-, β- και γ-κρυσταλλίνες. Υπάρχουν δύο μορφές α-κρυσταλλινών, η αα- και η αβ-, οι οποίες κωδικοποιούνται από δύο διαφορετικά γονίδια και εμφανίζουν μεγάλο βαθμό ομολογίας (Bhat & Nagineni, 1989; Iwaki et al., 1989). Η αβ-κρυσταλλίνη απαντάται σε σημαντικά επίπεδα εκτός από τον φακό του οφθαλμού, στην καρδιά και στον γραμμωτό μυ (Bhat & Nagineni, 1989). Το γεγονός ότι η αβ-κρυσταλλίνη μπορεί να επαχθεί από την θερμοκρασία και άλλους στρεσογόνους παράγοντες, καθώς και το ότι προσδίδει θερμοανθεκτικότητα στα κύτταρα, όπως και οι shsps, φανερώνει τη σημασία της σε επίπεδο φυσιολογίας (Sax et al., 1994). Τελικά, εξαιτίας του ότι η α-κρυσταλλίνη εμφανίζει την ικανότητα να αποτρέπει την αποδιάταξη των πρωτεϊνών (Horwitz, 1992), έχει αναγνωριστεί ως μοριακός συνοδός. Συνέπεια όλων αυτών είναι ότι πλέον η α-κρυσταλλίνη θεωρείται αντιπροσωπευτικό μέλος της ολοένα αυξανόμενης οικογένειας των shsps (de Jong et al., 1998). Τα μέλη της υπεροικογένειας α-κρυσταλλίνης shsps χαρακτηρίζονται από την παρουσία μιας ομόλογης αλληλουχίας κατάλοιπων, την επικράτεια της α-κρυσταλλίνης. Πρέπει ωστόσο να αναφερθεί ότι δεν ανήκουν όλες οι shsps σε αυτή την υπεροικογένεια. Συνηθίζεται να χρησιμοποιείται ο συμβολισμός α-hsp για την περιγραφή των shsps της υπεροικογένειας. Πολλά από τα α-shsp γονίδια, από τους προκαρυωτικούς οργανισμούς έως και τους ανώτερους ευκαρυωτικούς, εκφράζονται ιδιοσυστατικά σε χαμηλά επίπεδα ενώ παρατηρείται μία ανοδική ρύθμιση κάτω από συνθήκες στρες. Πολλά άλλα α-shsp γονίδια δεν μπορούν να επαχθούν από παράγοντες εξωγενούς στρες. Ρυθμίζονται αναπτυξιακά, εκφράζονται σε συγκεκριμένα στάδια και σε συγκεκριμένους κυτταρικούς τύπους, ενώ υπάρχει η υπόθεση ότι σχετίζονται με τη φυσιολογική αύξηση και ανάπτυξη του οργανισμού. Επομένως, η πρωταρχική λειτουργία της υπεροικογένειας γίνεται φανερή: να βοηθάει το κύτταρο στην επιβίωση του κάτω από συνθήκες στρες, είτε πρόκειται για παροδικό είτε για συνεχές, εξωγενές ή ενδογενές. Ο μηχανισμός λειτουργίας της προστατευτικής αυτής δράσης των α-shsps έναντι στρεσογόνων καταστάσεων θεωρείται ότι σχετίζεται με την in vitro δράση τους ως μοριακοί συνοδοί. Η ικανότητα σταθεροποίησης αποδιαταγμένων πρωτεϊνών, που πρώτα δείχθηκε στην α-κρυσταλλίνη (Horwitz, 1992) και στην Hsp27 των θηλαστικών (Merck et al., 1993; Jakob et al., 1993), τώρα είναι γνωστό ότι ισχύει για τις α-shsps ενός αριθμού οργανισμών. Επομένως η τάση των α-shsps να συσχετίζονται με τις αποδιαταγμένες πρωτεΐνες καθυστερώντας έτσι το σχηματισμό αδιάλυτων συσσωματωμάτων πρέπει να είναι μια αρχέγονη λειτουργία αυτών. Η ανάμιξη των α-shsps με τη σταθεροποίηση και την αναδιοργάνωση των κυτταροσκελετικών δομών στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς (Boelens & de Jong, 1995; Ehrnsperger et al., 1997) πρέπει να ανέρχεται από μία προγονική δραστηριότητα μοριακού συνοδού (de Jong et al., 1998).

23 ~ 23 ~ Εκτός από τον πρωταρχικό τους ρόλο ως μοριακοί συνοδοί καθώς και τους δομικούς τους ρόλους, οι α-shsps είναι πιθανό να έχουν επιπρόσθετες λειτουργίες που αφορούν τη ρύθμιση και τη σηματοδότηση κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης κάτω από φυσιολογικές ή στρεσογόνες συνθήκες (Boelens & de Jong, 1995; Ehrnsperger et al., 1997). Αυτό προτείνεται λόγω της διακριτής αναπτυξιακής ρύθμισης των α-shsps σε διάφορους οργανισμούς, από τους προκαρυωτικούς οργανισμούς μέχρι τα θηλαστικά, μέσω της αντιστρεπτής φωσφορυλίωσης και της μετατόπισης των διαφόρων α-shsps καθώς και τον συσχετισμό τους στην απόπτωση (Mehlen et al., 1996; Samali et al., 1996). Αυτό που γίνεται αντιληπτό μελετώντας εξελικτικά τις α-shsps, είναι ότι τα περισσότερα μέλη αυτής της υπεροικογένειας έχουν την τάση να σχηματίζουν ολιγομερή, έχουν δραστηριότητα μοριακών συνοδών και φέρουν συντηρημένες αλληλουχίες στο COOHτελικό άκρο της επικράτειας της α-κρυσταλλίνης. Η δευτεροταγή δομή της επικράτειας αυτής είναι υψηλά συντηρημένη και αποτελείται από δυο υδρόφοβα μοτίβα πλούσια σε δομές β-φύλλου, τα οποία διαχωρίζονται μεταξύ τους με μια υδρόφιλη περιοχή η οποία μερικές φορές έχει δομή α-έλικας και η ποικίλει σε μέγεθος. Η COOH-τελική περιοχή της αα-κρυσταλλίνης έχει τη τάση να σχηματίζει διμερή ή τετραμερή και δεν εμφανίζει δραστηριότητα μοριακού συνοδού. Υπάρχουν ενδείξεις ότι μία ποικίλη NH 2 -τελική περιοχή και μία υδρόφιλη COOH-τελική περιοχή είναι σημαντικές για τον ολιγομερισμό και τη δραστηριότητα μοριακού συνοδού. Φαίνεται δηλαδή ότι για τη δραστηριότητα μοριακού συνοδού είναι απαραίτητο το ευλύγιστο COOH-τελικό άκρο. Η υδρόφιλη ουρά είναι πολύ πιθανό σημαντική για να διατηρεί τα σύμπλοκα των μοριακών συνοδών και για την πρόσδεση των πρωτεϊνών. Επίσης, σημαντικό ρόλο φαίνεται να έχει το NH 2 -τελικό άκρο στην αλληλεπίδραση με τις εκτεθειμένες υδρόφοβες περιοχές των αποδιαταγμένων πρωτεϊνών (de Jong et al., 1998). 5. Τα υποστρώματα των shsps Οι μερικώς αποδιαταγμένες πρωτεΐνες βρίσκονται σε μία ασταθή, σφαιρική, τηγμένη κατάσταση, προσδένονται με τις shsps οπότε και καταστέλλεται η μη αντιστρεπτή συσσωμάτωση (Carver et al., 2002; Lindner et al., 2001). Οι shsps τείνουν να μην αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες που βρίσκονται στη φυσιολογική τους κατάσταση, με πρωτεΐνες που είναι ολοκληρωτικά αποδιαταγμένες ή με πρωτεΐνες που βρίσκονται σε σταθερή, μονομερή κατάσταση (Lindner et al., 2001; Treweek et al., 2000). Τα υποστρώματα ποικίλουν από πεπτίδια σε ολιγομερείς πρωτεΐνες χωρίς να παίζει ρόλο η αλληλουχία ή η δομή, και επειδή το πιο πιθανό είναι ότι τουλάχιστον μία πρωτεΐνη-στόχος προσδένεται ανά υπομονάδα, οι shsps αποτρέπουν την αποδιάταξη αποτελεσματικά (Haslbeck et al., 1999; Lee et al., 1997). Τα υποστρώματα απελευθερώνονται από τις shsps με τον τερματισμό του στρεσογόνου παράγοντα. Οι shsps σχετίζονται με τα μικρονημάτια, τα ενδιάμεσα νημάτια και τους μικροσωληνίσκους, δηλαδή με τα κυτταροσκελετικά στοιχεία των ευκαρυωτικών κυττάρων, με το να διατηρούν και να αναδιαμορφώνουν το κυτταροσκελετό (Sun & MacRae, 2005). Η αύξηση της έκφρασης της αβ-κρυσταλλίνης οδηγεί στη σταθεροποίηση της πρωτεΐνης GFAP των νηματίων, ενώ οι Hsp27 και αβ-κρυσταλλίνη αλληλεπιδρούν με τα ενδιάμεσα ινίδια αποτρέποντας έτσι τη δημιουργία πηκτώματος με το να εμποδίζεται η αλληλεπίδραση των ενδιάμεσων ινιδίων μεταξύ τους και ρυθμίζοντας την τοπολογική τους οργάνωση (Perng et al., 1999a, 199b). Επιπρόσθετα, η σχέση ανάμεσα στις shsps, στην ακτίνη και στα μικροϊνίδια έχει μελετηθεί πολύ καλά όπου φαίνεται ότι η φωσφορυλίωση παίζει πολύ

24 ~ 24 ~ σημαντικό ρόλο (Mounier & Arrigo, 2002). Για παράδειγμα, η μονομερής, μη φωσφορυλιωμένη Hsp27 περιβάλλει την ακτίνη και αναστέλλει το σχηματισμό μικροϊνιδίων, ενώ τα φωσφορυλιωμένα μονομερή και τα μη φωσφορυλιωμένα πολυμερή δεν επηρεάζουν τον πολυμερισμό της ακτίνης (Benndorf et al., 1994). Οι shsps αλληλεπιδρούν και με τις μεμβράνες. Ένα ποσοστό της α-κρυσταλλίνης του φακού βρίσκεται στη πλασματική μεμβράνη (Cobb & Petrash, 2000), κάτι που υποδηλώνει πως η διατήρηση των μεμβρανών, οι οποίες είναι από τα πιο ευαίσθητα στο στρες κυτταρικά συστατικά, είναι μία σημαντική λειτουργία των shsps (Narberhaus, 2002). Η Hsp17 ρυθμίζει τη φυσική κατάσταση των θυλακοειδών μεμβρανών, ενώ οι Hsp17 και α-κρυσταλλίνη σε συνδυασμό με μοριακούς συνοδούς όπως είναι ο GroEL, πιθανόν ρυθμίζουν τη ρευστότητα της μεμβράνης σταθεροποιώντας την υγρή φάση της κρυσταλλίνης και χαμηλώνοντας τη θερμοκρασία κατά την οποία επάγεται η υπερ-ρευστότητα της μεμβράνης (Sun & MacRae, 2005). Οι Ηsp27 και α-κρυσταλλίνη προσδένονται στους πυρηνίσκους και σε ενδοπυρηνικές δομές, όπου πιστεύεται ότι ρυθμίζουν μοριακές διαδικασίες ή ότι προστατεύουν πρωτεΐνες. Λειτουργικές σχέσεις ανάμεσα στις shsps και στα νουκλεϊκά οξέα φάνηκαν σε πειράματα όπου η α-κρυσταλλίνη φαίνεται να αναγνωρίζει και να προσδένεται στη διπλή έλικα του DNA, ενώ οι shsps πιθανόν να προστατεύουν το mrna κατά τη διάρκεια του στρες. Είναι προφανές ότι οι shsps αλληλεπιδρούν με πολύ σημαντικά μόρια σε διαφορετικά κυτταρικά διαμερίσματα και διαφορετικές κυτταρικές διαδικασίες. Η παρουσία των shsps είναι λοιπόν μείζονος σημασίας για όλους τους οργανισμούς, είτε ως πρώτη γραμμή άμυνας κατά τη διάρκεια του στρες ή ως σημαντικά στοιχεία κυτταρικών διαδικασιών κάτω από φυσιολογικές συνθήκες (Sun & MacRae, 2005). 6. Το αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρο των shsps Ο ολιγομερισμός των shsps όπως και η δράση τους ως μοριακοί συνοδοί επηρεάζονται από το ΝΗ 2 -τελικό άκρο σε αρκετές, αλλά όχι σε όλες shsps. Το ΝΗ 2 -τελικό τους άκρο είναι επιδεκτικό φωσφορυλίωσης και έχει δειχθεί ότι έχει μία χαλαρή εκτεθειμένη δομή (Sun & MacRae, 2005). Σε πειράματα όπου απομακρύνθηκαν 19 ΝΗ 2 -τελικά κατάλοιπα από την αακρυσταλλίνη δεν εμφανίστηκε κάποια σοβαρή επίδραση στην τεταρτοταγή της δομή, ενώ αφαιρώντας 56 ή περισσότερα ΝΗ 2 -τελικά κατάλοιπα ελαττώνονται τα ολιγομερή σε μονάδες των 3-4 μονομερών και περιορίζονται σημαντικά οι αντιδράσεις ανταλλαγής, υποδεικνύοντας σημαντικές λειτουργίες για τα κατάλοιπα (Bova et al., 2000). Πειράματα έδειξαν ακόμη ότι ο ολιγομερισμός της αβ-κρυσταλλίνης εξαρτάται από το ΝΗ 2 - τελικό άκρο της (Feil et al., 2001). Απομακρύνοντας 11 κατάλοιπα από το ΝΗ 2 -τελικό άκρο της μικρής θερμοεπαγόμενης πρωτεΐνης IbpB του βακτηρίου Escherichia coli έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό διμερών και την απώλεια της δραστηριότητας μοριακού συνοδού (Jiao et al., 2005). Για ορισμένες shsps το ΝΗ 2 -τελικό τους άκρο επηρεάζει τις αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στα μονομερή, ενώ η περιοχή αυτή δεν επαρκεί για τον ολιγομερισμό. Όμως σε μία τουλάχιστον περίπτωση ένα ΝΗ 2 -τελικό έλλειμμα της Hsp16.5 του Methanococcus jannaschii δείχνει ότι η περιοχή δεν έχει κάποιο κύριο ρόλο στη διατήρηση των ολιγομερών αλλά βοηθά στην οργάνωση των μονομερών πριν τον ολιγομερισμό. Σε αυτό το μοντέλο, το υδρόφοβο ΝΗ 2 -τελικό άκρο φέρει τις επικράτειες της α-κρυσταλλίνης σε στενή εγγύτητα για μία αρκετά μεγάλη έκταση ώστε να ενισχύεται η σύνδεση των ολιγομερών. Έχει γίνει η υπόθεση ότι τα ΝΗ 2 -τελικά άκρα όλων των shsps ενθαρρύνουν τον ολιγομερισμό με το να τοποθετούν τα μονομερή με τέτοιο τρόπο ώστε να υποκινούνται σταθερές αλληλεπιδράσεις ανάμεσα σε άλλες περιοχές των μορίων. Ακόμη,

25 ~ 25 ~ πιστεύεται ότι τα ΝΗ 2 -τελικά άκρα των περισσότερων shsps σχετίζονται με λειτουργίες που αφορούν τη συγκράτηση των μονομερών σε δυναμικά συμπλέγματα (Sun & MacRae, 2005). Το COOH-τελικό άκρο των shsps είναι μια ευλύγιστη περιοχή εμπλουτισμένη με πολικά και φορτισμένα αμινοξικά κατάλοιπα. Η αφαίρεση 11 αμινοξέων από το COOH-τελικό άκρο της θερμοεπαγόμενης πρωτεΐνης IbpB του βακτηρίου E. coli οδηγεί στο σχηματισμό διμερών και στην απώλεια της δραστηριότητας μοριακού συνοδού (Jiao et al., 2005). Προοδευτικό έλλειμμα του COOH-τελικού άκρου της αα-κρυσταλλίνης, ανθρώπου και ποντικού, μείωσε δραματικά τον ολιγομερισμό και προσάρμοσε την τεταρτοταγή δομή, με το που αφαιρέθηκαν και τα 11 ή και περισσότερα αμινοξέα, με τη μάζα του ολιγομερούς να μειωθεί από τα 550 στα 150 kda (Thampi & Abraham, 2003). Η αργινίνη 163, το 11ο κατάλοιπο από το COOHτελικό άκρο, πιθανόν να είναι ιδιαιτέρως σημαντική επειδή ο ολιγομερισμός μειώνεται με το που αφαιρεθεί. Η απομάκρυνση λιγότερων από 10 καταλοίπων είτε βελτιώνουν ελαφρώς τη δραστηριότητα μοριακού συνοδού είτε επιβάλλουν μικρές επιβλαβείς επιδράσεις και αυτό έρχεται σε συμφωνία με πειράματα όπου ο ολιγομερισμός της αα-κρυσταλλίνης δεν επηρεάστηκε από την αφαίρεση 10 αμινοξικών καταλοίπων από το COOH-τελικό άκρο. Απομακρύνοντας 11 κατάλοιπα από το COOH-τελικό άκρο της αα-κρυσταλλίνης παρατηρούνται μέτριες βλάβες στη δραστηριότητα μοριακού συνοδού ενώ ελλείμματα μεγαλύτερου μήκους έχουν σοβαρές συνέπειες (Bova et al., 2000). Έλλειμμα 17 αμινοξικών καταλοίπων του COOH-τελικού άκρου στην ανθρώπινη αα-κρυσταλλίνη έχει ως αποτέλεσμα την ελάττωση της διαλυτότητάς της και την παραγωγή μεγαλύτερων από το φυσιολογικό ολιγομερών (Andley et al., 1996). Με την τεχνική της φασματομετρίας μάζας διαπιστώνεται ότι η αφαίρεση 5 COOH-τελικών καταλοίπων από την αα-κρυσταλλίνη, ελαττώνει την κατά μέσο όρο μοριακή μάζα του ολιγομερούς από 540 kda σε 440 kda, αλλά δεν επηρεάζεται η δραστηριότητα μοριακού συνοδού (Aquilina et al., 2005). Μελέτες στα COOH-τελικά άκρα των αα- και αβ-κρυσταλλινών αποκάλυψαν ότι η ελαστικότητα του COOH-τελικού άκρου είναι σημαντική για τη δραστηριότητα μοριακού συνοδού (Linder et al., 2000). Η εισαγωγή ενός υδρόφοβου κατάλοιπου, όπως είναι η τρυπτοφάνη, στο COOHτελικό άκρο της αα-κρυσταλλίνης, ελαττώνει την ελαστικότητα της πρωτεΐνης, τη διαλυτότητα καθώς και τη θερμοσταθερότητά της (Derham et al., 2001; Smulders et al., 1996). Το COOH-τελικό άκρο φέρει ένα σχετικά καλά συντηρημένο V/IXI/V μοτίβο. Με απομάκρυνση είτε 5 είτε 15 αμινοξικών καταλοίπων από την ακραία περιοχή του COOHτελικού άκρου της HspH του Bradyrhizobium japonicum αφήνει το μοτίβο V/IXI/V ανέγγιχτο. Αφαιρώντας ωστόσο 15 κατάλοιπα από το COOH-τελικό άκρο έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό μεγαλύτερων ολιγομερών από εκείνα που φυσιολογικά σχηματίζονται. Απώλεια 20 COOH-τελικών καταλοίπων, συμπεριλαμβανομένου και του μοτίβου V/IXI/V, οδηγεί στην ολοκληρωτική καταστροφή της δραστηριότητας μοριακού συνοδού της HspH ενώ παρεμποδίζει στο σχηματισμό του ολιγομερούς (Studer et al., 2002). Ενδιαφέρον αποτελεί το ότι η Hsp22 ποντικού, με ΝΗ 2 -τελικό και COOH-τελικό άκρο συγκρίσιμο σε μήκος με τις περισσότερες από τις shsps, δεν φέρει το μοτίβο V/IXI/V και υπάρχει ως μονομερές, κάτι που υποδηλώνει κάποιο ρόλο του μοτίβου στον ολιγομερισμό (Chowdary, 2004). Εν κατακλείδι, το ποικίλο, υψηλά ελαστικό COOH-τελικό άκρο διατηρεί τη διαλυτότητα και τη σταθερότητα των shsps, τη δραστηριότητα μοριακού συνοδού, καθώς και τη διαλυτότητα του συμπλόκου shsp-υπόστρωμα, αλλά το πιο πιθανό είναι ότι δεν εμφανίζει κάποιο άμεσο ρόλο στην πρόσδεση του υποστρώματος. Ωστόσο, το COOH-τελικό άκρο αναμφισβήτητα συμβάλλει στη δραστηριότητα μοριακού συνοδού και μάλιστα παίζει πολύ σημαντικό ρόλο (Sun & MacRae, 2005).

26 ~ 26 ~ 7. Ο ολιγομερισμός των shsps Τα μέλη της οικογένειας των shsps παρουσιάζουν παρόμοιες λειτουργίες, ωστόσο συγκροτούν ένα μορφολογικό συνεχές δυναμικών πολυμερών με διαφορετική συμμετρία (εικόνα Α7.1). Πολλές shsps εμφανίζουν μια σφαιρική ή δακτυλιοειδή δομή αποκαλύπτοντας κεντρικές κοιλότητες. Ο ολιγομερισμός είναι απαραίτητος για την πρόσδεση του υποστρώματος και για τη δραστηριότητα μοριακού συνοδού, αν και ο ρόλος των ολιγομερών ποικίλει μεταξύ των shsps. Αντίθετα, οι ανθρώπινες Hsp22 και Hsp20 δεν σχηματίζουν ποτέ ομο-ολιγομερή, όμως in vitro εμφανίζουν δραστηριότητα μοριακού συνοδού. Επιπλέον, τα shsps ολιγομερή είναι δυναμικά με τη σύνδεσή/αποσύνδεσή τους να διαφέρει ανάλογα με την ηλικία του ιστού, τη θερμοκρασία, το ph, την ιοντική δύναμη, τη φωσφορυλίωση και τη συγκέντρωση της πρωτεΐνης. Η ανταλλαγή των υποστρωμάτων συμβαίνει ανάμεσα στα ολιγομερή, είτε των ίδιων είτε διαφορετικών shsps, ενώ ο ρυθμός της ανταλλαγής ποικίλει ανάλογα με τις διαφορετικές συνθήκες που παρατηρείται η δραστηριότητα μοριακού συνοδού. Η αποσταθεροποίηση του ολιγομερούς αυξάνει την υδρόφοβη επιφάνεια που είναι διαθέσιμη για τη δραστηριότητα μοριακού συνοδού, είτε με την ανακατανομή των υπομονάδων των ολιγομερών με σταθερό μέγεθος όπου τροποποιείται όμως το μέγεθος του συμπλόκου είτε αλλάζοντας τη διαμόρφωση των μονομερών (Sun & MacRae, 2005). Η ανταλλαγή των υπομονάδων αυξάνει τη διαθέσιμη υδρόφοβη επιφάνεια ενώ οι υπομονάδες που απελευθερώνονται μπορούν να δράσουν και μόνες τους με τα κατάλληλα υποστρώματα, πριν σχηματίσουν νέα σύμπλοκα. Μερικοί από αυτούς τους συνδυασμούς είναι πιο πιθανό να συμβούν κατά την έκθεση των κυττάρων σε δυσμενείς συνθήκες καθώς οι δομικές αλλαγές που συμβαίνουν λόγω στρες επηρεάζουν το πακετάρισμα των υπομονάδων σε ολιγομερή οδηγώντας τα σε ενισχυμένα μονομερή. Επιπλέον, η ανταλλαγή υπομονάδων σε κανονικές θερμοκρασίες θεωρείται ότι προετοιμάζει τις shsps για δραστηριότητες όπως είναι η ρύθμιση του κυτταροσκελετού και η προστασία από την απόπτωση καθώς και ότι παρέχει μια ταχεία απάντηση στις αλλαγές που συμβαίνουν στα κύτταρα ύστερα από έκθεση σε στρες (Wintrode et al., 2003). Εικόνα Α7.1. Οι shsps βρίσκονται σε ισορροπία ανάμεσα στις ολιγομερείς δομές τους και στην αναταλλαγή υπομονάδων. Βρίσκονται σε δύο καταστάσεις, με χαμηλή και υψηλή συγγένεια υποστρώματος αντίστοιχα. Κατά το θερμικό στρες η ισορροπία μετακινείται προς την κατάσταση υψηλής συγγένειας όπου και σχηματίζεται ένα σταθερό σύμπλοκο με τα υποστρώματα, όπως είναι οι πρωτεΐνες των οποίων η σωστή αναδίπλωση διαταράσσεται κατά το θερμικό στρες. Το σταθερό σύμπλοκο shsps-υπόστρωμα προλαμβάνει την μη αντιστρεπτή συσσωμάτωση και διευκολύνει την επαναδιαλυτοποίηση των συσσωματωμένων πρωτεϊνών δια μέσου του συστήματος μοριακών συνοδών (Tyedmers et al., 2010).

27 ~ 27 ~ 8. Τα μικρά θερμοεπαγόμενα γονίδια στο έντομο Drosophila melanogaster Τα shsp γονίδια του εντόμου D. melanogaster βρίσκονται σε συστάδα μέσα σε ένα τμήμα 12 kb στην περιοχή 67Β του αριστερού βραχίονα του τρίτου χρωμοσώματος. Κάθε ένα από αυτά τα γονίδια συγκροτούν ένα ανοιχτό αναγνωστικό πλαίσιο. Η ανάλυση της αλληλουχίας αποκαλύπτει τρεις μεγάλες ομόλογες επικράτειες ανάμεσα στις shsps (εικόνα Α8.1) (Michaud et al., 1997). Η κυρίαρχη πρόκειται για επικράτεια ομόλογη με την επικράτεια της α-κρυσταλλίνης των θηλαστικών, εντοπίζεται στο COOH-τελικό άκρο και συγκροτείται από 80 αμινοξέα (Ingolia et al., 1982). Ακριβώς καθοδικά από αυτή τη περιοχή βρίσκεται μία επικράτεια 25 αμινοξέων, συντηρημένη σε όλες τις shsps (Southgate et al., 1983). Δεν έχει βρεθεί κάποια γνωστή λειτουργία μέχρι τώρα για τη συγκεκριμένη περιοχή. Τέλος, μία πολύ υδρόφοβη ΝΗ 2 -τελική επικράτεια 15 αμινοξέων εντοπίζεται σε όλες τις shsps, με εξαίρεση την Hsp22. Η επικράτεια αυτή φαίνεται ότι παίζει κάποιο ρόλο στις αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στη πρωτεΐνη και στη μεμβράνη (Arrigo & Pauli, 1988). Εικόνα Α8.1. Δομή και επικράτειες των shsps του εντόμου D. melanogaster (Michaud et al., 1997). Η ιδανική θερμοκρασία επαγωγής των shsp γονιδίων είναι οι 35 C. Τα shsp γονίδια δεν φέρουν ιντρόνια. Όλοι οι υποκινητές των shsp γονιδίων φέρουν στοιχεία απόκρισης στο θερμικό στρες (HSEs, heat shock elements), αλληλουχίες απαραίτητες για την θερμοεπαγόμενη έκφραση (εικόνα Α8.2). Στο γονίδιο hsp27 εντοπίζονται σημαντικές περιοχές για την απόκριση στο θερμικό στρες μέχρι kb ανοδικά του γονιδίου. Ακόμη εντοπίζονται δευτερεύουσες αλληλουχίες που σχετίζονται με την θερμοεπαγόμενη έκφραση στις περιοχές -986 έως -337 και -445 έως -227 (Hoffman & Corces, 1986; Michaud et al., 1997). Το γονίδιο hsp26 φέρει εφτά διαφορετικά HSEs και το hsp23 φέρει σημαντικές αλληλουχίες για την σωστή θερμοεπαγόμενη έκφραση του στην περιοχή -145 έως -132 και ένα στοιχείο ανοδικά στο Το γονίδιο hsp22 φέρει δύο στοιχεία, εκ των οποίων το ένα είναι υπεύθυνο για την μεταγραφική ενεργοποίηση μετά το θερμικό στρες, ενώ το άλλο επιτρέπει την μετάφραση του mrna κάτω από συνθήκες θερμικού στρες (Michaud et al., 1997). Εικόνα Α8.2. Σχηματική αναπαράσταση των υποκινητών των shsp γονιδίων της D. melanogaster (Michaud et al., 1997).

28 ~ 28 ~ Έκφραση των shsps κατά την ανάπτυξη της Drosophila Το 1983 οι Cheney και Shearn ήταν οι πρώτοι που παρατήρησαν την παρουσία της Hsp23 στους εμβρυικούς δίσκους (imaginal disks) στο τρίτο στάδιο της προνύμφης Drosophila απουσία στρες. Έκτοτε έχει γίνει γνωστό ότι όλες οι shsps του εντόμου εκφράζονται κάτω από φυσιολογικές συνθήκες. Γενικά, τα επίπεδα της έκφρασης των shsps κατά την εμβρυογένεση και μεταμόρφωση είναι χαμηλότερα από αυτά που παρατηρούνται κάτω από συνθήκες στρες. Ενδιαφέρον αποτελεί το γεγονός ότι το αναπτυξιακό πρότυπο κάθε shsp διαφέρει στα διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια. Στη Drosophila, οι shsps εμφανίζουν μοναδικά πρότυπα έκφρασης τα οποία διαφοροποιούνται όχι μόνο στα διαφορετικά αναπτυξιακά στάδιά αλλά και στους διαφορετικούς ιστούς. Κάτι τέτοιο φαίνεται να ισχύει και παρουσία θερμικού στρες όπου η απόκριση στους διάφορους ιστούς και η επαγόμενη έκφραση των shsps είναι διαφορετική (Southgate et al., 1983; Joanisse et al., 1998; Michaud et al., 1997, 2002). Η Hsp22 είναι η λιγότερο κοινή shsp, συγκριτικά με τις άλλες τέσσερις, κατά την ανάπτυξη της Drosophila. Εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια και φαίνεται ότι τα επίπεδα του mrna της μειώνονται στο στάδιο της πρώιμης νύμφης (γνωστό και ως white pupae) όπως και στο στάδιο της ενδιάμεσης νύμφης (midpupae) (Mason et al., 1984). Αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης, 8 έως 10 φορές, παρατηρείται στα ενήλικα ηλικίας ημερών στην περιοχή του θώρακα πιθανότατα μέσα στα πλαίσια της διαδικασίας της γήρανσης. Η πρωτεΐνη εντοπίζεται στον εγκέφαλο ενηλίκων ηλικίας 5-10 ημερών (Joanisse et al., 1998). Η Hsp23 εντοπίζεται φυσιολογικά στο κυτταρόπλασμα και ιστολογικά παρατηρείται σε διάφορους ιστούς. Πειράματα έχουν δείξει ότι η Hsp23 είναι ελάχιστα ανιχνεύσιμη στους εμβρυικούς δίσκους και στο λιπαρό σώμα (fat body) των προνυμφών. Τα επίπεδα έκφρασής της αυξάνονται στο τέλος του τρίτου σταδίου της προνύμφης κάτι το οποίο ταυτίζεται με την αύξηση των επιπέδων της εκδυσόνης. Αυτό πιθανόν να σημαίνει ότι η έκφραση της επάγεται από την εκδυσόνη, υπόθεση η οποία έχει επαληθεύει (Cheney & Shearn, 1983). Σε αυτό το στάδιο, ιστολογικά εντοπίζεται στους σιελογόνους αδένες (Arrigo et al., 1981). Βρίσκεται στο έμβρυο (Haass et al., 1990) ενώ τα επίπεδα της πρωτεΐνης όπως και του mrna της αυξάνονται κατά την βομβυκίωση. Στα ενήλικα, η πρωτεΐνη βρίσκεται σε πολύ μειωμένα επίπεδα σε κύτταρα του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) και στις γονάδες. Αξίζει να σημειωθεί ότι στο κεφάλι και στους όρχεις εντοπίζεται με δύο διαφορετικές ισομορφές αντίστοιχα ενώ στις ωοθήκες υπάρχει σε μία μορφή (Joanisse et al., 1998). Η Hsp26, όπως και η Hsp23, είναι κυτταροπλασματική πρωτεΐνη. Τα επίπεδα της αυξάνονται φυσιολογικά στο πρώιμο έμβρυο (Haass et al., 1990), ενώ η έκφρασή της μειώνεται στο ώριμο έμβρυο. Στα ενήλικα εντοπίζεται στις γονάδες και σε χαμηλότερα επίπεδα στον εγκέφαλο. Το mrna της υπάρχει στο επιθήλιο, στο κοιλιακό γάγγλιο της προνύμφης, στα τροφοκύτταρα και στα αναπτυσσόμενα ωοκύτταρα. Η πρωτεΐνη παρατηρείται στο επιθήλιο και στα τροφοκύτταρα, ενώ ακόμη βρίσκεται στα σπερματοκύτταρα, στους εμβρυικούς δίσκους και στα νευροκύτταρα (Joanisse et al., 1998). Η Hsp27 στη Drosophila βρίσκεται σε ένα πλήθος ιστών και κυτταρικών τύπων κατά την ανάπτυξη. Εντοπίζεται κατά την εμβρυογένεση στο στάδιο του προβλαστοδέρματος και βλαστοδέρματος και η έκφρασή της μειώνεται κατά την διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης (Pauli et al., 1990). Η έκφρασή της στο στάδιο της προνύμφης περιορίζεται στο ΚΝΣ και στις γονάδες. Στο τρίτο στάδιο της προνύμφης εντοπίζεται στους εμβρυικούς δίσκους και, όπως η Hsp23, η έκφρασή της συσχετίζεται με την αύξηση του τίτλου της εκδυσόνης. Στα μέσα της ανάπτυξης της νύμφης δεν παρατηρείται καθόλου mrna και τα επίπεδα της πρωτεΐνης

29 ~ 29 ~ μειώνονται σε όλη τη διάρκεια του νυμφικού σταδίου. Στα ενήλικα η πρωτεΐνη εντοπίζεται στις γονάδες και σε χαμηλή συγκέντρωση στο θωρακικό γάγγλιο και στον εγκέφαλο. Κατά την ωογένεση εντοπίζεται τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασμα. Η Hsp27 είναι η μόνη shsp που έχει δείξει τόσο πυρηνικό όσο και κυτταροπλασματικό εντοπισμό (Joanisse et al., 1998; Michaud et al., 1997). Ενδοκυτταρικός εντοπισμός της Hsp27 Δεδομένα που δημοσιεύτηκαν το 2002 αποκάλυψαν ότι στη σταθερή κυτταρική σειρά HeLa η αβ-κρυσταλλίνη και η Hsp27 εμφανίζουν πυρηνικό εντοπισμό κάτω από φυσιολογικές συνθήκες (van den Ijssel et al., 2002). Ωστόσο η Hsp27, αντίθετα με την αβ-κρυσταλλίνη, εντοπίστηκε και σε κοκκία μέσα στο πυρηνίσκο, κάτι που υποδηλώνει ότι η δύο πρωτεΐνες έχουν παρόμοιους αλλά όχι εντελώς επικαλυπτόμενους ρόλους μέσα στον πυρήνα. Στον πυρήνα οι δύο αυτές πρωτεΐνες εντοπίζονται σε περιοχές μεταγραφικής δραστηριότητας (nuclear speckles) οι οποίες θεωρούνται ως περιοχές αποθήκευσης ή διακίνησης συστατικών της μηχανής του ματίσματος (van den Ijssel et al., 2002). Φαίνεται ότι υπάρχουν συγκεκριμένα υποστρώματα μέσα στον πυρήνα που αλληλεπιδρούν με την Hsp27. Η Hsp27 δεν είναι ομοιόμορφα κατανεμημένη μέσα στο πυρηνικό διαμέρισμα κυττάρων κάτω από συνθήκες στρες, αντίθετα σχηματίζει κοκκία. Ο πυρήνας φέρει έναν αριθμό από κοκκία και πρωτεΐνες που σχετίζονται με την επεξεργασία και αποθήκευση του mrna. Επιπρόσθετα, ο πυρήνας ενός κυττάρου κάτω από συνθήκες στρες στρατολογεί συστατικά που σχετίζονται με την απόκριση στο στρες, όπως είναι για παράδειγμα ο μεταγραφικός παράγοντας του θερμικού στρες, HSF1 (heat shock factor) στη σταθερή κυτταρική σειρά HeLa. Τα συστατικά αυτά συγκεντρώνονται σε δομές γνωστές ως κοκκία του στρες (stress granules) (Cotto et al., 1997). Η Hsp27 φωσφορυλιώνεται όχι μόνο για να αλληλεπιδράσει με συγκεκριμένα υποστρώματα αλλά και για να μετακινηθεί από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα ως απόκριση σε μια ποικιλία στρεσογόνων παραγόντων Το ένζυμο που φωσφορυλιώνει την Hsp27 είναι μία κινάση σερίνης και έχει ταυτοποιηθεί ως MAPKAP 2 (MAP-kinase activated protein kinase 2). Φαίνεται ότι η διαδικασία της φωσφορυλίωσης λαμβάνει χώρα ως μέρος του μονοπατιού p38 MAP kinase. Ωστόσο έχει αναφερθεί ότι η Hsp27 αποτελεί υπόστρωμα για πολλές κινάσες, συμπεριλαμβανομένων των κινασών τυροσίνης (Bryantsev et al., 2002; Geum et al., 2002; Wong et al., 2000). Πειράματα που ακολούθησαν έδειξαν ότι η φωσφορυλιωμένη Hsp27 εισέρχεται στον πυρήνα όχι μόνο ως απόκριση στο στρες, αλλά και κάτω από φυσιολογικές συνθήκες. Η διαφορά ανάμεσα στην κυτταροπλασματική και πυρηνική Hsp27 φαίνεται να είναι ότι η πρώτη διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην επιβίωση του κυττάρου ύστερα από την επίδραση στρεσογόνου παράγοντα, ενώ η δεύτερη συμμετέχει σε μηχανισμούς που σχετίζονται με την αποκατάσταση της φυσιολογικής λειτουργίας του κυττάρου από τη στιγμή που το στρες έχει παρέλθει (Bryantsev et al., 2007). Ένα χρόνο αργότερα γνωστοποιήθηκε ότι ο πυρηνικός εντοπισμός της Hsp27 στη Drosophila καθοδηγείται από μία αμινοξική αλληλουχία που εντοπίζεται στην περιοχή όπου περιλαμβάνει αργινίνες στις θέσεις 54, 55 και 56 (Michaud et al., 2008). Δεδομένου ότι η Hsp27 αλληλεπιδρά με το hnrna ανεξάρτητα από τις συνθήκες επαγωγής της (Kloetzel & Bautz, 1983), είναι ενδιαφέρον να διερευνηθεί το αν η Hsp27 αλληλεπιδρά απευθείας με το RNA μέσω της πλούσιας σε αργινίνες περιοχής της και αν ισχύει αυτό κατά πόσο η αλληλεπίδραση αυτή επηρεάζει την ενδοκυτταρική κατανομή της πρωτεΐνης (Michaud et al., 2008). Μέχρι τώρα δεν υπάρχει η πληροφορία ότι η Hsp27 στα θηλαστικά φέρει μια τέτοια περιοχή πλούσια σε αργινίνες που να καθοδηγεί την πρωτεΐνη στον πυρήνα, διαδικασία που φαίνεται να είναι ικανοποιείται μέσω της φωσφορυλίωσης της.

30 ~ 30 ~ 9. Το γονίδιο hsp27 της μεσογειακής μύγας Ceratitis capitata (Cchsp27) Το γονίδιο Cchsp27 έχει χαρτογραφηθεί στη περιοχή 81Α του έκτου πολυταινικού χρωμοσώματος της μεσογειακής μύγας C. capitata. Από τη φυλογενετική ανάλυση αρκετών shsps εντόμων έχει προταθεί ότι το γονίδιο Cchsp27 είναι ορθόλογο με τα γονίδια hsp27 της Drosophila και hsp25 της Sarcophaga crassipalpis. Δομική ανάλυση του γονιδίου αποκάλυψε την παρουσία πέντε πιθανών στοιχείων απόκρισης στο θερμικό στρες και ένα πιθανό στοιχείο απόκρισης στην εκδυσόνη. Κάτω από συνθήκες θερμικού στρες η έκφραση του γονιδίου Cchsp27 αυξάνεται ελαφρά στους 30 C ενώ μεγιστοποιείται σε θερμοκρασίες ανάμεσα της 39 και 41 C. Το γονίδιο Cchsp27 εκφράζεται κάτω από φυσιολογικές συνθήκες στα διάφορα στάδια της ανάπτυξης της μεσογειακής μύγας και φαίνεται ότι το αναπτυξιακό πρότυπο έκφρασής του ομοιάζει με το αντίστοιχο πρότυπο του γονιδίου hsp27 της Drosophila. Ωστόσο, έχουν παρατηρηθεί σημαντικές διαφορές στην έκφραση σε συγκεκριμένα αναπτυξιακά στάδια κάτι που υποδηλώνει διαφορική ρύθμιση του hsp27 γονιδίου στα δύο αυτά δίπτερα (Kokolakis et al., 2008). Έχουν βρεθεί σημαντικές ποσότητες του hsp27 RNA στις ωοθήκες και στους όρχεις των ενήλικων ατόμων της μεσογειακής μύγας οπότε υπάρχει η υπόθεση ότι το γονίδιο εμφανίζει συγκεκριμένες λειτουργίες κατά την ωογένεση και σπερματογένεση. Από πειράματα που διεξήχθησαν στους σιελογόνους αδένες της μεσογειακής μύγας φαίνεται ότι η έκφραση του γονίδιου Cchsp27 επάγεται από την εκδυσόνη (Kokolakis et al., 2008). Όπως και στην Drosophila, τα δυνητικά HSEs του Cchsp27 εντοπίζονται εκατοντάδες βάσεις ανοδικά του στοιχείου TATA. 10. Το γονίδιο hsp23 της μεσογειακής μύγας Ceratitis capitata (Cchsp23) Προσπάθεια απομόνωσης και χαρακτηρισμού του γονιδίου hsp23 στη μεσογειακή μύγα αποκάλυψε την ύπαρξη δύο γονιδίων που κωδικοποιούν προϊόντα ομόλογα με την πρωτεΐνη Hsp23 της D. melanogaster και τα οποία oνομάστηκαν CcHsp23-α και -β. Ανάλυση της αλληλουχίας τους έδειξε υψηλή ομοιότητα στην κωδική τους περιοχή και στην 5 UTR, καθώς και ότι μεταγράφονται με αντίθετες κατευθύνσεις (Kokolakis et al., 2009). Όπως συμβαίνει και στη Drosophila, τα γονίδια hsp23 και hsp27 της μεσογειακής μύγας είναι στενά συνδεδεμένα και χαρτογραφούνται στην ίδια περιοχή του έκτου χρωμοσώματος (Kokolakis et al, 2008, 2009). Η υψηλή ομοιότητα που εμφανίζουν τα δύο Cchsp23 γονίδια υποδηλώνει ότι προήλθαν από πρόσφατο διπλασιασμό ενός αρχικού γονιδίου. Τα δύο Cchsp23 φέρουν εφτά δυνητικά HSEs στην 5 ανοδική τους περιοχή και δύο στην κωδική τους περιοχή. Όπως και στη Drosophila, εντοπίζονται εκατοντάδες βάσεις ανοδικά του TATA box (Kokolakis et al., 2009). Στη μεσογειακή μύγα η επαγωγή του hsp23 ξεκινά στους 30 C και φτάνει τα μέγιστα επίπεδα στους C, τέσσερις βαθμούς περίπου υψηλότερα απ ότι παρατηρείται στη Drosophila. Το δύο Cchsp23 εκφράζονται κάτω από φυσιολογικές συνθήκες εμφανίζοντας συγκεκριμένο αναπτυξιακό πρότυπο το οποίο παρουσιάζει διαφορές συγκριτικά με αυτό που παρατηρείται στη Drosophila (Kokolakis et al., 2009).

31 ~ 31 ~ 11. Ρύθμιση της μεταγραφής των θερμοεπαγόμενων γονιδίων Στα ευκαρυωτικά κύτταρα η απόκριση στο θερμικό στρες περιλαμβάνει τη ρύθμιση της μεταγραφής των hsp γονιδίων. Η ρύθμιση αυτή πραγματοποιείται μέσω ενός μεταγραφικού παράγοντα γνωστό ως μεταγραφικό παράγοντα του θερμικού στρες, HSF (heat shock factor). Σε κύτταρα που δεν έχουν υποστεί στρες ο HSF βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα αλλά και στο πυρήνα σε μονομερή, ανενεργή μορφή. Σε απόκριση στο θερμικό στρες ο HSF τριμερίζεται και συγκεντρώνεται στον πυρήνα. Στην τριμερή του μορφή ενεργοποιείται και προσδένεται στα HSEs (Morimoto, 1993). Ο μεταγραφικός παράγοντας του θερμικού στρες (Heat Shock Factor, HSF) Η ρύθμιση της έκφρασης των θερμοεπαγόμενων γονιδίων μετά από θερμικό στρες γίνεται πρωταρχικά με την πρόσδεση του HSF σε ρυθμιστικές αλληλουχίες του υποκινητή τους, τα HSEs, όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Ο HSF υπάρχει σε διάφορες ισομορφές. Στα σπονδυλωτά έχουν βρεθεί τέσσερις διαφορετικοί HSFs μέχρι τώρα, οι HSF1-HSF4. Η παρουσία πολλαπλών HSFs υποδηλώνει λειτουργικές διαφορές ανάμεσα τους. Από τους παράγοντες αυτούς HSF2 δεν ενεργοποιείται Εικόνα Α11.1. Σχηματική αναπαράσταση της ρύθμισης του HSF. Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες ο HSF βρίσκεται σε ανενεργή, μονομερή μορφή και αλληλεπιδρά με την Hsp70 (1). Με την επίδραση του θερμικού στρες, ή άλλων μορφών στρες, ο HSF ομοτριμερίζεται (2), προσδένεται σε συγκεκριμένες αλληλουχίες στους υποκινητές των hsp γονιδίων (3) και φωσφορυλιώνεται (4). Η μεταγραφική ενεργοποίηση των hsp γονιδίων οδηγεί σε αυξημένα επίπεδα της Hsp70 και τον σχηματισμό του συμπλόκου HSF- Hsp70 (5). Τελικά ο HSF αποδεσμεύεται από το DNA και επανέρχεται στην μονομοερή, ανενεργή μορφή του (Morimoto, 1993). από το στρες. Ο HSF1 εμφανίζει τα τυπικά χαρακτηριστικά της απόκρισης λόγω στρες, δηλαδή τριμερίζεται και προσδένεται στο DNA. Η ενεργοποίηση των hsp γονιδίων γίνεται με τη μεσολάβηση της αλληλεπίδρασης του HSF με τα HSEs. Σε μη στρεσογόνες καταστάσεις ο HSF1 είναι παρόν στο κυτταρόπλασμα και υφίσταται στη μονομερή, μη ενεργή μορφή του όπου βρίσκεται προσδεμένος με τις Hsp70 και Hsp90 (εικόνα Α11.1). Κατά το θερμικό στρες οι Hsp70 και Hsp90 προσδένονται στις αποδιαταγμένες πρωτεΐνες και έτσι απελευθερώνουν τον HSF1. Ο ελεύθερος τώρα HSF1 εντοπίζεται στο πυρήνα όπου φωσφορυλιώνεται στα κατάλοιπα σερίνης, ομοτριμερίζεται και προσδένεται στο DNA. Ακολουθεί η ενεργοποίηση των θερμοεπαγόμενων πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων των Hsp70 και Hsp90. Η ενεργότητα του HSF1 ρυθμίζεται αρνητικά διαμέσου της αυξημένης πρόσδεσης των νεοσυντιθέμενων Hsp70 και Hsp90 στον HSF1. Με άλλα λόγια, η κυτταρική θερμοκρασία καθορίζει την ισορροπία ανάμεσα στην πρόσδεση των ελεύθερων θερμοεπαγόμενων πρωτεϊνών στον HSF1 ή στις αποδιαταγμένες λόγω στρες πρωτεΐνες (Katschinski, 2004). Στη D. melanogaster και στο σακχαρομύκητα υπάρχει μόνο μία ισομορφή, η οποία είναι ομόλογη με την ισομορφή HSF1 που απαντάται στα θηλαστικά (Morimoto, 1998).

32 ~ 32 ~ Εικόνα Α11.2. Γενικά δομικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά των HSFs. Σχηματική αναπαράσταση της δομής του HSF1 (Morimoto, 1998). Ο HSF1 έχει μέγεθος περίπου 70 kda και αποτελείται από τέσσερις διακριτές περιοχές (εικόνα Α11.2). Στο αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης εντοπίζεται η περιοχή πρόσδεσης στο DNA. Το τμήμα που ακολουθεί είναι υπεύθυνο για το σχηματισμό της τριμερούς μορφής και το οποίο αποτελείται από υδρόφοβες επαναλήψεις (HR-A/B). Στο καρβοξυτελικό άκρο βρίσκεται η περιοχή αλληλεπίδρασης με το σύμπλοκο έναρξης της μεταγραφής, Στην ίδια περιοχή εντοπίζονται και υδρόφοβες επαναλήψεις (HR-C) που αλληλεπιδρούν με την περιοχή HR-A/B και διατηρούν τον παράγοντα στην ανενεργή, μονομερή του μορφή (Morimoto, 1998). Στοιχεία απόκρισης στο θερμικό στρες (Heat Shock Elements, HSEs) Η έκφραση των θερμοεπαγόμενων πρωτεϊνών, όπως έχει ήδη αναφερθεί διεξοδικά, πραγματοποιείται μέσω της πρόσδεσης του HSF σε ρυθμιστικές αλληλουχίες στην περιοχή του υποκινητή, γνωστές ως στοιχεία απόκρισης στη θερμότητα (HSEs). Κύριο χαρακτηριστικό των HSEs είναι η ύπαρξη συνεχόμενων ανεστραμμένων επαναλήψεων του πεντανουκλεοτιδίου 5 -ngaan- 3, όπως φαίνεται στην εικόνα Α11.3 (Morimoto, 1998; Xiao & Lis, 1988). Έχει βρεθεί ότι για να είναι λειτουργικό ένα HSE απαιτούνται τουλάχιστον δύο επαναλήψεις της εν λόγω αλληλουχίας (Perisic et al., 1989). Εικόνα Α11.3. Αντιπροσωπευτικό HSE (Topol et al., 1985). Μεταλλάξεις μέσα στο κεντρικό τρινουκλεοτίδιο (GAA) μειώνουν την ισχύ δέσμευσης με τον HSF, ενώ το πρώτο νουκλεοτίδιο παίζει σημαντικό ρόλο στη δέσμευση του HSF και δείχνει μια ισχυρή προτίμηση να είναι αδενίνη (Fernandes et al., 1994). Σημαντικό ρόλο φαίνεται να παίζουν και κάποιες γειτονικές του πεντανουκλεοτιδίου βάσεις καθώς και άλλες ρυθμιστικές αλληλουχίες (Shopland & Lis, 1996). 12. Ρύθμιση του γονίδιου hsp27 (HSPB1) στον άνθρωπο Το γονίδιο hsp27 περικλείει ένα μετάγραφο 2.2 kb το οποίο περιέχει τρία εξόνια που κωδικοποιούν μία πρωτεΐνη 205 αμινοξέων. Φέρει δύο λειτουργικά HSEs (εικόνα Α12.1) τα οποία είναι υψηλά συντηρημένα ανάμεσα στα διάφορα είδη. Το πρώτο από τα δύο HSEs εντοπίζεται -200 bp ανοδικά από το πρώτο εξονιο (Hickey et al., 1986), ενώ το δεύτερο υπάρχει μέσα στο πρώτο ιντρόνιο (Trinklein et al., 2004). Ακόμη, έχει χαρτογραφηθεί ένα άτυπο camp στοιχείο απόκρισης (CRE) -678bp ανοδικά του εξονίου 1 το οποίο φαίνεται ότι αναγνωρίζεται από τους μεταγραφικούς παράγοντες ATF3 και ATF5, οι οποίοι προσδένουν στο CRE, ενεργοποιούν την έκφραση του γονιδίου και σχετίζονται με την κυτταρική

33 ~ 33 ~ επιβίωση ενάντια στο στρες (Wang et al., 2007). Το γονίδιο hsp27 χαρτογραφείται στο χρωμόσωμα 7q11.23 ενώ έχουν ανιχνευτεί δύο ψευδογονίδια στο ένατο και στο Χ χρωμόσωμα (Stock et al., 2003; Mymrikov et al., 2011). Εικόνα Α12.1. Ρύθμιση της έκφρασης της πρωτεΐνης Hsp27 (HSPB1): Η έκφραση της Hsp27 μπορεί να επαχθεί ταχύτατα από μια ποικιλία παραγόντων συμπεριλαμβανομένων των στρεσογόνων παραγόντων, της μίτωσης ή περιβαλλοντικών αλλαγών. Η νεοσυντιθέμενη, μη φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη Hsp27 σχηματίζει μεγάλα ολιγομερή που σχετίζονται με τη δραστηριότητα μοριακού συνοδού. Υπό κατάλληλο ερέθισμα, το αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης φωσφορυλιώνεται και οδηγεί στο σχηματισμό πρωτεϊνικών Hsp27 δομών με μικρότερο μοριακό βάρος. Η Hsp27 έχει συσχετιστεί με αλληλεπιδράσεις σε μονοπάτια σηματοδότησης κυτταρικού θανάτου, συμπεριλαμβάνοντας τη κασπάση-3 και το κυτόχρωμα c με τα οποία προσδένεται ή ανοδικά μονοπάτια σηματοδότησης που περιλαμβάνουν κινάσες (Stetler et al., 2009).

34 ~ 34 ~ Β. Έντομα 1. Έκδυση και Μεταμόρφωση Η ανάπτυξη των εντόμων διακρίνεται σε δύο φάσεις (Pechenik, 1996): την εμβρυϊκή όπου αναπτύσσεται το έμβρυο προστατευμένο μέσα στο χόριο του αυγού και την μετεμβρυϊκή φάση η οποία αρχίζει με την εκκόλαψη της προνύμφης και λήγει με την ανάπτυξη του σεξουαλικά ώριμου ατόμου. Η μεταμόρφωση στα έντομα πρώτιστα περιλαμβάνει την καταστροφή των ιστών της προνύμφης και την αντικατάσταση τους από έναν νέο, εντελώς διαφορετικό πληθυσμό κυττάρων. Υπάρχουν τρία κύρια πρότυπα μεταμόρφωσης στην ανάπτυξη των εντόμων (εικόνα Β1.1). Κάποια έντομα δεν εμφανίζουν προνυμφικό στάδιο και υπόκεινται σε άμεση ανάπτυξη. Αυτά καλούνται αμετάβολα έντομα. Με το που εκκολαφθούν εισέρχονται στο στάδιο της προνύμφης (pronymph) και μοιάζουν με το ενήλικο άτομο αλλά έχουν μικρότερο μέγεθος σώματος. Ύστερα από κάθε έκδυση αυξάνουν σε μέγεθος ενώ η μορφή τους παραμένει η ίδια. Η δεύτερη κατηγορία αφορά στα ημιμετάβολα έντομα. Εδώ η μεταμόρφωση είναι βαθμιαία. Υπάρχει ένα πολύ σύντομο προνυμφικό (pronymph) στάδιο και στη συνέχεια το έντομο εισέρχεται στο στάδιο της νύμφης (nymph) όπου μοιάζει σαν ένα ανώριμο ενήλικο άτομο. Οι διάφορες ενήλικες δομές, όπως για παράδειγμα τα φτερά, είναι παρούσες και σταδιακά ωριμάζουν με κάθε έκδυση. Με την τελευταία έκδυση το έντομο είναι ένα σεξουαλικά ώριμο άτομο. Τέλος υπάρχουν τα ολομετάβολα έντομα. Το προνυμφικό στάδιο ξεκινά με την εκκόλαψη του ατόμου από το αυγό. Η προνύμφη (larva) εισέρχεται σε διαδοχικές εκδύσεις καθώς αυξάνει σε μέγεθος. Ο αριθμός των εκδύσεων είναι χαρακτηριστικός για κάθε είδος, αν και διάφοροι περιβαλλοντικοί παράγοντες μπορούν να επηρεάσουν αυτόν τον αριθμό. Στο τέλος του προνυμφικού σταδίου παρατηρείται μία δραματική μεταμόρφωση και το άτομο εισέρχεται στο στάδιο της νύμφης (pupa). Η pupa δεν τρέφεται και όλη της η ενέργεια προέρχεται από την τροφή που κατανάλωσε ως larva. Τελικά, συμβαίνει μία τελική μεταμόρφωση και το άτομο εξέρχεται του βομβυκίου ως ενήλικο (Gilbert, 2006). Εικόνα Β1.1. Τα τρία κύρια πρότυπα μεταμόρφωσης στα έντομα. Οι εκδύσεις αντιπροσωπεύονται με τα βέλη. (Α) Αμετάβολη (άμεση) ανάπτυξη. Ύστερα από ένα σύντομο προνυμφικό στάδιο, το έντομο μοιάζει σαν ένα μικρό ενήλικο άτομο. (Β) Ημιμετάβολη (σταδιακή) μεταμόρφωση. Ύστερα από ένα πολύ σύντομο προνυμφικό στάδιο, το έντομο περνάει στο στάδιο της νύμφης. Μετά από κάθε έκδυση, το έντομο μοιάζει όλο και περισσότερο με το ενήλικο άτομο ενώ αυξάνονται διαδοχικά τα φτερά και τα γεννητικά όργανα. (C) Ολομετάβολη μεταμόρφωση. Όταν το έντομο εκκολαφθεί ως προνύμφη, υπόκειται σε επιτυχημένες διαδοχικές εκδύσεις μέχρι να εισέλθει στο στάδιο της νύμφης (metamorphic molt). Με μία ακόμη έκδυση (imaginal molt) μετατρέπεται σε ενήλικο άτομο (Gilbert, 2006).

35 ~ 35 ~ 2. Ορμονικός έλεγχος της μεταμόρφωσης των εντόμων Ορμόνες Οι ορμόνες είναι ρυθμιστικά μόρια που στοχεύουν σε διακριτούς ιστούς του οργανισμού. Μεταφέρουν περιβαλλοντικά και γενετικά σινιάλα δια μέσου των υποδοχέων τους με σκοπό την μεταγραφική ρύθμιση των γονιδίων στους ιστούς στόχους (Finch & Rose, 1995). To 1934 o Vincent Wigglesworth ( ) έδειξε ότι η αφαίρεση των ενδοκρινών αδένων στο έντομο Rhodnius προκαλεί πρόωρη έκδυση στο ενήλικο άτομο, ενώ η επανεμφύτευση τους εξασφαλίζει την διαδικασία της έκδυσης (Wigglesworth, 1934). Ο ορμονικός αυτός παράγοντας ονομάστηκε ορμόνη νεαροποίησης (juvenile hormone, JH) και είναι ο κύριος ορμονικός ρυθμιστής στα έντομα. Στα έντομα, όπως η Drosophila, η JH αποτελεί κύριο ενδοκρινή ρυθμιστή της ανάπτυξης. Εκκρίνεται από ενδοκρινείς αδένες που εντοπίζονται στο κεφάλι και ονομάζονται αδενικά σωμάτια (corpora allata) (εικόνα Β2.1). Στα έντομα παρατηρούνται τουλάχιστον οχτώ ισομορφές της JH ενώ η Drosophila συνθέτει δύο από αυτές, τις JHIII και JHB3. Η JH αποκρίνεται σε εσωτερικά ερεθίσματα, για παράδειγμα άλλες ορμόνες, και σε εξωτερικά όπως είναι η θερμοκρασία και η φωτοπερίοδος (Flatt et al., 2010). Μία άλλη κύρια ορμόνη της ανάπτυξης είναι η εκδυσόνη. Η εκδυσόνη είναι υπεύθυνη για την εκκίνηση και τον συντονισμό κάθε έκδυσης και ρυθμίζει τις αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση που συμβαίνουν κατά την μεταμόρφωση. Εκκρίνεται από τον προθωρακικό αδένα (prothoracic gland) και τροποποιείται στους περιφερειακούς ιστούς όπου και μεταπίπτει στην ενεργή της μορφή (20-hydroxyecdysone, 20Ε) (εικόνα Β2.2) (Gilbert, 2006). Εικόνα Β2.1. (Α). Το νευροενδοκρινές σύμπλοκο στον εγκέφαλο της Drosophila. Συγκροτείται από τους αδένες corpus allatum (CA) και corpus cardiacum (CC). Ο CA των ανώτερων δίπτερων είναι ένας ενδοκρινής αδένας που εντοπίζεται στο οπισθιο τμήμα του κεφαλιού. Συνθέτει τις δύο JH ισομορφές, JHIII και JHB3. Τα ενδιάμεσα νευροεκκριτικά κύτταρα (insulin-producing cells, IPCs) εκκρίνουν insulin-like πεπτίδια. Ο αδένας CC, γνωστός και ως καρδιακά σωμάτια, απελευθερώνει στην αιμολέμφο νευροεκκριτικές ουσίες του εγκεφάλου. Ο προθωρακικός αδένας (prothoracic gland) παράγει στεροειδείς ορμόνες (εκδυσόνη, 20Ε, και παράγωγα). Η 20Ε, είναι η κύρια ορμόνη της ανάπτυξης των εντόμων. Δεξιά διακρίνεται μία εικόνα συνεστιακής μικροσκοπίας, όπου με πράσινο απεικόνίζονται τα αδενικά σωμάτια. Scale bar: 50mm, Flatt et al, 2010). (Β). Δομή της ορμόνης JH (Gilbert, 2006). Εικόνα Β2.2. Δομές της εκδυσόνης και της ενεργής της μορφής 20- hydroxyecdysone, 20Ε (Gilbert, 2006).

36 ~ 36 ~ Εκδυστεροειδή και Εκδυσόνη Ο όρος εκδυστεροειδή χρησιμοποιείται για να περιγράψει μία οικογένεια στεροειδών που σχετίζονται με την εκδυσόνη. Το βιοσυνθετικό μονοπάτι της εκδυσόνης στα έντομα ξεκινά από την χοληστερόλη (εικόνα Β2.3). Ωστόσο τα έντομα δεν έχουν την ικανότητα να συνθέτουν χοληστερόλη από απλά πρόδρομα μόρια, αντίθετα τα στεροειδή εισέρχονται στον οργανισμό τους μέσω της διατροφής τους και στη συνέχεια μεταβολίζονται προς χοληστερόλη. Τα ένζυμα που παίζουν σημαντικό ρόλο στο βιοσυνθετικό μονοπάτι της εκδυσόνης είναι τα προϊόντα της οικογένειας των Halloween γονιδίων. Τα γονίδια αυτά είναι τα: disembodied (dib), shadow (sad), shade (shd) και phantom (phm) (Gilbert & Warren, 2005). Η 20-hydroxyecdysone (20Ε) συντονίζει πολλαπλά αναπτυξιακά γεγονότα κατά την διάρκεια του κύκλου ζωής των εντόμων μέσω των αλλαγών που προκαλεί στην έκφραση ενός αριθμού γονιδίων. Όπως και άλλοι ρυθμιστές της ανάπτυξης (για παράδειγμα, στεροειδείς ορμόνες, θυρεοειδείς ορμόνες, ρετινοειδή και βιταμίνη D), η εκδυσόνη ελέγχει τη γονιδιακή έκφραση μέσω της πρόσδεσής της στον πυρηνικό της υποδοχέα, ο οποίος έτσι ενεργοποιείται και δρα ως μεταγραφικός παράγοντας (Henrich & Brown, 1995). Εικόνα Β2.3. Το βιοσυνθετικό μονοπάτι της 20Ε στη Drosophila (Gilbert & Warren, 2005). Πυρηνικοί υποδοχείς ορμονών Γενικά, οι στεροειδείς ορμόνες είναι μικρά λιποδιαλυτά μόρια που προέρχονται από τον μεταβολισμό της χοληστερόλης. Διαχέονται προς εσωτερικό του κυττάρου δια μέσου της μεμβράνης οπότε και προσδένονται στους υποδοχείς τους. Οι υποδοχείς των στεροειδών ορμονών είναι πυρηνικοί υποδοχείς και με την πρόσδεση της ορμόνης δρουν ως μεταγραφικοί παράγοντες και ρυθμίζουν την μεταγραφή πολλών γονιδίων-στόχων. Ελέγχοντας την μεταγραφή, οι πυρηνικοί υποδοχείς ορμονών ρυθμίζουν πολλές πτυχές της ανάπτυξης, της φυσιολογίας και του μεταβολισμού. Συνήθως οι πυρηνικοί υποδοχείς ορμονών διακρίνονται από μία επικράτεια πρόσδεσης (ligand-binding domain, LBD) στην οποία προσδένονται επίσης και συνεργοποιητές ή συγκαταστολείς, και από μία συντηρημένη αμινοτελική επικράτεια μέσω της οποίας γίνεται η πρόσδεση στο DNA (DNA-binding domain, DBD) (εικόνα Β2.4). Αν και για πολλούς πυρηνικούς υποδοχείς ορμονών, κυρίως των σπονδυλωτών, έχουν προσδιοριστεί τα μόρια που προσδένονται σε αυτούς, για κάποιους που ονομάζονται ορφανοί δεν έχει χαρακτηριστεί κάποιο μόριο προσδέτης. Επιπλέον, πολλοί πυρηνικοί υποδοχείς ορμονών μπορούν να δράσουν χωρίς πρόσδεμα (Gáliková et al., 2011). Μελέτες στα σπονδυλωτά έχουν αποκαλύψει ότι οι πυρηνικοί υποδοχείς παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη, αναπαραγωγή και ομοιοστατική ρύθμιση του μεταβολισμού.

37 ~ 37 ~ Το ίδιο ευρύ φάσμα ρόλων ισχύει και για τους πυρηνικούς υποδοχείς στα έντομα. Ωστόσο, στα έντομα παρατηρείται μια διαφορετική δράση των υποδοχέων αυτών κάτι που δεν εμφανίζεται στα σπονδυλωτά. Αυτό αφορά σε ένα συντηρημένο καταρράκτη έκφρασης ρυθμιστικών γονιδίων, ο οποίος ενεργοποιείται από την δημιουργία του συμπλόκου εκδυσόνη/υποδοχέας της εκδυσόνης. Ο καταρράκτης αυτός αντιπροσωπεύει την αρχική απόκριση σε εκδυστεροειδή και περιλαμβάνει και άλλους πυρηνικούς υποδοχείς σε μία αλληλουχία επαγωγικών φαινομένων σε απόκριση στα εκδυστεροειδή. Όλα όσα είναι μέχρι σήμερα γνωστά αναφορικά με τις μετεμβρυϊκές δράσεις των πυρηνικών υποδοχέων στα έντομα σχετίζεται με τον εν λόγω καταρράκτη ο οποίος για την D. melanogaster αφορά στα γονίδια EcR, USP, HR3, HR4, HR78, E75, E78, και FTZ-F1. Τα γονίδια αυτά δρουν ως ρυθμιστές της μεταμόρφωσης του εντόμου (Fahrbach et al., 2012). Εικόνα Β2.4. Δομή των πυρηνικών υποδοχέων. Οι έξι επικράτειες (A-F) των πυρηνικών υποδοχέων είναι περιοχές συντηρημένες τόσο στη λειτουργία όσο και στην αλληλουχία. Όλοι οι πυρηνικοί υποδοχείς φέρουν μία κεντρική DBD επικράτεια (C) η οποία είναι η πιο συντηρημένη και περιλαμβάνει δύο δάκτυλους ψευδαργύρου μέσω των οποίων γίνεται η πρόσδεση στα ρυθμιστικά στοιχεία του DNA. Η LBD επικράτεια (Ε) περιέχει το μισό COOH-τελικό άκρο του υποδοχέα. Ανάμεσα στις DBD και LBD υπάρχει μία άρθρωση ποικίλου μήκους (D). Η ΝΗ 2-τελική επικράτεια (Α/Β) εμφανίζει ενεργότητα ανεξάρτητη της παρουσίας του προσδέματος (activation function 1, AF-1). Στο COOH -τελικό άκρο του υποδοχέα εντοπίζεται ενεργότητα εξαρτημένη από την παρουσία του προσδέματος (activation function 2, AF-2). Η επικράτεια διμερισμού εντοπίζεται μέσα στην LBD επικράτεια ( Ο υποδοχέας της εκδυσόνης (EcR) Ο υποδοχέας της εκδυσόνης (EcR) είναι μέλος της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων. Δρα ως μεταγραφικός παράγοντας ο οποίος ενεργοποιείται ύστερα από την πρόσδεση της εκδυσόνης σε αυτόν. Είναι ετεροδιμερές, σε αντίθεση με τους υποδοχείς των στεροειδών ορμονών στα σπονδυλωτά που είναι ομοδιμερή, και συγκροτεί λειτουργικό υποδοχέα της εκδυσόνης ύστερα από τον ετεροδιμερισμό των προϊόντων των γονιδίων EcR και usp (ultraspiracle). Η πρωτεΐνη USP αποτελεί και αυτή μέλος της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων και είναι ομόλογη με τον υποδοχέα Χ των ρετινοειδών (RXR, retinoid X receptor) στα σπονδυλωτά (Riddiford et al., 2001). Το γονίδιο EcR στη D. melanogaster κωδικοποιεί τρεις ισομορφές του υποδοχέα: EcR-A, EcR-B1 και EcR-B2 (εικόνα Β2.5) (Talbot et al., 1993). Οι τρεις αυτές πρωτεΐνες έχουν τις ίδιες αμινοξικές αλληλουχίες για τις επικράτειες C και Ε. Ωστόσο, το αμινοτελικό τους άκρο φέρει διακριτές, μοναδικές επικράτειες που επηρεάζουν την ικανότητα κάθε υποδοχέα να ενεργοποιεί ή να καταστέλλει την γονιδιακή έκφραση. Από τις τρεις αυτές ισομορφές, φαίνεται ότι η EcR-A είναι ένας αδύναμος ενεργοποιητής αλλά δυνατός καταστολέας, ενώ οι ισομορφές EcR-B1 και EcR-B2 είναι αδύναμοι καταστολείς και δυνατοί ενεργοποιητές (Hu et al., 2003; Schwedes et al., 2011). Το ετεροδιμερές EcR/USP συγκροτεί έναν λειτουργικό υποδοχέα της εκδυσόνης ο οποίος προσδένεται σε κατάλληλα ρυθμιστικά στοιχεία στο DNA που καλούνται στοιχεία απόκρισης στην εκδυσόνη (EcREs, ecdysone responsive elements). Όταν η ορμόνη βρίσκεται σε χαμηλά επίπεδα δεν προσδένεται στο ετεροδιμερές. Σε αυτή την περίπτωση, ο υποδοχέας πρόσδενεται χαλαρά στα EcREs προκαλώντας καταστολή της γονιδιακής έκφρασης. Όταν η

38 ~ 38 ~ ορμόνη προσδένεται στον υποδοχέα της, τότε το σύμπλοκο που δημιουργείται προσδένεται πιο ισχυρά στα EcREs οπότε και στρατολογεί συνενεργοποιητές για την έναρξη της γονιδιακής έκφρασης (Yao et al., 1992, 1993). Εικόνα Β2.5. Σχηματική αναπαράσταση των EcR ισομορφών στη Drosophila (τροποποίηση εικόνας από: Talbot et al., 1993). Ο υποδοχέας της εκδυσόνης στην C. capitata (CcEcR) (εικόνα Β2.6) χαρακτηρίστηκε το 1999 (Verras et al., 1999). Σύγκριση του CcEcR με τον EcR της Drosophila έδειξε ότι είναι ομόλογος με την EcR-B1 ισομορφή (εικόνα Β2.6) (Verras et al., 1999). Εικόνα Β2.6. Σχηματική αναπαράσταση του CcEcR. Τα γράμματα υποδεικνύουν τις επικράτειες του υποδοχέα ενώ οι αριθμοί το σύνολο των αμινοξέων κάθε επικράτειας (Verras et al., 1999). Το 2002 χαρακτηρίστηκε η δεύτερη ισομορφή του CcEcR, η CcEcR-Α (Verras et al, 2002). Οι δύο ισομορφές, CcEcR-Α και Β1, διαφέρουν μόνο στην αμινοτελική τους Α/Β περιοχή, ενώ οι επικράτειες C και μέρος της D είναι ταυτόσημες. Στοιχεία απόκρισης στην εκδυσόνη (EcREs) Τα στοιχεία απόκρισης στην εκδυσόνη είναι cis-acting (ομόπλευρα) DNA στοιχεία που προσδίδουν την ικανότητα σε κάποιον υποκινητή για απόκριση στην εκδυσόνη. Τα στοιχεία απόκρισης στην εκδυσόνη ταυτοποιήθηκαν για πρώτη φορά στη Drosophila ως μία αλληλουχία 23 βάσεων στον υποκινητή του γονιδίου hsp27 (εικόνα Β2.7) (Riddihough & Pelham, 1987). Εικόνα Β2.7. Σύγκριση της αλληλουχίας του hsp27 EcRE με τις αλληλουχίες των στοιχείων απόκρισης στα γλυκοκορτικοειδή, στα οιστρογόνα και στην προγεστερόνη (Riddihough & Pelham, 1987). Εκτενείς μελέτες σε συστήματα θηλαστικών έχουν δείξει ότι τα περισσότερα στοιχεία απόκρισης σε ορμόνες (hormone-response elements, HREs) συγκροτούνται από δύο περιοχές διαταγμένες ως ευθείες ή ανεστραμμένες επαναλήψεις οι οποίες διαχωρίζονται από έναν ποικίλο αριθμό νουκλεοτιδίων. Η νουκλεοτιδική αλληλουχία των περιοχών αυτών καθώς και η απόσταση μεταξύ τους καθορίζουν την ειδικότητα πρόσδεσης του υποδοχέα στα στοιχεία αυτά (Martinez & Wahli, 1991).

39 ~ 39 ~ Ορμονικός έλεγχος στα φαινόμενα της έκδυσης και μεταμόρφωσης Η επιδερμίδα ενός εντόμου συγκροτείται από μία στοιβάδα κυττάρων απ όπου στη πορεία θα προκύψει ο εξωσκελετός. Η διαδικασία της έκδυσης περιλαμβάνει γεγονότα που αφορούν στην απομάκρυνση της επιδερμίδας, την κυτταρική διαίρεση, σύνθεση νέας επιδερμίδας και καταστροφή της παλιάς (Riddiford et al., 2001). Όπως αναφέρθηκε ήδη, οι κύριες οικογένειες ορμονών που ελέγχουν τον ρυθμό της έκδυσης και της μεταμόρφωσης κατά την μετεμβρυϊκή ζωή είναι η JH και τα εκδυστεροειδή. Η JH επάγει την παραγωγή νέας επιδερμίδας κατά την έκδυση ενώ τα εκδυστεροειδή ρυθμίζουν τον χαρακτήρα της έκδυσης (Truman & Riddiford, 1999). Η διαδικασία της έκδυσης ξεκινά από τον εγκέφαλο όπου νευροεκκριτικά κύτταρα απελευθερώνουν την προθωρακικοτρόπο ορμόνη (prothoracicotropic hormone, PTTH). Εικόνα Β2.8. Το μονοπάτι της μεταμόρφωσης στα έντομα. Οι ορμόνες 20E και JH είναι υπεύθυνες για τις διαδοχικές εκδύσεις. Όταν η συγκέντρωση της JH ελαττωθεί αρκετά τότε επάγεται η 20E και το άτομο εισέρχεται στο στάδιο της νύμφης. Απουσία JH, η 20E οδηγεί την διαφοροποίηση των imaginal discs και στην τελική έκδυση απ όπου ανέρχεται το ενήλικο άτομο (Gilbert, 2006). Η απελευθέρωση αυτή γίνεται σε απόκριση νευρικών, ορμονικών ή περιβαλλοντικών σινιάλων. Η ορμόνη PTTH είναι ένα πεπτίδιο που διεγείρει την παραγωγή της εκδυσόνης από τον προθωρακικό αδένα, η οποία στη συνέχεια τροποποιείται στους περιφερειακούς ιστούς για να μεταπέσει στην ενεργή της μορφή. Η παρουσία της JH εξασφαλίζει ότι το αποτέλεσμα της έκδυσης είναι η μετάπτωση από το ένα επιμέρους προνυμφικό στάδιο στο επόμενο και όχι στο στάδιο της νύμφης ή του ενήλικου ατόμου (εικόνα Β2.8) (Gilbert, 2006). Στα ολομετάβολα έντομα, μετά την αρχική εξαφάνιση της JH, μία μικρή αύξηση των εκδυστεροειδών οδηγεί συγκεκριμένους ιστούς προς τη νυμφική διαφοροποίηση. Ωστόσο η νυμφική έκδυση επάγεται πολύ αργότερα σε απόκριση υψηλής συγκέντρωσης εκδυστεροειδών. Η JH επανεμφανίζεται κατά την διάρκεια αυτής της αύξησης σε εκδυστεροειδή αλλά μετά εξαφανίζεται πριν την τρίτη μεγάλη αύξηση σε εκδυστεροειδή (Truman & Riddiford, 1999). Κάθε έκδυση ξεκινά με μία ή δύο αυξήσεις στη συγκέντρωση της 20Ε. Κατά την προνυμφική έκδυση παρατηρείται μία μικρή αύξηση στον τίτλο της 20Ε στην αιμολέμφο της προνύμφης. Η αύξηση αυτή έχει ως αποτέλεσμα την αλλαγή στην κυτταρική συγκρότηση της επιδερμίδας. Μία δεύτερη αύξηση στον τίτλο της 20Ε οδηγεί στην εκκίνηση γεγονότων διαφοροποίησης που σχετίζονται με την έκδυση (εικόνα Β2.9). Ως αποτέλεσμα είναι η διέγερση των επιδερμικών κυττάρων να συνθέσουν ένζυμα που καταστρέφουν το παλιό επιδερμίδιο και συνθέτουν νέο (Gilbert, 2006).

40 ~ 40 ~ Εικόνα Β2.9. Γενικευμένο σχήμα όπου γίνεται περιγραφή των διακυμάνσεων του τίτλου της εκδυσόνης κατά την έκδυση (Riddiford et al., 2001). Επίπεδα EcR και εκδυσόνης στη D. melanogaster και C. capitata Οι EcR-A και B ισομορφές εμφανίζουν διακριτά χωρικά και χρονικά πρότυπα έκφρασης κατά την ανάπτυξη ενός εντόμου (Riddiford et al., 2001). Το EcR πρότυπο έκφρασης στη μεσογειακή μύγα φαίνεται να είναι παρόμοιο με αυτό της D. melanogaster (Verras et al., 1999). Ωστόσο στο επίπεδο του mrna παρατηρούνται κάποιες διαφορές ανάμεσα στα δύο είδη. Στη μεσογειακή μύγα εκφράζονται τα mrnas και των δύο ισομορφών σε υψηλά επίπεδα στις ώριμες ωοθήκες καθώς και στα πρώιμα έμβρυα (Verras et al., 2002). Αντίθετα, στη Drosophila μόνο η EcR-A ισομορφή εμφανίζεται στα πρώιμα έμβρυα (Talbot et al., 1993). Όπως και στη Drosophila (Talbot et al., 1993), έτσι και στη μεσογειακή μύγα τα mrnas των δύο ισομορφών σταδιακά εξαφανίζονται τις πρώτες ώρες της εμβρυϊκής ανάπτυξης και μετά εμφανίζονται ξανά αγγίζοντας μέγιστα επίπεδα περίπου στα μέσα της εμβρυογένεσης (Verras et al., 2002). Όπως και στη Drosophila (Talbot et al., 1993), το CcEcR-B1 mrna εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα κατά τα πρώιμα προνυμφικά στάδια ενώ το CcEcR-A mrna σχεδόν δεν ανιχνεύεται (Verras et al., 2002). Τα πρότυπα έκφρασης των EcR-A και B1 mrnas στη μεσογειακή μύγα κατά την ανάπτυξη της όψιμης προνύμφης και της νύμφης (prepupae και pupae) ομοιάζουν πολύ με αυτά που έχουν αναφερθεί για την Drosophila (Talbot et al., 1993; Kim et al., 1999). Έτσι ο EcR-B1 εκφράζεται κατά κύριο λόγο στην όψιμη προνύμφη ενώ ο EcR-A κατά την ανάπτυξη της νύμφης (prepupae και pupae) (Verras et al., 2002). Όπως έχει παρατηρηθεί και στη Drosophila, in vivo και in vitro μελέτες στους σιελογόνους αδένες της μεσογειακής μύγας έχουν αποκαλύψει ότι η εκδυσόνη πυροδοτεί την επαγωγή δύο κύκλων χρωμοσωματικών διογκώσεων: έναν στην μετάπτωση από την προνύμφη στη πρώιμη νύμφη και ο δεύτερος στα μέσα της ανάπτυξης της πρώιμης νύμφης (Gariou- Papalexiou et al., 1999, 2001). Στη μεσογειακή μύγα, τα EcR mrnas αγγίζουν τα μέγιστα επίπεδα κατά το jumping στάδιο της προνύμφης και μετά μειώνονται ταχέως και ελαχιστοποιούνται λίγες ώρες πριν το σχηματισμό του βομβυκίου. Το jumping στάδιο σηματοδοτεί την έναρξη του πρώτου κύκλου χρωμοσωματικών διογκώσεων όπου και παρατηρείται αύξηση στον τίτλο της εκδυσόνης στην αιμολέμφο (Verras et al., 2002). Ο τίτλος της εκδυσόνης στην αιμολέμφο αυξάνεται μέχρι και τον σχηματισμό του βομβυκίου και μετά μειώνεται για τις επόμενες 2-3 ώρες οπότε και ελαχιστοποιείται τη χρονική στιγμή που τελειώνει ο πρώτος κύκλος χρωμοσωματικών διογκώσεων (Gariou-Papalexiou et al., 1999).

41 ~ 41 ~ Εκδυσόνη και το γονίδιο hsp27 Στη D. melanogaster, το γονίδιο hsp27 φέρει το στοιχείο απόκρισης στην εκδυσόνη (EcRE) (GGTTCAaTGCACT) στη θέση Το στοιχείο αυτό έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς για in vitro μελέτες της απόκρισης στην εκδυσόνη (Riddihough & Pelham, 1987). Η πρώτη φορά που φάνηκε ότι το γονίδιο hsp27 επάγεται από την εκδυσόνη ήταν σε καλλιέργεια S3 (Schneider line 3) κυττάρων Drosophila και σε μαζικά απομονωμένους εμβρυϊκούς δίσκους. Όμως η επίδραση της ορμόνης στην έκφραση του γονιδίου ήταν μέτρια (Ireland et al., 1982). Μεταγενέστερες μελέτες στη Drosophila αποκάλυψαν ότι η έκφραση του hsp27 γονίδιου κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη και κατά την ανάπτυξη της όψιμης προνύμφης και πρώιμης νύμφης σχετίζεται με τον τίτλο της εκδυσόνης (Thomas & Lengyel, 1986), υποδεικνύοντας ότι η εκδυσόνη είναι υπεύθυνη για το μεγαλύτερο μέρος της αναπτυξιακής έκφρασης του γονιδίου. Μελέτη που δημοσιεύτηκε το 1991 έδειξε ότι ο υποκινητής του hsp27 γονιδίου στη Drosophila φέρει πρωτεύοντα αλλά και δευτερεύοντα EcREs (Amin et al., 1991). Την πληροφορία αυτή έρχεται να συμπληρώσει η παρατήρηση ότι η ακριβής φύση του στοιχείου απόκρισης στην εκδυσονη είναι λιγότερο σημαντική για την σωστή αναπτυξιακή έκφραση του γονιδίου, συγκριτικά με τις ρυθμιστικές αλληλουχίες που περιβάλλουν το EcRE (Antoniewski et al., 1996). Επιπρόσθετα, η έκφραση του γονιδίου hsp27 στους σιελογόνους αδένες της Drosophila κατά την προνυμφική ανάπτυξη φαίνεται ότι ακολουθεί τις αλλαγές που παρατηρούνται στα επίπεδα της εκδυσόνης (Dubrovsky et al., 1994). Ωστόσο έντονο ενδιαφέρον εμφανίζουν τα αποτελέσματα μελέτης όπου φάνηκε ότι κατά την προνυμφική ανάπτυξη η μέγιστη επαγωγή του hsp27 γονίδιου στους σιελογόνους αδένες των όψιμων προνυμφών, παρατηρείται πριν την κλασσική πρωταρχική απόκριση στην εκδυσόνη (Huet et al., 1996). Πιθανόν υπάρχει ένας συνδυασμός φαινομένων επαγωγής και διατήρησης των επιπέδων των hsp27 μεταγραφων στην περίοδο αυτή της ανάπτυξης. 3. Το έντομο Ceratitis capitata Γενικά στοιχεία Η οικογένεια Tephritidae συγκροτείται από περίπου δίπτερα είδη. Από αυτά, τα είναι γνωστό ότι αναπτύσσονται σε ώριμα φρούτα, συμπεριλαμβανομένων καρπών οικονομικής σημασίας. Γενικότερα τα έντομα αυτά είναι γνωστά ως φρουτόμυγες ωστόσο η ανάπτυξη των προνυμφών τους δύναται να συμβεί και σε άλλα τμήματα του φυτούξενιστή, όπως είναι τα άνθη ή και οι βλαστοί. Τα κύρια τέσσερα γένη της οικογένειας είναι τα Ceratitis, Bartocera, Anastrepha και Rhagoletis, τα οποία περιλαμβάνουν σημαντικά παρασιτικά είδη (Malacrida et al., 2007; Immaculada, 2010). Το γένος Ceratitis είναι ενδημικό της τροπικής Αφρικής (Νότια Σαχάρα) και περιλαμβάνει περίπου 65 είδη. Ένα από αυτά είναι η μύγα C. capitata (εικόνα Β3.1), γνωστή ως και μεσογειακή μύγα. Η μεσογειακή μύγα είναι ένα ευρέως διαδεδομένο είδος το οποίο τα τελευταία 100 χρόνια έχει επεκταθεί από την περιοχή προέλευσής του σε ένα μεγάλο αριθμό χωρών. Σε αυτές περιλαμβάνονται οι χώρες της Μεσογείου, της Νότιας και Κεντρικής Αμερικής και η Αυστραλία. Στης περιοχές αυτές το είδος επιβιώνει σε μια ποικιλία κλιματικών συνθηκών (Malacrida et al., 1998). Η υψηλή ικανότητα της μεσογειακής μύγας στη αποίκηση νέων οικολογικών θώκων υποστηρίζεται από έναν μεγάλο αριθμό προσαρμοστικών μορφολογικών και φυσιολογικών χαρακτηριστικών καθώς και γνωρισμάτων συμπεριφοράς που απαντώνται σε κάθε αναπτυξιακό στάδιο του κύκλου ζωής, από τις προνύμφες μέχρι και τα ενήλικα άτομα. Για παράδειγμα, οι προνύμφες της μεσογειακής μύγας βρίσκονται προστατευμένες από τους θηρευτές τους μέσα στους καρπούς του φυτού-ξενιστή. Οι προνύμφες έχουν την ικανότητα να προσαρμόζουν την συμπεριφορά

42 ~ 42 ~ τους ώστε να βελτιστοποιούν την διαδικασία πρόσληψης τροφής καθώς μεταναστεύουν ενεργά στα πιο θρεπτικά μέρη του καρπού. Καθώς οι προνύμφες θα υποστούν τη διαδικασία της βομβυκίωσης, η αναχώρηση τους από τους καρπούς προς το έδαφος πραγματοποιείται με ρυθμό και σε χρόνο τέτοιο ώστε να ελαχιστοποιηθούν οι πιθανότητες να καταναλωθούν από επίδοξους θηρευτές, όπως είναι τα μυρμήγκια. Η συμπεριφορά των ενηλίκων είναι ιδιαίτερα πολύπλοκη και, αντίθετα με άλλα βραχύβια έντομα τα οποία προσανατολίζονται κυρίως στην αναπαραγωγή, αυτά εδώ συνεχίζουν να τρέφονται με τον ίδιο ρυθμό όπως όταν ήταν προνύμφες. Η πολύ πλούσια διατροφή τους βασίζεται στους υδατάνθρακες και στις πρωτεΐνες κάτι που εξασφαλίζει υψηλά ποσοστά αναπαραγωγικής επιτυχίας. Ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό της C. capitata είναι η υψηλή πλαστικότητα στην ωοαποθετική συμπεριφορά, φαινόμενο που αντανακλά την ικανότητα αποικισμού ποικίλων θώκων. Επιπλέον, η αναπαραγωγική ικανότητα των θηλυκών ενηλίκων ατόμων χαρακτηρίζεται από τον σταθερό ρυθμό ωοαπόθεσης (Malacrida et al., 2007). Εικόνα Β3.1. Αρσενικό, ενήλικο άτομο Ceratitis capitata (Wiedemann). Φωτογραφία από USDA. Η μεσογειακή μύγα θεωρείται ως ένα από τα πιο καταστροφικά παρασιτικά έντομα λόγω της παγκόσμιας εξάπλωσής της, του μεγάλου εύρους ξενιστών που προσβάλει και της ταχείας διασποράς της που οφείλεται στην επέκταση του παγκόσμιου εμπορίου και στα διεθνή ταξίδια (συμπεριλαμβανομένων οι προσωπικές αποσκευές και το ταχυδρομείο), λόγω του αυξανόμενου εμπορίου των αγροτικών προϊόντων, της καλλιέργειας φυτών επιδεκτικά μόλυνσης από την μεσογειακή μύγα κοντά σε κατοικημένες περιοχές, της μετανάστευσης καθώς και άλλων (Bergsten et al., 1999; Immaculada, 2010). Ταξινόμηση Class Order Suborder Insecta Diptera Brachycera Infaorder Muscomorpha (ή Cyclorrhapha) Family Subfamily Tribe Genus Subgenus Species Tephritidae Dacinae Ceratitidini Ceratitis Ceratitis Ceratitis capitata (Wiedemann), 1984

43 ~ 43 ~ Συνώνυμα Ceratitis citriperda MacLeay Ceratitis hispanica Da Brême Paradalaspis asparagi Bezzi Tephritis capitata Wiedemann Ceratitis capitata (Wiedemann) Κύκλος ζωής Η μεσογειακή μύγα είναι ένα ολομετάβολο έντομο με τέσσερα αναπτυξιακά στάδια: έμβρυο, προνύμφη, νύμφη και ενήλικο άτομο. Το είδος ξεκινάει τον κύκλο ζωής του όταν το ενήλικο θηλυκό τρυπήσει το δέρμα (skin) του καρπού και αποθέσει από ένα έως και δέκα αυγά. Τα αυγά εκκολάπτονται και αναπτύσσονται σε προνύμφες οι οποίες στην πορεία της ανάπτυξής τους μεταπίπτουν σε νύμφες από τη στιγμή που θα πέσουν από τους καρπούς στο έδαφος. Από τις νύμφες εξέρχονται τα ενήλικα άτομα (Immaculada, 2010). Ο χρόνος που απαιτείται για να ολοκληρώσει μία μεσογειακή μύγα τον κύκλο ζωής της σε καιρικές συνθήκες καλοκαιριού είναι μέρες. Ένα θηλυκό άτομο αποθέτει ένα με δέκα αυγά σε μία κοιλότητα βάθους 1 mm και μπορεί να αποθέσει έως και 22 αυγά την ημέρα, ενώ κατά την διάρκεια της ζωής της αποθέτει έως και 800 με μέσο όρο τα 300 αυγά. Τα θηλυκά συνήθως πεθαίνουν μετά την παύση της ωοαπόθεσης. Τα αυγά αποτίθενται κάτω από το δέρμα του καρπού το οποίο μόλις έχει αρχίσει να ωριμάζει. Αρκετά θηλυκά μπορεί να χρησιμοποιήσουν την ίδια κοιλότητα για να αποθέσουν τα αυγά τους, με 75 ή και παραπάνω αυγά να δύναται να βρεθούν στην ίδια κοιλότητα. Όταν τα αυγά εκκολάπτονται οι προνύμφες αμέσως αρχίζουν να τρέφονται και τα πρώτα κανάλια (tunnels) αρχίζουν να σχηματίζονται. Γενικά, για την ωοαπόθεση προτιμώνται οι καρποί που δεν έχουν ακόμα ωριμάσει καλά, συγκριτικά με τους πλήρως ώριμους καρπούς. Οι ώριμοι καρποί είναι περισσότερο χυμώδεις κάτι που σχετίζεται συχνά με υψηλή θνησιμότητα των αυγών και των νεαρών προνυμφών. Τα θηλυκά δεν ωοαποθέτουν όταν οι θερμοκρασίες πέσουν κάτω από τους 16 C. Κατά τη διάρκεια θερμών συνθηκών τα αυγά εκκολάπτονται σε μιάμιση με τρεις μέρες. Η διάρκεια του εμβρυϊκού σταδίου αυξάνεται σημαντικά σε χαμηλές θερμοκρασίες (Thomas et al., 2010). Τα αυγά της Μεσογειακής μύγας (εικόνα Β3.2) είναι μεγέθους 1 mm x 0.2 mm, κυρτά, γυαλιστερά, χρώματος λευκού όταν έχει συμβεί πρόσφατα η ωοαπόθεση ενώ αποκτούν ένα κιτρινωπό χρώμα αργότερα. Το εμβρυϊκό στάδιο διαρκεί δύο ημέρες ενώ η ανάπτυξη σταματά όταν η θερμοκρασία πέσει κάτω από τους 11 C (Immaculada, 2010). Το προνυμφικό αναπτυξιακό στάδιο (εικόνα Β3.3) εμφανίζει τρία επιμέρους στάδια. Στο πρώτο η προνύμφη έχει μήκος 2 mm και στο τρίτο έχει μήκος mm και πλάτος mm. Η ανάπτυξη σταματά όταν η θερμοκρασία πέσει κάτω από τους 5 C, ενώ φυσιολογικά διαρκεί 7 8 ημέρες (Immaculada, 2010). Εικόνα Β3.2. Αυγά της μεσογειακής μύγας, Ceratitis capitata (Wiedemann). Φωτογραφία από: Jeffery Lotz (Florida Department of Agriculture and Consumer Services-Division of Plant Industry), Εικόνα Β3.3. Προνύμφη της μεσογειακής μύγας, Ceratitis capitata (Wiedemann). Το κεφάλι είναι στα αριστερά (Thomas et al., 2010).

44 ~ 44 ~ Η νύμφη (εικόνα Β3.4) είναι κυλινδρική, μήκους mm και χρώματος κοκκινωπό καφέ. Η ανάπτυξη αυτού του σταδίου λαμβάνει χώρα σε θερμοκρασίες μεταξύ 22 C και 30 C. Το στάδιο αυτό διαρκεί 9-10 ημέρες ενώ σε χαμηλές θερμοκρασίες η διάρκεια μπορεί να παραταθεί για αρκετές ημέρες (Immaculada, 2010). Εικόνα Β3.4. Νύμφη της μεσογειακής μύγας, Ceratitis capitata (Wiedemann) (Thomas et al., 2010). Τα ενήλικα άτομα (εικόνα Β3.5) έχουν μήκος σώματος 4 mm κατά μέσο όρο. Είναι χρώματος μαύρου και άσπρου με κίτρινη κοιλιακή περιοχή και κίτρινα στίγματα στο θώρακα, ενώ και στα φτερά διακρίνονται κιτρινωπά μπαλώματα (εικόνα Β3.6). Τα δύο φύλα διαχωρίζονται εύκολα: τα αρσενικά άτομα χαρακτηρίζονται από ένα ζεύγος κεραιών στο κεφάλι που καταλήγουν σε πεπλατυσμένους σχηματισμούς ενώ χαρακτηριστικό γνώρισμα των θηλυκών ατόμων είναι ο προεξέχων ωοαποθέτης στο πίσω μέρος της κοιλίας, ο οποίος όταν εκτείνεται έχει μήκος 1.2 mm. Κάτω από εργαστηριακές συνθήκες τα αρσενικά ζουν 36 ημέρες στους 25 C, ενώ τα θηλυκά 31 ημέρες. Η βιωσιμότητα των θηλυκών, όταν καλλιεργούνται απουσία αρσενικών, υπό εργαστηριακές συνθήκες αγγίζει τις 67 ημέρες. Η διαδικασία ζευγαρώματος ξεκινάει με τα αρσενικά να εκκρίνουν μία φερομόνη και να ανακινούν τα φτερά τους για λεπτά. Όταν το θηλυκό πλησιάζει το αρσενικό, το περιτριγυρίζει, το αρσενικό κινεί το κεφάλι του και χτυπάει τα φτερά του, πηδάει πάνω στο θηλυκό και ξεκινάει η αναπαραγωγική πράξη. Η προ-ωοαποθετική περίοδος διαρκεί 4-6 ημέρες (Immaculada, 2010). Εικόνα Β3.5. Ραχιαία και πλευρική όψη ενήλικου ατόμου (Thomas et al., 2010). Εικόνα Β3.6. Ο θώρακας (πάνω) και τα φτερά (κάτω) της ενήλικης μεσογειακής μύγας (Thomas et al., 2010). Στην εικόνα Β3.7 περιγράφεται σχηματικά ο κύκλος ζωής της μεσογειακής μύγας. Εικόνα Β3.7. Ο κύκλος ζωής του εντόμου

45 ~ 45 ~ Γενετική της Ceratitis capitata Ο καρυότυπος της C. capitata αποτελείται από 5 ζεύγη αυτοσωμάτων και ένα ζεύγος φυλετικών χρωμοσωμάτων. Το φύλο του εντόμου καθορίζεται χρωμοσωματικά από την παρουσία του Υ χρωμοσώματος. Στη μεσογειακή μύγα, όπως και σε άλλα Δίπτερα, παρατηρούνται πολυταινικά χρωμοσώματα. Τα πολυταινικά χρωμοσώματα του εντόμου αντιπροσωπεύουν τα 5 αυτοσωμικά ζεύγη ενώ τα φυλετικά χρωμοσώματα δεν πολυταινίζονται (Γαρίου-Παπαλεξίου, 1998). Οικονομική σημασία και Βιολογικός έλεγχος Η ζημιά στους καρπούς προκαλείται από θηλυκά που έχουν ήδη ζευγαρώσει και τρυπούν το δέρμα των φρούτων με σκοπό να ωοαποθέσουν τα αυγά τους, αλλά και από τις προνύμφες οι οποίες τρέφονται από τη σάρκα του φρούτου. Με την ωοαπόθεση προκαλείται άμεση βλάβη καθώς επάγεται οξείδωση με επακόλουθη τη σήψη και την καταστροφή του καρπού. Οι προνύμφες τρέφονται σχηματίζοντας κανάλια τα οποία επιτρέπουν την είσοδο στον καρπό δευτερευόντων παθογόνων, όπως είναι διάφορα βακτήρια και μύκητες με αποτέλεσμα και σε αυτή την περίπτωση την καταστροφή του καρπού. Σε ένα φρούτο μπορεί να υπάρξει ένας μεγάλος αριθμός προνυμφών, έτσι η ζημιά που προκαλείται να είναι σχεδόν ολοκληρωτική (Bergsten et al., 1999; Immaculada, 2010). Στην εικόνα Β3.8 φαίνεται η παγκόσμια κατανομή του εντόμου. Εικόνα Β3.8. Παγκόσμιος χάρτης όπου φαίνεται η κατανομή των κυριότερων ειδών της φρουτόμυγας (Malacrida et al., 2007). Οι μύγες του γένους Ceratitis επιδεικνύουν υψηλή εξελικτική πλαστικότητα κάτι που τους επιτρέπει να υπερνικούν τις δυσκολίες που προβάλλουν μέσα από τη διαδικασία της φυσικής επιλογής και να βελτιστοποιούν ως συνέπεια την αναπαραγωγική τους επιτυχία. Το γένος Ceratitis εμπεριέχει περί τα 78 είδη ανάμεσα στα οποία το πιο επικίνδυνο, από άποψη οικονομικής σημασίας, είναι η μεσογειακή μύγα, C. capitata. Το είδος εντοπίζεται κυρίως στις τροπικές και εύκρατες περιοχές ενώ διαρκώς απειλεί με εισβολή καινούριους θώκους (Malacrida et al., 2007). Συγκριτικά με την D. melanogaster, το γονιδίωμα της μεσογειακής μύγας είναι τριπλάσιο σε μέγεθος της τάξεως των 540 Mb. Αυτό ενισχύει την υπόθεση ότι το γονιδίωμα της μεσογειακής μύγας είναι πλούσιο σε επαναλαμβανόμενο DNA (Gomulski et al., 2004), συμπεριλαμβανομένων των μεταθέσιμων γενετικών στοιχείων. Τα μεταθέσιμα αυτά στοιχεία φανερώνουν διαφορετικά επίπεδα ποικιλότητας, αφθονίας και κατανομής. Τα εν δυνάμει ενεργά πολλαπλά μεταθέσιμα γενετικά στοιχεία που εντοπίζονται στο γονιδίωμα των

46 ~ 46 ~ Αφρικανικών ειδών έχουν εκτιμηθεί από την ικανότητά τους να επάγουν φαινόμενα δυσγενεσίας υβριδίων και άλλων γενετικών ασταθειών. Ωστόσο η γενετική αναδιοργάνωση ως αποτέλεσμα της κινητικότητας των μεταθέσιμων γενετικών στοιχείων, είναι δυνατόν να οδηγήσει σε νέες ποικιλίες οι οποίες θα φέρουν ισχυρό πλεονέκτημα στο επίπεδο της προσαρμογής. Στην Drosophila έχει γίνει γνωστό ότι αυτή η κινητικότητα των μεταθέσιμων γενετικών στοιχείων οδηγεί στην αποίκιση νέων θώκων (Malacrida et al., 2007). Στην βόρεια Ελλάδα η C. capitata καταστρέφει σαρκώδη φρούτα και φρούτα με σκληρό κουκούτσι καθώς και λωτούς (Diospyros kaki L.). Η μεσογειακή μύγα αυξάνει σε πληθυσμό το φθινόπωρο με αποτέλεσμα να αποτελεί σοβαρή απειλή για τα μήλα (Malus sylvetris Mill.) τα οποία ωριμάζουν την περίοδο αυτή. Προκαλεί σοβαρές ζημιές στα μήλα όχι μόνο στη βόρεια Ελλάδα αλλά και σε άλλες περιοχές με παρόμοιες κλιματικές συνθήκες. Σχετικές μελέτες αναφέρουν ότι η διάρκεια του σταδίου της προνύμφης, η αύξηση και επιβίωση του εντόμου ποικίλει ανάμεσα στα διάφορα φρούτα όπως είναι το μήλο, η συκιά, το βερίκοκο, το ροδάκινο, το πορτοκάλι και το κυδώνι. Αυτό οδηγεί στο συμπέρασμα ότι τα διαφορετικά θρεπτικά συστατικά κάθε φρούτου επηρεάζουν σημαντικά τη διάρκεια του προνυμφικού σταδίου. Όσο υψηλότερο το επίπεδο σε πρωτεΐνες στη διατροφή της προνύμφης τόσο πιο σύντομο το προνυμφικό στάδιο και τόσο μεγαλύτερο το μέγεθος των ενήλικων ατόμων. Το ποσοστό σε πρωτεΐνες στα ώριμα φρούτα είναι υψηλότερο σε φυτά-ξενιστές που οδηγούν σε πιο σύντομα προνυμφικά στάδια, όπως είναι η συκιά, η ροδακινιά και η πορτοκαλιά σε αντίθεση με τη μηλιά. Εργαστηριακές μελέτες δείχνουν ότι συγκεκριμένες ποικιλίες μήλου είναι περισσότερο προτιμητέες από άλλες και αυτό σχετίζεται άμεσα με τη διαφορετικότητα στο πάχος του μεσοκαρπού καθώς όσο πιο λεπτό το πάχος τόσο περισσότερο αυξάνει η επιβίωση της προνύμφης (Papadopoulos et al., 2002). Αναφορικά με την αντιμετώπιση των κρουσμάτων επιδρομής από την μεσογειακή μύγα, έχουν αναπτυχθεί συγκεκριμένες στρατηγικές. Από τις πιο διαδεδομένες αφορούν τις τεχνολογίες παγίδευσης, την αντιμετώπιση με εντομοκτόνα αλλά και μεθόδους που δεν περιλαμβάνουν χημικά συστήματα. Η αποτελεσματική μέθοδος παγίδευσης αφορά σε κατάλληλες παγίδες που τοποθετούνται στα φυτά και πρόκειται για αντιμετώπιση μικρού εύρους περιοχών. Οι παγίδες αυτές (Jackson trap, McPhail trap, εικόνα Β3.9) προσελκύουν ενήλικα άτομα και συνήθως εκκρίνουν οσμές που ομοιάζουν με αυτή του φρούτου (Bergsten et al., 1999). Εικόνα Β3.9. Αριστερά, Jackson trap. Δεξιά, McPhail trap (Bergsten et al., 1999). Αρκετά εντομοκτόνα έχουν αποδειχθεί αποτελεσματικά στην αντιμετώπιση της μεσογειακή μύγας. Ωστόσο η επιτακτική ανάγκη για την προστασία του υδροφόρου ορίζοντα αλλά και άλλων ευπαθών περιοχών, όπως τα σχολεία και τα νοσοκομεία, καθιστούν αρκετούς περιορισμούς στη χρήση τους. Τα διαφορετικά εντομοκτόνα στοχεύουν και σε διαφορετικά στάδια της ανάπτυξης του εντόμου (Bergsten et al., 1999). Καθώς η αναγκαιότητα για τον

47 ~ 47 ~ περιορισμό της χρήσης εντομοκτόνων είναι υπαρκτή γίνεται προσπάθεια αντικατάστασης τους μέσω νέων τεχνικών. Στην Ισπανία έχει παρατηρηθεί η αντίσταση της φρουτόμυγας στο malathion ενώ εντομοκτόνα όπως τα malathion, fenthion και trichlorphon έχουν απαγορευτεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση. Τα τελευταία χρόνια χρησιμοποιούνται χημικά που είναι περισσότερο φιλικά ως προς το περιβάλλον, όπως είναι το spinosad, ωστόσο έχουν σημειωθεί ζημιές στα φρούτα. Η τεχνική η οποία μέχρι τώρα έχει αποδειχθεί ότι είναι αποτελεσματική όσο τα εντομοκτόνα για τον έλεγχο των πληθυσμών της μεσογειακής μύγας, είναι η τεχνική μαζικής παγίδευσης, όπως αναφέρεται παραπάνω (Navarro-Llopis et al., 2012). Μέχρι στιγμής οι μη χημικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο του πληθυσμού του εντόμου δεν είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικές από μόνες τους αλλά συνδυάζονται πολύ καλά σε συνεργασία με τη χρήση χημικών (Bergsten et al., 1999).. Η πιο πρακτική μη χημική μέθοδος αφορά στην μέθοδο SIT (Sterile Insect Technique). Η SIT είναι μία στρατηγική ελέγχου του πληθυσμού παρασιτικών εντόμων. Περιλαμβάνει την μαζική καλλιέργεια του παρασιτικού εντόμου-στόχου και την απελευθέρωση στο περιβάλλον από αέρος, στείρων ατόμων συνήθως αρσενικών. Τα στείρα αρσενικά ανταγωνίζονται με τα αρσενικά αγρίου τύπου για το ποια θα ζευγαρώσουν με τα θηλυκά που υπάρχουν στην περιοχή, με αποτέλεσμα την μείωση του γηγενούς πληθυσμού καθώς όσα θηλυκά ζευγαρώσουν με τα στείρα αρσενικά θα γεννήσουν απογόνους που θα πεθάνουν στα πρώτα στάδια της εμβρυογένεσης. Εάν στείρα αρσενικά άτομα απελευθερώνονται αρκετά συχνά και σε ικανό αριθμό τότε ο γηγενής πληθυσμός μειώνεται και τελικά εξαφανίζεται. Η τεχνική αυτή είναι αποτελεσματική όταν απελευθερώνονται τουλάχιστον 100:1 στείρα αρσενικά: αρσενικά άγριου τύπου (Bergsten et al., 1999; Schetelig et al., 2009). 4. Οι επιπτώσεις της επίδρασης χαμηλής θερμοκρασίας (cold shock) στα έντομα Τα έντομα επιβιώνουν σε μια ποικιλία περιβαλλοντικών συνθηκών ανάμεσα στις οποίες περιλαμβάνονται και περιοχές με πολύ χαμηλές θερμοκρασίες. Οι στρατηγικές που αναπτύσσουν τα έντομα για την ανεκτικότητα σε πολύ χαμηλές θερμοκρασίες έχουν κατηγοριοποιηθεί σε δύο κύριες ομάδες: Τα έντομα αντιμετωπίζουν το ψύχος είτε με το να αναπτύσσουν μηχανισμούς ανεκτικότητας έναντι του παγώματος (freeze-tolerant) είτε με το να επιβιώνουν αποφεύγοντας το πάγωμα (freeze-avoidance). Πιο συγκεκριμένα, στην πρώτη κατηγορία περιλαμβάνονται τα έντομα που επιβιώνουν παρά τον σχηματισμό πάγου στο εσωτερικό τους, ενώ στην δεύτερη κατηγορία η επιβίωση επέρχεται με το να διατηρούν τα υγρά του σώματός τους σε υγρή κατάσταση αποτρέποντας το σχηματισμό πάγου. Τα έντομα επομένως ακολουθούν είτε τη μία είτε την άλλη στρατηγική χωρίς ωστόσο αυτό να αποτελεί μια απόλυτη κατάσταση καθώς υπάρχουν είδη που μπορούν να κινούνται ανάμεσα σε αυτούς τους δύο μηχανισμούς επιβίωσης (Sinclair et al., 2003). Οι κυριότερες αλλαγές που παρατηρούνται κατά την σταδιακή πτώση της θερμοκρασίας στους 0 C είναι η αύξηση των επιπέδων της γλυκόζης ενώ παρατηρούνται αλλαγές και στις μεμβράνες των κυττάρων με την αύξηση του ποσοστού των ακόρεστων λιπαρών οξέων έναντι των κορεσμένων. Ακόμη, παρατεταμένη έκθεση σε χαμηλές θερμοκρασίες οδηγεί στην αύξηση της έκφρασης ενός αριθμού διαφορετικών γονιδίων ανάμεσα στα οποία είναι τα antifreeze και τα heat shock γονίδια (Clark & Worland, 2008).

48 ~ 48 ~ Antifreeze proteins, AFPs Οι antifreeze πρωτεΐνες (antifreeze proteins, AFPs) ορίζονται ως οι πρωτεΐνες εκείνες που μπορούν και αναπτύσσουν ισχυρούς δεσμούς με τον πάγο. Σε μία κατάσταση όπου παρατηρείται ισορροπία ανάμεσα στην κατάσταση του πάγου και αυτή του υδάτινου διαλύματος, μια μικρή πτώση της θερμοκρασίας θα οδηγήσει στη μετατόπιση της ισορροπίας προς την στερεή κατάσταση με αποτέλεσμα πολλά διαλυτά μόρια, όπως είναι η πληθώρα των πρωτεϊνών, να εκδιωχθούν από το αναπτυσσόμενο κρυσταλλικό πλέγμα. Οι AFPs διαφοροποιούνται από αυτό το μοντέλο καθώς απορροφούν τους σχηματιζόμενους κρυστάλλους και έτσι περιορίζουν το μέγεθός τους (εικόνα Β4.1) (Raymond & DeVries 1977; Davies et al., 2002). Αυτό που συμβαίνει είναι ότι οι AFPs ρίχνουν τη θερμοκρασία πήξης των σωματικών υγρών κάτω από τη θερμοκρασία πήξης του νερού, ένα φαινόμενο γνωστό ως θερμική υστέρηση Εικόνα Β4.1. Σχηματική απεικόνιση των υδρογονοδεσμών που μάλλον αναπτύσσουν οι AFPs με τον πάγο (Davies et al., 2002). (thermal hysteresis, TH) (Duman & DeVries, 1974; Clark & Worland, 2008). Στον πίνακα ΙΙΙ αναφέρονται τα έντομα που έχουν καταγραφεί έως τώρα τα οποία εκφράζουν AFPs. Πίνακας ΙΙΙ. Είδη εντόμων που εκφράζουν AFPs (Duman et al., 2004). Cold shock στη Drosophila melanogaster H μύγα D. melanogaster εντοπίζεται σε ένα ευρύ γεωγραφικά πεδίο, σε τροπικές αλλά και εύκρατες περιοχές όπου η θερμοκρασία και η κατανομή του νερού είναι οι δύο κυριότεροι

49 ~ 49 ~ παράγοντες οριοθέτησης του εν λόγω εύρους. Αντίθετα με τα έντομα που επιβιώνουν στο κρύο, η Drosophila είναι ευαίσθητη στις χαμηλές θερμοκρασίες εμφανίζοντας ένα αναπτυξιακό κατώφλι στους 9-10 C, chill coma ή αλλιώς απώλεια της νευρικής και μυϊκής διεγερσιμότητας στους 7 C και θνησιμότητα στους -5 C. Καθώς δεν σχηματίζεται πάγος στα σωματικά υγρά του εντόμου παρά μόνο όταν η θερμοκρασία αγγίξει τους -17 με -20 C, τα προαναφερθέντα γεγονότα ορίζονται γενικά ως cold shock (Qin et al., 2005). Οι Hsps συντίθενται όχι μόνο κάτω από την επίδραση θερμικού στρες αλλά και κατά την επανάκαμψη του εντόμου ύστερα από παρατεταμένη έκθεση σε χαμηλές θερμοκρασίες απουσία θερμικού στρες (Burton et al., 1988). Γενικά η προσαρμογή σε συνθήκες χαμηλών θερμοκρασιών είναι ένα φαινόμενο που έχει παρατηρηθεί σε αρκετές μύγες και οδηγεί στην μείωση της θνησιμότητας όταν τα έντομα αυτά μεταφέρονται σταδιακά στους -5 C ή -7 C. Δεν είναι πολύ ξεκάθαρες οι μεταβολικές αλλαγές που οδηγούν στην αύξηση της επιβίωσης, ωστόσο φαίνεται ότι διαδραματίζουν πολύ σημαντικό ρόλο αλλαγές στην έκφραση γονιδίων, όπως είναι η αύξηση της έκφρασης των hsps γονιδίων (Qin et al., 2005). Από σχετικές μελέτες παρατηρήθηκε η αύξηση των μεταγράφων που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες Hsp23, Hsp26 και Hsp83, καθώς και των αντίστοιχων πρωτεϊνών, ύστερα από παρατεταμένη έκθεση στο κρύο (Qin et al., 2005). Το 2010 δημοσιεύτηκε μια εργασία όπου hsps γονίδια μελετήθηκαν κατά την επανάκαμψη ενηλίκων ατόμων D. melanogaster ύστερα από την έκθεση τους σε χαμηλές θερμοκρασίες (Colinet et al., 2010a). Τα άτομα εκτέθηκαν για εννέα ώρες στους 0 C και έπειτα αφέθηκαν να ανακάμψουν στους 25 C για οχτώ ώρες. Από τα γονίδια που μελετήθηκαν αυτά που εμφάνισαν πιο έντονη επαγωγή κατά την επανάκαμψη ήταν τα hsp70 και hsp68. Ακόμη, αύξηση στην έκφραση τους κατά την επανάκαμψη εμφάνισαν και τα γονίδια hsp40, hsp83 καθώς και τα τέσσερα shsps γονίδια (hsp22, hsp23, hsp26, και hsp27). Στον πίνακα IV αναγράφονται τα γονίδια που παίζουν ρόλο στην προσαρμοστικότητα στο κρύο, πάντα για την D. melanogaster. Πίνακας IV. Γονίδια που παίζουν ρόλο στην προσαρμοστικότητα σε χαμηλές θερμοκρασίες στη D. melanogaster (Clark & Worland, 2008). Το γονίδιο Frost (Fst) είναι ένα από τα λίγα γονίδια το οποίο έχει συσχετιστεί αποκλειστικά με την απόκριση στο στρες λόγω χαμηλών θερμοκρασιών. Φαίνεται ότι τα επίπεδα του Fst mrna αυξάνονται κατά την απόκριση στις χαμηλές θερμοκρασίες (Goto, 2001; Qin et al., 2005; Sinclair et al., 2007), αλλά και κατά την επανάκαμψη (Colinet et al., 2010b).

50 ~ 50 ~ Γ. Δημιουργία διαγονιδιακών εντόμων 1. Το μεταθετό στοιχείο piggybac Τα μεταθετά στοιχεία είναι κινητά τμήματα DNA και υπάρχουν στο γονιδίωμα όλων των οργανισμών και μπορούν να μετακινούνται ανάμεσα σε διαφορετικές θέσεις στο γονιδίωμα. Για το λόγο αυτό επηρεάζουν σημαντικά τη δομή του γονιδιώματος και κατ επέκταση αποτελούν σημαντικούς παράγοντες καθορισμού της εξέλιξης των γονιδίων (Kazazian, 2004). Ακόμη, τα μεταθετά στοιχεία χρησιμοποιούνται εκτενώς ως εργαλεία για την δημιουργία μεταλλάξεων και διαγονιδίων (Boeke, 2002). Το μεταθετό στοιχείο piggybac έχει μήκος 2472 kb με άκρα που φέρουν ανεστραμμένες επαναλήψεις (inverted terminal repeats, ITRs) των 13 bp και ανεστραμμένες επαναλήψεις (IRs) των 19 bp που εντοπίζονται 31 bp από το 5 ITR και 3 bp από το 3 ITR (Cary et al., 1989) (εικόνα Γ1.1). Ανάμεσα στις IRs αλληλουχίες υπάρχει μία μεταγραφική μονάδα 2.1 kb που φέρει ένα αναγνωστικό πλαίσιο μήκους 1.8 kb το οποίο κωδικοποιεί το ένζυμο μεταθετάση (transposase) (Elick et al., 1996). Εικόνα Γ1.1. Διάγραμμα του piggybac στοιχείου όπου φαίνονται οι ITRs και οι IRs αλληλουχίες. Το piggybac φέρει ένα αναγνωστικό πλαίσιο (ORF) μήκους 1.8 kb καθώς και οι αλληλουχία ένθεσης ΤΤΑΑ (Handler, 2002a). Η μετάθεση του piggybac συμβαίνει με ένα μηχανισμό όπου η αλληλουχία που βρίσκεται ανάμεσα στα ITRs αποκόπτεται και εντίθεται σε άλλη περιοχή του γονιδιώματος. Η ένθεση κατά κύριο λόγο είναι τυχαία αλλά απαιτεί την παρουσία ενός τεταρτονουκλεοτιδίου, του TTAA (εικόνα Γ1.2). Για να δουλέψει ένα σύστημα μετάθεσης piggybac απαραίτητα είναι δύο στοιχεία: μία DNA αλληλουχία προς μετάθεση η οποία θα φέρει στα άκρα της ITRs και μία πηγή του ενζύμου μεταθετάση το οποίο καταλύει την μετάθεση (εικόνα Γ1.3) (Fraser et al., 1996). Για να πραγματοποιηθεί μία μετάθεση, το ένζυμο μεταθετάση του piggybac επάγει την αποκοπή της αλληλουχίας προς μετάθεση που φέρει στα άκρα της ITRs από το πλασμίδιο/dna δότη. Η αποκοπή ξεκινάει με τη δημιουργία μιας εγκοπής στο 3 άκρο του μεταθετού στοιχείου. Το ελεύθερο 3 ΟΗ αντιδρά με το 5 άκρο της συμπληρωματικής αλυσίδας του μεταθετού στοιχείου, που φέρει το τεταρτονουκλεοτίδιο ΤΤΑΑ, και έτσι σχηματίζεται μία ενδομοριακή θηλιά, ταυτόχρονα απελευθερώνεται η αλληλουχία προς μετάθεση από το DNA δότη. Να σημειωθεί ότι η αλληλουχία προς μετάθεση, ή το μεταθετό στοιχείο, μετά την αποκοπή από το DNA δότη φέρει στα άκρα ΤΤΑΑ/ΑΑΤΤ. Η μεταθετάση στη συνέχεια ανοίγει τη θηλιά και εκθέτει τα 3 ΟΗ στα άκρα του μεταθετού στοιχείου τα οποία ακολούθως αντιδρούν με τα 5 άκρα της αλληλουχίας στόχου όπου και εδώ απαιτείται η παρουσία του τεταρτονουκλεοτιδίου ΤΤΑΑ. Μετά την αποκοπή του μεταθετού στοιχείου η αλληλουχία ΤΤΑΑ του DNA δότη επιδιορθώνεται (Mitra et al., 2008).

51 ~ 51 ~ Εικόνα Γ1.2. Σχηματική αναπαράσταση της piggybac μετάθεσης. Η μετάθεση ξεκινάει με την δημιουργία μιας εγκοπής στο 3 άκρο του μεταθετού στοιχείου οπότε και εκτίθενται οι 3 υδροξυλομάδες οι οποίες αντιδρούν με τα ΤΤΑΑ συμπληρωματικά άκρα της αλληλουχίας προς μετάθεση και έτσι δημιουργούνται δομές θηλιάς στα άκρα του μεταθετού στοιχείου. Οι δομές αυτές καταστρέφονται με την δράση της μεταθετάσης, οπότε και επανεκτίθενται οι 3 υδροξυλομάδες και ξαναδημιουργούνται τα ΤΤΑΑ άκρα στο 5 άκρο του μεταθετού στοιχείου. Το 3 ΟΗ του μεταθετού στοιχείου αντιδρούν με τις 5 Τ s της ΤΤΑΑ/ΑΑΤΤ αλληλουχίας στόχου. Επιδιόρθωση των κενών στα άκρα των νεοεντιθέμενου στοιχείου δίνουν γένεση στο διπλασίασμό της ΤΤΑΑ αλληλουχίας (Mitra et al., 2008). Εικόνα Γ1.3. Το σύστημα μετάθεσης piggybac συγκροτείται από δύο στοιχεία: ένα πλασμίδιο δότη που φέρει την αλληλουχία προς μετάθεση και ένα πλασμίδιο που κωδικοποιεί το ένζυμο μεταθετάση (Di Matteo et al., 2012).

52 ~ 52 ~ 2. Διαγονιδιακά έντομα Η δημιουργία διαγονιδιακών γενετικών σειρών εντόμων με τη χρήση μεταθετών στοιχείων είναι μία εξαιρετικά χρήσιμη τεχνική για την μελέτη της λειτουργίας των γονιδίων (Wimmer, 2003) αλλά και για την ανάπτυξη διαγονιδιακών στελεχών με σκοπό τον βιολογικό έλεγχο των πληθυσμών αγρίου τύπου, όπως είναι η τεχνική SIT (Robinson et al., 2004). Το σύστημα μετάθεσης piggybac είναι ένα ευρέως διαδεδομένο σύστημα για την δημιουργία διαγονιδιακών εντόμων. Φαίνεται ότι το piggybac δρα ως ένα αποτελεσματικός μεταλλάκτης και ότι ένθεση μπορεί να είναι θανατογόνος σε ποσοστό 22%. Ένα μεγάλο ποσοστό των ενθέσεων παρατηρείται μετά την περιοχή έναρξης της μεταγραφής και μάλιστα μέσα στην κωδική περιοχή. Σε αυτό το φαινόμενο αποδίδονται τα υψηλά ποσοστά θνησιμότητας και όχι σε κάποια θανατογόνο μετάλλαξη που δημιουργήθηκε στο γονιδίωμα λόγω ένθεσης (Thibault et al., 2004). Η θέση της ένθεσης μπορεί να επηρεάσει την έκφραση του διαγονιδίου, μια κατάσταση που καλείται φαινόμενο θέσης. Όταν η ένθεση για παράδειγμα συμβεί σε περιοχή κοντά σε κάποιο ιστο-ειδικό ενισχυτή μπορεί να οδηγήσει στην έκφραση του διαγονιδίου σε ιστούς ή αναπτυξιακά στάδια διαφορετικά από τα επιθυμητά (O Kane & Gehring, 1987). Το φαινόμενο θέσης μπορεί να περιοριστεί με το να πλαισιωθεί το διαγονίδιο με μονωτές. Οι μονωτές είναι ρυθμιστικά στοιχεία και συγκροτούν ανεξάρτητες επικράτειες μεταγραφικής δραστηριότητας μέσα στο γονιδίωμα. Οι μονωτές φέρουν δύο λειτουργικές ιδιότητες. Πρώτον, εμποδίζουν την ενεργότητα ενισχυτών (enhancers) και αποσιωπητών (silencers) όταν εντίθενται ανάμεσα σε αυτά τα ρυθμιστικά στοιχεία και στον υποκινητή (εικόνα Γ2.1α). Έτσι οι μονωτές περιορίζουν την δράση των ενισχυτών και των αποσιωπητών στους υποκινητές-στόχους και αυτό γίνεται χωρίς την απενεργοποίηση αυτών των στοιχείων (Cai & Levine, 1995; Kuhn & Geyer, 2003). Δεύτερον, οι μονωτές προστατεύουν την γονιδιακή έκφραση από θετικές και αρνητικές επιδράσεις της χρωματίνης (εικόνα Γ2.1β). Οι μηχανισμοί αυτοί εμπλέκονται στην προστασία από επιδράσεις λόγω της δομής της γειτονικής χρωματίνης ή στον περιορισμό των διάδοσης της αποσιώπησης της γονιδιακής έκφρασης λόγω της χρωματίνης που σε αυτήν την περίπτωση δρα κατασταλτικά (Cuvier et al., 2002; Kuhn & Geyer, 2003). Στη Drosophila οι μονωτές που χρησιμοποιούνται κυρίως είναι οι scs και scs', τμήμα του gypsy μεταθετού στοιχείου και το στοιχείο β-globin 5' HS4 της όρνιθας (Sarkar et al., 2006). Εικόνα Γ2.1. Ιδιότητες των μονωτών. (α) Οι μονωτές ( ) εμποδίζουν την δράση των ενισχυτών: (i) ένας μονωτής εντίθεται ανάμεσα σε έναν ενισχυτή ( ) και σε έναν υποκινητή ( ) και έτσι εμποδίζει την μεταγραφή, (ii) ενώ όταν ο μονωτής τοποθετείται ανοδικά ενός ενισχυτή ( ) τότε δεν επιδρά καθόλου στην γονιδιακή έκφραση. (β) Οι μονωτές προλαμβάνουν το φαινόμενο θέσης λόγω δομής της χρωματίνης: Ένα διαγονίδιο ( ) περιβάλλεται από μονωτές οι οποίοι το προστατεύοθν από την αποσιώπηση λόγω της κατασταλτικής δομής της χρωματίνης (αριστερά) (Kuhn & Geyer, 2003).

53 ~ 53 ~ Ο γενετικός μετασχηματισμός εντόμων είναι εφικτός με τη χρήση πέντε φορέων μεταθετών στοιχείων. Οι φορείς αυτοί είναι το στοιχείο P, mariner, Minos, Hermes και piggybac (Handler, 2002b; Robinson et al., 2004). Οι φορείς που έχουν κατασκευαστεί και βασίζονται στα παραπάνω μεταθετά στοιχεία έχουν χρησιμοποιηθεί για τον μετασχηματισμό 15 ειδών εντόμων περιλαμβάνοντας τα Δίπτερα, Υμενόπτερα, Λεπιδόπτερα και Κολεόπτερα. Για τον μετασχηματισμό της μεσογειακής μύγας έχουν χρησιμοποιηθεί τα Minos (Loukeris et al., 1995), piggybac (Handler et al., 1998) και Hermes (Michel et al., 2001). Η διάκριση των γενετικά μετασχηματισμένων ατόμων γίνεται με κατάλληλους γενετικούς δείκτες όπως το γονίδιο white (Robinson et al., 2004).

54 ~ 54 ~ Υλικά και Μέθοδοι

55 ~ 55 ~ Υλικά και Μέθοδοι 1. Καλλιέργεια του εντόμου Ceratitis capitata Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε εργαστηριακός πληθυσμός του εντόμου Ceratitis capitata ο οποίος προέρχεται από το Μπενάκειο Φυτοπαθολογικό Ινστιτούτο. Ο συγκεκριμένος πληθυσμός θεωρείται ως φυσιολογικό ή αγρίου τύπου στέλεχος και διαθέτει τη φυσιολογική δομή για όλα τα χρωμοσώματά του (Zacharopoulou, 1990). Η καλλιέργεια του εντόμου πραγματοποιείται σε ειδικό θάλαμο σταθερής θερμοκρασίας 25 ο C, με σχετική υγρασία 70% και 12ωρο φωτοπεριοδισμό. Τα στελέχη του εντόμου διατηρούνται μαζικά σε κλουβιά από plexi glass τα οποία στη μία τους πλευρά, που είναι στραμμένη προς το φως, φέρουν λεπτό συνθετικό ύφασμα (οργαντίνα) εύκολα διαπερατό από τον ωοαποθέτη των θηλυκών ατόμων. Η τροφή των ενηλίκων ατόμων αποτελείται από ζάχαρη και ξηρή μαγιά (Biolux Βελγίου) σε αναλογία 1:1 ενώ το απαραίτητο νερό το παίρνουν από σπογγώδες υλικό τύπου wettex που βρίσκεται είτε στην οροφή, είτε στο πλαϊνό μέρος του κλουβιού και εμποτίζεται από ειδική παροχετευτική διάταξη. Τα θηλυκά άτομα μιμούμενα τη συμπεριφορά των αγρίων στη φύση, όπου τρυπούν το φρούτο για να αφήσουν τα αυγά τους, διαπερνούν το συνθετικό ύφασμα του κλουβιού με τον ωοαποθέτη τους και αφήνουν τα αυγά στην εξωτερική επιφάνεια. Από εκεί τα αυγά πέφτουν σε μικρό τρυβλίο petri με νερό ώστε να μην ξεραθούν. Τα αυγά συλλέγονται με διήθηση του νερού σε συνθετικό ύφασμα και μεταφέρονται στην επιφάνεια ειδικής τροφής για καλλιέργεια προνυμφών, που βρίσκεται μέσα σε τρυβλίο petri, το καπάκι του οποίου είναι διάτρητο ώστε να αερίζονται οι προνύμφες. Στα αεριζόμενα αυτά τρυβλία petri, πραγματοποιείται τόσο η εμβρυογένεση, η οποία διαρκεί περίπου 48 ώρες, όσο και η ανάπτυξη των προνυμφών. Το θρεπτικό υλικό στο οποίο αναπτύσσονται τα προνυμφικά στάδια του εντόμου αποτελείται από: Νερό βρύσης Μαγιά Ζάχαρη Χαρτοβάμβακας (κομμένος σε μικρά τεμάχια) Διάλυμα Α (5,3% χοληστερόλη σε 25% αιθανόλη) Διάλυμα Β (14,5% HCl) Διάλυμα Γ (12,5% βενζοϊκό νάτριο σε 71,2% αιθανόλη) 500 ml 30 gr 30 gr 30 gr 10 ml 10 ml 8,5 ml Τα παραπάνω συστατικά αναμιγνύονται σε ομογενοποιητή (Sorval), μέχρι να προκύψει ένας ομοιογενής πολτός, ο οποίος μπορεί να διατηρηθεί στους 4 o C ως και 15 μέρες. Οι προνύμφες τρέφονται με αυτό το μίγμα και αναπτύσσονται με δύο διαδοχικές εκδύσεις. Το προνυμφικό στάδιο διαρκεί περίπου 6 μέρες σε θερμοκρασία 24±1 o C. Την έκτη μέρα της ανάπτυξής τους οι προνύμφες εκτινάσσονται με χαρακτηριστικό τρόπο (jumping) και εγκαταλείπουν το τρυβλίο petri με την τροφή για να προσγειωθούν σε ένα λεπτό στρώμα άμμου που το περιβάλλει. Εκεί αρχίζει και ολοκληρώνεται η βομβυκίωση των προνυμφών, με αποτέλεσμα το σχηματισμό της νύμφης, η οποία από άσπρο χρώμα (white pupa) σταδιακά σκουραίνει μέχρι να αποκτήσει καφέ χρώμα. Το στάδιο αυτό διαρκεί 9-10

56 ~ 56 ~ μέρες και μέσα σε αυτό το διάστημα οι νύμφες συλλέγονται και τοποθετούνται μέσα σε τρυβλία petri μέχρι να πραγματοποιηθεί η μεταμόρφωσή τους σε ενήλικα άτομα. Μόλις τα ενήλικα εκκολαφθούν, συλλέγονται και τοποθετούνται σε καθαρά κλουβιά ώστε να διατηρηθεί η καλλιέργεια. Συγχρονισμός καλλιέργειας Η ανάπτυξη των ατόμων μιας μαζικής καλλιέργειας της μεσογειακής μύγας παρουσιάζει αρκετή ποικιλότητα, με αποτέλεσμα να είναι απαραίτητος ο συγχρονισμός των καλλιεργειών ώστε να εξασφαλιστεί ότι τα άτομα τα οποία συλλέγονται για να μελετηθούν βρίσκονται στο ίδιο αναπτυξιακό στάδιο. Ο συγχρονισμός αυτός πραγματοποιείται ως εξής: Συλλογή αυγών: Τα αυγά συλλέγονται από τις μαζικές καλλιέργειες των εντόμων μέσα σε χρονικό διάστημα 20 λεπτών. Στη συνέχεια τοποθετούνται σε χαρτί whattman πάνω σε σπογγώδες νωπό υλικό (wettex) και μέσα σε ένα τρυβλίο petri. Τα αυγά επωάζονται στις συνθήκες στις οποίες αναπτύσσονται οι μαζικές καλλιέργειες. Συλλογή νεοεκκολαπτόμενων προνυμφών: Οι προνύμφες οι οποίες εκκολάπτονται μέσα σε χρονικό διάστημα 15 λεπτών συλλέγονται με λαβίδα και μεταφέρονται σε αεριζόμενο τρυβλίο petri το οποίο περιέχει τροφή για προνύμφες. Οι καλλιέργειες των προνυμφών επωάζονται στις συνθήκες ανάπτυξης των μαζικών καλλιεργειών. Συλλογή εκτινασσόμενων προνυμφών: Προς το τέλος του τρίτου προνυμφικού σταδίου οι προνύμφες παρουσιάζουν ένα χαρακτηριστικό πρότυπο συμπεριφοράς με βάση το οποίο εκτελούν άλματα στην προσπάθειά τους να εγκαταλείψουν την τροφή και να βρεθούν σε κατάλληλο στερεό υπόστρωμα ώστε να πραγματοποιηθεί η διαδικασία της βομβυκίωσης. Οι προνύμφες οι οποίες εγκαταλείπουν την τροφή πέφτουν σε κατάλληλο δοχείο με άμμο και συλλέγονται σε διάστημα 10 λεπτών. Στη συνέχεια τοποθετούνται σε τρυβλία petri τα οποία περιέχουν ένα λεπτό στρώμα άμμου. Συλλογή λευκών προβομβυκίων: Σε αυτό το στάδιο επιλέγονται οι προνύμφες εκείνες οι οποίες έχουν ακινητοποιηθεί στην άμμο και έχουν συρρικνωθεί σε μέγεθος αποκτώντας λευκό λείο επιδερμίδιο. Το στάδιο αυτό είναι χαρακτηριστικό της έναρξης της διαδικασίας σχηματισμού του προβομβυκίου (puparium formation). Συλλογή νεοεκκολαπτόμενων ενηλίκων: Συλλέγονται νεοεκκολαπτόμενα ενήλικα άτομα σε χρονικό διάστημα 15 λεπτών και τοποθετούνται σε ειδικά διαμορφωμένα πλαστικά δοχεία με παροχή νερού και τροφή ενηλίκων, όπως έχει ήδη περιγραφεί. Συγκεκριμένα συλλέχθηκαν τα εξής αναπτυξιακά στάδια για την αναπτυξιακή μελέτη του mrna του Cchsp2 (διατήρηση δειγμάτων σε υγρό άζωτο): Έμβρυα Προνύμφες Νύμφες Ενήλικα άτομα L3 (3 ημέρες Pf (σχηματισμός Μ0 (νεοεκκολαπτόμενα ανάπτυξης λευκού αρσενικά άτομα) προνυμφικού σταδίου) προβομβυκίου) Ε0 (μηδέν ώρες ανάπτυξης) Ε6 (6 ώρες ανάπτυξης) L5 (5 ημέρες ανάπτυξης προνυμφικού σταδίου) P4 (4 ημέρες ανάπτυξης νυμφικού σταδίου) F0 (νεοεκκολαπτόμενα θηλυκά άτομα) Ε12 (12 ώρες ανάπτυξης) Ε24 (24 ώρες ανάπτυξης) Ε48 (48 ώρες ανάπτυξης) J (στάδιο εκτινασσόμενων προνυμφών P8 (8 ημέρες ανάπτυξης νυμφικού σταδίου) Μ4 (αρσενικά άτομα 4 ημερών) F4 (θηλυκά άτομα 4 ημερών)

57 ~ 57 ~ Ανατομία προνυμφών, νυμφών και ενήλικων ατόμων C. capitata Υλικά -Διάλυμα Reager s: NaCl 130mM KCl 4,7 mm MgCl 2 1,8 mm KH 2 PO 4 0,74 mm Na 2 HPO 4 0,35 mm -Διάλυμα Robb s Για την παρασκευή του διαλύματος Robb s χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος Robb (Robb, 1969) κατά την οποία παρασκευάζονται δύο διαλύματα Α και Β: Διάλυμα Α (2x): NaCl 6.08 g KCl 5.96 g Γλυκόζη 3.60 g Σουκρόζη g MgSO 4.7H 2 O 0.59 g MgCl 2.6H 2 O 0.49 g CaCl 2.2H 2 O g H 2 O έως 2lt Διάλυμα Β(2x): Na 2 PO g KH 2 PO g Διόρθωση του ph με HCl 1N έως 6.75 H 2 O έως 2lt Τα δύο διαλύματα αποστειρώνονται ξεχωριστά και πριν την χρήση αναμιγνύονται σε αναλογία 1Α:1Β. Οι τελικές συγκεντρώσεις των συστατικών στο διάλυμα είναι: NaCl 2.6x10-2 M KCl 2.0x10-2 M Γλυκόζη 5.0x10-3 M Σουκρόζη 5.0x10-2 M MgSO 4 6.0x10-4 M MgCl 2 6.0x10-4 M CaCl 2 5.0x10-4 M Na 2 PO 4 1.0x10-3 M KH 2 PO 4 1.8x10-4 M ph: 6.5 Πορεία Απομονώθηκαν 20 ζεύγη όρχεων και 10 ζεύγη ωοθηκών, καθώς και 10 κεφάλια από αρσενικά και θηλυκά άτομα (ηλικίας τεσσάρων ημερών), για την μελέτη του αναπτυξιακού προτύπου του mrna του Cchsp27. Κατά την συλλογή των ιστών αυτοί διατηρούνταν σε διάλυμα Reager s και στη συνέχεια ψύχθηκαν σε υγρό άζωτο όπου και διατηρήθηκαν μέχρι την διαδικασία απομόνωσης του ολικού RNA. Η ίδια διαδικασία ακολουθήθηκε και για την απομόνωση 10 ζευγών σιελογόνων αδένων από τα στάδια J-24, J-12, J-6, J, Pf, Pf+6, Pf+12, Pf+24 *. Ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία για την απομόνωση των όρχεων, ωοθηκών (από

58 ~ 58 ~ νεοεκκολαπτόμενα ενήλικα και από ενήλικα ηλικίας μίας, δύο και τριών ημερών) και 30 ζευγών σιελογόνων αδένων με σκοπό την in vitro επώαση τους παρουσία εκδυσόνης, με τη διαφορά ότι οι ιστοί διατηρήθηκαν σε διάλυμα Robb s. Οι σιελογόνοι αδένες συλλέχθηκαν από τα στάδια J-24, J-12 και J. * J-24: 24 ώρες πριν την εκτίναξη των προνυμφών, J-12: 12 ώρες πριν την εκτίναξη των προνυμφών, J-6: 6 ώρες πριν την εκτίναξη των προνυμφών, J: στάδιο εκτίναξης των προνυμφών, Pf: στάδιο σχηματισμού λευκού προβομβυκίου, Pf+6: 6 ώρες μετά τον σχηματισμό λευκού προβομβυκίου, Pf+12: 12 ώρες μετά τον σχηματισμό λευκού προβομβυκίου, Pf+24: 24 ώρες μετά τον σχηματισμό λευκού προβομβυκίου. Επωάσεις ιστών in vitro παρουσία εκδυσόνης Υλικά Θρεπτικό μέσο Grace s (working medium: Grace s : 10% Ethanol = 5:1) Διάλυμα κυλοεξαμιδίου σε συγκέντρωση 5x10-6 Μ Διάλυμα εκδυσόνης σε συγκεντρώσεις 10-4 Μ, 10-5 Μ, 10-6 Μ και 5x10-6 Μ. Η εκδυσόνη (5 mg) διαλύθηκε σε 1 ml απόλυτης αιθανόλης και διατηρήθηκε σε συγκέντρωση 10-2 Μ στους -20 ο C. Πορεία Οι όρχεις, ωοθήκες και σιελογόνοι αδένες που απομονώθηκαν επωάστηκαν παρουσία κυκλοεξαμιδίου και εκδυσόνης ως εξής: ζεύγη όρχεων x 3, 10 ζεύγη ωοθηκών x 3 και 30 σιελογόνοι αδένες x 3 (από κάθε στάδιο) μεταφέρονται σε πηγαδάκια όπως φαίνεται στην εικόνα 1.1. Εικόνα 1.1. Σχεδιασμός πειράματος για την in vitro επώαση ιστού παρουσία εκδυσόνης. Στο πηγαδάκι Α1 επωάζεται ιστός σε θρεπτικό μέσο Grace s μόνο, στο Α2 ο ιστός επωάζεται πρώτα για μισή ώρα παρουσία κυκλοεξαμιδίου (cyclohex.), μετά προστίθεται η εκδυσόνη (ecd.) οπότε η επώαση συνεχίζεται για 5 ή 10 ώρες και στο Α3 επωάζεται ο ιστός παρουσία εκδυσόνης. Και στις τρεις περιπτώσεις η επώαση διαρκεί 5 ή 10 ώρες ενώ προηγείται επώαση μίας ώρας στο θρεπτικό μέσο. 2. Αρχικά οι ιστοί επωάζονται στο θρεπτικό μέσο Grace s. 3. Προστίθεται κυκλοεξαμίδιο σε συγκέντρωση 5x10-6 Μ και η επώαση συνεχίζεται για επιπλέον μισή ώρα.

59 ~ 59 ~ 3. Στην περίπτωση των όρχεων και ωοθηκών οι επωάσεις παρουσία εκδυσόνης έγιναν σε συγκεντρώσεις εκδυσόνης 10-4 Μ και 5x10-6 Μ για 5 ώρες. 4. Στην περίπτωση των σιελογόνων αδένων οι επωάσεις παρουσία εκδυσόνης έγιναν σε συγκεντρώσεις εκδυσόνης 10-4 Μ, 10-5 Μ, 10-6 Μ και 5x10-6 Μ για 5 ή 10 ώρες. Οι επωάσεις έγιναν στους 25 ο C. Μετά το πέρας των επωάσεων οι ιστοί συλλέχθηκαν και ψύχθηκαν σε υγρό άζωτο όπου και διατηρήθηκαν μέχρι την διαδικασία απομόνωσης του ολικού RNA. 2. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Η PCR είναι μία in vitro ενζυμική μέθοδος σύνθεσης και πολλαπλασιασμού DNA αλληλουχιών (Mullis, 1990). Το αρχικό υλικό για τη διεξαγωγή της PCR είναι ένα δείγμα DNA στο οποίο περιέχεται η αλληλουχία που πρόκειται να πολλαπλασιαστεί. Στην εικόνα 2.1 περιγράφεται διαγραμματικά η τεχνική της PCR. Εικόνα 2.1. Σχηματική περιγραφή της τεχνικής PCR (Watson et al., 2007). H DNA πολυμεράση χρησιμοποιεί μονόκλωνο DNA ως μήτρα για τη σύνθεση ενός συμπληρωματικού νέου κλώνου. Για να προκύψει μονόκλωνο DNA, αρκεί η θέρμανση του δίκλωνου DNA σε θερμοκρασία που πλησιάζει το σημείο βρασμού. Και οι δύο κλώνοι της διπλής έλικας μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη σύνθεση νέων μορίων. Καθώς το ένζυμο χρειάζεται ένα τμήμα δίκλωνου DNA ώστε να ξεκινήσει τη σύνθεση, προσθέτουμε δύο ειδικούς ολιγονουκλεοτιδικούς εκκινητές, συμπληρωματικούς με συγκεκριμένες περιοχές της αλυσίδας. Επομένως οι εκκινητές επιλέγονται κατάλληλα ώστε να υβριδοποιούνται εκατέρωθεν του τμήματος που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε. Στην πράξη, η τυπική απόδοση της τεχνικής ανέρχεται στο 10-30% της θεωρητικά μέγιστης. Παράγοντες που επηρεάζουν σημαντικά την απόδοση είναι το μήκος και η αλληλουχία του τμήματος που πρόκειται να διπλασιαστεί. Η DNA πολυμεράση συχνά δυσκολεύεται να αντιγράψει αλληλουχίες μεγάλου μήκους ή υψηλής περιεκτικότητας σε GC. Γενικά, πάντως, με την τεχνική της PCR παράγονται πάρα πολλά αντίγραφα (μετά από 32 κύκλους, δίκλωνα μόρια-στόχοι) και μπορεί κανείς να τα δει εύκολα μέσω ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα αγαρόζης βαμμένο με βρωμιούχο αιθίδιο. Για την βελτιστοποίηση της PCR είναι απαραίτητη η ρύθμιση πολλών παραμέτρων, όπως είναι η θερμοκρασία υβριδοποίησης των εκκινητών στην αλληλουχία-στόχο, οι συγκεντρώσεις των αλάτων και η χρονική διάρκεια κάθε επιμέρους βήματος. Επίσης, σημαντικό είναι ο σωστός σχεδιασμός των εκκινητών, των οποίων το ιδανικό μήκος κυμαίνεται από 18 έως 24 νουκλεοτίδια. Η DNA πολυμεράση που χρησιμοποιείται για την τεχνική της PCR είναι η θερμοανθεκτική Taq πολυμεράση. Η Taq

60 ~ 60 ~ πολυμεράση απομονώνεται από το βακτήριο Thermus aquaticus, το οποίο ζει στο νερό σε θερμοκρασία 75. Η βέλτιστη θερμοκρασία του ενζύμου είναι οι 72, ενώ είναι αρκετά σταθερό ακόμη και στους 94 (Watson et al., 2007). Ολιγονουκλεοτίδια αλληλουχίες έναρξης (primers) Για το σχεδιασμό των primers*, χρησιμοποιήθηκαν τα προγράμματα Oligo 4.0, National Biosciences Inc. και PC/GENE (Intelligenetics). Τα χαρακτηριστικά τα οποία πρέπει να διαθέτει ένας primer είναι: 1) Η αναλογία G/C και Α/Τ θα πρέπει να είναι περίπου 1:1. 2) Για να αποφευχθεί η σύνδεση των primers μεταξύ τους, πρέπει οι αλληλουχίες τους να μην είναι συμπληρωματικές κυρίως στο 3 άκρο τους. 3) Δεν θα πρέπει να υπάρχουν επαναλήψεις 3 ή περισσοτέρων C ή G στο 3 άκρο, κάτι που μπορεί να οδηγήσει σε λανθασμένη σύνδεση της αλληλουχίας έναρξης με περιοχές πλούσιες σε G και C βάσεις. 4) Να μην υπάρχουν εσωτερικές παλίνδρομες αλληλουχίες οι οποίες μπορεί να σχηματίσουν θηλιές. 5) Ο αριθμός των νουκλεοτιδίων ενός primer πρέπει να είναι τουλάχιστον 16, κατά προτίμηση 20 έως 24. 6) Οι τιμές των θερμοκρασιών τήξης Tm (melting temperature) πρέπει να είναι παρόμοιες, ενώ παρόμοιες πρέπει να είναι και οι συγκεντρώσεις τους. Υλικά (New England, Biolabs, Συστατικά Τελική Συγκέντρωση 5x OneTaq Standard 1x Reaction Buffer 10 mm dntps 200 µm 10 µm Forward Primer 0.4 µm 10 µm Reverse Primer 0.4µM OneTaq 5 units DNA Polymerase Template DNA variable Nuclease-free water up to 100μl Πορεία Σε σωληνάριο eppendorf προστίθενται 20μl 5x OneTaq Standard Reaction Buffer, 2 μl dntps, primers 4 μl ο καθένας, DNA 10ng, OneTaq DNA Polymerase 2 μl και προσθέτουμε H 2 O μέχρι τελικού όγκου 100 μl. Οι παράμετροι των κύκλων φαίνονται στο πίνακα Ι.

61 ~ 61 ~ Πίνακας Ι. Cycling Conditions Cycle Step Temperature Time (sec) Cycles ( o C) Initial denaturation Denaturation (gradient) 58 & x Annealing Extension 68 1min/kb Final extension 68 10min 1 Store 4 forever 3. Καθαρισμός του PCR προϊόντος Μετά το πέρας της PCR, ακολουθεί καθαρισμός του PCR προϊόντος με χρήση του πρωτοκόλλου DNA purification from PCR or other reactions (MN Nucleospin Extract II, MN-Macherey-Nagel) (εικόνα 3.1). Εικόνα 3.1. Σχηματική απεικόνιση του πρωτοκόλλου ( Πορεία Σημείωση: μέχρι 5 μg DNA και μέχρι 100 μl δείγματος ανά στήλη. 1) Προσθέτουμε ΝΤ buffer (200 μl /100 μl δείγματος) και αναδεύουμε με vortex. 2) Φορτώνουμε το διάλυμα στη στήλη και φυγοκεντρούμε για 1 min στα 11000g. 3) Ξεπλένουμε τη στήλη με 600 μl NT3 buffer και φυγοκεντρούμε για 1min στα 11000g. 4) Επαναλαμβάνουμε το βήμα-3 με 200 μl NT3 buffer (προαιρετικό). 5) Φυγοκεντρούμε τη στήλη για 2 min στα 11000g (ξηρή φυγοκέντρηση). 6) Ξηραίνουμε τη στήλη στους 70 για 5 min (προαιρετικό). 7) Ακολουθεί έκλουση της στήλης με 50 μl NE buffer και φυγοκέντρηση για 1 min στα 11000g. Το περιεχόμενο της στήλης φέρει το προϊόν της PCR και μεταφέρεται σε eppendorf όπου φυλάσσεται στους -20. Η αρχή της μεθόδου βασίζεται στο ότι το DNA, παρουσία χαοτροπικού άλατος προσδένεται με αντιστρεπτό τρόπο, στη silica (διοξείδιο του πυριτίου) μήτρα της στήλης. Αυτό συμβαίνει γιατί οι αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στη διπλή έλικα του DNA και στη silica μήτρα πιστεύεται ότι οφείλονται στην αφυδάτωση του φωσφοδιεστερικού σκελετού λόγω των χαοτροπικών αλάτων τα οποία επιτρέπουν στα εκτεθειμένα φωσφορικά κατάλοιπα να προσδένονται στη

62 ~ 62 ~ silica. Όντας πλέον ακινητοποιημένο το DNA στη silica μήτρα δεν μπορεί να εκλουστεί παρά μόνο όταν ενυδατωθεί από υδαρές buffer (Sambrook & Russel, 2001). Διάφορα αλάτια αλλά και διαλυτά μακρομόρια απομακρύνονται με ξέπλυμα της στήλης με το NT3 buffer το οποίο έχει ως βάση την αιθανόλη. Το DNA τελικά εκλούεται κάτω από συνθήκες χαμηλής ιοντικής ισχύος με το ελαφρά αλκαλικό NE buffer (5 mm Tris-HCl, ph 8.5). 4. Φωτομέτρηση DNA Με τη διαδικασία της φωτομέτρησης, είναι εφικτή όχι μόνο η εκτίμηση της συγκέντρωσης του δείγματος DNA, κάτι που άλλωστε μπορεί να πραγματοποιηθεί και μέσω της τεχνικής της ηλεκτροφόρησης, αλλά και η εκτίμηση της καθαρότητας του δείγματος. Η απορρόφηση μιας ουσίας εξαρτάται όχι μόνο από τη δομή αλλά και τη σύστασή της. Η οργανολογία ενός τυπικού φωτόμετρου απεικονίζεται στην εικόνα 4.1 (Brewer et al., 1974). Εικόνα 4.1. Σχηματική απεικόνιση φωτόμετρου (Brewer, 1974). Στην εικόνα 4.1 παρατηρούμε ότι το φως που εκπέμπεται από φωτεινή πηγή (light source) διαπερνά πρώτα το μονοχρωμάτορα (monochromator) ο οποίος αναλύει το φως σε όλες τις συχνότητες και μετά το δείγμα, η απορρόφηση του οποίου αποδίδεται στην οθόνη του μηχανήματος. Προτού τοποθετήσουμε το δείγμα στο φωτόμετρο, και αφού επιλέξουμε το μήκος κύματος, όπου στην προκειμένη επιλέγουμε τα 260 nm και 280 nm καθώς στο πρώτο απορροφά το DNA και στο δεύτερο απορροφούν οι πρωτεΐνες, μηδενίζουμε την ένδειξη της απορρόφησης με το τυφλό δείγμα, το οποίο δεν απορροφά και προσομοιάζει το προς μέτρηση δείγμα. Η απορρόφηση (Α) μιας ουσίας δίνεται από το νόμο του Beer: Α=abC, όπου a (ή ε) ο συντελεστής μοριακής απορρόφησης, b η οπτική διαδρομή (1cm) και C η συγκέντρωση του δείγματος.η καθαρότητα του δείγματος DNA, υπολογίζεται από το λόγο OD 260 /OD 280 > 1.8, ενώ η συγκέντρωση υπολογίζεται από τον τύπο C = OD 260 +(αραίωση)+50. Δηλαδή, αν π.χ. 3λ δείγματος αραιώθηκαν σε 600λ H 2 O τότε η αραίωση είναι 200, ενώ για απορρόφηση 1 OD 260 (DNA) η συγκέντρωση του δείγματος είναι 50 μg/μl. 5. Ηλεκτροφόρηση DNA σε πήκτωμα αγαρόζης Τεχνική η οποία εξυπηρετεί στο διαχωρισμό, ταυτοποίηση αλλά και απομόνωση μορίων DNA. Καθώς το DNA είναι αρνητικά φορτισμένο, κάτω από την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου, τρέχει σε πήκτωμα αγαρόζης με ταχύτητα η οποία είναι συνάρτηση του μήκους του, του φορτίου του και του σχήματος του. Τα μικρά τμήματα, γενικά, κινούνται γρηγορότερα από τα μεγάλα (εικόνα 5.1) (Watson et al., 2007).

63 ~ 63 ~ Εικόνα 5.1. Διαχωρισμός μορίων DNA διαφορετικού μεγέθους με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης (Watson et al., 2007) Η αγαρόζη είναι ένα γραμμικό πολυμερές που συντίθεται από D- και L-γαλακτόζη μέσω α- (1 3) και β-(1 4) γλυκοζιτικούς δεσμούς. Η δημιουργία πηκτώματος αγαρόζης έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός τρισδιάστατου δικτύου καναλιών που ποικίλουν από 50 έως 200nm (Norton et al., 1986). Οι παράγοντες που καθορίζουν τη μετανάστευση του DNA διαμέσου του πηκτώματος της αγαρόζης είναι: α) το μοριακό βάρος του DNA, β) η συγκέντρωση της αγαρόζης, γ) η διαμόρφωση του DNA, δ) η παρουσία βρωμιούχου αιθίδιου (EtBr) στο πήκτωμα και στο buffer της ηλεκτροφόρησης, ε) η εφαρμοζόμενη τάση, στ) ο τύπος της αγαρόζης και ζ) το buffer. της ηλεκτροφόρησης (Sambrook & Russel, 2001). Έτσι, ο ρυθμός με τον οποίο κινείται το DNA στο πήκτωμα είναι αντιστρόφως ανάλογος του λογαρίθμου (log10) του μοριακού του βάρους (Helling et al., 1974). Σε ότι αφορά τη συγκέντρωση της αγαρόζης, παρατίθεται ο πίνακας ΙΙ αναφορικά με τη διαμόρφωση του DNA, το υπερελικωμένο κυκλικό DNA, το κυκλικό με εγκοπές και το γραμμικό, μεταναστεύουν με διαφορετικούς ρυθμούς στο πήκτωμα αγαρόζης (Thorne, 1966, 1967). Η παρουσία EtBr ελαττώνει το αρνητικό φορτίο του DNA αυξάνοντας την ακαμψία αλλά και το μήκος του (Sharp et al., 1973), ενώ όταν η εφαρμοζόμενη τάση είναι χαμηλή ο ρυθμός μετανάστευσης του DNA είναι ανάλογος με την τάση. Αντίθετα όταν η τάση αυξηθεί κατά πολύ, τότε τα μόρια DNA με υψηλά μοριακά βάρη διαχωρίζονται με μη ομοιόμορφο τρόπο. Ο τύπος της αγαρόζης αφορά σε διαφορετικές θερμοκρασίες τήξης αυτής (Kirkpatrick, 1990), ενώ σχετικά με το buffer αναφέρεται ότι η ηλεκτροχημική κινητικότητα του DNA επηρεάζεται από την ιοντική δύναμη του buffer ηλεκτροφόρησης. Έτσι απουσία ιόντων, η ηλεκτρική αγωγιμότητα είναι ελάχιστη και το DNA μεταναστεύει πολύ αργά έως και καθόλου πολύ υψηλή συγκέντρωση ιόντων οδηγεί στην παραγωγή μεγάλων ποσών θερμότητας με αποτέλεσμα, σε ακραίες περιπτώσεις, το πήκτωμα να λιώσει ή το DNA να αποδιαταχθεί. Πίνακας ΙΙ. Αναλογία του % ποσοστού της αγαρόζης στο πήκτωμα με το μέγεθος τμημάτων DNA που μπορούν να αναλυθούν (Sambrook & Russel, 2001) % Αγαρόζη Μέγεθος DNA (Kb) bp to 25 kb bp to 15 kb bp to 12 kb bp to 6 kb bp to 4 kb bp to 3 kb bp to 25 kb bp to 15 kb bp to 12 kb

64 ~ 64 ~ Υλικά - Διάλυμα ηλεκτροφόρησης 0.5x TBE 1l διαλύματος 5x TBE: Tris-base 54 g Boric acid 27.5 g 0.4M EDTA 25 ml ph=8 H 2 O έως 1l - Διάλυμα DNA δειγμάτων 6x: 1.5g Ficoll 0.01g xylene cynol FF (XC) ή Bromophenol blue (BB) H 2 O 9.5 ml Αποθήκευση στους -20 ο C Πορεία Προετοιμάζουμε με θέρμανση το πήκτωμα Χ% σε αγαρόζη σε 1x ΤΒΕ προσθέτοντας 5 μl EtBr (σε τελική συγκέντρωση 1μg/ml) ανά 100 ml πηκτώματος. Το διάλυμα στερεοποιείται σε κατάλληλο υποδοχέα-μήτρα, ενώ στα δείγματα DNA προστίθεται διάλυμα δειγμάτων σε αναλογία 5 όγκοι δείγματος/1 όγκο διαλύματος. Τα δείγματα αναλύονται σε οριζόντια συσκευή ηλεκροφόρησης υπό σταθερή τάση 60V για περίπου 1 ώρα, σε ρυθμιστικό διάλυμα 1x ΤΒΕ. Μαζί με τα δείγματα τρέχουμε και κατάλληλο μάρτυρα. 6. Απομόνωση DNA από πήκτωμα αγαρόζης Για την απομόνωση μορίων DNA από πήκτωμα αγαρόζης, χρησιμοποιήθηκε το σύστημα MN Nucleospin Extract II της εταιρίας MN-Macherey-Nagel (εικόνα 3.1). Πορεία 1) Το DNA αναλύεται σε πήκτωμα αγαρόζης. Το πήκτωμα αποτελείται από 0.8% αγαρόζη σε τελικό όγκο 30 ml 1x TBE. 2) Όταν η ζώνη που μας ενδιαφέρει έχει διαχωριστεί πλήρως, κόβεται με νυστέρι και μεταφέρεται σε προζυγισμένο eppendorf. Το eppendorf με τη ζώνη, ζυγίζεται εκ νέου. 3) Προσθέτουμε NT buffer (2 μl/mg πηκτώματος) και επωάζουμε για 10 min στους 50. Ανάδευση σε vortex ώστε να διαλυτοποιηθεί πλήρως το πήκτωμα. 4) Φορτώνουμε το διάλυμα στη στήλη και φυγοκεντρούμε για 1 min στα 11000g. 5) Ξεπλένουμε τη στήλη με 600 μl NT3 buffer και φυγοκεντρούμε για 1min στα 11000g. 6) Επαναλαμβάνουμε το βήμα-5 με 200 μl NT3 buffer και φυγοκεντρούμε για 1 min στα 11000g. 7) Ακολουθεί ξηρή φυγοκέντρηση της στήλης για 2 min στα 11000g. 8) Η στήλη ξηραίνεται στους 70 για 5 min (προαιρετικό). 9) Η στήλη εκλούεται με 50 μl NE buffer, με φυγοκέντρηση για 1 min στα 11000g. 10) Για μεγάλα τμήματα DNA, χρησιμοποιούμαι προθερμασμένο NE buffer. 7. Αποφωσφορυλίωση γραμμικού πλασμιδιακού DNA Η ανταρκτική φωσφατάση είναι ένα ένζυμο το οποίο απομακρύνει τις φωσφορικές ομάδες από το 5 άκρο ενός γραμμικού DNA. Χρησιμοποιείται για την αποφωσφορυλίωση

65 ~ 65 ~ πλασμιδιακού DNA με συμπληρωματικά ή τυφλά άκρα ώστε τα άκρα του πλασμιδίου να μη μπορούν να συνδεθούν μεταξύ τους (Θεοδωράκη, 2005). Υλικά Ανταρκτική φωσφατάση [Antarctic Phosphatase (AnP) NEB-M0289 (5U/μl)]. 10x Antarctic Phosphatase Reaction Buffer: Bis-Tris-propane HCl 500mM, MgCl 2 10mM, ZnCl 2 1mM. Πορεία Πρωτόκολλο για 1-5 μg DNA (100 μl αντίδρασης). Αναμιγνύουμε το DNA με την κατάλληλη ποσότητα αποστειρωμένου miliq-h 2 O σε τελικό όγκο 88 μl. Προσθέτουμε 10 μl 10x Antarctic Phosphatase Reaction Buffer. Προσθέτουμε 2 μl ανταρκτική φωσφατάση και ανακινούμε ελαφρά. Επωάζουμε στους 37 C για 15min για 5 προεξέχοντα και τυφλά άκρα ή για 60min για 3 προεξέχοντα άκρα. Για απενεργοποίηση του ενζύμου επωάζουμε για 5min στους 60 C. 8. Αντίδραση σύνδεσης μορίων DNA Εφόσον έχει γίνει εκτίμηση της συγκέντρωσης του PCR προϊόντος αλλά και του φορέα, ακολουθεί η αντίδραση σύνδεσης των δύο αυτών μορίων. Το ένζυμο που καταλύει την αντίδραση αυτή είναι η DNA λιγάση. Όλοι οι ζωντανοί οργανισμοί συνθέτουν DNA λιγάση, αλλά το ένζυμο που χρησιμοποιείται στη γενετική μηχανική, συνήθως, έχει απομονωθεί από E. coli που είχε μολυνθεί με τον φάγο Τ4. Το ένζυμο in vivo, επιδιορθώνει τις ασυνέχειες που μπορεί να προκύψουν σε μία από τις δύο αλυσίδες δίκλωνου μορίου DNA. Μία τέτοια ασυνέχεια μπορεί να συμβεί όταν ο φωσφοδιεστερικός δεσμός ανάμεσα σε δύο νουκλεοτίδια απουσιάζει. In vitro, το ένζυμο DNA λιγάση δεν επιδιορθώνει μόνο τέτοιες ασυνέχειες, αλλά μπορεί επίσης να συνδέσει μεταξύ τους δύο διαφορετικά μόρια DNA, ή τα δύο άκρα του ίδιου μορίου καταλύοντας τη δημιουργία φωσφοδιεστερικού δεσμού μεταξύ των φωσφορικών ομάδων στα 5 άκρα και των υδροξυλομάδων στα 3 άκρα. Η σύνδεση μπορεί να αφορά μόρια DNA με συμπληρωματικά άκρα ή με τυφλά άκρα (Brown, 1986). Σύνδεση δίκλωνων μορίων με συμπληρωματικά άκρα Για να αποκτήσουμε 5 και 3 μονόκλωνα κολλώδη άκρα, αρκεί να πέψουμε τον φορέα και το ένθεμα με ένζυμα περιορισμού τα οποία πέπτουν ασύμμετρα μέσα στην αλληλουχία περιορισμού και αφήνουν συμπληρωματικά άκρα (Sambrook & Russel, 2001), οπότε, κατά την αντίδραση σύνδεσης φορέα και ενθέματος σχηματίζεται ένα νέο υβριδικό μόριο. Για τη σύνδεση τμημάτων DNA χρησιμοποιήθηκε το Quick Ligation Kit (New England - Biolabs) ενώ η αναλογία μόρια ενθέματος : μόρια φορέα ήταν 6 : 1. Υλικά Quick Ligaton Λιγάση Διάλυμα Σύνδεσης (10x): 500 mm Tris-HCl, 100 mm MgCl 2, 10 mm ATP, 100 mm Dithiothreitol, ph 7.5 Πορεία Πρωτόκολλο για 20 μl αντίδρασης: Αναμιγνύουμε τον φορέα με το ένθεμα, προσθέτουμε νερό μέχρι τελικό όγκο τα 9 μl και επωάζουμε για 5min στους 70 ο C. Προσθέτουμε 10 μl 2x ρυθμιστικό διάλυμα λιγάσης. Προσθέτουμε 1 μl λιγάσης και αναμιγνύουμε ελαφρά. Επωάζουμε για 5 min στους 25 (κολλώδη άκρα). Ακολουθεί μετασχηματισμός ή αποθηκεύουμε το διάλυμα στους -20 ο C.

66 ~ 66 ~ 9. Προετοιμασία δεκτικών κυττάρων (competent cells) για χημικό μετασχηματισμό Το 1970, οι Mandel και Higa περιέγραψαν μία μέθοδο επεξεργασίας δεκτικών κυττάρων Escherichia coli με σκοπό την επιμόλυνση τους από απομονωμένο φαγικό DNA (Mandel & Higa, 1970). Με μικρές τροποποιήσεις από τον Cohen και τους συνεργάτες του (Cohen et al, 1972), επιτεύχθηκε επιτυχημένος μετασχηματισμός με πλασμιδιακό DNA. Ακολούθησαν διάφορες τροποποιήσεις με σκοπό την βελτιστοποίηση της μεθόδου, ωστόσο η βασική αρχή παρέμενε η ίδια. Έτσι, συνοπτικά η τεχνική δημιουργίας δεκτικών κυττάρων με σκοπό την εισαγωγή ξένου DNA περιλαμβάνει: i) αρκετά πλυσίματα (washes) με κρύα διαλύματα NaCl, MgCl2 και /ή CaCl2, ii) επώαση με το ξένο DNA σε διάλυμα CaCl2 στους 0, iii) μικρής διάρκειας επώαση σε υψηλότερες θερμοκρασίες και iv) ανάπτυξη σε θρεπτικό μέσο και επιλογή των μετασχηματισμένων κυττάρων (Morrison, 1977). Δημιουργία δεκτικών κυττάρων με χρήση χλωριούχου ρουβιδίου (RbCl 2 ) Υλικά - Psi θρεπτικό υλικό: bacto-tryptone 2% bacto-yeast extract 0.5% MgSO4 0.5% Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με KOH στο 7.6 και στη συνέχεια αποστειρώνεται στο αυτόκαυστο. - SOB θρεπτικό υλικό: bacto-tryptone 2% bacto-yeast extract 0.5% NaCl 0.05% + άγαρ 1% Αφού διαλυθούν τα υλικά προσθέτουμε 1ml διαλύματος KCl 250mM και γίνεται εξισορρόπηση σε ph 7.0 με NaOH 10M. Ακολουθεί αποστείρωση στο αυτόκαυστο και στη συνέχεια προσθέτουμε 0.5 ml αποστειρωμένου διαλύματος MgCl 2Μ. - Tfb I διάλυμα: CH 3 COOK 30mM RbCl 2 100mM CaCl 2 10mM MnCl 2 50mM Glycerol 15% v/v Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με αραιό CH 3 COOH στο 5.8 και στη συνέχεια το διάλυμα αποστειρώνεται με διήθηση σε φίλτρο 0.45 μm. - Tfb II διάλυμα: MOPS 10mM CaCl 2 75mM RbCl 2 10mM Glycerol 15% v/v Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με αραιό NaOH στο 6.5 και στη συνέχεια το διάλυμα αποστειρώνεται με διήθηση σε φίλτρο 0.45 μm.

67 ~ 67 ~ Πορεία 1) Τρυβλίο SOB-άγαρ εμβολιάζεται με E. coli στέλεχος από stock γλυκερόλης (-70 ) και επωάζεται στους 37 για όλη τη νύχτα. 2) Από το τρυβλίο αυτό λαμβάνεται μοναδική αποικία με την οποία εμβολιάζονται 5 ml υγρού θρεπτικού μέσου και επωάζονται στους 37 για όλη τη νύχτα σε περιοδική ανάδευση (250 σ.α.λ.). 3) Από το προηγούμενο βήμα λαμβάνεται 1 ml καλλιέργειας με το οποίο εμβολιάζονται 100 ml υγρού θρεπτικού μέσου Psi. Ακολουθεί επώαση στους 37 με ανάδευση (~250 σ.α.λ.) μέχρι η απορρόφηση της καλλιέργειας να γίνει OD550 = 0.5. Στο σημείο αυτό παίρνουμε 850 μl καλλιέργειας, τα μεταφέρουμε σε σωληνάκι eppendorf και προσθέτουμε 150λ αποστειρωμένης γλυκερόλης. Αναδεύουμε καλά, ψύχουμε το eppendorf σε υγρό Ν2 και αποθηκεύουμε στους -70 (Βακτηριακό stock). 4) Η καλλιέργεια μεταφέρεται κάτω από άσηπτες συνθήκες σε κατάλληλο πλαστικό σωλήνα και ψύχεται για περίπου 15 λεπτά σε πάγο. 5) Τα κύτταρα φυγοκεντρούνται στις 4000 r.p.m. για 15 λεπτά στους 4 και αφού απορριφθεί το υπερκείμενο, ο σωλήνας αναστρέφεται για ένα λεπτό ώστε να απομακρυνθούν και τα τελευταία υπολείμματα θρεπτικού υλικού. 6) Τα κύτταρα επαναιωρούνται με ήπια ανάδευση σε 0.4 όγκους (40 ml) διαλύματος Tfb I (θερμοκρασίας 4 ) και διατηρούνται στον πάγο για 15 λεπτά. 7) Τα κύτταρα φυγοκεντρούνται ώστε να έχουμε στις 3000 r.p.m. για 10 λεπτά στους 4, το υπερκείμενο απορρίπτεται και ο σωλήνας αφήνεται ανεστραμμένος για περίπου 1 λεπτό ώστε να στεγνώσει πλήρως. 8) Τα κύτταρα επαναιωρούνται με ήπια ανάδευση σε 0.04 όγκους (4 ml) διαλύματος Tfb II (θερμοκρασίας 4 ) και διατηρούνται στον πάγο για 15 λεπτά. 9) Τα κύτταρα μοιράζονται σε κλάσματα των 100μl σε παγωμένα σωληνάκια eppendorf, τα οποία στη συνέχεια ψύχονται σε υγρό Ν2 και φυλάσσονται στους -70. Η όλη διαδικασία πραγματοποιείται σε άσηπτες συνθήκες (δουλεύουμε ανάμεσα σε δύο λύχνους). Ακολούθησε έλεγχος της απόδοσης και της ποιότητας των δεκτικών κυττάρων μέσω τριών μετασχηματισμών (βλ. πρωτόκολλο μετασχηματισμού). Οι δύο έγιναν με τα δεκτικά που κατασκευάστηκαν στο εργαστήριο χρησιμοποιώντας στη μία περίπτωση θρεπτικό υλικό που παρασκευάστηκε στο εργαστήριο ενώ στη δεύτερη θρεπτικό υλικό της εταιρίας (New England Biolabs). Ο τρίτος μετασχηματισμός έγινε με δεκτικά κύτταρα και θρεπτικό υλικό της εταιρίας Biolabs. Ο μετασχηματισμός ελέγχου έγινε με 1pg του πλασμιδίου puc 19 (50 pg/ul). 10. Μετασχηματισμός βακτηριακών κυττάρων με πλασμιδιακό DNA Μετασχηματισμός σε NEB10B δεκτικά κύτταρα (C3019H), ~10 9 αποικίες / μg πλασμιδίου 1) Ξεπαγώνουμε ( από της 70 όπου φυλάσσονται) σωληνάκι με 50 μl δεκτικών κυττάρων στον πάγο μέχρι και οι τελευταίοι κρύσταλλοι πάγου να εξαφανιστούν (~5min) 2) Προσθέτουμε 2 μl από την αντίδραση της λιγάσης και αναμιγνύουμε ελαφρά 3) Διατηρούμε το μίγμα στον πάγο για 30 min 4) Θερμικό σοκ της 42 για ακριβώς 30 sec 5) Τοποθετούμε στον πάγο για 5 min 6) Προθερμαίνουμε 950 μl SOC θρεπτικό υλικό σε σωλήνα των 50 ml (falcon)

68 ~ 68 ~ 7) Μεταφέρουμε το μίγμα στο προθερμασμένο SOC και επωάζουμε για 60 min σε περιοδική ανάδευση (250 σ.α.λ.) της 37 8) Επιστρώνουμε την κυτταρική καλλιέργεια (100 μl) σε τρυβλία διαλογής (LB-ampicillin) 9) Επωάζουμε τα τρυβλία για όλη τη νύχτα της 37 Μετασχηματισμός σε RbCl 2 δεκτικά κύτταρα, ~10 8 αποικίες / μg πλασμιδίου 1) Ξεπαγώνουμε ( από της 70 όπου φυλάσσονται) σωληνάκι με 50 μl δεκτικών κυττάρων στον πάγο μέχρι και οι τελευταίοι κρύσταλλοι πάγου να εξαφανιστούν (~5min) 2) Μεταφέρουμε 50 μl δεκτικών κυττάρων σε παγωμένο σωλήνα μετασχηματισμού ( σωλήνες πολύπροπενίου ) 3) Προσθέτουμε 2 μl από την αντίδραση της λιγάσης και αναμιγνύουμε ελαφρά 4) Διατηρούμε το μίγμα στον πάγο για 40 min 5) Θερμικό σοκ της 42 για ακριβώς 90 sec 6) Τοποθετούμε στον πάγο για 5 min 7) Προθερμαίνουμε 950 μl SOC θρεπτικό υλικό σε σωλήνα των 50 ml (falcon) 8) Μεταφέρουμε το μίγμα στο προθερμασμένο SOC και επωάζουμε για 60min σε περιοδική ανάδευση (250 σ.α.λ.) της 37 9) Επιστρώνουμε την κυτταρική καλλιέργεια (100 μl) σε τρυβλία διαλογής 10) Επωάζουμε τα τρυβλία για όλη τη νύχτα της 37 Παρατηρήσεις: Η προθέρμανση του SOC αρχίζει 10 min πριν από το θερμικό σοκ, όπου ποσότητα SOC μεταφέρεται σε υδατόλουτρο (37 ). Στα τρυβλία επιστρώνουμε 100 μl καλλιέργειας, οπότε χρησιμοποιούμε 2 τρυβλία. Στο πρώτο επιστρώνουμε 100 μl, ενώ πριν επιστρώσουμε το δεύτερο πραγματοποιείται φυγοκέντρηση της εναπομείναντος καλλιέργειας (900 μl) για 1 min στα 11000g, απομακρύνονται 800 μl από το υπερκείμενο, το ίζημα επαναιωρείται στα 100 μl που απομένουν τα οποία και επιστρώνονται στο δεύτερο τρυβλίο. Όταν επιστρώνουμε τα τρυβλία, αυτό γίνεται παρουσία λύχνου. Τα τρυβλία διαλογής φέρουν το κατάλληλο αντιβιοτικό αλλά και Xgal. Το Xgal (bromo-chloro-indolyl-galactopyranoside) χρησιμοποιείται ως ένδειξη για τον αν το κύτταρο εκφράζει το ένζυμο β-γαλακτοζιδάση το οποίο κωδικοποιείται από το γονίδιο lacz, καθώς το Xgal διασπάται από τη β-γαλακτοζιδάση. Έτσι, οι αποικίες εκείνες οι οποίες φέρουν ανέπαφο τον πολυσυνδέτη και άρα δεν έχουν ένθεμα, χρωματίζονται στο τρυβλίο μπλε μιας και έχουν το λειτουργικό lacz γονίδιο. Αντίθετα, οι ανασυνδυασμένες αποικίες εμφανίζονται με άσπρο χρώμα εφόσων το ένθεμα έχει εισαχθεί στον πολυσυνδέτη, κάτι που σημαίνει ότι δεν συνθέτουν το λειτουργικό ένζυμο άρα και το Xgal δεν διασπάται. 11. Απομόνωση πλασμιδιακού (ανασυνδυασμένου) DNA Για την απομόνωση του πλασμιδιακού DNA, ακολουθήθηκε πρωτόκολλο (εικόνα 10.1) που βασίζεται στη λύση των κυττάρων με NAOH και SDS. Χρησιμοποιήθηκε το σύστημα MN Nucleospin Plasmid (miniprep) της εταιρίας MN-Macherey-Nagel, το οποίο είναι κατάλληλο για μικρής κλίμακας απομόνωση πλασμιδιακού DNA. Το σύστημα αυτό έχει τυπική απόδοση <25 μg για 1-5 ml καλλιέργειας, και <40 μg για 5-10 ml καλλιέργειας ενώ είναι κατάλληλο για απομόνωση φορέων <15 Kbp. Στον πίνακα ΙΙΙ αναγράφονται οι προτεινόμενες απορροφήσεις στα 600 nm, ανάλογα με το μέγεθος της καλλιέργειας

69 ~ 69 ~ προκειμένου να απομονωθεί όσο το δυνατόν περισσότερο DNA και κοντά στην τυπική απόδοση. Πίνακας ΙΙΙ. Προτεινόμενες OD 600 OD Όγκος 15ml 8ml 5ml 4ml 3ml 2ml καλλιέργειας Υλικά -Διάλυμα STE: (100ml) 2ml 5M NaCl 0.5 ml 2M Tris-HCl, ph 8 0.2ml 0.5M EDTA (ή 0.25ml 0.4M EDTA) 97.3 ml miliq H 2 O Εικόνα Σχηματική απεικόνιση του πρωτοκόλλου ( ) - Διαλύματα του kit: Α1: περιέχει RNάση Α2: περιέχει NaOH το οποίο ανεβάζει το ph περίπου στο 10 και, όπως και το SDS, αποδιατάσσει τις πρωτεΐνες. Α3: όξινο διάλυμα, επαναφέρει το ph στο 7 οπότε και παρατηρείται επαναδιάταξη του DNA Α4: απορρυπαντικό ΑW: απορρυπαντικό ΑΕ: διάλυμα έκλουσης Πορεία 1) Επώαση 5 ml καλλιέργειας (από μοναδική αποικία) μετασχηματισμένων E. Coli σε θρεπτικό υλικό με κατάλληλο αντιβιοτικό για όλη τη νύχτα σε περιοδική ανάδευση (250 σ.α.λ.) στους 37. 2) Φυγοκέντρηση στις 7000 r.p.m. σε κλινική φυγόκεντρο για 15 min στους 4. Απορρίπτουμε το υπερκείμενο. 3) Επαναιώρηση κυττάρων σε 1 ml STE και μεταφορά σε eppendorf. Ακολουθεί καλή ανάδευση με vortex. 4) Φυγοκέντρηση στα 11000g για 30s ec. Απορρίπτουμε το υπερκείμενο 5) Προσθέτουμε 250 μl διαλύματος Α1 και επαναιωρούμε τα κύτταρα πολύ καλά με vortex Το Α1 σπάει τα κύτταρα.

70 ~ 70 ~ 6) Προσθέτουμε 250 μl διαλύματος Α2, αναμιγνύουμε ελαφρά αναστρέφοντας το eppendorf 6-8 φορές, επωάζουμε σε RT το μέγιστο για 5 min. Με το που προστίθεται το Α2 παρατηρείται εκχύλιση του DNA, καθώς το τοίχωμα και οι μεμβράνες των κυττάρων σπάνε. Ταυτόχρονα, και λόγω του αλκαλικού περιβάλλοντος, παρατηρείται αποδιάταξη του DNA, οπότε το ιξώδες του διαλύματος αυξάνει κάτι το οποίο γίνεται εμφανές. Χρωμοσωμικό και πλασμιδιακό DNA λοιπόν αποδιατάσσονται, ωστόσο στο πλασμιδιακό, καθ ότι κυκλικό, οι αλυσίδες παραμένουν ενωμένες. 7) Προσθέτουμε 300 μl διαλύματος Α3 και αναμιγνύουμε ελαφρά αναστρέφοντας το eppendorf 6-8 φορές. Καθώς το ph επανέρχεται στο 7, παρατηρείται επαναδιάταξη του DNA, πλασμιδιακού και χρωμοσωμικού. Όμως το χρωμοσωμικό DNA επαναδιατάσσεται μερικώς, αντίθετα με το πλασμιδιακό το οποίο επαναδιατάσσεται πλήρως. Έτσι, σχηματίζονται συσσωματώματα DNA-RNA- πρωτεΐνες τα οποία με τη φυγοκέντρηση, που ακολουθεί, καθιζάνουν ενώ το πλασμιδιακό DNA παραμένει στο υπερκείμενο. Το ιξώδες του διαλύματος μειώνεται. 8) Φυγοκέντρηση για 10 min (full speed). Κρατάμε το υπερκείμενο. 9) Προετοιμάζουμε τη στήλη, φορτώνουμε το υπερκείμενο και φυγοκεντρούμε στα 11000g για 1 min (απομακρύνουμε το έκλουμα). 10) Προσθέτουμε 600 μl διαλύματος Α4 και φυγοκεντρούμε στα 11000g για 1 min (απομακρύνουμε το έκλουμα). Το Α4, όπως και το AW, είναι απορρυπαντικό και απομακρύνει από τη silica μήτρα της στήλης ότι έχει απομείνει από RNA, πρωτεΐνες κλπ. 11) Προσθέτουμε 500 μl διαλύματος AW το οποίο έχουμε προθερμάνει στους 50 για 1 min, και φυγοκεντρούμε στα 11000g για 1 min (απομακρύνουμε το έκλουμα) (προαιρετικό). 12) Ακολουθεί ξηρή φυγοκέντρηση στα 11000g για 2 min (απομακρύνουμε το έκλουμα). 13) Μεταφέρουμε τη στήλη σε νέο σωληνάκι (eppendorf στο οποίο του έχουμε κόψει το καπάκι), και προσθέτουμε 50 μl ΑΕ. Επωάζουμε για 1 min σε RT και εκλούουμε το πλασμιδιακό DNA με φυγοκέντρηση στα 11000g για 1 min. Μεταφέρουμε το έκλουμα σε καινούριο eppendorf. 14) Φυγοκεντρούμε στα 11000g για 5 min. Μεταφέρουμε το έκλουμα σε καινούριο eppendorf 15) Φωτομετρούμε για την εκτίμηση της συγκέντρωσης του DNA και αποθηκεύουμε στους Απομόνωση ολικού RNA με τη χρήση του διαλύματος Tripure Isolation Reagent (Roche) Το διάλυμα Tripure Isolation Reagent της εταιρείας Roche, είναι ένα χρώματος κόκκινο μονοφασικό διάλυμα φαινόλης και γουανιδικής θειακυανίνης (guanidine thiocyanate). Επιτρέπει την απομόνωση ολικού RNA, DNA και πρωτεϊνών (εικόνα 12.1) από το ίδιο δείγμα (Chomczynski, 1993). Εικόνα Σχηματική περιγραφή της αρχής της μεθόδου απομόνωσης ολικού RNA. Κατά την ομογενοποίηση του δείγματος, το TriPure Isolation Reagent διαταράσσει τα κύτταρα και επιτρέπει την αποδιάταξη των ενδογενών νουκλεασών. Στη συνέχεια προστίθεται στο δείγμα χλωροφόρμιο και το μίγμα φυγοκεντρείται. Το βήμα αυτό οδηγεί στον διαχωρισμό του δείγματος σε τρεις φάσεις: μία διαυγής, υδάτινη φάση (upper), μία ενδιάμεση χρώματος λευκού και την οργανική φάση (lower) χρώματος κόκκινου. Η υδάτινη φάση μεταφέρεται σε ξεχωριστό σωληνάκι και από αυτή συλλέγεται το ολικό RNA με τη χρήση ισοπροπανόλης (

71 ~ 71 ~ Υλικά Tripure Isolation Reagent RNase free tips & eppendorf tubes Χλωροφόρμιο RNase free Γλυκογόνο RNase free Ισοπροπανόλη RNase free 75% Αιθανόλη RNase free miliq H 2 O RNase free (DEPC-treated) Πορεία 1. Προσθέτουμε 1 ml Tripure Isolation Reagent για κάθε mg ιστού/δείγματος. Το δείγμα πρέπει να είναι παγωμένο (αποθήκευση στο υγρό άζωτο). Συγκεκριμένα για την απομόνωση ολικού RNA από τα διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια χρησιμοποιήθηκαν 500 μl Tripure Isolation Reagent (20 mg έμβρυα -στάδια Ε0,Ε6,Ε12,Ε24,Ε48-, 100 άτομα από το προνυμφικό στάδιο L3, 8 άτομα από το προνυμφικό στάδιο L5, 8 άτομα από το στάδιο J, το στάδιο Pf, το στάδιο P4 και το στάδιο P8, 4 ενήλικα αρσενικά από το στάδιο Μ0 και 4 από το Μ4, ομοίως για τα θηλυκά για τα στάδια F0 και F4). Για την απομόνωση των ιστών χρησιμοποιήθηκαν 250 μl Tripure Isolation Reagent. Ακολουθεί η ομογενοποίηση των δειγμάτων. 2. Φυγοκέντρηση στις rpm για 10 min στους 4 o C. 3. Το υπερκείμενο μεταφέρεται σε καινούριο σωληνάκι. Επώαση για 5 min σε θερμοκρασία δωματίου για αποδιάταξη των νουκλεοπρωτεϊνικών συμπλόκων. 4. Προσθέτουμε χλωροφόρμιο (200 μl/1 ml Tripure) και 2 μl γλυκογόνο (μόνο για τους ιστούς). Αναδεύουμε ελαφρά για 15 sec. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 15 min. 5. Φυγοκέντρηση στις rpm για 15 min στους 4 o C. Στο σημείο αυτό παρατηρείται ο διαχωρισμός των φάσεων όπως φαίνεται στην εικόνα Στην υδάτινη φάση εμπεριέχεται το ολικό RNA, στην ενδιάμεση φάση το DNA, ενώ στην οργανική οι πρωτεΐνες. 6. Για την απομόνωση του ολικού RNA, μεταφέρουμε την υδάτινη φάση σε καινούριο σωληνάκι. Για την ιζηματοποίηση του RNA προσθέτουμε ισοπροπανόλη σε ποσότητα 500 μl/ 1 ml Tripure. Αναδεύουμε ελαφρά και επωάζουμε το δείγμα για 10 min σε θερμοκρασία δωματίου για την καθίζηση του RNA. Στην περίπτωση των ιστών, εναλλακτικά το δείγμα φυλάσσεται για όλη τη νύχτα στους -80 o C. 7. Φυγοκέντρηση στις rpm για 10 min στους 4 o C. Απορρίπτουμε το υπερκείμενο. 8. Προσθέτουμε 1 ml 75% αιθανόλη/1 ml Tripure. Αναδεύουμε με vortex τόσο όσο απαιτείται ώστε ξεκολλήσει το ίζημα από το τοίχωμα του eppendorf tube. 9. Φυγοκέντρηση στις 7000 rpm για 5 min στους 4 o C. Απορρίπτουμε πολύ καλά το υπερκείμενο. 10. Αφήνουμε τα δείγματα με ανοιχτά τα καπάκια σε θερμοκρασία δωματίου ώστε να στεγνώσει το RNA ίζημα. 11. Επαναιωρούμε το ίζημα σε miliq H 2 O RNase free σε τελικό όγκο 200 μl. Για τους ιστούς, ο τελικός όγκος ποικίλλει από 30 έως 100 μl. Για καλύτερη επαναιώρηση, επωάζουμε τα δείγματα για 7 min στους o C. 12. Αποθήκευση δειγμάτων στους -80 o C. 13. Εκτίμηση συγκέντρωσης ολικού RNA Η εκτίμηση της συγκέντρωσης του ολικού RNA γίνεται όπως και του DNA (ενότητα 4) με την διαφορά ότι η εξίσωση διαμορφώνεται ως εξής: C = OD 260 +(αραίωση)+40 καθώς για απορρόφηση 1 OD 260 η συγκέντρωση του δείγματος είναι 40 μg/μl.

72 ~ 72 ~ 14. Ηλεκτροφόρηση RNA Η διαδικασία ηλεκτροφόρησης RNA (εικόνα 14.1) είναι η ίδια με αυτή του DNA (ενότητα 5) με την διαφορά ότι τα διαλύματα είναι RNase free. Εικόνα Αντιπροσωπευτική εικόνα RNA ηλεκτροφόρησης όπου διαφαίνονται οι ζώνες που αντιστοιχούν στα 28S και 18S rrnas καθώς και στα trnas. 15. Επεξεργασία δειγμάτων ολικού RNA με DNase Ι Κατά την απομόνωση του ολικού RNA είναι πιθανόν στο τελικό δείγμα να έχουν απομείνει ίχνη DNA. Καθώς θα ακολουθήσει ανάλυση με την μέθοδο Real Time PCR και επειδή οι primers είναι σχεδιασμένοι πάνω στο ίδιο εσώνιο, για να εξασφαλίσουμε ότι οι primers θα υβριδοποιηθούν με το mrna του γονιδίου που μελετάμε και όχι με το γενομικό DNA επεξεργαζόμαστε τα δείγματα με το ένζυμο DNase I της εταιρείας PROMEGA. Στη συνέχεια ακολουθεί καθαρισμός των δειγμάτων με φαινόλη και χλωροφόρμιο για να απομακρυνθούν τόσο το ένζυμο όσο και τα αλάτια του ρυθμιστικού του διαλύματος, συστατικά που αν παραμείνουν στα δείγματα θα επηρεάσουν την απόδοση της αντίδρασης Real Time PCR. Υλικά Πλήρες σύστημα αντιδραστηρίων RQ1 RNase-free DNase I της εταιρείας Promega (#M6101) Ρυθμιστικό διάλυμα ΤΕ (tris-edta) RNase-free Εξισορροπημένη φαινόλη RNase-free Χλωροφόρμιο : ισοαμυλική αλκοόλη (24:1) RNase-free CH3COONa 3Μ ph=5,2 RNase-free 75% αιθανόλη RNase-free RNase-free tubes & tips Πορεία 1. Σε ένα eppendorf tube προσθέτουμε 10 μg ολικού RNA και miliq H 2 O RNase free μέχρι τελικού όγκου τα 80 μl. Προσθέτουμε 10 μl από το ρυθμιστικό διάλυμα 10x και 10 μl από το ένζυμο DNase I. Τελικός όγκος: 100 μl. 2. Επώαση για 30 min στους 37 o C. 3. Για την απενεργοποίηση του ενζύμου προσθέτουμε 10 μl από το Stop solution και το δείγμα επωάζεται για 10 min στους 65 o C. 4. Προσθέτουμε κατάλληλη ποσότητα ΤΕ διαλύματος ώστε ο τελικό όγκος να είναι 200 μl. 5. Προσθέτουμε 200 μl φαινόλη/χλωροφόρμιο 1:1, αναμιγνύουμε με vortex για 30 sec και επωάζουμε για 3 min στους o C.

73 ~ 73 ~ 6. Φυγοκέντρηση στις rpm για 10 min στους 4 o C. Μεταφέρουμε 150 μl από το υπερκείμενο σε καινούριο σωληνάκι. 7. Προσθέτουμε 150 μl χλωροφόρμιο, αναμιγνύουμε με vortex και επωάζουμε για 1 min στους o C. 8. Φυγοκέντρηση στις rpm για 10 min στους 4 o C. Μεταφέρουμε 100 μl από το υπερκείμενο σε καινούριο σωληνάκι. 9. Προσθέτουμε CH3COONa σε τελική συγκέντρωση 0.3 Μ, αναμιγνύουμε με vortex, προσθέτουμε δύο όγκους 75% αιθανόλης, αναμιγνύουμε με vortex. Επωάζουμε στους -80 o C όλη τη νύχτα. 9. Φυγοκέντρηση στις rpm για 10 min στους 4 o C. Απορρίπτουμε το υπερκείμενο. 10. Προσθέτουμε 500 μl 75% αιθανόλη και αναδεύουμε ελαφρά για 30 sec στους o C. 11. Φυγοκέντρηση στις rpm για 10 min στους 4 o C. Απορρίπτουμε το υπερκείμενο. 12. Επαναλαμβάνουμε τα βήματα 10 και Αφήνουμε τα δείγματα με ανοιχτά τα καπάκια σε θερμοκρασία δωματίου ώστε να στεγνώσει το RNA ίζημα. 14. Επαναιωρούμε το ίζημα σε miliq H 2 O RNase free σε τελικό όγκο 50 μl. Για τους ιστούς, ο τελικός όγκος ποικίλλει από 15 έως 40 μl. Για καλύτερη επαναιώρηση, επωάζουμε τα δείγματα για 5 min στους 50 o C. 15. Εκτίμηση συγκέντρωσης, ηλεκτροφόρηση και αποθήκευση δειγμάτων στους -80 o C. 16. Τεχνική 3 RACE (Rapid amplification of cdna ends) Η RACE (Frohmann et al., 1988) είναι μία τεχνική που βασίζεται στην PCR και διευκολύνει στην κλωνοποίηση ολόκληρων cdna αλληλουχιών όταν είναι γνωστό ένα μόνο μικρό τμήμα τους. Καθώς η cdna αλληλουχία, παραδοσιακά αποκαλύπτεται από κλώνους που είτε απομονώνονται από βιβλιοθήκες πλασμιδίων ή φάγων, συχνά οι κλώνοι αυτοί δεν φέρουν τις αλληλουχίες που αφορούν στα 5 ή στα 3 άκρα. Για τον λόγο αυτό έχει αναπτυχθεί η RACE τεχνική η οποία διακρίνεται στην 5 RACE και στην 3 RACE (εικόνα 3.1) για την αποκάλυψη των 5 και 3 άκρων αντίστοιχα. Στην προκειμένη περίπτωση ακολουθήθηκε η 3 RACE (της εταιρείας Invitrogen) για την διερεύνηση του 3 άκρου του cdna του Cchsp27. Εικόνα 3.1. Σχηματική απεικόνιση της τεχνικής 3 RACE (tools.invitrogen.com). Πορεία Α. Αντίστροφη μεταγραφή 1. Σε RNase free eppendorf tube προσθέτουμε τα παρακάτω αντιδραστήρια δουλεύοντας στον πάγο: 2μl RNA (1μg ολικού RNA), 4μl dntp mix, 2μl 3 RACE Adapter (5 -

74 ~ 74 ~ GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGT12VN-3 ), 2 μl 10x RT Buffer, 1μl M-MLV Reverse Trascriptase, 8μl Nuclease-free Water (τελικό; όγκος 20μl). 2. Αναμιγνύουμε ελαφρά. 3. Επώαση στους 42 o C για μία ώρα. 4. Αποθήκευση στους -20 o C ή συνέχεια στο επόμενο βήμα. Β. 3 RACE PCR (amplification of cdna). Outer 3 RACE PCR 1. Σε PCR tube προστίθενται τα παρακάτω αντιδραστήρια δουλεύοντας στον πάγο: 1μl RT reaction (από το προηγούμενο βήμα), 5μl 10x PCR Buffer, 4μl dntp Mix, 2μl 3 RACE gene-specific outer primer (10μM) (Hsp27T-F1:5 -TCGTTCAGATTCAGCAAACC-3 ), 2μl 3 RACE Outer Primer (5 -GCGGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG-3 ), Nuclease-free Water μέχρι τελικό όγκο 50μl, 0.25μl thermostable DNA polymerase (extended range) (1.25U of 5U/μl). 2. Αναμιγνύουμε ελαφρά. 3. Ακολουθεί PCR, οι συνθήκες της αντίδρασης φαίνονται στον πίνακα IV. Πίνακας IV. Cycle Conditions: (Hot Start: preheat thermal cycler to 94 o C) Cycle Step Temperature ( o C) Time Cycles Initial denaturation 94 3 min 1 Amplification Final extension sec 30sec 30sec 35x 72 7min 1 Γ. Inner 3 RACE PCR 1. Σε PCR tube προστίθενται τα παρακάτω αντιδραστήρια δουλεύοντας στον πάγο: 1μl Outer 3 RACE PCR (από το προηγούμενο βήμα), 5μl 10x PCR Buffer, 4μl dntp Mix, 2μl 3 RACE gene-specific inner primer (10μM) (Hsp27T-F2:5 -CGC-EcoRI- AACGACGGCAAAGCGAAG-3 ), 2μl 3 RACE Inner Primer (5 -CGCGGATCCGAATTAATACGACTCACTATAGG-3 ), Nuclease-free Water μέχρι τελικό όγκο 50μl, 0.25 μl thermostable DNA polymerase (1.25U of 5U/μl). 2. Αναμιγνύουμε ελαφρά. Σημείωση: ο 3 RACE Inner Primer έχει στο 5 άκρο του θέση περιορισμού για το ένζυμο BamHI. 17. RT-PCR με το πλήρες σύστημα αντιδραστηρίων OneStep RT-PCR (Qiagen) Το πλήρες σύστημα αντιδραστηρίων αυτό παρέχει ένα μίγμα ενζύμων το οποίο περιλαμβάνει δύο αντίστροφες μεταγραφάσες και μία DNA πολυμεράση. Οι αντίστροφες μεταγραφάσες Omniscript και Sensiscript είναι σχεδιασμένες για αντίστροφη μεταγραφή ποσοτήτων RNA μεγαλύτερων των 50 ng και μικρότερων των 50 ng, αντίστοιχα. Μ αυτόν το συνδυασμό, επιτυγχάνεται η αντίστροφη μεταγραφή ποσοτήτων RNA από 1 pg έως 2 μg. Το μίγμα των ενζύμων περιέχει την HotStarTaq DNA πολυμεράση η οποία κατά τη διαδικασία της αντίστροφης μεταγραφής είναι ανενεργή. Μετά το τέλος της αντίστροφης μεταγραφής οι

75 ~ 75 ~ αντιδράσεις θερμαίνονται στους 95 ο C για 15 min ώστε να ενεργοποιηθεί η DNA πολυμεράση και ταυτόχρονα να απενεργοποιηθούν οι αντίστροφες μεταγραφάσες ( Υλικά QIAGEN OneStep 5X ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης μίγμα dntps (10 mm κάθε dntp) εκκινητής 1 (10 μm) εκκινητής 2 (10 μm) μίγμα ενζύμων Χ μl ολικού RNA (Χρησιμοποιούνται 1 pg-2 μg ολικό RNA) RNase free H 2 O Πορεία Σε ένα PCR tube μεταφέρονται: 5 μl QIAGEN OneStep 5X ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης 1 μl μίγμα dntps 1.5 μl εκκινητής 1 (0.6 μμ) 1.5 μl εκκινητής 2 (0.6 μμ) 1 μl μίγμα ενζύμων 200 ng ολικού RNA από ενήλικα θηλυκά διαγονιδιακά άτομα που έφεραν το διαγονίδιο hsp27-gfp RNase free H 2 O μέχρι τελικό όγκο τα 25 μl Στον παρακάτω πίνακα αναγράφονται οι συνθήκες της RT-PCR. Πίνακας V. Cycle Conditions Cycle Step Temperature ( o C) Time (min) Cycles Reverse transcription (RT) Inactivation of RT and activation of DNA polymerase Denaturation of 94 1 DNA Annealing of x primers Polymeriyation 72 1 Extension Storage 4 forever 18. Real-Time qpcr Η Real-time PCR τεχνολογία χρησιμοποιεί μόρια φθορίζουσας χρωστικής για την παρακολούθηση της παραγωγής των PCR προϊόντων σε κάθε κύκλο μιας PCR αντίδρασης. Πρόκειται για μία πολύ ευαίσθητη, ειδική και αξιόπιστη διαδικασία για την ανίχνευση mrna ή DNA σε ένα δείγμα. Η τεχνική Real-time PCR βασίζεται στην ανίχνευση ανάλογου φθορισμού που παράγεται κατά τον πολλαπλασιασμό του νουκλεϊκού οξέος-στόχου. Με την μέθοδο αυτή είναι εφικτός ο προσδιορισμός του χρονικού εκείνου σημείου της αντίδρασης

76 ~ 76 ~ όπου ανιχνεύεται για πρώτη φορά το PCR προϊόν. Αυτό γίνεται μέσω του προσδιορισμού του κύκλου εκείνου όπου παρατηρείται αύξηση του φθορισμού σε επίπεδα πάνω από τον βασικό φθορισμό. Ο κύκλος αυτός αναφέρεται ως threshold cycle (Ct), εκτιμάται κατά την εκθετική φάση της PCR αντίδρασης και είναι αντιστρόφως ανάλογος με τον αριθμό των αντιγράφων του νουκλεϊκού οξέος στόχου (εικόνα 18.1). Αυτό σημαίνει ότι όσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός αντιγράφων του στόχου τόσο πιο σύντομα θα παρατηρηθεί αύξηση του φθορισμού, σε χαμηλότερο Ct. Ακόμη η αύξηση του σήματος φθορισμού σχετίζεται άμεσα με την ποσότητα του αρχικού υποστρώματος. Η τεχνική Real-time PCR παρουσιάζει υψηλή επαναληψιμότητα και μπορεί να διακρίνει ανάμεσα σε πολύ μικρές διαφορές στην σχετική έκφραση διαφορετικών στόχων (Bustin, 2000, 2005). Εικόνα Καμπύλες ενίσχυσης σε μία Real-Time PCR αντίδραση (Kubista et al., 2006). Η καμπύλη ενίσχυσης διακρίνεται σε τρεις φάσεις: την εκθετική, τη γραμμική και τη φάση κορεσμού. Κατά την εκθετική φάση (exponential phase), σε κάθε κύκλο της αντίδρασης πραγματοποιείται ακριβής διπλασιασμός του προϊόντος, καθώς όλα τα απαραίτητα για την PCR συστατικά (π.χ. dntps, εκκινητές, πολυμεράση) βρίσκονται σε περίσσεια (100% αποδοτικότητα). Καθώς συνεχίζεται η αντίδραση επέρχεται η γραμμική φάση κατά την οποία κάποια από τα αντιδραστήρια αρχίζουν να εξαντλούνται, ενώ παράλληλα συσσωρεύονται, σταδιακά, αναστολείς. Στη συγκεκριμένη φάση, η αντίδραση της ενίσχυσης επιβραδύνεται, καθώς μειώνεται η αποδοτικότητα της και τελικά σταματάει εντελώς, οπότε η καμπύλη φθορισμού φτάνει σε σημείο κορεσμού (plateau). Το σημείο κορεσμού διαφέρει μεταξύ των δειγμάτων και εξαρτάται από τις κινητικές των αντιδράσεών τους. Οι μετρήσεις για την ποσοτικοποίηση πραγματοποιούνται κατά την εκθετική φάση της αντίδρασης (Kubista et al., 2006). Στα πειράματα της παρούσας εργασίας χρησιμοποιήθηκε το σύστημα αντιδραστηρίων KAPA SYBR FAST qpcr Kit το οποίο περιέχει την φθορίζουσα χρωστική SYBR Green I (SG). Η SG χρωστική (εικόνα 18.2) χρησιμοποιείται για την ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων από το 1990 και το ευρύ φάσμα εφαρμογών της σχετίζεται με τις ιδιαίτερες ιδιότητες της. Η SG φθορίζουσα χρωστική εμφανίζει ιδανικές φωτοφυσικές ιδιότητες, σταθερότητα στις υψηλές θερμοκρασίες και προσδένεται ειδικά σε δίκλωνο DNA (Zipper et al., 2004). Κατά την PCR αντίδραση ο φθορισμός της χρωστικής αυξάνει μαζί με την ποσότητα του συντιθέμενου δίκλωνου PCR προϊόντος, ωστόσο η αύξηση αυτή δεν είναι αυστηρά ανάλογη καθώς η φθορίζουσα χρωστική βασίζεται στην αναλογία πρόσδεσης χρωστική : βάση η οποία μειώνεται κατά την πορεία της αντίδρασης (Kubista et al., 2006).

77 ~ 77 ~ Εικόνα Η δομή της SYBR Green I χρωστικής (Zipper et al., 2004, Kubista et al., 2006). Τα πειράματα της παρούσας εργασίας διεξήχθησαν στο μηχάνημα LightCycler 1.5 της Roche ( Οι αντιδράσεις μεταφέρονται σε κατάλληλα τριχοειδή των 20 μl τα οποία στη συνέχεια τοποθετούνται στο ειδικό μηχάνημα για PCR (thermal cycler) όπου ταυτόχρονα ανιχνεύεται και ο φθορισμός (εικόνα 18.3.). Εικόνα Οι PCR αντιδράσεις μεταφέρονται σε ειδικά τριχοειδή και έπειτα στο thermal cycler για την πραγματοποίηση της αντίδρασης και την ανίχνευση του φθορισμού ( Η αρχή λειτουργίας φαίνεται στην εικόνα Πιο συγκεκριμένα, ατμοσφαιρικός αέρας εισέρχεται στο thermal cycler μέσω ενός μικρού ανεμιστήρα και θερμαίνεται παρουσία ενός πηνίου. Για την διέγερση του φθορισμού, το LightCycler 1.5 χρησιμοποιεί μία μπλε LED λάμπα που εκπέμπει φως στα 470 nm. Το LightCycler 1.5 έχει ένα φωτόμετρο τριών καναλιών και μετράει τον φθορισμό στα 530, 640 και 705 nm. Μία τυπική αντίδραση PCR 30 κύκλων διαρκεί 30 λεπτά περίπου.

78 ~ 78 ~ Εικόνα Αρχή λειτουργίας του LightCycler 1.5 ( Στην παρούσα εργασία ακολουθήθηκε το πρωτόκολλο που ανταποκρίνεται στη two-step Real-Time PCR (εικόνα 18.5). Μετά την απομόνωση του ολικού RNA ακολουθεί μία απλή RT-PCR με τυχαίους primers οπότε και παράγεται το ολικό cdna το οποίο στην πορεία χρησιμοποιείται ως μήτρα για την πραγματοποίηση των Real-Time PCR αντιδράσεων με την χρήση εξειδικευμένων primers. Τα πλεονεκτήματα της two-step Real-Time PCR αφορούν στην οικονομία των RT αντιδραστηρίων καθώς μία RT-PCR αντίδραση παρέχει το υπόστρωμα για πολλαπλές Real-Time PCR αντιδράσεις. Επιπλέον φαίνεται ότι είναι πιο ευαίσθητη μέθοδος συγκριτικά με την one-step RT-PCR. Εικόνα Σχηματική απεικόνιση του πρωτοκόλλου Two-step Real-Time PCR (ocw.mit.edu). Σύνθεση ολικού cdna με το πλήρες σύστημα αντιδραστηρίων PrimeScript TM RT Reagent Kit (Perfect Real Time) της εταιρείας TAKARA Υλικά PrimeScriptTM Buffer 5x PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I Oligo dt Primer 50 μm Random 6 mers 100 μm RNase Free dh 2 O

79 ~ 79 ~ Πορεία 1. Σε PCR tube μεταφέρονται τα ακόλουθα συστατικά για μία RT-PCR αντίδραση τελικού όγκου 10 μl: PrimeScriptTM Buffer 5x 2 μl PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I 0.5 μl Oligo dt Primer 50 μm 0.5 μl Random 6 mers 100 μm 0.5 μl RNA υπόστρωμα (200 ng) RNase Free dh 2 O μέχρι τα 10 μl 2. Η αντίδραση μεταφέρεται στο PCR μηχάνημα όπου και ορίζονται οι παρακάτω συνθήκες: 37 ο C, 15 min (reverse transcription) 85 ο C, 5 sec (inactivation of RTase) Μετά το πέρας της αντίδρασης το cdna, του οποίου η συγκέντρωση εκτιμάται στα 20 ng/μl, είναι έτοιμο για την Real-Time PCR αντίδραση. Εφόσον δουλεύουμε αρχικά με RNA, όλα τα διαλύματα και τα αναλώσιμα που χρησιμοποιούμε είναι RNase Free. Two-step Real-Time PCR με το πλήρες σύστημα αντιδραστηρίων KAPA SYBR FAST qpcr Kit της εταιρείας KAPA BIOSYSTEMS Υλικά qpcr Master Mix 2x Εκκινητής 1 (10μΜ) Εκκινητής 2 (10μΜ) BSA (1mg/μl) H 2 O Πορεία 1. Σε eppendorf tube μεταφέρονται τα εξής συστατικά: qpcr Master Mix 2x 10 μl Εκκινητής 1 (10μΜ) 0.4 μl Εκκινητής 2 (10μΜ) 0.4 μl BSA (1mg/μl) 2 μl H 2 O 6.2 μl 2. Η αντίδραση μεταφέρεται σε τριχοειδές όπου εκεί προστίθεται cdna (20 ng) 1 μl. 3. Σε ένα από τα τριχοειδή δεν προσθέτουμε cdna, αλλά αντίστοιχη ποσότητα H 2 O. Το δείγμα αυτό λειτουργεί ως αρνητικό control και εξυπηρετεί για τον προσδιορισμό των διμερών των εκκινητών που πιθανόν σχηματίζονται. Ακόμη ένα τέτοιο control δείγμα πρέπει να ετοιμάζεται για κάθε ζευγάρι εκκινητών που χρησιμοποιούνται. 4. Τα τριχοειδή φυγοκεντρούνται για 5 sec στα 700rpm και μεταφέρονται στο thermal cycler. 5. Το πρόγραμμα της αντίδρασης ρυθμίζεται με τις εξής συνθήκες:

80 ~ 80 ~ Πίνακας VI. Cycle Conditions Cycle Step Temperature ( o C) Time (sec) Cycles Denaturation of 95 3 DNA Annealing of x primers Polymeriyation 72 2 Η κανονικοποίηση των δεδομένων έγινε με τη χρήση ως γονίδιο αναφοράς το γονιδίο 18S της μεσογειακής μύγας,. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με την χρήση των προγραμμάτων Microsoft Office Excel 2007 και Origin 6.1 με βάση την δημοσίευση των Schmittgen και Livak (2008). 19. Απομόνωση ολικής πρωτεΐνης Απομονώθηκαν πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από τέσσερα ενήλικα αρσενικά διαγονιδιακά άτομα που έφεραν το διαγονίδιο hsp27-gfp. Η αποθήκευση των ατόμων έγινε σε υγρό άζωτο. Υλικά -Διάλυμα ομογενοποίησης: Tris-HCl 20 mm, ph 7.5 NaCl 150 mm TritonX % EDTA 1 mm DTT 1 mm Γλυκερόλη 10% Λίγο πριν την ομογενοποίηση προσθέτουμε στον όγκο του διαλύματος ομογενοποίησης που θα χρησιμοποιήσουμε PMSF σε τελική συγκέντρωση 1mM καθώς και protease inhibitor coctail 1:100. Πορεία 1. Ομογενοποίηση των δειγμάτων σε τελικό όγκο διαλύματος ομογενοποίησης 200 μl. Το δείγμα μεταφέρεται στον πάγο. 2. Επίδραση με υπερήχους (5x10 sec με 10 sec ενδιάμεσες παύσεις). Το δείγμα σε όλη την διαδικασία βρίσκεται στον πάγο. 3. Φυγοκέντρηση στις rpm για 10 min στους 4 o C. Μεταφέρουμε το υπερκείμενο σε καινούριο σωληνάκι. 4. Επανάληψη του βήματος 3. Ποσοτική εκτίμηση πρωτεϊνικού εκχυλίσματος και αποθήκευση στους -20 o C. 20. Ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών Η συγκέντρωση των πρωτεϊνών, μετά την έκλουση, προσδιορίζεται με τη μέθοδο Bradford. Η μέθοδος βασίζεται στη δέσμευση της χρωστικής Coomasie Briliant Blue στα βασικά κυρίως αμινοξέα των πρωτεϊνών. Η δέσμευση είναι ανάλογη της ποσότητας της πρωτεΐνης και μετατοπίζει το μήκος κύματος της μέγιστης απορρόφησης της χρωστικής από τα 470nm στα 595 nm. Το χρώμα του συμπλόκου της πρωτεΐνης-χρωστικής είναι σταθερό για μία ώρα περίπου και έχει υψηλό μοριακό συντελεστή απορρόφησης που συνεπάγεται υψηλή

81 ~ 81 ~ ευαισθησία στις ποσοτικές μετρήσεις πρωτεϊνικών δειγμάτων. Με τη βοήθεια διαλυμάτων αλβουμίνης ορού βοός (BSA) γνωστών συγκεντρώσεων, κατασκευάζεται πρότυπη καμπύλη απ την οποία υπολογίζονται οι συγκεντρώσεις των εκχυλισμάτων σε πρωτεΐνη (Θεοδωράκη, 2005). Υλικά -Αντιδραστήριο Bradford: 85% Φωσφορικό οξύ 10% κ.ο. 95% Αιθανόλη 5% κ.ο. 1 Ν NaOH 5% κ.ο. -Coomasie Briliant Blue G % κ.ο. Το αντιδραστήριο διηθείται από ηθμό με χαρτί τύπου Whatmann No. 1 για να απομακρυνθεί η αδιάλυτη χρωστική. -Πρότυπο διάλυμα BSA (1mg/ml) Πορεία Σε σωληνάρια eppendorf προστίθεται 1 ml αντιδραστηρίου Bradford και στη συνέχεια μια ποσότητα δείγματος ή το πρότυπο διάλυμα BSA (2, 4, 8, 16 και 20 μl). Οι σωλήνες αναδεύονται έντονα με vortex, και το περιεχόμενό τους μεταφέρεται σε πλαστικές κυψελίδες ώστε να μετρηθεί η οπτική απορρόφηση των δειγμάτων. Οι μετρήσεις γίνονται σε μήκος κύματος 595 nm, μηδενίζοντας την οπτική απορρόφηση του μάρτυρα. Ο μάρτυρας περιλαμβάνει το αντιδραστήριο Bradford με την προσθήκη μόνο του ρυθμιστικού διαλύματος στο οποίο έχει πραγματοποιηθεί η έκλουση των πρωτεϊνών. 21. SDS-PAGE Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών Το μοριακό βάρος μιας πρωτεΐνης μπορεί να εκτιμηθεί μετρώντας την κινητικότητά της σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου κατάλληλης συγκέντρωσης. Σε ph 7, σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 1% SDS και 0.1 Μ μερκαπτοαιθανόλης, οι περισσότερες πρωτεΐνες δεσμεύουν περίπου 1.4g SDS / g πρωτεΐνης και αποδιατάσσονται. Το αποτέλεσμα είναι τα αποδιατεταγμένα μόρια της πρωτεΐνης να έχουν φορτιστεί αρνητικά, αν και αυτό δεν ισχύει για όλες τις πρωτεΐνες. Το αρνητικό φορτίο που αποκτούν οι πρωτεΐνες είναι ανάλογες του μεγέθους τους (Brewer, 1974). Το ακρυλαμίδιο δημιουργεί τρισδιάστατα πολυμερή δίκτυα σε ευρεία κλίμακα συγκεντρώσεων από 3% έως 30%. Το πήκτωμα σχηματίζεται με βινυλ-πολυμερισμό μονομερούς ακρυλαμιδίου που οδηγεί στο σχηματισμό αλυσίδων πολυακρυλαμιδίου. Σ αυτές ενσωματώνονται κατά διαστήματα μόρια ΝΝ-μεθυλενο-δις-ακρυλαμιδίου (bis) τα οποία λόγω της δομής τους μπορούν να ενσωματωθούν σε δύο διαφορετικές αλυσίδες και έτσι να δημιουργηθεί ένα πλέγμα. Ο πολυμερισμός του ακρυλαμιδίου (εικόνα 12.1) γίνεται με μία βάση, τη ΝΝΝ Ν -τετραμεθυλοδιαμίνη (TEMED), για τη δράση της οποίας είναι απαραίτητη η παρουσία υπερθειικών ιόντων (S 2 O 3 2- ). Τα υπερθειικά ιόντα ενεργοποιούν το TEMED προκαλώντας το σχηματισμό ελευθέρων ριζών, οι οποίες με τη σειρά τους καταλύουν την αντίδραση πολυμερισμού του ακρυλαμιδίου. Η συγκέντρωση του ακρυλαμιδίου καθορίζει το μέσο μήκος της αλυσίδας του πολυμερούς ενώ η αναλογία του ακρυλαμιδίου προς το μεθυλενο-δις-ακρυλαμίδιο καθορίζει την έκταση του σχηματισμού γεφυρών (cross-links). Έτσι, και τα δύο αυτά χαρακτηριστικά είναι σημαντικά για το καθορισμό των φυσικών ιδιοτήτων του πηκτώματος, όπως είναι η πυκνότητα, η ελαστικότητα, η μηχανική αντοχή και το μέγεθος των πόρων (Θεοδωράκη, 2005).

82 ~ 82 ~ Εικόνα Ο πολυμερισμός του πολυακρυλαμιδίου με το ΝΝ-μεθυλενο-δις-ακρυλαμιδίο (Brewer, 1974) Η SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση περιλαμβάνει πακετάρισμα των πρωτεϊνικών δειγμάτων σε πολύ λεπτά στρώματα και μετά ηλεκτροφόρηση αυτών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου. Το πακετάρισμα επιτρέπει την εκκίνηση της ηλεκτροφόρησης από ζώνες μόνο 1-100μ πάχος, οπότε και η τεχνική εμφανίζει τελικά ενισχυμένα χαρακτηριστικά στην ανάλυση των δειγμάτων (Brewer, 1974). Η πρωτεΐνη πακετάρεται στην περιοχή του πηκτώματος γνωστή ως stacking gel, ενώ ακολουθεί το πήκτωμα διαχωρισμού (separation gel) όπου γίνεται η ανάλυση των ζωνών. Stacking και separation gel αποτελούνται από την ίδια χημική σύσταση, σε διαφορετική όμως συγκέντρωση και ποσότητα των επιμέρους συστατικών. Για την ηλεκτροφόρηση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκε σύστημα κάθετης ηλεκτροφόρησης (εικόνα 12.2). Ως αποδιατακτικός παράγοντας χρησιμοποιήθηκε το ιοντικό απορρυπαντικό θειικό δωδεκυλικό νάτριο (SDS). Η χρήση του αναγωγικού β- μερκαπτοαιθανόλη έχει ως αποτέλεσμα την αναγωγή των δισουλφιδικών δεσμών, τόσο αυτών που υπάρχουν μέσα στην ίδια πολυπεπτιδική αλυσίδα, όσο και αυτών που συνδέουν διαφορετικές πολυπεπτιδικές αλυσίδες πολυμερών πρωτεϊνών. Η πλήρης μετουσίωση των πρωτεϊνών επιτυγχάνεται με θέρμανση των πρωτεϊνικών δειγμάτων στους 100 για 5min. Τελικά, τα πολυπεπτίδια τα οποία αναλύονται στην SDS-PAGE έχουν αποκτήσει καθαρό αρνητικό φορτίο και η ηλεκτροφορητική τους κινητικότητα είναι συνάρτηση του μοριακού τους βάρους (Θεοδωράκη, 2005). Υλικά -Διάλυμα ηλεκτροφόρησης 1x: 10x: Tris-HCl 0.25 Μ Glycine 1.92 M SDS 1% -Sample buffer (Sb) 4x (100ml) Tris-HCl 0.25 M, ph 6.7, 5ml Glycerol 4 ml SDS 0.8g Bromophenol Blue 0.02g -Acrylamide 30% Acrylamide 29.2 g Bis Acrylamide 0.8 g H 2 O μέχρι 100ml Φυλάσσεται στους 4, σε σκούρο μπουκάλι (να μην περνάει φως)

83 ~ 83 ~ - Ammonium persulphate (AP) 20% AP 0.1 g H 2 O 0.5 ml Φυλάσσεται στους 4-20% SDS 20 gr SDS H2O up to 100ml Φυλάσσεται σε θερμοκρασία δωματίου -Tris-HCl, ph 8.8, 1.5 M Tris-HCl 45.4 g HCl μέχρι ph 8.8 H2O μέχρι 250 ml Φυλάσσεται στους 4 -Tris-HCl, ph 6.8, 0.5 Μ Tris-HCl 6 g HCl μέχρι ph 6.7 H2O μέχρι 100ml Φυλάσσεται στους 4 Stacking gel 5 ml [125 mm Tris-HCl, ph 6.8, 0.1% SDS] 4% d.d H2O 3 ml 30% Acrylamide 0.67 ml 0.5 M Tris-HCl, ph ml 10% SDS 50 μl 20% AP 20 μl TEMED 10 μl Separation gel 6 ml [375 mm Tris-HCl, ph 8.8, 0.1% SDS] d.d H2O 1.42 ml 30% Acrylamide 3 ml 1.5 M Tris-HCl, ph ml 10% SDS 60 μl 20% AP 20 μl TEMED 4 μl Η συγκέντρωση του ακρυλαμιδίου και του μεθυλενο-δις-ακρυλαμιδίου δεν είναι πάντα η ίδια σε όλα τα πηκτώματα, αλλά καθορίζεται κάθε φορά από το μέγεθος των πολυπεπτιδίων τα οποία θέλουμε να διαχωρίσουμε. Για πολυπεπτίδια μεγάλου μοριακού βάρους χρησιμοποιούνται πηκτώματα χαμηλής συγκέντρωσης ακρυλαμιδιου (π.χ. 7-8%) ενώ για το διαχωρισμό πολυπεπτιδίων μικρότερου μοριακού βάρους χρησιμοποιούνται πηκτώματα μεγαλύτερης συγκέντρωσης ακρυλαμιδίου (π.χ %) (Θεοδωράκη, 2005).

84 ~ 84 ~ Πορεία 1) Παρασκευάζεται το separating gel και τοποθετείται στο σύστημα των τζαμιών. Στην επιφάνεια του πηκτώματος προστίθεται μικρή ποσότητα νερού ώστε αυτό να μην έρχεται σε επαφή με το ατμοσφαιρικό Ο2 καθώς αναστέλλεται ο πολυμερισμός, και επίσης για να εξασφαλιστεί ότι η επιφάνεια του πηκτώματος, μετά τον πολυμερισμό, θα είναι επίπεδη. Για να ολοκληρωθεί ο πολυμερισμός, απαιτούνται περίπου 30 min. 2) Απομακρύνεται το στρώμα νερού και προστίθεται το stacking gel. Στην επιφάνεια του τοποθετείται ειδική πλαστική οδοντωτή μήτρα ώστε να σχηματιστούν τα φρεάτια τοποθέτησης των δειγμάτων, Για να ολοκληρωθεί ο πολυμερισμός, απαιτούνται 15min περίπου. 3) Τα πρωτεϊνικά δείγματα αναμιγνύονται με 3:1 4x Sb όπου προστίθεται β-μερκαπταιθανόλη (5%). Ακολουθεί vortex και αμέσως επώαση σε βραστό νερό για 5 min, φυγοκέντρηση σε Εικόνα Σύστημα κάθετης SDS-PAGE ηλεκτοφόρησης ( jena.de) μικροφυγόκεντρο eppendorf, με μέγιστη ταχύτητα για 1min σε θερμοκρασία δωματίου 4) Τα δείγματα τοποθετούνται στα φρεάτια δειγμάτων και ακολουθεί ηλεκτροφόρηση με την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου σταθερής τάσης 35 mv μέχρις ότου το μέτωπο της χρωστικής να φθάσει 0.5 cm πριν το τέλος του separating gel. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης το πήκτωμα χρωματίζεται υπό συνεχή ανάδευση σε Coomasie Briliant Blue για περίπου 1hr. Έπειτα αποχρωματίζουμε με το αποχρωστικό διάλυμα, σε ανάδευση για όσο χρειαστεί, ώστε να μπορέσουμε να δούμε τις ζώνες των πρωτεϊνών. Για 1 lt αποχρωστικό χρειάζονται 430 ml μεθανόλης, 70 ml οξικού οξέος και 500 ml d. H2O. 22. Ανοσοτύπωμα (Western blot Analysis) Η μεθοδολογία αυτή εφαρμόζεται προκειμένου να γίνει η εκλεκτική ανίχνευση μιας πρωτεΐνης-αντιγόνου, με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων που έχουν παρασκευαστεί για το συγκεκριμένο αντιγόνο (Towbin et al., 1979). Η τεχνική περιλαμβάνει ηλεκτροφόρηση του δείγματος σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου και μεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης, νάιλον ή PVDF, οι οποίες έχουν την ιδιότητα να προσροφούν τις πρωτεΐνες (εικόνα 22.1). Οι πρωτεΐνες δεσμεύονται στις μεμβράνες μέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων, διατηρώντας τις αντιγονικές τους ιδιότητες και έτσι διευκολύνεται η αναγνώρισή τους από τα αντισώματα. Η μεμβράνη επωάζεται με το αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης που θέλουμε να ανιχνεύσουμε και στη συνέχεια με δεύτερο αντίσωμα έναντι της Fc περιοχής του πρώτου αντισώματος. Στο δεύτερο αντίσωμα έχει ομοιοπολικά συνδεθεί ένα ένζυμο, με τη δράση του οποίου σχηματίζεται έγχρωμο, αδιάλυτο προϊόν στη θέση του συμπλόκου. Στην παρούσα εργασία, το ένζυμο που ήταν συζευγμένο στα δεύτερα αντισώματα ήταν η υπεροξειδάση. Για τον προσδιορισμό του συμπλόκου αντιγόνουαντισώματος, εκτός απ τη μέθοδο της αναγωγής των χρωμογόνων με τη δράση της υπεροξειδάσης, σε πολλές περιπτώσεις χρησιμοποιείται και η μέθοδος της ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL). Σε αυτήν την περίπτωση, η δράση του συστήματος υπεροξειδάσης-υπεροξειδίου του υδρογόνου έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό οξειδωμένων μορφών κυκλικών διακυλυδραζιδίων. Αμέσως μετά την οξείδωση, οι μορφές αυτές βρίσκονται σε διεγερμένη κατάσταση και επανέρχονται στην κατάσταση ηρεμίας εκπέμποντας φωτόνια, τα οποία προσβάλλουν φωτογραφικό φίλμ (Θεοδωράκη, 2005).

85 ~ 85 ~ Υλικά -Transfer Buffer 10x (Tris-HCl 0.25 M, Glycine 1.92 M): Tris-HCl 3.03 g Glycine 14.4 g H 2 O μέχρι 2 lt -TBS 10x (Tris-HCl 0.5 M, NaCl 1.5 M) Tris-HCl g NaCl 87.6 g HCl μέχρι ph 7.5 H 2 O μέχρι 1 lt -Transfer Buffer (ph 8.3, Tris-HCl 25mM, Glycine 192 mm, Methanol 20%) Transfer Buffer 10x 200 ml Methanol 400 ml H 2 O 1400 ml -TBS-T (Tween % in TBS) TBS 1 lt Tween-20 2 ml -Stripping Buffer (ph 6.7, Tris-HCl 62.5 mm, SDS 2%, β-mercaptoethanol 0.7%) Tris-HCl ph 6.7,12.5 ml SDS 20% 10 ml H 2 O μέχρι 100 ml β-mercaptoethanol 0.7 ml -Ρυθμιστικό διάλυμα επώασης A: 5% γάλα σε σκόνη σε TBS-T -Ρυθμιστικό διάλυμα επώασης B: 5% γάλα σε σκόνη σε TBS/TBS-T 2:1 -Αντιδραστήριο ECL (Amersham): Luminol / Enhancer Διάλυμα υπεροξειδίου. Τα δύο διαλύματα αναμειγνύονται σε αναλογία 1:1 αμέσως πριν τη χρήση τους. -Πρώτο αντίσωμα: Anti-rabbit anti-gfp -Δεύτερο αντίσωμα: Anti-rabbit IgG συζευγμένο με υπεροξειδάση (Santa Cruz Biotechnologies). Πορεία 1. Η PVDF μεμβράνη (η οποία είναι θετικά φορτισμένη), επωάζεται για 30 sec σε μεθανόλη. 2. Στη συνέχεια μεταφέρεται σε transfer buffer όπου επωάζεται για 20 min. 3. Σε transfer buffer μεταφέρεται χαρτί whatman κομμένο σε κατάλληλο μέγεθος που να ταυτίζεται με αυτό της μεμβράνης (της οποίας ταυτίζεται με αυτό του πήκτωμα ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών).

86 ~ 86 ~ 4. Μετά την ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου, ακολουθεί ηλεκτρομεταφορά των πολυπεπτιδίων σε μεμβράνη PVDF. H μεταφορά επιτυγχάνεται με την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου σταθερής έντασης 400 ma για 120 λεπτά. Η ηλεκτρομεταφορά γίνεται σε ειδική συσκευή η οποία καλύπτεται από ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς. Εικόνα Σχηματική απεικόνιση της μεθόδου μεταφοράς πρωτεϊνών από το πήκτωμα στην PVDF μεμβράνη ( 5. Η μεμβράνη επωάζεται για όλη τη νύχτα στους 4 ο C σε ρυθμιστικό διάλυμα επώασης A. 6. Στη συνέχεια η μεμβράνη επωάζεται για 1 ώρα σε ρυθμιστικό διάλυμα επώασης B, παρουσία πρώτου αντισώματος σε αραίωση 1:2000. Μετά την επώαση, ξεπλένεται τρεις φορές με TBS-T για 5 λεπτά κάθε φορά καθώς και για 5 λεπτά σε TBS. 7. Η μεμβράνη επωάζεται για 1 ώρα στους 25 ο C σε ρυθμιστικό διάλυμα επώασης παρουσία του δεύτερου αντισώματος σε αραίωση 1:5000 και στη συνέχεια ξεπλένεται τρεις φορές με TBS για 5 λεπτά κάθε φορά, 5 λεπτά σε TBS-T και τέλος 5 λεπτά σε TBS. 8. Η εμφάνιση των ζωνών γίνεται με τη μέθοδο ECL. O βέλτιστος όγκος αντιδραστηρίου που απαιτείται έχει υπολογιστεί σε 0,125 ml/cm 2 επιφάνειας μεμβράνης. Η μεμβράνη επωάζεται για 1 λεπτό στο αντιδραστήριο ECL και στη συνέχεια εκτίθεται για χρονικό διάστημα 20 δευτερολέπτων έως μερικών λεπτών σε φιλμ Kodak X-omat. 23. Γενετικός μετασχηματισμός της μεσογειακής μύγας Ceratitis capitata και κατασκευή της ομόζυγης διαγονιδιακής σειράς hsp27-gfp Το πλασμιδιακό DNA που χρησιμοποιήθηκε για τις ενέσεις σε έμβρυα της C. capitata παρασκευάστηκε με χρήση του συστήματος αντιδραστηρίων MN Nucleospin Plasmid της εταιρείας MN-Macherey-Nagel όπως περιγράφεται στην παράγραφο 11. Μετά την έκλουση του πλασμιδίου από τη στήλη, ακολουθεί φυγοκέντρηση στις rpm για 15 min, με στόχο την απομάκρυνση του υλικού της στήλης που μπορεί να έχει συμπαρασυρθεί με το DNA. Στη συνέχεια, το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο και το βοηθητικό πλασμίδιο αναμιγνύονται και κατακρημνίζονται μαζί παρουσία NaCl τελικής συγκέντρωσης 0.2 Μ και δύο όγκων αιθανόλης στους -20 o C για ώρες. Το ίζημα ξεπλένεται δύο φορές με αιθανόλη 70%, αφήνεται να στεγνώσει καλά και επαναδιαλύεται στον επιθυμητό όγκο ρυθμιστικού διαλύματος ενέσεων (συνήθως 10μl). Βασική παράμετροι για την επιτυχία του μετασχηματισμού είναι η καθαρότητα του μίγματος DNA που θα χρησιμοποιηθεί στις ενέσεις, καθώς και η χρήση ισομοριακών ποσοτήτων του

87 ~ 87 ~ ανασυνδυασμένου πλασμιδίου και του βοηθητικού πλασμιδίου. Η σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος ενέσεων που χρησιμοποιήθηκε ήταν: Na-Phosphate 1 mm, ρύθμιση ph=6.8 με φωσφορικό οξύ, KCl 5 mm. Διεξαγωγή ενέσεων στα έμβρυα της C. capitata και ομοζύγωση των διαγονιδιακών σειρών 1. Γεμίζουμε τη βελόνα με το ενέσιμο μίγμα και την προσαρμόζουμε στη συσκευή. 2. Συλλέγονται έμβρυα 0-30 λεπτά μετά την ωοαπόθεση, σε νερό βρύσης. Η καλλιέργεια από την οποία συλλέγονται τα αυγά αποτελείται από νεαρά ενήλικα 5-10 ημερών του στελέχους wy, που έχει άσπρο χρώμα ματιών και ανοιχτό κίτρινο χρώμα σώματος. Επίσης, η σχετική υγρασία στο θάλαμο καλλιεργειών πρέπει να κυμαίνεται από 60-75%. 3. Μετά τη συλλογή τους, τα έμβρυα ξεπλένονται για 2 λεπτά με ddh2o και ακολουθεί αποχορίωση με διάλυμα 0,25% NaOCl για 75sec. Στη συνέχεια τα έμβρυα ξεπλένονται καλά με ddh2o για 5 min. Είναι ιδιαίτερα σημαντικό να παραμένει λίγο χόριο κοντά στους πόλους των εμβρύων, αφού κάτι τέτοιο καθιστά πιο εύκολη την είσοδο της βελόνας κατά τη διάρκεια των ενέσεων. 4. Στη συνέχεια τα έμβρυα συλλέγονται σε υγρό wettex με το οποίο απλώνονται στην επιφάνεια τρυβλίου με 1,5% άγαρ και εναποτίθενται στην άκρη καλυπτρίδας πάνω σε κολλητική ταινία διπλής όψεως. Σε κάθε καλυπτρίδα τοποθετούνται 100 έμβρυα με τρόπο ώστε ο οπίσθιος πόλος τους να κατευθύνεται προς την άκρη της καλυπτρίδας. 5. Ακολούθως τα έμβρυα καλύπτονται με λάδι κατάλληλο για βιολογικούς ιστούς (Halocarbon oil 700). Το λάδι περιέχει διαλυμένο οξυγόνο και έτσι επιτρέπει στα έμβρυα να αναπνέουν. 6. Η καλυπτρίδα τοποθετείται σε σταθερό υπόβαθρο και οι ενέσεις διεξάγονται σε μικροσκόπιο αντίθεσης φάσεων, αφού εφαρμοστεί η επιθυμητή πίεση στο υδραυλικό σύστημα ενέσεων. Οι ενέσεις γίνονται στην περιοχή του οπίσθιου πόλου όπου κατά τη διαφοροποίηση θα δημιουργηθούν τα γαμετικά κύτταρα των ενηλίκων ατόμων. Η διεξαγωγή των ενέσεων πρέπει να ολοκληρώνεται 2-2,5 ώρες μετά την εναπόθεση των αυγών, ώστε τα έμβρυα να είναι ακόμα στο προβλαστοδερμικό στάδιο. 7. Μετά το τέλος των ενέσεων οι καλυπτρίδες με τα έμβρυα τοποθετούνται σε τρυβλίο με τροφή και διατηρούνται σε θάλαμο 25 ο C. 8. Γενιά G0: Τα ενήλικα που εκκολάπτονται μπαίνουν σε κλουβιά μαζικών διασταυρώσεων αφού πρώτα διαχωριστούν ανάλογα με το φύλο τους. Συγκεκριμένα, αρσενικά διασταυρώνονται με 20 τουλάχιστον παρθένα θηλυκά wy, ενώ θηλυκά διασταυρώνονται με 20 αρσενικά wy.από τις καλλιέργειες αυτές μαζεύονται αυγά καθημερινά για μία περίπου εβδομάδα. Οι νύμφες αυτής της γενιάς υποβάλλονται σε καθημερινό θερμικό στρες στους 39 ο C για μία ώρα, ώστε να επαχθεί η έκφραση του γονιδίου Ccwhite που βρίσκεται κάτω από τον έλεγχο του υποκινητή της hsp70 μέσα στο μεταθέσιμο στοιχείο piggybac. 9. Γενιά G1: Τα ενήλικα που εκκολάπτονται εξετάζονται στο στερεοσκόπιο για το χρώμα των ματιών τους. Τα άτομα που έχουν χρωματιστά μάτια κρατούνται και διασταυρώνονται ατομικά με άτομα wy του αντίθετου φύλου. Κάθε αρσενικό άτομο με χρωματιστά μάτια διασταυρώνεται με 5 θηλυκά wy, ενώ κάθε θηλυκό με χρωματιστά μάτια διασταυρώνεται με 3 αρσενικά wy. Από τις διασταυρώσεις αυτές συλλέγονται αυγά για περίπου 10 μέρες. Οι νύμφες υποβάλλονται και πάλι σε καθημερινό θερμικό στρες στους 39 o C για μία ώρα. 10. Γενιά G2: Τα ενήλικα που εκκολάπτονται από κάθε μία από τις παραπάνω διασταυρώσεις, ελέγχονται για το χρώμα των ματιών τους και εφόσον είναι ίδιος (στη γενιά αυτή όλα τα άτομα με έγχρωμα μάτια που προκύπτουν είναι ετερόζυγα) διασταυρώνονται

88 ~ 88 ~ μεταξύ τους μαζικά. Αυγά από τις διασταυρώσεις αυτές συλλέγονται 2-3 φορές ανάλογα με την αποδοτικότητά τους και οι νύμφες υποβάλλονται και πάλι σε θερμικό στρες στις ίδιες συνθήκες. 11. Γενιά G3: Από τις παραπάνω διασταυρώσεις τα ενήλικα που έχουν το πιο σκούρο χρώμα ματιών επιλέγονται και διασταυρώνονται μεταξύ τους. Οι απόγονοι τις γενιάς G2 πρέπει να ακολουθούν την αναλογία 1wy : 2ετερόζυγα (ως προς την ένθεση) :1ομόζυγο (ως προς την ένθεση), εφόσον βέβαια η ένθεση δεν είναι σε ομοζυγωτία θανατογόνος ή φυλοσύνδετη. Και στη γενιά αυτή οι νύμφες υποβάλλονται σε καθημερινό θερμικό στρες. 12. Γενιά G4: Αν δεν υπάρχουν έντομα με άσπρα μάτια και όλοι οι απόγονοι έχουν το ίδιο χρώμα ματιών, η διαγονιδιακή σειρά έχει ομοζυγωθεί και είναι έτοιμη για μελέτη. Εικόνα Η διαδικασία των ενέσεων και οι διασταυρώσεις που ακολούθησαν για την απόκτηση των ομόζυγων σειρών (G4). Εκτός από τη διασταύρωση G1 x wy, όλες οι υπόλοιπες διασταυρώσεις ήταν μαζικές (Θεοδωράκη, 2005).

89 ~ 89 ~ Σκοπός Μεταπτυχιακής Διατριβής Σε προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου μας, κλωνοποιήθηκε και χαρακτηρίστηκε το γονίδιο hsp27 της μεσογειακής μύγας (Cchsp27). Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν: α) η μελέτη της έκφρασης του γονιδίου Cchsp27 στα διάφορα στάδια ανάπτυξης της μεσογειακής μύγας και σε διάφορους ιστούς, β) η μελέτη της επίδρασης της εκδυσόνης στην έκφρασης του γονιδίου Cchsp27 στους ιστούς του εντόμου, γ) η κατασκευή ενός διαγονιδιακού στελέχους που φέρει το υβριδικό γονίδιο Cchsp27-GFP υπό τον έλεγχο της ευρύτερης 5 περιοχής του γονιδίου Cchsp27 για την μελέτη της ιστολογικής και ενδοκυτταρικής έκφρασης της πρωτεϊνης Hsp27και δ) η μελέτη της επίδρασης του ψυχρού στρες στην έκφραση των γονιδίων Cchsp27 και Cchsp23.

90 ~ 90 ~ Αποτελέσματα

91 ~ 91 ~ Αποτελέσματα 1. Έκφραση του γονιδίου Cchsp27 κατά την ανάπτυξη Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η έκφραση του γονιδίου hsp27 κατά την ανάπτυξη της μεσογειακής μύγας. Για τον σκοπό αυτό απομονώθηκε ολικό RNA από τα εξής (συγχρονισμένα) αναπτυξιακά στάδια: έμβρυo (Ε0, Ε6, Ε12, Ε24, Ε48), προνύμφη (L3, L5), εκτινασσόμενη προνύμφη (J), λευκό προβομβύκιο (Pf), νύμφη (Ρ4, Ρ8), νεοεκκολαπτόμενα ενηλίκα (M0, F0), και ενήλικα τεσσάρων ημερών (M4, F4), όπου Μ, αρσενικά και F, θηλυκά. Το ολικό RNA επεξεργάστηκε με DNase I και αναλύθηκε με την μέθοδο two-step real-time PCR, όπως αναφέρεται και στην ενότητα Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα φαίνονται στην εικόνα 1.1. Υψηλά επίπεδα Cchsp27 mrna βρέθηκαν στο πρώιμο έμβρυο (Ε0), χρονικά πρόκειται για 0-20min μετά την ωοαπόθεση, γεγονός που υποδηλώνει ότι πρόκειται για μητρικό RNA. Το Cchsp27 mrna φαίνεται ότι αποικοδομείται κατά τις πρώτες 24 ώρες της εμβρυογένεσης ενώ τα επίπεδα έκφρασής του παρουσιάζουν μια μικρή άνοδο στα έμβρυα 48 ωρών (Ε48). Η έκφραση του παραμένει σε χαμηλά επίπεδα κατά τα προνυμφικά στάδια, παρουσιάζει μια αύξηση στο στάδιο του λευκού προβομβυκίου (Pf), ενώ κατά το στάδιο τη νύμφης τεσσάρων ημερών (Ρ4) παρατηρείται μία δραματική αύξηση που φτάνει περίπου στα επίπεδα του σταδίου Ε0. Στο στάδιο της νύμφης των 8 ημερών (Ρ8) η έκφραση του Cchsp27 mrna πέφτει σε πολύ χαμηλά επίπεδα. Χαμηλά επίπεδα παρατηρούνται επίσης στα νεοεκκολαπτόμενα ενήλικα (Μ0, F0) ενώ η έκφραση του Cchsp27 mrna αυξάνεται στα ενήλικα τεσσάρων ημερών (Μ4, F4) με τα αρσενικά να εμφανίζουν υψηλότερα επίπεδα. Τα αποτελέσματα αυτά έρχονται σε συμφωνία με αντίστοιχες μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί στο έντομο Drosophila με μικρές διαφορές. (Hoffman & Corces, 1984; Mason et al., 1984; Pauli et al., 1989, 1990 Arrigo et al., 1988; Thomas & Lengyel.,1986 ). Εικόνα 1.1. Αναπτυξιακό πρότυπο του hsp27 mrna στη μεσογειακή μύγα. Η έκφραση του Cchsp27 mrna εκτιμήθηκε με τη μέθοδο two-step real-time PCR. Οι αριθμοί στα εμβρυικά στάδια (Ε0-Ε48) αντιστοιχούν σε ώρες ενώ σε όλα τα άλλα στάδια σε ημέρες. Στο γράφημα αναπαριστώνται οι μέσες τιμές από τρεις ανεξάρτητες βιολογικές επαναλήψεις (mean ± SE). Με * συμβολίζονται οι στατιστικώς σημαντικές διαφορές (* για p<0,05, και ** για p<0,01).

92 ~ 92 ~ 2. Έκφραση του γονιδίου Cchsp27 στον εγκέφαλο, στις ωοθήκες και στους όρχεις Στη συνέχεια μελετήθηκε η έκφραση του γονιδίου Cchsp27 στον εγκέφαλο, στις ωοθήκες και στους όρχεις ενηλίκων ατόμων, ηλικίας τεσσάρων ημερών. Η ανατομία των ιστών έγινε όπως περιγράφεται στην ενότητα Υλικά και Μέθοδοι και τα ενήλικα άτομα προέρχονταν από συγχρονισμένες καλλιέργειες. Από τα αρσενικά άτομα απομονώθηκαν 20 ζεύγη όρχεων για κάθε πείραμα και από τα θηλυκά 10 ζεύγη ωοθηκών. Απομονώθηκε ολικό RNA από τους εν λόγω ιστούς το οποίο υπέστη την ίδια επεξεργασία όπως αναφέρεται παραπάνω. Η ανάλυση της σχετικής έκφρασης του Cchsp27 γονιδίου έγινε με την μέθοδο two-step realtime PCR. Τα αποτελέσματα για τον εγκέφαλο φαίνονται στην εικόνα 2.1 και για τις ωοθήκες και τους όρχεις στην εικόνα 2.2. Παρατηρείται σημαντική διαφορά στην έκφραση στον εγκέφαλο μεταξύ θηλυκών και αρσενικών ατόμων. Τα επίπεδα του Cchsp27 mrna στον εγκέφαλο των αρσενικών ατόμων ήταν περίπου 7 φορές υψηλότερα από τα αντίστοιχα επίπεδα των θηλυκών ατόμων. Επίσης η έκφραση του γονιδίου στους όρχεις βρέθηκε περίπου 3 φορές μεγαλύτερη από εκείνη των ωοθηκών. Τα αποτελέσματα αυτά έρχονται σε συμφωνία με αυτά της προηγούμενης ενότητας όπου σημειώθηκαν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου στα αρσενικά άτομα τεσσάρων ημερών από ότι στα αντίστοιχα θηλυκά. Έκφραση του hsp27 mrna και της αντίστοιχης πρωτεΐνης στον εγκέφαλο της Drosophila έχει αναφερθεί από τους Posey et al. (2001) και Pauli et al. (1990). Επίσης άλλες μελέτες στην Drosophila έχουν δείξει υψηλή έκφραση της Hsp πρωτεϊνης και στους όρχεις και τις ωοθήκες της Drosophila (Pauli et al., 1989, 1990; Michaud et al., 1997; Marin and Tanguay., 1996) Τα δεδομένα αυτά έρχονται σε αντίθεση με προηγούμενη μελέτη στη Drosophila όπου εμφανίζονται υψηλότερα επίπεδα hsp27 mrna στις ωοθήκες ενήλικων θηλυκών (Mason et al., 1984), αν και υπάρχουν μελέτες στη Drosophila που αναφέρουν ότι το hsp27 mrna εκφράζεται σε όρχεις και ωοθήκες χωρίς να επισημαίνουν διαφορές στην έκφραση του (Pauli et al., 1990). Στην ίδια έρευνα αναφέρονται διαφορές στην έκφραση της πρωτεϊνης Hsp27 ανάμεσα σε όρχεις και ωοθήκες, με την έκφραση της πρωτεΐνης να είναι αυξημένη στους όρχεις. Στις ωοθήκες, η πρωτεΐνη εκφράζεται στα τροφοκύτταρα του ώριμου ωοκυττάρου, ενώ στους όρχεις η Hsp27 εντοπίζεται όχι μόνο στα σπερματοκύτταρα αλλά και σε μερικά σωματικά μέρη του αρσενικού αναπαραγωγικού συστήματος. Σε ότι αφορά τον εγκέφαλο της Drosophila, έχει αναφερθεί η παρουσία του hsp27 mrna στον εγκέφαλο ενηλίκων ατόμων (Posey et al., 2001). Εικόνα 2.1. Σχετική έκφραση του Cchsp27 mrna στον εγκέφαλο ενηλίκων ατόμων ηλικίας 4 ημερών. Η έκφραση του Cchsp27 mrna εκτιμήθηκε με τη μέθοδο two-step realtime PCR. Στο γράφημα αναπαριστώνται οι μέσες τιμές από δύο ανεξάρτητες βιολογικές επαναλήψεις (mean ± SE). Με * συμβολίζονται οι στατιστικώς σημαντικές διαφορές (* για p<0,05).

93 ~ 93 ~ Εικόνα 2.2. Σχετική έκφραση του Cchsp27 mrna στις ωοθήκες και τους όρχεις ενηλίκων ατόμων ηλικίας 4 ημερών. Η έκφραση του Cchsp27 mrna εκτιμήθηκε με τη μέθοδο twostep real-time PCR. Στο γράφημα αναπαριστώνται οι μέσες τιμές από δύο ανεξάρτητες βιολογικές επαναλήψεις (mean ± SE). Με * συμβολίζονται οι στατιστικώς σημαντικές διαφορές (* για p<0,05, και ** για p<0,01). 3. Έκφραση του γονιδίου Cchsp27 στους σιελογόνους αδένες Ακολούθησε η μελέτη της έκφρασης του γονιδίου Cchsp27 στους σιελογόνους αδένες. Έγινε απομόνωση σιελογόνων αδένων από προνύμφες και νύμφες των σταδίων J-24 (24 ώρες πριν από το στάδιο των εκτινασσόμενων προνυμφών), J-12 (12 ώρες πριν από το στάδιο των εκτινασσόμενων προνυμφών), J (στάδιο των εκτινασσόμενων προνυμφών), Pf (στάδιο λευκού προβομβυκίου), Pf+6 (6 ώρες μετά το στάδιο λευκού προβομβυκίου), Pf+12 (12 ώρες μετά το στάδιο λευκού προβομβυκίου), Pf+24 (24 ώρες μετά το στάδιο λευκού προβομβυκίου). Τα άτομα που συλλέχθηκαν για ανατομία προέρχονταν από συγχρονισμένες καλλιέργειες. Απομονώθηκε ολικό RNA από τους σιελογόνους αδένες στο οποίο έγινε η ίδια επεξεργασία όπως και στα προηγούμενα πειράματα που αναφέρονται παραπάνω. Η ανάλυση της σχετικής έκφρασης του Cchsp27 έγινε με την μέθοδο two-step real-time PCR. Τα αποτελέσματα φαίνονται στην εικόνα 3.1. Το μέγιστο της έκφρασης παρατηρείται στο στάδιο J-24. Εικόνα 3.1. Σχετική έκφραση του Cchsp27 mrna στους σιελογόνους αδένες. Η έκφραση του Cchsp27 mrna εκτιμήθηκε με τη μέθοδο two-step real-time PCR. Στο γράφημα αναπαριστώνται οι μέσες τιμές από δύο ανεξάρτητες βιολογικές επαναλήψεις (mean ± SE). Με * συμβολίζονται οι στατιστικώς σημαντικές διαφορές (* για p<0,05, και ** για p<0,01). Η διακεκομμένη γραμμή συμβολίζει τον τίτλο της εκδυσόνης στα αντίστοιχα στάδια.

94 ~ 94 ~ Όπως φαίνεται στην εικόνα 3.1. παρατηρείται σταδιακή μείωση της έκφρασης του Cchsp27 γονιδίου έως το στάδιο J και ακολούθως μια αύξηση στο στάδιο Pf. Ανάμεσα στο στάδιο J και Pf έχει παρατηρηθεί αύξηση στα επίπεδα της εκδυσόνης στην αιμολέμφο καθώς και επαγωγή στις χρωμοσωμικές διογκώσεις (puffs) των πολυταινικών χρωμοσωμάτων των σιελογόνων αδένων (Gariou-Papalexiou et al., 1999). Επίσης στο στάδιο J, ο υποδοχέας της εκδυσόνης φτάνει στα μέγιστα επίπεδα (Verras et al. 2002). Τα παραπάνω υποδηλώνουν ότι η αύξηση της έκφρασης του γονιδίου Cchsp27 στο στάδιο Pf πιθανόν να οφείλεται στη δράση της εκδυσόνης. Τα αποτελέσματά μας συμφωνούν με αντίστοιχες μελέτες στη Drosophila (Dubrovsky et al., 1994; Huet et al., 1996). 4. Επίδραση της ορμόνης εκδυσόνης στην έκφραση του γονιδίου Cchsp27 στους ιστούς της μεσογειακής μύγας Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα θελήσαμε να δούμε αν η εκδυσόνη ρυθμίζει την έκφραση του γονιδίου Cchsp27. Για τον σκοπό αυτό σιελογόνοι αδένες από το στάδιο J, ωοθήκες από νεοεκκολαπτόμενα θηλυκά (F0) και θηλυκά ηλικίας μίας ημέρας και δύο ημερών (F1και F2 αντίστοιχα) καθώς και όρχεις από αρσενικά ηλικίας μίας ημέρας, δύο και τριών ημερών (Μ1, Μ2 και Μ3 αντίστοιχα), επωάστηκαν απουσία εκδυσόνης σε θρεπτικό μέσο Grace s, παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων εκδυσόνης για 5 ώρες και παρουσία εκδυσόνης και κυκλοεξαμιδίου ως αναστολέα της πρωτεϊνοσύνθεσης, όπως περιγράφεται στην ενότητα Υλικά και Μέθοδοι. Απομονώθηκαν 30 ζεύγη σιελογόνων αδένων το στάδιο J, 10 ζεύγη όρχεων από κάθε στάδιο, 10 ζεύγη ωοθηκών από το στάδιο F0 και 10 από το F1, και 5 ζεύγη από το στάδιο F2, από ενήλικα συγχρονισμένα άτομα. Απομονώθηκε ολικό RNA από τους ιστούς στο οποίο έγινε η ίδια επεξεργασία όπως και στα προηγούμενα πειράματα που αναφέρονται παραπάνω. Η μελέτη της έκφρασης του γονιδίου Cchsp27 έγινε με την μέθοδο της two-step real-time PCR. Τα δεδομένα που παρατίθενται προέρχονται από ένα πείραμα για την κάθε περίπτωση. α. Επίδραση της ορμόνης εκδυσόνης στην έκφραση του γονιδίου Cchsp27 στους σιελογόνους αδένες Τριάντα σιελογόνοι αδένες από το στάδιο J επωάστηκαν πρώτα για μία ώρα σε θρεπτικό μέσο Grace s. Στη συνέχεια 10 εξ αυτών επωάστηκαν σε θρεπτικό μέσο Grace s μόνο, 10 επωάστηκαν σε θρεπτικό μέσο Grace s παρουσία εκδυσόνης σε συγκέντρωση 10-4 M, 10 επωάστηκαν σε θρεπτικό μέσο Grace s παρουσία κυκλοεξαμιδίου συγκέντρωσης 5x10-6 M για μισή ώρα και μετά προστέθηκε εκδυσόνη σε τελική συγκέντρωση 10-4 M. Η επώαση διήρκησε 5 ώρες (εικόνα 5.1). Η ίδια διαδικασία ακολουθήθηκε για επώαση με εκδυσόνη σε συγκέντρωση 10-5 M (εικόνα 5.2), 5x10-6 M (εικόνα 5.3) και 10-6 M (εικόνα 5.4). Κάθε φορά προστίθεται κυκλοεξαμίδιο 5x10-6 M και ύστερα από επώαση μισής ώρας πρόστίθεται εκδυσόνη στην αντίστοιχη συγκέντρωση και ακολουθεί επώαση για 5 ώρες. Όπως φαίνεται στην εικόνα 4.1, παρατηρείται μείωση στην έκφραση του γονιδίου Cchsp27 ύστερα από την επώαση με 10-4 M εκδυσόνη ενώ κατά την επώαση με κυκλοεξαμίδιο και εκδυσόνη η έκφραση του γονιδίου είναι περίπου στα επίπεδα του μάρτυρα. Τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν ότι η εκδυσόνη, σε αυτή τη συγκέντρωση, οδηγεί σε καταστολή της έκφρασης του γονιδίου.

95 ~ 95 ~ Εικόνα 4.1. Σχετική έκφραση του Cchsp27 mrna στους σιελογόνους αδένες προνυμφών σταδίου J ύστερα από επώαση με εκδυσόνη για 5 ώρες. Η έκφραση του Cchsp27 mrna εκτιμήθηκε με τη μέθοδο two-step real-time PCR. Μάρτυρας, σιελογόνοι αδένες που επωάστηκαν απουσία κυκλοεξαμιδίου και εκδυσόνης. Εικόνα 4.2. Σχετική έκφραση του Cchsp27 mrna στους σιελογόνους αδένες προνυμφών σταδίου J ύστερα από επώαση με εκδυσόνη για 5 ώρες. Η έκφραση του Cchsp27 mrna εκτιμήθηκε με τη μέθοδο two-step real-time PCR. Μάρτυρας, σιελογόνοι αδένες που επωάστηκαν απουσία κυκλοεξαμιδίου και εκδυσόνης. Στο πείραμα της εικόνας 4.2. παρατηρείται ελαφρά μείωση στην έκφραση ύστερα από επώαση με εκδυσόνη σε συγκέντρωση 10-5 M ενώ μετά από επώαση με κυκλοεξαμίδιο και εκδυσόνη η έκφραση του γονιδίου είναι περίπου στα επίπεδα του μάρτυρα. Τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν ότι, σε αυτή τη συγκέντρωση, η εκδυσόνη οδηγεί σε ασθενή καταστολή της έκφρασης του Cchsp27 γονιδίου.

96 ~ 96 ~ Εικόνα 4.3. Σχετική έκφραση του Cchsp27 mrna στους σιελογόνους αδένες προνυμφών σταδίου J ύστερα από επώαση με εκδυσόνη για 10 ώρες. Η έκφραση του Cchsp27 mrna εκτιμήθηκε με τη μέθοδο two-step real-time PCR. Μάρτυρας, σιελογόνοι αδένες που επωάστηκαν απουσία κυκλοεξαμιδίου και εκδυσόνης. Στην εικόνα 4.3 παρατηρείται μία μικρή μείωση στην έκφραση του γονιδίου κατά την επώαση με εκδυσόνη σε συγκέντρωση 5x10-6 M. Το κυκλοεξαμίδιο δεν φαίνεται να έχει κάποια επίδραση στη δράση της ορμόνης. Η μικρή μείωση στην έκφραση παρουσία εκδυσόνης, σε αυτή τη συγκέντρωση, υποδηλώνει ασθενή καταστολή στην έκφραση του γονίδιου. Εικόνα 4.4. Σχετική έκφραση του Cchsp27 mrna στους σιελογόνους αδένες προνυμφών σταδίου J ύστερα από επώαση με εκδυσόνη για 5 ώρες. Η έκφραση του Cchsp27 mrna εκτιμήθηκε με τη μέθοδο two-step real-time PCR. Μάρτυρας, σιελογόνοι αδένες που επωάστηκαν απουσία κυκλοεξαμιδίου και εκδυσόνης. Στο παραπάνω διάγραμμα φαίνεται επαγωγή της έκφρασης του γονίδιου ύστερα από την επίδραση 10-6 M εκδυσόνης. Παρατηρείται περίπου διπλάσια αύξηση σε σχέση με το μάρτυρα. Το κυκλοεξαμίδιο δεν φαίνεται να έχει κάποια επίδραση στη δράση της ορμόνης. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι, στους σιελογόνους αδένες, η εκδυσόνη προκαλεί καταστολή του γονιδίου Cchsp27 σε υψηλές συγκεντρώσεις και επαγωγή σε μικρότερες συγκεντρώσεις.

97 ~ 97 ~ β. Επίδραση της ορμόνης εκδυσόνης στην έκφραση του γονιδίου Cchsp27 στις ωοθήκες Ογδόντα ωοθήκες από το στάδιο F0 και 80 από το στάδιο F1, ενώ από το στάδιο F2 απομονώθηκαν 40. Επωάστηκαν πρώτα για μία ώρα σε θρεπτικό μέσο Grace s. Στη συνέχεια 20 εξ αυτών επωάστηκαν σε θρεπτικό μέσο Grace s μόνο, 20 επωάστηκαν σε θρεπτικό μέσο Grace s παρουσία εκδυσόνης σε συγκέντρωση 5x10-6 M, 20 επωάστηκαν σε θρεπτικό μέσο Grace s παρουσία κυκλοεξαμιδίου συγκέντρωσης 5x10-6 M για μισή ώρα και μετά προστέθηκε εκδυσόνη σε τελική συγκέντρωση 5x10-6 M. Αντίστοιχες επωάσεις έγιναν και για τις ωοθήκες που απομονώθηκαν από το στάδιο F2, μόνο που για κάθε επώαση χρησιμοποιήθηκαν 10 ωοθήκες. Η επώαση διήρκησε 5 ώρες. Εικόνα 4.5. Σχετική έκφραση του Cchsp27 mrna στις ωοθήκες νεοεκκολαπτόμενων θηλυκών (F0) ύστερα από επώαση με εκδυσόνη για 5 ώρες. Η έκφραση του Cchsp27 mrna εκτιμήθηκε με τη μέθοδο two-step real-time PCR. Μάρτυρας, ωοθήκες που επωάστηκαν απουσία κυκλοεξαμιδίου και εκδυσόνης. Ύστερα από επώαση των ωοθηκών (F0) (εικόνα 4.5) με 5x10-6 M εκδυσόνη παρατηρήθηκε επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου Cchsp27, περίπου 1.7 φορές σε σχέση με το μάρτυρα. Παρουσία κυκλοεξαμιδίου η έκφραση του γονιδίου ήταν παρόμοια με εκείνη του μάρτυρα. Στο πείραμα που περιγράφεται στην εικόνα 4.6, ύστερα από επώαση των ωοθηκών (F1) με 5x10-6 M εκδυσόνη, παρατηρήθηκε μικρή επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου Cchsp27. Παρουσία κυκλοεξαμιδίου η έκφραση του γονιδίου ήταν παρόμοια με εκείνη του μάρτυρα.

98 ~ 98 ~ Εικόνα 4.6. Σχετική έκφραση του Cchsp27 mrna στις ωοθήκες θηλυκών (F1) ύστερα από επώαση με εκδυσόνη για 5 ώρες. Η έκφραση του Cchsp27 mrna εκτιμήθηκε με τη μέθοδο two-step real-time PCR. Μάρτυρας, ωοθήκες που επωάστηκαν απουσία κυκλοεξαμιδίου και εκδυσόνης. Εικόνα 4.7. Σχετική έκφραση του Cchsp27 mrna στις ωοθήκες θηλυκών (F2) ύστερα από επώαση με εκδυσόνη για 5 ώρες. Η έκφραση του Cchsp27 mrna εκτιμήθηκε με τη μέθοδο two-step real-time PCR. Μάρτυρας, ωοθήκες που επωάστηκαν απουσία κυκλοεξαμιδίου και εκδυσόνης. Στο πείραμα που περιγράφεται στην εικόνα 4.7, οι ωοθήκες (F2) επωάστηκαν κατά τα γνωστά όπως και στα προηγούμενα σχετικά πειράματα. Η μείωση στην έκφραση που παρατηρείται δεν φαίνεται να είναι σημαντική, γεγονός που υποδηλώνει ότι σε αυτό το στάδιο η εκδυσόνη δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση του Cchsp27 γονιδίου. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι, στις ωοθήκες των νεοεκολαπτόμενων θηλυκών ατόμων η εκδυσόνη επάγει έμμεσα την έκφραση του γονιδίου Cchsp27. γ. Επίδραση της ορμόνης εκδυσόνης στην έκφραση του γονιδίου Cchsp27 στους όρχεις Ογδόντα όρχεις από τα στάδια Μ1, Μ2 και Μ3. Επωάστηκαν πρώτα για μία ώρα σε θρεπτικό μέσο Grace s. Στη συνέχεια 20 εξ αυτών επωάστηκαν σε θρεπτικό μέσο Grace s μόνο, 20 επωάστηκαν σε θρεπτικό μέσο Grace s παρουσία εκδυσόνης σε συγκέντρωση 5x10-6 M, 20 επωάστηκαν σε θρεπτικό μέσο Grace s παρουσία κυκλοεξαμιδίου συγκέντρωσης 5x10-6 M

99 ~ 99 ~ για μισή ώρα και μετά προστέθηκε εκδυσόνη σε τελική συγκέντρωση 5x10-6 M. Η επώαση διήρκησε 5 ώρες. Εικόνα 4.8. Σχετική έκφραση του Cchsp27 mrna στους όρχεις αρσενικών (Μ1) ύστερα από επώαση με εκδυσόνη για 5 ώρες. Η έκφραση του Cchsp27 mrna εκτιμήθηκε με τη μέθοδο two-step real-time PCR. Μάρτυρας, ωοθήκες που επωάστηκαν απουσία κυκλοεξαμιδίου και εκδυσόνης. Ύστερα από επώαση των όρχεων (Μ1) (εικόνα 4.8) σε συγκέντρωση εκδυσόνης 5x10-6 M, παρατηρήθηκε αρκετά σημαντική αύξηση στη έκφραση του γονιδίου Cchsp27. Παρουσία κυκλοεξαμιδίου η έκφραση του γονιδίου ήταν μικρότερη και από εκείνη του μάρτυρα. Στην εικόνα 4.9 φαίνονται τα δεδομένα που προήλθαν ύστερα από επώαση όρχεων (Μ2) στις ίδιες συνθήκες όπως περιγράφονται στην προηγούμενη παράγραφο. Παρατηρείται μεγάλη αύξηση της έκφρασης του γονιδίου Cchsp27 ύστερα από επώαση με 5x10-6 M εκδυσόνη, περίπου 8 φορές σε σχέση με το μάρτυρα. Παρουσία κυκλοεξαμιδίου η έκφραση του γονιδίου ήταν περίπου διπλάσια από εκείνη του μάρτυρα. Εικόνα 4.9. Σχετική έκφραση του Cchsp27 mrna στους όρχεις αρσενικών (Μ2) ύστερα από επώαση με εκδυσόνη για 5 ώρες. Η έκφραση του Cchsp27 mrna εκτιμήθηκε με τη μέθοδο two-step real-time PCR. Μάρτυρας, ωοθήκες που επωάστηκαν απουσία κυκλοεξαμιδίου και εκδυσόνης.

100 ~ 100 ~ Εικόνα Σχετική έκφραση του Cchsp27 mrna στους όρχεις αρσενικών (Μ3) ύστερα από επώαση με εκδυσόνη για 5 ώρες. Η έκφραση του Cchsp27 mrna εκτιμήθηκε με τη μέθοδο two-step real-time PCR. Μάρτυρας, ωοθήκες που επωάστηκαν απουσία κυκλοεξαμιδίου και εκδυσόνης. Ακολούθησε επώαση όρχεων (Μ3) (εικόνα 4.10) στις ίδιες συνθήκες όπως περιγράφονται στην προηγούμενη παράγραφο. Παρατηρείται αρκετά σημαντική αύξηση της έκφρασης του γονιδίου Cchsp27 ύστερα από επώαση σε συγκέντρωση εκδυσόνης 5x10-6 M, περίπου δύο φορές σε σχέση με το μάρτυρα. Παρουσία κυκλοεξαμιδίου η έκφραση του γονιδίου ήταν λίγο μεγαλύτερη από εκείνη του μάρτυρα. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι και στα τρία αναπτυξιακά στάδια (Μ1, Μ2 και Μ3), η εκδυσόνη επάγει έμμεσα την έκφραση του γονιδίου Cchsp27, ιδιαίτερα στο στάδιο Μ2. 5. Δημιουργία και χαρακτηρισμός διαγονιδιακού στελέχους που εκφράζει την υβριδική πρωτεΐνη Hsp27-GFP Με σκοπό την μελλοντική μελέτη της κυτταρικής και ενδοκυτταρικής κατανομής της πρωτεΐνης Hsp27 κατά την ανάπτυξη του εντόμου Ceratitis capitata, δημιουργήθηκε ένα διαγονιδιακό στέλεχος που φέρει το υβριδικό γονίδιο hsp27-gfp υπό τον έλεγχο της ευρύτερης 5 περιοχής του hsp27 γονιδίου. Από αδημοσίευτα αποτελέσματα της υποψηφίου διδάκτορος, Κ. Οικονόμου, είναι γνωστό ότι η περιοχή αυτή οδηγεί σε μεγάλη έκφραση ένα γονίδιο αναφοράς, τόσο σε κανονικές συνθήκες όσο και σε συνθήκες θερμικού στρες. Στην εικόνα 5.1 παρουσιάζεται διαγραμματικά η κατασκευή hsp27-gfp για τη δημιουργία του μετασχηματισμένου στελέχους. Για την κατασκευή του διαγονιδίου hsp27-gfp η κωδική περιοχή της GFP συνδέθηκε καθοδικά της κωδικής περιοχής της HSP27 στο ίδιο πλαίσιο ανάγνωσης. Ακολούθως προστέθηκε ο τερματιστής του γονιδίου hsp27 ο οποίος απομονώθηκε με την τεχνική 3 RACE. Η όλη κατασκευή εντέθηκε στο φορέα γενετικού μετασχηματισμού piggybac.

101 ~ 101 ~ Εικόνα 5.1. (α) Γραφική απεικόνιση του διαγονιδίου hsp27-gfp της μεσογειακής μύγας. Με μπλε χρώμα συμβολίζεται η 5 περιοχή του γονιδίου, με ροζ η κωδική περιοχή του γονιδίου, με κόκκινα ωοειδή τα δυνητικά στοιχεία απόκρισης στη θερμότητα και με κίτρινο ωοειδές ένα δυνιτικό στοιχείο απόκρισης στη εκδυσόνη. Επίσης φαίνονται οι διάφορες θέσεις περιορισμού, το κουτί ΤΑΤΑ και τα σημεία έναρξης της μεταγραφής και της μετάφρασης. Με πράσινο χρώμα συμβολίζεται η κωδική περιοχή της GFP και με πορτοκαλί η τερματική αλληλουχία του γονιδίου hsp27 (β) Το διαγονίδιο εντέθηκε στον φορέα puc18 και μετά ακολούθως στον φορέα PHSS6 με σκοπό να δημιουργηθούν NotI άκρα ώστε να είναι εφικτή η κλωνοποίηση του στον φορέα μετασχηματισμού piggybac. Το piggybac φέρει στα άκρα του τα στοιχεία εκείνα που είναι αναγκαία για την ένθεση του στο γονιδίωμα του ξενιστή. Αμέσως μετά τα άκρα υπάρχουν μονωτές (SCS, SCS ) οι οποίοι προστατεύουν το διαγονίδιο από επιδράσεις εξωτερικών ρυθμιστικών στοιχείων του γονιδιώνματος του ξενιστή. Ccw το γονίδιο white της μεσογειακής μύγας. P και Τ: ο υποκινητής και ο τερματιστής του γονιδίου hsp70 της Drosophila melanogaster. Στο εργαστήριο μας είχε ήδη, από το φοιτητή Χρήστο Σπυρόπουλο, κλωνοποιηθεί η κατασκευή pbs-27p1 η οποία έφερε την 5 ανοδική περιοχή του γονιδίου Cchsp27. Για την ένθεση στην κατασκευή, της κωδικής περιοχής της HSP27 πραγματοποιήθηκε PCR με κατάλληλους εκκινητές. Ο αντίστροφος εκκινητής έφερε στο 5 άκρο του την αλληλουχία περιορισμού για το ένζυμο SpeI. Μετά την απομόνωση του PCR προϊόντος ακολούθησε πέψη με τα ένζυμα περιορισμού ClaI/SpeI και ένθεση στις αντίστοιχες θέσεις του pbs-27p1. Στη συνέχεια απομονώθηκε η κατασκευή που έφερε την κωδική περιοχή της GFP και με την πέψη SpeI/XbaI απομονώθηκε το θραύσμα που αντιστοιχεί στην κωδική περιοχή. Η κωδική περιοχή της GFP εντέθηκε καθοδικά της κωδικής περιοχής της HSP27 (CDS), όπως φαίνεται στην εικόνα 6.1. Για την απομόνωση του τερματιστή του Cchsp27 ακολουθήθηκε η τεχνική της 3 RACE. Το προϊόν από την αντίδραση 3 RACE απομονώθηκε, κόπηκε με τα ένζυμα περιορισμού BamHI/EcoRI κλωνοποίηθηκε στον φορέα pb-sk και στάλθηκε για αλληλούχιση (εικόνα 5.2). Το τμήμα αυτό φέρει την αλληλουχία ΤΑΑΤΑΑ που αποτελεί ένα εναλλακτικό σινιάλο πολυαδενυλίωσης (Derti et al., 2012). Εικόνα 5.2. Αλληλουχία της 3 UTR περιοχής του Cchsp27. Η υπογραμμισμένη αλληλουχία αποτελεί ένα εναλλακτικό σινιάλο πολυαδενυλίωσης.

102 ~ 102 ~ Η τερματική αλληλουχία του γονιδίου Cchsp27 εντέθηκε στο πλασμίδιο pbs-27p1-cds- GFP καθοδικά του GFP και το τμήμα 27P1-CDS-GFP-27Τ μεταφέρθηκε στο πλασμίδιο puc18 και ακολούθως στο πλασμίδιο PHSS6. Τέλος το διαγονίδιο κλωνοποιήθηκε ως NotI κασέτα στο φορέα μετασχηματισμού piggybac. Η τελευταία κατασκευή, Hsp27-GFP απομονώθηκε και προετοιμάστηκε κατάλληλα (Υλικά και Μέθοδοι) για την δημιουργία των μετασχηματισμένων ατόμων. Σε όλα τα στάδια των ενδιάμεσων πέψεων και κλωνοποιήσεων γινόταν έλεγχος με ηλεκτροφόρηση DNA. Οι ενέσεις του διαγονίδιου στο στέλεχος wy της μεσογειακής μύγας για την δημιουργία μετασχηματισμένων ατόμων έγιναν από την υποψήφια Διδάκτωρ του εργαστηρίου μας, Οικονόμου Κατερίνα, όπως περιγράφεται στην ενότητα Υλικά και Μέθοδοι. Τα ενήλικα άτομα του στελέχους wy, λόγω μετάλλαξης που φέρουν στο γονίδιο white, έχουν άσπρο χρώμα ματιών. Επομένως, η ένθεση του φορέα μετασχηματισμού piggybac, ο οποίος φέρει το κανονικό αλληλόμορφο του γονιδίου white (w + ) της μεσογειακής μύγας, μπορεί να προκαλέσει επαναφορά του φαινοτύπου των ματιών εφόσον η ενσωμάτωσή του συμβεί στα γεννητικά κύτταρα. Αυτός είναι και ο λόγος για τον οποίο η επαναφορά του φαινοτύπου δεν εμφανίζεται στα άτομα της γενιάς G0, αλλά στην επόμενη γενιά (G1). Τελικά, προέκυψαν τέσσερα διαγονιδιακά στελέχη από τα οποία τα δύο πέθαναν μέσα σε μικρό χρονικό διάστημα, το ένα δεν έδωσε απογόνους ενώ ένα από αυτά ήταν γόνιμο οπότε ήταν εφικτή η διατήρηση του και στο τέλος και η ομοζύγωσή του (εικόνα 5.3). Εικόνα 5.3. Χρώμα ματιών ενός μετασχηματισμένου ατόμου hsp27-gfp. (α) Στο πάνω μέρος της εικόνας το στέλεχος wy με άσπρα μάτια που χρησιμοποιήθηκε για τις ενέσεις και κάτω το στέλεχος Benakeio που είναι αγρίου τύπου. (β) το διαγονιαδιακό στελέχος που εκφράζει την υβριδική πρωτεΐνη Hsp27-GFP. Η πιστοποίηση της έκφρασης του hsp27-gfp διαγονιδίου έγινε με ανάλυση RT-PCR και με ανάλυση western blot χρησιμοποιώντας GFP εκκινητές και αντι-gfp αντισώματα αντίστοιχα. Ολικό RNA και ολική πρωτεϊνη από ενήλικα άτομα 4 ημερών, χωρίς και μετά από θερμικό στρες, υποβλήθηκαν σε ανάλυση RT-PCR και western blot όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα (εικόνες, 5.4 και 5.5) δείχνουν ότι το υβριδικό γονίδιο εκφράζεται τόσο στο επίπεδο του RNA όσο και στο επίπεδο της πρωτεΐνης και κατά συνέπεια το διαγονιδιακό στέλεχος που δημιουργήσαμε είναι κατάλληλο για μελέτη της κυτταρικής και ενδοκυτταρικής κατανομής της πρωτεΐνης Hsp27. Εικόνα 5.4. Έκφραση του hsp27-gfp mrna σε ενήλικα διαγονιδιακά άτομα τεσσάρων ημερών χωρίς και μετά από θερμικό στρες μιας ώρας στους 39 ο C. Η έκφραση του Cchsp27 mrna εκτιμήθηκε με τη μέθοδο RT-PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές από την κωδική περιοχή του γονιδίου GFP. Ισόποσα δείγματα από τα προϊόντα της RT-PCR αναλύθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 2%.

103 ~ 103 ~ Εικόνα 5.5. Έκφραση της υβριδικής πρωτεΐνης HSP27-GFP στο διαγονιδιακό στέλεχος. Από τέσσερα ενήλικα διαγονιδιακά άτομα τεσσάρων ημερών που υπέστησαν θερμικό στρες στους 39 ο C (heat shock) και από διαγονιδιακά αρσενικά τεσσάρων ημερών που δεν υπέστησαν θερμικό στρες (μάρτυρας) απομονώθηκε ολική πρωτεΐνη. Ακολούθησε ανάλυση σε πήκτωμα SDSπολυακρυλαμιδίου 11% ισόποσων δειγμάτων (60 μg) και μεταφορά σε PVDF μεμβράνη. Στη συνέχεια ακολούθησε η αντίδραση με μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της GFP και εμφάνιση έγινε με την μέθοδο ενισχυμένης χημειοφωταύγιας ECL, όπως αναφέρεται στα Υλικά και Μέθοδοι. 6. Επαγωγή των γονιδίων Cchsp27 και Cchsp23 σε συνθήκες ψυχρού στρες. Από προηγούμενη εργασία του εργαστηρίου (Πασπαλιάρης, 2012) ήταν γνωστό ότι η έκφραση των γονιδίων hsp70 και hsp83 επάγεται σημαντικά σε συνθήκες ψυχρού στρες. Για να δούμε αν και οι μικρά θερμοεπαγώμενα γονίδια (hsp27 και hsp23) επάγονται από το ψυχρό στρες έγιναν αντίστοιχα πειράματα και η έκφραση των γονιδίων hsp27 και hsp23 εκτιμήθηκε με τη μέθοδο two-step real-time PCR. Αρχικά, αρσενικά ενήλικα άτομα ηλικίας τεσσάρων ημερών επωάστηκαν για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα στους 0 ο C. Συνολικά επωάστηκαν 30 αρσενικά ενήλικα άτομα για 2, 4, 6, 12 και 24 ώρες στους 0 ο C. Aκολούθως έμειναν δύο ώρες σε θερμοκρασία δωματίου για να ανακάμψουν. Τα αποτελέσματα από δύο ανεξάρτητα πειράματα έδειξαν 100% βιωσιμότητα σε σχέση με τους μάρτυρες. Αυτό όμως που παρατηρήθηκε ήταν ότι κάποια άτομα είχαν μειωμένη κινητικότητα, την οποία ανακτούσαν ύστερα από λίγη ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθως μελετήθηκε η έκφραση των γονιδίων Cchsp27 και Cchsp23 με την μέθοδο της two-step real-time PCR όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Για το σκοπό αυτό δέκα ενήλικα αρσενικά ηλικίας 4 ημερών εκτέθηκαν για χρονικά διαστήματα που αναφέρονται παραπάνω στους 0 ο C και ακολούθως αφέθηκαν να ανακάμψουν για 2 ώρες στους 25 ο C. Η ανάκαμψη των 2 ωρών επιλέχθηκε γιατί έδινε τα μεγαλύτερα επίπεδα επαγωγής στα γονίδια hsp70 και hsp83 (Πασπαλιάρης, 2012). Μετά την ανάρρωση στους 25 ο C, απομονώθηκε ολικό RNA στο οποίο έγινε η ίδια επεξεργασία όπως και στα προηγούμενα πειράματα που αναφέρονται παραπάνω. Σαν αρνητικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε ολικό RNA από άτομα που δεν εκτέθηκαν σε στρες και σαν θετικός μάρτυρας άτομα που εκτέθηκαν σε θερμικό στρες (39 ο C για 1 ώρα και ανάκαμψη για 2 ώρες). Για το γονίδιο Cchsp27 τα αποτελέσματα φαίνονται στην εικόνα 4.1 ενώ για το Cchsp23 στην εικόνα 4.2. Και για τα δύο γονίδια παρατηρείται αύξηση της έκφρασής τους από τις 2 ώρες επώασης στους 0 ο C. Η έκφραση του γονιδίου Cchsp27 συνεχίζει να αυξάνεται μέχρι και τις 24 ώρες επώασης στους 0 ο C φθάνοντας στο 32% της έκφρασης του γονιδίου μετά από θερμικό στρες. Η έκφραση του γονιδίου Cchsp23 συνεχίζει να αυξάνεται μέχρι και τις 12 ώρες επώασης στους 0 ο C φθάνοντας στο 18% της έκφρασης του γονιδίου μετά από θερμικό στρες και ακολούθως παραμένει σταθερή. Τα παραπάνω αποτελέσματα βρίσκονται σε συμφωνία με αντίστοιχες μελέτες στη Drosophila όπου παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης των γονιδίων hsp23 και hsp27 σε συνθήκες ψυχρού στρες (Yocum et al., 1998; Qin et al., 2005; Colinet et al., 2010a, 2010c).