Genscreen HIV-1 Ag Assay 2 Πλακέτες

Transcript

1 Genscreen HIV-1 Ag Assay 2 Πλακέτες ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ (EIA) ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΟΥ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ P24 ΤΟΥ ΙΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΗΣ ΑΝΟΣΟΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑΣ ΤΥΠΟΥ I (HIV-1) ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟ ΟΡΟ, ΠΛΑΣΜΑ ΚΑΙ ΥΠΕΡΚΕΙΜΕΝΟ ΥΓΡΟ ΚΥΤΤΑΡΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ /01

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1 - ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΑ 2 - ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Genscreen HIV-1 ANTIGEN ASSAY 3 - ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Genscreen HIV-1 ANTIGEN ASSAY 4 - ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ ΠΟΥ ΔΕΝ ΠΑΡΕΧΟΝΤΑΙ 5 - ΟΔΗΓΙΕΣ ΥΓΙΕΙΝΗΣ ΚΑΙ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ 6 - ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ 7 - ΣΥΛΛΟΓΗ ΚΑΙ ΧΕΙΡΙΣΜΟΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ 8 - ΑΝΑΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ 9 - ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗΣ - ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΖΩΗΣ 10 - ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ 11 - ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 12 - ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΜΕ ΠΙΠΕΤΑ 13 - ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ 14 - ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ 15 - ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 2 [GR]

3 1 - ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΑ Ο αιτιολογικός παράγοντας του συνδρόµου επίκτητης ανοσοποιητικής ανεπάρκειας (AIDS) είναι ένας ρετροϊός που ονοµάζεται ιός της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV). Ο ιός HIV έχει αποµονωθεί από ασθενείς µε AIDS και από υγιή άτοµα σε οµάδες υψηλού κινδύνου για AIDS 1-2. Η µετάδοση είναι γνωστό ότι πραγµατοποιείται µε τη σεξουαλική επαφή, τη χρήση µολυσµένων βελονών, µέσω µετάγγισης µολυσµένων προϊόντων του αίµατος καθώς και περιγεννητικά, από µολυσµένη µητέρα στο έµβρυο ή το βρέφος 1-8. Ένδειξη προηγούµενης έκθεσης στον HIV είναι συνήθως η παρουσία του ειδικού για τον ιό αντισώµατος στον ορό ή το πλάσµα του ατόµου, µετά την έκθεση στον ιό. Πριν από την εµφάνιση ανιχνεύσιµων αντισωµάτων, προηγείται µια χρονική περίοδος κατά την οποία κυκλοφορούν στο αίµα ελεύθερα αντιγόνα του ιού. Ένα από αυτά τα αντιγόνα του ιού είναι η βασική πρωτεΐνη του πυρήνα του ιού, p24. Οι αναλύσεις αντιγόνων του HIV µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την ανίχνευση παρουσίας αντιγόνων του ιού, και συνεπώς µόλυνσης µε HIV, πριν από την οροµετατροπή. Η περίοδος αντιγοναιµίας πριν από εµφάνιση των αντισωµάτων HIV ποικίλλει και µπορεί να διαρκέσει ηµέρες ή εβδοµάδες στα µολυσµένα άτοµα. Καθώς πραγµατοποιείται οροµετατροπή σε ένα άτοµο, τα ειδικά για τον ιό αντισώµατα συµπλέκονται µε τα ελεύθερα αντιγόνα, µε αποτέλεσµα τη µείωση του επιπέδου ή την πλήρη απουσία ελεύθερων αντιγόνων στο αίµα Αντιγοναιµία ενδέχεται να εµφανιστεί ξανά κατά την εξέλιξη της νόσου 12. Η εξέταση Genscreen HIV-1 Antigen Assay προορίζεται για χρήση ως προληπτικός διαγνωστικός έλεγχος για δωρεές αίµατος και πλάσµατος καθώς και ως βοήθηµα στη διάγνωση και πρόγνωση της µόλυνσης µε HIV ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Genscreen HIV-1 ANTIGEN ASSAY Η εξέταση Genscreen HIV-1 Antigen Assay είναι µια ανοσοενζυµική ανάλυση για την ανίχνευση του αντιγόνου (p24) του πυρήνα του HIV-1 σε δείγµατα ανθρώπινου ορού και πλάσµατος. Η εξέταση «Genscreen HIV-1 Antigen Confirmatory Assay» (κωδικός 71121) είναι µια συµπληρωµατική ανάλυση που χρησιµοποιείται µε την ανάλυση του αντιγόνου του HIV-1 και την επιβεβαίωση της παρουσίας αντιγόνου p24 του HIV σε κατ' επανάληψη αντιδρώντα δείγµατα. Η εξέταση Genscreen HIV-1 Antigen Assay βασίζεται στη χρήση µιας στερεής φάσης η οποία προετοιµάζεται µε µονοκλωνικό αντίσωµα ποντικού για το αντιγόνο του HIV-1, ενός αρχικού συζεύκτη που προετοιµάζεται µε βιοτινυλιωµένο αντίσωµα antip24 προβάτου και ενός δεύτερου συζεύκτη που προετοιµάζεται µε αβιδίνη συνδυασµένη µε υπεροξειδάση χρένου. Η εκτέλεση της εξέτασης περιλαµβάνει τα παρακάτω βήµατα αντιδράσεων: 1. Προσθήκη αραιωτικού δείγµατος σε κάθε βύθισµα. Τα δείγµατα που πρόκειται να υποβληθούν σε εξέταση και οι οροί ελέγχου προστίθενται στα αντίστοιχα βυθίσµατα. Εάν υπάρχει HIV-1 Ag στο δείγµα, δεσµεύεται στα αντισώµατα που επικαλύπτουν το βύθισµα. Το HIV-1 Ag που δεσµεύεται στο βύθισµα δεν αποµακρύνεται κατά την πλύση που πραγµατοποιείται στη συνέχεια. Το χρώµα του αραιωτικού δείγµατος αλλάζει από πράσινο σε µπλε, επιβεβαιώνοντας την προσθήκη δείγµατος (ή ορού ελέγχου) στο βύθισµα. 2. Στη συνέχεια προστίθεται συζεύκτης 1 σε κάθε βύθισµα και τα βυθίσµατα υποβάλλονται σε επώαση. Με τον τρόπο αυτό, το βιοτινυλιωµένο αντίσωµα antip24 προβάτου στο συζεύκτη 1 µπορεί να δεσµευτεί σε οποιοδήποτε HIV-1 Ag που βρίσκεται στο βύθισµα. Τα σύµπλοκα αντιγόνου-αντισώµατος παραµένουν δεσµευµένα κατά τη διάρκεια του βήµατος πλύσης που ακολουθεί. 3. Στη συνέχεια προστίθεται συζεύκτης 2 στα βυθίσµατα, τα οποία υποβάλλονται σε επώαση. Η αβιδίνη στο συζεύκτη 2 δεσµεύεται ειδικά στα σύµπλοκα αντισώµατος- 3 [GR]

4 HIV-1 Ag που βρίσκονται στο βύθισµα. Η ποσότητα µη δεσµευµένου συζεύκτη αποµακρύνεται κατά την πλύση. 4. Στην πλάκα προστίθεται διάλυµα εργασίας TMB και ακολουθεί επώαση. Αναπτύσσεται µπλε ή µπλε-πράσινο χρώµα, ανάλογα µε την ποσότητα HIV-1 Ag στο δείγµα. Η ανάπτυξη χρώµατος διακόπτεται µε την προσθήκη οξέος, το οποίο αλλάζει το µπλε-πράσινο χρώµα σε κίτρινο. Η οπτική απορρόφηση των δειγµάτων και των ορών ελέγχου προσδιορίζεται φασµατοφωτοµετρικά, σε µήκος κύµατος 450/ nm. 3 - ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Genscreen HIV-1 ANTIGEN ASSAY Ετικετα Τυποσ αντιδραστηριου Μορφη R1 Microplate Μικροπλάκα 12 ταινίες των 8 βυθισµάτων, επικαλυµµένων µε µονόκλωνα αντισώµατα ποντικού για HIV-1 p24 2 Πλακέτες R2 Concentrated washing solution (20X) Συµπυκνωµένο διάλυµα πλύσης (20X) Ρυθµιστικό διάλυµα Tris NaCl ph 7,4 Συντηρητικό: ProClin 300 (0,04%) R3 Specimen diluent Αραιωτικό δείγµατος Triton X-100 (2%) Lithium Chlorid (2%) Χρωστική προσθήκης δείγµατος (πράσινη) Συντηρητικό: ProClin 300 (0,5%) C0 Negative control Αρνητικός ορός ελέγχου Ανθρώπινος ορός, µη αντιδρών για αντιγόνο HIV και AgHbs, καθώς και αντισώµατα για HIV-1, HIV- 2, HCV, HTLV-I Θειική γενταµυκίνη 0,005% Συντηρητικό: ProClin 300 (0,5%) C1 Positive control Θετικός ορός ελέγχου Κεκαθαρµένο, απενεργοποιηµένο αντιγόνο HIV-1 Συντηρητικό: ProClin 300 (0,5%) R4 R5 Concentrated conjugate 1 Concentrated conjugate 2 Συµπυκνωµένος συζεύκτης 1 (100X) Συζεύκτης anti-p24 προβάτου, θειική γενταµυκίνη 0,005% Κίτρινη χρωστική - συντηρητικό: ProClin 300 (0,5%) Συµπυκνωµένος συζεύκτης 2 (100X) Συζεύκτης αβιδίνης-hrp, θειική γενταµυκίνη 0,005% Πράσινη χρωστική - συντηρητικό: ProClin 300 (0,5%) R6 Conjugate diluent Αραιωτικό συζεύκτη Ρυθµιστικό διάλυµα µε σταθεροποιητές πρωτεϊνών Συντηρητικό: ProClin 300 (0,5%) R8 Substrate buffer Ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος Ρυθµιστικό διάλυµα κιτρικού οξέος/οξικού νατρίου ph 4,0 Υπεροξείδιο υδρογόνου 0,015%, Διµεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) 4% R9 Chromogen: TMB solution (11X) R10 Stopping solution Χρωµογόνο Τετραµεθυλοβενζιδίνη (TMB) Διάλυµα αναστολής 1N H 2 SO 4 1 φιαλίδιο 235 ml 1 φιαλίδιο 20 ml 1 φιαλίδιο 10 ml 1 φιαλίδιο 7 ml 1 φιαλίδιο 1 ml 1 φιαλίδιο 1 ml 1 φιαλίδιο 100 ml 1 φιαλίδιο 60 ml 1 φιαλίδιο 5 ml 2 φιαλίδια 2 x 28 ml 4 [GR]

5 4 - ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ ΠΟΥ ΔΕΝ ΠΑΡΕΧΟΝΤΑΙ Αποσταγµένο νερό Λευκαντικό οικιακής χρήσης (υποχλωριώδες νάτριο 5% έως 8%) που µπορεί να αραιωθεί έως ελάχιστη συγκέντρωση 10% (ή υποχλωριώδες νάτριο 0,5%). Στα εναλλακτικά απολυµαντικά περιλαµβάνονται τα εξής: Αιθανόλη 70% ή Wescodyne 0,5% (West Chemical Products, Inc.). Πιπέτες ακριβείας για διοχέτευση όγκων από 10 µl έως 200 µl, 1 ml, 5 ml και 10 ml (µε ορθότητα ± 10%). Πιπέτα πολλαπλών καναλιών µε δυνατότητα διοχέτευσης 100 µl ή 200 µl, προαιρετικά. Βαθµονοµηµένοι κύλινδροι 25 ml, 100 ml, 1000 ml. Δοχείο για µολυσµένα υπολείµµατα. Υδατόλουτρο ή ξηρός επωαστήρας*, µε θερµοστατική ρύθµιση στους 37±1 C ή 40 ± 1 C. Χειροκίνητη, ηµιαυτόµατη ή αυτόµατη συσκευή πλύσης µικροπλάκας (*). Συσκευή ανάγνωσης µικροπλάκας µε φίλτρα 450 nm και nm (*). Ταινίες χωρίς επισήµανση για έλεγχο σε µη πλήρεις πλάκες, σε αυτόµατο τρόπο λειτουργίας. Δοχεία αντιδραστηρίων EIA (προαιρετικά). Γάντια µίας χρήσης Απορροφητικό χαρτί Καθαρά πλαστικά δοχεία (από πολυστυρένιο ή πολυπροπυλένιο) για την προετοιµασία διαλυµάτων συζευκτών εργασίας και διαλύµατος TMB. Μέσο κυτταροκαλλιέργειας, π.χ. RPMI-1640 που περιέχει εµβρυϊκό ορό µόσχου 10%, αντίστοιχο µε εκείνο που χρησιµοποιείται για την καλλιέργεια µολυσµένων κυττάρων (κατά την εξέταση δειγµάτων κυτταροκαλλιέργειας). (*) Επικοινωνήστε µαζί µας για λεπτοµερείς πληροφορίες σχετικά µε τον εξοπλισµό που συνιστάται από το τµήµα τεχνικής υποστήριξης. 5 - ΟΔΗΓΙΕΣ ΥΓΙΕΙΝΗΣ ΚΑΙ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ Όλα τα αντιδραστήρια που περιέχει το κιτ προορίζονται για «in vitro» διαγνωστική χρήση. Κατά το χειρισµό αντιδραστηρίων και δειγµάτων πρέπει να φοράτε γάντια µίας χρήσης και να πλένετε σχολαστικά τα χέρια σας µετά το χειρισµό τους. Μην αναρροφάτε µε πιπέτα από το στόµα. Το υλικό ανθρώπινης προέλευσης που χρησιµοποιήθηκε για την προετοιµασία του αρνητικού ορού ελέγχου υποβλήθηκε σε έλεγχο και επιβεβαιώθηκε ότι είναι µη αντιδρών για αντιγόνο HIV- 1, αντισώµατα anti-hiv1 και anti-hiv2, αντιγόνο ηπατίτιδας B (HB Ag), αντισώµατα anti-hcv, αντισώµατα anti HTLV1/HTLV 2 και HIV1/HIV2. Ο θετικός ορός ελέγχου αδρανοποιείται µε θερµότητα, µέσω διαχωρισµού παράγοντα. Καθώς καµία γνωστή µέθοδος εξέτασης δεν µπορεί να διασφαλίσει πλήρως την απουσία των ιών HIV, ηπατίτιδας B και C ή άλλων µολυσµατικών παραγόντων, τα αντιδραστήρια αυτά καθώς και τα δείγµατα ασθενών πρέπει να θεωρούνται εν δυνάµει µολυσµατικά και ο χειρισµός τους πρέπει να πραγµατοποιείται µε προσοχή. Ο εξοπλισµός που έρχεται σε άµεση επαφή µε δείγµατα και αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης, καθώς και µε ρυθµιστικά διαλύµατα, θα πρέπει να θεωρείται µολυσµένος και ο χειρισµός του πρέπει να είναι ανάλογος. Απαιτείται προσοχή ώστε να µη χυθούν δείγµατα ή διαλύµατα που περιέχουν δείγµατα. 5 [GR]

6 Καθαρίζετε τις µολυσµένες επιφάνειες µε αραιωµένο λευκαντικό 10%. Αν το µολυσµένο υγρό είναι οξύ, οι µολυσµένες επιφάνειες πρέπει αρχικά να εξουδετερωθούν µε διττανθρακικό νάτριο και, στη συνέχεια, να καθαριστούν µε λευκαντικό και να σκουπιστούν µε απορροφητικό χαρτί. Το υλικό που χρησιµοποιείται για τον καθαρισµό πρέπει να απορρίπτεται σε δοχείο για βιολογικά επικίνδυνα απόβλητα. Τα δείγµατα, τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης, καθώς και τα µολυσµένα υλικά και τα προϊόντα πρέπει να απορρίπτονται µετά την απολύµανση: - είτε µε εµβάπτιση σε λευκαντικό µε τελική συγκέντρωση υποχλωριώδους νατρίου 5% (1 όγκος λευκαντικού ανά 10 όγκους µολυσµένου υγρού ή νερού) για 30 λεπτά. - είτε µε αποστείρωση σε αυτόκαυστο στους 121 C για τουλάχιστον 2 ώρες. Η αποστείρωση σε αυτόκαυστο είναι η βέλτιστη µέθοδος αδρανοποίησης των HIV και HBV. ΠΡΟΣΟΧΗ: ΜΗΝ ΤΟΠΟΘΕΤΕΙΤΕ ΣΤΟ ΑΥΤΟΚΑΥΣΤΟ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΠΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΥΝ ΥΠΟΧΛΩΡΙΩΔΕΣ ΝΑΤΡΙΟ. Το δελτίο δεδοµένων ασφάλειας διατίθεται κατόπιν αίτησης. Αποφεύγετε τυχόν επαφή του δέρµατος και του βλεννογόνου µε το ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος, το χρωµογόνο και το διάλυµα αναστολής (κίνδυνος τοξικότητας, ερεθισµού ή εγκαύµατος). Μην παραλείπετε την εξουδετέρωση και/ή αποστείρωση σε αυτόκαυστο των αποβλήτων πλύσης ή άλλων υγρών που περιέχουν βιολογικά δείγµατα, πριν από την απόρριψή τους στο νεροχύτη. Ο χειρισµός και η απόρριψη χηµικών ουσιών θα πρέπει να εκτελείται σύµφωνα µε την ορθή εργαστηριακή πρακτική. Για συστάσεις αναφορικά µε τους κινδύνους και τις προφυλάξεις που σχετίζονται µε κάποια χηµικά συστατικά αυτού του κιτ εξέτασης, ανατρέξτε στα εικονογραφήµατα που αναφέρονται στις ετικέτες και στις πληροφορίες που παρέχονται στο τέλος των οδηγιών χρήσης. Το Δελτίο Δεδοµένων Ασφαλείας διατίθεται στη διεύθυνση ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ Η αξιοπιστία των αποτελεσµάτων εξαρτάται από τη σωστή τήρηση της ακόλουθης ορθής εργαστηριακής πρακτικής: Η ονοµασία της εξέτασης καθώς και ο ειδικός αριθµός αναγνώρισης της εξέτασης αναγράφονται στο πλαίσιο κάθε πλάκας µικροτιτλοδότησης. Αυτός ο ειδικός αριθµός αναγνώρισης αναγράφεται, επίσης, και σε κάθε ταινία. Genscreen HIV-1 Ag Assay: Ειδικός αριθµός αναγνώρισης = 49 Επαληθεύετε τον ειδικό αριθµό αναγνώρισης πριν από τη χρήση. Αν δεν υπάρχει αριθµός αναγνώρισης ή ο αριθµός αναγνώρισης είναι διαφορετικός από αυτόν που αναφέρεται παραπάνω, δεν πρέπει να χρησιµοποιήσετε την ταινία. Μη χρησιµοποιείτε αντιδραστήρια που έχουν λήξει. Μην αλλάζετε τη διαδικασία της ανάλυσης. Εκτελέστε προσεκτικά ανασύσταση των αντιδραστηρίων αποφεύγοντας τυχόν µόλυνση. Μην αναµιγνύετε αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες σε µία συγκεκριµένη εξέταση. Παρατήρηση: Για το διάλυµα πλύσης (R2, στοιχεία ετικέτας: 20X, πράσινο χρώµα), το ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος υπεροξειδάσης (R8, στοιχεία ετικέτας: ρυθµιστικό διάλυµα TMB, µπλε χρώµα), το χρωµογόνο (R9, στοιχεία ετικέτας: TMB 11X, µοβ χρώµα) και το διάλυµα αναστολής (R10, στοιχεία ετικέτας: 1N, κόκκινο χρώµα) µπορείτε να χρησιµοποιήσετε άλλες παρτίδες από αυτές που 6 [GR]

7 περιλαµβάνονται στο κιτ, µε την προϋπόθεση ότι σε µία συγκεκριµένη εξέταση θα χρησιµοποιηθεί η ίδια παρτίδα. Τα αντιδραστήρια αυτά µπορούν να χρησιµοποιηθούν και µε ορισµένα άλλα προϊόντα της εταιρίας µας. Επιπλέον, το διάλυµα πλύσης (R2, στοιχεία ετικέτας: 20X, πράσινο χρώµα) µπορεί να αναµιχθεί µε τα υπόλοιπα 2 διαλύµατα πλύσης που συµπεριλαµβάνονται σε διάφορα κιτ αντιδραστηρίων της Bio-Rad (R2, στοιχεία ετικέτας: 10X, µπλε χρώµα ή 10X, πορτοκαλί χρώµα), µετά από κατάλληλη ανασύσταση και µε την προϋπόθεση ότι θα χρησιµοποιηθεί µόνο ένα µίγµα σε µια συγκεκριµένη εξέταση. Για περισσότερες πληροφορίες επικοινωνήστε µε την τεχνική υπηρεσία. Πριν από τη χρήση πρέπει να περιµένετε 30 λεπτά, ώστε τα αντιδραστήρια να σταθεροποιηθούν σε θερµοκρασία δωµατίου (18-30 C). Μην εκτελείτε την εξέταση παρουσία δραστικών αερίων (οξέων, αλκαλίων, αλδεϋδών) ή σκόνης που θα µπορούσαν να επηρεάσουν την ενζυµική δραστηριότητα του συζεύκτη. Χρησιµοποιείτε υλικά από γυαλί, που έχουν πλυθεί και ξεπλυθεί σχολαστικά µε αποσταγµένο νερό, ή κατά προτίµηση, υλικά µίας χρήσης. Μην αφήνετε τη µικροπλάκα να στεγνώσει στο διάστηµα από το τέλος της πλύσης και µέχρι την κατανοµή των αντιδραστηρίων. Για κάθε δείγµα χρησιµοποιείτε νέο ακροφύσιο κατανοµής. Ελέγχετε τη ορθότητα και την ακρίβεια των πιπετών και βεβαιωθείτε ότι λειτουργούν σωστά τα όργανα που χρησιµοποιούνται. Πλύση: Ακολουθήστε µε προσοχή τις διαδικασίες πλύσης που περιγράφονται, για µέγιστη απόδοση της εξέτασης. Μη χρησιµοποιείτε ποτέ το ίδιο δοχείο για την κατανοµή του συζεύκτη και του διαλύµατος ανάπτυξης χρώµατος. Η ενζυµική αντίδραση είναι πολύ ευαίσθητη στα µεταλλικά ιόντα. Εποµένως, κανένα µεταλλικό στοιχείο δεν πρέπει να έρχεται σε επαφή µε τα διαλύµατα συζεύκτη ή υποστρώµατος. Το διάλυµα ανάπτυξης (ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος + χρωµογόνο) πρέπει να έχει ροζ χρώµα. Η µεταβολή του ροζ χρώµατος εντός µερικών λεπτών µετά την ανασύσταση υποδεικνύει ότι το αντιδραστήριο δεν µπορεί να χρησιµοποιηθεί και πρέπει να αντικατασταθεί. Η προετοιµασία του διαλύµατος ανάπτυξης µπορεί να πραγµατοποιηθεί σε καθαρό πλαστικό δίσκο µίας χρήσης ή σε γυάλινο δοχείο που έχει προηγουµένως πλυθεί µε HCl 1N, ξεπλυθεί σχολαστικά µε αποσταγµένο νερό και στεγνώσει. Το αντιδραστήριο αυτό πρέπει να αποθηκεύεται σε σκοτεινό µέρος. 7 - ΣΥΛΛΟΓΗ ΚΑΙ ΧΕΙΡΙΣΜΟΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Συλλέξτε ένα δείγµα αίµατος σύµφωνα µε την τρέχουσα πρακτική. Μπορείτε να χρησιµοποιήσετε δείγµατα ορού, πλάσµατος ή κυτταροκαλλιέργειας. Έχουν ελεγχθεί και είναι αποδεκτά τα παρακάτω αντιπηκτικά: EDTA, ηπαρίνη, κιτρικό νάτριο, CPDA-1 και ACD. Όταν συλλέγονται δείγµατα σε σωληνάρια µε αντιπηκτικό, τα σωληνάρια πρέπει να είναι εντελώς γεµάτα, όπως υποδεικνύεται στις ετικέτες, ώστε να διασφαλιστεί σωστή αραίωση. Αφαιρέστε τον ορό ή το πλάσµα από το θρόµβο ή τα ερυθρά αιµοσφαίρια το συντοµότερο δυνατόν, ώστε να αποφευχθεί η αιµόλυση. Τυχόν εκτεταµένη αιµόλυση µπορεί να επηρεάσει την απόδοση της εξέτασης. Πριν από την εξέταση, τα δείγµατα στα οποία είναι ορατά σωµατίδια πρέπει να υποβάλλονται σε φυγοκέντρηση, για επαναφορά της διαύγειας. Τα εναιωρήµατα συσσωµατωµάτων ινώδους ή σωµατιδίων ενδέχεται να προκαλέσουν ψευδώς θετικά αποτελέσµατα. Για τα δείγµατα κυτταροκαλλιέργειας στα οποία απαιτείται αραίωση πριν από την εξέταση, η αραίωση µπορεί να πραγµατοποιηθεί µε µέσο καλλιέργειας αντίστοιχο µε εκείνο που χρησιµοποιείται για την κυτταροκαλλιέργεια. 7 [GR]

8 ΜΗ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΕΙΤΕ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΠΟΥ ΑΔΡΑΝΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΜΕ ΘΕΡΜΟΤΗΤΑ. Τα δείγµατα πρέπει να αποθηκεύονται στους +2-8 C, εφόσον ο διαγνωστικός έλεγχος θα πραγµατοποιηθεί εντός 7 ηµερών, ή να καταψύχονται στους -20 C. Το πλάσµα πρέπει να αποψύχεται γρήγορα µε θέρµανση για µερικά λεπτά σε υδατόλουτρο στους 40 C (ώστε να αποφευχθεί η κατακρήµνιση του ινώδους). Δεδοµένης της αστάθειας του HIV Ag, δεν πρέπει να χρησιµοποιούνται θερµοκρασίες άνω των 40 C. Τα δείγµατα που έχουν ψυχθεί και αποψυχθεί περισσότερες από 3 φορές δεν πρέπει να χρησιµοποιούνται. Εάν τα δείγµατα πρόκειται να µεταφερθούν, πρέπει να συσκευαστούν σύµφωνα µε τους ισχύοντες κανονισµούς σχετικά µε τη µεταφορά αιτιολογικών παραγόντων. ΜΗ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΕΙΤΕ ΜΟΛΥΣΜΕΝΟΥΣ, ΥΠΕΡΛΙΠΑΙΜΙΚΟΥΣ Ή ΥΠΕΡΒΟΛΙΚΑ ΑΙΜΟΛΥΜΕΝΟΥΣ ΟΡΟΥΣ Ή ΠΛΑΣΜΑ. Παρατήρηση: Τα δείγµατα που περιέχουν έως και 80 mg/l χολερυθρίνης, 36 mg/l ανοσοσφαιρίνης M ή G, τα λιπαιµικά δείγµατα που περιέχουν έως και 5 g/l λιπιδίων και τα αιµολυµένα δείγµατα που περιέχουν έως και 2,5 g/l αιµοσφαιρίνης δεν επηρεάζουν τα αποτελέσµατα. 8 - ΑΝΑΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Πριν από τη χρήση, αφήστε τα αντιδραστήρια να αποκτήσουν θερµοκρασία δωµατίου (18-30 C), εκτός από τους συµπυκνωµένους συζεύκτες 1 και 2 (R4 και R5). Αντιδραστήρια έτοιµα για χρήση: Αντιδραστήριο R1: Μικροπλάκα Κάθε πλαίσιο που περιέχει 12 ταινίες είναι συσκευασµένο σε σφραγισµένη σακούλα αλουµινίου. Κόψτε τη σακούλα µε ψαλίδι ή νυστέρι 0,5-1 cm πάνω από τη σφράγιση. Ανοίξτε τη σακούλα και αφαιρέστε το πλαίσιο. Τοποθετήστε ξανά στη σακούλα τις µη χρησιµοποιηµένες ταινίες. Κλείστε προσεκτικά τη σακούλα και αποθηκεύστε την ξανά στους +2-8 C. Αντιδραστήριο R3: Αραιωτικό δείγµατος Αντιδραστήριο C0: Αρνητικός ορός ελέγχου Αντιδραστήριο C1: Θετικός ορός ελέγχου Αντιδραστήριο R10: Διάλυµα αναστολής Αντιδραστήρια προς ανασύσταση: Συµπυκνωµένο διάλυµα πλύσης (20X): R2 Αραιώστε σε αναλογία 1:20 σε αποσταγµένο νερό, για να παρασκευάσετε το έτοιµο για χρήση διάλυµα πλύσης. Προετοιµάστε 800 ml για µία πλάκα των 12 ταινιών. Διάλυµα συζεύκτη εργασίας 1 (R4 + R6) και διάλυµα συζεύκτη εργασίας 2 (R5 + R6): Οι συζεύκτες 1 (R4) και 2 (R5) διατίθενται ως συµπυκνώµατα 100X. Προετοιµάστε ξεχωριστά το διάλυµα συζεύκτη εργασίας 1 και το διάλυµα συζεύκτη εργασίας 2 αραιώνοντας κάθε συζεύκτη σε αναλογία 1:101 σε αραιωτικό συζεύκτη (R6). Η προετοιµασία πρέπει να πραγµατοποιείται σε καθαρά πλαστικά δοχεία. Σηµειώστε στο δοχείο τον αριθµό παρτίδας του συµπυκνώµατος συζεύκτη, την ηµεροµηνία και ώρα προετοιµασίας καθώς και την ηµεροµηνία και ώρα λήξης (24 ώρες µετά την προετοιµασία). Αναµίξτε ελαφρώς τα αντιδραστήρια εργασίας πριν από τη χρήση. Μετά την ανάµιξη, το διάλυµα συζεύκτη εργασίας 1 είναι κίτρινο και το διάλυµα συζεύκτη εργασίας 2 είναι πράσινο. 8 [GR]

9 Προετοιµασία διαλυµάτων συζεύκτη εργασίας 1 και 2 ανά ταινία Αριθµός ταινιών που θα χρησιµοποιηθούν * 24** Ποσότητα συµπυκνώµατος συζεύκτη (µl) Ποσότητα αραιωτικού συζεύκτη (µl) * Μία πλήρης πλάκα. **Δύο πλήρεις πλάκες Διάλυµα ανάπτυξης ενζύµων (R8 + R9) Αραιώστε σε αναλογία 1:11 το χρωµογόνο (R9) στο ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος (R8). (π.χ.: 1 ml αντιδραστηρίου R9 +10 ml αντιδραστηρίου R8). Για 1 έως 12 ταινίες απαιτούνται και επαρκούν 10 ml. Οµογενοποιήστε. 9 - ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗΣ - ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΖΩΗΣ Το κιτ πρέπει να αποθηκεύεται στους +2-8 C. Μετά το άνοιγµα, κάθε αντιδραστήριο στο κιτ Genscreen HIV-1 Ag Assay µπορεί να χρησιµοποιηθεί µέχρι την ηµεροµηνία λήξης που αναγράφεται στη συσκευασία, εκτός από τις περιπτώσεις στις οποίες ισχύουν ειδικές οδηγίες: R1: Μετά το άνοιγµα της σφραγισµένης υπό κενό σακούλας, οι ταινίες µικροβυθισµάτων που αποθηκεύονται στους +2-8 C µπορούν να χρησιµοποιηθούν για 1 µήνα, εφόσον έχετε σφραγίσει ξανά προσεκτικά τη σακούλα. R2: Το αραιωµένο διάλυµα πλύσης µπορεί να αποθηκευτεί στους C για 2 εβδοµάδες. Το συµπυκνωµένο διάλυµα πλύσης (R2) µπορεί να αποθηκευτεί στους C. R8 - R9: Μετά την ανασύσταση, το αντιδραστήριο που είναι αποθηκευµένο σε σκοτεινό χώρο µπορεί να χρησιµοποιηθεί για 6 ώρες, σε θερµοκρασία δωµατίου (18-30 C). R4 - R5: Μετά την ανασύσταση, τα διαλύµατα συζεύκτη εργασίας µπορούν να χρησιµοποιηθούν για 24 ώρες, σε θερµοκρασία δωµατίου (18-30 C) ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ Στη συνέχεια περιγράφονται δύο διαδικασίες για την ανίχνευση αντιγόνου p24 του HIV-1 σε δείγµατα ορού, πλάσµατος ή κυτταροκαλλιέργειας ανθρώπινης προέλευσης: Διαδικασία Επώαση στους 37 C Επώαση στους 40 C Επώαση δείγµατος Στατική επώαση 37 ± 1 C, ξηρή θερµότητα 60 ± 5 λεπτά Στατική επώαση 40 ± 1 C, ξηρή θερµότητα 60 ± 5 λεπτά Επώαση συζεύκτη 1 Στατική επώαση 37 ± 1 C, ξηρή θερµότητα 30 ± 5 λεπτά Στατική επώαση 40 ± 1 C, ξηρή θερµότητα 30 ± 5 λεπτά Επώαση συζεύκτη 2 Στατική επώαση 37 ± 1 C, ξηρή θερµότητα 30 ± 5 λεπτά Στατική επώαση 40 ± 1 C, ξηρή θερµότητα 30 ± 5 λεπτά Ανάπτυξη χρώµατος Στατική επώαση 18 έως 30 C, σε σκοτεινό χώρο 30 ± 5 λεπτά Στατική επώαση 18 έως 30 C, σε σκοτεινό χώρο 30 ± 5 λεπτά Για τα δείγµατα που υποβλήθηκαν αρχικά σε εξέταση στους 37 C ή 40 C, τυχόν επαναληπτικές εξετάσεις ή επαληθεύσεις πρέπει να πραγµατοποιούνται χρησιµοποιώντας την ίδια διαδικασία. 9 [GR]

10 Ο αναµενόµενος χρόνος ολοκλήρωσης αυτής της διαδικασίας είναι περίπου 2:30 ώρες από την έναρξη του πρώτου βήµατος επώασης. Μετά την έναρξη, κάθε κύκλος της συγκεκριµένης ανάλυσης πρέπει να ολοκληρώνεται χωρίς διακοπές. Σε κάθε πλάκα πρέπει να υποβάλλονται σε ανάλυση δύο θετικοί οροί ελέγχου και τρεις αρνητικοί οροί ελέγχου. Κατά την εξέταση δειγµάτων κυτταροκαλλιέργειας απαιτείται η χρήση τριών ορών ελέγχου µέσου κυτταροκαλλιέργειας αντί του αρνητικού ορού ελέγχου του κιτ (C0). Η τιµή αναφοράς για τα δείγµατα ασθενή καθορίζεται από τους ορούς ελέγχου σε κάθε πλάκα ξεχωριστά. Μην εκθέτετε τις πλάκες σε φως κατά τη διάρκεια του τελικού βήµατος επώασης (µετά την προσθήκη του διαλύµατος εργασίας TMB). Ακολουθήστε πιστά τη συνιστώµενη διαδικασία και εφαρµόστε την παρακάτω ορθή εργαστηριακή πρακτική: 1. Καταρτίστε προσεκτικά το διάγραµµα κατανοµής και ταυτοποίησης δειγµάτων, 2. Προετοιµάστε το αραιωµένο διάλυµα πλύσης, 3. Αφαιρέστε το δίσκο µεταφοράς και τις ταινίες (R1) από το προστατευτικό σακουλάκι, 4. Χωρίς να προηγηθεί πλύση της πλάκας, προσθέστε απευθείας και διαδοχικά τα εξής: 50 µl αραιωτικού σε κάθε βύθισµα 150 µl αρνητικού ορού ελέγχου (C0) στα βυθίσµατα A1- B1 - C1 150 µl θετικού ορού ελέγχου (C1) στα βυθίσµατα D1- E1 150 µl δείγµατος στα βυθίσµατα G1, κ.λπ. Ανάλογα µε το σύστηµα που χρησιµοποιείται, είναι δυνατή η τροποποίηση της θέσης των ορών ελέγχου ή της σειράς κατανοµής. Κατά την εξέταση δειγµάτων κυτταροκαλλιέργειας απαιτείται η χρήση τριών ορών ελέγχου µέσου κυτταροκαλλιέργειας αντί του αρνητικού ορού ελέγχου του κιτ. Βεβαιωθείτε ότι το αραιωτικό δείγµατος έχει αναµιχθεί καλά µε το δείγµα (ή τον ορό ελέγχου). Σηµείωση: Η κατανοµή του δείγµατος µπορεί να ελεγχθεί οπτικά σε αυτό το βήµα της διαδικασίας: µετά την προσθήκη του δείγµατος, το χρώµα του αραιωτικού αλλάζει από πράσινο σε µπλε, επιβεβαιώνοντας την προσθήκη δείγµατος ή ορού ελέγχου στο βύθισµα. Εάν πραγµατοποιηθεί σωστά η ανάµιξη, το περιεχόµενο κάθε βυθίσµατος έχει οµοιόµορφο χρώµα. Στα δείγµατα κυτταροκαλλιέργειας ενδέχεται να µην παρουσιάζεται µεταβολή χρώµατος, ανάλογα µε το µέσο κυτταροκαλλιέργειας που χρησιµοποιείται. (Για την αυτόµατη επαλήθευση, ανατρέξτε στην ενότητα 12 - ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΜΕ ΠΙΠΕΤΑ). 5. Εάν είναι δυνατό, καλύψτε τη µικροπλάκα µε αυτοκόλλητη µεµβράνη. Πιέστε σταθερά σε ολόκληρη την επιφάνεια της πλάκας για να διασφαλιστεί η σωστή εφαρµογή. 6. Υποβάλλετε την πλάκα σε επώαση για 60 ± 5 λεπτά στους 37 ± 1 C ή 40 ± 1 C χρησιµοποιώντας επωαστήρα στατικής επώασης µε ξηρή θερµότητα. 7. Αφαιρέστε την αυτοκόλλητη µεµβράνη. Αναρροφήστε το περιεχόµενο όλων των βυθισµάτων σε ένα δοχείο για βιολογικά επικίνδυνα απόβλητα (που περιέχει υποχλωριώδες νάτριο). Προσθέστε σε κάθε βύθισµα τουλάχιστον 0,370 ml διαλύµατος πλύσης. Ο χρόνος διαπότισης πρέπει να είναι 20 έως 60 δευτερόλεπτα. Αναρροφήστε ξανά. Επαναλάβετε τη διαδικασία 4 φορές (δηλ. τουλάχιστον 5 πλύσεις συνολικά). Ο όγκος που υπολείπεται πρέπει να είναι µικρότερος από 10 µl (αν είναι απαραίτητο, στεγνώστε την πλάκα αναποδογυρίζοντάς την πάνω σε απορροφητικό χαρτί). Σε περίπτωση που χρησιµοποιείτε αυτόµατη συσκευή πλύσης, ακολουθήστε την ίδια διαδικασία (ανατρέξτε στην ενότητα 10: συστάσεις) 10 [GR]

11 8. Διοχετεύστε αµέσως 100 µl διαλύµατος συζεύκτη εργασίας 1 σε όλα τα βυθίσµατα. Ο συζεύκτης πρέπει να αναδεύεται ελαφρώς πριν από τη χρήση. Σηµείωση: Η κατανοµή του διαλύµατος συζεύκτη εργασίας 1, το οποίο έχει κίτρινο χρώµα, µπορεί να ελεγχθεί οπτικά σε αυτό το βήµα της διαδικασίας. 9. Εάν είναι δυνατό, καλύψτε τη µικροπλάκα µε αυτοκόλλητη µεµβράνη. Υποβάλλετε την πλάκα σε επώαση για 30 ± 5 λεπτά στους 37 ± 1 C ή 40 ± 1 C χρησιµοποιώντας επωαστήρα στατικής επώασης µε ξηρή θερµότητα. 10. Αφαιρέστε την αυτοκόλλητη µεµβράνη. Αναρροφήστε το περιεχόµενο όλων των βυθισµάτων σε ένα δοχείο για βιολογικά επικίνδυνα απόβλητα (που περιέχει υποχλωριώδες νάτριο). Προσθέστε σε κάθε βύθισµα τουλάχιστον 0,370 ml διαλύµατος πλύσης. Ο χρόνος διαπότισης πρέπει να είναι 20 έως 60 δευτερόλεπτα. Αναρροφήστε ξανά. Επαναλάβετε τη διαδικασία τουλάχιστον 4 φορές (δηλ. τουλάχιστον 5 πλύσεις συνολικά). Ο όγκος που υπολείπεται πρέπει να είναι µικρότερος από 10 µl (αν είναι απαραίτητο, στεγνώστε την πλάκα αναποδογυρίζοντάς την πάνω σε απορροφητικό χαρτί). 11. Διοχετεύστε αµέσως 100 µl διαλύµατος συζεύκτη εργασίας 2 σε όλα τα βυθίσµατα. Ο συζεύκτης πρέπει να αναδεύεται ελαφρώς πριν από τη χρήση. Σηµείωση: Η κατανοµή του διαλύµατος συζεύκτη εργασίας 2, το οποίο έχει πράσινο χρώµα, µπορεί να ελεγχθεί οπτικά σε αυτό το βήµα της διαδικασίας. 12. Εάν είναι δυνατό, καλύψτε τη µικροπλάκα µε αυτοκόλλητη µεµβράνη. Υποβάλλετε την πλάκα σε επώαση για 30 ± 5 λεπτά στους 37 ± 1 C ή 40 ± 1 C χρησιµοποιώντας επωαστήρα στατικής επώασης µε ξηρή θερµότητα. 13. Αφαιρέστε την αυτοκόλλητη µεµβράνη, αδειάστε όλα τα βυθίσµατα µε αναρρόφηση και εκτελέστε τη διαδικασία πλύσης τουλάχιστον 5 φορές, όπως περιγράφεται παραπάνω. Ο όγκος που υπολείπεται πρέπει να είναι µικρότερος από 10 µl (αν είναι απαραίτητο, στεγνώστε τις ταινίες αναποδογυρίζοντάς τες πάνω σε απορροφητικό χαρτί). 14. Διοχετεύστε αµέσως σε κάθε βύθισµα 100 µl προετοιµασµένου διαλύµατος ανάπτυξης (R8+R9), το οποίο προετοιµάσατε ακριβώς πριν από τη χρήση. H αντίδραση θα πρέπει να πραγµατοποιηθεί σε σκοτεινό µέρος για 30 ± 5 λεπτά, σε θερµοκρασία δωµατίου (18-30 C). Μη χρησιµοποιείτε αυτοκόλλητη µεµβράνη κατά τη διάρκεια της συγκεκριµένης επώασης. Σηµείωση: Η κατανοµή του διαλύµατος ανάπτυξης, το οποίο έχει ροζ χρώµα, µπορεί να ελεγχθεί οπτικά σε αυτό το βήµα της διαδικασίας: Υπάρχει σαφής διαφορά στο χρώµα των κενών βυθισµάτων και των βυθισµάτων που περιέχουν το ροζ διάλυµα υποστρώµατος. (για την αυτόµατη επαλήθευση, ανατρέξτε στην ενότητα 12: ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΜΕ ΠΙΠΕΤΑ). 15. Προσθέστε 100µl διαλύµατος αναστολής (R10) χρησιµοποιώντας την ίδια ακολουθία και συχνότητα κατανοµής που χρησιµοποιήσατε για το διάλυµα υποστρώµατος. Οµογενοποιήστε το µίγµα αντίδρασης. Σηµείωση: Η κατανοµή του διαλύµατος αναστολής, το οποίο είναι άχρωµο, µπορεί να ελεγχθεί οπτικά σε αυτό το βήµα της διαδικασίας. Μετά την προσθήκη του διαλύµατος αναστολής, το ροζ χρώµα του υποστρώµατος εξαφανίζεται (στα αρνητικά δείγµατα) ή το χρώµα µεταβάλλεται από µπλε σε κίτρινο (στα θετικά δείγµατα). 16. Σκουπίστε προσεκτικά το κάτω µέρος της πλάκας. Τουλάχιστον 4 λεπτά µετά την προσθήκη του διαλύµατος αναστολής και εντός 30 λεπτών από τη διακοπή της αντίδρασης, ελέγξτε την οπτική πυκνότητα στα 450/ nm χρησιµοποιώντας µια συσκευή ανάγνωσης πλάκας. 11 [GR]

12 17. Ελέγξτε την αντιστοιχία µεταξύ της ένδειξης και του διαγράµµατος κατανοµής και ταυτοποίησης πλάκας και δειγµάτων ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 1 - Επαλήθευση αποτελεσµάτων Μια ανάλυση θεωρείται έγκυρη εφόσον πληρούνται τα παρακάτω κριτήρια: Η τιµή απορρόφησης για κάθε αρνητικό ορό ελέγχου (NC) (ή ορό ελέγχου κυτταροκαλλιέργειας, ανάλογα µε την περίπτωση) είναι µεγαλύτερη από 0,000 AU και µικρότερη ή ίση µε 0,100 AU. Μπορείτε να απορρίψετε µία τιµή αρνητικού ορού ελέγχου και να υπολογίσετε τη µέση τιµή των αρνητικών ορών ελέγχου από τις υπόλοιπες δύο τιµές. Η µέση τιµή NC µπορεί να υπολογιστεί από τις υπόλοιπες δύο τιµές απορρόφησης. Εάν είναι εκτός ορίων δύο ή περισσότεροι αρνητικοί οροί ελέγχου, η πλάκα είναι µη έγκυρη και απαιτείται επανάληψη της διαδικασίας. Η µέση τιµή απορρόφησης των θετικών ορών ελέγχου (PCX) πρέπει να είναι µεγαλύτερη ή ίση µε 0,500 AU, ενώ οι µεµονωµένες τιµές απορρόφησης πρέπει να βρίσκονται εντός του εύρους αναπαραγωγιµότητας, 0,65 έως 1,35 φορές η τιµή PCX. Δεν µπορείτε να απορρίψετε τιµές θετικών ορών ελέγχου. 2 - Υπολογισµός µέσων τιµών απορρόφησης Χρησιµοποιήστε τους επαληθευµένους ορούς ελέγχου για να προσδιορίσετε τις µέσες τιµές απορρόφησης των αρνητικών και θετικών ορών ελέγχου διαιρώντας το άθροισµα των τιµών απορρόφησης µε τον αριθµό των αποδεκτών ορών ελέγχου. 3 - Τιµή αναφοράς Προσδιορίστε την τιµή αναφοράς προσθέτοντας 0,070 στη µέση τιµή NC (NCX), όπως φαίνεται στο παρακάτω παράδειγµα: Τιµή αναφοράς = 0,070 + NCX Παράδειγµα: NCX = 0,033 - τιµή αναφοράς = 0, ,033 = 0, Ερµηνεία αποτελεσµάτων Η παρουσία ή απουσία αντιγόνου του HIV-1 προσδιορίζεται µέσω συσχέτισης της τιµής απορρόφησης του δείγµατος µε την τιµή αναφοράς. Τα δείγµατα µε τιµή απορρόφησης <0,000 πρέπει να υποβάλλονται ξανά σε ανάλυση. Τα δείγµατα εκείνα των οποίων οι τιµές είναι µεγαλύτερες από τα υψηλότερα όρια γραµµικότητας της συσκευής ανάγνωσης, θα πρέπει να αναφέρονται ως αντιδρώντα. Τα δείγµατα µε τιµές απορρόφησης µικρότερες από την τιµή αναφοράς θεωρούνται µη αντιδρώντα µε την εξέταση Genscreen HIV-1 Antigen Assay και µπορούν να θεωρηθούν αρνητικά για αντιγόνο HIV-1. Δεν απαιτείται περαιτέρω εξέταση. Τα δείγµατα µε τιµές απορρόφησης µεγαλύτερες ή ίσες µε την τιµή αναφοράς θεωρούνται αρχικά αντιδρώντα µε την εξέταση Genscreen HIV-1 Antigen Assay. Τα δείγµατα που αρχικά θεωρούνται αντιδρώντα πρέπει να υποβάλλονται εκ νέου σε εξέταση εις διπλούν, για επαλήθευση των αρχικών αποτελεσµάτων της εξέτασης. Εάν µετά την επαναληπτική εξέταση οι τιµές απορρόφησης και των δύο δειγµάτων είναι µικρότερες από την τιµή αναφοράς, µπορεί να θεωρηθεί ότι το αρχικό δείγµα είναι αρνητικό για αντιγόνο του HIV-1 και δεν είναι κατ επανάληψη αντιδρών. Στις αιτίες ύπαρξης δειγµάτων που δεν αντιδρούν κατ επανάληψη συµπεριλαµβάνονται οι εξής: ανεπαρκής πλύση των µικροπλακών διασταυρούµενη µόλυνση µη αντιδρώντων δειγµάτων για HIV-1 Ag από κάποιο δείγµα υψηλού τίτλου µόλυνση του ρυθµιστικού διαλύµατος υποστρώµατος µε οξειδωτικούς παράγοντες (λευκαντικό, µεταλλικά ιόντα κ.λπ ) µόλυνση του διαλύµατος αναστολής 12 [GR]

13 Εάν µετά την επαναληπτική εξέταση η τιµή απορρόφησης οποιουδήποτε εκ των δύο δειγµάτων είναι µεγαλύτερη ή ίση µε την τιµή αναφοράς, το αρχικό αποτέλεσµα είναι αναπαραγώγιµο και το δείγµα πρέπει να θεωρηθεί αντιδρών µε την εξέταση Genscreen HIV-1 Antigen Assay, σε συµµόρφωση µε τα όρια που περιγράφονται παρακάτω. Τα δείγµατα που είναι κατ επανάληψη αντιδρώντα µε την εξέταση Genscreen HIV-1 Antigen Assay πρέπει να επαληθεύονται µε την εξέταση Genscreen HIV-1 Antigen Confirmatory Assay (Αρ. προϊόντος 71121). Το δείγµα µπορεί να θεωρηθεί θετικό για αντιγόνο του HIV-1 µόνο εφόσον είναι δυνατή η εξουδετέρωση του αντιγόνου HIV-1 κατά τη διαδικασία επιβεβαίωσης ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΜΕ ΠΙΠΕΤΑ Φασµατοφωτοµετρική επαλήθευση µεταφοράς δειγµάτων µε πιπέτα Μετά τη διοχέτευση του αραιωτικού δείγµατος (R3) και των δειγµάτων, η παρουσία προς εξέταση δείγµατος στα βυθίσµατα µπορεί να επαληθευθεί µε φασµατοφωτοµετρική µέτρηση στα 620 nm: η οπτική πυκνότητα ενός βυθίσµατος που περιέχει δείγµα είναι µεγαλύτερη από 0,250 (εάν η οπτική πυκνότητα είναι µικρότερη, υποδηλώνεται ανεπαρκής κατανοµή του δείγµατος). ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ: Το χρώµα των δειγµάτων κυτταροκαλλιέργειας ενδέχεται να µην αλλάξει, ανάλογα µε το µέσο κυτταροκαλλιέργειας. Σε αυτήν την περίπτωση, µη χρησιµοποιείτε αυτόµατη επαλήθευση. Φασµατοφωτοµετρική επαλήθευση µεταφοράς διαλύµατος ανάπτυξης µε πιπέτα Μπορείτε να επαληθεύσετε την παρουσία του ροζ διαλύµατος ανάπτυξης στα βυθίσµατα µε αυτόµατη µέτρηση στα 490 nm: ένα βύθισµα µε διάλυµα ανάπτυξης πρέπει να έχει οπτική πυκνότητα µεγαλύτερη από 0,100 (τυχόν µικρότερη οπτική πυκνότητα υποδηλώνει ανεπαρκή κατανοµή του διαλύµατος ανάπτυξης) ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ Ευαισθησία 138 ασθενείς, µολυσµένοι µε HIV σε διαφορετικά στάδια (AIDS, ARC, άλλα), υποβλήθηκαν σε εξέταση και βρέθηκαν θετικοί µε την εξέταση Genscreen HIV-1 Antigen Assay. Υποβλήθηκαν σε µελέτη 20 επαρκώς τεκµηριωµένοι πίνακες οροµετατροπής. Τα αποτελέσµατα που προέκυψαν είναι παρόµοια µε εκείνα που παρατηρούνται µε άλλες αναλύσεις HIV Ag. Τουλάχιστον 64 δείγµατα πρώιµης οροµετατροπής εξετάστηκαν µε Genscreen HIV-1 Antigen Assay. 55 δείγµατα υπερκείµενου υγρού από κυτταροκαλλιέργειες HIV 1 (53 οµάδας M και 2 οµάδας O) και ο πίνακας αραίωσης «Ag VIH SFTS 96» βρέθηκαν θετικά µε την εξέταση Genscreen HIV-1 Antigen Assay, εκτός από 2 αραιώσεις υπερκείµενου υγρού κυτταροκαλλιέργειας οµάδας O. - Τα 53 δείγµατα υπερκείµενου υγρού κυτταροκαλλιέργειας HIV-1 οµάδας M περιλαµβάνουν τους παρακάτω γονότυπους: 10 γονότυπους A, 10 B, 9 C, 5 D, 11 E, 2 F, 2 G, 1 H, 2 J και 1 N. - Ο πίνακας αραίωσης «Ag VIH SFTS 96» περιλαµβάνει τους παρακάτω γονότυπους: γονότυπους A, B, C, D, E, F, G, H από την οµάδα Μ και 1 από την οµάδα O. 13 [GR]

14 Αναλυτική ευαισθησία Το όριο ανίχνευσης έχει υπολογιστεί λιγότερο από 2 IU / ml µε τη δοκιµή του 1ου Διεθνή κωδικού Αναφοράς NIBSC 90/636 του ΠΟΥ και βρέθηκε στα 0,36 IU / ml CI 95% [0,08-0,65 IU / ml] µε 3 διαφορετικές παρτίδες κατά τη διάρκεια της εσωτερικής αξιολόγησης. Το όριο ευαισθησίας της εξέτασης προσδιορίστηκε µέσω ενός εύρους διαλυµάτων που προετοιµάστηκαν βάσει του γαλλικού εθνικού προτύπου (κεκαθαρµένο ιικό προϊόν λύσης γονότυπου B, αραιωµένο σε αρνητικό πλάσµα µε κιτρικό) και του πίνακα BBI (PRA 801). Το όριο ευαισθησίας υπολογίστηκε στα 8 pg/ml Ag HIV, ανεξάρτητα από το πρωτόκολλο. Η καµπύλη βαθµονόµησης που προέκυψε από δείγµα που υποβλήθηκε σε βαθµονόµηση µε το πρότυπο HIV-1 Ag Standard (κωδικός 72217) είναι γραµµική από 0 έως 5 IU / ml (ή 0 έως 100 pg / ml). Διαγνωστική ειδικότητα Η διαγνωστική ειδικότητα η οποία υπολογίστηκε βάσει: 4038 αιµοδοτών ανήλθε στο 99,95%. 209 κλινικών ασθενών ανήλθε στο 100%. Υποβλήθηκε σε εξέταση ένας πίνακας 105 δειγµάτων ασθενών. Αποτελείται από τα εξής δείγµατα: δείγµατα που περιέχουν αντισώµατα για HAV, HCV, HTLV, HSV, EBV, ερυθρά, Toxoplasma Gondii, Treponema Pallidum, CMV. δείγµατα που περιέχουν αυτοαντισώµατα, IgG, ρευµατοειδή παράγοντα IgM δείγµατα από εγκύους, πληθυσµό µε κίρρωση, άτοµα που έχουν υποβληθεί σε πολλαπλές µεταγγίσεις και ασθενείς µε συστηµατικό ερυθηµατώδη λύκο. Μόνο ένα δείγµα από ασθενή µε συστηµατικό ερυθηµατώδη λύκο βρέθηκε αντιδρών µε την εξέταση Genscreen HIV-1 Ag Assay, αλλά δεν επιβεβαιώθηκε µε την εξέταση επιβεβαίωσης. Ορθότητα Η αναπαραγωγιµότητα εντός της ανάλυσης αξιολογήθηκε µε την εξέταση 3 θετικών δειγµάτων και ενός αρνητικού δείγµατος, 30 φορές στην ίδια ανάλυση. Η αναπαραγωγιµότητα µεταξύ των αναλύσεων αξιολογήθηκε µε την εξέταση 3 θετικών δειγµάτων και ενός αρνητικού δείγµατος, κατά τη διάρκεια 5 ηµερών, από 2 διαφορετικούς τεχνικούς. Ο συντελεστής µεταβλητότητας των θετικών δειγµάτων ήταν µικρότερος από 10% ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Κατά την εξέταση ορού, πλάσµατος ή δειγµάτων κυτταροκαλλιέργειας για την παρουσία αντιγόνου HIV-1, είναι απαραίτητο να τηρηθεί η διαδικασία της εξέτασης Genscreen HIV-1 Antigen Assay καθώς και οι οδηγίες ερµηνείας των αποτελεσµάτων. Συνιστάται η προσεκτική ανάγνωση του ένθετου της συσκευασίας πριν από την εκτέλεση της εξέτασης. Συγκεκριµένα, η διαδικασία εξέτασης πρέπει να τηρείται προσεκτικά για τη µεταφορά δειγµάτων και αντιδραστηρίων µε πιπέτα, για την πλύση πλάκας και για το χρονισµό των βηµάτων επώασης. Ο χαρακτηρισµός ενός δείγµατος ως αντιδρών για το αντιγόνο HIV-1 δεν πρέπει να βασίζεται στο αποτέλεσµα µίας µόνο εξέτασης. Απαιτούνται περαιτέρω εξετάσεις, όπως εξέταση επιβεβαίωσης, για τον προσδιορισµό της ειδικότητας οποιουδήποτε δείγµατος χαρακτηρίζεται ως αντιδρών βάσει της διαδικασίας διαγνωστικού ελέγχου. Όλες οι ανοσοαναλύσεις υψηλής ευαισθησίας ενδέχεται να παρουσιάσουν µη ειδικές αντιδράσεις, οι οποίες µπορεί να οδηγήσουν σε ψευδώς θετικά 14 [GR]

15 αποτελέσµατα. Το ποσοστό των αντιδράσεων που είναι ψευδείς εξαρτάται από την ευαισθησία και την ειδικότητα του κιτ εξέτασης. Αρνητικά αποτελέσµατα ενδέχεται να προκύψουν εάν η ποσότητα του δείκτη που υπάρχει στο δείγµα είναι υπερβολικά µικρή για τα όρια ανίχνευσης της ανάλυσης ή εάν ο δείκτης προς ανίχνευση δεν παρουσιάζεται κατά τη διάρκεια του σταδίου της ασθένειας στο οποίο συλλέχθηκε το δείγµα. Η µεταβλητότητα του ιού HIV καθιστά αδύνατο τον αποκλεισµό της πιθανότητας ψευδώς αρνητικών αποτελεσµάτων. Καµία γνωστή µέθοδος εξέτασης δεν µπορεί να διασφαλίσει πλήρως την απουσία του ιού HIV. Σε περίπτωση που η προσθήκη δειγµάτων ή αντιδραστηρίων δεν πραγµατοποιείται σύµφωνα µε τις οδηγίες που περιγράφονται στη διαδικασία, ενδέχεται να προκύψουν ψευδώς αρνητικές εξετάσεις. Όταν υπάρχει κλινική υποψία µόλυνσης ή σφάλµατος διαδικασίας, θα πρέπει να λαµβάνεται υπόψη το ενδεχόµενο επαναληπτικής εξέτασης. Τιµή απορρόφησης µικρότερη από 0,000 AU υποδηλώνει σφάλµα στη διαδικασία ή το όργανο και απαιτείται επανάληψη της εξέτασης. Στους παράγοντες που µπορούν να επηρεάσουν την εγκυρότητα των αποτελεσµάτων περιλαµβάνονται η αποτυχία προσθήκης δείγµατος στο βύθισµα, η ανεπαρκής πλύση των βυθισµάτων της µικροπλάκας, η αποτυχία τήρησης των καθορισµένων χρόνων επώασης και θερµοκρασιών, η προσθήκη εσφαλµένων αντιδραστηρίων στα βυθίσµατα, η παρουσία µεταλλικών στοιχείων ή η επαφή των βυθισµάτων µε λευκαντικό. Τα χαρακτηριστικά απόδοσης της εξέτασης δεν έχουν αξιολογηθεί σε µεταθανάτια δείγµατα ή σε άλλα βιολογικά υγρά, πλην ορού, πλάσµατος ή δειγµάτων κυτταροκαλλιέργειας. Το χρώµα του αραιωτικού δείγµατος ενδέχεται να µη µεταβληθεί παρουσία δειγµάτων κυτταροκαλλιέργειας, ανάλογα µε το µέσο κυτταροκαλλιέργειας. Ακόµη και η αναλυτική ευαισθησία που υπολογίστηκε στα 8 pg/ml κατά τη διάρκεια της αξιολόγησης της παρούσας εξέτασης ενδέχεται να διαφέρει ανάλογα µε τις συνθήκες λειτουργίας και λόγω διαφοροποιήσεων µεταξύ των παρτίδων. Κατά συνέπεια, η Bio-Rad παρέχει εγγύηση µόνο για αναλυτική ευαισθησία κάτω από τα 15 pg/ml. Η χρωµατοµετρική µέθοδος για την επαλήθευση εναπόθεσης δείγµατος, συζεύκτη και διαλύµατος ανάπτυξης δεν παρέχει τη δυνατότητα επαλήθευσης της ορθότητας του διοχετευµένου όγκου. Με τη µέθοδο αυτή επιβεβαιώνεται µόνο η παρουσία δείγµατος, συζεύκτη και διαλύµατος ανάπτυξης στα βυθίσµατα. Το ποσοστό εσφαλµένων αποτελεσµάτων µε τη συγκεκριµένη µέθοδο σχετίζεται σε µεγάλο βαθµό µε την ορθότητα του συστήµατος που χρησιµοποιείται (αν το άθροισµα των τιµών συντελεστή µεταβλητότητας της διοχέτευσης και της µέτρησης είναι µεγαλύτερο από 10%, µειώνεται σηµαντικά η ποιότητα της επαλήθευσης). Σε περίπτωση εξαιρετικά χαµηλής απόδοσης πλύσης µετά την επώαση του συζεύκτη, ενδέχεται να προκύψουν εσφαλµένα αποτελέσµατα από την αυτόµατη επαλήθευση της µεταφοράς διαλύµατος ανάπτυξης µε πιπέτα (µέσω µέτρησης της οπτικής πυκνότητας στα 490 nm), όταν η τιµή οπτικής πυκνότητας είναι µεγαλύτερη από 0,100 απουσία διαλύµατος ανάπτυξης. Ωστόσο, το φαινόµενο αυτό δεν παρατηρήθηκε κατά την αξιολόγηση 939 δειγµάτων που υποβλήθηκαν σε εξέταση. 15 [GR]

16 15 - REFERENCES 1. Barre-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, et al: Isolation of T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome(aids). Science 220: , Gallo RC, Salahuddin SZ, Popovic M, et al: Frequent detection and isolation of cytopathic retroviruses (HTLV-lll) from patients with AIDS and at risk for AIDS. Science 224: , Coffin J, Haase A, Levy JA, et al: What to call the AIDS virus? Nature 321:10, Van der Graff M, Diepersloot R: Transmission of human immunodeficiency virus (HIV/ HTLV-III/ LAV): a review, Infection 14: , Weis R: Retrovirus and human disease. J Clin Pathol 40: , Tovo P, Gabiano C, Riva C, et al: Specific antibody and virus antigen expression in congenital HIV infection, Lancet 1:1201, Tegtmeier G: Current tests for serologic detection of HlV-1 infection. J Clin lmmunoassay 11: , Schumacher R, Garrett P, Tegtmeier G, et al: Comparative detection of anti-hiv in early HIV seroconversion. J Clin lmmunoassay 11: , Casey JM, Kim Y, Andersen PR, et al: Human T-cell lymphotropic virus type III: immunologic characterization and primary structure analysis of the major internal protein, p24. J Virology 55: , Ritter J, Escaich S, Trepo C, et al: HIV antigen detection in antibody negative sera. Abstract 1627, IV International Conference on AIDS, Veronese FD, Sarngadharan MG, Rahman R, et al: Monoclonal antibodies specific for p24, the major core protein of human T-cell Leukemia virus type III. Natl Acad Sci USA, 82: , Schaeffler B, Flesher A, Shriver K, Tam MR: Monoclonal antibody detection of p25 HIV antigen in the serum and CSF of patients within the AIDS spectrum. Abstract 7759, IV International Conference on AIDS, Bos ES, van der Doelen AA, van Rooy N, Schurs AHWM: 3,3',5,5' - Tetramethylbenzidine as an Ames test negative chromogen for horseradish peroxidase in enzyme immunoassay. J lmmunoassay 2: , Garner RC, Walpole AL, Rose FL: Testing of some benzidine analogues for microsomal activation to bacterial mutagens. Cancer Letters 1:39-42, Resnick L, Veren K, Salahuddin SZ, et al: Stability and inactivation of HTLV- III/LAV under clinical laboratory environments. JAMA 255: , Sarngadharan MG, Markham PD: The role of human T-Lymphotropic retroviruses in leukemia and AIDS, in Wormser GP (ed.): AIDS and Other Manifestations of HlV Infection. New Jersey, Noyes Publications 1987, pp Bond WW, Favero MS, Petersen NJ, et al: Inactivation of Hepatitis B virus by intermediate-to-high level disinfectant chemicals. J Clin Micro 18: , [GR]

17 17 [GR]

18 18 [GR]

19 19 [GR]

20 20 [GR]

21 21 [GR]