ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΠΟΛΥΔΥΝΑΜΩΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΣΕΙΡΩΝ ΑΠΟ ΤΗΝ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΗ ΜΟΝΑΔΑ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗΣ Γ ΜΑΙΕΥΤΙΚΗ ΚΑΙ ΓΥΝΑΙΚΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Δ. ΡΟΥΣΣΟΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ ΑΡΙΘΜ.2929 ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΠΟΛΥΔΥΝΑΜΩΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΣΕΙΡΩΝ ΑΠΟ ΤΗΝ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΗ ΜΟΝΑΔΑ ΤΣΑΓΙΑ Δ. ΝΙΚΟΛΑΟΥ ΙΑΤΡΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ

2 1 Επιβλέπων Καθηγητής Βασίλειος Καραγιάννης (Καθηγητής Ιατρικής Σχολής Α.Π.Θ) Συμβουλευτική Επιτροπή Βασίλειος Καραγιάννης (Καθηγητής Ιατρικής Σχολής Α.Π.Θ) Γεώργιος Κολιάκος (Καθηγητής Ιατρικής Σχολής Α.Π.Θ) Ζουρνατζη Βασιλική (Καθηγήτρια Ιατρικής Σχολής Α.Π.Θ) Εξεταστική Επιτροπή Βασίλειος Καραγιάννης (Καθηγητής Ιατρικής Σχολής Α.Π.Θ) Γεώργιος Κολιάκος (Καθηγητής Ιατρικής Σχολής Α.Π.Θ) Ζουρνατζη Βασιλική (Καθηγήτρια Ιατρικής Σχολής Α.Π.Θ) Μπίλλη Ελένη (Επίκουρος Καθηγήτρια Ιατρικής Σχολής Α.Π.Θ) Μαμόπουλος Απόστολος (Επίκουρος Καθηγητής Ιατρικής Σχολής Α.Π.Θ) Μαλισίοβας Νικόλαος (Καθηγητής Ιατρικής Σχολής Α.Π.Θ) Ιακωβίδου-Κρίτση Ζαφειρούλα (Καθηγήτρια Ιατρικής Σχολής Α.Π.Θ) <<Η έγκριση της Διδακτορικής Διατριβής από το τμήμα Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των απόψεων του συγγραφέα >> (Ν. 5343/1932, άρθρο και Ν.1268/80, αρθ.50 8)

3 2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΤΑΡΛΑΤΖΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ

4 3 Στους Καθηγητές μου Β. Καραγιάννη, Γ. Κολιάκο, Β. Ζουρνατζή με σεβασμό

5 4 Στον πατέρα μου και στην μητέρα μου, Δημήτριο και Ευδοκία Τσάγια ως ελάχιστη ανταπόδοση των κόπων τους

6 5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ...12 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΧΗΜΙΚΩΝ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΟΡΩΝ...13 ΕΙΣΑΓΩΓΗ TΑ ΒΛΑΣΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΕΡΕΥΝΑ Οι τύποι των βλαστοκυττάρων Εμβρϋικά βλαστοκύτταρα Βλαστοκύτταρα ενηλίκων Βλαστοκύτταρα ομφαλοπλακουντιακής μονάδας Μεταμοσχεύσεις ομφαλοπλακουντιακού αίματος Αποθήκευση και φύλαξη ομφαλοπλακουντιακών μονάδων ΒΛΑΣΤΟΚΥΤΤΑΡΑ ΣΤΗΝ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΗ ΜΟΝΑΔΑ Αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα Φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων Συχνότητα των αιμοποιητικών βλαστιοκυττάρων σε ένα ομφαλοπλακουντιακό μόσχευμα Σημασιά του αριθμού των CD34 αιμοποιηιτικών βλαστοκυττάρων Μέθοδοι μέτρησης των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων του ομφαλοπλακουντιακού αίματος Παράγοντες που επηρεάζουν τον αριθμό των αιμοποιητικών κυττάρων σε ένα δείγμα ομφαλοπλακουντιακού αίματος Κλινική σημασία της ποσότητας των CD34 αιμοποιητικών βλαστιοκυττάρων σε μια μονάδα ομφαλοπλακουντιακού αίματος Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα της χρήσης του ομφαλοπλακουντιακού αίματος έναντι άλλων πηγών Μεταμόσχευση διπλών ομφαλοπλακουντιακών μονάδων Μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα Κριτήρια για αποτελεσματική απομόονωση των μεσεγχυματικών κυττάρων από το άιμα του ομφαλίου λώρου Ανοσοφαινότυπος των μεσεγχυματικών κυττάρων Χρήσεις βλαστικών κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος για τη θεραπεία μη-αιματολογικών ασθενειών

7 6 3. Ο ΠΛΑΚΟΥΝΤΑΣ Γενικά χαρακτηριστικά Πλακουντιακή κυκλοφορία Εμβρυοπλακούντια κυκλοφορία Μητροπλακούντια κυκλοφορία Πλακουντιακή μεμβράνη Εμβρυολογία του πλακούντα και του ομφάλιου λώρου Βλαστοκύτταρα που απομονώνονται από τον πλακούντα Αμνιακά επιθηλιακά κύτταρα Αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα από τον πλακούντα Μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα από τον πλακούντα Κλινικές μελέτες με βλαστοκύτταρα του πλακούντα WHARTON JELLY Μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα από τον ομφάλιο λώρο Μέθοδοι απομόνωσης μεσεγχυμαιτικών βλαστικών κυττάρων από τον ομφάλιο λώρο Αλλοι τύποι μεσεγχυματικών κυττάρων από τον ομφάλιο λώρο Πλαστικόττητα των μεσεγχυματικών κυττάρων που απομονόνωνται από τον ομφάλιο λώρο Τα μεσεγχυματικά κύτταρα του ομφαλίου λώρου αποτελούν πρωτογενή πολυδύναμα κύτταρα Διαφορές μεταξύ των μεσεγχυματικών κυττάρων που απομονόνωνται από τον ομφάλιο λώρο και από το μυελό των οστών Θεραπευτικές εφαρμογές των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από τον ομφάλιο λώρο Υπερπολυδύναμα κύτταρα ομφαλοπλακουντιακού αίματος (USSCs) Κύτταρα από την ομφαλοπλακουντιακή μονάδα που εκφράζουν δείκτες εμβρυϊκών κυττάρων...59 ΣKOΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ...61 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ...63 ΑΤΟΜΑ ΠΟΥ ΣΥΜΜΕΤΕΙΧΑΝ ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ..63

8 7 1.ΜΕΛΕΤΗ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΠΟΥ ΚΑΘΟΡΙΖΟΥΝ ΤΗΝ ΠΟΙΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Αιματολογικός κυτταρικός αναλυτής Μέτρηση της βιωσιμότητας και του συνολικού αριθμού των CD34+ αιμοποηιτκών βλαστικών κυττάρων και των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων (ΗPSCs) Ικανότητα σχηματισμού αποικιών Στατιστική ανάλυση.65 2.ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΜΟΝΑΔΩΝ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΜΕ ΣΤΟΧΟ ΤΗΝ ΥΨΗΛΗ ΑΝΑΚΤΗΣΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕΤΑ ΤΗΝ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ Μείωση του όγκου Μέτρηση των κυτταρικών στοιχείων των δειγμάτων και των παραμέτρων των αιμοπεταλίων Μέτρηση της βιωσιμότητας και του συνολικού αριθμού των CD34+ αιμοποηιτκών βλαστικών κυττάρων και των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων (ΗPSCs) Κρυοσυντήρηση των δειγμάτων μετά την επεξεργασία Απόψυξη Ικανότητα σχηματισμού αποικιών 68 3.ΜΕΘΟΔΟΣ ΣΥΛΛΟΓΗΣ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΑΠΟ ΤΟΝ ΠΛΑΚΟΥΝΤΑ-ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΟΥ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΟΥ ΔΥΝΑΜΙΚΟΥ ΤΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΠΛΑΚΟΥΝΤΑ Δυο κλειστά στάδια συλλογής Επεξεργασία των δειγμάτων από τα δυο στάδια Απομόνωση μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από τον πλακούντα Κυτταρομετρία ροής Καλλιέργειες κυττάρων Μελέτη της ικανότητας των κυττάρων που απομονώνονται από τον πλακούντα για διαφοροποίηση.71

9 Διαφοροποίηση σε οστικά κύτταρα Χρώση οστικών κυττάρων Διαφοροποίηση σε λιποκύτταρα Χρώση λιποκυττάρων ΗLA ανάλυση Βακτηριολογικός έλεγχος ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΤΗΝ ΟΥΣΙΑ ΤΟΥ WHARTON Συλλογή ομφαλίων λώρων Απομόνωση, καλλιέργεια, κρυοσυντήρηση Κυτταρομετρία ροής Απόψυξη Μελέτη τμημάτων του ομφαλίου λώρου Μικροβιολογικός έλεγχος ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΩΝ ΒΛΑΣΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΟΛΟΚΛΗΡΟ ΤΟ ΣΩΜΑ ΤΟΥ ΟΜΦΑΛΙΟΥ ΛΩΡΟΥ Συλλογή ομφαλίων λώρων Επεξεργασία όόκληρου του τμήματος του ομφάλιου λώρου Ενζυμικός διαχωρισμός Κυτταρικός αναλυτής Κυτταρομετρία ροής Σύγκριση των μεθόδων Κατάψυξη- Απόψυξη Καλλίεργεια των μεσεγχυματικών κυττάρων Διαφοροποίηση των μεσεγχυματικών κυττάρων Μικροβιολογικός αναλυτής ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ USSCS ΜΕ ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΛΙΠΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ...80

10 Απομόνωση βλαστοκυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος Απομόνωση βλαστικών κυττάρων από το λιπώδη ιστό Κυτταρικές καλλίεργειες Κυτταρομετρία ροής ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΙΚΡΩΝ ΣΕ ΜΕΓΕΘΟΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΣΩΜΑ ΤΟΥ ΟΜΦΑΛΙΟΥ ΛΩΡΟΥ ΠΟΥ ΕΚΦΡΑΖΟΥΝ ΔΕΙΚΤΕΣ ΕΜΒΡΥΪΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Κυτταρομετρία ροής Κυτταρικές καλλίεργιες Χρώση των πολυδύναμων κυττάρων από το σώμα του ομφαλίου λώρου με αλκαλική φωσφατάση Χρώση των κυττάρων με πολυδύναμους εμβρϋικούς δείκτες...83 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΠΟΥ ΚΑΘΟΡΙΖΟΥΝ ΤΗΝ ΠΟΙΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Χαρακτηριστικά στοιχεία των δειγμάτων συλλογής από τη μελέτη Επίδραση της θερμπκρασίας και του χρόνου καθυστέρησης επεξεργασίας του δείγματος 84 2.ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΜΟΝΑΔΩΝ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΜΕ ΣΤΟΧΟ ΤΗΝ ΥΨΗΛΗ ΑΝΑΚΤΗΣΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕΤΑ ΤΗΝ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕΘΟΔΟΣ ΣΥΛΛΟΓΗΣ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΑΠΟ ΤΟΝ ΠΛΑΚΟΥΝΤΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΑ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΩΝ ΒΛΑΣΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Καλλίεργεια των μεσεγχυματικών κυττάρων Διαφοροποιήση των μεσεγχυματικών κυττάρων του πλακούντα ΗLA ανάλυση Μικροβιολογικός έλεγχος...101

11 10 4.ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΤΗΝ ΟΥΣΙΑ ΤΟΥ WHARTON Απομόνωση κυττάρων και καλλίεργεια Κυτταρομετρία ροής Απόψυξη Τμήματα ομφαλίου λώρου Μικροβιολογικός έλεγχος ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΩΝ ΒΛΑΣΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΟΛΟΚΛΗΡΟ ΤΟ ΣΩΜΑ ΤΟΥ ΟΜΦΑΛΙΟΥ ΛΩΡΟΥ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ USSCS ΜΕ ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΛΙΠΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΙΚΡΩΝ ΣΕ ΜΕΓΕΘΟΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΣΩΜΑ ΤΟΥ ΟΜΦΑΛΙΟΥ ΛΩΡΟΥ ΠΟΥ ΕΚΦΡΑΖΟΥΝ ΔΕΙΚΤΕΣ ΕΜΒΡΥΪΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΜΕΛΕΤΗ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΠΟΥ ΚΑΘΟΡΙΖΟΥΝ ΤΗΝ ΠΟΙΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΜΟΝΑΔΩΝ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΜΕ ΣΤΟΧΟ ΤΗΝ ΥΨΗΛΗ ΑΝΑΚΤΗΣΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕΤΑ ΤΗΝ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕΘΟΔΟΣ ΣΥΛΛΟΓΗΣ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΑΠΟ ΤΟΝ ΠΛΑΚΟΥΝΤΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΑ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΩΝ ΒΛΑΣΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ.. 129

12 11 4.ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΤΗΝ ΟΥΣΙΑ ΤΟΥ WHARTON ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΩΝ ΒΛΑΣΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΟΛΟΚΛΗΡΟ ΤΟ ΣΩΜΑ ΤΟΥ ΟΜΦΑΛΙΟΥ ΛΩΡΟΥ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ USSCS ΜΕ ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΛΙΠΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΙΚΡΩΝ ΣΕ ΜΕΓΕΘΟΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΣΩΜΑ ΤΟΥ ΟΜΦΑΛΙΟΥ ΛΩΡΟΥ ΠΟΥ ΕΚΦΡΑΖΟΥΝ ΔΕΙΚΤΕΣ ΕΜΒΡΥΪΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙA...149

13 12 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής μελετήθηκαν οι διάφοροι πληθυσμοί βλαστικών κυττάρων που μπορούν να απομονωθούν από την ομφαλοπλακουντιακή μονάδα. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στον Καθηγητή και Διευθυντή της Γ Γυναικολογικής και Μαιευτικής Κλινικής του Ιπποκράτειου Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης κ. Καραγίαννη Βασίλειο, που με εμπιστεύτηκε και μου ανάθεσε την εκπόνηση της παρούσας διατριβής. Τον ευχαριστώ για τις συμβουλές του και την αμέριστη υποστήριξή του όλον αυτό τον καιρό όχι μόνο στο συγκεκριμένο θέμα αλλά και σε γενικά θέματα της σύγχρονης μαιευτικής και γυναικολογίας. Ευχαριστώ επίσης θερμά τον Αναπληρωτή Καθηγητή Βιοχημείας της Ιατρικής Σχολής κ. Γεώργιο Κολιάκο για την ευκαιρία που μου έδωσε να δουλέψω πέντε χρόνια μαζί του σε ένα άρτια οργανωμένο εργαστήριο, παρέχοντάς μου όλα τα απαραίτητα εφόδια προκειμένου να πραγματοποιήσω την έρευνά μου. Τον ευχαριστώ για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε και γιατί ήταν πάντα δίπλα μου σε ότι και αν χρειαζόμουν. Το πάθος του για την έρευνα και ο ανυποχώρητος ζήλος του με ενέπνευσαν και αποτέλεσαν παράδειγμα για μένα, ενώ με έκαναν να αγαπήσω ακόμα περισσότερο την έρευνα. Ευχαριστώ επίσης την Καθηγήτρια κ Ζουρνατζή-Κοϊου Βασιλική για το αμέριστο ενδιαφέρον της και την πολύτιμη βοήθεια της στην ολοκλήρωση της διατριβής αυτής. Την ευχαριστώ επίσης για τη συμμετοχή της στην τριμελή συμβουλευτική επιτροπή και τη διόρθωση της διδακτορικής μου διατριβής. Τέλος ιδιαιτέρως θα ήθελα να ευχαριστήσω την κ. Κουζή-Κολιάκου Κοκκώνα για τις συμβουλές της καθ όλη τη διάρκεια του ερευνητικού μου έργου. Την ευχαριστώ επίσης για τις εύστοχες παρατηρήσεις και την πολύτιμη βοήθεια της για και την καθοδήγησή της για τη συγγραφή αυτού του κειμένου. Τα εφόδια που πήρα είναι ανεκτίμητα και θα με συντροφεύουν μια ζωή στη μετέπειτα ερευνητική μου πορεία.

14 13 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΧΗΜΙΚΩΝ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΟΡΩΝ ΒFU-E: αποικίες ερυθροβλαστών CFU-Colony Forming Unit: Σχηματισμός Αποικιών CFU-GM: αποικίες πολυμορφοπύρηνων-μακροφάγων CFU-GEMM: μεικτές αποικίες πολυμορφοπύρηνων - ερυθροβλαστών και μεγακαρυοκυττάρων CPD-A: citrate-phospate-dextrose-adenine : αντιπηκτικό DMEM-Dulbecco s Modified Medium: θρεπτικό μέσο DMSO: διμεθυλοσουλφοξείδιο (dimethylsulfoxide) EDTA- ethylenediaminetetracetic acid: αιθυλενο-διαμινο-τετραοξικό οξύ FCS: ορός εμβρύου μόσχου (fetal calf serum) FITC: fluorescein isothiocyanate HES 200/0.5: hydroxyethyl starch 200/0.5: διάλυμα για την καθίζηση των ερυθρών αιμοσφαιρίων HSCs-Haematopoietic Stem Cells: Αιμοποιητικά Βλαστικά Κύτταρα HPSCs-Haematopoietic Prgenitors Stem Cells: Πρόδρομα Αιμοποιητικά Βλαστικά Κύτταρα GVHD-Graft Versus Host Disease- Aντίδραση απόρριψης μοσχεύματος έναντι του ξενιστή. 7-AAD: 7-amino-actinomycin D: 7- ακτινομυκίνη MPV: μέσος όγκος των αιμοπεταλίων ΜSCs-Mesemchymal Stem Cells: Μεσεγχυματικά Βλαστικά Κύτταρα PBS- phosphate-buffered saline: ουδέτερο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα PCR-Polymerase Chain Reaction: Αλυσιδωτή αντίδραση Πολυμεράσης

15 14 PC5: phycoerythrin-cyanin 5 PCT: αιμοπεταλιοκρίτης PDW: πλάτος διανομής των αιμοπεταλίων RBC-Red Blood Cells: Ερυθρά Αιμοσφαίρια RPE R: φυκοερυθρίνη (R-phycoerythrin) TNCs- Total nucleated stem cells-συνολικά εμπύρηνα κύτταρα USSCs- Unrestricted somatic stem cells: υπερπολυδύναμα βλαστικά κύτταρα VSELs-Very Small Embryonic like stem cells: πολύ μικρά σε μέγεθος κύτταρα που εκφράζουν δείκτες εμβρυϊκών κυττάρων

16 15 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. ΤΑ ΒΛΑΣΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΕΡΕΥΝΑ Η μελέτη των βλαστοκυττάρων τα τελευταία χρόνια αρχίζει να οριοθετεί μια νέα εποχή στον τομέα της ιατρικής και της βιοιατρικής έρευνας. Η ανακάλυψη αυτών των κυττάρων δημιουργεί νέες ελπίδες για τη θεραπεία πολλών ασθενειών. Τα βλαστικά κύτταρα είναι εκείνα τα κύτταρα, τα οποία έχουν την ικανότητα να πολλαπλασιάζονται αλλά και να αναπαράγουν πολλούς διαφορετικούς τύπους κυττάρων. Ειδικότερα για να χαρακτηριστεί ένα κύτταρο ως βλαστικό κύτταρο θα πρέπει να πληρεί τις εξής προϋποθέσεις: i) να έχει την ιδιότητα να διαιρείται και να αυτοανανεώνεται για μεγάλο χρονικό διάστημα μέσα από τις κυτταρικές διαιρέσεις, ii) να είναι αδιαφοροποίητο και iii) να μπορεί να διαφοροποιηθεί σε άλλους κυτταρικούς τύπους (Εικόνα 1). Εικόνα 1. Αδιαφοροποίητο βλαστικό κύτταρο το οποίο μπορεί να διαφοροποιηθεί σε άλλους κυτταρικούς τύπους Οι τύποι των βλαστοκυττάρων Είναι πλέον γνωστό ότι βλαστοκύτταρα υπάρχουν στον ανθρώπινο οργανισμό από τα πρώτα στάδια της ανάπτυξης του ως το τέλος της ζωής του. Όλα τα βλαστοκύτταρα αποδεικνύονται χρήσιμα στην ιατρική έρευνα, κάθε τύπος, όμως, παρέχει τόσο υποσχέσεις όσο και περιορισμούς. Έτσι λοιπόν υπάρχουν τα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα, τα οποία, έχουν τη δυνατότητα να παράγουν όλους τους τύπους κυττάρων του ανθρώπινου σώματος και τα ενήλικα βλαστοκύτταρα, που βρίσκονται

17 16 σε ορισμένους ιστούς του πλήρως ανεπτυγμένου ανθρώπινου οργανισμού ανεξάρτητα από την ηλικία του, και μπορεί να περιορίζονται στην παραγωγή ορισμένων μόνο τύπων εξειδικευμένων κυττάρων. Ειδική κατηγορία ενήλικων βλαστικών κυττάρων αποτελούν τα βλαστοκύτταρα από το αίμα και τους ιστούς της ομφαλοπλακουντιακής μονάδας από τα οποία μπορούν να παραχθούν διάφοροι τύποι κυττάρων Εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα Σ αυτή την κατηγορία κυττάρων ανήκουν τα κύτταρα του εμβρύου που προκύπτουν από τις πρώτες διαιρέσεις μετά τη γονιμοποίηση (μέχρι την 4 ημέρα). Τα κύτταρα αυτά θεωρούνται παντοδύναμα (totipotent) και από αυτά μπορούν να δημιουργηθούν όλα τα κύτταρα του εμβρύου καθώς και οι εξωεμβρυϊκοί σχηματισμοί, όπως ο πλακούντας. Τα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα, τα οποία προέρχονται από έμβρυο ηλικίας μεγαλύτερης των 4-5 ημερών θεωρούνται ολοδύναμα (plutripotent) και μπορούν να μετατραπούν σε όλους τους κυτταρικούς τύπους ενός οργανισμού. Τα κύτταρα αυτά προέρχονται από το εσωτερικό της βλαστοκύστης. Η βλαστοκύστη είναι το εμφυτευμένο έμβρυο που έχει αναπτυχθεί 5 ημέρες μετά τη γονιμοποίηση ενός ωαρίου από ένα σπερματοζωάριο. Η βλαστοκύστη περιέχει όλα τα υλικά που είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη ενός πλήρους ανθρώπινου σώματος. Η βλαστοκύστη είναι μια ως επί το πλείστον κοίλη σφαίρα από κύτταρα, το μέγεθος της οποίας είναι μικρότερο από το μέγεθος της τελείας που υπάρχει στο τέλος αυτής της πρότασης. Στο εσωτερικό της βρίσκεται η εσωτερική μάζα κυττάρων που αποτελείται από κύτταρα που χαρακτηρίζονται από τους επιστήμονες ως ολοδύναμα, λόγω της ικανότητάς τους να διαφοροποιούνται προς όλους τους τύπους κυττάρων του ανθρώπινου σώματος (1,2). Οι επιστήμονες χρησιμοποιούν τους όρους μορίδιο και βλαστοκύστη όταν αναφέρονται σε καθορισμένα στάδια της ανάπτυξης, πριν την εμφύτευση. Στη φυσιολογική ανάπτυξη, η βλαστοκύστη εμφυτεύεται στο τοίχωμα της μήτρας ώστε να γίνει έμβρυο και να συνεχίσει να αναπτύσσεται σε ώριμο οργανισμό. Τα εξωτερικά κύτταρά της θα αρχίσουν να σχηματίζουν τον πλακούντα, ενώ τα εσωτερικά θα αρχίσουν να διαφοροποιούνται προς όλο και περισσότερο εξειδικευμένα κύτταρα του οργανισμού. Όταν η βλαστοκύστη πρόκειται να χρησιμοποιηθεί στην έρευνα των βλαστοκυττάρων, οι επιστήμονες αφαιρούν την εσωτερική μάζα κυττάρων και τα τοποθετούν σε τριβλία με ένα πλούσιο θρεπτικό υπόστρωμα, ώστε να δώσουν

18 17 εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα. Τα κύτταρα αυτά φαίνεται ότι είναι περισσότερο ευέλικτα από τα βλαστικά κύτταρα των ενηλίκων, καθώς έχουν τη δυνατότητα να παραγάγουν κάθε τύπο κυττάρου του ανθρώπινου οργανισμού. Ωστόσο η χρήση των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων γεννά πολλά ηθικά διλήμματα και επιπλέον δεν είναι άμοιρη συνεπειών, καθώς έχει βρεθεί ότι έγχυση τους σε πειραματόζωα δημιουργεί ένα τύπο όγκου που ονομάζεται τεράτωμα Βλαστοκύτταρα Ενηλίκων Η μελέτη των βλαστικών κυττάρων από ενήλικες δε γεννά ηθικά διλήμματα και ερωτήματα όπως τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα. Υπάρχουν πολλές πηγές βλαστικών κυττάρων, όπως ο μυελός των οστών, το περιφερικό αίμα, ο λιπώδης ιστός, ο περιοδοντικός ιστός, o εγκέφαλός, το ήπαρ, και το ομφαλοπλακουντιακό αίμα. Τα βλαστοκύτταρα ενηλίκων θεωρούνται πολυδύναμα (multipotent) καθώς έχουν τη δυνατότητα να αυτοανανεωθούν αλλά η δυνατότητα διαφοροποίησης τους είναι πιο περιορισμένη. Μπορούν να ωριμάσουν σε κύτταρα του ιστού ή του οργάνου από το οποίο προέρχονται αλλά και παίζουν βασικό ρόλο στην συντήρηση και στην επιδιόρθωση τους (3-5) Βλαστοκύτταρα ομφαλοπλακουντιακής μονάδας- Περιγεννητικά βλαστοκύτταρα Τα βλαστοκύτταρα της ομφαλοπλακουντιακής μονάδας ανήκουν στην κατηγορία των ενήλικων βλαστικών κυττάρων. Πολλοί θεωρούν ότι τα βλαστοκύτταρα αυτά αποτελούν ξεχωριστή κατηγορία βλαστικών κυττάρων εξαιτίας των μοναδικών τους ιδιοτήτων αλλά και της στιγμής κατά την οποία λαμβάνονται. Έτσι λοιπόν τα τελευταία χρόνια επιστημονικές έρευνες που αφορούν τα βλαστοκύτταρα από την ομφαλοπλακουντιακή μονάδα υποδεικνύουν πως το εύρος των δυνατοτήτων τους είναι πολύ μεγάλο και μπορεί να θεωρηθούν ως ολοδύναμα κύτταρα (pluripotent) και όχι απλά ως πολυδύναμα (multipotent). To φαινόμενο αυτό αποτελεί τη λεγόμενη πλαστικότητα των βλαστικών κυττάρων που προέρχονται από την ομφαλοπλακουντιακή μονάδα και αποτελεί τη βάση της κυτταρικής θεραπείας και της χρήσης τους στο πεδίο των μεταμοσχεύσεων.

19 Mεταμοσχέυσεις ομφαλοπλακουντιακού αίματος Μέχρι σήμερα έχουν πραγματοποιηθεί πάνω από είκοσι χιλιάδες μεταμοσχεύσεις με βλαστοκύτταρα ομφαλοπλακουντιακού αίματος για τη θεραπεία κακοηθών και μη κακοηθών ασθενειών που θεραπεύονταν με μεταμοσχεύσεις μυελού των οστών (6,7). Ειδικότερα όταν μιλάμε για κακοήθη νοσήματα, αυτά περιλαμβάνουν την οξεία και τη χρόνια μυελογενή και λεμφοειδή λευχαιμία, τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (6,8), καθώς και για τη θεραπεία συμπαγών όγκων,όπως νευροβλάστωμα,ρετινοβλάστωμα κλπ. Μη κακοήθη νοσήματα που θεραπεύονται σήμερα με τη χρήση βλαστοκυττάρων από την ομφαλοπλακουντιακή μονάδα είναι οι αιμοσφαιρινοπάθειες (9), μεταβολικές παθήσεις (10), λευκοδυστροφίες (11) και πρωτοπαθείς ανοσοαναεπάρκειες (12). Πρακτικά με τα σημερινά επιστημονικά δεδομένα όλες οι ασθένειες οι οποίες θεραπεύονταν με μεταμόσχευση μυελού των οστών θεραπεύονται με βλαστοκύτταρα από την ομφαλοπλακουντιακή μονάδα. Παρακάτω παρατίθεται ένας πίνακας με τις σημαντικότερες ασθένειες στις οποίες εφαρμόζεται η χρήση των βλαστοκυττάρων του ομφαλοπλακουντιακού αίματος (ΟΠΑ) (Πίνακας 1). Πίνακας1. Ασθένειες που θεραπεύονται με βλαστοκύτταρα του ΟΠΑ Οξείες λευχαιμίες Οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία Οξεία μυελοβλαστική λευχαιμία Χρόνιες λευχαιμίες Χρόνια μυελογενής λευχαιμία Χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία Μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα Χρόνια Μυελομονοκυτταρική λευχαιμία Μυελοπαραγωγικά σύνδρομα Οξεία μυελοίνωση Πολυκυτταραιμία Θρομβοκυτταροπενία Διαταραχές των βλαστοκυττάρων Απλαστική αναιμία Συγγενής κυτταροπενία Αναιμία Fanconi Παροξυσμική νυκτερινή αιμοσφαιρινουρία Λεμφοπαραγωγικά σύνδρομα Νόσος Hodgkin Non-hodgkin λέμφωμα Προλεμφοκυτταρική λευχαιμία Διαταραχές φαγοκυττάρωσης Χρόνια κοκκιοκυτταρική νόσος Ανεπάρκεια της ακτίνης ουδετερόφιλων Μακροσφαιριναιμία του Waldestrom Διαταραχές πλασματοκυττάρων Πολλαπλούν μυέλωμα Λευχαιμία των πλασματοκυττάρων Ανοσοανεπάρκειες Απουσία Τ λεμφοκυττάρων Απουσία Τ και Β λεμφοκυττάρων Τιλλεγγειεκτασία Ανεπάρκεια της προσκόλλησης λευκοκυττάρων Σύνδρομο Wiscott-Aldrich

20 19 Παράλληλα πραγματοποιούνται παγκοσμίως πολλές κλινικές μελέτες με τα βλαστοκύτταρα του ομφαλίου λώρου που αφορούν ένα ευρύ πεδίο ασθενειών όπως το νευροβλάστωμα, η ισχαιμική εγκεφαλοπάθεια, το σάρκωμα Ewing, οι κακοήθεις όγκοι του εγκεφάλου, ο σακχαρώδης διαβήτης, η σκλήρυνση κατά πλάκας, η μυϊκή δυστροφία, η αναγέννηση του μυοκαρδίου μετά από έμφραγμα. Το έτος 2008 ήταν η εικοστή επέτειος από την πρώτη μεταμόσχευση με βλαστοκύτταρα από το ομφαλοπλακουντιακό αίμα. Επρόκειτο για ένα νεαρό ασθενή ο οποίος έπασχε από αναιμία Fanconi και υποβλήθηκε σε μεταμόσχευση ομφαλοπλακουντιακού αίματος από συμβατό συγγενή δότη (13). Διαπιστωθεί ότι ο δέκτης της πρώτης ομφαλοπλακουντιακής μεταμόσχευσης μετά από είκοσι χρόνια εξακολουθεί να είναι υγιείς και ελεύθερος νόσου. Η πρώτη μεταμόσχευση που πραγματοποιήθηκε (13) καθώς και οι αμέσως επόμενες έγιναν χάρη στη θεώρηση των επιστημόνων ότι το ομφαλοπλακουντιακό αίμα είναι πλούσιο σε αιμοποιητικά αλλά και πρόδρομα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα (14). Οι μεταμοσχεύσεις αφορούσαν πλήρως η μερικώς ιστοσυμβατά δείγματα από συγγενείς ή μη-συγγενείς δότες. Υπολογίζεται ότι υπάρχουν πάνω από δείγματα σε τράπεζες φύλαξης ομφαλοπλακουντιακού αίματος και ότι κάθε χρόνο πραγματοποιούνται πάνω από 2000 μεταμοσχεύσεις παγκοσμίως (15) Αποθήκευση και φύλαξη ομφαλοπλακουντιακών μονάδων Τα ομφαλοπλακουντιακά μοσχεύματα συνήθως καταψύχονται σε βαθιά κατάψυξη στους -196 ο C χρησιμοποιούνται ύστερα από απόψυξη μετά την απομάκρυνση των ερυθρών αιμοσφαιρίων από τα δείγματα. Το δείγμα που ψύχεται είναι εμπλουτισμένο σε βλαστοκύτταρα και λευκά αιμοσφαίρια (13,14). Τα βλαστοκύτταρα φαίνεται ότι μετά από την απόψυξη διατηρούν τις λειτουργικές ιδιότητες και τα μορφολογικά χαρακτηριστικά τους. Πριν από μερικά χρόνια έγινε ο πρώτος έλεγχος δειγμάτων που είχαν καταψυχθεί πριν από 15 χρόνια (16), ενώ πρόσφατα πραγματοποιήθηκε έλεγχος σε δείγματα τα οποία είχαν καταψυχθεί πριν από 24 χρόνια ( αδημοσίευτα στοιχεία Βroxmeyer H και συν., 2010). Ο έλεγχος αφορούσε την ικανότητα σχηματισμού αποικιών μετά από την απόψυξη καθώς και την ικανότητα εμφύτευσης των βλαστοκυττάρων σε ανοσοκατασταλμένα πειραματόζωα. Η μελέτη απέδειξε ότι μετά από βαθιά κατάψυξη τα κύτταρα διατηρούν τη λειτουργικότητα τους μετά από πολλά χρόνια.

21 20 2. ΒΛΑΣΤΟΚΥΤΤΑΡΑ ΣΤΗΝ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΗ ΜΟΝΑΔΑ Στην ομφαλοπλακουντιακή μονάδα υπάρχουν διάφοροι τύποι βλαστοκυττάρων όπως αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα, μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα και πρόδρομα ενδοθηλιακά βλαστοκύτταρα. Τα τελευταία χρόνια οι επιστήμονες ανακάλυψαν και άλλους πληθυσμούς βλαστοκυττάρων πολύ πιο πρώιμους που έχουν κάποια κοινά χαρακτηριστικά με τα πολυδύναμα εμβρυϊκά κύτταρα, όπως τα υπερπολυδύναμα κύτταρα του ομφαλοπλακουντιακού αίματος (Unrestricted somatic stem cells, USSCs) και τα πολύ μικρά παρόμοια με εμβρυϊκά κύτταρα (Very Small Embryonic Like Stem Cells, VSELs). Η ανακάλυψη των κυττάρων αυτών ανοίγει νέους ορίζοντες για την χρήση του ομφαλοπλακουντιακού αίματος στις θεραπείες της αναγεννητικής ιατρικής και στο πεδίο των μεταμοσχεύσεων Αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα Ο αιμοποιητικός ιστός περιέχει ένα μικρό αριθμό αρχέγονων και πολυδύναμων αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων. Αυτά τα κύτταρα προσδιορίζονται από την ικανότητα τους να αυτοανανεώνονται, να πολλαπλασιάζονται καθώς και την ικανότητα τους να διαφοροποιούνται σε όλες τις αιμοποιητικές κυτταρικές σειρές παράγοντας προγονικά κύτταρα τόσο της μυελικής όσο και της λεμφικής σειράς (17,5,18). Η πολυπλοκότητα του συστήματος είναι μεγάλη αν σκεφτεί κανείς ότι ερυθρά αιμοσφαίρια και λευκά αιμοσφαίρια παράγονται κάθε μέρα κατά τη διάρκεια της ζωής (19). Κάθε βλαστοκύτταρο θεωρείται ικανό για πάνω από 50 διαιρέσεις η διπλασιασμούς, ενώ ο πολλαπλασιασμός τους φαίνεται ότι ελέγχεται από αιμοποιητικούς αυξητικούς παράγοντες και ιντερλευκίνες (20,21). To 1974 πρώτος ο Ηal Broxmeyer περιέγραψε την ύπαρξη αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων στο ομφαλοπλακουντιακό αίμα και συμμετείχε στην πρώτη μεταμόσχευση ομφαλοπλακουντιακού αίματος το 1988 (13,14).

22 Φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων Τα πιο αρχέγονα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα έχει αποδειχθεί ότι εκφράζουν τα παρακάτω αντισώματα CD34, CD45low, Thy-1, C-kit (CD117), CD133 (17,19, 22-25). CD34 H πρωτεΐνη CD34 είναι μια γλυκοπρωτεϊνη μεγέθους kda η οποία εκφράζεται σε πρώιμα αιμοποιητικά και προγονικά κύτταρα του ομφαλοπλακουντιακού αίματος και του μυελού των οστών (18,26), όπως επίσης και στα ενδοθηλιακά κύτταρα (27,28). Αν και το CD34 αντίσωμα αποτελεί τον κατεξοχήν δείκτη των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων πολύ πρώιμα κύτταρα δεν εκφράζουν αυτό το δείκτη. Εξαρτάται από το στάδιο διαφοροποίησης καθώς ένα βλαστοκύτταρο αρνητικό στο CD34 μπορεί να είναι τόσο πρώιμο ώστε να μπορεί να δημιουργήσει όχι μόνο αιμοποιητικά αλλά και μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα. Πρόσφατες έρευνες έχουν αποδείξει την εκπληκτική πλαστικότητα ενός πληθυσμού κυττάρων ο οποίος μπορεί να διαφοροποιηθεί σε αιμοποιητικά και μεσεγχυματικά κύτταρα (29). Πιθανώς το CD34 αντίσωμα να είναι ένας δείκτης των ενεργοποιημένων βλαστικών κυττάρων καθώς CD34 αρνητικά κύτταρα μετατρέπονται σε CD34 θετικά (30). Η ποσότητα των θετικών CD34 αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων αποτελεί σημαντικό χαρακτηριστικό για την ποιότητα ενός ομφαλοπλακουντιακού μοσχεύματος. Από τη στιγμή που η ποσότητα ενός ομφαλοπλακουντιακού μοσχεύματος είναι περιορισμένη η γνώση του αριθμού των CD34 αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων είναι καίριας σημασίας (31).

23 Συχνότητα των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων σε ένα ομφαλοπλακουντιακό μόσχευμα Παράμετροι οι οποίοι συνήθως χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση μιας μονάδας ομφαλοπλακουντιακού αίματος αλλά και ως προγνωστικοί δείκτες για τη δράση της ως μόσχευμα είναι ο συνολικός αριθμός των εμπύρηνων κυττάρων (NCs) και των αιμοποιητικών CD34 κυττάρων (32). Περίπου 1-3% του συνολικού αριθμού εμπύρηνων κυττάρων του μυελού των οστών είναι CD34 θετικά αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα (33-35). Σε μονάδες ομφαλοπλακουντιακού αίματος το ποσοστό είναι 1-2% του συνόλου των μονοκυττάρων (MNCs), (36-38), ενώ φαίνεται ότι το ομφαλοπλακουντιακό αίμα περιέχει δέκα φορές περισσότερα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα από το περιφερικό αίμα. Στο περιφερικό αίμα το ποσοστό των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων κυμαίνεται μεταξύ 0,01%-0,1% του συνόλου των εμπύρηνων κυττάρων (33). Ωστόσο επιστημονικές έρευνες έχουν δείξει μεγάλη ποικιλία στον αριθμό των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων ανάμεσα στις μονάδες ομφαλοπλακουντιακού αίματος. Ο αριθμός των CD34 θετικών βλαστοκυττάρων σε σχέση με το συνολικό αριθμό εμπύρηνων κυττάρων, που εκφράζουν το CD45 δείκτη φαίνεται ότι κυμαίνεται μεταξύ 0.28±0.15 % σύμφωνα με μια έρευνα (39), και 0,4 ±0.03 % σύμφωνα με κάποιους άλλους ερευνητές (40). Τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα αποτελούν 1.4 ± 0.9%, (41) ή το 0.36 ± 0.33% του κλάσματος των μονοκυττάρων (42). Ο απόλυτος αριθμός των CD45 εμπύρηνων κυττάρων του ομφαλοπλακουντιακού αίματος είναι 12 ±1.3 Χ10 6 /ml, ενώ ο απόλυτος αριθμός των CD34 αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων είναι 5.6±3.9Χ10 4 ml (40). Κάποιοι ερευνητές υποστηρίζουν ότι ο αριθμός των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων κυμαίνεται μεταξύ 15 και 100 Χ10 4 κύτταρα ανά ml (39, 43, 44). Οι διαφορές είναι αποτέλεσμα πιθανώς της ετερογένειας των δειγμάτων ή των διαφορετικών τεχνικών που ακολουθούν οι διάφορες ερευνητικές ομάδες για την απομόνωση των βλαστοκυττάρων.

24 Σημασία του αριθμού των CD34 αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων Η κύρια παράμετρος που χρησιμοποιείται για την επιλογή μιας μονάδας ομφαλοπλακουντιακού αίματος για μια επιτυχή μεταμόσχευση είναι ο αριθμός των εμπύρηνων λευκών αιμοσφαιρίων και ο αριθμός των αιμοποιητικών CD 34 κυττάρων (32). Ειδικότερα ο αριθμός των εμπύρηνων λευκών αιμοσφαιρίων φαίνεται να σχετίζεται με την ανάκαμψη των λεμφοκυττάρων και των αιμοπεταλίων καθώς και με τα ποσοστά επιβίωσης μετά την μεταμόσχευση (45). Ωστόσο μέχρι σήμερα δεν υπάρχει συμφωνία μεταξύ των ερευνητών για τον ελάχιστο αριθμό κυττάρων που απαιτούνται για επιτυχή μεταμόσχευση. Έχει προταθεί ότι ο ελάχιστος αριθμός εμπύρηνων κυττάρων, προκειμένου να μειωθεί ο χρόνος της ανάκτησης του αιμοποιητικού συστήματος μετά από μεταμόσχευση πρέπει να είναι 1,5 Χ10 7 (46) ή 2 Χ10 7 ανά kg βάρους σώματος του ασθενούς (47). Ο αριθμός των CD 34 αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων είναι επίσης πολύ σημαντικός, καθώς υπάρχει συσχέτιση του αριθμού αυτού με τον αριθμό των συνολικών εμπύρηνων κυττάρων (48). Έρευνες οι οποίες έχουν διεξαχθεί σε μια προσπάθεια να προσδιοριστεί ο ακριβής αριθμός κυττάρων που απαιτείται έδειξε ότι σημαντικοί παράγοντες εκτός του αριθμού των κυττάρων παίζουν σημαντικό ρόλο για την επιτυχή έκβαση μιας μεταμόσχευσης, όπως ο δότης, το αυτόλογο ή ετερόλογο μόσχευμα, ο αριθμός των ταυτόσημων HLA αλληλίων καθώς και το είδος της ασθένειας του δέκτη (49). Πρόσφατη έρευνα έδειξε ότι ένας ελάχιστος αριθμός 2.0X10 5 CD34 αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων απαιτείται (47), ενώ μεγαλύτερος αριθμός κυττάρων έχει σαν αποτέλεσμα την καλύτερη ανάκτηση των κυττάρων της μυελικής σειράς και των αιμοποτελίων (50) Μέθοδοι μέτρησης των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων του ομφαλοπλακουντιακού αίματος Παγκοσμίως υπάρχουν δυο κύριες μέθοδοι προσδιορισμού των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων. Είναι το πρωτόκολλο του ISHAGE (International Society of Hemotherapy and Graft Engineering) και η μέθοδος Procount (Becton Dickinson) (32). Το 1996 ο Sutherland και η ερευνητική του ομάδα πρότειναν τις κατευθυντήριες γραμμές του ISHAGE, το οποίο ονομάστηκε πρωτόκολλο ISCT (ΙΝΤΕRNATIONAL SOCIETY OF CELLYLAR THERAPY), το οποίο στηρίζεται

25 24 στη μέτρηση των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων με τη βοήθεια της κυτταρομετρίας ροής (33). Με την τεχνική αυτή χρησιμοποιώντας διάφορες παραμέτρους, όπως το μέγεθος, ο σκεδασμός, ο αριθμός των CD34 και CD45 κυττάρων με διάφορες μεθόδους επιλογής είναι δυνατή η διάκριση ενός CD34 θετικού κυττάρου ανάμεσα σε χίλια κύτταρα (51). To πρωτόκολλο αυτό στη συνέχεια υπέστη διάφορες βελτιώσεις από διάφορες ερευνητικές ομάδες. Έτσι ο Gratama και οι συν., εισήγαγαν έναν δείκτη για την μέτρηση της βιωσιμότητας των κυττάρων, την 7-ΑΑD (7-αμινο ακτινομυκίνη D). (52). Είναι γνωστό ότι η 7-ΑΑD είναι μια χρωστική η οποία προσδιορίζει τα νεκρά ή τα κύτταρα τα οποία είναι σε απόπτωση. Πολλές έρευνες διεθνώς δείχνουν ότι η 7-ΑΑD είναι πολύ σημαντική για τον υπολογισμό των CD34 αιμοποιητικών κυττάρων στο πρωτόκολλο του ISHAGE καθώς προσδιορίζει και τα αδύναμα CD34 κύτταρα τα οποία έχουν εισέλθει στη διαδικασία της απόπτωσης και επομένως δεν θα συνεισφέρουν σε ενδεχόμενη μελλοντική μεταμόσχευση (53). Ειδικότερα έχει αποδειχθεί ότι η προσθήκη της χρωστικής μειώνει κατά 50 % τον αριθμό των CD34 αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων, αποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα αυτά δεν είναι βιώσιμα (54). Ειδικότερα η προσθήκη της χρωστικής είναι σημαντική στην περίπτωση της επιλογής του κατάλληλου δείγματος ομφαλοπλακουντιακού αίματος για θεραπεία από μια τράπεζα ομφαλοπλακουντιακού αίματος ή ακόμη και στην περίπτωση που τα δείγματα καταψύχονται για τον έλεγχο της βιωσιμότητας τους μετά την απόψυξη (53,55,56). CD45 Εκφράζεται τυπικά σε όλα τα αιμοποιητικά κύτταρα σε υψηλά επίπεδα. Είναι γνωστός σαν δείκτης των λευκοκυττάρων. Η έκφραση του είναι μεγαλύτερη στο κλάσμα των λεμφοκυττάρων, ενώ είναι χαμηλότερη στα άλλα λευκοκύτταρα (

26 Παράγοντες που επηρεάζουν τον αριθμό των αιμοποιητικών κυττάρων σε ένα δείγμα ομφαλοπλακουντιακού αίματος Πολλοί παράγοντες επηρεάζουν τη συγκέντρωση των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων στο ομφαλοπλακουντιακό αίμα. Η ποσότητα των συνολικών εμπύρηνων κυττάρων (TNCs) φαίνεται να σχετίζεται με το επί τοις εκατό ποσοστό των CD34 αιμοποιητικών κυττάρων, ενώ συσχέτιση υπάρχει ακόμη ανάμεσα στον αριθμό των CD34 κύτταρων και του συνολικού όγκου αίματος καθώς και του συνολικού CD45 αριθμού κυττάρων (48,57). Είναι γνωστό ότι μεγαλύτερη ποσότητα ομφαλοπλακουντιακού αίματος συλλέγεται όταν η λήψη γίνεται ενώ ο πλακούντας βρίσκεται ακόμη μέσα στη μήτρα (58,59). Επιπλέον παράγοντες, όπως το μέγεθος του νεογνού αλλά και το βάρος του πλακούντα φαίνεται ότι σχετίζονται με τον αριθμό των βλαστοκυττάρων (59, 60). Επίσης ο μακρύτερος ομφάλιος λώρος, η καισαρική τομή και η ηλικία κύησης της μητέρας φαίνεται να σχετίζονται με τον όγκο του αίματος που συλλέγεται αλλά και τον αριθμό των βλαστοκυττάρων (60). Επίσης παρατεταμένο χρονικό διάστημα του πρώτου σταδίου του τοκετού έδειξε θετική συσχέτιση με τον αριθμό των εμπύρηνων κυττάρων και των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων (61). Επίσης παρατηρήθηκε θετική συσχέτιση της ηλικίας κύησης με τον όγκο του αίματος που συλλέγεται (62) και του αριθμού των CD34 αιμοποιητικών κυττάρων (48). Ο αριθμός των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων που περιέχει το ομφαλοπλακουντιακό αίμα είναι αντιστρόφως ανάλογος με την ηλικία κύησης (63) όμως η ποσότητα του αίματος που συλλέγεται είναι κατά κανόνα μεγαλύτερη στα τελειόμηνα νεογνά λόγω μεγαλύτερου βάρους τους αλλά και λόγω του μεγαλύτερου πλακούντα με αποτέλεσμα στα τελειόμηνα νεογνά να συλλέγεται συνολικά μεγαλύτερη ποσότητα βλαστοκυττάρων (60). Παρά το γεγονός ότι βρέθηκε μια γραμμική σχέση του αριθμού των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων και του αριθμού των εμπύρηνων λευκοκυττάρων, ωστόσο δείγματα με παρόμοιο αριθμό εμπύρηνων κυττάρων παρουσίασαν σημαντικές διαφορές (μερικές φορές και δεκαπλάσιο αριθμό) στον πληθυσμό των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων (37,63). Διάφορες εξηγήσεις δόθηκαν για το γεγονός αυτό. Υπάρχουν ενδείξεις ότι ο αριθμός των CD 34 αιμοποιητικών κυττάρων αν και είναι ένας αξιόπιστος δείκτης του αριθμού των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, ωστόσο είναι πολύ ετερογενής στη φύση. Από

27 26 την άλλη πλευρά αυτά τα ανομοιογενή αποτελέσματα μπορεί να αντανακλούν στην ευαισθησία των μεθόδων που χρησιμοποιούν οι διάφορες ερευνητικές ομάδες. Εκτός από την ηλικία κύησης, άλλοι παράγοντες που έχουν αναφερθεί ότι σχετίζονται με τον αριθμό των CD 34 αιμοποιητικών κυττάρων είναι το είδος του τοκετού (φυσιολογικός τοκετός ή καισαρική τομή), και η θέση του νεογνού μετά τον τοκετό (63,64). Ορισμένες μελέτες αναφέρουν ότι ο συνολικός αριθμός των αιμοποιητικών κυττάρων είναι μεγαλύτερος στις καισαρικές τομές λόγω του υψηλότερου όγκου δείγματος που συλλέγεται (65). Από την άλλη πλευρά σε άλλες μελέτες δεν παρατηρήθηκε καμία συσχέτιση των καισαρικών τομών με το συνολικό αριθμό των εμπύρηνων αλλά και των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων (48,62). Αν και έχουν πραγματοποιηθεί λίγες έρευνες σχετικά με την εθνικότητα των ατόμων και τον αριθμό των CD 34 αιμοποιητικών κυττάρων, έχει διαπιστωθεί ότι οι καυκάσιοι παρουσιάζουν μεγαλύτερο αριθμό αιμοποιητικών κυττάρων σε σχέση με τους λαούς της Αφρικής κα της Ασίας (48). Διαδικασίες, όπως η σύσφιγξη του ομφάλιου λώρου όσο γίνεται πιο κοντά στο σώμα του νεογνού για να επιτευχθεί μεγαλύτερο μήκος του λώρου καθώς και η συλλογή όσο γίνεται πιο γρήγορα μετά την έξοδο του κυήματος οδηγούν σε μεγαλύτερο όγκο συλλεγέντος αίματος (60). Επιπλέον έχει αναφερθεί ότι όσο μικρότερος είναι ο χρόνος που μεσολαβεί μεταξύ της λήψης του δείγματος και της επεξεργασίας του τόσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων (57). O Bertolini και η ερευνητική του ομάδα έδειξαν ότι όταν η σύσφιγξη του ομφάλιου λώρου γίνεται μέσα στα πρώτα 30 δευτερόλεπτα μετά την έξοδο του κυήματος συλλέγεται μεγαλύτερη ποσότητα αίματος αλλά αυτό έχει σαν αποτέλεσμα τα νεογνά να παρουσιάζουν χαμηλότερη αιμοσφαιρίνη τις πρώτες τέσσερις ημέρες της ζωής τους. Ειδικότερα το ποσό του αίματος κατά την πρώιμη σύσφιγξη ήταν 76 ± 22 ml έναντι 39 ±17 ml όταν ή σύσφιγξη γινόταν πιο αργά (χρονικό διάστημα άνω των 30 sec), ενώ η μέση τιμή αιμοσφαιρίνης των νεογνών ήταν 16± 1.1 έναντι 17± 1.3 στη όψιμη σύσφιγξη. (66). Η εργασία αυτή δημιούργησε πολλά ηθικά ερωτήματα σχετικά με το αν θα πρέπει να γίνεται η σύσφιγξη του ομφαλίου λώρου τόσο πρώιμα, ώστε να στερεί το νεογνό από τα δικά του κύτταρα (67). Ωστόσο ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (W.H.O), το 2007 ανακοίνωσε ότι η σύσφιγξη του ομφάλιου λώρου καλό θα είναι να μη γίνεται πολύ γρήγορα. Τα πράγματα περιπλέκονται ακόμη περισσότερο καθώς ερευνητές βρήκαν ότι η καθυστερημένη περίδεση αυξάνει

28 27 τα ποσοστά εμφάνισης ίκτερου των νεογνών κατά 2% (68). Από κει και πέρα το θέμα που πρέπει να εξεταστεί είναι οι κίνδυνοι που ενέχονται στη γέννηση παιδιών με λίγο χαμηλότερη αιμοσφαιρίνη ή παιδιών με εμφάνιση ίκτερου. Στην περίπτωση των πρώιμων νεογνών που γεννήθηκαν πριν από τις 37 εβδομάδες μια συστηματική μελέτη έδειξε ότι καθυστερημένη σύσφιγξη του ομφάλιου λώρου, λίγο μεγαλύτερη από 30 δευτερόλεπτα αποδεικνύεται πιο ασφαλής, καθώς σχετίζεται με χαμηλά ποσοστά μεταγγίσεων των νεογνών και εμφάνιση ενδοκοιλιακής αιμορραγίας (69) Αυτού του είδους οι μελέτες είναι πολύ σημαντικές καθώς συμβάλλουν στη λήψη και την αποθήκευση δειγμάτων με υψηλότερη ποιότητα τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν στο μέλλον με μεγαλύτερη ασφάλεια Κλινική σημασία της ποσότητας των CD34 αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων σε μια μονάδα ομφαλοπλακουντιακού αίματος Από τη στιγμή που το ομφαλοπλακουντιακό αίμα αποτελεί σημαντική πηγή αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων, που είναι εν δυνάμει ικανά να επιτύχουν την ανασύσταση του αιμοποιητικού συστήματος μια ακριβής ποσότητα βλαστικών κυττάρων είναι ζωτικής σημασίας. Πολλές έρευνες πραγματοποιούνται παγκοσμίως που έχουν σαν θέμα τη σύγκριση του ομφαλοπλακουντιακού αίματος με άλλες πηγές, κυρίως με το μυελό των οστών. Οι μελέτες αφορούν την αντίδραση μοσχεύματος έναντι του ξενιστή (GVHD), την ανασύσταση του αιμοποιητικού συστήματος, την επίδραση του μοσχεύματος ενάντια του όγκου, και την επιβίωση των ασθενών σε σχέση με την δόση των βλαστοκυττάρων που μεταμοσχεύονται και το βαθμό της ιστοσυμβατότητας. Χρησιμοποιούμενες δόσεις πάνω από 3.0 Χ10 7 TNCs/kg φαίνεται να αντισταθμίζουν τις αρνητικές συνέπειες ενός μη ταυτόσημου HLA αλληλόμορφου (70). Ο κίνδυνος ανάπτυξης χρόνιας και οξείας απόρριψης μοσχεύματος κατά του ξενιστή σε λήπτες με πάνω από δυο μη ταυτόσημα αλληλόμορφα είναι παρόμοιος με την περίπτωση λήψης δείγματος από τον μυελό των οστών από συμβατό δότη (71). Ωστόσο παρόλο που το ομφαλοπλακουντιακού αίμα είναι μια ιδανική πηγή για μεταμόσχευση και σε ενήλικους ασθενείς ο μικρός αριθμός αιμοποιητικών κυττάρων

29 28 που λαμβάνεται λόγω του περιορισμένου όγκου περιορίζει τη χρήση του. του αίματος που συλλέγεται Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα της χρήσης του ομφαλοπλακουντιακού αίματος έναντι άλλων πηγών. Πολλές έρευνες παγκοσμίως αναλύουν τα πλεονεκτήματα της χρήσης των ομφαλοπλακουντιακών μοσχευμάτων σε σύγκριση με άλλες πηγές, κυρίως με το μυελό των οστών. Καταρχήν το ομφαλοπλακουντιακό αίμα περιέχει μεγαλύτερο αριθμό αιμοποιητικών κυττάρων συγκριτικά με το περιφερικό αίμα και τον μυελό των οστών εξαιτίας της μετάθεσης της αιμοποίησης από το εμβρυϊκό ήπαρ στο μυελό των οστών κατά τη στιγμή της γέννησης. Αυτή η μετεγκατάσταση της αιμοποίησης μπορεί να οφείλεται για τις υψηλότερες πολλαπλασιαστικές ικανότητες των βλαστικών κυττάρων του ομφαλοπλακουντιακού αίματος (72,73). Επιπλέον στην περίπτωση των ομφαλοπλακουντιακών μοσχευμάτων ο χρόνος ανεύρεσης συμβατού δότη είναι πολύ λιγότερος. Μια έρευνα η οποία πραγματοποιήθηκε από ερευνητές του πανεπιστήμιου της Μινεσότα το 2004 ανέφερε ότι ο χρόνος εύρεσης μοσχεύματος είναι περίπου 13,5 μέρες για τον αίμα του ομφαλίου και 49 ημέρες στην περίπτωση του μυελού των οστών (74). Ο λιγότερος απαιτούμενος χρόνος παρατηρείται όχι μόνο στην περίπτωση των αυτόλογων μεταμοσχεύσεων όπου κάθε λήπτης έχει το δικό του μόσχευμα και δε χάνει πολύτιμο χρόνο για την αναζήτηση συμβατού δότη αλλά και στην περίπτωση των ετερόλογων μοσχευμάτων εξαιτίας του γεγονότος ότι τα μοσχεύματα του ομφαλίου λώρου δεν απαιτούν πλήρη ιστοσυμβατότητα. Ένα άλλο, λοιπόν σημαντικό πλεονέκτημα της χρήσης των ομφαλοπλακουντιακών μοσχευμάτων είναι ότι δεν είναι απαραίτητη η εύρεση πλήρους ιστοσυμβατού δότη για τη χρήση ενός μοσχεύματος. Οι περισσότερες κλινικές μελέτες χρησιμοποιούν μοσχεύματα στα οποία η ιστοσυμβατότητα μπορεί να είναι μέχρι και 50 % (δηλαδή τρεις ταυτόσημοι γονιδιακοί τόποι από τους 6). Και σε αυτές τις περιπτώσεις δεν παρατηρήθηκε αύξηση στην αντίδραση μοσχεύματος έναντι του ξενιστή (GVHD). Αυτή η ευελιξία που παρατηρείται με τα ομφαλοπλακουντιακά μοσχεύματα είναι πολύ σημαντική καθώς έτσι αυξάνεται ο

30 29 αριθμός των ατόμων που θα μπορούσαν να λάβουν κάποιο μόσχευμα. Αν και πολλές μελέτες αναφέρουν ότι όσο μεγαλύτερη είναι η συμβατότητα των ομφαλοπλακουντιακών μοσχευμάτων τόσο υψηλότερα είναι τα ποσοστά επιβίωσης, ωστόσο και δείγματα χωρίς πλήρη ιστοσυμβατότητα μπορεί να οδηγήσουν σε ικανοποιητικά αποτελέσματα χωρίς να αυξάνεται η αντίδραση μοσχεύματος έναντι του ξενιστή. Κάτι τέτοιο δεν παρατηρείται στην περίπτωση του μυελού των οστών και του περιφερικού αίματος (75,76). Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος του νεογνού είναι πολύ << νεαρά>> και γενικότερα το ανοσοποιητικό σύστημα του νεογνού είναι πιο ανώριμο σε σχέση με το ανοσοποιητικό σύστημα των ενηλίκων (77). Στις μεταμοσχεύσεις ομφαλοπλακουντιακού αίματος μεγαλύτερη σημασία έχει η συμβατότητα στα αλληλόμορφα HLA-A και HLA-B. Αντίθετα στην περίπτωση του μυελού των οστών κάθε μη ορολογική αντιστοιχία θεωρείται ότι είναι παράγοντας κινδύνου για μηεπιτυχή μεταμόσχευση (78). Το πιο βασικό μειονέκτημα της χρήσης ομφαλοπλακουντιακών μοσχευμάτων για θεραπεία είναι ότι η λήψη τους μπορεί να γίνει μόνο μια φορά κατά τη γέννηση. Επίσης η ποσότητα αίματος που λαμβάνεται με τις καθιερωμένες μεθόδους κυμαίνεται μεταξύ κάποιων ορίων, αλλά είναι συγκεκριμένη. Ο περιορισμός αυτός είναι ακόμη πιο σημαντικός στην περίπτωση των ατόμων που έχουν σπάνιους ΗLA απλότυπους κα χρειάζονται αυτόλογα μοσχεύματα. Ένα άλλο μειονέκτημα το οποίο παρατηρήθηκε σε συγκριτικές μελέτες μεταμόσχευσης ασθενών με μυελό των οστών και ομφαλοπλακουντιακό αίμα είναι ότι στην δεύτερη περίπτωση ο χρόνος της ανάκτησης των ουδετερόφιλων ήταν μεγαλύτερος. Ειδικότερα ο χρόνος ήταν μέρες στην περίπτωση της μεταμόσχευσης με ομφαλοπλακουντιακό μόσχευμα έναντι 18 ημερών για την περίπτωση των μοσχευμάτων από τον μυελό των οστών (79,80). Επίσης άλλες έρευνες επισημαίνουν το ποσοστό επιβίωσης δυο χρόνια μετά τη λήψη βλαστοκυττάρων το οποίο σε συγκεκριμένη μελέτη ήταν 36 % για το ομφαλοπλακουντιακό αίμα και 42 % για το μυελό των οστών (81). Πρέπει να επισημανθεί όμως ότι όλες οι μελέτες αφορούν ετερόλογα μοσχεύματα, όπου οι ασθενείς ειδικότερα στην περίπτωση των ομφαλοπλακουντιακών μοσχευμάτων κατά κανόνα λαμβάνουν μερικώς ιστοσυμβατά μοσχεύματα και επιπλέον λαμβάνουν χαμηλότερη δόση βλαστικών κυττάρων. Ειδικότερα επισημαίνεται ότι η ανάκτηση των ουδετερόφιλων αλλά και των αιμοποπεταλίων εξαρτάται από την ποσότητα της

31 30 χορηγούμενης δόσης βλαστοκυττάρων (82,83). Η χορηγούμενη δόση στις περισσότερες μελέτες, λόγω του συγκεκριμένου όγκου αίματος που έχει ληφθεί είναι 1.7Χ10 5 CD34/kg ή 2.5Χ10 7 εμπύρηνα λευκά αιμοσφαίρια/kg βάρους σώματος (84). Η δόση αυτή είναι μέχρι και 100 φορές μικρότερη σε σύγκριση με μεταμοσχεύσεις δειγμάτων μυελού των οστών. Γι α αυτό το λόγο και οι μεταμοσχεύσεις που πραγματοποιήθηκαν αρχικά με δείγματα ομφαλοπλακουντιακού αίματος αφορούσαν μικρά παιδιά, βάρους κάτω από 50 kg. Οι ανωτέρω μελέτες αποδεικνύουν ότι ο σημαντικότερος παράγοντας για μια επιτυχή μεταμόσχευση με τη χρήση των ομφαλοπλακουντιακών μοσχευμάτων είναι ο αριθμός των βλαστοκυττάρων και η χορηγούμενη δόση Μεταμόσχευση διπλών ομφαλοπλακουντιακών μονάδων Από τη στιγμή που ο σημαντικότερος παράγοντας για μια επιτυχή μεταμόσχευση με ομφαλοπλακουντιακό μόσχευμα είναι η χορηγούμενη δόση και από τη στιγμή που ο αριθμός των βλαστοκυττάρων ενός μοσχεύματος αυξάνεται με τον όγκο αίματος διάφορες ερευνητικές ομάδες προσπάθησαν να αντιμετωπίσουν το πρόβλημα αυτό με τη χρήση ταυτόχρονα δυο ομφαλοπλακουντιακών μονάδων για μεταμόσχευση. Το 2005 ο Barker και οι συν., παρουσίασαν τη μεγαλύτερη έρευνα που αφορούσε την κλινική μελέτη ασθενών που έλαβαν διπλά ομφαλοπλακουντιακά μοσχεύματα (84). Η μελέτη αφορούσε 23 ασθενείς ηλικίας οι οποίοι έπασχαν από λευχαιμία και οι οποίοι υπεβλήθησαν σε διπλή μεταμόσχευση (χρησιμοποιούμενη δόση 3.5 Χ 10 7 /kg). Οι περισσότεροι ασθενείς έλαβαν μοσχεύματα τα οποία ήταν μερικώς συμβατά (ταυτόσημοι 4 γονιδιακοί τόποι) και μόνο δυο ασθενείς έλαβαν πλήρως ιστοσυμβατά μοσχεύματα (ταυτόσημοι 6 γονιδιακοί τόποι). Τα αποτελέσματα ήταν θετικά αν και τα ποσοστά της οξείας απόρριψης μοσχεύματος ήταν 13 % ενώ της χρόνιας ήταν 23 %. Σε μια άλλη μελέτη διαπιστώθηκε ότι αν και το χρονικό διάστημα ελεύθερο νόσου ήταν μεγαλύτερο με τη χρήση διπλών ομφαλοπλακουντιακών μοσχευμάτων τα ποσοστά οξείας απόρριψης ήταν μεγαλύτερα (85). Αν και οι μελέτες που έχουν γίνει με τη χρήση διπλών μοσχευμάτων είναι περιορισμένες οι περισσότερες ερευνητικές ομάδες συμφωνούν ότι παρά τα όποια μειονεκτήματα της χρήσης διπλών μοσχευμάτων η

32 31 μέθοδος μπορεί να εφαρμοστεί στην περίπτωση ενήλικων ασθενών, όπου το βάρος τους είναι τέτοιο ώστε μια ομφαλοπλακουντιακή μονάδα δεν επαρκεί (86) Μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα Τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα εντοπίστηκαν για πρώτη φορά στο στρώμα του μυελού των οστών ως κύτταρα τα οποία έχουν την ικανότητα να προσκολλώνται σε πλαστικές επιφάνειες, έχουν την ικανότητα να σχηματίζουν αποικίες με μορφή ινοβλαστών και είναι δυνητικά ικανά για οστεογένεση. Από τότε τα μεσεγχυματικά κύτταρα του μυελού των οστών έχουν οριστεί ως μη αιμοποιητικά αδιαφοροποίητα κύτταρα τα οποία είναι πολυδύναμα και έχουν την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε τρεις το λιγότερο κυτταρικές σειρές οι οποίες προέρχονται από το μεσόδερμα (οστεοβλάστες, χονδροβλάστες και λιποκύτταρα). Τα κύτταρα αυτά αντιπροσωπεύουν το % των κυττάρων του μυελού των οστών και ειδικότερα έχει βρεθεί ότι ο αριθμός του μειώνεται όσο αυξάνεται η ηλικία του ατόμου (87-89). Το μικρό ποσοστό εμφάνισης των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων στο μυελό των οστών καθώς και οι επεμβατικές μέθοδοι που ακολουθούνται για τη λήψη τους οδήγησε στην αναζήτηση εναλλακτικών πηγών. Μια εναλλακτική πηγή αποτελεί το αίμα του ομφάλιου λώρου, το οποίο λαμβάνεται με μια λιγότερο επεμβατική μέθοδο. Ωστόσο αντικρουόμενα παραμένουν τα αποτελέσματα μεταξύ των ερευνητών καθώς κάποιες ερευνητικές ομάδες κατάφεραν να απομονώσουν μεσεγχυματικά κύτταρα από το αίμα του ομφάλιου λώρου (90-91) και κάποιες όχι (92-93). Το ποσοστό απομόνωσης μεσεγχυματικών κυττάρων από το αίμα του ομφάλιου λώρου κυμαίνεται από 30 % μέχρι 63 % σε φρέσκα δείγματα ομφαλίου λώρου, ενώ μειώνεται στο 19.5 % σε δείγματα τα οποία έχουν καταψυχθεί (90). Ο ιστός του ομφάλιου λώρου και του πλακούντα φαίνεται ότι αποτελεί σημαντική πηγή πρόδρομων μεσεγχυματικών κυττάρων.

33 Κριτήρια για αποτελεσματική απομόνωση των μεσεγχυματικών κυττάρων από το αίμα του ομφαλίου λώρου. Ερευνητές διαπίστωσαν ότι μόνο καλής ποιότητας δείγματα περιέχουν ικανό αριθμό μεσεγχυματικών κυττάρων. Ειδικότερα βρέθηκε θετική συσχέτιση του όγκου του ομφαλοπλακουντιακού αίματος με τον αριθμό των μεσεγχυματικών κυττάρων. Οι ερευνητές σαν ελάχιστο όγκο αίματος θεώρησαν στην μελέτη τους τα 33 ml. Επιπλέον δείγματα με αιμόλυση ή δείγματα με πήγματα αίματος δεν είχαν μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα. Καθοριστικός παράγοντας για την επιτυχή απομόνωση αποτελεί και η άμεση επεξεργασία του δείγματος. Δείγματα που επεξεργάζονται μέσα στο πρώτο δεκαπεντάωρο από την παραλαβή έχουν περισσότερα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα. Εφόσον τηρούνται οι παραπάνω προϋποθέσεις τριπλασιάζεται το ποσοστό επιτυχούς απομόνωσης βλαστικών κυττάρων από το ομφαλοπλακουντιακό αίμα (90) Ανοσοφαινότυπος των μεσεγχυματικών κυττάρων Το 2006 η Διεθνής Εταιρεία Κυτταρικής Θεραπείας (ISCT- International Society of Cellular Therapy) προσπάθησε να αποσαφηνίσει τον χαρακτηρισμό μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα. Πρόκειται για πρόδρομα κύτταρα, με ικανότητα προσκόλλησης σε πλαστικές επιφάνειες, μορφή ινοβλαστών τα οποία μπορούν να διαφοροποιηθούν σε όλες τις κυτταρικές σειρές που προέρχονται από το μεσόδερμα. Είναι επιπλέον θετικά σε μεσεγχυματικούς δείκτες όπως CD90, CD105, CD29, CD44, CD13, CD70, HLA-ABC, και αρνητικά στα αντισώματα CD34, CD45, CD14, CD11b και HLA-DR (41). Παρακάτω αναλύονται μερικοί από τους βασικούς δείκτες των μεσεγχυματικών κυττάρων. CD29 Αποτελεί τον υποδοχέα της φιμπρονεκτίνης και ανήκει στην οικογένεια των ιντεγκρινών. Οι ιντεγκρίνες αποτελούν υποδοχείς μεμβρανών που παίζουν σημαντικό ρόλο στην προσκόλληση και αναγνώριση των κυττάρων συμμετέχοντας σε σημαντικές διαδικασίες, όπως η εμβρυογένεση, η αιμόσταση, η ανοσολογική

34 33 απάντηση επανόρθωση και αναγέννηση των ιστών. Ανάλυση με κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα εκφράζουν τον δείκτη αυτό (94-97) CD90 Ανήκει στην υπεροικογένεια των Ig γλυκοπρωτεϊνών (Thy-1) αποτελεί μόριο προσκόλλησης (98,99). Το CD90 αντίσωμα εκφράζεται στα μεσεγχυματικά κύτταρα στους συνδετικούς ιστούς σε ινοβλάστες καθώς και σε αιμοποιητικά κύτταρα και νευρώνες διαφόρων ειδών. Στον άνθρωπο το αντίσωμα αυτό εκφράζεται σε ένα πολύ μικρό ποσοστό στα εμβρυϊκά θυμοκύτταρα και σε ποσοστό10-40% των CD34 κυττάρων του μυελού των οστών και σε λιγότερο από 1 % των λεμφοκυττάρων του περιφερικού αίματος (99). CD105 Ανήκει στην υπεροικογένεια των γλυκοπρωτεϊνών. Εκφράζεται κυρίως στα ενδοθηλιακά κύτταρα, στα χονδροκύτταρα και στα συγκυτιακά κύτταρα του πλακούντα. Εκφράζεται επίσης από τα ενεργοποιημένα μονοκύτταρα και από τα μεσεγχυματικά κύτταρα. Έχει βρεθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην αγγειογένεση και στην επανόρθωση των ιστών (100). CD 44 Το CD44 έχει αποδειχθεί σε πολλές μελέτες ότι εκφράζεται στα ανθρώπινα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα (95-97). Παίζει σημαντικό ρόλο στην προσκόλληση των λευκοκυττάρων καθώς και στη μεταφορά των λευκοκυττάρων σε σημεία φλεγμονής. Παίζει επίσης ρόλο και στην ενεργοποίηση των Τ-κυττάρων. STRO-1 Το Stro-1 αντίσωμα χαρακτηρίζει τις αποικίες των μεσεγχυματικών κυττάρων και επομένως είναι ένας σημαντικός δείκτης των πρόδρομων πολυδύναμων μεσεγχυματικών κυττάρων. Θετικά κύτταρα στο αντίσωμα προερχόμενα από το μυελό των οστών έχουν την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε διάφορους κυτταρικούς τύπους (101) και μελέτες έχουν δείξει ότι οι λειτουργίες των

35 34 μεσεγχυματικών κυττάρων εξαρτώνται από την έκφραση του Stro-1 αντισώματος Κύτταρα τα οποία είναι θετικά στο αντίσωμα παίζουν και υποστηρικτικό ρόλο στην αιμοποίηση. (102). Στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 2) παρουσιάζονται οι κυριότεροι επιφανειακοί δείκτες που χαρακτηρίζουν τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα του ομφάλιου λώρου. Πίνακας 2. Επιφανειακοί δείκτες που χαρακτηρίζουν τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα του ομφάλιου λώρου.

36 Χρήσεις βλαστικών κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος για τη θεραπεία μη-αιματολογικών ασθενειών Αυτοάνοσα νοσήματα Ήδη από το 2006 δημοσιεύτηκαν νέα πεδία εφαρμογών των βλαστικών κυττάρων από το European Group for Blood and Marrow. Στις εφαρμογές αυτές περιλαμβάνεται πλέον και το αίμα του ομφαλίου λώρου, μαζί με τον μυελό των οστών στο πρόγραμμα των αυτόλογων και αλλογενών μεταμοσχεύσεων. Στις νέες θεραπείες έχουν προστεθεί τα αυτοάνοσα νοσήματα για αυτόλογη μεταμόσχευση και η θεραπεία κακοηθών όγκων. Κλινικές μελέτες στις οποίες χρησιμοποιούνται μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα αφορούν τη ρευματοειδή αρθρίτιδα, τον ερυθηματώδη λύκο, την πολλαπλή σκλήρυνση. Μεταμόσχευση βλαστοκυττάρων από τον πλακούντα βελτίωσε τη νεφρίτιδα σε πειραματικό μοντέλο με ερυθηματώδη λύκο (103). Κλινική μελέτη σε ασθενείς με ερυθηματώδη λύκο, ανθεκτικό στην καθιερωμένη θεραπεία παρουσίασαν βελτίωση των κλινικών συμπτωμάτων τους αλλά και των εργαστηριακών κα βιοχημικών τους εξετάσεων. Θεραπεία του ινσουλινοεξαρτώμενου διαβήτη τύπου Ι Η αυτόλογη χρήση βλαστοκυττάρων για τη θεραπεία του ινσουλινοεξαρτώμενου διαβήτη (διαβήτης τύπου Ι) βρίσκεται ήδη σε κλινικές δοκιμές από το 2008 (104). Μέχρι σήμερα 23 παιδιά έχουν θεραπευθεί, ενώ το πρώτο παιδί στο οποίο εφαρμόστηκε το πρωτόκολλο της χρήσης των βλαστοκυττάρων ήταν σε θέση να παράγει ινσουλίνη για περισσότερο χρονικό διάστημα σε σχέση με παιδιά ίδιας πρόγνωσης. Τα περισσότερα από τα παιδιά ανέφεραν καλύτερο έλεγχο και διαχείριση της γλυκόζης του αίματος καθώς και διατήρηση της ενδογενούς ινσουλίνης, όπως φαίνεται από την έκκριση του πεπτιδίου C. Θεραπεία εγκεφαλικής παράλυσης Μια πολλά υποσχόμενη κλινική έρευνα πραγματοποιείται τα τελευταία χρόνια στο Πανεπιστήμιο Dukes, στην Καλιφόρνια. Σύμφωνα με επίσημα στοιχεία κάθε χρόνο παιδιά διαγιγνώσκόνται με εγκεφαλική παράλυση ( Οι ερευνητές χορηγούν αυτόλογα βλαστοκύτταρα ομφαλοπλακουντιακού αίματος σε παιδιά με εγκεφαλική παράλυση,

37 36 που είχαν αποθηκεύσει τα βλαστοκύτταρα τους κατά τη στιγμή της γέννησης. Τα αποτελέσματα είναι πολύ θετικά και τα ποσοστά βελτίωσης και οι προκλινικές μελέτες που πραγματοποιούνται δίνουν πολύ ενθαρρυντικά αποτελέσματα. Άλλη μια κλινική μελέτη πραγματοποιείται από ερευνητές στην Ευρώπη. Φαίνεται ότι όσο πιο νωρίς γίνει η χορήγηση τόσο πιο θεαματικά είναι τα αποτελέσματα (C. McGuckin, Novussanguis Foundation, Paris, France, May 2008, personal communication). Κρανιοεγκεφαλικές κακώσεις Στο πανεπιστήμιο του Τexas εφαρμόζεται κλινική δοκιμή εγκεκριμένη από τον FDA για τη θεραπεία παιδιών με κρανιοεγκεφαλικές κακώσεις με τη χρήση αυτόλογων βλαστοκυττάρων από το ομφαλοπλακουντιακό αίμα (C.S. Cox and J.E. Baumgartner, 2008, UT Health Sciences Center, Houston, Texas, personal communication). Τα επιτυχή αποτελέσματα που πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση αυτόλογων βλαστοκυττάρων από τον μυελό των οστών αποδεικνύουν την αποτελεσματικότητα των βλαστοκυττάρων σε κρανιοεγκεφαλικές κακώσεις (105).

38 37 3. Ο ΠΛΑΚΟΥΝΤΑΣ 3.1 Γενικά χαρακτηριστικά Ο πλακούντας είναι η πρωταρχική θέση ανταλλαγής θρεπτικών ουσιών και αερίων μεταξύ της μητέρας κα του εμβρύου. Είναι ένα εμβρυομητρικό όργανο το οποίο αποτελείται από δυο μοίρες : Την εμβρυϊκή μοίρα, που προέρχεται από τον χοριακό σάκο Την μητρική μοίρα που προέρχεται από το ενδομήτριο Ο πλακούντας και οι μεμβράνες του εμβρύου αποβάλλονται από την μήτρα μετά τον τοκετό. Ο πλακούντας έχει συνήθως δισκοειδές σχήμα, διάμετρο εκ. και πάχος 2-3 έκ. Ζυγίζει γρ., το ένα έκτο περίπου του βάρους ενός μέσου εμβρύου. Το σχήμα του πλακούντα καθορίζεται από την περιοχή των λαχνών, η οποία είναι συνήθως κυκλική και προσδίδει στον πλακούντα δισκοειδές σχήμα. Καθώς οι χοριακές λάχνες εισχωρούν στο βασικό φθαρτό, ο φθαρτικός ιστός εκφυλίζεται και διευρύνεται ο μεσολάχνιος χώρος. Η διάβρωση αυτή δημιουργεί αρκετές, σφηνοειδούς σχήματος, περιοχές φθαρτού, τα φθαρτικά διαφραγμάτια, τα οποία προεκβάλλουν προς το χοριακό πέταλο. Τα πλακουντιακά διαφράγματα διαιρούν το εμβρυϊκό τμήμα του πλακούντα σε ακανόνιστες περιοχές τις κοτυληδόνες. Κάθε κοτυληδόνα αποτελείται από δυο ή περισσότερες στελεχιαίες λάχνες και τις πολλαπλές διακλαδώσεις τους. Η μητρική επιφάνεια του πλακούντα Η χαρακτηριστική, υπό μορφή λιθόστρωτου, εμφάνιση της μητρικής επιφάνειας του πλακούντα, οφείλεται στην ελαφρά προβολή των περιοχών των λαχνών-των κοτυληδόνων-οι οποίες χωρίζονται μεταξύ τους με αύλακες που καταλαμβάνονται από τα πλακουντιακά διαφραγμάτια (Εικόνα 3). Η επιφάνεια των κοτυληδόνων καλύπτεται από μια λεπτή, γκρίζου χρώματος στιβάδα βασικού φθαρτού, η οποία αποχωρίζεται από το τοίχωμα της μήτρας κατά την αποβολή του πλακούντα.

39 38 Εμβρυϊκή επιφάνεια του πλακούντα Ο ομφάλιος λώρος προσφύεται συνήθως στην εμβρυϊκή επιφάνεια του πλακούντα και το επιθήλιο του αποτελεί συνέχεια του αμνίου, που καλύπτει την επιφάνεια αυτή (Εικόνα 2). Η εμβρυϊκή επιφάνεια του πλακούντα είναι λεία και στίλβουσα, επειδή καλύπτεται από το αμνίο. Τα χοριακά αγγεία που εξορμώνται από τον ομφάλιο λώρο και καταλήγουν σ αυτόν διακρίνονται ευκρινώς διαμέσου του διαφανούς αμνίου. Τα ομφαλικά αγγεία διακλαδίζονται στην εμβρυϊκή επιφάνεια και σχηματίζουν τα χοριακά, τα οποία εισχωρούν στις λάχνες και σχηματίζουν το αρτηριοτριχοειδικό-φλεβικό σύστημα των λαχνών. Το εμβρυϊκό τμήμα του πλακούντα συνδέεται με το μητρικό (βασικός φθαρτός), με το κυτταροτροφοβλαστικό έλυτρο. Οι χοριακές λάχνες προσφύονται στερεά διαμέσου του κυτταροτροφοβλαστικού ελύτρου, στο βασικό φθαρτό, τον οποίο συνδέουν με το χοριακό σάκο. Οι αρτηρίες και οι φλέβες του ενδομητρίου περνούν ελεύθερα από χάσματα του κυτταροτροφοβλαστικού ελύτρου και εκβάλλουν στο μεσολάχνιο χώρο.

40 Εικόνα 2. Πλακούντες και εμβρυϊκές μεμβράνες μετά τη γέννηση. Α. Μητρική επιφάνεια με τις κοτυληδόνες και τις αύλακες γύρω από αυτές. Κάθε κοτυληδόνα αποτελείται από έναν αριθμό κύριων στελεχιαίων λαχνών και τις διακλαδώσεις τους. Β. Εμβρυϊκή επιφάνεια με τα αιμοφόρα αγγεία, που διατρέχουν το χοριακό πέταλο και συγκλίνουν για να σχηματίσουν τα ομφαλικά αγγεία στο σημείο πρόσφυσης του ομφάλιου λώρου (Moore KL, Persaud TVN, Shiota K: Color Atlas Of Clinical Embryology, 2 nd ed. Philadelphia, WB Saunders 2000). 39

41 Πλακουντιακή κυκλοφορία Οι διακλαδώσεις των χοριακών λαχνών δημιουργούν μια μεγάλη επιφάνεια κατά μήκος της οποίας γίνεται ανταλλαγή ουσιών διαμέσου της πολύ λεπτής πλακουντιακής μεμβράνης που παρεμβάλλεται μεταξύ της εμβρυϊκής και μητρικής κυκλοφορίας Εμβρυοπλακουντική Κυκλοφορία Μη οξυγονωμένο αίμα εγκαταλείπει το έμβρυο και φθάνει στον πλακούντα διαμέσου των ομφαλικών αρτηριών. Στο σημείο πρόσφυσης του ομφαλίου λώρου στον πλακούντα, οι αρτηρίες αυτές διαιρούνται σε αρκετές ακτινοειδώς διαταγμένες, χοριακές αρτηρίες, οι οποίες διακλαδίζονται ελεύθερα μέσα στο χοριακό πέταλο πριν εισχωρήσουν στις χοριακές λάχνες (Εικόνα 4). Τα αιμοφόρα αυτά αγγεία σχηματίζουν ένα εκτεταμένο αρτηριο-τριχοειδο-φλεβικό σύστημα κατά μήκος των χοριακών λαχνών, το οποίο μεταφέρει το εμβρυϊκό αίμα πολύ κοντά στο μητρικό και δημιουργεί μια πολύ μεγάλη επιφάνεια για την ανταλλαγή ουσιών-αερίων μεταξύ εμβρυϊκής και μητρικής κυκλοφορίας. Φυσιολογικά δεν υπάρχει ανάμειξη μεταξύ των δυο κυκλοφοριών. Εντούτοις μικρές ποσότητες εμβρυϊκού αίματος μπορούν να εισχωρήσουν στην μητρική κυκλοφορία όταν υπάρχουν χάσματα στην πλακουντιακή μεμβράνη. Το καλά οξυγονωμένο αίμα των εμβρυϊκών τριχοειδών περνά σε λεπτοτοιχωματικές φλέβες που ακολουθούν τις χοριακές αρτηρίες μέχρι τη θέση πρόσφυσης του ομφάλιου λώρου όπου και συμβάλλουν στο σχηματισμό της ομφαλικής φλέβας. Το μεγάλο αυτό αγγείο επαναφέρει το αίμα εμπλουτισμένο με οξυγόνο στο σώμα του εμβρύου (Εικόνα 4) Μητροπλακούντια κυκλοφορία Το μητρικό αίμα στο μεσολάχνιο χώρο βρίσκεται παροδικά έξω από το κυκλοφορικό σύστημα της μητέρας. Εισέρχεται με ελικοειδείς αρτηρίες του ενδομητρίου, οι οποίες εκβάλλουν στο μεσολάχνιο χώρο δια μέσου χασμάτων των κυτταροτροφοβλαστικών ελύτρων. Το αίμα κυλάει αργά πάνω από τις δευτερεύουσες λάχνες επιτρέποντας την ανταλλαγή ουσιών και αερίων με το εμβρυϊκό αίμα και επιστρέφει τελικά στην μητρική κυκλοφορία χωρίς να γίνεται ανάμειξη με το εμβρυϊκό αίμα.

42 Πλακουντιακή μεμβράνη Η πλακουντιακή μεμβράνη είναι μια σύνθετη δομή, η οποία αποτελείται από εξωεμβρυϊκούς ιστούς που διαχωρίζουν την μητρική από την εμβρυϊκή κυκλοφορία. Μέχρι την εικοστή περίπου εβδομάδα, αποτελείται από τέσσερις στιβάδες, τη συγκυτιοτροφοβλάτη, την κυτταροτροφοβλάστη, τον συνδετικό ιστό της λάχνης και το ενδοθήλιο των εμβρυϊκών τριχοειδών. Μετά την εικοστή εβδομάδα, οι ιστολογικές μεταβολές της κυτταροτροφοβλάστης έχουν σαν αποτέλεσμα την λέπτυνση πολλών δευτερευουσών λαχνών. Τελικά τα κυτταροτροφοβλαστικά έλυτρα εξαφανίζονται από πολλές περιοχές των λαχνών με αποτέλεσμα η πλακουντιακή μεμβράνη να αποτελείται από τρεις στιβάδες (106) (Εικόνα 3).

43 42 Εικόνα 3. Σχηματική απεικόνιση εγκάρσιας διατομής ώριμου πλακούντα στην οποία φαίνεται i) η σχέση του λαχνωτού χορίου (εμβρυϊκή επιφάνεια με το βασικό φθαρτό (μητρική επιφάνεια) ii) η εμβρυοπλακουντιακή κυκλοφορία, iii) η μητροπλακουντιακή κυκλοφορία. Το εμβρυϊκό αίμα ρέει στον μεσολάχνιο χώρο υπό μορφή πιδάκων από τις ελικοειδείς αρτηρίες του ενδομητρίου και ανταλλάσσει στοιχεία με το εμβρυϊκό αίμα καθώς διέρχεται από τις διακλαδώσεις των στελεχιαίων λαχνών χωρίς να γίνεται ανάμειξη των δυο κυκλοφοριών. (107). 3.3 Εμβρυολογία του πλακούντα και του ομφάλιου λώρου. Τα υπερπολυδύναμα εμβρυϊκά κύτταρα από τα οποία προκύπτουν όλα τα σωματικά και γεννητικά κύτταρα ολόκληρου του οργανισμού εμφανίζονται αμέσως μετά τη διαίρεση του ζυγωτού. Αυτή η ικανότητα διατηρείται στο έμβρυο πριν από την εμφύτευση και στη συνέχεια στο στάδιο της βλαστοκύστης τα κύτταρα αρχίζουν να προορίζονται για συγκεκριμένους ιστούς. Τα βλαστικά κύτταρα στο στάδιο της βλαστοκύστης είναι πολυδύναμα και μπορούν να σχηματίσουν διαφορετικούς κυτταρικούς πληθυσμούς Στα θηλαστικά ο ομφάλιος λώρος και το μεσόδερμα της εμβρυϊκής επιφάνειας του πλακούντα προέρχονται από την αλλαντοϊδα. Η αλλαντοϊδα σχηματίζεται κατά την 16 η μέρα. Παραμένει πολύ μικρή στα ανθρώπινα έμβρυα αλλά το αλλαντοϊκό μεσόδερμα επεκτείνεται κάτω από το χόριο και μέσα σε αυτό σχηματίζοντας αιμοφόρα αγγεία τα οποία εξυπηρετούν τις λειτουργίες του πλακούντα. Τα αγγεία αυτά εξελίσσονται στις ομφαλικές αρτηρίες. Αντίθετα το αμνίο και το χόριο προέρχονται από το έμβρυο. Ειδικότερα το χόριο προέρχεται από την τροφοβλάστη και το αμνίο από την επιβλάστη κατά την 8 η μέρα μετά τη γονιμοποίηση. Η γαστριδίωση ολοκληρώνεται κατά την τρίτη εβδομάδα και έχει σαν αποτέλεσμα τον σχηματισμό των τριών βλαστικών δερμάτων, εξώδερμα, ενδόδερμα και μεσόδερμα. Τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα παρατηρούνται αρχικά στον λεκιθικό ασκό. Καθώς ο πλακούντας αναπτύσσεται τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα μεταναστεύουν στο εμβρυϊκό ήπαρ μέσω των ομφαλικών αγγείων και στη συνέχεια επιστρέφουν μέσω των ομφαλικών αγγείων για να εγκατασταθούν στον μυελό των οστών. Λόγω της ταυτόχρονης ανάπτυξης των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων με την ανάπτυξη του πλακούντα, του ομφάλιου λώρου του αμνίου και των ομφαλικών φλεβών τα

44 43 αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα φαίνεται να διατηρούν μερικά από τα χαρακτηριστικά των πολυδύναμων κυττάρων της επιβλάστης. Αυτά τα αρχέγονα κύτταρα εγκλωβίζονται μέσα στη γέλη του Wharton και στο σώμα του αρχέγονου ομφάλιου λώρου και ανιχνεύονται κατά τη γέννηση στο ομφαλοπλακουντιακό αίμα, στην ουσία του Wharton, στην ομφαλική φλέβα, στους ιστούς του πλακούντα και στο αμνιακό υγρό. Σε αυτά τα πολυδύναμα κύτταρα με ιδιότητες αρχέγονων κυττάρων συμπεριλαμβάνονται τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα από την ουσία του Wharton,τα αμνιακά επιθηλιακά κύτταρα, και τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα από τους ιστούς του πλακούντα και το αμνιακό υγρό. (108) (Εικόνα 4). Εικόνα 4. Ανάπτυξη αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων.

45 Βλαστοκύτταρα που απομονώνονται από τον πλακόυντα Από τον πλακούντα έχουν απομονωθεί τρεις διαφορετικοί τύποι βλαστικών κυττάρων : Αμνιακά επιθηλιακά κύτταρα Αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα Μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα Αμνιακά Επιθηλιακά Κύτταρα Τα αμνιακά επιθηλιακά κύτταρα απομονώνονται από την αμνιακή μεμβράνη που περιβάλλει την εμβρυϊκή επιφάνεια του πλακούντα. Τα κύτταρα αυτά εκφράζουν δείκτες βλαστικών κυττάρων και μπορούν να διαφοροποιηθούν σε κυτταρικούς πληθυσμούς και των τριών βλαστικών δερμάτων. Έχει αποδειχθεί ότι τα κύτταρα που απομονώνονται από την αμνιακή μεμβράνη του πλακούντα εκφράζουν δείκτες εμβρυϊκών κυττάρων, όπως OCT-4, SRY, SOX-2, Nanog. (109). Αμνιακά επιθηλιακά κύτταρα έχουν διαφοροποιηθεί σε παγκρεατικά και ηπατικά κύτταρα ( ) Αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα από τον πλακούντα Είναι γνωστό ότι ο πλακούντας αποτελεί πηγή αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων. Πρόσφατα αποδείχθηκε ότι ο εμβρυϊκός πλακούντας αποτελεί και αιμοποιητικό όργανο. O Alvarez-Silva και η ερευνητική ομάδα το 2003 έδειξαν ότι ο πλακούντας επιμύων περιέχει πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα πριν λάβει χώρα η αιμοποίηση στο εμβρυϊκό ήπαρ (113). Στη συνέχεια οι Gekas και η ερευνητική του ομάδα απέδειξαν ότι οι μέσης κύησης πλακούντες περιέχουν έναν πολύ μεγάλο αριθμό πρόδρομων αιμοποιητικών κυττάρων που έχουν την ικανότητα να πολλαπλασιάζονται (114). Αυτές οι πρώτες έρευνες απέδειξαν ότι ο πλακούντας αποτελεί ένα ακόμη όργανο όπου λαμβάνει χώρα η αιμοποίηση εκτός από τον λεκιθικό ασκό και το εμβρυϊκό ήπαρ. Ο λεκιθικός ασκός είναι το πρώτο σημείο όπου λαμβάνει χώρα η αιμοποίηση (115). Πρόσφατα ερευνητές μελέτησαν την αιμοποιητική δραστηριότητα σε ανθρώπινους πλακούντες και διαπίστωσαν ότι πλακούντες πρώτου, δευτέρου και τρίτου σταδίου κύησης περιέχουν πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα, τα οποία είναι εμβρυϊκής προέλευσης. Ειδικότερα ο αριθμός

46 45 αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων CD34 +, CD45 low, αυξάνεται κατά τη διάρκεια της κύησης καθώς αυξάνεται το βάρος του πλακούντα (116). Ο πλακούντας περιέχει πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα, που μπορούν να διαφοροποιηθούν σε αιμοποιητικά κύτταρα της ερυθράς, της μυελικής σειράς. Επιπλέον ερευνητές έδειξαν ότι ο πλακούντας πειραματόζωων περιέχει αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα τα οποία είναι εμβρυϊκής προέλευσης (117) Μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα από τον πλακούντα Τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα μπορούν να απομονωθούν από το αμνίο αλλά και από το χόριο και θεωρείται ότι προέρχονται από το εμβρυϊκό μεσόδερμα (107). Μεσεγχυματικού τύπου βλαστοκύτταρα έχουν απομονωθεί από πρώτου και τρίτου τριμήνου μεσόδερμα (118,119). Η απομόνωση γίνεται με τη χρήση διαφόρων ενζύμων, όπως κολλαγεννάση, δισπάση, τρυψίνη με τα οποία επιτυγχάνεται η ενζυματική πέψη του ιστού. Ειδικότερα από το χόριο η απομόνωση έχει επιτευχθεί μετά από ενζυματική πέψη της επιφάνειας της τροφοβλάστης (120) ή της χοριακής λάχνης (121). Τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα από τους ιστούς του πλακούντα έχουν διαφοροποιηθεί και στους τρεις κυτταρικούς πληθυσμούς που προέρχονται από το μεσόδερμα (οστίτη, χόνδρό και λιπώδη ιστό), (120, 122), ενώ έχει αναφερθεί και διαφοροποίηση των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων που προέρχονται από το αμνίο σε κυτταρικούς πληθυσμούς και των τριών βλαστικών δερμάτων (123,124).

47 Κλινικές μελέτες με βλαστοκύτταρα του πλακούντα Οι περισσότερες κλινικές μελέτες λαμβάνουν χώρα με τη χρήση μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από τους ιστούς του πλακούντα που απομονώνονται με την χρήση ειδικών ενζύμων για την ενζυματική πέψη του ιστού. Αναγέννηση ηπατικού ιστού Η μεταμόσχευση ηπατοκυττάρων για τη θεραπεία ασθενειών του ήπατος αποτελεί μια νέα θεραπευτική προσέγγιση για τη θεραπεία ασθενειών του ήπατος, η οποία όμως περιορίζεται από την έλλειψη των κατάλληλων ηπατοκυττάρων για μεταμόσχευση (125) Η διαφοροποίηση αμνιακών επιθηλιακών κυττάρων σε ηπατοκύτταρα αποδεικνύει ότι η χρήση τους για τη θεραπεία ασθενειών του ήπατος μπορεί να είναι ιδιαίτερα χρήσιμη και αποτελεσματική. Μέχρι σήμερα τουλάχιστον 30 γονίδια τα οποία είναι γνωστό ότι εκφράζονται στο ανθρώπινο ήπαρ έχει αποδειχθεί ότι εκφράζονται στα διαφοροποιημένα ηπατικά κύτταρα ενώ έχει επιτευχθεί η εμφύτευση ανθρώπινων αμνιακών επιθηλιακών κυττάρων σε ιστούς ήπατος. Αναγέννηση μυοκαρδίου Εμφύτευση μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων από την αμνιακή μεμβράνη σε πειραματόζωα με ισχαιμία του μυοκαρδίου έδειξε ότι τα βλαστοκύτταρα διατηρήθηκαν για χρονικό διάστημα μεγαλύτερο από δυο μήνες και ότι είχαν διαφοροποιηθεί σε καρδιομυοκύτταρα (123). Παράλληλα με τη μεταμόσχευση και διαφοροποίηση των κυττάρων του πλακούντα, επιστήμονες παρατήρησαν και την αύξηση της έκκρισης διάφορων <<τροφικών παραγόντων>>, όπως αγγειογενείς αντιαποπτωτικούς παράγοντες, που πιθανώς παίζουν σημαντικό ρόλο στην μείωση του έμφρακτου που παρατηρείται μετά τη μεταμόσχευση (126).

48 47 Διατατική μυοκαρδιοπάθεια Προκλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα του πλακούντα αναστέλλουν τη φλεγμονή του μυοκαρδίου, την απόπτωση των καρδιομυοκυττάρων, συμβάλουν στην αγγειογένεση και βελτιώνουν τη διατατική μυοκαρδιοπάθεια σε πειραματικά μοντέλα. Πρόσφατα παρουσιάστηκε η θεραπεία ασθενούς με διατατική μυοκαρδιοπάθεια ο οποίος παρουσίασε σημαντική βελτίωση μετά από την έγχυση μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων από τον πλακούντα (127). Θεραπεία νευρολογικών ασθενειών Αμνιακά επιθηλιακά κύτταρα εκφράζουν δείκτες νευρικών κυττάρων καθώς και πρωτεΐνες που εκφράζουν τα κύτταρα του νευρικού ιστού (128). Μέχρι σήμερα έχει πραγματοποιηθεί εμφύτευση μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από τον πλακούντα στον ιππόκαμπο (129) και στη σπονδυλική στήλη (130). Μεταμόσχευση μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων από τον πλακούντα σε πειραματόζωα με νόσο του Parkinson βελτίωσε τα συμπτώματα και σταμάτησε την καταστροφή των νευρικών κυττάρων που είναι αποτέλεσμα της νόσου (131). Βλαστοκύτταρα τα οποία εγχύθηκαν στην περιοχή του ιππόκαμπου πειραματόζωων είχε σαν αποτέλεσμα τη διαφοροποίηση τους σε νευρικά κύτταρα (129). Πρόσφατα ερευνητές πραγματοποίησαν μεταμόσχευση μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων από τον πλακούντα σε πειραματόζωα τα οποία είχαν υποστεί εγκεφαλικό επεισόδιο με πολύ θετικά αποτελέσματα (132).

49 48 4. WHARTON JELLY To Wharton jelly (WJ) ή γέλη του Wharton αποτελεί το βλεννώδη συνδετικό ιστό που υπάρχει γύρω από τις αρτηρίες και τη φλέβα του ομφάλιου λώρου. Αυτός ο συνδετικός ιστός με τη μορφή ζελέ περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον Τhomas Wharton to O Meyer και οι συνεργάτες του τρεισήμισι αιώνες μετά μελέτησαν την βιοχημική δομή του. Αποτελείται κυρίως από ίνες κολλαγόνου, στρωματικά κύτταρα και πρωτεογλυκάνες (133). Περιέχει πολύ λίγο κολλαγόνο, έναν άλλο δείκτη του πρώιμου σταδίου διαφοροποίησης του ιστού, ενώ η πιο συχνή πρωτεογλυκάνη είναι το υαλουρονικό οξύ (134), το οποίο είναι υπεύθυνο για τη ζελατινοειδή μορφή του αλλά και για την αρχιτεκτονική δομή του ομφάλιου λώρου καθώς προστατεύει τα ομφαλικά αγγεία από τις πιέσεις (135). Ειδικότερα βρέθηκε κολλαγόνο τύπων II, III, IV, VI. Οι τύποι Ι και ΙΙΙ συναντώνται κυρίως μεταξύ των ομφαλικών αγγείων και θεωρείται ότι η υψηλή αντοχή του ιστού οφείλεται στην υψηλή ποσότητα κολλαγόνου τύπου ΙΙΙ. (136). Οι πρωτεογλυκάνες προέρχονται στο μεγαλύτερο ποσοστό από τα ιστιοκύτταρα, τα οποία βρίσκονται στα ομφαλικά αγγεία (137 ). Το υαλουρονικό οξύ αποτελεί το 70 % του συνόλου των πρωτεογλυκανών, ενώ το ποσοστό άλλων πρωτεογλυκανών, όπως η κερατίνη, η ηπαρίνη και η χονδροιτίνη είναι πολύ χαμηλό. (136). Το ποσοστό αυτό είναι ένα από τα μεγαλύτερα που συναντούμε σε ανθρώπινους ιστούς. Ωστόσο μη φυσιολογικές συγκεντρώσεις φαίνεται να σχετίζονται με καταστάσεις παθογένεσης. Για παράδειγμα εξαιρετικά υψηλές συγκεντρώσεις υαλουρονικού οξέος έχουν παρατηρηθεί σε περιπτώσεις συνδρόμου Down (138) Μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα από τον ομφάλιο λώρο Τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα έχουν απομονωθεί από διάφορα τμήματα του ιστού (Εικόνα 5). Ειδικότερα έχουν απομονωθεί από το αίμα του ομφάλιου λώρου από το ενδοθήλιο των ομφαλικών αγγείων και από τη γέλη του Wharton. Η ουσία του Wharton στην ουσία αντιπροσωπεύει την περιοχή γύρω και ενδιάμεσα από τα ομφαλικά αγγεία. Δεν είναι γνωστό μέχρι σήμερα αν τα

50 49 μεσεγχυματικά κύτταρα τα οποία απομονώνονται από τις διαφορετικές περιοχές του ομφάλιου λώρου αντιπροσωπεύουν διαφορετικούς πληθυσμούς (139). Εικόνα 5. Πέντε ξεχωριστές περιοχές στον ομφάλιο λώρο από τις οποίες έχουν απομονωθεί μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα. MSCs μπορούν να απομονωθούν: (1) από το αίμα του ομφαλίου λώρου σε ποσοστό 20 50%, (2) MSCs από το ενδοθήλιο της ομφαλικής φλέβας, (3) με ενζυματικό διαχωρισμό από το εξωτερικό στρώμα των αγγείων, την περιαγγειακή περιοχή, (4) την περιοχή ανάμεσα από τα ομφαλικά αγγεία, ενδοαγγειακό διάστημα, (5) την ενδοαμνιακή περιοχή. Η ουσία του Wharton περιλαμβάνει τις ζώνες ανάμεσα στην 3 και την 5 περιοχή. 4.2 Μέθοδοι απομόνωσης μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από τον ομφάλιο λώρο Μέχρι σήμερα έχουν περιγραφεί διάφορες μέθοδοι που αφορούν την απομόνωση βλαστικών κυττάρων από το σώμα του ομφάλιου λώρου. Το 2003 ο Romanov YA και η ερευνητική του ομάδα με τη χρήση ενζυματικής μεθόδου και με διαδοχικές φυγοκεντρήσεις κατάφεραν να απομονώσουν κύτταρα τα οποία δημιουργούσαν αποικίες με μορφή ινοβλαστών σε καλλιέργεια. Διαπίστωσε επίσης ότι τα κύτταρα ήταν θετικά σε μεσεγχυματικούς δείκτες. Ωστόσο

51 50 το ποσοστό απομόνωσης των κυττάρων αυτών από τα δείγματα, το οποίο είναι σημαντικό για την κλινική χρήση των κυττάρων αυτών δε περιγράφηκε (140). Άλλοι ερευνητές κατόρθωσαν να απομονώσουν κύτταρα από μικρό ποσοστό (30%) δειγμάτων (141 ). Το 2006 ο Weiss και η ερευνητική του ομάδα ανέφεραν μια πιο αποτελεσματική μέθοδο απομόνωσης μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων με τη χρήση ενζυματικής μεθόδου και τον τεμαχισμό του ομφαλίου λώρου σε τεμάχια του 1 cm. Προηγουμένως είχαν αφαιρεθεί τα ομφαλικά αγγεία για την απομάκρυνση περιαγγειακών και ενδοθηλιακών κυττάρων. Με την μέθοδο αυτή κατόρθωσε να απομονώσει μεσεγχυματικά κύτταρα από το 78 % του συνόλου των δειγμάτων του και πάνω από 1.5 Χ10 6 κύτταρα/cm ομφάλιου λώρου (142). Ο Fu και οι συνεργάτες του ανέφεραν τη απομόνωση 1Χ10 6 μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων από 20 cm κόβοντας και αυτοί τον ιστό σε μικρά κομμάτια (143). Άλλες ερευνητικές ομάδες αναφέρουν πρωτόκολλα απομόνωσης μεσεγχυματικών κυττάρων από το σώμα του ομφάλιου λώρου χωρίς τη χρήση ενζύμων τα οποία και τοποθετούνται απευθείας σε καλλιεργητικές φλάσκες (144). Παράλληλα κάποιες άλλες ερευνητικές ομάδες ύστερα από τον τεμαχισμό του ομφαλίου λώρου χρησιμοποίησαν περαιτέρω ομογενοποίηση του ιστού και στη συνέχεια την κατευθείαν κατάψυξη του χωρίς την χρήση ενζύμων (145) Άλλοι τύποι μεσεγχυματικών κυττάρων από τον ομφάλιο λώρο Κάποιες ερευνητικές ομάδες επικεντρώθηκαν σε έναν πληθυσμό κυττάρων ο οποίος βρίσκεται γύρω από τα ομφαλικά αγγεία (146,147). Αυτός ο πληθυσμός κυττάρων ονομάστηκε περιαγγειακά κύτταρα (human perivascular cells, HUCPV). Αυτά τα κύτταρα διαθέτουν χαρακτηριστικά μεσεγχυματικών κυττάρων, όπως το ότι εκφράζουν μεσεγχυματικούς δείκτες, την ικανότητα προσκόλλησης, και την ικανότητα διαφοροποίησης. Ωστόσο εκφράζουν και κάποιους διαφορετικούς δείκτες, όπως τα αντίσωματα CD 146 και 3G5. O Karahusevinoglou και οι συνεργάτες του το 2006, συνέκριναν την ικανότητα πολλαπλασιασμού των περιαγγειακών κυττάρων και των μεσεγχυματικών κυττάρων από την ουσία του Wharton και διαπίστωσαν την μεγαλύτερη ικανότητα πολλαπλασιασμού των δεύτερων. Θεωρήθηκε ότι τα περιαγγειακά βλαστικά κύτταρα αποτελούν ένα πιο ώριμο πληθυσμό βλαστικών κυττάρων και για αυτό το λόγο εξηγείται πιθανώς το γεγονός ότι τα κύτταρα αυτά δεν μπορούν να μετασχηματιστούν σε κύτταρα νευρικού ιστού.

52 51 Το ενδοθήλιο της ομφαλικής φλέβας αποτελεί ένα άλλο τμήμα του σώματος του ομφαλίου λώρου από το οποίο έχουν απομονωθεί μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (140). Τα κύτταρα αυτά είναι παρόμοια με τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα που απομονώνονται από το μυελό των οστών και έχουν την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε κύτταρα διαφορετικών κυτταρικών σειρών, όπως σε κύτταρα οστίτη ιστού (148,149) Πλαστικότητα των μεσεγχυματικών κυττάρων που απομονώνονται από το σώμα του ομφαλίου λώρου. Τα μεσεγχυματικά κύτταρα που απομονώνονται από τον ομφάλιο λώρο έχουν την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε διαφορετικούς κυτταρικούς πληθυσμούς με την προσθήκη ειδικών αυξητικών παραγόντων στα καλλιεργητικά μέσα (Πινακας 3). Ειδικότερα έχουν διαφοροποιηθεί σε οστεοβλάστες, χονδροβλάστες, καρδιομυοκύτταρα (139,146)και νευρώνες (150,143). Φαίνεται ότι τα μεσεγχυματικά βλαστικά από το σώμα του ομφαλίου λώρου διαθέτουν μεγαλύτερη πλαστικότητα καθώς ερευνητικές ομάδες κατόρθωσαν και τη μετατροπή τους σε νησίδια παρόμοια με αυτά του παγκρέατος (151). Πίνακας 3. Διαφοροποίηση μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων από τον ομφάλιο λώρο Διαφοροποίηση μεσεγχυματικών βλαστοκυτταρων από τον ομφάλιο λώρο In vitro In vivo Λιποκύτταρα Χονδροκύτταρα Οστεοκύτταρα Καρδιομυοκύτταρα Μυϊκά κύτταρα Ενδοθηλιακά Κύτταρα Ντοπαμινεργικοί νευρώνες Μυϊκά κύτταρα Ενδοθηλιακά Κύτταρα Ντοπαμινεργικοί νευρώνες

53 Τα μεσεγχυματικά κύτταρα του ομφάλιου αποτελούν πρωτογενή πολυδύναμα κύτταρα Μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα από την ουσία του Wharton φαίνεται ότι αποτελούν πολυδύναμα κύτταρα παρόμοια με αυτά του γονιμοποιημένου ωαρίου κατά τις πρώτες διαιρέσεις. Μεσεγχυματικά κύτταρα από πειραματόζωο βρέθηκαν θετικά σε δείκτες που συναντούμε στα πολυδύναμα εμβρυϊκά κύτταρα, όπως Nanog Oct-4 και Sox-2 (152). Η ανίχνευση αντισωμάτων που χαρακτηρίζουν τα εμβρυϊκά κύτταρα είναι πολύ σημαντική αν σκεφτεί κανείς την δυνατότητα χρήσης αυτών των κυττάρων σε διαγονιαδιακές βιοτεχνολογικές εφαρμογές. Πιθανώς επειδή τα κύτταρα αυτά απομονώνονται κατά τη γέννηση και το χρονικό διάστημα που τα χωρίζει από τα εμβρυϊκά κύτταρα είναι μικρότερο σε σχέση με τα ενήλικα βλαστοκύτταρα για αυτό το λόγο εκφράζουν κοινούς δείκτες. Πολλοί ερευνητές εξάλλου θεωρούν ότι τα μεσεγχυματικά κύτταρα που απομονώνονται από το σώμα του ομφάλιου λώρου αποτελούν κύτταρα πρωιμότερου σταδίου συγκριτικά με τα μεσεγχυματικά κύτταρα που προέρχονται από το μυελό των οστών (153 ). Μια άλλη πολύ σημαντική ένδειξη ότι είναι πολυδύναμα κύτταρα είναι ότι χρωματίζονται έντονα με τη χρωστική Hoechst και την αλκαλική φωσφατάση που είναι δείκτες των πολυδύναμων κυττάρων. (152). Οι ομφαλικές φλέβες και ο γύρω μεσεγχυματικός ιστός στον οποίο ανήκει και η γέλη του Wharton προέρχονται από το εμβρυϊκό μεσόδερμα, ενώ ο αμνιακός σάκος είναι η εμβρυϊκή πηγή για τα αρχέγονα γεννητικά κύτταρα και για το πρώτο αιμοποιητικό κύτταρο (154). Είναι πολύ πιθανό κάποιοι από αυτούς τους κυτταρικούς πληθυσμούς να συνυπάρχουν με τα μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα από τη γέλη του Wharton (142,155) Βασικό πλεονέκτημα των μεσεγχυματικών κυττάρων από τον ομφάλιο λώρο είναι ότι αν και έχουν κάποιες ιδιότητες των πολυδύναμων κυττάρων καθώς εκφράζουν κοινούς δείκτες δεν είναι υπεύθυνα για το σχηματισμό καρκινικών όγκων όπως τα εμβρυϊκά κύτταρα. ( ). Ερευνητές μεταμόσχευσαν μεσεγχυματικά κύτταρα από την ουσία του Wharton σε ανοσοκατασταλμένα ποντίκια. Μετά από 50 μέρες από την έγχυση δεν παρατηρήθηκε κανένας σχηματισμός όγκου στα πειραματόζωα. (158). Επιπλέον δεν παρατηρήθηκε σχηματισμός καρκινικών όγκων κατά την έγχυση τους σε πειραματόζωα με παθήσεις του αμφιβληστροειδούς (159). Τα μεσεγχυματικά κύτταρα από τη γέλη του Wharton διατηρούν τον καρυότυπο τους σταθερό κατά τη διάρκεια καλλιεργειών. (159,142).

54 53 Επιπλέον παρόμοια με τους εμβρυϊκούς ινοβλάστες τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα από τον ομφάλιο μπορούν να βοηθήσουν στην ανάπτυξη άλλων αρχέγονων κυττάρων. Βλαστοκύτταρα από την ουσία του Wharton όταν χρησιμοποιηθούν σαν στρωματικά κύτταρα μπορούν να συμβάλλουν στον πολλαπλασιασμό εμβρυϊκών κυττάρων αλλά και αιμοποιητικών κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος (141) Διαφορές μεταξύ των μεσεγχυματικών κυττάρων που απομονώνονται από τον ομφάλιο λώρο και από το μυελό των οστών. Τα μεσεγχυματικά κύτταρα μπορούν να απομονωθούν από το μυελό των οστών από την ομφαλοπλακουντιακή μονάδα καθώς και από ιστούς ενηλίκων, όπως από το λιπώδη ιστό. Τα μεσεγχυματικά κύτταρα τα οποία απομονώνονται από τον ομφάλιο λώρο φαίνεται ότι έχουν μεγαλύτερη ικανότητα πολλαπλασιασμού λόγω πιθανόν των μεγαλύτερων τελομερών που διαθέτουν (160). Ειδικότερα παρουσιάζουν πιο υψηλούς χρόνους διπλασιασμού και διατηρούν αυτή την ικανότητα μέχρι και 30 ανακαλλιέργειες. Μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα ομφαλίου λώρου εμφανίζουν μεγαλύτερη συχνότητα μεσεγχυματικών αποικιών από ότι τα μεσεγχυματικά κύτταρα του μυελού των οστών. Η δημιουργία αποικιών σχετίζεται άμεσα με τον αριθμό των μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων, συνεπώς ο ομφάλιος λώρος είναι πιο πλούσιος σε μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα από ότι ο μυελός. Δεύτερον τα μεσεγχυματικά κύτταρα του νεογνού φαίνεται να εκφράζουν μόνο αντιγόνα ιστοσυμβατότητας τύπου Ι και να μη διαθέτουν κάποια αντιγόνα ιστοσυμβατότητας τύπου ΙΙ (161). Ειδικότερα βρέθηκε ότι τα μεσεγχυματικά κύτταρα του ομφαλίου παρουσιάζουν χαμηλά ποσοστά έκφρασης των HLA-ABC αντιγόνων ιστοσυμβατότητας και απουσία του HLA-DR. Καθώς το HLA-ABC αποτελεί σημαντικό παράγοντα για μια επιτυχή αλλογενή μεταμόσχευση, η χαμηλή του έκφραση θα μπορούσε να θεωρηθεί ευνοϊκή για τη χρήση των μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων για αλλογενείς κυτταρικές θεραπείες (141). Τρίτον, μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα από τον ομφάλιο παρουσιάζουν χαμηλότερα ποσοστά στο CD106 αντίσωμα. Η διαφορετική έκφραση πιθανώς αντιπροσωπεύει ένα ειδικό δείκτη για το διαχωρισμό των περιφερικών μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από αυτά του

55 54 μυελού των οστών, καθώς θετικά στο αντίσωμα αυτό βρέθηκαν και μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα που απομονώθηκαν από το λιπώδη ιστό (147). Επιπλέον φαίνεται ότι έχουν ανοσοκατασταλτικό ρόλο καθώς εμποδίζουν τον πολλαπλασιασμό των Τ- λεμφοκυττάρων. Ακόμη έχει βρεθεί ότι τα κύτταρα τα οποία απομονώνονται από την ουσία του Wharton εκφράζουν δείκτες εμβρυϊκών κυττάρων,όπως Oct και Nanog σε χαμηλά επίπεδα Θεραπευτικές εφαρμογές των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από τον ομφάλιο λώρο Τα μεσεγχυματικά κύτταρα από τον ομφάλιο λώρο εξαιτίας της ικανότητας τους να πολλαπλασιάζονται in vitro, της ικανότητας τους για διαφοροποίηση αλλά και του ανοκατασταλτικού τους ρόλου αποτελούν ιδιαίτερα ελκυστικό εργαλείο για την χρήση τους σε κυτταρικές θεραπείες. Ασθένειες νευρικού συστήματος Σε ένα πειραματικό μοντέλο Parkinson η έγχυση μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων βελτίωσε τα συμπτώματα της ασθένειας σε σχέση με μοντέλα μάρτυρες (150). Άλλοι ερευνητές μετέτρεψαν in vitro μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα σε ντοπαμινεργικούς νευρώνες χρησιμοποιώντας αυξητικούς παράγοντες και στη συνέχεια επιχείρησαν την έγχυση σε πειραματόζωα (143). Παρά το γεγονός ότι τα πειραματόζωα δεν ήταν ανοσοκατασταλμένα τα ανθρώπινα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα εντοπίστηκαν πέντε μήνες μετά την έγχυση και είχαν σαν αποτέλεσμα την πρόληψη της προοδευτικής εκφύλισης που παρατηρήθηκε στους μάρτυρες. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν και σε πειραματικά μοντέλα εγκεφαλικής ισχαιμίας, όπου η χορήγηση βλαστοκυττάρων είχε σαν αποτέλεσμα την άμεση μείωση της απώλειας νευρώνων (162). Σε πειραματικό μοντέλο εγκεφαλικής ισχαιμίας η ενδοφλέβια έγχυση μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση της ισχαιμικής περιοχής (163). Ασθένειες καρδιαγγειακού συστήματος

56 55 Παρόμοια θετικά αποτελέσματα παρουσιάστηκαν κατά τη διαφοροποίηση των μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων σε ενδοθηλιακά κύτταρα in vitro και in vivo. Χρησιμοποιώντας αυξητικούς παράγοντες οι ερευνητές μετέτρεψαν τα βλαστοκύτταρα σε ενδοθηλιακά κύτταρα τα οποία εισήχθησαν σε πειραματικό μοντέλο με ισχαιμία όπου παρατηρήθηκε αναγέννηση του ιστού και νεοαγγείωση. (153 ). Παθήσεις αμφιβληστροειδούς O Lund και η ερευνητική του ομάδα χορήγησαν μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα από το σώμα του ομφάλιου λώρου σε πειραματόζωα με πάθηση του αμφιβληστροειδούς. Σε συγκριτική μελέτη μεταξύ των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από το μυελό των οστών, από τον πλακούντα και από τον ομφάλιο λώρο διαπίστωσαν ότι το καλύτερο ιστολογικό αποτέλεσμα παρατηρήθηκε με τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα του ομφαλίου λώρου. Επιπρόσθετα διαπίστωσαν σημαντική αύξηση ειδικών αυξητικών παραγόντων, όπως ο νευροτροφικός παράγοντας και ο αυξητικός παράγοντας-2 (159). Παθήσεις παγκρέατος Μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα από τη γέλη του Wharton διαφοροποιήθηκαν σε β-νησίδια παγκρέατος. Τα πολυδύναμα κύτταρα παρήγαγαν ινσουλίνη τόσο σε κυτταρικές καλλιέργειες, όσο και σε in vitro μελέτες σε πειραματόζωα. Καρκινικοί όγκοι Τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα του ομφαλίου λώρου φαίνεται ότι έχουν την τάση να μεταναστεύουν σε περιοχές όπου αναπτύσσονται καρκινικοί όγκοι. Ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα στήθους εισήχθησαν με μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα ομφαλίου λώρου, τα οποία προηγουμένως είχαν επισημανθεί σε ανοσοκατασταλμένα πειραματόζωα. Μια εβδομάδα μετά την έγχυση τα βλαστοκύτταρα βρέθηκαν κοντά σε καρκινικούς όγκους πνεύμονα και όχι σε άλλους ιστούς. Τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα προκάλεσαν σημαντική μείωση των καρκινικών όγκων καθώς με γενετική τροποποίηση έγιναν φορείς ιντερφερόνης-β (158).

57 56 Νεφρική βλάβη Δεν υπάρχουν πολλά δεδομένα για την εφαρμογή των μεσεγχυματικών κυττάρων του ομφαλίου λώρου για τη θεραπεία της οξείας νεφρικής ανεπάρκειας. Ωστόσο πρόσφατα επιτεύχθηκε η μεταμόσχευση μεσεγχυματικών κυττάρων σε πειραματόζωα με νεφρική ανεπάρκεια. Τα αποτελέσματα ήταν πολύ ελπιδοφόρα καθώς παρατηρήθηκε μείωση της ουρίας και της κρεατινίνης σε σχέση με τους μάρτυρες (164). Στην περίπτωση της οξείας νεφρικής βλάβης η μεταμόσχευση μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων βελτιώνει τη νεφρική λειτουργία και την βλάβη των νεφρικών σωληναρίων με αποτέλεσμα την καλύτερη επιβίωση (165). Ασθένειες του πνεύμονα Μέχρι σήμερα δεν είναι γνωστό κατά πόσο κύτταρα από τον ομφάλιο λώρο μπορούν να μετατραπούν σε κυτταρικούς τύπους πνευμονικού παρεγχύματος τόσο in vivo όσο και in vitro. Πρόσφατα πραγματοποιήθηκε μια νέα μελέτη με θέμα το κατά πόσο η ενδοτραχειακή ή ενδοπεριτοναϊκή μεταμόσχευση μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων από τον ομφάλιο λώρο θα μπορούσε να βελτιώσει την υπεροξία που δημιουργείται ως αποτέλεσμα της αναπνευστικής ανεπάρκειας. Τα θετικά αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν πιθανώς να σχετίζονται με την επίδραση των βλαστοκυττάρων στην καταστολή διαδικασιών φλεγμονής κα ίνωσης (166).

58 57 5. ΥΠΕΡΠΟΛΥΔΥΝΑΜΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ (USSCS) Πρόσφατα επιστήμονες ανακάλυψαν ένα νέο πληθυσμό κυττάρων στο ομφαλοπλακουντιακό αίμα (167). Πρόκειται για έναν πολύ πρώιμο πληθυσμό κυττάρων πιο αρχέγονων από τα μεσεγχυματικά κύτταρα και επομένως με μεγαλύτερη πλαστικότητα. Ονομάστηκαν unrestricted somatic stem cells (USSCs). Μορφολογικά μοιάζουν με ινοβλάστες όταν καλλιεργούνται ενώ έχουν την ικανότητα να προσκολλώνται στις καλλιεργητικές επιφάνειες, όπως τα μεσεγχυματικά κύτταρα. Το μέγεθος τους κυμαίνεται από 20-25μm, ενώ μπορούν να πολλαπλασιαστούν μέχρι και κύτταρα χωρίς να χάσουν την πλαστικότητα τους, διατηρώντας φυσιολογικό καρυότυπο. Σε in vitro μελέτες τα κύτταρα αυτά μετατράπηκαν σε οστεοβλάστες, χονδροβλάστες, λιποκύτταρα, όπως τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα. Επιπλέον όμως μετατράπηκαν σε αιμοποιητικά κύτταρα αλλά και νευρικά, όπως αστροκύτταρα και νευρώνες παρουσιάζοντας νευροδιαβιβαστικούς φαινότυπους. Επιπλέον έχουν την ικανότητα να μετατρέπονται σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους καρδιακών κυττάρων, όπως μυοκαρδιοκύτταρα αλλά και ίνες του Purkinje (167). Ο ανοσοφαινότυπος αυτών των κυττάρων μοιάζει με αυτό των μεσεγχυματικών κυττάρων καθώς είναι αρνητικά για τα CD14, CD33, CD34, CD45, CD49b, CD49c, CD49d, CD49f, CD50, CD62E, CD62L, CD62P, CD106, CD117, και HLA-DR αντισώματα και εκφράζουν υψηλά επίπεδα των εξής αντισωμάτων : CD13, CD29, CD44, CD49e, CD90, CD105, και χαμηλή έκφραση του συμπλέγματος HLA-ABC. Ένα ακόμη ιδιαίτερο χαρακτηριστικό που φαίνεται ότι τα διαφοροποιεί από τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα και ενισχύει το γεγονός ότι αποτελούν πιο πρώιμο πληθυσμό κυττάρων είναι ότι παρουσιάζουν μεγαλύτερα τελομερή (167). In vivo διαφοροποίηση των USSCs επιτεύχθηκε τόσο σε ιστούς που προέρχονται από το μεσόδερμα, όσο και από το ενδόδερμα. Ειδικότερα διαφοροποιήθηκαν σε νευρικά κύτταρα, οστό, χόνδρο, λιποκύτταρα, αιμοποιητικά κύτταρα, ηπατικά κύτταρα, μυοκαρδιακά κύτταρα και νευρικές ίνες του Purkinje. Η ανακάλυψη των κυττάρων αυτών αποτέλεσε σταθμό στην έρευνα του ομφαλοπλακουντιακού αίματος για την χρήση του στις εφαρμογές της αναγεννητικής

59 58 ιατρικής. Αν και πολλές ερευνητικές ομάδες δεν κατόρθωσαν να απομονώσουν αυτά τα βλαστικά κύτταρα διαθέτουν μερικά πολύ σημαντικά χαρακτηριστικά που τα κάνουν μοναδικά. Καταρχήν τα κύτταρα αυτά χαρακτηρίζονται από μεγαλύτερη πλαστικότητα σε σχέση με τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα, καθώς μπορούν να διαφοροποιηθούν σε περισσότερους κυτταρικούς τύπους. Φαίνεται λοιπόν ότι πρόκειται για πιο ανώριμα κύτταρα, πρόδρομα των βλαστοκυττάρων τόσο των αιμοποιητικών, όσο και των μεσεγχυματικών. Ωστόσο σε πειράματα in vivo σε πειραματόζωα τα κύτταρα αυτά αν και μοιάζουν στην πλαστικότητα με τα εμβρυϊκά κύτταρα δε φαίνεται να σχετίζονται με το σχηματισμό καρκινικών όγκων. Ειδικότερα τα κύτταρα αυτά μεταναστεύουν στο σημείο της βλάβης χωρίς να ανευρίσκονται αλλού. Μειονέκτημα των κυττάρων είναι ότι ενώ μπορούν πολύ εύκολα να καλλιεργηθούν, ωστόσο ανευρίσκονται στο 40% των δειγμάτων ομφαλοπλακουντιακού αίματος (167). Πολλές κλινικές μελέτες πραγματοποιούνται ανά τον κόσμο σχετιζόμενες με τα υπερπολυδύναμα αυτά βλαστοκύτταρα.

60 59 6. ΚΥΤΤΑΡΑ ΑΠΟ ΤΗΝ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΗ ΜΟΝΑΔΑ ΠΟΥ ΕΚΦΡΑΖΟΥΝ ΔΕΙΚΤΕΣ ΕΜΒΡΥΪΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Ερευνητές απομόνωσαν από την ομφαλοπλακουντιακή μονάδα ύστερα από λύση και απομάκρυνση των ερυθρών αιμοσφαιρίων πολύ μικρά κύτταρα μεγέθους 6-8μm, τα οποία χαρακτηρίζονται από ευμεγέθη πυρήνα, μη οργανωμένη χρωματίνη και εκφράζουν δείκτες πολυδύναμων εμβρυϊκών κύτταρων, όπως Oct-4, Nanog, CXCR4 είναι θετικά για τα CD34 και CD133 αντίσωματα, ενώ είναι CD45 αρνητικά. (168). Τα κύτταρα αυτά επονομάστηκαν Very Small embryonic like cells (VSELs). Είναι γνωστό ότι τα πολυδύναμα εμβρύϊκά κύτταρα εκφράζουν τους μεταγραφικούς παράγοντες Oct-4, Nanog και μάλιστα κατά τη διαφοροποίηση τους μειώνεται η έκφραση αυτών των εμβρυϊκών δεικτών ( 169,170). Αρχικά τα κύτταρα αυτά απομονώθηκαν από το μυελό των οστών (171). Παρά το μικρό τους μέγεθος τα κύτταρα αυτά περιέχουν διπλοειδή αριθμό χρωμοσωμάτων. Τα κύτταρα αυτά είναι μικρότερα σε μέγεθος από τα ερυθρά αιμοσφαίρια αλλά μεγαλύτερα από τα αιμοπετάλια. Είναι επιστημονικώς αποδεκτό ότι τα μόνα ολοδύναμα κύτταρα είναι αυτά του γονιμοποιημένου ωαρίου που δίνουν γένεση σε όλους τους εμβρυϊκούς ιστούς αλλά και σε εξωεμβρυϊκούς, όπως ο πλακούντας. Στο στάδιο του μοριδίου τα κύτταρα έχουν χάσει την ολοδύναμη ιδιότητα τους, ωστόσο μπορούν αν διαφοροποιηθούν και στα τρία βλαστικά δέρματα. Αυτά τα κύτταρα ονομάζονται πολυδύναμα. Τέτοια κύτταρα έχουν εντοπιστεί και μεταγενέστερα στην εμβρυϊκή ανάπτυξη, στο στάδιο του γαστριδίου στην εσωτερική επιφάνεια της βλατοκύστης που θα δώσει γένεση στο πρωτογενές εξώδερμα (επιβλάστη). Θεωρείται ότι τα μικρά αυτά πολυδύναμα κύτταρα προέρχονται από την επιβλάστη από την οποία προέρχεται και ο πλακούντας (172). Τα κύτταρα αυτά διαθέτουν πολλά χαρακτηριστικά που τα κάνουν να μοιάζουν με τα εμβρυϊκά κύτταρα. Αποτελούνται από μεγάλο πυρήνα και πολύ περιορισμένο κυτταρόπλασμα. Ο λόγος Ν/C που είναι λόγος πυρηνικής/κυτταροπλασματικής δομής είναι ιδιαίτερα υψηλός, όπως ακριβώς και στα εμβρυϊκά κύτταρα. Επιπλέον όταν τα κύτταρα αυτά καλλιεργούνται σε ειδικά θρεπτικά μέσα μπορούν να διαφοροποιηθούν σε κυτταρικούς τύπους και των τριων βλαστικών δερμάτων, όπως νευρικά, καρδιομυοκύτταρα και παγκρεατικά κύτταρα (171). Επιπλέον έχει αποδειχθεί ότι VSELs που εισάγονται σε πειραματικό μοντέλο με οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου βελτιώνουν την καρδιακή λειτουργία (173). Όταν

61 60 καλλιεργούνται σε επαφή με κυτταρικές σειρές C2C12 που προέρχονται από επίμυες δημιουργούν συσσωματώματα και σχηματισμούς σφαιρών που μοιάζουν πολύ με εμβρυϊκούς σχηματισμούς (173). Κύτταρα τα οποία προέρχονται από αυτές τις μάζες διατηρούν τον πολυδύναμο τους χαρακτήρα και μπορούν να διαφοροποιηθούν και στα τρία βλαστικά δέρματα. Τέλος το γεγονός ότι εκφράζουν δείκτες πολυδύναμων κυττάρων είναι ένα ισχυρό κριτήριο για να θεωρηθούν ότι τα κύτταρα αυτά διαθέτουν πολλές από τις ιδιότητες των πολυδύναμων εμβρυϊκών κυττάρων Οι ερευνητές θεωρούν ότι τα περισσότερα κύτταρα χάνονται κατά την επεξεργασία του ομφαλοπλακουντιακού αίματος με τη χρήση διάφορων μεθόδων διαχωρισμού λόγω του μικρού μεγέθους τους. (168). Ειδικότερα διαπιστώθηκε ότι με τα συνήθη μέσα διαχωρισμού που χρησιμοποιούν οι διάφορες ερευνητικές ομάδες χάνεται περίπου το 50 % των πολυδύναμων αυτών κυττάρων γι αυτό και συνιστούν στις διάφορες τράπεζες ομφαλοπλακουντιακού αίματος να τροποποιήσουν τις τεχνικές επεξεργασίας των ομφαλοπλακουντιακών μονάδων, ώστε να μην χάνονται οι πολύτιμοι αυτοί πληθυσμοί κυττάρων. Ωστόσο είναι χαρακτηριστικό ότι ενώ αυτού του είδους τα μικρά πολυδύναμα κύτταρα έχουν βρεθεί στο ομφαλοπλακουντιακό αίμα δεν έχουν βρεθεί στους ιστούς της ομφαλοπλακουντιακής μονάδας.

62 61 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Στην παρούσα εργασία έγινε μια προσπάθεια για την απομόνωση και ταυτοποίηση πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων από την ομφαλοπλακουντιακή μονάδα. Αρχικά μελετήθηκαν όλοι οι παράγοντες οι οποίοι μπορεί να επηρεάζουν την ποιότητα ενός δείγματος ομφαλοπλακουντιακού αίματος όπως ο βέλτιστος χρόνος, η βέλτιστη ποσότητα ομφαλοπλακουντιακού αίματος και οι συνθήκες διατήρησης του δείγματος μέχρι την επεξεργασία του. Πραγματοποιήθηκε μελέτη της σχέσης του όγκου του ομφαλοπλακουντιακού αίματος με τον αριθμό των εμπύρηνων και των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων. Στη συνέχεια εφαρμόσθηκε μια ολοκληρωμένη μέθοδος για την επεξεργασία και την απομόνωση πολυδύναμων αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων από τις μονάδες ομφαλοπλακουντιακού αίματος. Η νέα μέθοδος έχει σαν στόχο την υψηλή ανάκτηση πολυδύναμων αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων. Στη συνέχεια έγινε έλεγχος της ικανότητας των βλαστικών κυττάρων να δημιουργούν αποικίες όλων των αιμοποιητικών κυτταρικών σειρών. Παράλληλα εφαρμόσθηκε μια μέθοδος απομόνωσης βλαστικών κυττάρων και από το αίμα το οποίο βρίσκεται παγιδευμένο μέσα στον πλακούντα. Στόχός ήταν να αυξηθεί η συνολική ποσότητα ομφαλοπλακουντιακού αίματος και επομένως και οι δυνατότητες για μεταμόσχευση τόσο σε παιδιά όσο και σε ενήλικους ασθενείς. Έγινε σύγκριση των δυο διαδικασιών λήψης ομφαλοπλακουντιακού αίματος και μελετήθηκε η συνεισφορά του δεύτερου σταδίου (εξαγωγή του ομφαλοπλακουντιακού αίματος από τον πλακούντα) στον αριθμό των εμπύρηνων κυττάρων, των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων και στην ικανότητα σχηματισμού αιμοποιητικών αποικιών σε σύγκριση με το πρώτο στάδιο λήψης βλαστικών κυττάρων (παρακέντηση ομφαλικής φλέβας). Εφαρμόσθηκε μια ολοκληρωμένη μελέτη στη συνέχεια που αφορά την απομόνωση και πολυδύναμων μεσεγχυματικών κυττάρων από την ομφαλοπλακουντιακή μονάδα. Στη συνέχεια έγινε έλεγχος της ικανότητας των κυττάρων για καλλιέργεια καθώς και της πλαστικότητας των κυττάρων με διαφοροποίηση τους σε άλλες κυτταρικές σειρές. Πραγματοποιήθηκε έλεγχος της ιστοσυμβατότητας του δείγματος για τον αποκλεισμό της τυχόν μόλυνσης

63 62 με μητρικό αίμα καθώς και πλήρης ιολογικός και μικροβιολογικός έλεγχος για τον αποκλεισμό τυχόν μικροβιακής μόλυνσης από τη διαδικασία. Επίσης μελετήθηκε η απομόνωση μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από την ουσία του Wharton. Αρχικά εφαρμόσθηκε η διαδικασία η οποία ακολουθείται από τις περισσότερες ερευνητικές ομάδες και έγινε συγκριτική μελέτη με άλλες μεθόδους. Στη συνέχεια εφαρμόσθηκε μια νέα διαδικασία που και εδώ είχε σαν στόχο την απομόνωση περισσότερων μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από το σώμα του ομφαλίου λώρου αλλά και κυττάρων που εκφράζουν δείκτες πολυδύναμων εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων. Εφαρμόσθηκε μια διαδικασία απομόνωσης από ολόκληρο το σώμα του ομφαλίου λώρου. Έγινε μέτρηση των κυττάρων με διαφορετικές μεθόδους και έλεγχος της ικανότητα τους για πολλαπλασιασμό με κυτταρικές καλλιέργειες. Έγινε χαρακτηρισμός των κυττάρων με την επώαση με ειδικά αντισώματα. Έγινε έλεγχος του ανοσοφαινότυπου των κυττάρων κατά τη διάρκεια των καλλιεργειών. Πραγματοποιήθηκε πολλαπλασιασμός των κυττάρων. Παράλληλα ελέγχθηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από απόψυξη αλλά και η ικανότητα τους να διαφοροποιούνται σε άλλους κυτταρικούς τύπους με την καλλιέργεια τους σε ειδικά καλλιεργητικά μέσα με την προσθήκη ειδικών αυξητικών παραγόντων. Στην προσπάθεια να απομονωθούν βλαστικά κύτταρα με μεγαλύτερη πλαστικότητα πραγματοποιήθηκε μελέτη συνκαλλιέργειας βλαστικών κυττάρων με βλαστοκύτταρα που απομονώνονται από τον λιπώδη ιστό. Έγινε συγκριτική μελέτη της ικανότητας για πολλαπλασιασμό δείγματος βλαστικών κυττάρων από την ουσία του Wharton και δείγματος συνκαλλιέργειας με βλαστικά κύτταρα λιπώδους ιστού. Μελετήθηκε ο ανοσοφαινότυπος των δειγμάτων με τη βοήθεια κυτταρομετρίας ροής. Παράλληλα μελετήθηκε η ύπαρξη πολυδύναμων κυττάρων από το σώμα του ομφάλιου λώρου. Για το σκοπό αυτό έγινε επώαση των κυττάρων με δείκτες που εκφράζουν πολυδύναμα εμβρυϊκά κύτταρα καθώς και χρώση με ειδικές χρωστικές πολυδύναμων κυττάρων. Μελετήθηκε ο ανοσοφαινότυπος των κυττάρων με τη βοήθεια κυτταρομετρίας ροής και με βάση ειδικά μορφολογικά χαρακτηριστικά

64 63 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΆΤΟΜΑ ΠΟΥ ΣΥΜΜΕΤΕΙΧΑΝ ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ Η συλλογή του ομφαλοπλακουντιακού αίματος πραγματοποιήθηκε στο Ιπποκράτειο Νοσοκομείο Θεσσαλονίκης από γυναικολόγους μετά το πέρας του τοκετού, είτε φυσιολογικού, είτε μετά από καισαρική τομή. Η συλλογή έγινε ύστερα από τη συγκατάθεση της μητέρας, εφόσον είχε ληφθεί το ατομικό και οικογενειακό ιστορικό. Ειδικότερα η επιλογή των δειγμάτων έγινε σύμφωνα με τα κριτήρια που έχουν θεσπιστεί από την Eurocord και τα οποία είναι: απουσία οικογενειακού ιστορικού όσον αφορά τις γονιδιακά κληρονομούμενες ασθένειες, αρνητικός ιολογικός και μικροβιολογικός έλεγχος, διάρκεια κύησης πάνω από 35 εβδομάδες, συλλογή αίματος σε λιγότερο από 24 ώρες μετά από τη ρήξη των μεμβρανών. Επίσης δείγματα μικρού όγκου ή δείγματα τα οποία περιείχαν μικρό αριθμό βλαστοκυττάρων δε αποτέλεσαν υλικό μελέτης και επεξεργασίας. 1. ΜΕΛΕΤΗ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΠΟΥ ΚΑΘΟΡΙΖΟΥΝ ΤΗΝ ΠΟΙΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Στην πρώτη φάση της μελέτης η λήψη πραγματοποιήθηκε με παρακέντηση της ομφαλικής φλέβας, ύστερα από την έξοδο του κυήματος, ενώ ο πλακούντας βρισκόταν μέσα στη μήτρα. Πριν από την παρακέντηση έγινε καθαρισμός του ομφαλίου με αιθανόλη και ιώδιο για την αποφυγή επιμολύνσεων. Η συλλογή πραγματοποιήθηκε σε τριπλό ασκό συλλογής όπου το αίμα ρέει ελεύθερα με τη βοήθεια της βαρύτητας Σκοπός της μελέτης ήταν να αξιολογήσει τις καλύτερες συνθήκες για τη συλλογή των κυττάρων του ομφαλοπλακουντιακού αίματος για μεταμόσχευση και να αποφευχθεί η απώλεια των αιμοποιητικών CD34 + βλαστικών κυττάρων και των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων (HPSCs). Ειδικότερα μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας και της χρονικής καθυστέρησης από τη στιγμή της συλλογής του δείγματος μέχρι την επεξεργασία του και τον διαχωρισμό των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων.

65 64 Συνολικά 13 δείγματα ομφαλοπλακουντιακού αίματος χρησιμοποιήθηκαν για αυτή τη μελέτη. Τα δείγματα συλλέχθηκαν σε τριπλό ασκό συλλογής και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν στο εργαστήριο για την περαιτέρω επεξεργασία. Στο εργαστήριο πραγματοποιήθηκε διαχωρισμός του κάθε δείγματος σε δυο διαφορετικούς ασκούς που ο καθένας περιείχε το μισό όγκο δείγματος από τον αρχικό. Ο ένας ασκός από κάθε αρχικό δείγμα μεταφέρθηκε στο ψυγείο σε θερμοκρασία 4 o C ενώ ο άλλος παρέμεινε σε θερμοκρασία δωματίου 25 o C για χρονικό διάστημα 96 ωρών. Κάθε 24 ώρες γινόταν λήψη δείγματος αίματος για μέτρηση του συνολικού αριθμού εμπύρηνων κυττάρων, των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων και των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων. Παράλληλα πραγματοποιήθηκε έλεγχος της συσχέτισης των παραπάνω κυτταρικών παραμέτρων με τον αρχικό όγκο συλλογής του δείγματος Αιματολογικός κυτταρικός αναλυτής Η μέτρηση του ολικού αριθμού των εμπύρηνων κυττάρων αλλά και των μονοκυττάρων πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια αιματολογικού αναλυτή (Beckman Coulter, Maiami, FL,USA) Μέτρηση της βιωσιμότητας και του συνολικού αριθμού των CD34 + αιμοποιητικών και αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων (HPSCs). Για τη μέτρηση της βιωσιμότητας των κυττάρων χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος που περιγράφεται από τους Keeney et al. (34), η οποία βασίζεται στο πρωτόκολλο ISHAGE. Έγινε ανάλυση των δειγμάτων με τη χρήση κυτταρομετρητή ροής (Beckman Coulter EPICS XL/MCL) με τη χρήση stem kit. Το stem-kit TM περιέχει το διπλό CD45-FITC/CD34-PE αντίσωμα, ισοτυπικό κοντρόλ PE, ειδικό διάλυμα μικροσφαιρίδιων με γνωστή συγκέντρωση ανά μl, διάλυμα λύσης χλωριούχου αμμωνίου καθώς και χρωστική 7-aminoactinomycin D (7-AAD) η οποία χρωματίζει τα κύτταρα τα οποία δεν είναι ζωντανά. Για τον υπολογισμό των πρόδρομων μορφών των αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων, CD34 HPCS (hematopoietic progenitors cells) ορίστηκε μια περιοχή CD34 + /CD45 dim.

66 Ικανότητα σχηματισμού αποικιών Η ικανότητα σχηματισμού αποικιών (Colony forming assay-cfu) τόσο πριν όσο και μετά τη διαδικασία του διαχωρισμού των κυττάρων μελετήθηκε χρησιμοποιώντας ειδικό για το σκοπό αυτό διάλυμα μεθυλοκυτταρίνης, Methocult GF H4434 (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada). Τα αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα τοποθετήθηκαν σε ειδικές φλάσκες καλλιέργειας με τελική συγκέντρωση κύτταρα ανά φλάσκα. Οι φλάσκες επωάζονταν στους 37 C και ελέγχονταν καθημερινά με το ανάστροφο μικροσκόπιο για το σχηματισμό αποικιών πολυμορφοπύρηνων-μακροφάγων (CFU-GM), ερυθροβλαστών (BFU-E) καθώς και μεικτών αποικιών πολυμορφοπύρηνων-ερυθροβλαστών και μεγακαρυοκυττάρων (CFU-GEMM) Στατιστική ανάλυση Η στατιστική μελέτη πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια του Correlation Program from the Prism Graph Pad Program (San Diego USA). Για τη συγκριτική μελέτη του αριθμού των εμπύρηνων κυττάρων, των CD34+ βλαστικών κυττάρων και των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων (HPSCs) στις δυο διαφορετικές θερμοκρασίες χρησιμοποιήθηκε το Τ κριτήριο.

67 66 2. ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΜΟΝΑΔΩΝ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΜΕ ΣΤΟΧΟ ΤΗΝ ΥΨΗΛΗ ΑΝΑΚΤΗΣΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕΤΑ ΤΗΝ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ. 150 μονάδες δείγματος ομφαλοπλακουντιακού αίματος συλλέχθηκαν ύστερα από σύμφωνη γνώμη των γονέων για τη μελέτη αυτή. Η συλλογή πραγματοποιήθηκε σε τριπλό ασκό που περιείχε αντιπηκτικό (CPD-A). Η επιλογή των δειγμάτων έγινε με βάση τα κριτήρια της Eurocord. Μετά τη λήψη οι μονάδες μεταφέρονταν στο εργαστήριο όπου μέχρι την επεξεργασία διατηρούνταν στους 4 o C. Ό χρόνος από τη συλλογή μέχρι την επεξεργασία του δείγματος δεν ξεπερνούσε τις 48 ώρες Μείωση του όγκου Για τη μείωση του όγκου των δειγμάτων και την συμπύκνωση ουσιαστικά των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων εφαρμόστηκε μια νέα μέθοδος χωρίς την προσθήκη διαλυμάτων βαθμίδωσης, που στόχο είχε την απομάκρυνση του μεγαλύτερου ποσοστού των ερυθρών αιμοσφαιρίων και την ανάκτηση του μεγαλύτερου ποσοστού των εμπύρηνων κυττάρων και των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων. Ο όγκος του αίματος και από τα δυο στάδια υπολογίστηκε αφαιρώντας το απόβαρο του ασκού καθώς και τον όγκο του αντιπηκτικού, θεωρώντας ότι 1 γραμμάριο αίματος ισοδυναμεί με 1 ml. Ύστερα από λήψη μικρής ποσότητας αίματος για μέτρηση στον αιματολογικό αναλυτή (coulter Beckman) διάλυμα Hydroxyethyl Starch προστέθηκε στο ομφαλοπλακουντιακό αίμα για την καθίζηση των ερυθρών αιμοσφαιρίων (ασκός 1), έτσι ώστε να επιτευχθεί τελική συγκέντρωση του ίση με 2%, ενώ άλλα 26 ml από το διάλυμα Hydroxyethyl Starch προστέθηκαν στον δεύτερο ασκό (ασκός 2), που περιείχε 100 ml μανιτόλης (SAG-M). Ο ασκός 1 κρεμάστηκε από ένα σταντ για 45 λεπτά με στόχο την καθίζηση των ερυθρών αιμοσφαιρίων. Στη συνέχεια το υπερκείμενο μεταφέρθηκε αργά στον άδειο ασκό (ασκός 3) χωρίς να ανασηκωθούν τα ερυθρά αιμοσφαίρια. Για τη δεύτερη ανάκτηση των εναπομεινάντων εμπύρηνων κυττάρων μέσα στο κλάσμα των ερυθρών αιμοσφαιρίων τα 100 ml του δεύτερου ασκού (ασκός 2), μεταφέρθηκαν στον πρώτο ασκό (ασκός 1) και ακολουθούσε νέα καθίζηση για 45

68 67 λεπτά και τελικά η μεταφορά του υπερκειμένου στον τρίτο ασκό (ασκός 3) για μια ακόμη φορά. Στη συνέχεια ο πρώτος ασκός αποκόπτονταν από τους δύο άλλους. Το σύστημα των δυο υπόλοιπων ασκών στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στις 400 στροφές για 20 λεπτά στους 10 C και μετά το πέρας το πλάσμα μεταφέρθηκε στον ασκό 2, ενώ 15 ml περίπου πλάσματος παρέμειναν στον ασκό 3, ο οποίος τελικά αποκόπτονταν από τον ασκό 2. Στη συνέχεια με σύριγγα τα 15 ml μεταφέρθηκαν σε σωλήνα των 50 ml όπου και ακολουθούσε νέα φυγοκέντρηση. Με τις διαδοχικές αυτές διαδικασίες ο τελικός όγκος αίματος εμπλουτισμένου σε αρχέγονα κύτταρα ήταν περίπου 5ml Μέτρηση των κυτταρικών στοιχείων των δειγμάτων και των παραμέτρων των αιμοπεταλίων. Ο συνολικός αριθμός των εμπύρηνων κυττάρων (NCs), των μονοκυττάρων, των ερυθρών αιμοσφαιρίων και των αιμοπεταλίων πριν και μετά τη διαδικασία πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του αιματολογικού αναλυτή (Beckman Coulter, Maiami, FL,USA) Μέτρηση της βιωσιμότητας και του συνολικού αριθμού των CD34 + αιμοποιητικών και αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων (HPSCs). Πραγματοποιήθηκε μέτρηση της βιωσιμότητας και του συνολικού αριθμού των CD34 + αιμοποιητικών και αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων (HPSCs) πριν και μετά την επεξεργασία και έγινε έλεγχος της ανάκτησης των βλαστοκυττάρων και της απομάκρυνσης των ερυθρών αιμοσφαιρίων με τη βοήθεια κυτταρομετρίας ροής όπως έχει αναφερθεί και παραπάνω Κρυοσυντήρηση των δειγμάτων μετά την επεξεργασία Μετά την επεξεργασία τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε βαθιά κατάψυξη στους C. Αρχικά προστέθηκε στα δείγματα ειδικό κρυοπροστατευτικό διάλυμα το οποίο περιείχε 10% DMSO σαν κρυοπροστατευτική ουσία και 4% HEAS-steril σε

69 68 διάλυμα αντιπηκτικού CPD-A. Τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε ειδικά κρυοπροστατευτικά σωληνάκια και στη συνέχεια ακολουθώντας της διαδικασία της βαθμιαίας κατάψυξης με ρυθμό 1 0 C/min μέχρι τους C σε ειδικό δοχείο (freezing container Nalgene). Έπειτα μεταφέρθηκαν στο υγρό άζωτο στους C όπου και φυλάχτηκαν μέχρι τη χρήση τους Απόψυξη Δύο μήνες μετά την τοποθέτηση στο υγρό άζωτο τα κύτταρα αποψύχθηκαν με ταχεία εμβάπτιση και ανακίνηση σε υδατόλουτρο θερμοκρασίας 37 0 C μέχρις ότου δεν υπήρχε ορατός πάγος και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε αποστειρωμένο χώρο. Στη συνέχεια το εναιώρημα κυττάρων μεταφέρθηκε σε πλαστικούς κωνικούς δοκιμαστικούς σωλήνες περιεκτικότητας 15ml και προστέθηκαν 2-3 ml θρεπτικό υλικό DMEM (10% FCS). Έπειτα τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στις 1500 rpm για 10 λεπτά, έγινε ρίψη του υπερκείμενου και επαναιώρησή τους σε θρεπτικό υλικό. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν 2 ακόμα πλύσεις-φυγοκεντρήσεις στις ίδιες συνθήκες (στις 1500 rpm για 10 λεπτά). Στη συνέχεια τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε θρεπτικό υλικό DMEM (10% FCS). Στα αποψυχθέντα δείγματα εξετάσθηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων με τη βοήθεια κυτταρομετρίας ροής και τη χρήση της 7 ακτινομυκίνης D Ικανότητα σχηματισμού αποικιών Για τον έλεγχο της ικανότητας των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων να διατηρούν το αιμοποιητικό δυναμικό πριν και μετά την κατάψυξη πραγματοποιήθηκε έλεγχος του σχηματισμού αιμοποιητικών αποικιών πριν και μετά την κρυοσυντήρηση των δειγμάτων.

70 69 3. ΜΕΘΟΔΟΣ ΣΥΛΛΟΓΗΣ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΑΠΟ ΤΟΝ ΠΛΑΚΟΥΝΤΑ-ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΚΑΙ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΟΥ ΔΥΝΑΜΙΚΟΥ ΤΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΠΛΑΚΟΥΝΤΑ Για την πειραματική μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν 68 δείγματα αίματος ομφαλοπλακουντιακής μονάδας από το Νοσοκομείο Ιπποκράτειο της Θεσσαλονίκης ύστερα από φυσιολογικό τοκετό. Παράλληλα σε αποστειρωμένο δοχείο έγινε και η συλλογή από τους πλακούντες από τους 68 τοκετούς. Στη δεύτερη αυτή μελέτη εφαρμόσθηκε μια κλειστή μέθοδος αποστράγγισης του αίματος από τον πλακούντα για τη μείωση του μικροβιακού φορτίου. Έγινε έλεγχος του μεσεγχυματικού χαρακτήρα των κυττάρων που λαμβάνονται από τον πλακούντα αλλά και ανάλυση του DNA του εκπλύματος του πλακούντα σε σύγκριση με το ομφαλοπλακουντιακό αίμα που λαμβάνεται με την πρώτη διαδικασία και με τον ιστό του ομφάλιου λώρου προκείμενου να βρεθεί τυχόν επιμόλυνση της διαδικασίας με μητρικό αίμα. Παράλληλα έγινε έλεγχος της ομάδας αίματος και για τις δυο διαδικασίες λήψης ομφαλοπλακουντιακού αίματος. Με τον τρόπο αυτό προτείνεται μια πιο επιστημονικά τεκμηριωμένη μέθοδος λήψης αίματος από τον πλακούντα Δυο κλειστά στάδια συλλογής Εφαρμόστηκε η ιδία γνωστή κοινή διαδικασία λήψης ομφαλοπλακουντιακού αίματος με παρακέντηση της ομφαλικής φλέβας όσον αφορά το πρώτο στάδιο της συλλογής. Για το δεύτερο στάδιο αρχικά αφαιρέθηκε με αποστειρωμένο νυστέρι η αμνιακή μεμβράνη από τον ιστό του πλακούντα. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε σχολαστική έκπλυση της εξωτερικής επιφάνειας του πλακούντα, ειδικότερα από την μητρική επιφάνεια. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκε αποστειρωμένο διάλυμα φυσιολογικού ορού 0.9% NACl το οποίο είχε προθερμανθεί στους 37 0 C. Στη συνέχεια ακολούθησε έκπλυση με Betadine και με διάλυμα φυσιολογικού ορού για μια ακόμη φορά. Για την καλύτερη απομάκρυνση του μητρικού αίματος ή πηγμάτων από το μητρικό αίμα χρησιμοποιήθηκαν αποστειρωμένες γάζες. Στη συνέχεια ο πλακούντας μέσα σε αποστειρωμένη γάζα εισήλθε σε ειδικό ασκό συλλογής χωρητικότητας 2L (teruflex, 2L, Terumo Corp.), όπου πραγματοποιήθηκε έγχυση αντιπηκτικού μέσα στο αγγειακό δίκτυο του πλακούντα. Ένδειξη της σωστής διαδικασίας αποτελεί η ελεύθερη και αβίαστη ροή του αντιπηκτικού μέσα στα

71 70 αγγεία. Στη συνέχεια ο ασκός με τον πλακούντα έκλεισε με ειδικό Sealer (Thermogenesis Corp., USA) και συνδέθηκε με τον τριπλό ασκό συλλογής. Έτσι λοιπόν δημιουργήθηκε ένα κλειστό σύστημα για την εξαγωγή του αίματος από τον πλακούντα Επεξεργασία των δειγμάτων από τα δυο στάδια Από εδώ και πέρα εφαρμόστηκε η ίδια διαδικασία μείωσης του όγκου και της επεξεργασίας των δειγμάτων και μέτρησης των εμπύρηνων αλλά και των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων. Πραγματοποιήθηκε μικροβιολογικός έλεγχος με τη μέθοδο Bactec (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA). Έγινε έλεγχος της παρουσίας προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων με τη δημιουργία αιμοποιητικών αποικιών από το υλικό έκπλυσης του πλακούντα Απομόνωση μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από τον πλακούντα Κυτταρομετρία ροής Έγινε έλεγχος για απομόνωση μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από το αίμα που συλλέχθηκε από το αγγειακό σύστημα του πλακούντα. Για το σκοπό αυτό ποσότητα αίματος από τον πλακούντα επωάστηκε με ειδικά αντισώματα τα οποία χαρακτηρίζουν τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα. Ειδικότερα έγινε επώαση με CD29 αντίσωμα το οποίο ήταν συνδεδεμένο με τη χρωστική φλουοροσκεϊνη (FITC) και με το αντίσωμα CD105, το οποίο ήταν συνδεδεμένο με τη χρωστική PE (φυκοερευθρίνη) (Beckman-Coulter, Miami, FL, USA). Η επώαση έγινε για 20 λεπτά και στη συνέχεια έγινε μέτρηση με κυτταρομετρία ροής -Beckman-Coulter FC500 flow cytometer (Beckman-Coulter, Miami, FL, USA). Πραγματοποιήθηκε συγκριτικός έλεγχος του μεσεγχυματικού χαρακτήρα των κυττάρων που λαμβάνονται με την κλασική διαδικασία και των κυττάρων που λαμβάνονται με την εφαρμογή της κλειστής διαδικασίας αποστράγγισης του αίματος από το αγγειακό δίκτυο του πλακούντα Καλλιέργειες κυττάρων

72 71 Για να διαπιστωθεί εάν τα κύτταρα που απομονώσαμε από τον πλακούντα έχουν μεσεγχυματικό χαρακτήρα έκτος από τη μέτρηση με ειδικά αντισώματα τοποθετήθηκαν και σε ειδικές καλλιεργητικές πλάκες. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε θρεπτικό μέσο DMEM (Dulbeccco s medium), το οποίο περιείχε 10% FBS (Fetal bovine serum) με την προσθήκη αντιβιοτικών πενικιλίνης και στρεπτομυκίνης (Sigma-Aldrich, St Louis). Τα κύτταρα στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε επωαστικό κλίβανο ο οποίος περιείχε 5% CO 2. Η αλλαγή του θρεπτικού υλικού γινόταν κάθε 3-5 ημέρες ενώ ο έλεγχος του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, της μορφολογίας τους και της συμπεριφοράς τους εν γένει στο καλλιεργητικό υλικό γινόταν με τη βοήθεια ανάστροφου μικροσκοπίου. Όταν τα κύτταρα έφταναν σε πυκνότητα 80% πραγματοποιούνταν αποκόλληση από την επιφάνεια της φλάσκας με διάλυμα 0,25% τρυψίνης/edta Μελέτη της ικανότητας των κυττάρων που απομονώνονται από τον πλακούντα για διαφοροποίηση Για να μελετήσουμε την ικανότητα των κυττάρων να διαφοροποιούνται σε άλλες κυτταρικές σειρές, κύτταρα από τις καλλιέργειες τοποθετήθηκαν σε ειδικά καλλιεργητικά μέσα με ειδικούς αυξητικούς παράγοντες. Κύτταρα τα οποία καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικά μέσα χωρίς την παρουσία αυξητικών παραγόντων χρησιμοποιήθηκαν σαν μάρτυρες Διαφοροποίηση σε οστικά κύτταρα Η διαφοροποίηση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με την καλλιέργεια των κύτταρων του πλακούντα ύστερα από τέσσερις ανακαλλιέργειες σε ειδικό θρεπτικό μέσο διαφοροποίησης για οστικά κύτταρα σύμφωνα με τους Kern S και συν., 2006 (174). Το θρεπτικό μέσο διαφοροποίησης ήταν DMEM (Dulbeccco s medium), το οποίο περιείχε 10% FBS (Fetal bovine serum) με την προσθήκη 2 mm L-glutamine, 100 U/mL penicillin, 100 mg/ml streptomycin, 100 nm dexamethasone, 0.2 mm L- ascorbate, and 10 mm b-glycerophosphate (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στο θρεπτικό μέσο διαφοροποίησης για χρονικό διάστημα 28 ημερών, ενώ η αλλαγή του θρεπτικού μέσου πραγματοποιούνταν κάθε 3-5 ημέρες. Ο έλεγχος για οστική διαφοροποίηση έγινε με τη χρήση ειδικής χρωστικής, αλιζαρίνης.

73 Χρώση οστικών κυττάρων Αρχικά απομακρύνθηκε το υπερκείμενο θρεπτικό διάλυμα. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε μονιμοποίηση των κυττάρων με την προσθήκη 70% αιθανόλης για μια ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Έπειτα από την απομάκρυνση του μονιποιητικού με αποστειρωμένο νερό έγινε η προσθήκη της χρωστικής (alizarinered). Έγινε επώαση για μισή ώρα και στη συνέχεια έγινε απομάκρυνση της περίσσειας της χρωστικής με διαδοχικές πλύσεις με αποστειρωμένο νερό. Η παρατήρηση των κυττάρων έγινε με τη βοήθεια του ανάστροφου μικροσκοπίου. Η χρωστική έχει την ιδιότητα να επικάθεται και να χρωματίζει κόκκινες τις εναποθέσεις ασβεστίου των οστεοκυττάρων Διαφοροποίηση σε λιποκύτταρα Η διαφοροποίηση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με την καλλιέργεια των κύτταρων του πλακούντα ύστερα από τέσσερις ανακαλλιέργειες σε ειδικό θρεπτικό μέσο διαφοροποίησης για λιποκύτταρα σύμφωνα με τους Kern S και συν., 2006 (174) Το θρεπτικό μέσο διαφοροποίησης ήταν DMEM (Dulbeccco s medium), το οποίο περιείχε 10% FBS (Fetal bovine serum) με την προσθήκη 2 mm L-glutamine, 100 U/mLπενικιλίνης, 100 mg/ml στρεπτομυκίνης, 60 mm ινδομεθακίνης, 1mM dexamethasone, 0.5 mm IBMX, και 10μg/mL ινσουλίνης. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στο θρεπτικό μέσο διαφοροποίησης για χρονικό διάστημα 22 ημερών, ενώ η αλλαγή του θρεπτικού μέσου πραγματοποιούνταν κάθε 3-5 ημέρες. Ο έλεγχος για διαφοροποίηση σε λιποκύτταρα έγινε με τη χρήση ειδικής χρωστικής, Oil Red O (Sigma) Χρώση λιποκυττάρων Αρχικά απομακρύνθηκε το υπερκείμενο θρεπτικό διάλυμα. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε μονιμοποίηση των κυττάρων με την προσθήκη 2% παραφορμαλδεϋδης για λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Έπειτα από την απομάκρυνση του μονιποιητικού με αποστειρωμένο νερό έγινε η προσθήκη της χρωστικής (Oil Red O). Έγινε επώαση για 50 λεπτά και στη συνέχεια έγινε απομάκρυνση της περίσσειας της χρωστικής με διαδοχικές πλύσεις με αποστειρωμένο νερό. Τέλος έγινε η προσθήκη αιματοξυλίνης (0.5 ml) η οποία έχει την ιδιότητα να χρωματίζει με μπλε χρώμα του πυρήνες των κυττάρων. Η

74 73 παρατήρηση των κυττάρων έγινε με τη βοήθεια του ανάστροφου μικροσκοπίου. Τα κύτταρα τα οποία έχουν διαφοροποιηθεί σε λιποκύτταρα αναγνωρίζονται από την κόκκινη χρώση των λιποσταγονιδίων από το Oil Red O και από την μπλε χρώση των πυρήνων από την προσθήκη της αιματοξυλίνης HLA ανάλυση Για τη διαπίστωση τυχόν πρόσμιξης μητρικού αίματος στα δείγματα της έκπλυσης του πλακούντα, πραγματοποιήθηκε ανάλυση και σύγκριση του DNA από το αίμα που συλλέγεται από την έκπλυση του πλακούντα, από το αίμα που συλλέγεται από την παρακέντηση της ομφαλικής φλέβας και από τον ιστό του ομφάλιου λώρου. Η εξαγωγή του DNAέγινε με τη βοήθεια του QIAamp DNA Mini kit (Qiagen). Η μελέτη των αλληλομόρφων έγινε με τη βοήθεια PCR ανάλυσης. Τα αλληλόμορφα τα οποία μελετήθηκαν ήταν τα αλληλόμορφα της κλάσης-1, HLA-A*, -B* and -C* και τα αλληλόμορφα της κλάσης-2, HLA-DRB1*, DRB3*, DRB4*, DRB5* and DQB1*. Στη συνέχεια ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε διάλυμα 2% αγαρόζης. (e-gels by Invitrogen). Για τη διαπίστωση της ευαισθησίας της μεθόδου, για την ικανότητα της να ανιχνεύει μητρικό αίμα έστω και σε μικρό ποσοστό, πραγματοποιήθηκε μίξη περιφερικού αίματος της μητέρας σε διάφορες αραιώσεις με ομφαλοπλακουντιακό αίμα. Οι αραιώσεις οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν ήταν 5%, 2%, 1 %, 0.5% και 0.1 %. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση των υλικών μίξης και αναζήτηση του σημείου εκείνου στο οποίο εξαφανίζεται το DNA της μητέρας Βακτηριολογικός έλεγχος Πραγματοποιήθηκε βακτηριολογικός έλεγχος για να διαπιστωθεί αν η εφαρμογή του κλειστού συστήματος απομόνωσης ομφαλοπλακουντιακού αίματος από τον πλακούντα αυξάνει το μικροβιακό φορτίο των δειγμάτων. Η ανάλυση έγινε με το σύστημα Bactec (Becton Dickinson, Mountain View, Calif, USA).

75 74 4.ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΤΗΝ ΟΥΣΙΑ ΤΟΥ WHARTON 4.1. Συλλογή των ομφάλιων λώρων Με σύμφωνη γνώμη των γονέων έγινε συλλογή 67 δειγμάτων ομφαλίου λώρου μήκους 15 cm τα οποία μεταφέρθηκαν στο εργαστήριο εμβαπτισμένα σε Hank s Balanced Salt solution (Biochrom AG)θερμοκρασίας 4 0 C το οποίο περιείχε 100μg/ml πενικιλλίνης /100μg/ml στρεπτομυκίνης, (Biochrom AG ) και αποθηκεύτηκαν 1-24 ώρες πριν την επεξεργασία 4.2. Απομόνωση, καλλιέργεια και κρυοσυντήρηση Κάτω από άσηπτες συνθήκες το τμήμα του ομφαλίου λώρου αποστειρώθηκε με διάλυμα betadine, στη συνέχεια με αλκοόλη 100% και τέλος ξεπλύθηκε με φυσιολογικό ορό. Με τη χρήση αποστειρωμένων εργαλείων απομακρύνθηκαν τα ομφαλικά αγγεία και τμήματα της ουσίας του Wharton 2-5mm 3 επωάστηκαν με διάλυμα κολλαγενάσης Ι (GIBCO) και υαλουρονιδάσης (Applichem) για μία ώρα στους 37 0 C με συνεχή ανάδευση. Η επώαση συνεχίστηκε με διάλυμα 2,5% τρυψίνης για 30 λεπτά κάτω από τις ίδιες συνθήκες. Το υλικό της επώασης αναδιαλύθηκε 1:2 σε PBS και το ίζημα διηθήθηκε μέσω φίλτρου 70μm για τη λήψη κυττάρων ιδίου μεγέθους. Το υλικό φυγοκεντρήθηκε για 15 λεπτά στους 37 0 C και το ίζημα αναδιαλύθηκε σε διάλυμα HEAS 10% Fresenius Kabi το οποίο περιείχε 25% Human albumin (12.5 g/50ml Bayer). Η βιωσιμότητα των κυττάρων εξετάστηκε με το trypan blue σε πλάκα Neubauer. Για το σκοπό αυτό ίση ποσότητα κυττάρων αναμίχτηκε με ίση ποσότητα trypan blue. Η χρωστική έχει την ιδιότητα να βάφει τα νεκρά κύτταρα. Μικρό τμήμα του διαλύματος τοποθετήθηκε σε πλάκες CELLSTAR με πυκνότητα κυττάρων 1.7 έως 9.4Χ10 3 κύτταρα/cm 2 και καλλιεργήθηκε στους 37 0 C σε επωαστικό κλίβανο σε ατμόσφαιρα 5% CO ώρες αργότερα έγινε αλλαγή του θρεπτικού υλικού και απομάκρυνση των μη προσκολληθέντων κυττάρων. Επακολουθούσε αλλαγή του θρεπτικού υλικού κάθε 2-3 ημέρες. Τρία δείγματα συνέχισαν την καλλιέργεια σε μεγαλύτερες φλάσκες και μετά από έξι ανακαλλιέργειες τα κύτταρα αποκολλήθηκαν και μία μικρή ποσότητα εξετάστηκε ως

76 75 προς την παρουσία μεσεγχυματικών δεικτών. Τα υπόλοιπα κύτταρα διαλύθηκαν με συνεχή ανάδευση και αργή προσθήκη της κρυοπροστατευτικής ουσίας DMSO 20% σε αναλογία 1:2, καταψύχθηκαν βαθμιαία, παρέμειναν στους C για οκτώ ώρες και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν στο υγρό άζωτο στους C Κυτταρομετρία ροής Όταν η επιφάνεια της φλάσκας καλύπτονταν στο % από κύτταρα τότε γίνονταν αποκόλληση των κυττάρων με διάλυμα τρυψίνης στους 37 0 C για 3-7 λεπτά. Γινόταν συλλογή των κυττάρων με φυγοκέντρηση και μικρό δείγμα εξετάζονταν για τη βιωσιμότητά του με trypan blue σε πλάκα Νeubauer. Τα υπόλοιπα κύτταρα σημάινόταν με φθορίζοντες δείκτες PE-anti CD105, FITC anti CD29, PC5anti CD90 επωάζονταν για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και έγινε καταμέτρηση με κυτταρόμετρο ροής της εταιρείας Bekman-Coulter. Γινόταν χρώση των νεκρών κυττάρων με 7 ακτινομυκίνη D και καταμέτρηση συγχρόνως για την ύπαρξη μεσεγχυματικών δεικτών Απόψυξη Δύο μήνες μετά την τοποθέτηση στο υγρό άζωτο τα κύτταρα αποψύχονταν με ταχεία εμβάπτιση και ανακίνηση σε υδατόλουτρο θερμοκρασίας 37 0 C μέχρις ότου να μην υπήρχε ορατός πάγος και στη συνέχεια μεταφέρονταν σε αποστειρωμένο χώρο. Στα αποψυχθέντα δείγματα εξετάζονταν η βιωσιμότητα των κυττάρων με το κυτταρόμετρο ροής και τη χρήση της 7 ακτινομυκίνης D. Πέντε από τα αποψυχθέντα δείγματα καλλιεργήθηκαν και εξετάστηκε η ικανότητα κυτταρικού πολλαπλασιασμού Μελέτη τμημάτων του ομφαλίου λώρου Πέντε τεμάχια ομφαλίου λώρου, χωρίς προηγούμενη επεξεργασία τοποθετήθηκαν σε πλάκες CELLSTAR και καλλιεργήθηκαν κάτω από τις ίδιες συνθήκες, όπως και τα κύτταρα που απομονώθηκαν μετά την ενζυμική διαδικασία. Οι πλάκες παρέμειναν για τρεις έως πέντε ημέρες στον επωαστικό κλίβανο και στη συνέχεια επακολουθούσε αλλαγή του θρεπτικού υλικού κάθε 2-3 ημέρες. Οι καλλιέργειες ελέγχονταν καθημερινά για την εμφάνιση κυττάρων στην περιφέρεια των τμημάτων του ομφαλίου λώρου.

77 76 Τμήματα ομφαλίου λώρου τοποθετούνταν κατευθείαν στο υλικό κρυοσυντήρησης και καταψύχονταν βαθμιαία με τον ίδιο τρόπο όπως και τα κύτταρα που ακολούθησαν την ενζυμική επεξεργασία. Τα τμήματα δύο μήνες αργότερα αποψύχονταν κατά τον ίδιο τρόπο και ακολουθούσαν την ίδια διαδικασία της καλλιέργειας και καταμέτρησης των κυττάρων που αναπτύσσονταν στην περιφέρειά τους Μικροβιολογικός έλεγχος Το υπερκείμενο υγρό μετά την ενζυμικό διαχωρισμό των κυττάρων και πριν την κρυοσυντήρηση ελέγχονταν με το σύστημα Bactec (Becton Dickinson) για την ανίχνευση αερόβιων και αναερόβιων μικροβίων. Οι καλλιέργειες επίσης ελέγχονταν καθημερινά για επιμολύνσεις από μικρόβια και μύκητες.

78 77 5. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΩΝ ΒΛΑΣΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΟΛΟΚΛΗΡΟ ΤΟ ΣΩΜΑ ΤΟΥ ΟΜΦΑΛΙΟΥ ΛΩΡΟΥ Συλλογή ομφάλιων λώρων Με σύμφωνη γνώμη των γονέων έγινε συλλογή 12 ομφάλιων λώρων. Η μεταφορά των ομφαλίων στο εργαστήριο για την επεξεργασία πραγματοποιούνταν είτε μαζί με το σώμα του πλακούντα είτε ξεχωριστά σε αποστειρωμένο δοχείο, το οποίο περιείχε διάλυμα Hank s Balanced Salt solution (Biochrom AG) με την προσθήκη 100 μl 100μg/ml πενικιλλίνης/100μg/ml στρεπτομυκίνης, (Biochrom AG). Για τη μελέτη χρησιμοποιήθηκε ολόκληρος ο ομφάλιος λώρος Επεξεργασία ολόκληρου του τμήματος του ομφαλίου λώρου Εφαρμόστηκε μια διαφορετική διαδικασία η οποία σαν στόχο είχε την απομόνωση μεγαλύτερου αριθμού μεσεγχυματικών κυττάρων χρησιμοποιώντας ολόκληρο τον ομφάλιο λώρο. Αρχικά ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία για την αποστείρωση των ομφαλίων λώρων με διάλυμα betadine, στη συνέχεια με αλκοόλη 100% και τέλος ξέπλυμα με φυσιολογικό ορό. Στην εξωτερική επιφάνεια των ομφάλιων με αποστειρωμένο νυστέρι πραγματοποιούνταν κάθετες τομές χωρίς όμως να επηρεάζουν τα ομφαλικά αγγεία για την καλύτερη διείσδυση των ενζύμων στη συνέχεια. Το βάρος και το μήκος των ομφαλίων υπολογίστηκε σε κάθε περίπτωση Ενζυμικός διαχωρισμός Οι ομφάλιοι τοποθετήθηκαν μέσα σε αποστειρωμένους ασκούς, αφού προηγουμένως είχαν δεθεί τα άκρα τους με αποστειρωμένο νήμα για την μείωση της εκροής ομφαλοπλακουντιακού αίματος που τυχόν είχε παραμείνει μέσα στα ομφαλικά αγγεία. Δεν προηγήθηκε ούτε απομάκρυνση των αγγείων, ούτε τεμαχισμός των ομφαλίων σε μικρότερα κομμάτια. Το ένα άκρο του ασκού κόβονταν με αποστειρωμένο νυστέρι για την είσοδο των ομφαλίων, ενώ στη συνέχεια σφραγίζονταν με ειδικό Sealer (Thermogenesis Corp., USA). Ολόκληροι οι ομφάλιοι επωάστηκαν με διάλυμα κολλαγενάσης Ι (GIBCO) και υαλουρονιδάσης (Applichem) για τρεις ώρες στους 37 0 C με συνεχή ανάδευση. Η επώαση συνεχίστηκε με διάλυμα 2,5% τρυψίνης για 30 λεπτά κάτω από τις ίδιες συνθήκες. Το υλικό της επώασης

79 78 αναδιαλύθηκε 1:2 σε PBS και το ίζημα διηθήθηκε μέσω φίλτρου 70μm για τη λήψη κυττάρων ιδίου μεγέθους. Το υλικό φυγοκεντρήθηκε για 15 λεπτά στους 37 0 C και το ίζημα αναδιαλύθηκε σε διάλυμα HEAS 10% Fresenius Kabi το οποίο περιείχε 25% Human albumin (12.5 g/50ml Bayer). Η βιωσιμότητα των κυττάρων εξετάστηκε με το trypan blue σε πλάκα Neubauer και με τη βοήθεια κυτταρόμετρου ροής Κυτταρικός αναλυτής Αμέσως μετά τον ενζυμικό διαχωρισμό των κυττάρων πραγματοποιήθηκε μέτρηση του αριθμού των ολικών εμπύρηνων κυττάρων με τη βοήθεια κυτταρικού αναλυτή Κυτταρομετρία ροής Παράλληλα αμέσως μετά τον ενζυμικό διαχωρισμό πραγματοποιήθηκε μέτρηση των κυττάρων και της βιωσιμότητας τους με τη βοήθεια κυτταρομετρίας ροής. Για το σκοπό αυτό έγινε επώαση των κυττάρων για 20 λεπτά στο σκοτάδι με ειδικούς δείκτες των μεσεγχυματικών κυττάρων συνδεδεμένους με ειδικές χρωστικές. Ειδικότερα έγινε επώαση με τα αντισώματα CD29, CD90, CD44, CD 45, τα οποία ήταν συνδεδεμένα με τη χρωστική φλουορεσκεϊνη (FITC), και με τα αντισώματα CD105 και CD34, τα οποία ήταν συνδεδεμένα με την φυκοερυθρίνη (PE). Η μέτρηση της βιωσιμότητας των κυττάρων έγινε με τη χρωστική 7- ακτινομυκίνη (7-ΑΑD). To κυτταρόμετρο που χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη αυτή ήταν το Beckman-Coulter FC500 flow cytometer (Beckman-Coulter, Miami, FL, USA) Σύγκριση των μεθόδων Υπολογίστηκε ο συνολικός αριθμός εμπύρηνων και μεσεγχυματικών κυττάρων από ολόκληρους τους ομφάλιους. Παράλληλα υπολογίστηκε ο αριθμός των μεσεγχυματικών και των εμπύρηνων κυττάρων ανά cm και ανά gr και έγινε σύγκριση των τιμών από τo κυτταρόμετρο ροής, τον κυτταρικό αναλυτή και την πλακά Neubauer Κατάψυξη-Απόψυξη Ακολούθησε κατάψυξη των δειγμάτων στους C σε βαθιά κατάψυξη και απόψυξη των δειγμάτων για τη μελέτη της βιωσιμότητας και του αριθμού των μεσεγχυματικών κυττάρων μετά την απόψυξη. Η μέθοδος που ακολουθήθηκε για την

80 79 ψύξη και την απόψυξη των δειγμάτων αναφέρεται και παραπάνω. Για πέντε δείγματα έγινε χαρακτηρισμός των κυττάρων μετά την απόψυξη Καλλιέργεια των μεσεγχυματικών κυττάρων Πέντε από τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε ειδικές καλλιεργητικές πλάκες σε θρεπτικό μέσο DMEM (Dulbeccco s medium), το οποίο περιείχε 10% FBS (Fetal bovine serum) με την προσθήκη αντιβιοτικών πενικιλίνης και στρεπτομυκίνης (Sigma-Aldrich, St Louis). Τα κύτταρα στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε επωαστικό κλίβανο ο οποίος περιείχε 5% CO 2. Η αλλαγή του θρεπτικού υλικού γινόταν κάθε 3-5 ημέρες ενώ ο έλεγχος του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, της μορφολογίας τους και της συμπεριφοράς τους εν γένει στο καλλιεργητικό υλικό γινόταν με τη βοήθεια ανάστροφου μικροσκοπίου. Όταν τα κύτταρα έφταναν σε πυκνότητα 80% πραγματοποιούνταν αποκόλληση από την επιφάνεια της φλάσκας με διάλυμα 0,25% τρυψίνης/edta. Πραγματοποιήθηκαν 3 ανακαλλίεργειες των κυττάρων για τη διαπίστωση της διατήρησης του μεσεγχυματικού τους χαρακτήρα κατά τις ανακαλλιέργειες. Για το σκοπό αυτό γινόταν μέτρηση κάθε φορά με κυτταρόμετρο ροής και με την επώαση μεσεγχυματικών δεικτών Διαφοροποίηση των μεσεγχυματικών κυττάρων που λαμβάνονται από ολόκληρο τον ομφάλιο λώρο. Για να διαπιστώσουμε κατά πόσο τα κύτταρα που απομονώνονται είναι πολυδύναμα κύτταρα πραγματοποιήθηκε επώαση των κυττάρων σε ειδικά θρεπτικά μέσα διαφοροποίησης για οστικά κύτταρα και λιποκύτταρα, όπως ακριβώς περιγράφηκε και στην διαφοροποίηση των μεσεγχυματικών κυττάρων από το υλικό έκπλυσης του πλακούντα Μικροβιολογικός έλεγχος Για να διαπιστώσουμε εάν η νέα μέθοδος απομόνωσης μεσεγχυματικών κυττάρων από τον ομφάλιο λώρο πληρεί όλες τις προϋποθέσεις για εφαρμογή για κυτταρικές θεραπείες πραγματοποιήθηκε μικροβιολογικός έλεγχος για αερόβια και αναερόβια βακτήρια.

81 80 6. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ USSCS ΜΕ ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΛΙΠΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ Στη μελέτη αυτή μελετήθηκε η επίδραση των βλαστοκυττάρων από το λιπώδη ιστό στην πλαστικότητα των καλλιεργειών ομφαλοπλακουντιακού αίματος και στην ικανότητα απομόνωσης υπερπολυδύναμων βλαστικών κυττάρων (USSCs). Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν συνκαλλιέργειες βλαστοκυττάρων λιπώδους ιστού με βλαστοκύτταρα ομφαλοπλακουντιακού αίματος Απομόνωση βλαστοκυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος Πραγματοποιήθηκε μείωση του όγκου του ομφαλοπλακουντιακού αίματος και απομάκρυνση των ερυθρών σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφηκε παραπάνω μέσα στον τριπλό ασκό συλλογής. Έγινε μέτρηση του συνολικού αριθμού εμπύρηνων κυττάρων των δειγμάτων και του αριθμού των αιμοποηιτκών βλαστικών κυττάρων με τη βοήθεια του κυτταρικού αναλυτή και του κυτταρόμετρου ροής (Beckman Coulter EPICS XL/MCL) με τη χρήση stem kit Απομόνωση βλαστικών κυττάρων από το λιπώδη ιστό Έγινε συλλογή δείγματος λιπώδους ιστού από ασθενείς κατά τη διάρκεια προγραμματισμένου χειρουργείου. Η συλλογή έγινε με τη σύμφωνη γνώμη του δότη και ο ιστός μεταφέρθηκε σε αποστειρωμένο δοχείο για περαιτέρω επεξεργασία. Κάτω από άσηπτες συνθήκες το τμήμα του λιπώδους ιστού αποστειρώθηκε με διάλυμα betadine, στη συνέχεια με αλκοόλη 100% και τέλος ξεπλύθηκε με φυσιολογικό ορό για την απομάκρυνση του αίματος. Στη συνέχεια ο ιστός τεμαχίστηκε με αποστειρωμένο νυστέρι σε όσο το δυνατόν μικρότερα κομμάτια και μεταφέρθηκε σε ειδικό ασκό συλλογής για την επεξεργασία του λιπώδους ιστού. Έγινε προσθήκη διαλύματος κολλαγεννάσης και επώαση για χρονικό διάστημα μιας ώρας. Στη συνέχεια με διαδοχικές φυγοκεντρήσεις έγινε η συλλογή ιζήματος πλούσιου σε βλαστικά κύτταρα από το λιπώδη ιστό.

82 Κυτταρικές καλλιέργειες Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε ειδικές καλλιεργητικές πλάκες Τ25 (costar) σε συγκέντρωση 5-7Χ10 6 κύτταρα/ml, σύμφωνα με τους Kogler και συν., Το θρεπτικό μέσο που χρησιμοποιήθηκε για την δημιουργία αποικιών πολυδύναμων κυττάρων ήταν DMEM με την προσθήκη 30% FCS, δεξαμεθαζόνης (10-7 mol/l; Sigma-Aldrich), πενικιλίνης (100 U/mL;Grünenthal), στρεπτομυκίνης(0.1 mg/ml; Hefa-pharma) και γλουταμίνης(2 mmol/l; Cambrex). Για την απομόνωση και δημιουργία πολυδύναμων αποικιών το FCS και η δεξαμεθαζόνη χρησιμοποιήθηκαν ουσιαστικά σαν αυξητικοί παράγοντες. Την επόμενη μέρα πραγματοποιήθηκε αλλαγή του θρεπτικού μέσου με παρόμοιο θρεπτικό μέσο στο οποίο απουσίαζε η δεξαμεθαζόνη. Στις καλλιέργειες του ομφαλοπλακουντιακού αίματος προστέθηκε μικρή ποσότητα βλαστικών κυττάρων από την επεξεργασία του λιπώδους ιστού (1Χ10 4 κύτταρα/ml,). Τα κύτταρα στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε επωαστικό κλίβανο ο οποίος περιείχε 5% CO 2. Η αλλαγή του θρεπτικού υλικού γινόταν κάθε 3-5 ημέρες ενώ ο έλεγχος του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, της μορφολογίας τους και της συμπεριφοράς τους εν γένει στο καλλιεργητικό υλικό γινόταν με τη βοήθεια ανάστροφου μικροσκοπίου. Όταν τα κύτταρα έφταναν σε πυκνότητα 80% πραγματοποιούνταν αποκόλληση από την επιφάνεια της φλάσκας με διάλυμα 0,25% τρυψίνης/edta Κυτταρομετρία ροής Παράλληλα αμέσως μετά πραγματοποιήθηκε μέτρηση των κυττάρων της συνκαλλίεργειας και της βιωσιμότητας τους με τη βοήθεια κυτταρομετρίας ροής. Για το σκοπό αυτό έγινε επώαση των κυττάρων για 20 λεπτά στο σκοτάδι με ειδικούς δείκτες των πολυδύναμων κυττάρων (unrestricted somatic stem cells-usscs), συνδεδεμένους με ειδικές χρωστικές. Ειδικότερα έγινε επώαση με τα αντισώματα CD29, CD44, CD49e, CD45 τα οποία ήταν συνδεδεμένα με τη χρωστική φλουορεσκεϊνη (FITC), με το αντίσωμα CD90 το οποίο ήταν συνδεδεμένο με τη χρωστική PC5 και με τα αντισώματα CD105, CD34, CD51, Stro-1, CD117, CD133, και γλυκοφορίνη Α τα οποία ήταν συνδεδεμένα με την φυκοερυθρίνη (PE). Η μέτρηση της βιωσιμότητας των κυττάρων έγινε με τη χρωστική 7- ακτινομυκίνη (7- ΑΑD). To κυτταρόμετρο που χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη αυτή ήταν το Beckman-Coulter FC500 flow cytometer (Beckman-Coulter, Miami, FL, USA).

83 82 7. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΙΚΡΩΝ ΣΕ ΜΕΓΕΘΟΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΣΩΜΑ ΤΟΥ ΟΜΦΑΛΙΟΥ ΛΩΡΟΥ ΠΟΥ ΕΚΦΡΑΖΟΥΝ ΔΕΙΚΤΕΣ ΕΜΒΡΥΪΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Είναι γνωστό ότι και άλλοι ιστοί εκτός από τα γονιμοποιημένα ωάρια εκφράζουν κοινούς δείκτες και παρουσιάζουν παρόμοια μορφολογία σε κυτταρικές καλλιέργειες. Στη μελέτη αυτή μελετήθηκε η τυχόν ύπαρξη στο σώμα του ομφαλίου λώρου κυττάρων μικρών σε μέγεθος που εκφράζουν δείκτες πολυδύναμων κυττάρων, όπως CXR184, Oct και Nanog. Για το σκοπό αυτό δημιουργήθηκε ειδικό πρωτόκολλο κυτταρομετρίας ροής και παρατήρηση των κυττάρων με τη βοήθεια ανάστροφου μικροσκοπίου και χρώση με ειδικές χρωστικές Κυτταρομετρία ροής Κύτταρα τα οποία απομονώθηκαν από το σώμα του ομφάλιου λώρου με την τεχνική που περιγράφηκε παραπάνω επωάστηκαν με ειδικά αντισώματα. Αρχικά πραγματοποιήθηκε επώαση των κυττάρων με τα επιφανειακά αντισώματα CXR184 και CD45. Η επώαση πραγματοποιήθηκε για 20 λεπτά στο σκοτάδι. Στη συνέχεια έγινε μονιμοποίηση των κυττάρων με την προσθήκη 4% παραφορμαλδεϋδης. Μετά από χρονικό διάστημα 20 λεπτών απομακρύνθηκε το μονιμοποιηιτικό, έγιναν δυο διαδοχικές πλύσεις με PBS και προστέθηκε στα κύτταρα διάλυμα 0.1 %Tris για τη δημιουργία οπών στην κυτταρική μεμβράνη. Μετά από 10 λεπτά το διάλυμα απομακρύνθηκε και ακολούθησαν δυο διαδοχικές πλύσεις με PBS. Στη συνέχεια έγινε επώαση με τα αντισώματα Oct και Nanog για 20 λεπτά στο σκοτάδι. Στη συνέχεια η παρουσία των εμβρυικών δεικτών μελετήθηκε με τη βοήθεια του κυτταρόμετρου ροής Κυτταρικές καλλιέργειες Κύτταρα τα οποία απομονώθηκαν από το σώμα του ομφάλιου λώρου καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό υλικό DMEM με την προσθήκη 30% FCS, δεξαμεθαζόνης (10-7 mol/l; Sigma-Aldrich), πενικιλίνης (100 U/mL;Grünenthal), στρεπτομυκίνης(0.1 mg/ml; Hefa-pharma) και γλουταμίνης (2 mmol/l; Cambrex). Μεσεγχυματικά κύτταρα τα οποία είχαν προσκολληθεί στην επιφάνεια καλλιεργητικών πλακών χρησιμοποιήθηκαν σαν στρώμα για την καλλιέργεια των πολυδύναμων εμβρυϊκών κυττάρων. Η αλλαγή του θρεπτικού μέσου γινόταν κάθε 3-

84 83 5 ημέρες. Η παρατήρηση των κυττάρων έγινε με τη βοήθεια ανάστροφου μικροσκοπίου. Κύτταρα από το υπερκείμενο της καλλιέργειας αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής Χρώση των πολυδύναμων κυττάρων από το σώμα του ομφαλίου λώρου με αλκαλική φωσφατάση Είναι γνωστό ότι τα εμβρυϊκά κύτταρα χαρακτηρίζονται από υψηλή έκφραση ενός ενζύμου, της αλκαλικής φωσφατάσης. Για το λόγο αυτό πραγματοποιήθηκε χρώση των καλλιεργειών με αλκαλική φωσφατάση. Για τη χρώση ακολουθήθηκε η εξής διαδικασία: Αρχικά απομακρύνθηκε το υπερκείμενο θρεπτικό διάλυμα. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε μονιμοποίηση των κυττάρων με την προσθήκη 4% παραφορμαλδεϋδης για 1-2 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Επώαση για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα οδηγεί σε απενεργοποίηση του ενζύμου της αλκαλικής φωσφατάσης. Έπειτα από την απομάκρυνση του μονιποιητικού με αποστειρωμένο νερό έγινε η προσθήκη της χρωστικής. Έγινε επώαση για δεκαπέντε λεπτά της ώρας στο σκοτάδι και στη συνέχεια έγινε απομάκρυνση της περίσσειας της χρωστικής με διαδοχικές πλύσεις με αποστειρωμένο νερό. Τέλος έγινε κάλυψη των κυττάρων με διάλυμα PBS. Η παρατήρηση των αποικιών των κυττάρων που εκφράζουν την αλκαλική φωσφατάση και επομένως χρωματίζονται, έγινε με τη βοήθεια του ανάστροφου μικροσκοπίου Χρώση των κυττάρων με πολυδύναμους εμβρυϊκούς δείκτες Αρχικά απομακρύνθηκε το υπερκείμενο θρεπτικό διάλυμα. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε μονιμοποίηση των κυττάρων με την προσθήκη 4% παραφορμαλδεϋδης για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθησε απομάκρυνση του μονιμοποιητικού, πλύση με PBSκαι στη συνέχεια προστέθηκε στα κύτταρα διάλυμα 0.1 %Tris για τη δημιουργία οπών στην κυτταρική μεμβράνη. Μετά από 10 λεπτά το διάλυμα απομακρύνθηκε και ακολούθησαν δυο διαδοχικές πλύσεις με PBS. Στη συνέχεια προστέθηκαν οι ειδικές χρωστικές για εμβρυϊκούς δείκτες και πραγματοποιήθηκε επώαση στο σκοτάδι για χρονικό διάστημα 60 λεπτών. Ακολούθησαν δυο διαδοχικές πλύσεις για την αφαίρεση της περίσσειας του αντισώματος και παρατήρηση με τη βοήθεια μικροσκοπίου φθορισμού.

85 84 AΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1.ΜΕΛΕΤΗ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΠΟΥ ΚΑΘΟΡΙΖΟΥΝ ΤΗΝ ΠΟΙΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ 1.1. Χαρακτηριστικά στοιχεία των δειγμάτων συλλογής για τη μελέτη 13 δείγματα ομφαλοπλακουντιακού αίματος συλλέχθηκαν για αυτή τη μελέτη. Η μέση τιμή του όγκου αίματος των δειγμάτων ήταν 81.85±25.3 ml (mean± SD). Ο αριθμός, η βιωσιμότητα των εμπύρηνων κυττάρων και ο αριθμός των μονοκυττάρων, των CD34 + και των HPCs κυττάρων αμέσως μετά τη συλλογή παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 4). Πίνακας 4. Χαρακτηριστικά στοιχεία των δειγμάτων ομφαλοπλακουντιακού αίματος (N=13) κατά τη συλλογή. Χαρακτηριστικά Mean ± SD Διακύμανση Όγκος (ml) ± Εμπύρηνα κύτταρα 9.1 ± Βιωσιμότητα (%) ± Μονοκύτταρα (10-6 ) ± CD34 + κύτταρα(10-6 ) 4.98 ± HPCs(10-6 ) 4.26 ± Επίδραση της θερμοκρασίας και του χρόνου καθυστέρησης της επεξεργασίας του δείγματος Η επίδραση του χρόνου καθυστέρησης της επεξεργασίας του δείγματος από τη στιγμή της συλλογής του πραγματοποιήθηκε με μετρήσεις του αριθμού των κυττάρων σε διάφορες χρονικές στιγμές (12, 24 και 48 ώρες) και σε δυο διαφορετικές θερμοκρασίες (4 o C και 25 o C) (Διάγραμμα 1).

86 sample 1 sample 2 Per cent recovery of CD34+ cells oC 12h 4o C 12h 25oC 24h 4o C 24h 25oC 48h 4o C 48h 25oC 72h 4o C 72h sample 3 sample 4 sample 5 sample 6 sample 7 sample 8 sample 9 sample 10 sample 11 sample 12 sample 13 Διάγραμμα 1. Επί τοις εκατό ανάκτηση των CD34 + κυττάρων σε δυο διαφορετικές θερμοκρασίες. αιμοποιητικών βλαστικών Παρατηρήθηκε σημαντική συσχέτιση του αριθμού των εμπύρηνων κυττάρων, των μονοκυττάρων, των CD34 + και των HPCs και των δυο παραμέτρων που μελετήθηκαν. Ειδικότερα παρατηρήθηκε μια σημαντική μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων όσο αυξάνεται το χρονικό διάστημα μεταξύ της συλλογής και της επεξεργασίας των δειγμάτων ομφαλοπλακουντιακού αίματος. Για το χρονικό διάστημα των πρώτων δώδεκα ωρών η μείωση της βιωσιμότητας αλλά και του αριθμού των κυττάρων είναι μικρή για τα δείγματα, στη συνέχεια όμως όσο αυξάνεται το χρονικό διάστημα της καθυστέρησης τόσο περισσότερο μειώνεται ο αριθμός και η βιωσιμότητα των δειγμάτων. Η απώλεια ήταν μεγαλύτερη σε δείγματα τα οποία διατηρήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου σε σχέση με αυτά που διατηρήθηκαν στο ψυγείο. Παρακάτω παρατίθενται η απώλεια των εμπύρηνων κυττάρων, των CD34 + και των HPCs στις δυο διαφορετικές θερμοκρασίες (Διάγραμμα 2).

87 86 Percent recovery of NCS o C 25o C Percent recovery of CD o C 25o C Percent recovery of HPCs o C 25o C 0 12 h 24 h 48 h 72 h 0 12 h 24 h 48 h 72 h 0 12 h 24 h 48 h 72 h Διάγραμμα 2. Μείωση του αριθμού των εμπύρηνων κυττάρων, των CD34 + HPCs στις δυο διαφορετικές θερμοκρασίες και των Ειδικότερα η ανάκτηση των εμπύρηνων κυττάρων ύστερα από 24 ώρες για τα δείγματα που διατηρήθηκαν στους 25 o C ήταν για τα εμπύρηνα κύτταρα 61.2 ± 4.02 %, για τα CD34 + αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα ήταν 59.6 ± και για τα HPCs ήταν 57.6 ± 4.8 %. Για τα δείγματα που διατηρήθηκαν στους 4 o C παρατηρήθηκε μια σχετική σταθερότητα στον αριθμό των κυττάρων μέχρι το χρονικό διάστημα των 24 ωρών από τη συλλογή με την ανάκτηση των κυττάρων να είναι πάνω από 80 %. Η ανάκτηση των κυττάρων μετά από την παρέλευση 72 ωρών μειώθηκε σημαντικά για όλους τους τύπους των κυττάρων για τα δείγματα που διατηρήθηκαν στους 25 o C με τιμές κοντά στο 20%. Για τα δείγματα που διατηρήθηκαν στους 4 o C η ανάκτηση των εμπύρηνων κυττάρων ήταν ± 5.1 ενώ τα αιμοποιητικά CD34 + και HPCs βλαστικά κύτταρα παρουσίασαν υψηλότερη ανάκτηση με τιμές 62.3 ± 4.48 % και 61.9 ± 3.89 αντίστοιχα. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν και όσον αφορά την ύπαρξη πρόδρομων αιμοποιητικών κυττάρων υπεύθυνων για το σχηματισμό αιμοποιητικών αποικιών. Ειδικότερα παρατηρήθηκε μια δραματική μείωση στον αριθμό των προγονικών κυττάρων που μπορούν να σχηματίσουν αποικίες, καθώς η ανάκτηση των αιμοποιητικών αποικιών για δείγματα τα οποία διατηρήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου ήταν 57.6 ± 4.8 % μόλις ύστερα από 24 ώρες. Αντίθετα σε δείγματα τα οποία διατηρήθηκαν στους 4 o C το ποσοστό ήταν πάνω από 80 % και πολύ υψηλότερο ακόμα και μετά την παρέλευση 72 ωρών από την παραλαβή του δείγματος (61.9 ± 3.89) σε σχέση με δείγματα τα οποία διατηρήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για διάστημα μόλις 24 ωρών. Στο παρακάτω διάγραμμα

88 87 φαίνονται συγκριτικά τα αποτελέσματα για δείγματα τα οποία διατηρήθηκαν στους 4 o C και 25 o C όσον αφορά τον αριθμό των HPCs αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων, των MNCs και του αριθμού των αιμοποιητικών αποικιών CFUs στα διάφορα χρονικά διαστήματα (24, 48 και 72 ώρες ) (Διάγραμμα 3) C 4 0 C 4 0 C C 25 0 C 25 0 C Percentage of recovery HPCs MNCs CFU HPCs MNCs CFU HPCs MNCs CFU HPCs MNCs CFU HPCs MNCs CFU HPCs MNCs CFU Time of delay in hours Διάγραμμα 3. Επί τοις εκατό ανάκτηση των HPCs αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων, των MNCs και του αριθμού των αιμοποιητικών αποικιών CFUs στα διάφορα χρονικά διαστήματα (24, 48 και 72 ώρες) Όσον αφορά τον έλεγχο συσχέτισης των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων σε σχέση με τον αρχικό όγκο διαπιστώθηκε θετική συσχέτιση του όγκου αίματος και του αριθμού των λευκοκυττάρων και των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων(p<0.0001), αλλά και θετική συσχέτιση μεταξύ των λευκοκυττάρων και των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων(p<0.0001). Έτσι λοιπόν ο συνολικός όγκος ενός δείγματος μπορεί να αποτελέσει ένα δείκτη πρώιμο της ποιοτικής κατάστασης ενός ομφαλοπλακουντιακού δείγματος.

89 88 2. ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΜΟΝΑΔΩΝ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΜΕ ΣΤΟΧΟ ΤΗΝ ΥΨΗΛΗ ΑΝΑΚΤΗΣΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕΤΑ ΤΗΝ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ Όπως παρουσιάζεται στον πίνακα 5, εφαρμόζοντας το συγκεκριμένο πρωτόκολλο επεξεργασίας για τα 150 δείγματα επιτεύχθηκε μείωση του όγκου σε 6 ± 1.5 ml. Η απομάκρυνση των ερυθρών αιμοσφαιρίων (RBC) από τα δείγματα επιτεύχθηκε σε πολύ υψηλό ποσοστό ενώ συγχρόνως η βιωσιμότητα των εμπύρηνων λευκών αιμοσφαιρίων παρέμεινε ακέραια. Πίνακας 5. Χαρακτηριστικά των 150 δειγμάτων ομφαλοπλακουντιακού αίματος πριν και μετά την επεξεργασία πριν μετά Όγκος (ml)* 75.4± ±1.5ml RBC μείωση (%)* ± 1.1 ( ) Βιωσιμότητα (%) Εμπύρηνα κύτταρα 91.4±2.8 ( ) 90.7±1.2 ( ) Μικροβιακό φορτίο αρνητικό αρνητικό *Mean ± SD (διακύμανση) Επιπλέον όπως παρουσιάζεται στον πίνακα 6 τα κύτταρα διατήρησαν τη βιωσιμότητα τους και μετά την διαδικασία της μείωσης του όγκου και της απομάκρυνσης των ερυθρών.

90 89 Πίνακας 6. Αριθμός κυττάρων ( 10 6 ) πριν και μετά την κατάψυξη και % ανάκτηση για τα150 δείγματα ομφαλοπλακουντιακού αίματος Τύπος κυττάρων πριν μετά ανάκτηση (%) Εμπύρηνα 1294± ± ±2.3 Μονοκύτταρα 568±84 544± ±3.1 CD34 + HPC 5.7± ± ±1.5 Η ανάκτηση των κυττάρων μετά τη διαδικασία της κρυοσυντήρησης υπολογίστηκε για 25 δείγματα. Η ανάκτηση ήταν γύρω στο 80 % για τα εμπύρηνα κύτταρα, ενώ για τα αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα 96 %. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 7). Πίνακας 7. Αριθμός κυττάρων και CFU ( 10 6 ) και % ανάκτηση μετά από κατάψυξη-απόψυξη 25 δειγμάτων) Τύπος κυττάρων Πριν την επεξεργασία Μετά επεξεργασία Μετά DMSO Απόψυξη Ανάκτηση (%) Εμπύρηνα κύτταρα 1014± ± ± ± ±5.4 Μονοκύτταρα * 486± ±98 469± ± ±4.4 CD34 + HPC* 4.7±4 4.6±5 4.6± ±1.3 96±2.5 *mean±sd CFU* 2.7± ±07 2.7± ± ±4.1 Ο αριθμός των εμπύρηνων κυττάρων, των βλαστικών κυττάρων αλλά και άλλων παραμέτρων αιματολογικών (παράμετροι αιμοπεταλίων και ερυθρών αιμοσφαιρίων) ήταν οι ίδιοι πριν και μετά τη διαδικασία. Δεν παρατηρήθηκε συσσώρευση των αιμοπεταλίων. Μια σημαντική αύξηση του αριθμού των αιμοπεταλίων παρατηρήθηκε πριν από τη διαδικασία της κρυοσυντήρησης. Ωστόσο ο αριθμός των αιμοπεταλίων

91 90 μειώθηκε μετά την προσθήκη του DMSO και την απόψυξη (p<0.05). Αυτή η μείωση ακολούθησε αύξηση (p<0.05) μετά την απόψυξη των MPV και PWD (Πίνακας 8). Πίνακας 8: Παράμετροι αιμοπεταλίων για τα 25 δείγματα πριν μετά μετά DMSO απόψυξη αιμοπετάλια * ± ± ± ±504.2 MPV 6.7± ± ± ±0.4 PCT(%) 0.125± ± ± ±0.423 PWD (%) 16.8± ± ± ±0.51 *( 10 3 /µl)

92 91 3. ΜΕΘΟΔΟΣ ΣΥΛΛΟΓΗΣ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΑΠΟ ΤΟΝ ΠΛΑΚΟΥΝΤΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΑ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΩΝ ΒΛΑΣΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Για τη μελέτη αυτή έγινε συλλογή 68 δειγμάτων πλακούντα. Η έκπλυση του πλακούντα οδήγησε σε μεγαλύτερο αριθμό CD45 + και CD34 + βλαστικών κυττάρων, σε μετρήσεις με κυτταρικό αναλυτή και κυτταρόμετρο ροής, όπως φαίνεται από τους παρακάτω πίνακες (Πίνακας 9), (Πίνακας 10). Πίνακας 9. Στοιχεία των δειγμάτων από το πρώτο στάδιο Όγκος 1 (ml) NCs (X10 9 ) Cd45 + (X10 8 ) CD34 + HPCs (X10 6 ) Βιωσιμότητα (%) Μέσος όρος SEM Mεγ Ελαχ Πίνακας 10. Στοιχεία δειγμάτων από το δεύτερο στάδιο της έκπλυσης του πλακούντα Μέσος όρος Όγκος 2 (ml) NCs (X10 9 ) Cd45 (X10 8 ) Cd34 HPCs (X10 6 ) Βιωσιμότητα (%) , SEM Μέγ Ελαχ Τα δείγματα αναλύθηκαν με τη βοήθεια κυτταρομετρίας ροής για την ύπαρξη αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων. Παρακάτω παρατίθεται ένα παράδειγμα κυτταρομετρίας ροής από τα πρώτο και το δεύτερο στάδιο συλλογής (Διάγραμμα 4).

93 92 Διάγραμμα 4. Συγκριτική ανάλυση του αιμοποιητικού δυναμικού δείγματος από το πρώτο (Α.Β) και δεύτερο στάδιο συλλογής (C,D). A) CD45 θετικά κύτταρα από το πρώτο στάδιο συλλογής.. (B) CD45, CD34 αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα από το πρώτο στάδιο συλλογής. (C) CD45 θετικά κύτταρα από το δεύτερο στάδιο συλλογής. (έκπλυση πλακούντα) (D)CD45, CD34 αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα από το δεύτερο στάδιο συλλογής (έκπλυση πλακούντα). Για την εξέταση της ύπαρξης όχι μόνο αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων αλλά και πρόδρομων αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων ικανών να δημιουργούν όλες τις αιμοποιητικές σειρές, κύτταρα από την έκπλυση του πλακούντα εξετάστηκαν για το σχηματισμό αιμοποιητικών αποικιών. Τα κύτταρα σχημάτισαν αιμοποιητικές αποικίες και από τις 3 κυτταρικές σειρές (Εικόνα 6)

94 93 Εικόνα 6. Πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα που απομονώνονται από τον πλακούντα σχηματίζουν αιμοποιητικές αποικίες και των τριών κυτταρικών σειρών: α)cfu-gm, β)bfu-e και γ)cfu-g, αντίστοιχα. Τα δείγματα από το πρώτο και από το δεύτερο στάδιο μελετήθηκαν για την ύπαρξη μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων. Καταρχήν τα δείγματα επωάστηκαν με ειδικούς μεσεγχυματικούς δείκτες και έγινε μέτρηση των μεσεγχυματικών κυττάρων με τη βοήθεια κυτταρόμετρου ροής. Ειδικότερα τα δείγματα επωάστηκαν με τα αντισώματα CD29-FITC και CD105-PE. Στο παρακάτω διάγραμμα διαφαίνεται η μεγάλη διαφορά στον αριθμό των μεσεγχυματικών κυττάρων που λαμβάνονται από τα δυο στάδια (Διάγραμμα 5).

95 94 Διάγραμμα 5. Συγκριτική απεικόνιση του αριθμού των μεσεγχυματικών κυττάρων που λαμβάνονται από τα δυο στάδια συλλογής. Τα κύτταρα επωάστηκαν με ειδικούς μεσεγχυματικούς δείκτες CD29-FITC και CD105-PE. Τα κύτταρα που εμφανίζονται στην περιοχή R3 του διαγράμματος (B,D) είναι θετικά στους παραπάνω μεσεγχυματικούς δείκτες και επομένως είναι μεσεγχυματικά. Στο διάγραμμα D στην περιοχή R3 μαζική συγκέντρωση μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων σε σύγκριση με την περιοχή R3 του διαγράμματος Β 3.1. Καλλιέργεια των μεσεγχυματικών κυττάρων του πλακούντα Κύτταρα από το δεύτερο στάδιο μεταφέρθηκαν σε ειδικές καλλιεργητικές πλάκες και καλλιεργήθηκαν σε πλήρες θρεπτικό υλικό. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν με τη βοήθεια ανάστροφου μικροσκοπίου, ενώ το θρεπτικό υλικό άλλαζε κάθε 3 με πέντε ημέρες. Παρατηρήθηκε ότι τα κύτταρα άρχισαν να προσκολλώνται στην επιφάνεια των καλλιεργητικών πλακών και άρχισαν να εκτείνουν αποφυάδεςψευδοπόδια (Εικόνες 7-8).

96 95 Εικόνες 7-8. Κύτταρα από την έκπλυση του πλακούντα τα οποία ύστερα από την παρέλευση λίγων ωρών προσκολλώνται στις καλλιεργητικές πλάκες. Μετά από χρονικό διάστημα 3-5 ημερών τα κύτταρα άρχισαν να παρουσιάζουν τυπική εικόνα ινοβλαστών και να πολλαπλασιάζονται με ταχείς ρυθμούς μέσα στο καλλιεργητικό υλικό (Εικόνες 9-10). Εικόνες Τυπική μορφολογία μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από το υλικό έκπλυσης του πλακούντα. Μόλις τα κύτταρα κάλυπταν το 80% της επιφάνειας των καλλιεργητικών πλακών γινόταν αποκόλληση τους με την προσθήκη διαλύματος τρυψίνης και επώαση για χρονικό διάστημα δέκα λεπτών στον κλίβανο. Στη συνέχεια τα κύτταρα

97 96 από την καλλιέργεια επωάζονταν με μεσεγχυματικούς δείκτες για την μελέτη της διατήρησης του μεσεγχυματικού τους χαρακτήρα και μετά την καλλιέργεια. Τα δείγματα αναλύθηκαν με τη βοήθεια κυτταρομετρίας ροής. Ειδικότερα έγινε επώαση με CD29-FITC και CD105-PE και CD90-PC5 (Διάγραμμα 6). Διάγραμμα 6..Κυτταρομετρία ροής των δειγμάτων του δευτέρου σταδίου συλλογής (υλικό έκπλυσης πλακούντα) ύστερα από καλλιέργεια. Τα κύτταρα επωάστηκαν με ειδικούς μεσεγχυματικούς δείκτες CD29-FITC και CD105-PE και CD90-PC5. Τα δείγματα εκφράζουν σε μεγάλο ποσοστό τους μεσεγχυματικούς δείκτες σε σχέση με τα IgG-FITC και IgG-PE ισοτυπικά control Διαφοροποίηση των μεσεγχυματικών κυττάρων του πλακούντα Στη συνέχεια δείγματα που τοποθετήθηκαν σε καλλιεργητικό υλικό μετά από ανακαλλιέργειες τοποθετήθηκαν σε ειδικά μέσα διαφοροποίησης με σκοπό τη μελέτη της πλαστικότητας τους, κατά πόσο δηλαδή είναι ικανά να διαφοροποιούνται σε άλλους κυτταρικούς πληθυσμούς. Ειδικότερα καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικά μέσα για διαφοροποίηση σε οστικά κύτταρα και λιποκύτταρα με την προσθήκη ειδικών αυξητικών παραγόντων. Κύτταρα τα οποία καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικά μέσα χωρίς την προσθήκη των αυξητικών παραγόντων χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Είναι χαρακτηριστικό ότι όλα τα δείγματα τα οποία καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικά μέσα διαφοροποίησης διαφοροποιήθηκαν σε οστεοβλάστες και λιποκύτταρα. Για την διαπίστωση της διαφοροποίησης χρησιμοποιήθηκαν ειδικές χρώσεις. Ειδικότερα για τη μελέτη της διαφοροποίησης σε οστικά κύτταρα χρησιμοποιήθηκε η αλιζαρίνη, η οποία έχει την ιδιότητα να επικάθεται στις εναποθέσεις ασβεστίου των οστικών κυττάρων (Εικόνα 11).

98 97 Εικόνα 11. Α Διαφοροποίηση των μεσεγχυματικών κυττάρων από τον πλακούντα σε οστικά κύτταρα. Η αλιζαρίνη χρωματίζει κόκκινες τις εναποθέσεις ασβεστίου των οστικών κυττάρων Β. Καλλιέργεια-μάρτυρας μεσεγχυματικών κυττάρων από τον πλακούντα Μεσεγχυματικά κύτταρα από τον πλακούντα καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό υλικό διαφοροποίησης για λιποκύτταρα. Η παρατήρηση έγινε με τη βοήθεια της χρωστικής Oil Red O (Sigma). Τέλος έγινε η προσθήκη αιματοξυλίνης η οποία έχει την ιδιότητα να χρωματίζει με μπλε χρώμα του πυρήνες των κυττάρων. Η παρατήρηση των κυττάρων έγινε με τη βοήθεια του ανάστροφου μικροσκοπίου. Τα κύτταρα τα οποία έχουν διαφοροποιηθεί σε λιποκύτταρα αναγνωρίζονται από την κόκκινη χρώση των λιποσταγονιδίων από το Oil Red O και από την μπλε χρώση των πυρήνων με την προσθήκη της αιματοξυλίνης (Εικόνα 12). Εικόνα 12.C. Διαφοροποίηση των μεσεγχυματικών κυττάρων από τον πλακούντα σε λιποκύτταρα. Τα κύτταρα τα οποία έχουν διαφοροποιηθεί σε λιποκύτταρα αναγνωρίζονται από την κόκκινη χρώση των λιποσταγονιδίων με το Oil Red O και

99 98 από την μπλε χρώση των πυρήνων μετά την προσθήκη της αιματοξυλίνης.d. Καλλιέργεια-μάρτυρας μεσεγχυματικών κυττάρων από τον πλακούντα 3.3. HLA ανάλυση Στη συνέχεια μελετήθηκε η παρουσία μητρικού DNA στο υλικό έκπλυσης του πλακούντα. Για το σκοπό αυτό αναλύθηκε το DNA στο υλικό έκπλυσης του πλακούντα, στο ομφαλοπλακουντιακό αίμα που λαμβάνεται από το πρώτο στάδιο συλλογής κα στον ιστό του σώματος του ομφαλίου λώρου. Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε η PCR ανάλυση και ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε διάλυμα αγαρόζης. Τα αλληλόμορφα τα οποία μελετήθηκαν ήταν τα αλληλόμορφα της κλάσης-1, HLA-A*, -B* and -C* και τα αλληλόμορφα της κλάσης-2, HLA-DRB1*, DRB3*, DRB4*, DRB5* and DQB1*. Διαπιστώθηκε ότι το DNA και από τις τρεις πηγές του ίδιου δείγματος παρουσίαζαν τα ίδια αλληλόμορφα κατά την ηλεκτροφόρηση στο διάλυμα αγαρόζης. (Εικόνα 13)

100 99 Εικόνα 13. Παράδειγμα HLA typing DNA που προέρχεται από το ίδιο δείγμα (A) ομφαλοπλακουντιακό αίμα (πρώτο στάδιο), (B) έκπλυση πλακούντα (δεύτερο στάδιο) και (C) ιστός από τον ομφάλιο λώρο αντίστοιχα. Τα δείγματα αναλύθηκαν με τη βοήθεια PCR. στήλη 1, στήλη 26 : DNA μοριακοί δείκτες μεγέθους 100bp. Στήλη 2 : αρνητικός μάρτυρας.στήλες 3-24 άνω γραμμή PCR μάρτυρες. Παράδειγμα στήλη 5 κάτω γραμμή DRB1* 15. Στήλη 10 DRB1* 03. Στήλη 24 DRB4* 01.Στήλη 25 DRB5* 01. Τα ίδια αλληλόμορφα παρουσιάζονται στο ομφαλοπλακουντιακό αίμα, στην έκπλυση του πλακούντα και στον ιστό του ομφαλίου λώρου του ίδιου δείγματος. Ένα βασικό στάδιο μελέτης της μεθόδου ανάλυσης των ΗLA αλληλόμορφων ήταν η μελέτη της ευαισθησίας της μεθόδου, μέχρι ποιο ποσοστό δηλ. ανιχνεύει την παρουσία μητρικού DNA στα δείγματα. Για το σκοπό αυτό έγινε ανάλυση του HLA του περιφερικού αίματος της μητέρας και του ομφαλοπλακουντιακού αίματος από τα πρώτο στάδιο συλλογής (Εικόνα 14).

101 100 Εικόνα 14. Ανάλυση αλληλόμορφων HLA από το περιφερικό αίμα της μητέρας και από το ομφαλοπλακουντιακό αίμα αντίστοιχα. στήλη 1, στήλη 26 : DNA μοριακοί δείκτες μεγέθους 100bp. Στήλες 3-24 άνω γραμμή PCR μάρτυρες. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παραπάνω είκόνας η μητέρα διαθέτει αλληλόμορφα στη θέση 10 και 24 είναι τα αλήλια DRB1* 04 και DRB4* 01 αντίστοιχα τα οποία δεν ανευρίσκονται στο αίμα του παιδιού. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε μίξη περιφερικού αίματος της μητέρας σε διάφορες αραιώσεις με ομφαλοπλακουντιακό αίμα. Οι αραιώσεις οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν ήταν 5%, 2%, 1 %, 0.5% και 0.1 %. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση των υλικών μίξης και αναζήτηση του σημείου εκείνου στο οποίο εξαφανίζεται το DNA της μητέρας, δηλαδή αναζητήθηκε η αραίωση στην οποία εξαφανίζονται τα αλληλόμορφα της μητέρας, τα οποία δεν ανευρίσκονται κανονικά στο αίμα του παιδιού (Εικόνα 15).

102 101 Εικόνα 15. Ηλεκτροφόρηση δείγματος μίξης περιφερικού αίματος της μητέρας με ομφαλοπλακουντιακό αίμα. Μετά από την αραίωση 1% του μητρικού αίματος δεν ανιχνεύονται τα αλληλόμορφα του DNA της μητέρας. Στήλη 1, στήλη 26 : DNA μοριακοί δείκτες μεγέθους 100bp. Στήλες 3-24 άνω γραμμή PCR μάρτυρες.παράδειγμα :εξαφάνιση των αλληλόμορφων της μητέρας DRB1* 04 και DRB4* Μικροβιολογικός έλεγχος Δεν βρέθηκε κανένα δείγμα θετικό σε αερόβια και αναερόβια μικρόβια, γεγονός που δείχνει ότι η μέθοδος δεν αυξάνει το μικροβιακό φορτίο των δειγμάτων.

103 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΤΗΝ ΟΥΣΙΑ ΤΟΥ WHARTON 4.1. Απομόνωση κυττάρων και καλλιέργεια Μεσεγχυματικά κύτταρα απομονώθηκαν από 67 ομφάλιους λώρους και μετρήθηκαν σε αιματοκυτταρομετρητή Neubauer. Ο μέσος όρος των κυττάρων που απομονώθηκαν ήταν 260 x 10 3 βιώσιμα κύτταρα ανά εκατοστό λώρου ( x 10 3 /εκ. λώρου). Η βιωσιμότητα με τη μέθοδο trypan blue ήταν 97.6% ± 3.1%. Τα κύτταρα εμφάνιζαν χαρακτήρες ινοβλαστών τοποθέτηση στην καλλιέργεια (Εικόνα 16). 24 ώρες μετά την Εικόνα 16. Μορφολογικά χαρακτηριστικά κυττάρων που καλλιεργήθηκαν αμέσως μετά την απομόνωση στην πρώτη (A) και τρίτη ημέρα (B). Κύτταρα μετά την πρώτη ανακαλλιέργεια στην τρίτη (C) και έβδομη (D) ημέρα. (Μεγέθυνση x 10).

104 103 Ο αρχικός αριθμός των κυττάρων που καλλιεργήθηκαν ήταν 5.2 x 10 3 κύτταρα/cm 2, και η επιφάνεια της πλάκας καλύφθηκε μετά από 14.3 ± 7.9 ημέρες (Πίνακας 11). Πίνακας 11: Ο χρόνος που χρειάστηκε για να ολοκληρωθεί η καλλιέργεια αμέσως μετά την απομόνωση των κυττάρων από τον ομφάλιο λώρο σε σχέση με την αρχική πυκνότητα κυττάρων που καλλιεργήθηκε. Πυκνότητα κυττάρων (x 10 3 /cm 2 ) Ημέρες για ολοκλήρωση της καλλιέργειας ± ± ± ± ± ± Αριθμός δειγμάτων Με αυτή την αρχική πυκνότητα κυττάρων και κατά τη διάρκεια έξι ανακαλλιεργειών τα κύτταρα πολλαπλασιάστηκαν 300 φορές (307.9 φορές ± 49.7, n=3) Κυτταρομετρία ροής Η βιωσιμότητα των κυττάρων αμέσως μετά την απομόνωση ήταν 98.9 ± 1.1%, όπως καθορίστηκε μετά από χρώση με 7-ΑΑD. Επίσης τα κύτταρα ήταν θετικά ως προς την έκφραση του CD105 σε ποσοστό 81.9 ± 17.8%), του CD ± 1.4% και του CD ± 5.3% (n=67). Η βιωσιμότητα των καλλιεργειών ήταν 96 ± 3.6%, όπως καθορίστηκε μετά από χρώση με 7-ΑΑD (Διάγραμμα 7) (n=67).

105 104 Διάγραμμα 7. Έκφραση των μεσεγχυματικών επιφανειακών δεικτών σε αρχική καλλιέργεια σε ένα αντιπροσωπευτικό δείγμα. Επίσης η κατά μέσο όρο ποσοστιαία μείωση της έκφρασης του CD105 από την πρώτη μέχρι την έκτη ανακαλλιέργεια, για τρία δείγματα, ήταν 4.5%, ενώ δεν παρατηρήθηκε μείωση στην έκφραση του CD90 και του CD29 (n=3). Το παρακάτω διάγραμμα περιγράφει την πορεία της έκφρασης των μεσεγχυματικών δεικτών στη διάρκεια των έξι ανακαλλιεργειών (Διάγραμμα 8).

106 105 Διάγραμμα 8. Μ.Ο. ± τυπική απόκλιση της ποσοστιαίας έκφρασης των μεσεγχυματικών δεικτών σε τρία δείγματα από την πρώτη έως την έκτη καλλιέργεια Απόψυξη Η βιωσιμότητα μετά από απόψυξη των κυττάρων που κρυοσυντηρήθηκαν αμέσως μετά την απομόνωση ήταν 96.9 ± 1.5%, όπως καθορίστηκε μετά από χρώση με 7-ΑΑD (n=9). Η έκφραση των μεσεγχυματικών δεικτών στα αποψυχθέντα κύτταρα μετρήθηκε μετά από καλλιέργεια και συγκρίθηκε με τις αντίστοιχες τιμές προ της κρυοσυντήρησης (n=5). Τα κύτταρα που αποψύχθηκαν και καλλιεργήθηκαν έδειξαν υψηλότερη έκφραση των μεσεγχυματικών δεικτών (Πίνακας 12). Οι καλλιέργειες αυτές ολοκληρώνονταν μετά από 14 ± 4.4 μέρες, ενώ οι αντίστοιχες καλλιέργειες πριν την κρυοσυντήρηση χρειάζονταν 10 ± 0.5 μέρες.

107 106 Πίνακας 12: Μ.Ο. ± τυπική απόκλιση της ποσοστιαίας έκφρασης μεσεγχυματικών δεικτών στις αρχικές καλλιέργειες σε 5 δείγματα πριν την κρυοσυντήρηση και μετά από απόψυξη. Δείκτης Πριν την κρυοσυντήρηση (%) Απόψυξη (%) CD105 CD29 CD ± ± ± ± ± ± Τμήματα ομφαλίου λώρου Πέντε καλλιέργειες τμημάτων ομφαλίου λώρου συγκρίθηκαν μορφολογικά με αυτές που προήλθαν από το ίδιο δείγμα μέσω της ενζυμικής μεθόδου. Στις καλλιέργειες των τμημάτων αναπτύχθηκαν συμπαγείς αποικίες με πυκνά κέντρα οι οποίες εμφάνιζαν εστιακή αποκόλληση. (Εικόνα 17). B Εικόνα 17. Η ανάπτυξη τμημάτων του ομφαλίου λώρου στην καλλιέργεια μετά από 12 ημέρες (A) και 26 ημέρες (B). (Μεγέθυνση x 20 για το A και x 10 για το B). Η καλλιέργεια ολοκληρώνονταν πολύ αργότερα, 25 ± 8.7 ημέρες, σε σχέση με αντίστοιχες καλλιέργειες που ακολούθησαν μετά την ενζυμική μέθοδο, 15 ± 9.9 ημέρες. Εξαιτίας της δημιουργίας των συμπαγών μαζών, οι καλλιέργειες των τμημάτων του ομφαλίου λώρου δεν μπορούσαν να χαρακτηριστούν με

108 107 κυτταρομετρία ροής. Τέλος δεν παρατηρήθηκε πολλαπλασιασμός κυττάρων μετά από απόψυξη μικρών τεμαχίων Μικροβιολογικός έλεγχος Ο μικροβιολογικός έλεγχος ήταν αρνητικός όσον αφορά τη διαδικασία της μεθόδου αλλά και τις καλλιέργειες των κυττάρων

109 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΩΝ ΒΛΑΣΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΟΛΟΚΛΗΡΟ ΤΟ ΣΩΜΑ ΤΟΥ ΟΜΦΑΛΙΟΥ ΛΩΡΟΥ. Στη μελέτη αυτή στόχος ήταν η εφαρμογή μιας μεθόδου η οποία θα οδηγήσει σε περισσότερα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα τα οποία θα απομονώνονται από ολόκληρο το μήκος του ομφαλίου λώρου και από διάφορα σημεία του ιστού, που έχουν βρεθεί μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα και όχι αποκλειστικά και μόνο από την ουσία του Wharton. Μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα απομονώθηκαν από 12 ομφάλιους λώρους και καταμετρήθηκαν με τη βοήθεια Neubauer αιματοκυτταρόμετρου και με τη βοήθεια κυτταρομετρίας ροής. Το μέσο μήκος του ομφάλιου λώρου που χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη μας ήταν 31 cm (διακύμανση 22 cm -50 cm). Ο συνολικός αριθμός των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων υπολογίστηκε με την πλάκα Neubauer στα 0.46X10 6 /cm κύτταρα με διακύμανση ( X10 6 /cm ομφαλίου), ενώ με την κυτταρομετρία ο αριθμός υπολογίστηκε λίγο πιο ψηλός 0.65X10 6 /cm (διακύμανση X10 6 /cm) λόγω πιθανώς της ευαισθησίας του κυτταρόμετρου. Τα χαρακτηριστικά των κυττάρων που απομονώθηκαν από τους 12 ομφάλιους λώρους κατά τη μέτρηση με το Neubauer αιματοκυτταρόμετρο και με τη βοήθεια κυτταρομετρίας ροής φαίνονται στον παρακάτω πίνακα.( Πίνακας 13). Πίνακας 13. Συνολικός αριθμός και βιωσιμότητα των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων που απομονώθηκαν από το σώμα του ομφάλιου λώρου. (12 δείγματα). Μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα Βιωσιμότητα Κύτταρα/cm X10 6 Κύτταρα/gr X10 6 Κύτταρα/cord X10 6 %±SEM Neubauer αιμοκυτταρόμετρο 0.46 ( ) 0.52 ( ) (3.6-21) 94.3±0.65 Κυτταρόμετρο ροής 0.65 ( ) 0.74 ( ) 20.2 (4.1-38) 81.4±4.4

110 109 Όλοι οι προηγούμενοι ερευνητές οι οποίοι μελέτησαν την απομόνωση μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από τον ιστό του ομφάλιου λώρου αναφέρουν το συνολικό αριθμό των εμπύρηνων κυττάρων που απομονώνονται από τις μελέτες τους και όχι τον ακριβή αριθμό των μεσεγχυματικών κυττάρων. Ο μέσος όρος των εμπύρηνων κυττάρων που απομονώθηκαν από τη μελέτη μας ήταν 0.95X10 6 /cm ομφαλίου λώρου με διακύμανση X10 6 /cm που σημαίνει ότι σύμφωνα με τα αποτελέσματα μας από τα συνολικά εμπύρηνα κύτταρα το 68.4% ήταν μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα. Στον πίνακα 16 παρουσιάζονται συγκριτικές μελέτες σε σχέση με τη δική μας που αφορούν την απομόνωση μεσεγχυματικών κυττάρων από τον ομφάλιο λώρο. (Πίνακας 14). Πίνακας 14. Μελέτες που αφορούν το συνολικό αριθμό των εμπύρηνων κυττάρων που απομονώνονται από τον ομφάλιο λώρο Enzymatic procedure Εμπύρηνα κύτταρα* Βιωσιμότητα Ref Whole cord without mincing 2.7 mg/ml collagenase 0.95X 10 6 ( ±4.4 Tsagias et al. type I, 0.7 mg/ml hyalouronidase 2,5 % trypsin, 3 hours in PBS ) WTm, 0.075% collagenase type II 30 min,0.125% 1x10 6 NR Lu LL et al. ( trypsin 30 mins with gentle agitation at PBS WJm, collagenase type B (1μg/ml) in DMEM- 2.6 x10 4 NR Karahauseinoglu S et al Ham sf12 (1:1), 10% FBS 4hs with gentle agitation WJm, collagenase, hyaluronidase, trypsin, x10 3 NR Weiss M et al mins HUCPV+ WJ, collagenase 1mg/ml (PBS) hs x10 4 NR Sarugaser R et al WJm, enzyme cocktail: 4mg/ml BSA, 4mg/ml 728 x10 3 NR Meyer T et al. Collagenase, 1mg/ml Hyaluronidase, 0.1mg/ml Trypsin-Inhibitor and 200 mg/ml DNAse II WJm, collagenase 18 hs, washed, 2.5% trypsin 30 mins with agitation. 5 x10 4 NR Fu YS et al WJm: Wharton s jelly minced, WTm: Whole tissue minced, HUCPV+ WJ: Human UC perivascular with its surrounding WJ * cell recovery/cm UC, NR: not repoted FBS; fetal bovine serum, PBS: phosphate buffer saline, hs:hours.tissue digestion is done at 37 C Κύτταρα τα οποία απομονώθηκαν από πέντε δείγματα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες θρεπτικό υλικό. Η παρατήρηση των κυττάρων έγινε με τη βοήθεια ανάστροφου μικροσκοπίου. Ύστερα από 3 μέρες καλλιέργειας κύτταρα με μορφολογία ινοβλαστών παρατηρήθηκαν.(εικόνα 18 Α., Εικόνα 18Β).

111 110 Εικόνα 18 Α, Β. Κύτταρα με μορφολογία ινοβλαστών ύστερα από την καλλιέργεια σε πλήρες θρεπτικό μέσο DMEM μετά από(α) 3 και (Β) 5 ημέρες αντίστοιχα. Τα κύτταρα της καλλιέργειας εξέφρασαν μεσεγχυματικούς δείκτες CD29 CD105 CD90, και CD44 ενώ ήταν αρνητικά για δείκτες αιμοποιητικών κυττάρων όπως CD45, CD34. Τα βλαστικά κύτταρα διατήρησαν την έκφραση των μεσεγχυματικών δεικτών και την μορφολογία ινοβλαστών κατά τη διάρκεια των τριών ανακαλλιεργειών. (Πίνακας 15). Πίνακας 15. Μ.Ο. ± τυπική απόκλιση της ποσοστιαίας έκφρασης των μεσεγχυματικών δεικτών σε πέντε δείγματα από την πρώτη έως την τρίτη ανακαλλιέργεια. Μεσεγχυματικοί Δείκτες CD105 Καλλιέργεια Ανακαλλ. 1 Ανακαλλ 2 Ανακαλλ 3 % % % % 93.2 ± ±2.1 97± ±0.25 CD ± ±2.8 96± ±0.55 CD ± ± ±0.9 99±0.26 CD ±2.6 59± ± ±13.4

112 111 Επιπλέον τα κύτταρα διατήρησαν τα χαρακτηριστικά τους και μετά τη διαδικασία της κρυοσυντήρησης. Η έκφραση των μεσεγχυματικών δεικτών έγινε με τη βοήθεια κυτταρόμετρου ροής. (Δίαγραμμα 9) Διάγραμμα 9. Έκφραση των μεσεγχυματικών δεικτών CD90 και CD105 σε ένα αντιπροσωπευτικό δείγμα κατά τη διάρκεια των ανακαλλιεργειών (Α-D) αλλά και μετά από απόψυξη (Ε). Στη συνέχεια δείγματα που τοποθετήθηκαν σε καλλιεργητικό υλικό μετά από ανακαλλιέργειες τοποθετήθηκαν σε ειδικά μέσα διαφοροποίησης με σκοπό τη μελέτη της πλαστικότητας τους, κατά πόσο δηλαδή είναι ικανά να διαφοροποιούνται σε άλλους κυτταρικούς πληθυσμούς. Ειδικότερα καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικά μέσα για διαφοροποίηση σε οστικά κύτταρα και λιποκύτταρα με την προσθήκη ειδικών αυξητικών παραγόντων. Ειδικότερα για τη μελέτη της διαφοροποίησης σε οστικά κύτταρα χρησιμοποιήθηκε η αλιζαρίνη, η οποία έχει την ιδιότητα να επικάθεται στις εναποθέσεις ασβεστίου των οστικών κυττάρων (Εικόνα 20A,) ενώ κύτταρα τα οποία είχαν διαφοροποιηθεί σε λιποκύτταρα αναγνωρίζονται από την κόκκινη χρώση των λιποσταγονιδίων από το Oil Red O και από την μπλε χρώση των πυρήνων από την προσθήκη της αιματοξυλίνης (Εικόνα 20C). Βλαστικά κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό μέσο χωρίς αυξητικούς παράγοντες λειτούργησαν ως μάρτυρες (Εικόνες 20Β, D).

113 112 Εικόνα 19. Διαφοροποίηση των μεσεγχυματικών κυττάρων από το σώμα του ομφάλιου λώρου σε (Α) οστικά κύτταρα και (C) λιποκύτταρα αντίστοιχα. Οι εικόνες Β και D αποτελούν τους αρνητικούς μάρτυρες των δειγμάτων. Όλα τα δείγματα ήταν αρνητικά για αερόβια και αναερόβια μικρόβια

114 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ USSCS ΜΕ ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΛΙΠΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΟΜΦΑΛΟΠΛΑΚΟΥΝΤΙΑΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ Στις διπλές κυτταρικές καλλιέργειες μέσα σε χρονικό διάστημα 3 ημερών παρατηρήθηκε με τη βοήθεια του ανάστροφου μικροσκοπίου ο σχηματισμός κυττάρων με μορφολογία ινοβλαστών, ενώ στις μονές κυτταρικές καλλιέργειες αυτό παρατηρήθηκε σε διπλάσιο χρονικό διάστημα και όχι σε όλες τις κυτταρικές καλλιέργειες. Τόσο στις απλές κυτταρικές καλλιέργειες λιπώδους ιστού όσο και στις μικτές με την παρουσία βλστοκυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος παρατηρήθηκε ο σχηματισμός αποικιών, των οποίων όμως η πυκνότητα ήταν μεγαλύτερη στις διπλές καλλιέργειες (Εικόνες 20-23) Εικόνες Βλαστοκύτταρα από υλικό λιποαναρρόφησης κυτταρικής καλλιέργειας σε θρεπτικό υλικό DMEM. ύστερα από 6 μέρες Εικόνες Βλαστοκύτταρα ομφαλοπλακουντιακού αίματος στα οποία προστέθηκαν βλαστοκύτταρα από υλικό λιποαναρρόφησης ύστερα από 6 μέρες κυτταρικής καλλιέργειας σε θρεπτικό υλικό DMEM.

115 114 Η μορφολογία των κυττάρων παρέμεινε σταθερή σε όλα τα περάσματα σε νέες καλλιεργητικές φλάσκες, ενώ μετά το πρώτο πέρασμα CD45+ κύτταρα δεν παρατηρήθηκαν στα δείγματα συνκαλλιέργειας. Τα κύτταρα από τις μικτές καλλιέργειες διατήρησαν την ικανότητα τους να προσκολλώνται στην επιφάνεια της καλλιέργειας και να δημιουργούν αποικίες (Εικόνες 24-25). Εικόνες Βλαστοκύτταρα από τις μικτές καλλιέργειες μετά από 5 περάσματα. Τα κύτταρα διατηρούν τη μορφολογία τους και την ικανότητα τους να προσκολλώνται στην επιφάνεια της κυτταρικής καλλιέργειας. Όταν οι κυτταρικές καλλιέργειες καταλάμβαναν το 80 % της επιφάνειας των καλλιεργητικών φλασκών πραγματοποιούνταν αποκόλληση τους με τη βοήθεια διαλύματος τρυψίνης. Στη συνέχεια γινόταν η επώαση τους με ειδικούς κυτταρικούς δείκτες (Διάγραμμα 10).

116 115 Διάγραμμα 10. Χαρακτηρισμός του πολυδύναμου πληθυσμού που λαμβάνεται με την συνκαλλιέργεια βλαστικών κυττάρων από την ομφαλοπλακουντιακή μονάδα και από το υλικό της λιποαναρρόφησης Τα κύτταρα ήταν θετικά για τα αντισώματα CD29, CD44, CD49e, CD90, CD105, CD51, Stro και C-kit. Ενώ ήταν αρνητικά για τα CD34, CD45, CD133, και την γλυκοφορίνη A, δείκτες που χαρακτηρίζουν τα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα.

117 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΙΚΡΩΝ ΣΕ ΜΕΓΕΘΟΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΣΩΜΑ ΤΟΥ ΟΜΦΑΛΙΟΥ ΛΩΡΟΥ ΠΟΥ ΕΚΦΡΑΖΟΥΝ ΔΕΙΚΤΕΣ ΕΜΒΡΥΪΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Βλαστικά κύτταρα τα οποία απομονώθηκαν από το σώμα του ομφάλιου λώρου επωάστηκαν με αντισώματα τα οποία είναι δείκτες πολυδύναμων αδιαφοροποίητων εμβρυϊκών κυττάρων. Στη συνέχεια δημιουργήθηκε ειδικό πάνελ κυτταρομετρίας ροής για την ανίχνευση μικρών σε μέγεθος κυττάρων τα οποία είναι CD45 - και είναι θετικά στο επιφανειακό αντίσωμα CD184 και στους μεταγραφικούς παράγοντες Οct και Nanog. Παρακάτω παρατίθενται μια αντιπροσωπευτική μελέτη για την ανίχνευση πολυδύναμων κυττάρων από το σώμα του ομφάλιου λώρου. Η περιοχή R1 περιλαμβάνει τα CD184 θετικά κύτταρα. Η περιοχή R2 συμπεριλαμβάνει τα κύττάρα προς μελέτη, τα οποία είναι μικρού μεγέθους. Η περιοχή R4 περιλαμβάνει επιπλέον τα κύτταρα τα οποία είναι αρνητικά στο επιφανειακό αντίσωμα CD45. Καταλήγουμε στη συνέχεια στις περιοχές R5 και R6 που αντιστοιχούν στα κύτταρα τα οποία είναι και επιπλέον θετικά στα αντισώματα Οct και Nanog και είναι τα κύτταρα τα οποία αναζητούμε (Διάγραμμα 11).

118 117 Διάγραμμα 11. Πρωτόκολλο Κυτταρομετρίας ροής για τη μέτρηση μικρών σε μέγεθος κυττάρων από τον ιστό του ομφάλιου λώρου που εκφράζουν εμβρυϊκούς δείκτες Η περιοχή R1 περιλαμβάνει τα CD184 θετικά κύτταρα Η περιοχή R2 συμπεριλαμβάνει τα κύττάρα προς μελέτη, τα οποία είναι μικρού μεγέθους. Η περιοχή R4 περιλαμβάνει επιπλέον τα κύτταρα τα οποία είναι αρνητικά στο επιφανειακό αντίσωμα CD45. Καταλήγουμε στη συνέχεια στις περιοχές R5 και R6 που αντιστοιχούν στα κύτταρα τα οποία είναι επιπλέον θετικά στα αντισώματα Οct και Nanog Κύτταρα τα οποία απομονώθηκαν μεταφέρθηκαν σε καλλιεργητικό μέσο DMEM. Τα κύτταρα άρχισαν να σχηματίζουν σφαιρικές δομές παρόμοιες με αυτές που παρατηρούνται κατά την καλλιέργεια εμβρυϊκών κυττάρων (Εικόνες 26-27) Εικόνες Καλλιέργεια μικρών σε μέγεθος κυττάρων από τον ιστό του ομφάλιου λώρου σε πλήρες θρεπτικό μέσο DMEM. Τα κύτταρα σχηματίζουν σφαιρικές δομές παρόμοιες με αυτές που παρατηρούνται κατά την καλλιέργεια των πολυδύναμων εμβρυϊκών κυττάρων. Προσθήκη διαλύματος αλκαλικής φωσφατάσης χρωματίζει έντονα τις σφαιρικές δομές της καλλιέργειας. Η παρατήρηση των αποικιών των κυττάρων που

119 118 εκφράζουν την αλκαλική φωσφατάση και επομένως χρωματίζονται, έγινε με τη βοήθεια του ανάστροφου μικροσκοπίου (Εικόνες 28-29). Εικόνες Χρώση των κυττάρων του ομφάλιου λώρου με αλκαλική φωσφατάση. Τα κύτταρα δημιουργούν σφαιρικές δομές οι οποίές χρωματίζονται έντονα με την προσθήκη αλκαλικής φωσφατάσης. Όταν κύτταρα που μοιάζουν με εμβρυϊκά μεταφέρθηκαν σε καλλιέργεια, όπου υπήρχαν μεσεγχυματικά κύτταρα από το σώμα του ομφαλίου λώρου, αυτά λειτούργησαν σαν στρωματικά κύτταρα, τα οποία οδήγησαν τα πολυδύναμα κύτταρα που απομονώθηκαν στο σχηματισμό σφαιρών. Οι σφαίρες αυτές δεν είχαν την ικανότητα προσκόλλησης στην επιφάνεια της καλλιεργητικής πλάκας αλλά βρίσκονταν στο υπερκείμενο διάλυμα (Εικόνες 30-31) Μηχανικός διαχωρισμός των σφαιρών και στη συνέχεια επαναιώρηση τους σε θρεπτικό μέσο με στρωματικά μεσεγχυματικά κύτταρα είχε σαν αποτέλεσμα τον επανασχηματισμό σφαιρικών δομών και συσσωμάτων κυττάρων. Ανάλυση των δεικτών που εκφράζουν με τη βοήθεια κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι εκφράζουν δείκτες εμβρυϊκών κυττάρων, όπως Nanog και Oct.

120 119 Εικόνες Σχηματισμός σφαιρών από τα πολυδύναμα εμβρυϊκά κύτταρα, όταν στη καλλιέργεια χρησιμοποιούνται σαν στρωματικά κύτταρα μεσεγχυματικά κύτταρα από τον ιστό του ομφάλιου λώρου. Οι σφαίρες επιπλέουν στο υπερκείμενο θρεπτικό μέσο και δεν προσκολλώνται στην επιφάνεια των καλλιεργητικών πλακών. Ταυτόχρονη τοποθέτηση τόσο εμβρυϊκών όσο και μεσεγχυματικών κυττάρων από τον ιστό του ομφάλιου λώρου σε καλλιεργητικές πλάκες είχε σαν αποτέλεσμα την δημιουργία σχηματισμών τόσο σφαιρικών δομών και συσσωμάτων με ικανότητα προσκόλλησης, όσο και μεμονωμένων μεσεγχυματικών κυττάρων. Θεωρούμε ότι οι σφαιρικές δομές προέρχονται από τα πολύ μικρά κύτταρα που εκφράζουν δείκτες εμβρυϊκών κυττάρων. Για το σκοπό αυτό έγινε χρώση των κυττάρων με εμβρυϊκούς δείκτες. Μελέτη των σχηματισμών με ανοσοϊστοχημεία έδειξε ότι οι σφαιρικές δομές εκφράζουν το δείκτη των εμβρυϊκών κυττάρων, Nanog (Εικόνες 32-33).

121 120 Εικόνες Συνκαλλιέργεια μικρών σε μέγεθος κυττάρων που εκφράζουν εμβρυϊκούς δείκτες με μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα από τον ομφάλιο λώρο. Ύστερα από 3-5 ημέρες παρατηρούνται τυπική εικόνα μεσεγχυματικών κυττάρων αλλά και σφαιρικοί σχηματισμοί κυττάρων. Χρώση των κυττάρων με τον εμβρυϊκό δείκτη Nanog. Οι σφαιρικοί σχηματισμοί εκφράζουν τον εμβρυϊκό δείκτη.