ΤΟ ΠΑΡΑ ΕΙΓΜΑ ΤΗΣ ΧΡΗΣΗΣ ΜΥΚΗΤΩΝ ΣΤΗΝ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΓΟΝΙ ΙΩΝ ΑΠΟ ΑΝΩΤΕΡΑ ΦΥΤΑ ΚΑΙ ΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ

Transcript

1 ΤΟ ΠΑΡΑ ΕΙΓΜΑ ΤΗΣ ΧΡΗΣΗΣ ΜΥΚΗΤΩΝ ΣΤΗΝ ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΓΟΝΙ ΙΩΝ ΑΠΟ ΑΝΩΤΕΡΑ ΦΥΤΑ ΚΑΙ ΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ Β. Σοφιανοπούλου Εργαστήριο Μοριακής Γενετικής Ινστιτούτο Βιολογίας, ΕΚΕΦΕ

2 ιαµεµβρανικές πρωτεΐνες υπεύθυνες για την κυτταρική επικοινωνία µέσω της εξειδικευµένης και ελεγχόµενης µεταφοράς µεταβολιτών (σάκχαρα, αµινοξέα, πεπτίδια, νουκλεοσίδια, νουκλεοτιδικές βάσεις, αζωτούχες ενώσεις, βιταµίνες, ιόντα, ορµόνες, νευροδιαβιβαστές κλπ) Μηχανισµούς αναγνώρισης και πρόσδεσης µεταβολιτών παρόµοιους µε αυτoύς των ενζύµων

3 ΙΑΜΕΜΒΡΑΝΙΚΕΣ ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ 1. ΚΑΝΑΛΙΑ 2. ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ ΜΕΤΑΦΟΡΕΙΣ (Saier, 2000; Mol.Biol.Rev. 64: ) Κανάλια: κανάλια µε δευτεροταγείς δοµές α-έλικας κανάλια δευτεροταγείς δοµές β-βαρελιού (πορίνες) κανάλια τοξινών κανάλια πεπτιδίων

4 Πρωτεΐνες µεταφορείς: κατατάσσονται µε κριτήριο τις ενεργειακές τους απαιτήσεις παθητικοί και ενεργητικοί πρωτογενούς ενεργότητας δευτερογενούς ενεργότητας τροποποιητές υποστρώµατος (group translocators) συµµεταφορείς αντιµεταφορείς µονοµεταφορείς

5 Ρόλος των µεταφορέων στους ανώτερους οργανισµούς Ανακατανοµή ή/και ανακύκληση ενδογενών µεταβολιτών σε διάφορους ιστούς ο µεταφερόµενος µεταβολίτης µπορεί να χρησιµεύει ως µοριακό σήµα, νευροδιαβιβαστής, µόριο άµυνας ή ορµόνη Αποµάκρυνση τοξικών µεταβολιτών και ξενοβιοτιοτικών φαρµάκων (γενική ή συγγενής µυοτονία, υπερκαλαµική περιοδική παράλυση, κληρονοµική δρεπανοκυττάρωση, δυσαπορρόφηση γλυκόζης, κυστινουρία και καλοήθη ή επιθετικά χολοστατικά σύνδροµα)

6 Ρόλος των µεταφορέων στους ανώτερους οργανισµούς Ανακατανοµή ή/και ανακύκληση ενδογενών µεταβολιτών σε διάφορους ιστούς Ο µεταφερόµενος µεταβολίτης µπορεί να χρησιµεύει ως µοριακό σήµα, νευροδιαβιβαστής, µόριο άµυνας ή ορµόνη Αποµάκρυνση τοξικών µεταβολιτών και ξενοβιοτιοτικών φαρµάκων Στον άνθρωπο συνδέονται συχνά µε γενετικές παθήσεις και είναι µόρια-στόχοι ορισµένων από τα συχνότερα συνταγογραφούµενα φάρµακα πχ Prozac

7 Cystic fibrosis (CFTR, chloride carrier), 1989 Darier disease (muscle Ca 2+ ATPase), 1999 Congestive heart failure (Na + /Ca 2+ antiporter; Na + /K + ATPase) Multidrug resistance regulation (MDR1,2) Hexose malabsorption (SGLT1, sodium-glucose carrier) Congenital hypothyroidism (NIS, Na + -iodide symporter) Cystinuria (SLC3A1, SLC7A9, cystine & dibasic amino acid carriers) Slow channel syndrome (AchR, acetylcholine-gated ion channel) Amyotrophic Lateral Sclerosis (EAAT2, glutamate transporter) Obsessive-Compulsive Disorder (SERT, serotonin transporter/prozac)

8 Ρόλος των µεταφορέων στους ανώτερους οργανισµούς 1. Επιτρέπουν την είσοδο απαραίτητων θρεπτικών ουσιών στο κυτταρόπλασµα και τα οργανίδια που συµµετέχουν στον καταβολισµό εξωγενών πηγών άνθρακα, αζώτου, θείου και φωσφόρου. 2. Μετέχουν στη ρύθµιση της ενδοκυτταρικής συγκέντρωσης µεταβολιτών µέσω της έκκρισης από τα κύτταρα και τα οργανίδια τελικών προϊόντων µεταβολικών µονοπατιών 3. Συµβάλλουν στη διατήρηση του ph και της προωθητικής ηλεκτροχηµικής δύναµης της µεµβράνης 4. Ρυθµίζουν την έκκριση ή πρόσληψη φεροµονών, αλαρµονών, ορµονών, νευροδιαβιβαστών και άλλων µορίων-σηµατοδοτών 5. Εµπλέκονται στη µεταφορά αντιγονικών πεπτιδίων 6. Συµµετέχουν στην έκκριση πρωτεϊνών, υδρογονανθράκων και λιπιδίων 7. Συµβάλλουν στην ενεργή αποβολή αντιβιοτικών, αντιικών και αντιµυκητικών παραγόντων και τοξινών 8. Λειτουργούν ως αισθητήρες εξωκυτταρικών διαλελυµένων ουσιών 9. Χρησιµοποιούνται ως υποδοχείς ιών 10. Γενετικές ασθένειες οφείλονται στη µη φυσιολογική δοµή ή/και λειτουργία πρωτεϊνικών µεταφορέων (γενική ή συγγενής µυοτονία, υπερκαλαµική περιοδική παράλυση, κληρονοµική δρεπανοκυττάρωση, δυσαπορρόφηση γλυκόζης, κυστινουρία και καλοήθη ή επιθετικά χολοστατικά σύνδροµα)

9 ΜΕΛΕΤΗ ΙΑΜΕΜΒΡΑΝΙΚΩΝ ΜΕΤΑΦΟΡΕΩΝ Η πολυπλοκότητα των ανώτερων οργανισµών, η δυσκολία του γενετικού χειρισµού τους και ο ραγδαία αυξανόµενος αριθµός γονιδίων άγνωστης λειτουργίας που προκύπτουν από την ολοκλήρωση του προσδιορισµού της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των γονιδιωµάτων τους καθιστούν επιτακτική την αναζήτηση κατάλληλων µικροβιακών οργανισµών που θα χρησιµοποιηθούν ως πρότυπα συστήµατα για την εύρεση της λειτουργίας γονιδίων από ανώτερους οργανισµούς

10 Βιολογικά συστήµατα µελέτης διαµεµβρανικών µεταφορέων 1. Saccharomyces cerevisiae 2.ωοκύτταραΧenopus 3. in vitro συστήµατα (καλλιέργειες κυττάρων από έντοµα ή τον άνθρωπο) 4.Αspergillus nidulans?

11 Aspergillus nidulans µη παθογόνος ευκαρυωτικός µικροοργανισµός πρότυπο σύστηµα µελέτης Ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης Ρύθµιση της µίτωσης και της κυτταρικής διαίρεσης Ρύθµιση της µείωσης και των µηχανισµών οµοθαλλισµού Ρύθµιση του µεταβολισµού Κίνηση Πυρήνων Εγκαθίδρυση και διατήρηση της πολικότητας Εξειδίκευση και τοπογένεση πρωτεϊνών-µεταφοράς Σχηµατισµός κονιδιοσπορίων Ρύθµιση του σχηµατισµού fruiting bodies Μετάθεση, ρύθµιση και εξειδίκευση Unconventional genetic elements

12 πρότυπο σύστηµα µικρός χρόνος ανάπτυξης σε απλά και φθηνά θρεπτικά µέσα σχετικά υψηλή αποδοτικότητα µετασχηµατισµού γνωστή και διαθέσιµη αλληλουχία γονιδιώµατος 2.5x10 7 bp φυλετικό, αγενή και παραφυλετικό κύκλο ανάπτυξης ευκολία µελέτης συγκεκριµένων µεταφορέων µε απλές δοκιµασίες ανάπτυξης και µετρήσεις πρόσληψης ραδιοσηµασµένων υποστρωµάτων τους σε καθορισµένο γενετικό υπόβαθρο

13 ιπλοειδές (συµπληρωµατικότητα, επικράτεια (dominance)) Ετεροκάρυον Παραφυλετικός Κύκλος Ασκοσπόρια Haploidisation (chromosome mapping, detection of translocations) mitotic recombination (mapping in elation to centromeres) Ασκός Φυλετικός Κύκλος µείωσης Αποικία Κλειστοθήκια Υφές Αγενής Κύκλος Dicaryon ιπλοειδές Κονίδιο Κονιδιοφορέας

14 Μεταφορείς νουκλεοτιδικών βάσεων Βιολογική σηµασία Βιοσύνθεση νουκλεοτιδίων και νουκλεϊκών οξέων, µόρια κλειδιά του µεταβολισµού των νουκλεϊκών οξέων στα θηλαστικά πηγές αζώτου σε βακτήρια και µύκητες Συµµετέχουν στην παραγωγή ATP και GTP Ουρικό οξύ ασθένειες (υπερουριχαιµία, ουρολιθίαση κλπ), περισυλλέκτης ελευθέρων ριζών οξυγόνου, αντιοξειδωτική δράση Πουρίνες νευροδιαβιβαστές Ανάπτυξη φύλλων C4 φυτών (π.χ καλαµπόκι) Αποθήκευση του αζώτου στα φυτά υπό τη µορφή ουρείδων

15 ATP de novo GTP AMP IMP XMP GMP αδενίνη υποξανθίνη ξανθίνη γουανίνη ουρικό οξύ αλλαντοΐνη αλλαντοϊκό οξύ ουρεΐδογλυκίνη γλυοξυλική ουρία ουρία αµµωνία

16 Μεταφορείς νουκλεοτιδικών βάσεων - διαµεσολαβητές για τη µεταφορά αντιικών (acyclovir, carbovir, ganciclovir), αντινεοπλασµατικών (5 flourouracil, 6-mercaptopurine, thioguanine) και αντιπαρασιτικών φαρµάκων (melarsoprol) Μεταφορείς νουκλεοτιδικών βάσεων - µόρια/στόχοι αντιµετώπισης ασθενειών του ανθρώπου που προκαλούνται από παρασιτικά πρωτόζωα (malaria, leishmaniasis, trypanosomiasis, toxoplasmosis). Η πλειοψηφία των παθογόνων µικροοργανισµών έχει εξειδικευµένους µεταφορείς βάσεων - υποσχόµενους διαµεσολαβητές στοχευµένης δράσης φαρµάκων. Τα σηµαντικότερα παθογόνα πρωτόζωα δεν παράγουν de novo πουρίνες και εξαρτώνται αποκλειστικά από αυτές των ξενιστών τους για την επιβίωσή τους.

17 Η µελέτη των µεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων είναι πρωταρχικής φυσιολογικής, κλινικής, φαρµακολογικής και αγροτικής σπουδαιότητας

18 Οικογένειες Μεταφορέων Νουκλεοτιδικών Βάσεων ΝΑΤ (Νucleobase Ascorbate Transporters): αρχαιοβακτήρια, ευβακτήρια, ευκάρυα (µύκητες, έντοµα, φυτά, θηλαστικά) PbuX, UraA, PyrP, UapA, UapC, hsvct1, hsvct2 ΕΝΤ (Εquilibrative Nucleoside Transporters): θηλαστικά, πρωτόζωα hεντ1-3, rent1-3 PRΤ (Purine Related Transporters): αρχαιοβακτήρια, ευβακτήρια, µύκητες CodB, FUR4, FCY2 PUP (PUrine Permeases): φυτά AtPUP1 - AtPUP15 UPS (Ureide Permeases): φυτά AtUPS1 AtUPS5

19

20 Μεταφορείς νουκλεοτιδικών βάσεων της οικογένειας ΝΑΤ µεταφορείς δευτερογενούς ενεργότητας συντηρηµένη περιοχή 12 αµινοξέων, αλληλουχία υπογραφής >21% ταυτότητα, > 40% οµοιότητα αµινοξικής αλληλουχίας

21 Μεταφορείς Νουκλεοτιδικών Βάσεων παρόµοια πρότυπα υδροφοβικότητας 9-14 πιθανά διαµεµβρανικά τµήµατα (α-έλικα) κοινοί µηχανισµοί µεταφοράς συµµεταφορείς κατιόντος/υποστρώµατος (Η +, Na + ) η θέση πρόσδεσης του υποστρώµατος εντοπίζεται µόνο από τη µία πλευρά της µεµβράνης απαιτούν αλλαγή της στερεοδιαµόρφωσής τους κατά τη µεταφορά του υποστρώµατος

22 εξωκυττάριος χώρος υπόστρωµα µεταφορείς ενδοκυττάριος χώρος κυτταροπλασµατική µεµβράνη

23 εξωκυττάριος χώρος υπόστρωµα µεταφορείς ενδοκυττάριος χώρος κυτταροπλασµατική ταροπλασµατική µεµβράνη

24 Γιατί ο Aspergillus nidulans??? Στους περισσότερους µικροοργανισµούς η πρόσληψη πουρινών και πυριµιδινών εξυπηρετεί δύο κύριες λειτουργίες: τη βιοσύνθεση νουκλεοτιδίων και νουκλεικών οξέων τη χρήση κυρίως των πουρινών ως πηγές αζώτου µε τον καταβολισµό τους σε ουρία και αµµωνία S. cerevisiae: έχει χάσει την ικανότητά του να καταβολίζει πουρίνες. Αυτό το γεγονός αντανακλάται στην εξέλιξη των συστηµάτων πρόσληψης νουκλεοτιδικών βάσεων του µύκητα, που περιλαµβάνουν µεταφορείς ειδικούς για την πρόσληψη πουρινών και πυριµιδινών που ανακυκλώνονται κατά τη βιοσύνθεση νουκλεικών οξέων ενώ δεν διαθέτουν µεταφορείς οξειδωµένων πουρινών, ουρικού οξέος και ξανθίνης που µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως πηγές αζώτου 1. Ικανότητα χρήσης ευρέος φάσµατος νουκλεοτιδικών βάσεων ως µοναδικές πηγές αζώτου (ουρικό οξύ, ξανθίνη, αδενίνη, γουανίνη, υποξανθίνη) 2. Καλά µελετηµένο σύστηµα µεταφοράς πουρινών

25

26 Μεταφορείς πουρινών του Aspergillus nidulans UapA: υψηλής συγγένειας, υψηλής µεταφορικής ικανότητας υπεύθυνος για τη µεταφορά των οξειδωµένων πουρινών (ουρικό οξύ και ξανθίνη) UapC: υψηλής συγγένειας, µέσης/χαµηλής µεταφορικής ικανότητας γενικός µεταφορέας πουρινών και αναλόγων τους ΑzgA: υψηλής συγγένειας, υψηλής µεταφορικής ικανότητας µεταφορέας αδενίνης, γουανίνης και υποξανθίνης UapA και UapC: 62% ταύτιση αµινοξικής αλληλουχίας

27

28 αποµονώθηκαν συνολικά 104 αποικίες 88 περιείχαν πλασµίδια διαφορετικά από το αρχικό 16 (~15%) περιείχαν πλασµίδια που προήλθαν µετά από οµόλογο ανασυνδυασµό µεταξύ των γονιδίων uapc και uapa 7 περιείχαν πλασµίδια που προήλθαν από οµόλογο ανασυνδυασµό σε διαφορετικά σηµεία των γονιδίων uapc και uapa και έδιναν διαφορετικά πλαίσια ανάγνωσης Μετασχηµατισµό του στελέχους ΑCZ-ArgB - Στελέχη που προέρχονται από απλή οµόλογη ένθεση των πλασµιδιακών αλληλουχιών στο γενετικό τόπο argb

29

30

31 Χιµαιρικοί Μεταφορείς UapA-UapC UapC UapC-UapA UapA L8-TMS9 TMS9-L9-TMS10-L10 Περιοχή που καθορίζει την εξειδίκευση

32

33

34

35

36

37

38 Χιµαιρικοί Μεταφορείς UapA-UapC UapC UapC-UapA UapA L8-TMS9 TMS9-L9-TMS10-L10 Περιοχή που καθορίζει την εξειδίκευση

39 Μελέτες Σχέσεων οµής/λειτουργίας Μεταφορέων Πουρινών UapΑ και UapC in vivo κατασκευή χιµαιρικών γονιδίων uapa/uapc και uapc/uapa σε κατάλληλα βακτηριακά στελέχη και έκφραση των αντίστοιχων χιµαιρικών µεταφορέων σε στελέχη - δέκτες του A. nidulans A404 E412 R414 UapA Q126 F569 H (F/Y/S)X(Q449/E/P)N450XGXXXXT457(K/R/Q) αλληλουχία υπογραφής

40 Ταυτοποίηση αµφίφιλης περιοχής που καθορίζει την εξειδίκευση των µεταφορέων UapA και UapC ως προς τις πουρίνες που αναγνωρίζουν και µεταφέρουν Στην περιοχή αυτή ταυτοποιήθηκαν αµινοξέα που είναι σηµαντικά για την εξειδίκευση ή/και τη λειτουργία του µεταφορέα UapA καθώς και για την πρόσδεση και τη µεταφορά υποξανθίνης από το µεταφορέα UapC in silico ανάλυση: UapA και >70 πρωτεΐνες ταυτότητα (>22%) έδωσε συναινετική αλληλουχία (motive) συντηρηµένη σε όλους τους γνωστούς µεταφορείς νουκλεοτιδικών βάσεων

41 ΝΑΤ ΜΕΤΑΦΟΡΕΙΣ ΣΤΑ ΦΥΤΑ 13 φυτικά γονίδια 1 παράλογο από το ice plant (Mesembryanthenum crystallium) 11 παράλογα από την Arabidopsis 30 EST κλώνοι (ρύζι, ντοµάτα, σόγια κλπ) LPE1 (Leaf permease1) από το καλαµπόκι

42 LPE1 πρωτεΐνη Χαρακτηριστικά των µελών της οικογένειας ΝΑΤ 487 αµινοξέα, ΜW 53.2 kd 25% ταυτότητα µε το µεταφορέα UapA, πιθανά διαµεµβρανικά τµήµατα Όχι αλληλουχίες πρόσδεσης στο DNA Όχι σηµατοδοτικές αλληλουχίες για στόχευση σε ενδοκυτταρικές δοµές (µιτοχόνδρια, χλωροπλάστες) αλληλουχία υπογραφής ανενεργοποίηση του γονιδίου lpe1 προκαλεί δοµικές αλλαγές στους χλωροπλάστες τον κατ εξοχήν τόπο βιοσύνθεσης των πουρινών

43 Τα LPE1 µεταλλαγµένα στελέχη (ένθεση του ενδογενούς µεταθετού στοιχείου Ac) φέρουν στα φύλλα τους τοµείς διαφορετικού χρώµατος Ιστολογικές παρατηρήσεις έδειξαν ότι τα κύτταρα του κολεού της δέσµης (C4 φυτά) έχουν ασυνήθιστα µικρούς χλωροπλάστες (µέση τιµή µήκους 4.1µm) και ο αριθµός τους είναι κατά 50% µικρότερος του στελέχους φυσικού τύπου Περιέχουν λίγα ή καθόλου κοκκία αµύλου και έχουν κατά µέσο όρο 15 θυλακοειδή Τα κύτταρα του µεσοφύλλου των µεταλλαγµένων στελεχών έχουν φυσιολογικό µέγεθος αλλά λιγότερα θηλακοειδή

44 Ενδείξεις ότι η πρωτεΐνη LPE1 συµµετέχει σε µονοπάτια διακίνησης των νουκλεοτιδικών βάσεων διαµέσου µεµβρανών Η µελέτη των µηχανισµών και των συστηµάτων µεταφοράς νουκλεοτιδικών βάσεων δεν είναι εύκολο να πραγµατοποιηθεί σε φυτικά κύτταρα: ο χειρισµός τους σε εργαστηριακές συνθήκες είναι σύνθετος και η παρουσία στα φυτικά κύτταρα πολλαπλών µεταφορέων ΝΑΤ ή PUT οδηγεί σε αυξηµένη πιθανότητα παρουσίας αλληλο-επικαλυπτόµενων εξειδικεύσεων στα διαφορετικά συστήµατα µεταφοράς Το γονίδιο lpe1 παρουσιάζει παρόµοια περιεκτικότητα σε GC µε το γονίδιο uapa Λειτουργική έκφραση της φυτικής πρωτεΐνης στον ασκοµύκητα (βιοχηµική και φυσιολογική λειτουργία)

45 Γενετικόςµετασχηµατισµόςτουστελέχους ACZ (uapa - uapc - azga - argb-) µεκατάλληλοφορέαέκφρασης (pan-lpe1) SstI uapa promoter NcoI XbaI uapa terminator SalI/XhoI KpnI Φορέας έκφρασης pan-lpe1 5 και 3 ρυθµιστικές περιοχές του γονιδίου uapa το γονίδιο argb που κωδικοποιεί το ένζυµο ornithine carbamoyl transferase που εµπλέκεται στο µονοπάτι βιοσύνθεσης της αργινίνης cdna lpe1 κλώνο 1.6kb 5 UapA 3 UapA ArgB LPE1 NcoI-BamHI XbaI CCATGGATCCCGTGAAGGCCGAG//AGGTACTTCCCCTCGCTCTAGTCTAGA Fusion protein M D P V K A E //R Y F P S L * LPE1 M P P V K A E //R Y F P S L * ACZ: αυξότροφο για την αργινίνη πλήρη απώλεια λειτουργίας των ενδογενών µεταφορέων πουρινών µη ανάπτυξη σε ΜΜ παρουσία διαφορετικών πουρινών ως µοναδικές πηγές αζώτου

46 γενετικός µετασχηµατισµός στελέχους - δέκτη uapa uapc azga argb εκφράζει µη λειτουργικούς τους ενδογενείς µεταφορείς πουρινών και το ένζυµο ArgB του µονοπατιού βιοσύνθεσης της αργινίνης + κυκλικός φορέας έκφρασης αποµόνωση µετασχηµατισµένων στελεχών σε ελάχιστο θρεπτικό υλικό απουσία αργινίνης

47 Γενετικές µελέτες µετασχηµατισµένων στελεχών ACZ:pAN-Lpe1 urea NH 4 + Τα µετασχηµατισµένα µε τις φυτικές αλληλουχίες στελέχη αναπτύσσονται µε διαφορετικό ρυθµό σε ουρικό οξύ και ξανθίνη αλλά όχι παρουσία υποξανθίνης, αδενίνης ή γουανιδίνης ως µοναδικές πηγές αζώτου proline uric acid Τα στελέχη LP2 και LP5 αναπτύσσονται έχοντας συµπαγή µορφολογία ανάλογη του στελέχους φυσικού τύπου και του στελέχους που εκφράζει το µεταφορέα UapA Tα στελέχη LP4 και LP6 δεν έχουν συµπαγή µορφολογία και παρουσιάζουν µειωµένο ρυθµό ανάπτυξης και σε πηγές αζώτου διαφορετικές των πουρινών uapa - uapa + LP5 LP6 LP2 LP4

48 Ερώτηµα: Ο φαινότυπος των µετασχηµατισµένων στελεχών οφείλεται στην παρουσία των φυτικών αλληλουχιών µετασχηµατισµού στο γονιδίωµά τους ή σε επαναφορά της αρχικής µεταλλαγής στο γονίδιο uapa?

49 Μοριακή Ανάλυση lpe1- Μετασχηµατισµένων Στελεχών ανάλυση κατά Southern uapa uapa+ LP2 LP5 LP4 LP6 lpe1

50 Μοριακή Ανάλυση lpe1- Μετασχηµατισµένων Στελεχών ανάλυση κατά Southern uapa uapa+ LP2 LP5 lpe1 αριθµός αντιγράφων γονιδίου lpe1 ανάλυση κατά Northern lpe1 επίπεδα έκφρασης γονιδίου lpe1 acn

51 To στέλεχος LP2 που έχει την καλύτερη ανάπτυξη παρουσία ουρικού οξέος και ξανθίνης φέρει 3 αντίγραφα των αλληλουχιών lpe1 ενώ το στέλεχος LP5 που δείχνει µειωµένη ανάπτυξη φέρει πάνω από 10 αντίγραφα ενσωµατωµένα στον ίδιο γενετικό τόπο, και η έκφρασή του είναι 3.4 φορές αυξηµένη Ο αριθµός lpe1 αντιγράφων και τα επίπεδα έκφρασής τους είναι σηµαντικά για την ανάπτυξη των στελεχών LP2 και LP5 σε ουρικό οξύ και ξανθίνη

52 η ικανότητα ανάπτυξης των lpe1-µετασχηµατισµένων στελεχών σε ουρικό οξύ ή ξανθίνη οφείλεται στην ενσωµάτωση των φυτικών αλληλουχιών στο γονιδίωµα του µύκητα και την έκφρασή τους ο ρυθµός ανάπτυξης εξαρτάται από τη θέση ενσωµάτωσης των φυτικών αλληλουχιών και τον αριθµό των αντιγράφων τους, ο οποίος καθορίζει τα επίπεδα έκφρασης της αλληλουχίας lpe1

53 Αυτογονιµοποίηση-Selfing Κατά τη διάρκεια του φυλετικού κύκλου ανάπτυξης του µύκητα (µειώσεις) όταν υπάρχουν πολλαπλά αντίγραφα πλασµιδιακής αλληλουχίας ενσωµατωµένα στο γονιδίωµά του, ευνοείται οµόλογος ανασυνδυασµός µεταξύ των αντιγράφων αυτών, που συχνά οδηγεί σε άνιση ανακατανοµή του αριθµού τους σε απογόνους που προέρχονται από διαφορετικά ασκοσπόρια Αποµόνωση απογόνων είτε µε µειωµένο είτε µε αυξηµένο αριθµό αντιγράφων µιας αλληλουχίας LP2 X LP2

54 Γενετικές µελέτες απόγονων στελεχών LP2, µετά από αυτογονιµοποίηση (selfing) uapa - uapa + LP5 LP2 LP2-S2 LP2-S1 LP2-S0 ουρία Ουρικό οξύ ξανθίνη

55 Ανάλυση κατά Southern Lpe1 (~9 kb) uapa - uapa + LP2 LP5 LP2-S0 LP2-S1 LP2-S2

56 Ανάλυση κατά Northern Lpe1 acn uapa + uapa - LP2 LP5 LP2-S0 LP2-S1 LP2-S2

57 ταεπίπεδαέκφρασηςτηςαλληλουχίας lpe1, που είναι ευθέως ανάλογα του αριθµού των ενσωµατωµένων πλασµιδιακώναντιγράφων, καθορίζουν την ικανότητα ανάπτυξης σε ουρικό οξύ ή ξανθίνη

58 ΒιοχηµικάΧαρακτηριστικάΜεταφορέα LPΕ1 ρυθµός πρόσληψης ξανθίνης ρυθµός πρόσληψης ξανθίνης (pmol min κονίδια) 0,3 0,2 0, συγκέντρωση υποστρώµατος (µμ) K m = 30 µμ ± 2.5µΜ 1/[V] (1/p m o l m in κονιδιοσπόρια ) Γράφηµα Lineweaver-Burk y = 141,83x + 4, ,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1/[S] (1/µΜ) V max = 0.22 pmol min κονιδιοσπόρια

59 ο Μεταφορέας LPE1 Είναι ευτερογενούς Ενεργότητας επίδραση ενώσεων που διαταράσσουν την ηλεκτροχηµική προωθητική δύναµη της µεµβράνης στην πρόσληψη ξανθίνης από το µεταφορέα LPE1 LPE1 UapA % πρόσληψη 3 Η -ξανθίνης απουσία αναστολέα DCCD CCCP

60 Επίδραση ιονοφόρων και αναστολέων ΑΤΡασών στην πρόσληψη 3 Η-ξανθίνης από τους µεταφορείς UapA και LPE1 ρυθµός πρόσληψης 3 Η-ξανθίνης (pmoles/min 10 7 inhibitors κονίδια) DCCD CCCP UapA LPE , CCCP: λιπόφιλο ιονοφόρο που διαπερνά τη λιπιδική στοιβάδα. Στο µόριο αυτό προσδένονται πρωτόνια µε αποτέλεσµα να εξουδετερώνεται η φυσιολογική κλίση τους εκατέρωθεν της µεµβράνης DCCD: αναστολέαςατpασών

61 % πρόσληψης 3 Η-ξανθίνης Προσδιορισµός της Ειδίκευσης της πρωτεΐνης LPE1 1. Πειράµαταανταγωνισµούπρόσληψης 10µΜ 3 Η-ξανθίνης παρουσία 300µΜ µη ραδιοσηµασµένου ανταγωνιστή UapA LPE1 0 καφεΐνη ουρακίλη κυτοσίνη θυµίνη γουανίνη αδενίνη υποξανθίνη ουρικό οξύ ξανθίνη

62 % πρόσληψης 3 Η-ξανθίνης 2. Πειράµαταανταγωνισµούπρόσληψης 10µΜ 3 Η-ξανθίνης παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων ασκορβικού οξέος 100 UapA LPE mM 90mM 75mM 45mM 10mM 5mM 0.3mM 35mM 22.5mM 20mM L-ασκορβικό οξύ 0.3mΜ ξανθίνη

63 το Ασκορβικό Οξύ Προσδένεται Εξειδικευµένα στο Μεταφορέα LPE LP2 % πρόσληψης 3 H-προλίνης 0 10 mm 5 mm 0.3 mm προλίνη 20 mm 35 mm 45 mm L-ασκορβικό οξύ

64 3. Ανταγωνιστικήαναστολή (competitive ihhibition)της πρόσληψης ξανθίνης από το ασκορβικό οξύ Τιµές K m συγγένειαςτουµεταφορέα LPE1 γιατηξανθίνη παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων ασκορβικού οξέος Συγκεντρώσεις Ασκορβικού οξέος 5 mm 10 mm 45 mm K m 34 µμ 47 µμ 59 µμ 92 µμ

65 µέτρησηάµεσηςπρόσληψης 14 C ασκορβικού από στέλεχος LP2 ο µεταφορέας LPE1 δεν µεταφέρει ασκορβικό οξύ

66 Λειτουργικός χαρακτηρισµός της πρωτεΐνης LPE1 από το καλαµπόκι µε την έκφρασή της στον Aspergillus nidulans Η πρωτεΐνη LPE1 είναι ένας υψηλής συγγένειας, υψηλής µεταφορικής ικανότητας εξειδικευµένος µεταφορέας οξειδωµένων πουρινών (ξανθίνης και ουρικού οξέος) Είναι µεταφορέας δευτερογενούς ενεργότητας και λειτουργεί ως συµµεταφορέας πρωτονίων εσµεύει αλλά δεν µεταφέρει ασκορβικό οξύ Η θέση ενσωµάτωσης, αριθµός των αντιγράφων και τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου lpe1 καθορίζουν τη λειτουργική έκφραση της πρωτεΐνης LPE1

67 O Aspergillus nidulans εισάγεται ως πρότυπο σύστηµα έκφρασης ετερόλογων µεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων

68 ΝΑΤ ΜΕΤΑΦΟΡΕΙΣ ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ (ΜΕΤΑΦΟΡΕΙΣ ΑΣΚΟΡΒΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ) hsvct1, hsvct2 (human Sodium-dependent Vitamin C Transporters) hsvct1 (YSLP3): νεφρός, έντερο, ήπαρ (Km=233,8 µμ) hsvct2 (YSLP2): στους περισσότερους από τους ιστούς που έχουν µελετηθεί (Km=22,6 µμ)

69 Γενετικός µετασχηµατισµός του στελέχους ACZ (uapa - uapc - azga - argb - ) µε κατάλληλο φορέα έκφρασης (pns335/svct2/argb) SstI uapa promoter NcoI XbaI uapa terminator SalI/XhoI KpnI 5 UapA 3 UapA ArgB SVCT2/SVCT1 NcoI / BamHI XbaI φορέας pns335/svct2/argb

70 ACZ:pAN-hSVCT1

71 ShrA hsvct1

72 ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΣΧΕΣΕΩΝ ΟΜΗΣ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΜΕΤΑΦΟΡΕΑ ΑΣΚΟΡΒΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ 471 S S P N I G V L G I T K V G S R R 488 F A Q N N G V I A L T R C A N R W αλληλουχία υπογραφής hsvct1 αλληλουχία υπογραφής UapA 1. P473Q 2. S485N 3. SSP FAQ

73 O Αspergillus nidulans καθιερώνεται ως πρότυπο σύστηµα για το λειτουργικό χαρακτηρισµό και τη µελέτη των σχέσεων δοµής λειτουργίας γονιδίων που κωδικοποιούν µεταφορείς της οικογένειας ΝΑΤ από ανώτερους οργανισµούς

74 Βιβλιογραφία: 1. G. Diallinas, J. Valdez, V. Sophianopoulou, A. Rosa and C. Scazzocchio, Chimeric purine transportersof Aspergillus nidulans define a domain critical for function and specificity conserved in bacteria, plant and metazoan homologues. EMBO J. 17 (14): E. Argyrou, V. Sophianopoulou, N. Schultes and G. Diallinas, Functional characterization of a maize purine transporter by expression in Aspergillus nidulans. Plant Cell 13 (4): G. Diallinas and V. Sophianopoulou, Nucleobase transporters as a novel tool in molecular pharmacology. Rev. Clin. Pharmacokinetics, International Edition 16: Αλέξανδρος Πίττης. Χρήση ενός µικροβιακού συστήµατος για τη λειτουργική µελέτη µεταφορέα ασκορβικού οξέος του ανθρώπου ιπλωµατική Εργασία, Τοµέας Βοτανικής, ΕΚΠΑ (2008).