ویروس وای سیبزمینی جداشده از استان خوزستان بر پایۀ ژن پروتئین پوششی چکیده

Transcript

1 Iranian Journal of Plant Protection Science Vol 48, o 1, Spring & Summer 2017 (97107) DI: /ijpps دانش گیاهپزشکی ایران درة 48 شمارة 1 بهار تابستان 1396 )ص 97107( بررسی سه جدایۀ یرس ای سیبزمینی جداشده از استان خزستان بر پایۀ ژن پرتئین پششی 2 *2 1 سید سجاد ذبیحی ثمین السادات حسینی سید احمد حسینی 1 2. دانشجی سابق کارشناسی ارشد استادیار دانشکدۀ کشارزی دانشگاه لیعصر)عج( رفسنجان )تاریخ دریافت: 1395/3/18 تاریخ پذیرش: 1395/12/7( چکیده یرس ای سیبزمینی ( ) virus,y یکی از یرسهای مهم زیانبار با دامنۀ میزبانی گسترده است. در این پژهش با تجه به شناسایی یرس ای سیبزمینی جداسازی آن از کشتزارهای شلغم استان خزستان در سال زراعی 1392 یژگیهای سه جدایۀ انتخابی از شهرستانهای دزفل ششتر شش 7Tu( 9Tu )10Tu بررسی شد. در آزمن تعیین دامنۀ میزبانی سه جدایه ری گیاهانی متعلق به سه خانادۀ henopodiaceae Solanaceae Amaranthaceae بهصرت مکانیکی مایهزنی شدند. هر سه جدایه ری سیبزمینی گجهفرنگی فلفل تاتره گل تکمهای نشانههای مضعی فراگیر )سیستمیک( ایجاد کردند لی ری بتههای سلمهتره نشانههایی مشاهده نشد. در آزمن SDSPAGE د باند با اندازۀ حدد کیلدالتنی در آمدۀ خالصشدۀ هر سه جدایۀ خالصسازیشده مشاهده شد. برای تعیین سیۀ جدایههای انتخابی از جفت آغازگرهای اختصاصی سیۀ F/R( F/R, F/R, )PVIBIP/3TIM که بر پایۀ ناحیۀ )( طراحی شدهاند استفاده شد. در آزمن PR با آغازگرهای اختصاصی سیۀ )R/F( سیۀ 3TIM( PVIBIP ( به ترتیب د قطعۀ جفت بازی در هر سه جدایه افزایش شد. در ادامه ناحیۀ هر سه جدایه افزایش همسانهسازی تالییابی شد. درنهایت با استفاده از مجمع نتایج بهدستآمده از آزمنهای زیستی )بیلژیکی( بررسی تالی نکلئتیدی آمیناسیدی مشخص شد که جدایههای 9Tu 7Tu 10Tu جداشده از کشتزارهای شلغم استان خزستان بیشترین همسانی را با سیههای یرس دارند. این نخستین گزارش از شناسایی یرس ای سیبزمینی در کشتزارهای شلغم است. اژههای کلیدی: پرتئین پششی شلغم یرس ای سیبزمینی.SDSPAGE RTPR The characterization of three isolates of virus Y from khuzestan province according to the coat protein Seyed Sajjad Zabihi 1, SaminoSadat Hosseini 2* and Seyed Ahmad Hosseini 2 1, 2. Former M. Sc. Student and Assistant Professor, Faculty of Agricluture, ValieAsr University of Rafsanjan, Iran (Received: Jun. 7, 2016 Accepted: Feb. 25, 2017) ABSTRAT virus Y is one of the most important damaging viruses with a broad host range. In this research due to detection and isolation of virus Y in turnip fields of Khuzestan province during 2014 growing season, characteristics of three selected isolates (7Tu, 9Tu and 10Tu) from Dezful, Shushtar and Shush cities were investigated. To analyze the host range of the isolates, three selected isolates were mechanically inoculated on some members of Solanaceae, henopodiaceae, and Amaranthaceae. All three isolates induced local and systemic symptoms on the leaves of potato, tomato, pepper, datura, and gomphrena plants, but no symptoms were observed on henopodium quinoa. Analysis of the partially purified preparations indicated that molecular weight of two protein bands obtained by SDSPAGE was estimated to be about 33 and 31 KDa. To determine the strain of selective isolates the specific primer pairs F/R, F/R, F/R, and F/R were used. Using F/R and 3TIM/PVIBIP primers, two fragments with 609 and 1200 bp length respectively were amplified. The region in the all three isolates was amplified, cloned and sequenced. The results of all aforementioned tests showed that 7Tu, 9Tu, and 10Tu isolates are probably a member of or strain groups. According to our knowledge, this is the first report on occurrence of in turnip fields. Keywords: oat protein, turnip, virus Y, RTPR, SDSPAGE. * orresponding author s.hosseini@vru.ac.ir

2 ذبیحی همکاران: بررسی سه جدایۀ یرس ای سیبزمینی جداشده از شلغم با نام علمی مقدمه Brassica napus L. تیرة ruciferae متعلق به )چلیپاسانان( گیاهی است د ساله که از راه بذر افزایش مییابد )2013 al.,.)kuchacki et سطح زیر کشت شلغم در ایران بنا بر آمار سازمان جهاد کشارزی خزستان در سال هکتار است که 2/66 درصد از سطح زیر کشت سبزیهای غیر اصلی را به خد اختصاص میدهد ( al., Kuchacki et 2013(. سطح زیر کشت این محصل در استان خزستان یکی از مناطق مهم کشت سبزیها بنابر آمار سازمان جهاد کشارزی خزستان در سال 1389 هکتار 300 است. باالترین میزان کشت شلغم مربط به شهرستانهای دزفل شش ششتر است Khuzestan agriculture jahad..) بیماریهای ( باعث یرسی ایجاد آسیبهای کمی کیفی در گیاه شلغم میشند. مهمترین نشانههای یرسی مشاهدهشده ری این گیاه عبارتاند از: ایجاد لکههای بافت مرده مزاییک مالیم تا شدید کاهش ایجاد رشد لکههای پژمردگی حلقی تاکنن یرسهای اندکی کشتزارهای شلغم گزارش برگها ری کتلگی.)Kachroo et al., 2000( شدهاند بهصرت ( طبیعی از Leisner et al.,.)1992 در نمنهبرداریهای انجامشده از کشتزارهای شلغم استان خزستان در سال زراعی 9493 گیاهانی با نشانههای مزاییک بدشکلی مشاهده شد. بررسیهای الیه با االیزا نشاندهندة رابطۀ عامل بیماری با یرس ای سیبزمینی ( ) virus,y بد. با تجه به اینکه تاکنن این یرس از شلغم گزارش نشده است در این پژهش سه جدایۀ انتخابی از مناطق عمدة کشت شلغم در استان خزستان بررسی شدند. یرس ای سیبزمینی )( یکی از مهمترین پتییرسهایی است که گسترش جهانی گستردهای دارد. این یرس نخستین بار در جهان تسط اسمیت در سال 1931 از کشر انگلستان در ایران تسط کریمی در سال 1346 از ری سیبزمینی گزارش شده است.)Smith, 1931( تکال به اندازة حدد یرس ای سیبزمینی ژنگان )ژنم( 10 کیل باز تنها یک چارچب خانش باز )RF( دارد یک پلیپرتئین کد میکند که تسط سه پرتئاز یرسی )P1 پرتئین عملگر )P1 Hro 6K1 P3 Hro )Ia به ده 6K2 I Ib VPG Ia ) شکسته میشد ژنگان پتییرسها تسط حدد.)Ha, 2007( ملکل 2000 زیراحد پرتئین پششی )( احاطه شده است. این پرتئین شناختهشدهترین ناحیۀ ژن در پتییرسهاست برای هدفهای آرایهبندی )تاکسنمیکی( تعیین تنع ژنتیکی به کار میرد. پرتئین پششی از سه ناحیۀ terminal مرکزی terminal تشکیل شده است ( Higgins et al., 1998; al., 2003.)Fuji et پرتئین پششی در افزایش انتقال با شته ایجاد پشش برای RA یرس حرکت یاخته به یاخته حرکت راه در دخالت دارد Urcuqui( جدایههای.)Inchima et al., 2001 بر پایۀ دامنۀ میزبانی طبیعی به سیههای گجهفرنگی سیبزمینی تتن فلفل )2002 )Hull, بر پایۀ دامنۀ میزبانی آزمایشگاهی شتههای ناقل یرس به سه سیۀ rdinary or ( )Tobacco vein necrotic strain( )ommon strain )Stipple streak strain( تقسیم میشند 2004( al.,.)missiou et نترکیبیهای زیادی بین د گره در نتیجۀ حضر همزمان این د در یک گیاه ظهر کرده است. د سیۀ مهم بهدستآمده از نترکیبی بین د سیۀ عبارتاند از Visser et al..)anayakkara et al., 2012( (2012) نشان دادند که مقعیت طل قطعههای نترکیب تنع در محل ایجاد نترکیبی باعث ایجاد سیههای مختلف از جمله زیر گرههای شده است. ماد رشها i : انتخاب سه جدایۀ افزایش در شرایط گلخانه 1392 در سال نمنههایی با نشانههای یرسی از کشتزارهای شلغم سه شهرستان دزفل شش ششتر که با تجه به آمار جهاد کشارزی استان خزستان باالترین سطح کشت این محصل را دارند گردآری در شرایط خنک به آزمایشگاه منتقل برای تشخیص شد. یرس ای سیبزمینی در نمنههای گردآریشده از آزمن DASELISA پادتن )آنتیبادی( چند

3 99 دانش گیاهپزشکی ایران درة 48 شمارة 1 بهار تابستان 1396 همسانهای DSMZ )AS0137( تهیهشده از مؤسسۀ آلمان با استفاده از رش lark & Adams (1977) استفاده شد. نتایج پس از گذشت حدد دقیقه با دستگاه االیزاخان ( )BioTek, Elx با طلمج 405 نانمتر خانده شد. نمنههایی که میزان جذبشان بیشتر از سه برابر میانگین جذب نمنههای منفی بد بهعنان نمنۀ آلده به یرس در نظر گرفته شد. برای بررسی یژگیهای یرس ای سیبزمینی جداشده از کشتزارهای شلغم چند جدایۀ که در آزمن الیزا مثبت بدند انتخاب با بافر فسفات پتاسیم 0/05 مالر له ری برگهای بتههای سیبزمینی سالم در مرحلۀ چهار تا پنج برگی مایهزنی شد. از بین جدایههای افزایششده سه جدایه با نامهای )جداشده از شهرستان دزفل( شهرستان ششتر( 7Tu 9Tu 10Tu شش( که غلظت باالیی در )جداشده از )جداشده از شهرستان بتههای مایهزنی شده داشتند انتخاب شدند بتههای آلده به این جدایهها بهعنان منبع یرس در شرایط گلخانهای مناسب با دمای 25 تا 30 درجۀ سلسیس نگهداری شدند. تعیین دامنۀ میزبانی سه جدایۀ انتخابی برای تعیین دامنۀ میزبانی جدایههای انتخابی به نسبت یک به ده در بافر فسفات پتاسیم 0/05 مالر با 7 اسیدیتۀ Solanaceae عصارهگیری ری گیاهانی از تیرة henopodiaceae Amaranthaceae بهصرت مکانیکی مایهزنی در شرایط مناسب گلخانهای نگهداری شدند. برای هر گیاه یک نمنه بهعنان شاهد تنها با بافر فسفات بهصرت مکانیکی مایهزنی شد. این آزمن چهار مرتبه تکرار شد. این گیاهان به دلیل افتراقی بدن میتانند به جداسازی سیههای یرس ای سیبزمینی کمک کنند. برای اطمینان از افزایش یرس از آزمن استفاده شد. خالصسازی DASELISA پادتن اختصاصی نسبی یرس تعیین زن ملکلی پرتئین پششی () سه جدایۀ با استفاده از.SDSPAGE برای خالصسازی از رش استفاده شد.)Jensen et al., 1986( بهمنظر تعیین درجۀ خلص یرس در آمدههای خالصشده میزان جذب نری آن در طلمجه یا نانمتر با دستگاه ناندراپ Epoch( )BioTech, اندازهگیری شد. در ادامه برای تعیین زن ملکلی پرتئین پششی آمدههای خالصشده الکترفرز عمدی پرتئین در ژل پلیاکریلآمید حای سدیم د دسیل سلفات )SDSPAGE( با ژل جداکننده با غلظت 12 درصد ژل متراکمکنندة 5 درصد به رش (1970) Laemmli آزمن RTPR انجام شد. برای استخراج RA یرسی از کیت ستندار شرکت دنازیست )ایران( بر پایۀ دسترکار شرکت سازنده استفاده شد. پس از استخراج RAی یرسی برای شناسایی الیۀ ناحیۀ جدایههای انتخابشده با استفاده از آغازگرهای اختصاصی این ناحیه در اکنش )f/r( RTPR افزایش شد. ازآنجاکه این آغازگرها قابلیت جداسازی زیر سیۀ را ندارند از آغازگرهای F/R F/R F/R )طراحیشده بر پایۀ ناحیۀ ) 3TIM/PVIBIP )طراحیشده بر پایۀ ناحیۀ انتهای کربکسی ناحیۀ )Ib به ترتیب برای افزایش اختصاصی سیههای )جدل 1 ( استفاده شد. اکنش RTPR cda برای تلید در د مرحله در حجم نهایی 20 میکرلیتر انجام شد. در آغاز ریزلله )میکرتیب(های حای 2 میکرلیتر میکرلیتر 1 Reverse transcriptase Buffer (10X) 1 میکرلیتر dtps (10 mmol/μ lit) Reverse Primer (10 pmol/ul) 10 میکرلیتر آب دینیزة سترنشده )استریل( را به مدت پنج دقیقه در 65 o در دستگاه ترمسایکلر BioRad( )T100 قرار داده پس از آن بیدرنگ ری یخ قرار داده شد. در مرحلۀ دم آنزیمهای MuMLV Reverse transcriptase (RT) Rase inhibitor (40 U/μl) هرکدام به میزان 0/5 میکرلیتر به ریزللهها اضافه به مدت یک ساعت در دمای 42 o در دستگاه ترمسایکلر قرار داده شد. اکنش PR برای افزایش minipurification

4 ذبیحی همکاران: بررسی سه جدایۀ یرس ای سیبزمینی جداشده از cda در حجم نهایی 25 میکرلیتر شامل: 5/5 میکرلیتر آب دینیزة سترنشده 12/5 میکرلیتر Master mix (1.5mM MgL 2 ) یراژن (AmpliqonII: TaqDAPol2X) از هر آغازگر با غلظت 10pmol/ul ساخت شرکت 1 میکرلیتر 5 میکرلیتر از cda گرمایی اکنش در دستگاه ترمسایکلر انجام گرفت. برنامۀ PR برای آغازگرهای f/r F/R F/R F/R بهصرت: اسرشتسازی الیه به مدت یک دقیقه در دمای 94 o 30 چرخه شامل اسرشتسازی یک دقیقه در دمای 94 o اتصال به مدت یک دقیقه در دمای 57 o بسط به مدت د دقیقه در دمای 72 o بسط نهایی به مدت ده دقیقه در دمای 72 o تنظیم شد. برای جفت آغازگرهای 3TIM/PVIBIP اسرشتسازی الیه به مدت سه دقیقه در دمای 94 o 35 چرخه شامل 30 ثانیه در دمای o ثانیه در دمای o ثانیه در دمای 72 o به مدت پنج دقیقه در دمای 72 o بسط نهایی انجام شد. Primer for rev F R F R F R 3TIM PVIBIP جدل 1. آغازگرهای مرد استفاده برای در آزمن RTPR Table 1. ligonucleotide primers used for in the RTPR test Sequence Fragment References 5 ATAAAGTTGAAATGAAAATG 3 5 ATAAAGATTTAATGTTTTGAT 3 824bp Folwarczna et al., TTGGRAAATAGTRR3 5 TGTATGATGAGTGAA3 609bp Boonham et al., TTGGAATAYATGTGA3 5 TTATTTGAATGTGTGTT3 549bp Boonham et al., TTGGAAATATGT AAA3 5 TGTATGATGAGTGAA3 609bp Boonham et al., GGGGGGGTTTGATTGAAGTTTAAG3 5 GGGGGGGG(/T)TTA(/T)GAAATGATGGT3 1224bp hshima et al., 2000 بافر بررسی محصالت PR در ژل آگارز 1 درصد )1X( TBE پس از افزدن 2 میکرلیتر محلل Red safe )محصل شرکت )Intron برای رنگآمیزی با استفاده از دستگاه الکترفرز Mini( BioRad, )sub ell GT با لتاژ ثابت 85 نتایج با دستگاه UV لت ترانسلمیناتر ( شد. انجام uvidoc )Uvitec مشاهده همسانهسازی پالسمیدی عکسبرداری شد. قطعات DAی ناحیۀ همسانهسازی ناحیۀ با استفاده از کیت در حامل InsTAclone PR loning Kit #K1214 محصل شرکت Scientific در حامل ptz57r/t باکتری Thermo Escherichia بر پایۀ DH5α سیۀ coli دسترالعمل شرکت سازنده انجام گرفت. استخراج پالسمید نترکیب از باکتری به رش (1979) Doly & Birnbiom الکترفرز نمنهه یا همسانهسازی آنزیمی با استفاده از د آنزیم برشی )محصل شرکت انجام گرفت. شده پس از هضم EcoRI HindIII )Fermentas برای اطمینان از الحاق محصل محصالت PR PR در حامل در ژل آگارز 1 درصد انجام شد. ناحیۀ مرد بررسی با آغازگرهای همسانهسازیشده برای تعیین تالی از شرکت دنازیست به شرکت Macrogen کرة جنبی فرستاده شدند. بررسی فیلژنتیکی جدایههای پرتئین پششی ترادف بر پایۀ تالی بهدستآمدة سه جدایۀ مرد بررسی در آغاز با برنامۀ hromas, version 2.13 بازبینی شد سپس با استفاده از برنامۀ BLAST در پایگاه اطالعاتی ترادف برخی از جدایههای مقایسه شدند )جدل BI مجد در با GenBank.)2 تجزیهتحلیل ترادف نکلئتیدی ترجمه این ترادف به ترادف اسیدآمینه مقایسۀ ژنگان جدایۀ مرد بررسی با دیگر جدایههای ثبتشده در بانک ژن همردیفسازی چندگانه ترادف نکلئتیدی اسیدآمینه بازسازی درخت تبارزایی )فیلژنی( با نرمافزارهای VectorTI Advance 11 (Invitrogen) شد. درخت تبارزایی با برنامۀ MEGA6.2.2 MEGA6.2.2 انجام بر پایۀ رش

5 101 دانش گیاهپزشکی ایران درة 48 شمارة 1 بهار تابستان 1396 )GU724847( با 1000 تکرار رسم شد. virus, SMV heat streak mosaic Maximum Likelihood, ML در تحلیلهای تبارزایی از جدایۀ استفاده شد. بهعنان برن گره Isolate HAMKA KHH KERS AZA.TA..T AZA.TA. FA.G KERSA KERKER KER.JI. KER.JI ESFH KERLA Boushehr SYRB16 D6 IB 34/01 Linda Z TU RRA1 H2 Thol Jg Mont E11 H605 np Son41 LYE84.2 Adgen SASA 110 SRI SASA 61 Z SASA 207 L56 ID1 R1 SMV جدل 2. نام رس شمار جدایههای انتخابی در این پژهش Table 2. ame of selected isolates in this study and their accession number Accession o. country Strain HM Hamedan HM henaran/khorasan HM Soghan/Kerman HM Tabriz HM Tabriz HM ghlid/fars HM Sardo/Kerman HM Kerman HM Jiroft HM Jiroft HM Isfahan HM Lalezar/Kerman EF Bushehr AB Syria AB Japan AJ Slovenia AJ Poland AJ Germany AM ew Zealand AY anada AY AY GQ hina M95491 Hungary AY anada AY DQ X Switzerland AF Italy AJ France AJ Spain AJ France AJ England AJ England AJ England EF AJ England AY anada DQ DQ DQ GU ut group Source Host Tomato Tomato Eggpalnt Tobacco Tobacco Pepper ightshade Tomato Tobacco ut group.)et al., 2002 نتایج بحث بررسی دامنۀ میزبانی جدایههای مرد بررسی بر پایۀ نتایج بهدستآمده در مرد تعیین دامنۀ میزبانی از میان گیاهان آزمن مرد آزمایش جدایههای مرد بررسی در گیاهان سیبزمینی گجهفرنگی تاتره فلفل افزایش شدند نشانههای مضعی یا فراگیر )سیستمیک( بهصرت مزاییک سبزردی مضعی پس از هفت تا نه رز پس از مایهزنی یا مزاییک خفیف تا شدید در برخی مارد بافتمردگی فراگیر پس از 14 تا رز پس از مایهزنی در گیاهان محک ایجاد شد 16 )جدل 3( که همسان نشانههای مشاهده شده تسط دیگر جدایههای گزارششده برای بد ( Boonham برخی نشانههای گزارششده از جمله 7Tu 9Tu ایجاد بدشکلی برگ در سیبزمینی تسط د جدایۀ 9Tu ایجاد تیرگی رگبرگ در گجهفرنگی تسط ایجاد نشانههای مزاییک در گل تکمهای 10Tu برخالف نتایج بهدستآمده در دیگر پژهشها ( Hosseini al., 2001 )et al., 2012; Inoueagata et بد )شکل 1 (. با تجه به پژهشهای گذشته سیههای قادر به ایجاد نشانههای که بافتمردگی ری سیبزمینی هستند ری سلمه تره نشانههایی ایجاد نمیکنند همچنین در برگهای تاتره باعث ایجاد نشانههای مزاییک گجهفرنگی به ترتیب سبزردی رشنی رگبرگ مزاییک میشند. درحالیکه سیههای

6 ذبیحی همکاران: بررسی سه جدایۀ یرس ای سیبزمینی جداشده از باعث ظهر درجههای مختلفی از نشانههای مزاییک در برگهای سیبزمینی نشانههای لکۀ مضعی بافت مرده سبزرد در سلمه تره میشند در برگهای تاتره گجهفرنگی به ترتیب نشانههای مزاییک مزاییک بدشکلی ایجاد میکنند ( Fakhrabad et al., 2012;.)Inoueagata et al., 2001; Hosseini et al., 2012 در این آزمن در بیشتر گیاهان سه جدایۀ انتخابی نشانههای همسانی ایجاد کردند. با تجه به ایجاد نشانههای بافتمردگی در سیبزمینی دیگر نشانههای یادشده بهاحتمال این سه جدایه متعلق به یا سیۀ جداسازیکنندة سیههای که تنها سیۀ هستند. یکی از گیاهان گیاه فلفل است میتاند نشانههای فراگیر ری فلفل ایجاد کند )2008 al.,.)singh et در این پژهش جدایههای یادشده ری فلفل د هفته پس از مایهزنی نشانههای مزاییک ایجاد کردند. بنابراین بهنظر میرسد که احتمال دارد جدایههای 9Tu 7Tu 10Tu از نظر دامنۀ میزبانی همسان با جدایههای سیۀ باشند. با تجه به پژهشهای گذشته تنها با تکیه بر دامنۀ میزبانی نمیتان نع سیه را تشخیص داد اما این آزمن در کنار دیگر رشهای ملکلی سرلژیک میتاند برای تعیین قطعی سیۀ استفاده شد )2005 al.,.)moury et برای اطمینان از جد یرس داس االیزا پادتنهای اختصاصی که تأییدکنندة مشاهدههای عینی بد. در میزبانهای مختلف از رش استفاده شد جدل 3. نشانههای ایجادشده تسط جدایههای ری گنههای گیاهی انتخابی Table 3. Symptoms induced by isolates on selected plant species Indicator plants Isolate 7Tu 9Tu 10Tu Solanaceae Solanum tuberosum L.,M,Mf, M, Mf, M Lycopersicum scullentum Mill. Mf, M VB, M VB, M apsicum annuum L. M M M Datura stramonium L. M, LL M, LL M, LL Datura metel L. LL, M LL, M LL, M henopodiaceae henopodium amaranticolor L. Amaranthaceae Gomphrena globosa L. Mf, M Mf, M Mf, M :LL لکۀ مضعی سبزرد M: مزای ک ی بدشکلی شدن :LL لکۀ مضعی بافت مرده : بافتمردگی فراگیر :VB تیرگی رگبرگ. :Mf LL: chlorotic local lesion, M: mosaic, Mf: malformation, LL: necrotic local lesion, : necrosis, VB: vein banding. A B D شکل 1. نشانههای سه جدایۀ ایر یان 9Tu 7Tu 10Tu ری گیاهان مختلف: A( ایجاد بافتمردگی بدشکلی تسط جدایۀ 9Tu ری سیبزمینی B( ایجاد نشانههای بافتمردگی جدایۀ 10Tu ری سیبزمینی ( ایجاد نشانههای مزای کی تسط جدایۀ 7Tu ری سیبزمینی D( ایجاد نشانههای تیرگی رگبرگ تسط جدایۀ 9Tu ری گجهفرنگی E( ایجاد نشانههای لکۀ مضعی بافت مرده ر ی تاتره تسط جدایۀ 10Tu Figure 1. Symptoms of three Iranian isolates on plant species: A) necrosis and leaf distortion on potato caused by 9Tu isolate, B) leaf distortion on potato caused by 10Tu isolate, ) mosaic on tomato caused by 7Tu isolate, D) vein banding symptoms on tomato caused by 9Tu isolate, E) ecrotic local lesion on Datura stramonium L. caused by 10Tu isolate. E

7 103 دانش گیاهپزشکی ایران درة 48 شمارة 1 بهار تابستان 1396 تعیین زن ملکلی پرتئین پششی با استفاده از Sabir, 2012 ;1976( Amer et al., ;2004 رش SDSPAGE زن پرتئین پششی جدایههای با 10Tu 9Tu 7Tu استفاده از مارکرهای پرتئینی رسم منحنی خط )RF( رگرسین در حدد کیلدالتن برآرد شد )شکلهای 2 3( که با نتایج تحقیقات پیشین همخانی داشت. علت احتمالی این پدیده که در برخی پتی یرسهای دیگر هم گزارش شده است ایجاد تغییر در نتیجۀ آنزیمهای پرتئلیتیک است. تمایل پرتئینهای یرسی به تجزیه شدن میتاند به یرس یا میزبان بستگی داشته باشد Huttinga & (.)Mosch, 1974; Moghal & Francki, 1976.Huttinga & Mosch, 1974; Moghal & Francki, شکل 2. لکترفرز پرتئینی پارتیکلهای جدایههای 9Tu 10Tu 7Tu :M نشانگر پرتئینی )Thermo, 14.4kDa116kDa( :ph گیاه سالم در ژل پلی اکریل آمید گیاه آلده :pd Figure 2. Electrophoresis of proteins from 10Tu, 9Tu and 7Tu particles in polyacrylamide gel M: Molecular weight marker (Thermo, 14.4kDa116kDa), ph: Healthy plant and pd: Infected plant شکل 3. خط رگرسین زن پرتئین پششی =RF( حرکت نسبی باندها ری ژل( Figure 3. Linear regression line related to coat protein weight (RF = relative movement of bands in gel) تعیین سیۀ جدایههای با استفاده از آغازگرهای اختصاصی با بررسی اکنش جدایههای آغازگرهای اختصاصی 9Tu 7Tu 10Tu F/R F/R با F/R هر سه جدایۀ تنها قادر به افزایش ناحیۀ 609 جفتبازی با جفت آغازگر F/R اختصاصی سیۀ بدند )شکل 4(. بنابراین تالی ناحیۀ انتهایی ژن پرتئین پششی این جدایهها همسان تالی جدایههای سیۀ پششی زیرگرهه یا است. با تجه به اینکه تالی انتهای پرتئین از سیۀ منشأ میگیرند در اثر نترکیبی ژنگان Visser, 2012; Karasev & (.)Gray, 2013 برای بررسی بیشتر از جفت آغازگر

8 ذبیحی همکاران: بررسی سه جدایۀ یرس ای سیبزمینی جداشده از TIM/PVIBIP اختصاصی سیۀ نیز استفاده شد یک قطعۀ 1124 جفت بازی از ناحیۀ / انتهای 3 سه جدایه افزایش شد )شکل 5(. با تجه به افزایش جدایههای 9Tu 7Tu 10Tu با آغازگر اختصاصی این جدایهها احتمال دارد متعلق به یا سیۀ باشند. برای تعیین دقیق سیه بایستی ناحی مختلف ژنگان تالییابی با دیگر تالیهای مجد در بانک ژن مقایسه شد. شکل 4. نقش الکترفرزی محصالت PR جدایهه یا نشانگرDA 9Tu 7Tu 10Tu با آغازگرهای :M :F/R/F/ R/ F )Qiagen, 100bp DA ladder( به ترتیب شامل نمنهه یا 9Tu 7Tu 10Tu 5 4 F/R 9 به ترتیب شامل نمنهه یا نمنهه یا 9Tu 7Tu 10Tu با آغازگرهای اختصاصی F/R با آغازگرهای اختصاصی Tu 7Tu 10Tu با آغازگرهای اختصاصی F/R است به ترتیب شامل Figure 4. Electrophoresis pattern of PR products of 10Tu, 9Tu and 7Tu isolates with F/R/F/ R/ F primers. M: DA ladder (Qiagen, 100bp), 1, 2, 3: related to amplification of 7Tu, 9Tu, 10Tu isolates with F/R primer pairs. 4, 5, 9: related to amplification of 7Tu, 9Tu and 10Tu isolates using F/R primer pairs. 6, 7, 8: related to amplification of 7Tu, 9Tu and 10Tu using F/R primer pairs. شکل 5. نقش الکترفرزی بهدستآمده از اکنش PR جدایهه یا 9Tu 7Tu 10Tu با آغازگرهای :3TIM/PVIBIP )Fermantase, GeneRuler 1 kb DA Ladder( DA نشانگر )M ( کنترل منفی. Figure 5. Electrophoresis pattern of PR products of 10Tu, 9Tu and 7Tu isolates using 3TIM/PVIBIP primer pairs. M: DA ladder (Fermantase, GeneRuler 1 kb DA Ladder), : negative control. بررسی تالی ناحیۀ قطعههای افزایششده از هر د س تالییابی آنگاه با گزینۀ Assemble برنامۀ ترادف پرتئین VectorTI پششی منتاژ تصحیح شد. ناحیۀ همپشان با دیگر تالیهای ثبتشده در بانک ژن تسط برنامۀ بالست مقایسه شد که نتایج همسان انتظار نشاندهندة همانندی باالی این جدایه با دیگر جدایههای ثبتشده داشت. سپس ترجمۀ تالی نکلئتیدی به تالی اسیدآمینه با برنامۀ نکلئتیدی جدایههای 100 درصد با جدایۀ VectorTI 9Tu 10Tu 7Tu همانندی تالی نکلئتیدی ناحیۀ انجام گرفت. تالی با یکدیگر به میزان 99 درصد همسانی دارند. جدایههای 7Tu 9Tu 10Tu با دیگر جدایهها 87 تا 99 درصد است که بیشترین همانندی را با جدایههای L56 ID1 H2

9 105 دانش گیاهپزشکی ایران درة 48 شمارة 1 بهار تابستان 1396 SRI SASA207 Z R1 کمترین همانندی را با جدایهه یا SYRB16 KERKER E11 دارند. تالی آمیناسیدی سه جدایۀ مرد بررسی 100 درصد با هم همسانی دارد. درصد همانندی تالی آمیناسیدی ناحیۀ تا 99 9Tu 10Tu این جدایهها با دیگر جدایهها 86 درصد است که بیشترین همانندی جدایههای 7Tu به ترتیب با جدایههای SYR )99 درصد( کمترین همانندی SYRIB Z IB با 10Tu KERKER KERSA KERKER انجامشده تسط حفاظتشده KERSA Hosseini et al. د جدایۀ دیگر با مشاهده میشد. در پژهش (2012) GSTKKDAKQ )تالی د متیف 179( PLKEKE انتخابی متعلق به )تالی 3124( در همۀ جدایههای ایرانی سیههای جداشده از سیبزمینی جد داشت که در جدایههای متعلق به سیۀ دیده نمیشد. جدایههای 9Tu 7Tu 10Tu بهجای این د متیف دارای متیفهایی با تالی GS(S)KKDARP SLKGKD جدایههای ایرانی متعلق به سیههای شده در پژهش از جدایههای متعلق به سیۀ همسان با (2012) Hosseini et al. مانند گزارش برخی دیگر SYRB H2 هستند. بنابراین به نظر میرسد به علت رخداد نترکیبی زیاد در ناحیۀ این ناحیه نمیتاند برای جداسازی همۀ جدایههای متعلق به سیۀ بهکار رد. از این نظر جدایههای ایرانی جداشده از شلغم با جدایههای ایرانی جداشده از سیبزمینی متفات هستند. بهترین مدل برای رسم درخت تبارزایی برای تالی نکلئتیدی اسیدآمینه بنابر نتایج بهدستآمده از برنامۀ MEGA6 به ترتیب مدل HasegawaKishinoYano JonesTaylorThornton تعیین شد. برای رسم درخت تبارزایی بر پایۀ تالی نکلئتیدی اسیدآمینۀ ناحیۀ جدایههای از رش ML استفاده شد. در درخت رسم شده بر پایۀ تالی نکلئتیدی ناحیۀ جدایهها به چهار گره تقسیم شدند. در گره یک جدایههای 9Tu 7Tu SYRB H2 10Tu در کنار د جدایۀ آسیایی )جدایههای به ترتیب از چین سریه( متعلق به جداشده از ایران دیگر نقاط جهان که در زیرگرههای جداگانه جای گرفتند دیده میشند. در گره دم جدایههای متعلق به سیۀ در گره سم جدایههای متعلق به سیۀ تبارزایی رسمشده A/ قرار دارند. در درخت بر پایۀ تالی اسیدآمینه نیز چنین تقسیمبندی مشاهده میشد )شکل 6(. اما به علت حفاظتشدگی زیاد د گره ال دم در یک گره با هم ادغام میشند جدایههای سیۀ جدایههای میگیرند. چند جدایۀ در کنار آسیایی قرار شکل 6. درخت تبارزایی رسمشده بر پایۀ مقایسۀ تالی اسیدآمینۀ ناحیۀ جدایهه یا برخی جدایهه یا 9Tu 7Tu 10Tu به رش.ML با Figure 6. Phylogenetic tree constructed based on amino acid sequences of coat protein region of 7Tu, 9Tu and 10Tu isolates in comparison with some of the isolates using ML method ID1 R1 SASA 207 H2 SYRB16 Z FA.G L56 7Tu 9Tu 10Tu AZA.TA..T AZA.TA. KER.S HAM.KA KH.H SRI SASA110 Adgen LYE84.2 p S41 KER.SA KER.JI ESF.H IB 34/ KER.JI. Linda KER.LA Thol T5 KER.KER H605 Z Mont E11 TU660 Jg D6 RRA1 SASA61 SMV Group 1 Group 2 سیۀ جدایههای سیۀ جدایههای سیۀ

10 ذبیحی همکاران: بررسی سه جدایۀ یرس ای سیبزمینی جداشده از به نظر میرسد تنها با تکیه بر نتایج بهدستآمده از یک ناحیه نمیتان با قاطعیت سیۀ را تعی نی کرد. برای اطمینان بیشتر بایس یت ناحی بیشتری از ژنگان تالییا یب شد. از نظر تالی جدایههای سیۀ شبیه به هستند. بنابراین با تجه به نتایج بهدستآمده از بررسی ناحی مختلف به نظر میرسد هر سه جدایۀ انتخابی در این پژهش متعلق به سیۀ یا است. نتیجهگیری کلی در این پژهش با رش DASELISA پادتن اختصاصی یرس یادشده از کشتزارهای استان خزستان که از مناطق مهم کشت شلغم است ردیابی جداسازی شد. در آزمن RTPR آغازگرهای اختصاصی جنس با استفاده از حضر یرس ای سیبزمینی ثابت شد با استفاده از رش مشاهده د قطعۀ کیلدالتنی SDSPAGE از پرتئین پششی یرس جد یرس تأیید شد. در ادامه با استفاده از گیاهان آزمن آغازگرهای 10Tu اختصاصی نع سیۀ جدایههای 9Tu 7Tu جداشده همسان از شهرستانهای سیههای دزفل تعیین ششتر شد. شش درنهایت بررسی جدایههای تالی نکلئتیدی آمیناسیدی مقایسۀ ناحی 10Tu آن با دیگر 9Tu 7Tu جدایههای برداشتشده از بانک ژن نشان داد که هر سه جدایه از نظر تالی ناحیۀ به سیۀ همسان جدایههای متعلق هستند. بنابر نتایج بهدستآمده از آغازگرهای اختصاصی بررسی ناحی مختلف هر سه جدایۀ مرد بررسی متعلق به خانادة پتییریده جنس گره یا هستند. REFEREES 1. Amer, M., ElHammady, M., Mazyad, H., Shalaby, A. & AboElabbas, F. (2004). loning, expression and nucleotide sequence of oat protein gene of an Egyptian isolate of Virus Y strain infecting plants. Egyptian Journal Virology, 1, Bimboim, H.. & Doly, J. (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant (6), Research, plasmid DA. ucleic acids 3. Boonham,., alsh, K., Hims, M., Preston, S., orth, J. & Barker, I. (2002). Biological and sequence comparisons of virus Y isolates associated with tuber necrotic ringspot disease. Plant Pathology, 51, lark, M. F. & Adams, A. (1977). haracteristics of the microplate method of enzymelinked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Journal of General Virology, 34, Fakhrabad, F. Z., asrollanejad, S., Ahmadikhah, A. & Taghinasab, M. (2012). Sequencing of three isolates and prevalence of virus Y in Tobacco fields of Golestan province, and phylogenetic comparison of the Iranian and world isolates of the virus. Iranian Journal of Plant Pathology, Folwarczna, J., Plchova, H., Moravec, T., Hoffmeisterova, H., Dedic,. & erovska,. (2008). Production of polyclonal antibodies to a recombinant oat protein of virus Y. Folia Microbiologica, 53(5), Fuji, S., Inoue, M., Yamamoto, H., Furuya, H., aito, H. & Matsumoto, T. (2003). ucleotide sequences of the oat protein gene of Potyviruses infecting rnithogalum thyrsoides. Archives of Virology, 148, Ha, uong Viet. (2007). Detection and identification of potyviruses and geminiviruses in Vietnam. Ph.D. thesis. by Publication, Queensland University of Technology, Queensland. 9. Higgins,., assidy, B., Teycheney, P.Y., ongkaew, S. & Dietzgen, R. (1998). Sequences of the oat protein gene of five Peanut stripe virus (PStV) strains from Thailand and their evolutionary relationship with other Bean common mosaic virus sequences. Archives of Virology, 143, Hosseini, S., Koohi Habibi, M., Mosahebi, G., Motamedi, M. & inter, S. (2012). First report on the occurrence of Tobacco streak virus in Sunflower in Iran. Journal of Plant Pathology, 94, Hull, R. (2002). Induction of disease 1: virus movement through the plant and effects on plant metabolism. Matthew s plant Virology, 4th edn, Academic Press, San Diego, Huttinga, H. & Mosch,. (1974). Properties of viruses of the Potyvirus group. 2. Buoyant density, S value, particle morphology, and molecular weight of the oat protein subunit of Bean yellow mosaic virus, Pea mosaic virus, Lettuce mosaic virus, and virus Y. etherlands Journal of Plant Pathology, 80, Inoueagata, A. K., Fonseca, M. e.., Lobo, T.., Ávila, A.. & Monte, D.. (2001). Analysis of the nucleotide sequence of the oat protein and 3'untranslated region of two Brazilian virus Y isolates. Fitopatologia Brasileira, 26, 4552.

11 تابستان بهار 1 شمارة 48 درة ایران گیاهپزشکی دانش 14. Jensen, S. G., LongDavidson, B. & Seip, L. (1986). Size variation among proteins induced by Sugarcane mosaic viruses in plant tissue. Journal Series Paper, 68583, Kachroo, P., Yoshioka, K., Shah, J., Dooner, H. K. & Klessig, D. F. (2000). Resistance to Turnip crinkle virus in Arabidopsis is regulated by two host genes and is salicylic acid dependent but PR1, ethylene, and jasmonate independent. The Plant ell, 12, Kuchacki, A. R., asirimahalati, M., Hassanzade Aval, F., Mansuri, H., Amiri, S. R., Zarghani, H. & Karimian, M. (2013). Assessment of biodiversity vegetables in ecosystems crop of Iran. Journal of Applied Ecology, 4(2), 111. (in Farsi) 17. Khuzestan Agriculture Jahad. (2010). Turnip harvest from the fields of Khuzestan province. Retrieved December 22, 2014, from Laemmli, U. K. (1970). leavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. ature, 227, Leisner, S. M., Turgeon, R. & Howell, S. H. (1992). Long distance movement of auliflower mosaic virus in infected Turnip plants. Molecular. PlantMicrobe Interact, 5, Missiou, A., Kalantidis, K., Boutla, A., Tzortzakaki, S., Tabler, M. & Tsagris, M. (2004). Generation of transgenic plants highly resistant to virus Y () through RA silencing. Molecular Breeding, 14, Moghal, S. & Francki, R. (1976). Towards a system for the identification and classification of Potyviruses: I. Serology and amino acid composition of six distinct viruses. Virology, 73, Moury, B., Palloix, A., aranta,., Gognalons, P., Souche, S., Selassie, K. G. & Marchoux, G. (2005). Serological, molecular, and pathotype diversity of Pepper veinal mottle virus and hili veinal mottle virus. Phytopathology, 95, anayakkara, U.., Singh, M., Pelletier, Y. & ie, X. (2012). Investigation of virus Y () strain status and variant population in es in ew Brunswick, anada. American Journal of Research, 89, hshima, K., Sako, K., Hiraishi,., akagawa, A., Matsuo, K., gawa, T., Shikata, E. & Sako,. (2000). tuber necrotic ringspot disease occurring in Japan: its association with virus Y necrotic strain. Plant Disease, 84, Sabir, J. S. (2012). Identification of six virus Y isolates from Saudi Arabia. African Journal of Biotechnology, 11, Singh, R. P., Valkonen, J. P., Gray, S. M., Boonham,., Jones, R., Kerlan,. & Schubert, J. (2008). Discussion paper: The naming of virus Y strains infecting. Archives of Virology, 153, Smith, K. M. (1931). omposite nature of certain viruses of the mosaic group. ature, 127, UrcuquiInchima, S., Haenni, A.L. & Bernardi, F. (2001). Potyvirus proteins: a wealth of functions. Virus Research, 74, Visser, J.. (2012). A study of the strain evolution and recombination of South African isolates of virus Y. Ph. D. thesis.stellenbosch University, Stellenbosch.