چکیده. Identification and partial characterization of the virus infecting saffron (Crocus sativus) in Iran

Transcript

1 Iranian Journal of Plant Protection Science Vol 47, No 2, Autumn & Winter ) DOI: /ijpps دانش گیاهپزشکی ایران درة 47 شمارة 2 پاییز زمستان 1395 )ص شناسایی بررسی برخی از یژگیهای یرس آلدهکنندة زعفران sativus )Crocus در ایران محمدی 2 *2 1 شیرین پریزاد اکبر دیزجی مینا کهی حبیبی غالمحسین 6 فرناند گارسیا آرنال مصاحبی اشتفان ینتر سیامک کالنتری فاطمه ایزدپناه 7 3. دانشجی دکتری دانشیار استاد گره گیاهپزشکی پردیس کشارزی منابع طبیعی دانشگاه تهران کرج دانشیار دانشجی سابق گره باغبانی پردیس کشارزی منابع طبیعی دانشگاه تهران کرج 6. مرکز بیتکنلژی ژنمیکس گیاهان دانشگاه پلی تکنیک مادرید مادرید اسپانیا 7. کلکسین آلمانی میکر ارگانیسمها کشت سللی DSMZ برانشایگ آلمان )تاریخ دریافت: /6/28 تاریخ پذیرش: 1395/9/ تا 1394 شمار چکیده پس از نمنهبرداری تصادفی از برگها بنههای گیاه زعفران.L Crocus sativus از شش استان کشر در ساله یا 641 از 890 نمنه با آنتیبادیهای عممی جنس پتییرس همانطر با آنتیبادی اختصاصی یرس مزاییک معملی لبیا ) در آزمن االیزا اکنش مثبت نشان داد. زن ملکلی پرتئین پششی )CP چند جدایة مرد بررسی پتییرس زعفران با استفاده از آزمن سترن بالت 35 کیل دالتن محاسبه شد. پس از استخراج آر.ان.ا کل از گیاهان آلده سه قطعه منقطع از ژنم )مربط به انتهای '3 ژنم بخشی از ناحی CI )HC-Pro تکثیر شد. پرتئین پششی CP) پتییرس زعفران بر پایة تالی نکلئتیدی بیشترین یکسانی را )74 درصد با Ceratobium mosaic virus Telosma mosaic virus بر پایة تالی ترجمة اسیدآمینهای بیشترین یکسانی را )78/8 درصد با Bean common mosaic necrosis virus داشت. بهرغم رابطة سرمشناختی )سرلژیکی باالی این پتییرس با خیشاندی تبارزایی )فیلژنتیکی با زیرگره بر پایة ناحیة CP میزان یکسانی تالی نکلئتیدی ترجمه اسید آمینهای پرتئین پششی آن کمتر از آستانة تعیین حدد گسترة گنه در جنس پتییرس است. لذا بهاحتمالزیاد پتییرس آلدهکنندة زعفران گنة جدیدی از جنس پتییرس بده که اظهارنظر قطعی مستلزم تعیین تالی کل ژنم آن است. زعفران L.).Crocus sativus اژهه یا کلیدی: االیزا پرتئین پششی پتییرس Identification and partial characterization of the virus infecting saffron Crocus sativus) in Iran Shirin Parizad 1, Akbar Dizadji 2*, Mina Koohi Habibi 2, Gholam Hossein Mosahebi Mohammadi 3, Siamak Kalantari 4, Fatemeh Izadpanah 5, Fernando García-Arenal 6 and Stephan Winter 7 1, 2, 3. Ph.D. Student, Associate Professor and Professor, Department of Plant Protection, College of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran, Karaj, Iran 4, 5. Associate Professor and Former M.Sc. Student, Department of Horticultural Science, College of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran, Karaj, Iran 6. Centro de Biotecnología y Genómica de plantas UPM-INIA), Universidad Politécnica de Madrid, Madrid, Spain 7. Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany Received: Sep. 18, Accepted: Dec. 13, 2016) ABSTRACT Following the random sampling of saffron Crocus sativus L.) leaves and corms from six provinces of Iran, during growing seasons of , a total of 890 leaf tissue samples were investigated by enzyme-linked immunosorbent assay ELISA) tests. The results revealed that 641 samples showed positive reaction only with Potyvirus genus specific and exactly with Bean common mosaic virus ) specific antibodies. The molecular mass of several isolates of the virus coat protein CP) was estimated as 35 kda by western blotting. Following total RNA extraction from virus infected samples, three discontinuous fragments corresponding to genomic 3', partial CI and HC-Pro regions) were amplified. The CP region of the virus infecting saffron has the highest nucleotide identity with Ceratobium mosaic virus CerMV) and Telosma mosaic virus TelMV) 74%) and the highest deduced amino acid identity with Bean common mosaic necrosis virus BCMNV) 78.8%). Despite the high serological relationship with and a close phylogenetic relationship with subgroup based on CP region, the identity values are less than described species demarcation criteria for Potyviridae family. Overall, it seems that the saffron infecting Potyvirus is a new species of Potyvirus genus but the definitive statement requires sequencing the entire genome of the virus. Keywords: Coat protein, ELISA, Potyvirus, saffron Crocus sativus L.). * Corresponding author adizaji@ut.ac.ir Tel:

2 دانش گیاهپزشکی ایران درة 47 شمارة 2 پاییز زمستان زعفران یکی ادیة مقدمه Crocus sativus L.) از مهمترین جهان از خانادة زنبقیان بهعنان محصالت کشارزی گرانبهاترین رزافزن به است که تجه یژگیهای زعفران ازجمله یژگیهای ضد سرطانی ضدافسردگی ضدآلزایمری آن مجب افزایش تجه دانشمندان به اینگنة گیاهی در جهت بهبد کیفیت کمیت تلید آن شده است در دههه یا.)Grilli Caiola & Faoro, 2011 با آلدگی پتییرسی شکل اخیر تغییرپذیری فراساختاری مرتبط )اندامکه یا در کالله خامه برگه یا Crocus cartwrightianus )گنة همراه فرفرهای زعفران زراعی حشی نیای احتمالی زعفران یافت شده است. با تجه به مشاهده نشدن عالیم بیماری در این گیاهان میتان استدالل آلدگیه یا کرد بهطر گستردهای پنهان پتییرسی پنهان یرسی در Crocus spp. انتشار یافته است. جد آلدگی در C. cartwrightianus )نیای احتمالی زعفران زراعی نیز نشاندهندة قدمت آلدگی Crocus spp. )استرینه یا بیمارگر به یرس بده مالیم در طی تکامل انتخاب شدهاند احتمال دارد همراه سیه میزبان- Grilli Caiola & Faoro, از دالیل احتمالی انتشار آلدگیه یا پتییرسی در راه شته اندامه یا یژگیه یا Crocus spp. پنهان انتقال پتییرسها از تکثیری )بنه است. افزن بر آن ریختشناختی )مرفلژیکی زعفران مجب میشد مشاهدة کتلگی یا شکستگی رنگ گلبرگ آنها به آلدگیه یا عالیمی گله یا مانند ارتباط دادن پتییرسی کار دشاری باشد همة این مسائل مجب انتشار آلدگی پتییرسی در زعفران شده است.Grilli Caiola & Faoro, 2011) تاکنن در چند بررسی مربط به آلدگیه یا یرسی در جنس Crocus یرسهایی از جمله یرس 1 مزاییک زرد لبیا BYMV) Russo et al., 1979; )Grilli Caiola, 1982; Pisi and Bellardi, یرس مزاییک شلغم TuMV) Chen & Chen, )2000; Jishuang, 2000; Chen et al., 2004 یرس مزاییک شدید زنبق ISMV) یرس جغجغک تتن Brunt & Phillips, Van TRV) )Slogtern, 1958 ردیابی شده است. در سال 2005 نتایج ردیابی )نکرز از بهدستآمده BYMV ISMV بررسیه یا ملکلی گیای TRV یرس بافت مردگی TNV) 5 تتن NMV) کتلگی زردی گلبرگ بد از چند کلتیار 6 یرس مزاییک نرگس بافت مردگی Crocus spp..)miglino et al., 2005 عالیم با شکستگی رنگ جنس پتییرس بزرگترین جنس یرسه یا گیاهی دارای ژنم آر.ان.ا تکرشتهای مثبت با طل 10 حدد خمشپذیر کیلباز پیکره به طل Hull, 2002) پ یل بهصرت رشتهای میباشد نانمتر بیان ژنم پتییرسها بهصرت یک پرتئین است که در پی آن تسط پرتئینازهای یرسی P1 )NIa HC-Pro به بالغ شکسته میشد NIb CP بیشینه 10 پرتئین VPg NIa-Pro HC-Pro P3 6K1 CI 6K2 آلدگی الزم این یرسها اندامکه یا یژگیه یا یرسها است ر ی P1 که برای چرخة هستند 2004), Singnoret.Lapierre & در سیتپالسم میزبان یاختة همراه فرفره مانندی تلید میکنند که از مهم آرایهبندی )تاکسنمیکی.Urcuqui-Inchima et al., 2001) متأسفانه باجد تحقیقات جنبهه یا این بررسیهای انجامشده مختلف زیستی )بیلژیکی بمشناختی )اکلژی ژنتیک زعفران تابهحال بررسیهای معددی درزمینة عاملهای بیماریزیا آلدهکنندة زعفران بهیژه یرسه یا این گیاه در سطح جهان انجام شده است. بررسیهای الیه تسط پریزاد همکاران )منتشرنشده برای نخستین بار نشاندهندة آلدگی گیاهان زعفران به پتییرس در ایران بد. در این تحقیق افزن بر مطالعه پراکنش این یرس در مناطق عمدة کشت زعفران در کشر برخی از یژگیهای زیستی ملکلی این یرس ردیا یب شده بررسی شد. 3. Iris sever mosaic virus 4. Tobacco rattle virus 5. Tobacco necrosis virus 6. Narcissus mosaic virus 1. Bean yellow mosaic virus 2. Turnip mosaic virus

3 265 پریزاد همکاران: شناسایی بررسی برخی از یژگیهای یرس... ماد رشها نمنهبرداری کشت بنههای زعفران در استانه یا بازدیدهای کشتزارهای از بهعملآمده زعفران تهران اصفهان فارس آذربایجان شرقی خراسان جنبی رضی در ساله یا بتههای زعفران به آلدگی یرسی بررسی 1390 تا 1394 ازنظر داشتن عالیم احتمالی مربط 790 شمار درمجمع نمنه برگی 100 نمنه بنة گیاهی بهصرت تصادفی شد. بنهها نمنهبرداری پس از انتقال به گلخانه در دمای 17 درجة سلسیس شرایط نری 16 ساعت رشنایی 8 ساعت تاریکی کشت شدند. ارزیا یب مختلف آلدگی آلدگی احتمالی نمنهه یا نمنههای برگی زعفران به یرسه یا مزرعهای نیز نمنههای برگی بتههای زعفران رشد کرده در شرایط گلخانه )درمجمع 890 نمنه به پتییرس با آزمن Antigen Coated-Plate Enzyme Joisson et al., ACP-ELISA )Linked Immunosorbent Assay )1992 با استفاده از آنتیبادیهای تک همسانهای جنس پتییرس )دریافتشده از مؤسسة آلمان بررسی شدند. نمنههایی که در آزمن DSMZ ACP- ELISA اکنش مثبت نشان داده بدند با آنتیبادی اختصاصی گنهه یا مختلف رایج جنس پتییرس )جدل 1 به رش Clark & DAS-ELISA )Adams, 1977 ارزیا یب شدند. همچنین آلدگی احتمالی نمنهها با چندگنة دیگر )غیر پتییرس جدل 1 به رش DAS-ELISA بررسی شد. میزان جذب نری در این آزمن در طلمج 405 نانمتر با استفاده از دستگاه ELISA-Reader اندازهگیری شد. نمنههایی با میزان جذب بیش از سه برابر جذب نمنه سالم بهعنان نمنة آلده در نظر گرفته شدند. جدل 1. آنتیسرمهای مرد استفاده در بررسی مقدماتی آلدگی یرسی زعفران Table 1. List of antibodies used in this study for preliminary assays of saffron viral infection Virus Assay Antibody code Alfalfa mosaic virus AMV) DAS-ELISA DSMZ-AS-0779 Bean common mosaic virus ) DAS-ELISA DSMZ-AS-0242 Bean common necrosis mosaic virus BCMNV) DAS-ELISA DSMZ-AS-0239 Bean yellow mosaic virus BYMV) DAS-ELISA DSMZ-AS-0471 Cowpea aphid borne mosaic virus CABMV) DAS-ELISA DSMZ-AS-0417 Cucumber mosaic virus CMV) DAS-ELISA DSMZ-AS-0929 Genus Potyvirus ACP-ELISA DSMZ-AS-0573/1 Lettuce mosaic virus LMV) DAS-ELISA DSMZ-AS-0886 Potato virus Y PVY) DAS-ELISA DSMZ-AS-0137 Soybean mosaic virus SMV) DAS-ELISA DSMZ-AS-0543 Tobacco etch virus TEV) DAS-ELISA DSMZ-AS-0138 Tobacco necrosis virus TNV) DAS-ELISA DSMZ-AS-0070 Tobacco rattle virus TRV) DAS-ELISA DSMZ-AS-0208 Tomato spotted wilt virus TSWV) DAS-ELISA DSMZ-AS-0580 Turnip mosaic virus TuMV) DAS-ELISA DSMZ-AS-0132 Watermelon mosaic virus WMV) DAS-ELISA DSMZ-AS-0203 Zucchini yellow mosaic virus ZYMV) DAS-ELISA DSMZ-AS-0234 تعیین دامنة میزبانی در شرایط گلخانه بهمنظر بررسی انتقال مکانیکی پتییرس زعفران بر پایة نتایج آزمن االیزا د جدایه از هر استان )جدایههای Ir-Kh1 Ir-Kh2 استان خراسان تهران Ir-T1 بهترتیب از Ir-T2 Ir-F1 Ir-F2 فردس تربتحیدریه از رستای یقة استان از استهبان استان فارس Ir-I1 Ir-I2 از میمة استان اصفهان که با آنتیبادی جنس پتییرس در پی آن با آنتیبادی اختصاصی اکنش مثبت نشان داده بدند انتخاب با رش مکانیکی ری گیاهان محک مایهز ین در شرایط مناسب در گلخانه نگهداری شدند. گیاهان محک مرد استفاده برای مایهز ین شامل Gomphrena Chenopodium amaranticolor globosa Phaseolus vulgaris Cucumis sativus C. quinoa

4 دانش گیاهپزشکی ایران درة 47 شمارة 2 پاییز زمستان Nicotiana N. tabacum cv. Vigna unguigulata Pisum sativum tabacum cv. White Burley N. debneyi N. clevelandii N. glutinosa Samsun Datura stramonium N. rustica N. benthamiana Cicer arietinum D. metel Vicia faba بدند. برای مایهزنی این گیاهان از بافر فسفات پتاسیم 0/1 )ph مالر میلیمل 2/3 همراه با )7 NaDIECA diethyldithocarbamate )Natrium پدر فعال استفاده شد. خالصسازی نسبی یرس زغال الکترفرز عمدی پرتئین در ژل پلی اکریل آمید )SDS-PAGE آزمن سترن بالت برای بررسی بهتر یژگیهای فیزیکشیمیایی تعیین زن ملکلی پرتئین پششی پتییرس آلدهکنندة زعفران از رش پ یل الکترفرز عمدی پرتئینها ژل در اکریل آمید حای سدیم ددسیل dodecyl sodium Leammli, 1970; Sambrook & Russel, )PAGE 2001 آزمن سترن بالت Towbin et al., 1979; al., 1989 )Sambrook et استفاده شد. بدین منظر جدایههیا Ir-I2 Ir-T2 Ir-T1 Ir-Kh2 Ir-Kh1.sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- Ir- F2 H1 به همراه د نمنة عاری از پتییرس )شاهد منفی H2 انتخاب به همراه آمدة نیمه خالص جدایهای از یرس بررسی شدند. برای استخراج پرتئین کل عصارهگیری از 0/1 گرم نمنهه یا که برگی با استفاده از بافر استخراج )حای 50 میلیمل تریس اسیدی 5 میلیمل اسید بریک 5 درصد گلیسرل در آب مقطر PVP) به هنگام استفاده رلیدن یلپین پ یل 1/5 درصد )40000 )MW 0/01 درصد 2 -مرکاپتاتانل به آن اضافه شد انجام درن للهه یا 1/5 میلیلیتری به مدت سی دقیقه در یخچال قرار داده شدند. سپس 30 میکرلیتر از مایع ریی به للة جدید منتقل حجم یکسان از بافر د بار لملی buffer 2x Lammli به آن اضافه شد. نمنهها به همراه پرتئینهای استاندارد از پیش رنگآمیزیشده دقیقه Benchmark TM ) به مدت پنج در آب در حال جشیدن قرار پس از آن بیدرنگ به درن ظرف حای یخ انتقال داده شدند. برای خالصسازی نسبی Mini purification) یرس )1986 al., )Jensen et از بافت برگ گیاه آلده به جدایةIr-Kh1 پتییرس استفاده شد. از بافت برگی گیاهان عاری از بهعنان نیز شاهد منفی در خالصسازی نسبی استفاده شد. 2 گرم از بافت برگ تازة نمنهها در 15 میلیلیتر بافر سیترات سدیم 0/1 مالر 6/5 حای ph درصد 0/25 2 -مرکاپتاتانل 0/1 NA-DIECA 1 درصد PVP درصد عصارهگیری پس از عبر از پارچة ململ چندالیه به مدت بیست دقیقه با سرعت 10000rpm میلیلیتر محلل 33 درصد سانتریفژ شد. رنشین با 4 Triton X-100 در آب مقطر مخلط ری بالشتک محلل 20 درصد سکرز در بافر عصارهگیری به مدت سه ساعت با سرعت 24000rpm سانتریفژ شد. آمدههای پرتئین کل آمدة نیمه خالص یرس به همراه نشانگر پرتئینی Pierce.Unstained Protein MW Marker, Thermo Fisher )Scientific, USA متراکمکننده در ژل ناپیسته 5 12 استفاده شدند. پس از جداسازی درصد درصد جداکنندة پلی اکریل آمید پرتئینها باندهای پرتئینی به غشای سللزی از چندهمسانهای انتقال آنتیسرم )DSMZ-AS-0242 برای ردیابی یرس استفاده شد. ردیابی باند پرتئین پششی اکنش داده با یرس همزمان 75 میلیگرم اضافه کردن تسط آنتیسرم Nitro blue tetrazolium chloride میلیلیتر 1 در NBT) دیمتیل 50 فرمامید میلیگرم- p 5-bromo-4-Chloro-3'-Indolyphosphate Toluidine Salt BCIP) میلیلیتر 1 در دیمتیل فرمامید در 10 میلیلیتر بافر آلکالین فسفاتاز 9/5 ph صرت گرفت. بر پایة حرکت نسبی پرتئینهای نشانگر لگاریتم زن ملکلی تدة ملکلی پرتئین پششی تعیین شد 1981 Crothers,.)Fried & آنها خط رگرسینی ترسیم پتییرس زعفران استخراج آر.ان.ا کل نسخهبرداری معکس- اکنش زنجیرهای پ یل مراز RT-PCR) بهمنظر تعیین تالی بخشهایی از ژنم پتییرس زعفران پنج جدایة Ir-I1 Ir-T1 Ir-Kh2 Ir-Kh1 Ir-F1 انتخاب شدند. آر.ان.ا کل از 100 میلیگرم بافت

5 267 پریزاد همکاران: شناسایی بررسی برخی از یژگیهای یرس... برگی زعفرانه یا آلده به یرس با استفاده از کیت RNeasy plant mini kit, Qiagen, Germany) بنابر دسترکار شرکت سازنده استخراج شد. برای تکثیر سه ناحیة ناپیسته از ژنم بررسی مرد جدایههیا پتییرس آلدهکنندة زعفران از جفت آغازگر عممی مربط به انتهای '3 ژنم )در برگیرندة ناحی 3'UTR بخشی از CP بخشی از ناحی استفاده شد )NIb )شکل CI جفت آغازگرهای متناظر با تکثیر HC-Pro 1 جدل 2. در همة ژنم پتییرسها اکنشها ساخت دی.ان.ا مکمل با 5 میکرلیتر آر.ان.ا کل 6/5 میکرلیتر آب دینیزة سترن )استریل 4 0/75 میلیمل dntps RT-buffer 5X میکرلیتر 0/5 میلیمل RiboLock پیکمل آغازگر معکس 20 احد 5 DTT RNase inhibitor Thermo Scientific, Lithuania) استفاده از دستگاه ترمسایکلر با Palm cycler, CG1-96, )Cobett research, Australia صرت گرفت. اکنشها در دمای 72 درجة سلسیس به مدت سه تا پنج دقیقه قرار گرفت پس از قرار دادن للهها ری یخ 100 احد آنزیم نسخة بردار معکس M-MuLV RevertAid Reverse Transcriptase, Thermo.Scientific, )Lithuania به هر یک از للهها اضافه در دمای 42 درجة سلسیس به مدت یک ساعت قرار داده شد. اکنش زنجیرهای پلیمراز در اکنشهایی با حجم نهایی 25 میکرلیتر )شامل 5 میکرلیتر دی.ان.ا مکمل ساخته )سنتزشده 14/6 میکرلیتر آب دینیزة استریل 2/5 میکرلیتر PCR-buffer 2 0/2 میلیمل dntps 3 میلیمل MgCl 2 10X پیکمل از هر آغازگر مستقیم معکس 2/5 احد آنزیم Sinaclon, SmartTaq DNA Polymerase )Iran انجام گرفت. برای مشاهدة قطعههای تکثیرشده الکترفرز در ژل آگارز 1 درصد در بافر )Borate-EDTA استفاده شد. Tris- TBE شکل 1. مقعیت آغازگرهای عممی متناظر با ژنم پتییرسها مرد استفاده برای تکثیر سه ناحیة ژنمی ناپیسته پتییرس آلدهکنندة زعفران Figure 1. Position of universal primers corresponding to the potyviruses genome used for amplification of three interrupted regions of saffron infecting Potyvirus genome جدل 2. جفت آغازگرهای عممی مرد استفاده مربط به تکثیر بخشهایی از ژنم پتییرسها Primer pair Table 2. Universal primer pairs used in this study for partial amplification of potyviruses genome Sequence 5'-3') Position on the genome Annealing temperature C) Reference PV1/SP6 GATTTAGGTGACACTATAGAATTTTTTTTTTTTTTTTVN 3'UTR, CP, NIb 58 Mackenzie et al., 1998 PV21/T7 TAATACGACTCACTATAGGGNAAYAAYAGYGGNCARCC3'UTR, CP, NIb Mackenzie et al., 1998 CIFor GGIVVIGTIGGIWSIGGIAARTCIAC CI 40 Ha et al., 2008 CIRev ACICCRTTYTCDATDATRTTIGTIGC CI Ha et al., 2008 HPFor TGYGAYAAYCARYTIGAYIIIAAYG HC-Pro 40 Ha et al., 2008 HPRev GAICCRWAIGARTCIAIIACRTG HC-Pro Ha et al., 2008 I=inosine, Y=C/T, R=G/A, W=A/T, V=A/C/G, S=C/G, D=A/G/T, N=A/T/C/G

6 دانش گیاهپزشکی ایران درة 47 شمارة 2 پاییز زمستان همسانهسازی نکلئتیدی قطعههای تکثیرشده پس از الکترفرز افقی محصل قطعههای الحاق به حامل ژن مقامت به درن یاختهه یا تکثیرشده از ژل آگارز تعیین اکنشهیا استخراج تالی PCR ptg19-t PCR cloning vector آنتیبیتیک صرت گرفت. همسانهه یا پس از )دارای آمپیسیلین تراریزش به مستعد Escherichia coli سیة DH5α Luria-Bertani medium) نترکیب در محیط کشت LB حای آنتیبیتیک آمپیسیلین کشتشده درنهایت پالسمیدهای نترکیب به رش لیز قلیایی )Sambrook & Russel, 2001 استخراج برای تعیین تالی د طرفه به شرکت ماکرژن کرة جنبی فرستاده شدند. تحلیل تالی نکلئتیدی قطعههای افزایششده تالی نکلئتیدی آلدهکنندة زعفران کدکنندة متناظر با تالیه یا مجد در بانک ژن قطعههای تکثیرشده ترجمة NCBI یرس ژنم اسیدآمینهای ناحی نکلئتیدی اسیدآمینهای با استفاده از نرمافزار Blastn پایة شد. بر نتایج این مقایسه یرسهیا مقایسه مشابه انتخاب هم ردیفسازی چندگانة تالی نکلئتیدی قطعههای تکثیرشدة ژنم یرس آلدهکنندة زعفران ترجمة اسیدآمینهای ناحی کدکنندة استفاده از نرمافزار متناظر با Tamura et al., 2013) MEGA6 انجام گرفت. بهترین مدل جانشینی نکلئتیدی اسیدآمینهای در MEGA6 همترازها با استفاده از نرمافزار تعیین درخت تبارزایی )فیلژنی بر پایة تالی نکلئتیدی ناحیة ژنمی کدکنندة ترجمة CP اسیدآمینهای متناظر با رش maximum likelihood تکرار رسم شد. یرس مزاییک گندم TrMV) نیز بهعنان برن گره استفاده شد. نتایج بحث آزمن های سرلژیکی نمنههای زعفران در بازدیدهای مکرر از کشتزارهای زعفران استانه یا تهران اصفهان فارس آذربایجان شرقی خراسان جنبی رضی عالیم شبهیرسی در بتهها مشاهده نشد. پس از نمنهبرداری تصادفی از برگها بنهه یا گیاهان زعفران بررسی بررسی 890 درمجمع سرمشناختی )سرلژیکی آلدگی نمنة نمنهها به یرسه یا برگی قرار گرفتند. مختلف مرد در با آزمن االیزا هیچ اکنش مثبتی دال بر آلدگی 2 نمنهها به یرس مزای کی خیار یرس مزای کی 3 یرس پژمردگی ینجه لکهای 4 گجهفرنگی به دست نیامد درحالیکه 641 نمنة جمعآریشده از استانهای مختلف با آنتیسرم جنس پتییرس اکنش مثبت نشان دادند. در نتایج آزمن االیزای این شمار با نمنه )641 عدد با استفاده از آنتیسرم اختصاصی یازده گنة پتییرس همة نمنهها فقط آنتیسرم دادند )جدل 3. اختصاصی اکنش مثبت نشان بررسی دامنة میزبانی آزمایشگاهی عالیم ناشی از مایهز ین ری گیاهان محک گیاهان محک مایهز ین زعفران یرس به نتایج بهطر تاکنن آنها مرتب با انتقال شده با هشت جدایة پتییرس ازنظر برز عالئم بازدید انتقال آزمن االیزا بررسی این مکانیکی اساس بر شد. یرس به گیاهان محک نامفق بده است البته آزمایشهای بیشتری در این خصص در حال انجام میباشد. تعیین زن ملکلی پرتئین پششی یرس پس از الکترفرز آمدههای پرتئین کل نیمه خالص یرس از بافت برگ گیاهان آلده به آلده غیر پتییرس در ژل پلیاکریلآمید تفات عمدهای بین آمدهها مشاهده نشد که این امر نشان داد رش خالصسازی نسبی باعث حذف چشمگیری از پرتئینهای گیاهی نشده بد. پس از انتقال پرتئینها به غشای سللزی باند رنگآمیزی ژل اکریلآمید پ یل پرتئینی در ژل گیای انتقال کامل نبد همة 2. Cucumber mosaic virus 3. Alfalfa mosaic virus 4. Tomato spotted wilt virus 1. Triticum mosaic virus

7 269 پریزاد همکاران: شناسایی بررسی برخی از یژگیهای یرس... از باند ظاهرشده در آمدة پرتئین کل گیاه آلده بد. این نتیجه گیای تغلیظ پیکرههای یرسی در فرآیند خالصسازی نسبی بهرغم کم بدن حجم بافت گیاهی بد )شکل 2. بر پایة خط رگرسین بین حرکت نسبی لگاریتم زن ملکلی پرتئینهای نشانگر زن ملکلی پرتئین پششی پتییرس زعفران حدد 35 کیلدالتن برآرد شد. پرتئینها به غشا بد. در آزمن سترن بالت یک باند پرتئینی در آمدة پرتئین کل نیمهخالص گیاهان آلده به جدایههای Ir-T2 Ir-T1 Ir-Kh2 Ir-Kh1 Ir-I2 Ir-F2 با آنتیسرم اختصاصی اکنش نشان داد درحالیکه هیچ اکنش مثبتی در آمدههای گیاهان سالم مشاهده نشد. باند مربط به پرتئین پششی یرس در آمدة نیمهخالص بهمراتب قیتر جدل 3. درصد آلدگی نمنههای زعفران مناطق مختلف ایران به پتییرس زعفران Table 3. Infection rate of saffron samples originated from different locations of Iran with detected virus Sampling region Number of samples Number of infected samples Infection rate %) Isfahan East Azarbayjan Alborz Razavi & South Khorasan Fars شکل 2. آزمن به جدایههای SDS-PAGE b) a) )الف سترن بالت )ب آمدة نیمه خالص یرس P) آمدههای پرتئین کل برگ زعفران آلده Ir-I2, Ir-Kh1, Ir-Kh2, Ir-T1, Ir-T2, Ir-F2 یرس گیاهان زعفران سالم )H1 M H2. نشانگر پرتیئنی.Pierce Unstained Protein MW Marker, Thermo Fisher Scientific, USA) Figure 2. SDS PAGE A) and western blot B) of partial purified virus P) and extracted total protein from virus infected saffron plants Ir-I2, Ir-Kh1, Ir-Kh2, Ir-T1, Ir-T2, Ir-F2) and healthy saffron plants H1, H2). M: Pierce Unstained Protein MW Marker, Thermo Fisher Scientific, USA) جفتبازی مربط به 3'UTR )227 نکلئتید پرتئین پششی )822 نکلئتید بخشی از NIb )588 نکلئتید د قطعة دیگر به طل 700 اکنش زنجیرهای پلیمراز معکس )RT-PCR بهمنظر آلدهکنندة تعیین یژگیهای زعفران سه قطعه ملکلی پتییرس ناپیسته از پنج ژنم جدایة پتییرس زعفران با استفاده از آمدة آر.ان.ا کل استخراجشده از گیاهان آلده با اندازة قطعهها تکثیر مرد انتظار شامل قطعهای شد. این جفتباز متناظر با بخشی از ناحی بد HC-Pro CI درحالیکه در آمدة آر.ان.ا کل استخراجشده از گیاه 1637 سالم هیچ قطعهای تکثیر نشد )شکل 3.

8 دانش گیاهپزشکی ایران درة 47 شمارة 2 پاییز زمستان b) a) شکل 3. محصل اکنش زنجیرهای پلیمراز معکس )RT-PCR آغازگر اختصاصی جنس پتییرس )الف جفت آغازگر مربط به بخشی از ناحیة CI آمدة آر.ان.ا کل زعفران آلده به یرس با استفاده از جفت HC-Pro )ب. H1: گیاه سالم M: نشانگر دی.ان.ا 1 کیل بازی Germany) Gene Ruler TM, SM0313, 1Kb DNA Ladder, MBI Fermentas, Figure 3. RT-PCR product of virus infected saffron total RNA using Potyvirus specific primer pair A) and primer pairs corresponding to the partial CI and HC-Pro regions. M: 1Kb DNA Ladder Gene Ruler TM, SM0313, 1Kb DNA Ladder, MBI Fermentas, Germany). VSLQ/S تحلیل تالی نکلئتیدی نتایج بهدستآمده از مقایسة تالی نکلئتیدی ناحی تکثیرشده تالیه یا ژنم از نکلئتیدی یرس جداشده مربط به دیگر مجد در بانک ژن با استفاده از نرمافزار از زعفران یرسه یا Blastn با نشان داد که این یرس با پتییرسها بیشترین شباهت را دارد. نتیجة نکلئتیدی آلدهکنندة قطعههای زعفران همردیفسازی ترجمة تکثیرشده چندگانة ژنم تالی یرس اسیدآمینهای ناحی کدکنندة متناظر پتییرسها در جدلهای 4 5 نشان دادهشده است. محل برش زعفران تالی اسیدآمینهای NIb/CP VLLQ/S LQ/S پتییرس دارد پتییرس که تالی همسان با تالی متناظر در اغلب اعضای جنس این تالی پنج است 2005b).Adams et al., مقایسة اسیدآمینهای با چهار یرس مرتبط نشان داد که تفات در اسیدآمینة دم جد دارد به این حالت که برخالف پتییرس زعفران این تالی در Ceratobium mosaic virus CerMV) BCMNV Telosma mosaic virus TelMV) بهصرت بده درحالیکه تالی VHLQ/S در این ناحیه دارد. بر پایة نتایج هم ردیفسازی چندگانة ناحیة کدکنندة پرتئین پششی پتییرس زعفران با تالی مشابهترین پتییرسها با استفاده از نرمافزار Huang & Miller, 1991) LALIGN بیشترین یکسانی تالی نکلئتیدی یرس زعفران با TelMV CerMV BCMNV با مربط به ) 74 درصد ترجمة اسیدآمینهای )78/8 درصد تعیین شد که تالی ژنی CerMV در بانک ژن بهصرت تالی غیر کامل )جزئی است هیچ تالی کاملی از آن در دسترس نیست. با تجه به معیارهای ملکلی تعیین حدد گسترة گنه در تیرة پتییریده Adams et )al., 2005a یکسانی کمتر از درصدی تالی نکلئتیدی اسیدآمینهای ناحیة پرتئین پششی نشاندهندة ماهیت آنها بهعنان گنة جداگانه است. نتایج بهدستآمده از این تحقیق نشان داد که بیشترین یکسانی نکلئتیدی اسیدآمینهای ناحیة CP پتییرس آلدهکنندة زعفران کمتر از آستانة تعیینشده برای جدایههای مربط به یکگنه است.

9 271 پریزاد همکاران: شناسایی بررسی برخی از یژگیهای یرس... همچنین بهمنظر تعیین رابط تبارزایی این یرس با دیگر گنهه یا جنس پتییرس مدل general )Tavaré, 1986 GTR+G+I) time-reversible در همترازهای نکلئتیدی Jones-taylor-Thornton Jones et al., 1992) JTT+G) در همترازهای اسیدآمینهای بهعنان بهترین مدل جانشینی تعیین درخت تبارزایی بر پایة تالی ناحیة کدکنندة پرتئین پششی پتییرس زعفران تالی متناظر در دیگر پتییرسه یا مرتبط با این یرس با استفاده از نرمافزار MEGA6 رسم شد )شکلهیا 4 5. در درخت تبارزایی نکلئتیدی رسم شده پتییرس آلدهکنندة زعفران در خشة زیرگره از جنس پتییرس در کنار East Asian passiflora virus EAPV) TelMV در درخت تبارزایی اسیدآمینهای در خشة زیرگره همراه با BCMNV پتییرس باالیی با سرمشناختی با بسیار قرار گرفت. بر پایة نتایج این تحقیق آلدهکنندة زعفران رابطة سرمشناختی خبی نشان دارد آنتیسرم پرتئین پششی نیز در زیرگره بهطریکه اختصاصی در اینگنه آزمنه یا اکنش میدهد همچنین بر پایة تالی قرار میگیرد لی میزان یکسانی تالی این ناحیه کمتر از آستانة تعی نی شده برای جدایههای مربط به یکگنه از جنس پتییرس است. لذا بر پایة این نتایج احتمال زیاد میرد پتییرس آلدهکنندة زعفران گنة جدیدی از جنس پتییرس باشد. لیکن تعیین جایگاه آرایهبندی دقیق این پتییرس مستلزم بررسیهای بیشتر بهیژه تعیین تالی کل ژنم آن است. جدل 4. مقایسة تالی نکلئتیدی ترجمة اسیدآمینهای بخشهایی از ژنم پتییرس آلدهکنندة زعفران با پتییرسهای مرتبط Table 4. Comparison of nucleotide and deduced amino acid sequences of saffron infecting Potyvirus partial genome with closely related potyviruses Region of Potyvirus infecting Nucleotide identity Amino acid identity saffron genome Virus Percentage Virus Percentage 3' UTR, CP, NIb SMV CP CerMV/EAPV 74.8 BCMNV 78.8 Partial NIb TelMV 73.8 TelMV 78.6 CI 77.4 SMV 86.6 HC-Pro SMV 76.9 WMV 87.8 جدل 5. مقایسة تالی نکلئتیدی ترجمة اسیدآمینهای ناحیة پرتئین پششی پتییرس آلدهکنندة زعفران بر پایة هم ردیفسازی دگانه با تالی متناظر پتییرسهای مشابه با استفاده از نرمافزار LALIGN Table 5. Comparison between the nucleotide and deduced amino acid sequences saffron infecting Potyvirus coat protein region with related potyviruses based on two alignment using LALIGN program Virus Nucleotide identity %) Deduced amino acid identity %) BCMNV CerMV CLLV EAPV FVY PasVY SMV TelMV Uganadan passiflora virus WMV WVMV YMV

10 دانش گیاهپزشکی ایران درة 47 شمارة 2 پاییز زمستان شکل 4. درخت تبارزایی بر پایة تالی نکلئتیدی ناحیة کدکنندة پرتئین پششی یرس آلدهکننده زعفران تالی متناظر maximum likelihood GTR+G+I دیگر پتییرسهای نزدیک به این یرس با استفاده از نرمافزار MEGA6 مدل به رش هزار تکرار. یرس مزاییک گندم بهعنان برن گره در نظر گرفته شده است. Figure 4. Phylogenetic tree of saffron infecting Potyvirus genome and other closely related potyviruses based on CP nucleotide sequence reconstructed using MEGA6 and GTR+G+I model based on analysis with 1000 bootstrap replications.triticum mosaic virus was considered as outgroup. BCMNV: Bean common mosaic necrosis virus AB ); : Bean common mosaic virus KC ); BYMV: Bean yellow mosaic virus JX ); CLLV: Calla lily latent virus EF ); CABMV: Cowpea aphid-borne mosaic virus KM ); CerMV: Ceratobium mosaic virus AF ); CSV: Cocksfoot streak virus EU ); DsMV: Dasheen mosaic virus KJ ); EAPV: East Asian passiflora virus KP ); FVY: Fritillary virus Y AM ); ISMV: Iris sever mosaic virus NC ); MDMV: Maize dwarf mosaic virus JQ ); PRSV: Papaya ringspot virus AY ); Passiflora virus Y PasVY) JF ); PPV: Plum pox virus KC ); PSbMV: Pea seed-borne mosaic virus AJ ); PTV: Peru tomato mosaic virus NC ); PepMoV: Pepper mottle virus EU ); PVY: Potato virus Y KF ); SMV: Soybean mosaic virus LC ); SCMV: Sugarcane mosaic virus JX ); SPFMV: Sweet potato feathery mottle virus KP ); SrMV: Surghum mosaic virus KM ); TeMV: Telosma mosaic virus DQ ); ToNStV: Tomato necrotic stunt virus JQ ); TrMV: Triticum mosaic virus NC ); TuMV: Turnip mosaic virus AY ); Ugandan Passiflora virus FJ ); WMV: Watermelon mosaic virus KP ); WVMV: Wisteria vein mosaic virus AY ); YMV: Yam mosaic virus NC ); YBMV: Yam bean mosaic virus, JN ); ZYMV: Zucchini yellow mosaic virus KF )

11 273 پریزاد همکاران: شناسایی بررسی برخی از یژگیهای یرس... شکل 5. درخت تبارزایی بر پایة تالی ترجمة اسیدآمینهای پرتئین پششی یرس آلدهکنندة زعفران تالی متناظر دیگر maximum likelihood پتییرسهای نزدیک به این یرس با استفاده از نرمافزار MEGA6 مدل JTT+G به رش تکرار. یرس مزاییک گندم بهعنان برن گره در نظر گرفته شده است. هزار Figure 5. Phylogenetic tree of saffron infecting Potyvirus genome and other closely related potyviruses based on CP amino acid sequence reconstructed using MEGA6 and GTR+G+I model based on analysis with 1000 bootstrap replications. Triticum mosaic virus was considered as outgroup. BCMNV: Bean common mosaic necrosis virus BAM ); : Bean common mosaic virus CAA ); BYMV: Bean yellow mosaic virus JX ); CLLV: Calla lily latent virus EF ); CABMV: Cowpea aphid-borne mosaic virus KM ); CerMV: Ceratobium mosaic virus AAC ); CSV: Cocksfoot streak virus EU ); DsMV: Dasheen mosaic virus KJ ); EAPV: East Asian passiflora virus BAD ); FVY: Fritillary virus Y YP ); ISMV: Iris sever mosaic virus NC ); MDMV: Maize dwarf mosaic virus JQ ); PRSV: Papaya ringspot virus AY ); Passiflora virus Y PasVY) ADZ ); PPV: Plum pox virus KC ); PSbMV: Pea seed-borne mosaic virus AJ ); PTV: Peru tomato mosaic virus NC ); PepMoV: Pepper mottle virus EU ); PVY: Potato virus Y KF ); SMV: Soybean mosaic virus LC ); SCMV: Sugarcane mosaic virus JX ); SPFMV: Sweet potato feathery mottle virus KP ); SrMV: Surghum mosaic virus KM ); TeMV: Telosma mosaic virus YP ); ToNStV: Tomato necrotic stunt virus JQ ); TrMV: Triticum mosaic virus YP ); TuMV: Turnip mosaic virus AY ); Ugandan Passiflora virus ACZ ); WMV: Watermelon mosaic virus KP ); WVMV: Wisteria vein mosaic virus AY ); YMV: Yam mosaic virus NC ); YBMV: Yam bean mosaic virus JN ); ZYMV: Zucchini yellow mosaic virus KF ).

12 دانش گیاهپزشکی ایران درة 47 شمارة 2 پاییز زمستان نتیجهگیری کلی درمجمع نتایج این تحقیق نشان میدهد که پتییرس ردیا یب شده از زعفران با درصد باالی آلدگی یرس غالب در مناطق عمدة زعفرانکاری است. در بررسیهای سرمشناختی انجامشده در آزمن االیزا این یرس تنها با آنتیسرم اختصاصی یرس مزاییک معملی لبیا ) اکنش مثبت نشان داد زن ملکلی پرتئین پششی این یرس در ژل پلی اکریل آمید آزمن سترن بالت 35 کیلدالتن برآرد شد که در دامنة زن ملکلی اعضای جنس پتییرس )30 تا 47 کیلدالتن 2011 al., )King et قرار میگیرد. انتقال مکانیکی یرس ری چندین گنة گیاه محک تاکنن مفق نبده است. درنهایت با تجه به تحلیلهای ملکلی تبارزایی بر پایة تالی نکلئتیدی ناحیة کدکنندة پرتئین پششی این یرس در زیرگره از جنس پتییرس قرار گرفت لی میزان یکسانی تالی نکلئتیدی ترجمة اسیدآمینهای متناظر این ناحیه کمتر از آستانة تعی نی شده برای جدایههای مربط به یکگنه از جنس پتییرس است. بر پایة این نتایج پتییرس آلدهکنندة زعفران بهاحتمالزیاد گنة جدیدی از جنس پتییرس است لیکن تعیین جایگاه آرایهبندی دقیق این پتییرس مستلزم بررسیهای بیشتری در زمینة یژگیهای زیستی انتقالپذیری با شتهها بهیژه تعیین تالی نکلئتیدی کل ژنم آن است. با تجه به درصد باالی آلدگی در کشتزارهای زعفران استانه یا مرد بازدید این یرس میتاند بهعنان یک هشدار جدی برای این محصل ارزشمند کشر باشد. اگرچه تاکنن تأثیر آلدگی زعفران به این یرس ری محصل زعفران بررسی نشده لیکن انجام آن بسیار ضرری است. ممکن است با فراهم شدن شرایط بهتر بهیژه ازنظر فعالیت شتهه یا ناقل یا ظهر سیهه یا مهاجمتر یرس )در اثر قع تغییر ژنتیکی ژنم یرس آلدگی زعفران به این یرس به آستانة خطر رسیده منجر به آسیبه یا غیرقابل پیشبینی شد. همچنین بررسی دامنة میزبانی طبیعی این یرس ضرری است. سپاسگزاری این تحقیق با حمایت مالی صندق حمایت از پژهشگران فناران کشر ) طرح تحقیقاتی مصب انجام شده است. REFERENCES 1. Adams, M. J., Antoniw J. F. & Fauquet C. M. 2005a). Molecular criteria for genus and species discrimination within the family Potyviridae. Archives of Virology, 150 3), Adams, M. J., Antoniw, J. F. & Beaudoin, F. 2005b). Overview and analysis of the polyprotein cleavage sites in the family Potyviridae. Molecular Plant Pathology, 6, Brunt, A. A. & Phillips, S. 1979). Viruses of bulb crops. Crocus tomasinianus and Narcissus spp. Annual Report of the Glasshouse Crops Horticultural Research Institute, Chen, C. C., Chang, C. A., Tsai, H. T. & Hsu, H. T. 2004). Identification of a Potyvirus causing latent infection in calla lilies. Plant Disease, 88, Chen, J. & Chen, J. S. 2000). Occurrence and control of mosaic disease Turnip mosaic virus) in saffron Crocus sativus). Zhejiang Nongye Kexue, 3, Clark, M. F. & Adams, A. N. 1977). Characteristics of microplate method of enzyme linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Journal of General Virology, 34, Fried, M. & Crothers, D.M. 1981). Equilibria and kinetics of lac repressor operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research, 9, Grilli Caiola, M. & Faoro, F. 2011). Latent virus infections in Crocus sativus and Crocus cartwrightianus. Phytopathologia Mediterranea, 50, Grilli Caiola, M. 1982). Virus-like particles in cells of saffron flowers. Phytopathology Zeitschrift, 105, Ha, C., Coombs, S., Revill, P. A., Harding, R. M., Vu, M. & Dale, J. L. 2008). Design and application of two novel degenerate primer pairs for the detection and complete genomic characterization of potyviruses. Archives of Virology, 15, Huang, X. & Miller W. 1991). A time-efficient linear-space local similarity algorithm. Advances in Applied Mathematics, 12, Hull, R. 2002). Matthews' Plant Virology 4th ed.), New York, USA. Academic Press pp.

13 275 پریزاد همکاران: شناسایی بررسی برخی از یژگیهای یرس Jensen, S. G., Long-Davidson, B. & Seip, L. 1986). Size variation among proteins induced by sugarcane mosaic viruses in plant tissue. Phytopathology, 76, JiShuang, C. 2000). Occurrence and control of mosaic disease Turnip mosaic virus) in saffron Crocus sativus). Journal Zhejiang Nongye Kexue, 3, Joisson, C., Dubs, M. C., Briand, J. P., Van Regenmortel, M., H. 1992). Detection of potyviruses with antisera to synthetic peptides. Research in Virology, 143 3), Jones, D. T., Taylor, W. R., Thornton, J. M. 1992). The rapid generation of mutation data matrices from protein sequences. Computer Applications in the Biosciences, 8, King, A. M. Q., Adams, M. J., Carstens, E. B. and Lefkowitz, E. J. 2011). Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses: Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. San Diego. Elsevier, 1327 pp. 18. Lapierre, H. & Singnoret, P. A. 2004). Viruses and virus disease of Poaceae Gramineae). USA. Science publishers. 19. Leammli, U.K. 1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Journal of Nature, 277, Mackenzie, A. M., Nolan, M., Wei, K. J., Clements, M. A., Gowanlock, D., Wallace, B. J. & Gibbs, A. J. 1998). Ceratobium mosaic potyvirus: another virus from orchids. Archives of Virology, 143, Miglino, R., Jodlowska, A. & van Schadewijk, A. R. 2005). First report of Narcissus mosaic virus Infecting Crocus spp. cultivars in the Netherlands. Plant Disease. 89 3), Ochwo-Ssemakula, M., Sengooba, T., Hakiza, J. J., Adipala, E., Edema, R., Redinbaugh, M. G., Aritua, V. & Winter. S. 2012). Characterization and distribution of a potyvirus associated with passion fruit woodiness disease in Uganda. Plant Disease, 96, Pisi, A. & Bellardi, G. 1990). Ultrastructural study of cytoplasmic inclusions in plants infected with Potyviruses. Journal of Phytopathology, 130, Russo, M., Martelli, G. P., Cresti, M. & Ciampolini, F. 1979). Bean yellow mosaic virus in saffron. Phytopathologia Mediterranea, 18, Sambrook, J. & Russell, D. 2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed.). New York, USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press pp. 26. Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. 1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed.). New York, USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press pp. 27. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A. & Kumar, S. 2013). MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution, 30, Tavaré, S. 1986). Some Probabilistic and Statistical Problems in the Analysis of DNA Sequences PDF). Lectures on Mathematics in the Life Sciences. American Mathematical Society, 17: Towbin, H., Staehelin, T. & Gordon, J. 1997). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Academic Science USA, 76, Urcuqui-Inchima, S., Haenni, A. L. & Bernardi, F. 2001). Potyvirus proteins: a wealth of functions. Virus Research, 74, Van Slogtern, D. H. M. 1958). Rattle virus as a cause of diseases in flower bulbs, and the possibility of controlling infection by soil disinfectants. Tijdschr PlZiekt, 64, 5-6.