Celične strukture. mikroskopija. površina celic. celična stena. citoplazemska membrana. citoplazma. spore in sporulacija

Transcript

1 Celične strukture mikroskopija površina celic celična stena citoplazemska membrana citoplazma spore in sporulacija

2 Mikroskopija mikrobiologija v svetlem polju mikroskopija v temnem polju stereomikroskopija fazno kontrastna mikroskopija Nomarski mikroskopija polarizacijska mikroskopija mikroskopija v bližnjem polju mikroskopija na atomsko silo fluorescenčna mikroskopija konfokalna fluorescenčna mikroskopija elektronska transmisijaksa mikroskopija vrstična elektronska mikroskopija

3 Mikroskopija v svetlem polju Za kvaliteto mikroskopa je najpomembnejša ločljivost, sposobnost ločevanja dveh točk. S povečevanjem objekta ne dosežemo veliko, če je ločljivost slaba. Ločljivost, D, je odvisna od: -aperture objektiva, α - lomnega količnika, n - valovne dolžine svetlobe, λ D = 0.61λ / (n x sin α) Zaradi tehničnih omejitev glede α, λ in n je meja ločljivosti pri svetlobni mikroskopiji okoli 0.2 µm.

4 Video svetlobna mikroskopija

5 Merjenje dimenzij s svetlobnim mikroskopom

6 Štetje mikroorganizmov s svetlobnim mikroskopom Število dobimo tako, da: preštejemo število celic upoštevamo redčitev vzorca upoštevamo volumen števne komore

7 Kontrastiranje

8 Barvanje po Gramu

9 Barvanje po Gramu G+ temno vijolično G- rožnato Barvo vedno primerjamo z ustrezno kontrolo (poznana G+ in G- bakterija, ki je bila enako pripravljena kot neznani vzorec.

10 Druga barvanja negativno barvanje (nigrozin, indijsko črno, kristal vijolično, metilensko modro) acidorezistentno barvanje (za barvanje mikobakterij) barvanje endospor barvanje cist (npr. ciste pri Azotobacter sp.) barvanje kapsule barvanje flagel barvanje citoplazmatskih vključkov (polifosfat, poli-β-hidroksibutirat, glikogen, kisli polisaharidi) barvanje nukleoida barvanje spirohet,rikecij, legionel, mikoplazm

11 Običajne oblike mikrobnih celic

12 Oblike mikrobnih celic

13 Oblike kokov diplokoki streptokoki stafilokoki tetrade sarcine

14 Stereo mikroskopija Guignardia bidwellii, črna grozna gniloba

15 Mikroskopija v temnem polju Arachnoidiscus ehrenbergi, diatomeja

16 DIC (differential interference contrast) ali Nomarski mikroskopija Sordaria fimicola, plodno telesce z askusi

17 Fazno kontrastna mikroskopija

18 Polarizacijska mikroskopija a sferulit b polikarbonat c DNA

19 Epi-fluorescenčni mikroskop Olympus BX51

20 LSCM - laserska vrstična konfokalna mikroskopija

21 Dekonvolucijska mikroskopija

22 Fluorofori za G+ in G- bakterije Pseudomonas aeruginosa zeleno Bacillus cereus rumeno Pseudomonas aeruginosa zeleno Bacilus cereus oranžno

23 Fluorofori za ločevanje živih in mrtvih celic Micrococcus luteus žive celice zelene mrtve celice modre Micrococcus luteus in Bacilus cereus žive celice zelene mrtve celice rdeče

24 Fluorofori za določanje spor membrane rdeče DNA modro zeleno fuzijski zeleni protein

25 Fluorofori za določanje virusov Večje rumene pike celice, manjše zelene pike virusi (Syber Green-1)

26 Fluorofori na osnovi 16S rrna 16S rrna specifična barvila za dve vrsti bakterij na globokomorskem črvu

27 Fluorofori za določanje celičnih struktur aktin rdeče membrane zeleno jedro modro tubulin kromosomi

28 Konjugacija ciliate Spolna delitev ciliate Tetrahymena thermophila tubulin rdeče makro in mikrojedra zeleno

29 Fluorofori za vakuole in celične stene Sacharomyces cerevisae vakuola rdeča celična stena modra Sacharomyces cerevisae lumen vakuole moder

30 Fluorofori za ER in Golgijev aparat Endoplazmatski retikulum rdeč vakuole zelene Golgijev aparat rumen jedro zeleno tubulin rdeč

31 Fluorofori za mitohondrije mitohondriji rdeče aktin zeleno jedro modro lizosomi modro mitohondriji rdeče

32 Aktivnost alkalne fosfataze v celici aktivna mesta v celici, kjer deluje alkalna fosfataza so zelena jedro so modro obarvana

33 Fluorescenčna vizualizacija lipidnih domen Domenska struktura velikih lipidnih veziklov izgrajenih iz DPPC/DLPC mešanice.

34 TEM - transmisijska elektronska mikroskopija Osnovni principi so enaki kot pri svetlobni mikroskopiji. Namesto svetlobe uporabljamo snop elektronov in elektromagnetne leče. Zaradi absrpcije elektronov v zraku je potrebno delati v vakumu. Vir elektronov je vroča katoda z napetostjo kv, ki pospeši elektrone proti anodi. Elektrone detektiramo na fluorescenčnem zaslonu. ločljivost je ~ 0.1 nm potrebna posebna priprava vzorca

35 Priprava vzorca za TEM Ultramikroroton: vzorec fiksiramo v glutaraldehidu ali ozmijevem tetroksidu, ga posušimo v etanolu ali acetonu in ga nato damo v tekočo plastiko, ki jo s toploto polimeriziramo. Polimerizirano plastiko in vzorec razrežemo na ultratanke rezine ~ 0.1 µm, ki jih naložimo na mikroskopirne mrežice. Freze-fracture: vzorce hitro zamrznemo v tekočem dušiku in jih nato z ostrim nožem lomimo. Odlomljene dele naparimo s težkimi kovinami.

36 SEM - vrstična elektronska mikroskopija omogoča opazovanje površine vzorca vzorec je potrebno predhodno obdelati s težkimi kovinami (npr. platino), z elektroni vrstično preizkujemo vzorec in detektiramo sekundarne elektrone, z obdelavo podatkov lahko dobimo navidezno 3D sliko.

37 SEM slike

38 NSOM (Near Field Scanning Optical Microscopy)

39 AFM - mikroskopija na atomsko silo AFM bacteriorodopsina iz Holobacterium salinarium

40 Velikost mikrobnih celic

41 Zakaj so prokariontske celice manjše od evkariontskih? Z zmanjšanjem celice se povečuje razmerje med volumnom in površino. To pomeni, da imajo manjše celice večjo relativno površino. Npr.pri krogli je razmerje med površino S = 4πr 2 in volumnom V = 4/3πr 3 : pri r = 1 je S/V = 3 pri r = 2 je S/V = 1.5 pri r = 5 je S/V = 0.6 pri r = 10 je S/V = 0.3

42 Strukture, ki jih najdemo na površini bički fimbriji fibrile pili invazosomi kodri S-plast kapsule

43 Flagele - bički peritrihne flagele polarne flagele lopotrihne flagele lopotrihne flagele Flagela je izgrajena iz proteina flagelina, ki tvori dolgo votlo cev.

44 Struktura bakterijskega bička

45 Delovanje kemotaktičnega motorja CheR CH 3 CheW CheA P CheY P CH3 CheB P CheY CheY P CheZ

46 Taksa - gibanje bakterij v gradientu Poznamo več vrst takse: -kemotaksa -aerotaksa -magnetotaksa - fototaksa - ozmotaksa

47 Fimbriji strukturno podobni flagelam, vendar niso pomembne za gibanje so manjši (0.5 do 10 µm) tanjši in številčnejši od flagel izgrajeni iz fimbrilinov in pilinov, ki tvorijo vijačnico pomagajo pri adsorpciji bakterij na površino (adhezini) pomembni pri patogenezi in nastanku biofilmov

48 Fibrile krajše (do 0.5 µm), tanše in številčnejše od fimbrijev izgrajene iz večjih proteinov pomembne pri adsorpciji

49 Pili daljši in debelejši od fimbrij običajno jih je le nekaj (1 do 10) na celico specifični receptorji za viruse pomembni pri konjugaciji pomembni pri adheziji na površino

50 Curli - kodri zavite kodrasne strukture na površii celic sestavljene iz polisaharidov in proteinov najdemo samo pri E.coli in Salmonelli omogočajo vezavo na epitelijske celice gostitelja ali pa na fibronektin in plazminogen

51 Ivazosomi površinske proteinske strukture pri Salmonelli typhimurium podobni so čepkom, 3x debelejše od flagel in 10x krajše od flagel do 100 na celico po internalizaciji bakterije v celice gostitelja se struktura invazosoma razgradi

52 S-plast S-plast najdemo na površini nekaterih bakterijskih in arhejskih celic in ima heksagonalno ali tetragonalno simetrijo. S-plast je sestavljena iz ene vrste proteinov oziroma glikoproteinov in se samo-sestavi. Z ostalo celico je povezana preko nekovalentnih vezi. Integriteta S-plasti je vezana na prisotnost divalentnih kationov.

53 Kapsula Veliko mikroorganizmov na svojo površini izloča sluzast material, predvsem polisaharide in proteine. Kapsula ni trdno vezana na površino celice. Kapsula ima več funkcij: vezava na površino vezava na gostitelja zaloga za vodo in hranila zaščita pred infekcijo tvori matrkis pri nastanku biofilma močno antigena, pomembna pri virulenci

54 Centrifugiranje Diferencialno centrifugiranje: Centrifugiramo pri različnih pospeških oziroma različno dolgo npr. 10 min pri 5000 x g sedimentiramo intaktne celice 20 min prii x g fragmenti stene in večji membranski fragmenti 60 min pri x g sedimentiramo membranske vezikle in ribosome Ravnotežno gradientno centrifugiranje: Strukture s podobno velikostjo vendar različno gostoto lahko ločimo v saharoznem gradientu (lažje strukture) ali CsCl gradientu (težje strukture). v= d 2 (p p = 18η p l)g d je premer delca, p p je gostota delca, p l je gostota tekočine, g je zemeljski pospešek, η je viskoznost tekočine

55 Frakcioniranje celičnih komponent Mehansko razbijanje celic: francoska preša (1000 atm) ultrasonikacija zamrzovanje in odtajanje mikrovalovna pečica Kemijska liza celic: detergenti ozmotska liza segrevanje alkalna liza

56 Celična stena bakterij

57 Osnovna sladkorja peptidoglikana N-acetilglukozamin N-acetil muramična kislina

58 Osnovna enota peptidoglikana N-acetilglukozamin N-acetilmuramična kislina

59 Povezava glikanskih verig pri G+ in G- bakterijah M-G-M-G-M-G-M-G G- M-G-M-G-M-G-M-G G+ L-Ala L-Ala D-Glu D-Glu DAP D-Ala D-Ala DAP D-Glu D-Ala [Gly] 5 L-Lys D-Ala [Gly] 5 D-Ala L-Lys D-Glu D-Ala [Gly] 5 M-G-M-G-M-G-M-G M-G-M-G-M-G-M-G

60 Razlike med peptidoglikani preko 100 kemijsko različnih peptidoglikanov G- bakterije imajo DAP (diaminopimelično kislino), G+ bakterije imajo namesto DAP običajno lizin. različne povezave med tetrapeptidi različna sestava tetrapeptidov (npr. glicin, treonin, serin in aspartat). V celični steni ne najdemo razvejanih aminokislin, aromatskih aminokislin, žveplo vsebujočih aminokislin, histidina, arginina in prolina.

61 Sinteza peptidoglikana Dva temeljna problema: kako pridejo sestavni deli v periplazmo kako poteka sinteza peptidoglikana v periplazmi brez ATP Sinteza peptidoglikana poteka v več stopnjah: - sinteza pentapeptida in derivatizacija UDP sladkorjev - prenos pentapeptida in derivatiziranih sladkorjev preko membrane z lipidnim prenašalcem baktoprenolom - polimerizacija osnovne enote peptidoglikana v periplazmi - transpeptidacija

62 Nastanek in derivatizacija UDP sladkorjev fruktoza-6-p glukozamin-6-p N-acetilglukozamin-6-P N- acetilglukozamin-1-p UDP-N-acetilglukozamin UDP-Nacetilglukozamin-3-enolpiruvileter UDP-N-acetilmuramična kislina UDP-muramil-pentapeptid Nastanek UDP-muramil pentapeptida in UDP-N-acilgkukozamina je vezana na citoplazmo.

63 Prenos UDP-sladkorjev preko membrane citoplazma UDP-M citoplazmatska membrana C 55 -P periplazma UMP UDP-G M - PP - C 55 C 55 -PP - M -G -M -G -M -G C 55 - PP - M - G G -M -PP -C 55 UDP

64 Rast peptidoglikana Komponente celične stene so dodajajo v obstoječo celično steno v katero zareže avtolizin zareže, kar omogoča dodajanje nove osnovne enote peptidoglikana. Zaradi tega na mestu brazgotina dodajanja nastane brazgotina. V kolikor avtolizin zareže, nov celični material pa ni dodan, lahko pride do avtolize.

65 Transpeptidacija - rast peptidoglikana Reakcijo katalizirata karboksipeptidaza in transpeptidaza, ki sta pomembni tarči za delovanje antibiotikov.

66 G+ bakterijska stena

67 Tehojske in tehuronske kisline O O -O-P-O-CH 2 -CH -CH 2 -O-P-O- O - O O - R n R=alanin glicerol fosfat tehojska kislina O O R=alanin GlcNac R -O-P-O-CH 2 -CH -CH 2 -O-P-O- O - OH O - n glicerol fosfat tehojska kislina O O R=glukoza -O -P -O -CH 2 -CH -CH -CH -CH 2 -O -P -O - O - O OH OH R O - n ribitol fosfat tehuronska kislina - ManNacUA - D-Glu - - D-GluUA - GalNac - tehuronska kislina z N-acetilmanuronsko kislino tehuronska kislina z N-acetilgalaktozaminom

68 Lipotehojske kisline polimeri glicerol fosfata, ki je substituiran z D-alaninom in sladkorji kovalentno vezane na lipide vzdržujejo strukturo celične stene vezavno mesto za površinske proteine vzdržujejo negativen naboj celične površine antigeni, povzročajo vnetni odziv

69 Proteini vezani na površino večinoma so kovaletno vezani na stranske verige aminokislin v peptidoglikanu, ostali interagirajo s tehojsko in lipotehojsko kislino pomembni pri adheziji pomembni pri razgradnji polimerov pomembni pri indukciji citokinov

70 M - protein streptokokov A štrli do 60 nm izven membrane. omogoča serotipizacijo streptokokov A (obstaja preko 80 različnih tipov) pomemben virulenčni dejavnik

71 G- bakterijska stena

72 Periplazma Komponente periplazme: - oligosaharidi (ozmotska regulacija) - proteini, ki vežejo topljence (npr. transport sladkorjev, amino kislin, železo) - citokormi (npr. citokrom c) - hidrolitični encimi (npr. alkalna fosfataza, glikozidaze) - detoksificirajoči agensi (npr. β-laktamaza)

73 Lipoprotein Zunanja membrana gram negativnih bakterij je povezana s peptidoglikanom preko lipoproteina z nekovalentnimi vezmi, kar omogoča selektivno odstranitev zunanje membrane.

74 Nastanek protoplastov Peptidoglikan lahko razgradimo z lizocimom, ki cepi 1-4 β-glikozidno vez. Ob dodatku EDTA se zunanja membrana loči. Celice brez celične stene imenujemo protoplasti. Velikokrat pa celične stene ne moremo popolnoma odstraniti in dobimo sferoplaste. Nekatere bakterije (npr. mikoplazme) lahko preživijo brez celične stene, vendar imajo v svoji plazmatski membrani povečano koncentracijo sterolov, ki omogočajo vzdrževanje integritete celične membrane.

75 Zunanja membrana porin Notranji monosloj je sestavljen predvsem iz fosfolipidov, medtem, ko je zunanji monosloj sestavljen predvsem iz lipopolisaharidov LPS. Relativno propustna membrana.

76 Porin Porin neselektivno prepušča molekule, ki so manjše od 600 Da, najdemo ga samo v zunanji membrani gram negativnih bakterij. V celici je več različnih porinov, npr. E.coli ima: OmpC porin ima najmanjše pore, difuzijska bariera OmpF porin ima večje pore, olajšan transport PhoE porin je selektivna pora za transport fosfata

77 LPS - lipopolisaharid O - antigen sredica lipid A P KDO P Glu- Nac Gal Hep P KDO GlcN Glu Gal Glu Hep Hep KDO GlcN n P P GlcN KDO Hep Glu Gal GluNac glukozamin ketodeoksikonat heptoza glukoza galaktoza N-acetilglukozamin

78 Sinteza LPS Sinteza lipida A: fruktoza-6-p glukozamin-6-p N-acetilglukozamin-6-P N-acetilglukozamin-1-P UDP-N-acetilglukozamin UDP-3-monomiristiol- GlcNac UDP-2,3-dimiristoilglukozamin 1-6 tetramiristoil disaharid-1-p tetramiristoil-disaharid-1,4-difosfat lipid A Sinteza sredice: na lipid A se ena za drugo vezejo ketodeoksonat, heptoza, glukoza, galaktoza in N-acetilglukozamin. Ko so na lipid A vezani vsi sladkorji sredice se lipid A skupaj s sredico prenese v periplazmatski prostor, kjer se dodajo sladkorji O antigena. Sinteza O-antigena: sinteza poteka ločeno od sinteza lipida A in sredice. Sinteza poteka z baktoprenolom podobno kot pri sintezi peptidoglikana. O- antigen raste tako, da baktoprenol s sladkorjem iizpodrine baktoprenol, ki ima vezano veriogo sladkorjev O-antigena.

79 Sinteza LPS citoplazmatska membrana sredica Lipid A Lipid A sredica -O -O -O -O -O O C 55 -PP C 55 -PP -O -O -O -O -O C 55 -PP -O -O -O -O O - PP - C 55 C 55 - PP - O

80 Pseudopeptidoglikan (arheje) Bistvena razlika med bakterijskim in arhejskim peptidoglikanom je: N-acetiltalosaminuronska kislina namesto N-acetilmuramične kisline 1-3 β-glikozidna vez namesto 1-4 β-glikozidne vezi nekatere arheje sploh nimajo pseudopeptidoglikana in imajo le polisaharide ali proteine (S-plast)

81 Biološka membrana

82 Funkcije biološke membrane transport snovi v celico in iz celice energijske transformacije signaliziranje gibanje

83 Gradnja biološke membrane Lipidi: predstavljajo semipermeabilno pregrado in matriks v katerem so vgrajeni proteini. Proteini: skrbijo za encimske reakcije v membrani, omogočajo strukturne povezave s citoskeletom, mediirajo energijske transformacije, sprejemajo in prevajajo kemijske signale. Ogljikovi hidrati: v povezavi z lipidi in proteini skrbijo za sprejem signala, tvorijo zaščito pred fizikalno-kemijskim stresom in so rezervoar za hranila.

84 Običajne fosfolipidne glave NH 3 + -CH 2 -C-COO - H -CH 2 -CH 2 -NH+ 3 fosfatidil serin, PS fosfatidil etanolamin, PE -CH 2 -CH -CH 2 OH OH fosfatidil glicerol, PG O difosfatidil glicerol (kardiolipin), CL -CH 2 -CH -CH 2 -O-P-CH 2 -CH -CH 2 OH OH O- OH

85 Običajne maščobne kisline nasičene maščobne kisline C atmov: 1, 2, 3, 4, 6, 10, 16, 18 (-C -C -C -) mono nenasičene maščobne kisline C atomov: 4, 12, 14, 16, 18 (- C - C = C - C -) di nenasičene maščobne kisline C atomov: 6, 18 (- C = C - C = C -) tri nenasičene maščobne kisline C atomov: 18 (- C = C - C = C - C = C -) tetra nenasičene maščobne kisline C atomov: 20 (- C = C - C = C - C = C - C = C -) penta nenasičene maščobne kisline C atomov: 20 (- C = C - C = C - C = C - C = C - C = C -)

86 Običajne maščobne kisline Hidroksialkanojske kisline C atmov: 12, 18 (- CH 2 -CH -COOH) OH Keto in ciklo maščobne kisline C atmov: 5, 19 (-C -C -C -) (-C -C -C -C -) O CH 2 Razvejane maščobne kisline C atomov: 5, 10, 16, 19, 20 CH 3 CH 2 CH 3 CH - (CH 2 )n - COOH CH - (CH 2 )n - COOH CH 3 CH 3

87 Kemijske vezi, ki jih najdemo pri lipidih etrske vezi samo pri arhejah estrske vezi pri bakterijah in evkariontih izoprenska enota samo pri arhejah

88 Dinamika lipidnih molekul porazdelitev fosfatne skupine vzdolž lipidnega dvosloja verjetnost

89 Dinamika lipidnih molekul

90 Polimorfizem lipidov invezna bikontinuirana kubična faza Pn3m inverzna heksagonalna faza H II Multilamelarni lipidni dvosloj

91 Struktura in topologija integralnih membranskih proteinov Dve najbolj običajni strukturi membranskih proteinov α-heliks β-naguban list

92 Topologija perifernega peptida v lipidnem dvosloju

93 Intracitoplazemske membrane Veliko prokariontov ima v citoplazmi močno nagubane membrane, ki so povezane s citoplazmatsko membrano in imajo posebno fiziološko funkcijo. Takšne membrane najdemo pri: metanotrofih fiksatorjih dušika nitrifikatorjih fototrofih

94 Lipidno-proteinske interakcije Za pravilno funkcioniranje biološke membrane je pomembna: sestava lipidov in proteinov ter njihovo razmerje in selektivnost konfiguracija lipidnih acilnih verig ter njihova fluidnost ukrivljenost lipidnega dvosloja interakcija lipidnih polarnih glav s proteini struktura proteina topologija proteina agregacijski status proteinov hidrofobno neujemanje proteina in lipidnega dvosloja

95 Transport snovi skozi membrano Vsa hranila morajo skozi citoplazmatsko membrano. Za nekatere npr. O 2, CO 2, NH 3 in H 2 O velja, da hitro difundirajo skozi membrano. Nižje maščobne kisline lahko prosto prehajajo membrano (višje maščobne kisline potrebujejo transporterje). Za vse ostale spojine velja, da je njihova difuzija skozi membrano močno omejena in je potreben aktivni transport.

96 Difuzija snovi skozi membrano Membrana je različno permeabilna za snovi. Permeabilnost (P) za: vodo ~ 10-3 cm/s glicerol ~ 10-5 cm/s glukozo ~ 10-7 cm/s Cl - ~ cm/s Na + ~ cm/s Tok snovi skozi membrano je J = c P S kjer je c razlika v koncentraciji, P je permeabilnost, S je površina membrane. Za glukozo velja, da bi bil pri razliki v koncentracije glukoze znotraj in zunaj celice 10-4 mol/cm 3 in permeabilnostjo = 10-7 cm/s pretok skozi 1 cm 2 membrane ~10-11 mol/sek oziroma 6 x 10 4 molekul na sekundo skozi 1µm 2.

97 Difuzija vode skozi akvaporine

98 Kinetika transporta topljencev skozi membrano Z difuzijo poteka transport počasi. Z aktivnim transportom poteka prenos hitro vendar prihaja pri višjih koncentracijah substrata do saturiranosti transporterja. Koncentracijo substrata pri kateri je hitrost transporta enaka 1/2 max hitrosti imenujemo K m ali afinitetna konstanta za substrat.

99 Aktivni transport snovi skozi membrano Različno velike spojine potujejo skozi membrano na različne načine: majhni topljenci (npr. ioni, monomeri) s permeazami in transporterji veliki topljenci (npr. proteini) s transporterji delci s fagocitozo

100 Struktura transporterjev

101 Nastanek gradientov preko membrane Snov vedno potuje vzdolž gradienta. Kontinuiran nastanek gradientov H +, K +, Na + ali H 2 PO 4- ionov preko membrane omogočajo metabolne reakcije s pomočjo: svetlobe redoks reakcij kotransporta hidrolize ATP Zmanjševanje gradienta ionov preko membrane spremlja sproščanje energije.

102 Energetika prenosa naboja preko membrane Sprememba proste energije zaradi transporta spojine preko membrane je G = -RT ln c in /c out Sprememba proste energije zaradi prenosa naboja preko membrane je G = nfv pri ravnotežnih pogojih velja nfv -RT ln c in /c out = 0 oziroma, električni potencial preko membrane, ko ni toka elektronov je V = RT/nF ln c in /c out V primeru, da je koncentracija K + v celici 140 mm, zunaj pa 5 mm se pri sobne temperaturi razvije 89 mv potenciala.

103 Sekundarni transportni sistemi Sekundarne transportne sisteme poganjajo sklopitve s primarnimi transportnimi sistemi, ki generirajo gradient ionov preko membrane. -simporterji - antiporterji

104 Energetika sekundarnega transporta simport elektronevtralnega topljenca s protonom [H + ]/[S] p = -60 log [S in ]/[S out ] H + S simport monovalentnega aniona s protonom H + ([H + ]/[S - ] - 1) -[H + ]/[S - ] 60 ph = -60 log [S - in ]/[S- out ] S - antiport kationa s protonom H + ([H + ]/[S + ] - 1) -[H + ]/[S + ] 60 ph = -60 log [S + in ]/[S+ out ] S -

105 Transport s simportom in antiportom simport antiport H + /glicin H + /galaktoza H + /Ca 2+ H + /histidin H + /laktoza H + /CaHPO 4 H + /lizin H + /fosfat H + /K + H + /fenilalanin Na +, H + /glutamat H + /Na + H + /laktat Na + /prolin K + /CH 3 NH 4 H + /piruvat Na + /melobioza H 2 PO 4- /organski anioni H + /sukcinat Mg 2+,H + /citrat H 2 PO 4- / heksoza-6-p H + /glukonat H + /arabinoza H 2 PO 4- / glicerol-3-p H 2 PO 4- / fosfoenolpiruvat

106 Transportni sistemi Haemophilus influenzae

107 Fosforilacija sladkorja po prehodu skozi membrano Sisetem za prenos sladkorjev je izgrajen iz 24 proteinov. Fosfatna skupina prihaja iz fosfoenolpiruvata. Glukoza-6P vstopa direktno v glikolizo.

108 ABC transportni sistemi pri G- bakterijah ABC je akronim za ATPbinding cassette in je sestavljen iz 3 delov. Pri prokariontih poznamo več kot 200 različnih ABC transporterjev. Za vse ABC transporterje je značilna visoka konstanta za vezavo substrata v periplazmi.

109 Transport železa, železo-kelirajoč agensi (hidroksamat) hidrokamat Fe 3+ Fe 3+ - hidrokamat citoplazemska membrana Fe 3+ - hidrokamat Fe 3+ -hidrokamat hidrokamat Fe 2+ redukcija porfirin hem

110 Transporterji za ostale ione ion Ca 2+ Fe 3+ Cu 2+ Ni 2+ Zn 2+ Co 2+ transporter fosfoprotein siderogfori/citrat/transferin caeruloplazmin albumin/histidin albumin vitamin B12

111 Transport proteinov skozi membrano Obstaja več sistemov za transport proteinov skozi membrano: Sec sistem tip I tip II tip III tip IV tip V šaperoni zunanja membrana notranja membrana šaperoni tip II tip IV tip V tip I Sec Tat tip III

112 Tip I sistem Tol C Hyl D Hyl B ADP + P i ATP Pul E

113 Tip III sistem TARČNA CELICA gostiteljska membrana Yop B, D zunanja membrana Lcr D / Ysc notranja membrana ADP + P i ATP

114 Sec sistem SecD, F SecY, E, G FtsY SecB SRP ribosom

115 Tat sistem Tat A, B, E citoplazemska membrana

116 Tip II sistem Pul D Pul C, F - O SecD, F SecY, E, G Pul E

117 Citoplazma inkluzijska telesca in granule ribosomi plinski vezikli nukleoid citosol znotrajcelične membrane poli hidroksi butirati polifosfati polisilfudi elementarno žveplo glikogen karboksisom, klorosom magnetosom metanotrofi nitrifikatorji fototrofi fiksatorji dušika

118 Granule elementarnega žvepla Veliko mikroorganizmov lahko oksidira H 2 S in tiosulfat. Pri tem lahko pride do akumulacije elementarnega žvepla v obliki granul. Granule se večajo dokler je na voljo reducirana oblika žvepla. Ko reducirane oblike zmanjka pride do porabe granul in oksidacije žvepla do sulfata.

119 Polifosfat Veliko mikroorganizmov akumulira rezerve anorganskega fosfata v obliki granul polifosfata. Anorganski fosfat je pomemben pri celični energetiki in signaliziranju. Polifosfat v celici lahko pobarvamo z bazičnimi barvili.

120 Poli-β-hidroksialkaonati Inkluzijska telesca iz poli-β-hidroksibutirata so izgrajena iz več podenot poli-β-hidroksibutirata povezanih z esterskimi vezmi. Dolžina monomerov je različna od C4 (butirat) do C18. Poli-β-hidroksialkaonate producirajo bakterije in arheje. Poli-β hidroksialkaonate uporabljamo za izdelavo biorazgradljive plastike. O CH 3 O CH 3 O CH 3 C O CH C CH C CH CH 2 O CH 2 O CH 2

121 Glikogen V glikogenu so glukozni ostanki povezani z α-1,4 in α-1,6 glikozidno vezjo. Granule glikogena so običajno majhne. Glikogen se podobno kot poli-β-hidroksalkanoati uporablja kot energijska rezerva in kot vir ogljika.

122 Karboksisom Avtotrofne bakterije, ki uporabljajo CO 2 kot edini ali glavni vir ogljika imajo velika (do 100 nm) poliedrska inkluzijska telesca, v katerih se nahaja ribuloza-bifosfat (glavni encim Calvinovega cikla). Take vključke najdemo pri: nitrifikatorjih žveplo oksidirajočih bakterijah cijanobakterijah

123 Klorosom Zelene žveplove in nežveplove bakterije imajo elipsoidno inkluzijsko telesce, ki ga obdaja membrana. Klorosom je pomemben pri fotosintezi.

124 Magnetotaktične bakterije in magnetosomi Magnetosomi so intracelularni kristali magnetita Fe 3 O 4. Magnetosom daje celici permanenten magnetni dipol, kar omogoča bakteriji, da se orientira v magnetnem polju. Magnetosomi so obdani s fosfolipidno membrano in glikoproteini.

125 Plinski vezikli Omogočajo celici lebdenje v vodnem stoplu, izgrajeni iz proteinov ~ 2 nm debeli, kar omogoča rigidnost. V veziklih je sestava atmosfere enaka kot v citoplazmi, napolnjeni vezikli so od GvpA 5 do 20 krat lažji od ostalega celičnega materiala. GvpC

126 Ribosomi Ribosomi so ribonukleoproteinski delci, kjer poteka sinteza proteinov. So ~ 30 nm veliki, sestavljeni iz velike in male podenote. Njihovo število se spreminja glede na metabolni status celice.

127 Nukleoid Nukleoid je mesto sinteze DNA in RNA. Nahaja se v središču bakterij. Hitro rastoče bakterije odprta struktura supernavita struktura imajo lahko več nukleoidov. Bazični proteini ovijajo DNA in skrbijo za njeno supernavitje.

128 Citosol Citosol je tekoči del citoplazme. V citosolu so raztopljeni minerali, monomeri, intermediati metabolizma, nukleinske kisline, oligosaharidi in vodotopni proteini. Med proteini v citosolu ločimo: samostojne proteine encimske komplekse: npr. piruvat dehidrogenaza (sestavljen iz 3 različnih encimov in 50 proteinov), α-ketoglutarat (3 različni encimi in 48 različnih proteinov, maščobno kislinska sintetaza (7 različnih encimov)

129 Neugodni pogoji za rast Mikrobne celice imajo izjemno sposobnost, da ostanejo žive v pogojih, ki ne dovoljujejo rasti in začno zelo hitro rasti, ko ponovno nastopijo ugodni pogoji. Mikrobne celice se na neugodne pogoje v okolju prilagodijo tako da: zmanjšajo metabolno aktivnost agregirajo s sosednjimi celicami spremenijo morfologijo sporulirajo

130 Morfološke spremembe stradajočih celic Zaradi stradanja se spremeni morfologija celic glede na rastoče celice. Celice postanejo: manjše okrogle spremenijo se razmerja med subcelularni kompartmenti (kondenzirana citoplazma, povečana periplazma) poveča se hidrofobnost površine celic (agregacija) spremeni se sestave membrane (povečanje nasičenosti lipidov) spremeni se struktura celične stene prihaja do kondenzacije kromosomov in plazmidov

131 Spore in sporulacija

132 Nastanek spore I

133 Nastanek spore II

134 Nastanek spore III

135 Struktura evkariontske celice

136 Evkariontska celica Obnovi znanje o strukturi evkariotske celice, ki si ga pridobil pri predmetu Biologija celice: sestava evkariontske membrane organeli in njihova funkcija struktura citoskeleta struktura znotrajceličnega vezikularnega transporta struktura signalnih poti pri evkariontskih celicah struktura evkariontskega genetskega aparata

137 Primerjava prokarionti : evkarionti struktura/funkcija prokarionti evkarionti skupine bakterije, arheje alge, glive, protozoji, rastline, živali velikostni rang < 2 µm > 2 µm celična organizacija enocelični enocelični, večcelični jedrna membrana nima ima diferenciacija nediferencirani diferencirani število kromosomov 1 > 1 gibanje kromosomov citoplazmatska m. delitveno vreteno jedrce nima ima DNA nima histonov histoni

138 Primerjava prokarionti : evkarionti struktura/funkcija prokarionti evkarionti introni redki običajni plazmidi prisotni odsotni telomeraza nima ima spolni ciklus redek, nepopolen običajen, popolen celični cikel nima ima transkr./translacija v istem kompartmentu ločeno operon kontrola več encimov kontrola enega encima - regulacija transkripcije običajna neobičajna + regulacija transkripcije neobičajna običajna mrna policistrinska monocistronska

139 Primerjava prokarionti : evkarionti struktura/funkcija prokarionti evkarionti modifikacija mrna redka poli A in metilacija rrna 5S, 16S, 23S 5S, 5.8S, 18S, 28S mala p. ribosoma 21 proteinov 30 proteinov velika p. ribosoma 34 proteinov 50 proteinov poliproteini niso prisotni lahko prisotni posttranslacijske mod. neobičajne običajne glikokaliks prisoten, debel tanjši flagele rotirajoče nerotirajoče flagele-sestava flagelin mikrotubuli neflagelarno gibanje drsenje ameboidno

140 Primerjava prokarionti : evkarionti struktura/funkcija prokarionti evkarionti fimbrije pili prisotni odsotni plazmatska m. nima sterolov ima sterole plazmatska m. nima ogljikohidratov ima notranje membrane samo nekateri običajne fagocitoza odsotna prisotna mesto respiracije citoplazmatska m. mitohondriji mesto fotosinteze citoplazmatska m. kloroplasti organeli nima ima vakuole redke običajne mikrotubuli nima prisotni

141 Primerjava prokarionti : evkarionti struktura/funkcija prokarionti evkarionti zračni vezikli lahko ima nima metabolizem aeroben/anaeroben aeroben eksosopre pri nekaterih običajne pri glivah endospore lahko prisotne nima rezervne snovi žveplo, polifosfati škrob glikogen polibutirati

142 Pomembna gesla ABC transporter periplazma kristalografija kemotaksa glikokaliks fluorofor endospora peritrihen koki flagela lopotrihe bacili plinski vezikli fototaksa pili G- in G+ bakterije PHB fimbrije transport skupin protoplast LPS sferoplast magnetosom TEM nukleoid SEM organeli LSCM peptidoglikan AFM