Neavtorizirani povzetki izbranih predavanj iz biokemije. UN študij Okolje Politehnika Nova Gorica. doc. dr. Marko Dolinar

Transcript

1 Neavtorizirani povzetki izbranih predavanj iz biokemije UN študij Okolje Politehnika Nova Gorica doc. dr. Marko Dolinar obravnavane teme v študijskem letu 2003/2004: Pretok genetskih informacij (5. poglavje) Raziskovanje genov (6. poglavje) Podvojevanje DNA in popravljanje (27. poglavje) Sinteza RNA in splicing (28. poglavje) Sinteza proteinov (29. poglavje) Kontrola genskega izražanja (31. poglavje) Biosinteza nukleotidov (25. poglavje) Lipidi in celične membrane (12. poglavje) Membranski kanalčki in črpalke (13. poglavje) Prevajanje signalov (15. poglavje) Uvod v metabolizem (14. poglavje) Fotosinteza (19. poglavje) Cikel pentoze-fosfata in Calvinov cikel (20. poglavje) Metabolizem glikogena (21. poglavje) Metabolizem maščobnih kislin (22. poglavje) Presnova proteinov: razgradnja aminokislin in cikel uree (23. poglavje) Imunološke tehnike (33. poglavje: splošna imunologija; tehnike niso obravnavane v učbeniku) Povzetki so namenjeni pomoči pri študiju iz učbenika Berg, J.M., Tymoczko, J.L., Stryer, L.: Biochemistry, 5. izdaja, W.H. Freeman & Co., New York, oglejte si tudi spletni strani na naslovih: (izpitni rezultati in splošna obvestila) (seznam strani za pomoč pri študiju nekaterih poglavij iz biokemije)

2 Pretok genetskih informacij DNA in RNA DNA in RNA sta dolga linearna polimera, sestavljena iz med seboj povezanih nukleotidov. Nukleotide sestavljajo sladkor (deoksiriboza oziroma riboza), fosfat in organska baza; ogrodje sestavljata fosfat in nanj vezani sladkor, baze pa so v notranjosti strukture in se parijo preko vodikovih vezi v točno določenih kombinacijah: A-T (adenin-timin) in C-G (citozin-gvanin). Ta lastnost omogoča prenašanje genetskih informacij, ki je shranjena v zaporedju specifičnih nukleotidov vzdolž verige DNA. Sparjeni povezani nukleotidi tvorijo dvojnoverižno zgradbo v obliki vijačnice. Pri podvojevanju (replikaciji) se verigi najprej razkleneta, potem pa s pomočjo encima DNA-polimeraza podvojita. Genetska informacija z DNA preide najprej na RNA v procesu prepisovanja (transkripcija), ki predstavlja matrico za sintezo proteinov na ribosomih (prevajanje ali translacija). Obstaja več vrst RNA; kot matrica služi samo mrna, medtem ko drugi dve obliki sodelujeta v procesu sinteze proteinov kot prenašalka aminokislin (trna) oz. kot sestavni del ribosomov (rrna). Vse tipe RNA sintetizirajo RNA-polimeraze na osnovi zapisa DNA.. Informacija na nivoju nukleinskih kislin je šifrirana s pomočjo genetskega koda, ki definira razmerje med zaporedjem baz in aminokislinskimi ostanki, ki se nizajo v proteinski strukturi. Tri baze kodon določajo eno aminokislino. Ribosomi so organeli, sestavljeni iz več tipov rrna in nad 50 različnih proteinov. Razlika med DNA in RNA je v pentozi; pri RNA gre za ribozo, pri DNA pa za deoksiribozo, ki se od riboze loči samo po tem, da ogljik na mestu 2' nima vezane skupine OH, pač pa le H. Razen tega je namesto timina (T) v RNA prisotna baza uracil (U). Sladkorni ostanki so med seboj povezani s fosfodiestrskimi vezmi, ki povezujejo 3'-OH s 5'-OH naslednjega nukleotida. Ti fosfatni mostički so negativno nabiti in dajejo naboj celotni nukleinski kislini. Kombinacija sladkorja in fosfata tvori ogrodje, na katerega so vezane baze. Bazi A in G spadata med purine, C in T (U) pa med pirimidine. Enota nukleinske kisline, ki jo sestavljajo sladkor in baza, vezana z estrsko vezjo na fosfat, se imenuje nukleotid; sama kombinacija baze in sladkorja pa nukleozid (nukleozidna vez). Prostorsko zgradbo molekule DNA sta rešila Watson in Crick leta Ima obliko dvojne vijačnice, kjer se en zavoj razteza preko 34 Å oziroma 10 baznih parov, širina vijačnice pa je 20 Å.. V središču vijačnice so bazni pari; med A in T sta 2 H-vezi, med C in G pa 3. Molekule DNA so lahko zelo dolge. Celoten genom bakterije Escherichia coli predstavlja ena sama molekula DNA dolžine 4.6 milijonov nukleotidov. Človekov genom ima skupno dolžino 3 milijarde nukleotidov (v 24 molekulah kromosomih). Nekatere molekule DNA so krožne (npr. mitohondrijska DNA) in so lahko tudi dodatno zvite gre za način kompaktiranja dolgih verig, ki tako zavzamejo manj prostora in so manj dovzetne za poškodbe. Pri replikaciji DNA prihaja do semikonzervativnega podvajanja: dve verigi DNA se razkleneta, nato pa se na osnovi vsake posamezne sintetizira komplementarna veriga in s tem ponovno pride do tvorbe dvojnoverižne strukture. Dvojno vijačnico lahko razpre encim helikaza, v laboratoriju pa ločbo verig dosežemo s segrevanjem (obstaja temperatura tališča, pri kateri je polovica helikalne strukture razprte), dodatkom baze ali kisline. Pri prehodu v enoverižno obliko se spremenijo tudi spektroskopske lastnosti DNA absorbanca pri 260 nm se poveča. Ob počasnem ohlajanju 'raztopljene' DNA pride do ponovnega združevanja verig. Zlepljajo se tudi molekule z neidentičnimi, vendar pa podobnimi zaporedji, kar izkoriščamo pri karakterizaciji zaporedij nukleinskih kislin v postopku hibridizacije. Enoverižne nukleinske kisline lahko tvorijo sekundarne strukture, ki segajo od preprostih zgradb steblozanka, pa do zapletenih oblik, ki jih zavzemajo dolge molekule mrna. in pri katerih pride do stika med bazami, ki so v linearnem zaporedju precej oddaljene.

3 Pri podvajanju DNA v celici sodeluje več kot 20 proteinov, med katerimi imajo ključno vlogo DNApolimeraze, ki katalizirajo nastanek fosfodiestrske vezi pri postopnem dodajanju deoksiribonukleotidov na rastočo verigo DNA: (DNA) n + dntp (DNA) n+1 + PP i. Sinteza teče vedno le, če je prisotna prosta komplementarna veriga in nek začetni sparjeni fragment. Nekatere polimeraze imajo tudi nukleazno aktivnost, ki jim pomaga pri odstranjevanju napačno vgrajenih nukleotidov, tako da je dodajanje baz glede na matrico izredno natančno (pogostost napačne vgradnje je 10-8 ). Vsi celični organizmi imajo gene iz DNA, medtem ko imajo nekateri virusi genetske informacije shranjene v obliki RNA. Pri skupini retrovirusov se RNA ob delovanju reverzne transkriptaze in po vstopu v celico, ki jo virus okuži, postopno pretvori v DNA, ta pa se vključi v genom okuženega osebka. Celice vsebujejo več vrst RNA, med katerimi je po količini kar 80% rrna, 15% je trna, le 5% pa mrna, ki služi kot informacija za sintezo proteinov. Pri evkariontih najdemo še snrna, ki sodeluje v procesu izrezovanja intronov. RNA nastaja po matrici DNA s pomočjo RNA-polimeraz. Postopek je podoben kot pri replikaciji DNA in poteka v smeri 5' 3', vendar ne potrebuje začetnega sparjenega fragmenta. Nastane veriga, ki je po zaporedju baz komplementarna matrici DNA.. Prepisovanje se začne na točno določenem odseku DNA, imenovanem promotor, ki ima zaporedje, ki specifično veže RNApolimerazo. Pri prokariontih so promotorji bolje definirani kot pri evkariontih. Proces se zaključi na mestu terminatorja, ki ima pri E. coli obliko lasnične zanke (na nivoju RNA), ki ji sledi zapredje več uracilnih ostankov. Evkariontska RNA po sintezi doživi več modifikacij, kot so dodajanje poli-a repa na 3'-koncu in kapice na 5'-koncu. Zapis za aminokisline je zvezen, pri čemer po 3 baze (triplet) določajo eno aminokisilno. Isto aminokislino lahko kodira več različnih tripletov (degeneracija genetskega koda), vendar vsak triplet določa vedno samo eno aminokislino. Tudi konec aminokislinske verige je zapisan kot triplet. Od 64 kombinacij, ki so teoretično možne na osnovi 4 baz, 3 kombinacije zapisujejo konec verige (stop-kodon), ostalih 61 pa 20 aminokislin. Genetski kod je univerzalen (vsi organizmi prevedejo isto zaporedje treh baz v isto aminokislino) z redkimi izjemami. Pri višjih evkariontih so kodirajoče regije genov (eksoni) prekinjeni z nekodirajočimi območji (introni). Introni se izrezujejo po prepisovanju z DNA (primarni transkript) in pred nastankom mrna. Raziskovanje genov Osnovna orodja: restrikcijska analiza tehnike prenosa NA in detekcije določanje nukleotidnega zaporedja sinteza NA na trdnih nosilcih PCR bioinformatika Tehnologija rekombinantne DNA restikcija ligacija plazmidi in fagi kot vektorji genomska knjižnica hoja po kromosomu Manipuliranje z evkariontskimi geni

4 Priprava cdna in izražanje Študij nivojev ekspresije (mikromreže) Izražanje v evkariontskih celicah Transgenske živali Tehnologija izbijanja genov Vnos genov v rastline Mestno-specifična mutageneza Podvojevanje DNA in popravljanje DNA obstaja v več helikalnih oblikah (A, B, Z). Je dovolj fleksibilna, da se lahko upogiba, krivi in razvija, hkrati pa zelo stabilna zaradi vodikovih vezi med bazami obeh verig in zaradi efekta nalaganja baz znotraj iste verige. Struktura B ima značilna veliki in mali žleb, ki sta mesti za dostop drugih molekul, ki interagirajo z značilnimi zaporedji baz na DNA. Ob dehidraciji prehaja oblika B v obliko A, kjer so baze glede na os nekoliko zamaknjene, vendar je vijačnica še vedno desna. Oblika Z ima značilnosti leve vijačnice in nastane le v zaporedjih, kjer se izmenjujejo purini in pirimidini. DNA-polimeraze katalizirajo nukleofilni napad 3'-hidroksilne skupine na notranji fosforjev atom v deoksiribonukleotidu. Delujejo lahko le, če je na matrično verigo DNA že vezan segment komplementarne nukleinske kisline s prostim 3'-koncem (začetni oligonukleotid). Encimi iz različnih organizmov so si po zgradbi podobni in potrebujejo za delovanje kovinske ione. Polimeraze z aktivnostjo kontrolnega branja imajo tudi 3' 5' eksonukleazno aktivnost. Preden pride do podvojevanja dvojnoverižne DNA, se morata verigi razkleniti, kar povzročijo helikaze ob hkratni hidrolizi ATP. Dvojnoverižna DNA se lahko ovija okrog same sebe. Vezavno število nam pove, kolikokrat se je veriga zavila. Molekule z različnimi vezavnimi števili so topoizomere, ki lahko prehajajo v druge topoizomere samo po predhodnem rezanju ene ali obeh verig po delovanju topoizomeraz. Pri E. coli se podvajanje DNA začne na mestu oric in se od tam nadaljuje simetrično v obe smeri. Helikaza razklene verigi in ustvari replikacijske vilice. Obe verigi tu služita kot matrici za sintezo nove DNA. Ker DNA-polimeraze za delovanje potrebujejo začetne nukleotide, najprej primaza (posebna RNApolimeraza) sintetizira kratka zaporedja RNA, na osnovi katerih se nato nadaljuje sinteza DNA. Z replikacijskih vilic se sinteza po eni matrični verigi nadaljuje neprekinjeno (vodilna eriga), na drugi verigi pa po segmentih (zastajajoča veriga), dolgih ~1 kb (Okazakijevi fragmenti). Encim, ki katalizira podvajanje je pri obeh verigah DNA-polimeraza III, asimetrični dimer z veliko molekulsko maso. Do različnega načina podvajanja ene in druge matrične verige prihaja zaradi enosmernega delovanja polimeraze, ki lahko deluje le v smeri 5' 3', končni efekt na zastajajoči verigi pa je, kot da bi šlo za nastajanje nove verige v smeri 3' 5'. Začetne oligonukleotide RNA razgradi DNA-polimeraza I preko svoje nukleazne aktivnosti, isti encim pa tudi dopolni manjkajoče zaporedje z dntp. Na koncu se fragmenti DNA med seboj povežejo z DNA-ligazo. Pri evkariontih je podvajanje DNA bolj zapleteno. Kromosomi evkariontov so linearne molekule, zato njihove konce podvaja posebna od RNA odvisna DNA-polimeraza, imenovana telomeraza. Polimeraza III je izredno zmogljiv encim, saj je natančen in hiter (1000 baz/s; polimeraza I samo 10 baz/s), vendar tudi zelo velik (10 polipeptidnih verig s skupno maso 900 kda; polimeraza I le 1 veriga, ~90 kda).

5 Podobna prostorsko ločena nukleotidna zaporedja se lahko med sabo rekombinirajo. Pri tem pomagajo rekombinaze, ki tvorijo in prekinjajo t.i. Hollidayeva križišča, splete 4 nukleotidnih verig. Mehanizem delovanja je podoben kot pri topoizomerazah. Mutacije nastajajo zaradi napak v parjenju baz, kovalentnih modifikacij baz ali pa zaradi insercije ali delecije baz. S tavtomerizacijo vodikovih atomov na bazah (pretvorbo med dvema izomerama) lahko pride do napačnega parjenja. Analogi baz (npr. 5-bromouracil) se lahko vgrajujejo v DNA in s tem povzročajo napake pri podvajanju. Kemični mutageni delujejo na baze in jih modificirajo do te mere, da se z derivati parijo napačne baze, ali pa (v primeru ploskih aromatskih molekul kot so akridini) interkalirajo med bazne pare in s tem pride do insercij. UV-svetloba pa povzroča tvorbo pirimidinskih dimerov, ki niso kompatibilni z dvojno vijačnico. DNA-polimeraza je sposobna popravljati nekatere napake, druge pa popravljajo še nekateri encimi, ki vsi za preverjanje odčitavajo zaporedje baz matrične verige. Pirimidinske dimere, ki nastanejo zaradi delovanja UV-žarkov, popravlja uvrabc-ekscinukleaza, ki odstrani zaporedje 12 baz, vključno z dimerom. Pri ljudeh z okvarami v sistemu popravljanja DNA pride do nastanka različnih bolezni, predvsem različnih rakov. Standardni test mutagenosti je Amesov test, ki ga izvajamo na posebnih sevih bakterij iz rodu Salmonella. Bakterije imajo v genomu točno določene vrste okvar v zapisih za posamezne encime metabolnih poti (biosinteza histidina). Ko bakterije rastejo na gojišču z mutagenim sredstvom, bo prišlo pri nekaterih bakterijah do revertiranja okvara bo mutirala v divji tip in celice bodo rastle na selektivnem gojišču. V testu uporabimo tudi homogenat sesalskih jeter; encimi v ekstraktu lahko pretvorijo nekatere prekurzorje mutagenih sredstev v prave mutagene. Sinteza RNA pri prokariontih Vse molekule RNA nastajajo na osnovi matrice DNA s pomočjo RNA-polimeraz. Delujejo v smeri 5'-> 3' (tako kot pri sintezi DNA), pri čemer začetni sparjeni segment ni potreben, odsotna pa je tudi aktivnost kontrolnega branja. Gre za polimerizacijo, kjer se zapored dodajajo aktivirani monomeri ribonukleozid trifosfati. Encim ima več nalog: poišče promotorska mesta in se veže nanja, razvije kratek segment dsdna, izbere ustrezen NTP in katalizira tvorbo fosfodiestrske vezi, zazna terminacijski signal, interagira z aktivatorji in represorji. Pri E. coli je RNA-polimeraza encim z več podenotami (holoencim: α 2 ββ'σ) in skupno maso 550 kda; pri tem osrednji encim zavzemajo podenote α 2 ββ'. Najprej pride do vezave holoencima preko podenote σ 70 na promotorsko regijo, ki jo sestavljata dva segmenta na mestih ~10 in ~35 nukleotidov navzgor od začetka transkripcije. Običajni promotorji imajo zelo ohranjena promotorska zaporedja. V posebnih pogojih rasti (npr. povišana temperatura) pa se izraža drugačna podenota σ 32, ki se zato tudi veže na drugačna promotorska zaporedja (heat-shock geni). RNA-polimeraza najprej odvije ~17b dolgo zaporedje v dvojni vijačnici, nakar se začne prepisovanje. Ko se začne elongacija (podaljševanje) in se sintetizira prvih ~10 b, podenota σ disociira iz holoencima, polimerizacija pa se nadaljuje s hitrostjo ~50 b/s (17 nm/s) znotraj takoimenovanega transkripcijskega mehurčka, ki se pomika po matrični DNA. Polimerizacija se konča na določenih mestih. To so lahko posebne lasnične strukture, ki jih ustvari nastala RNA, ali pa signal, ki ga prebere faktor ρ (ro). Pri lasničnih zankah pride do zaustavitve delovanje polimeraze, hkrati pa je nastali hibrid DNA-RNA v tej regiji nestabilen in pride do disociacije RNA z DNA in z encima. Faktor ρ (heksamer z ATPazno aktivnostjo) se veže na 72 b novonastale RNA, nato pa po njej potuje do transkripcijskega mehurčka, kjer deluje na hibrid DNA-RNA kot helikaza in prekine hibrid, kar povzroči prekinitev prepisovanja. Nastala RNA, ki je namenjena za trna oz. rrna se po sintezi še kemično spremeni, medtem ko mrna ostane nespremenjena in služi kot matrica za sintezo proteinov. Primarni transkript lahko vsebuje RNA, ki po delovanju RNaz razpade na predhodnike trna in rrna. Pri rrna pride še do modifikacije riboze in

6 metilacije nekaterih baz. Pri trna pride do naknadnega dodajanja zaporedja CCA ter do modifikacije posameznih baz. Nekateri antibiotiki delujejo na nivoju transkripcije. Rifampicin npr. inhibira fazo iniciacije s tem, da se veže v bližino kanalčka, kjer je mesto za hibrid DNA-RNA (na podenoti β). Aktinomicin pa se veže na dsdna, tako da se ne more razpreti in matrica DNA ne pride v stik s polimerazo. Pri prokariontih potekata prepisovanje in prevajanje v citoplazmi, medtem ko imajo evkarionti celične razdelke in različni procesi tečejo v različnih razdelkih: prepisovanje v jedru, prevajanje pa v citoplazmi na ribosomih. Sinteza in procesiranje RNA pri evkariontih V evkariontskem jedru so 3 različne RNA-polimeraze z različnimi funkcijami. RNA-pol I sintetizira prekurzorje rrna, RNA-pol II sintetizira mrna, RNA-pol III pa prekurzorje trna. Katalitski mehanizem je enak kot pri prokariontskih RNA-polimerazah (nukleofilni napad 3'-OH na alfa-p vstopajočega NTP brez začetnega oligonukleotida, v smeri 5'->3'). Strup rdeče mušnice vsebuje α-amanitin, ciklični oktapeptid z neobičajnimi aminokislinami. Tesno se veže na RNA-pol II in tako blokira tvorbo prekurzorjev mrna (fazo elongacije). Promotorji za RNA-pol II so: TATA-škatla (-25), CAAT-škatla in CG-škatla slednji 2 samo pri pogosto prepisujočih se matricah na mestih med 45 in 110. Inicacija poteče s pomočjo transkripcijskih faktorjev. Za RNA-pol II se najprej na TATA-škatlo veže TFIID, nato pa še IIA in IIB ter končno RNA-pol in TFIIE, ki skupaj tvorijo osnovni transkripcijski aparat. TFIID (700 kda) vsebuje TBP (30 kda podenota), 'protein, ki se veže na TATA-škatlo'. Po vezavi pride do strukturnih sprememb na DNA, ki se upogne na obeh straneh TATA-škatle, DNA pa se tudi delno razvije. Na transkripcijo lahko vplivajo tudi oddaljena zaporedja DNA, ki se zapogne, da aktivatorji, vezani na ojačevalna zaporedja DNA, pridejo v stik s transkripcijskim aparatom. Evkariontska mrna se na 5'-koncu takoj po sintezi modificira; po odcepu fosfata pride do interakcije med difosfatom in GTP, da nastane nenavadna 5'-5' trifosfatna vez. Nastala struktura = kapica, se nato metilira, metilirajo pa se lahko tudi riboze navzdol po sekvenci. Kapice povečajo stabilnost mrna in odpornost proti fosfatazam in nukleazam. Na 3'-koncu imajo evkar. mrna poli-a rep, ki ni kodiran na nivoju DNA, po drugi strani pa se pogosto 3'-konec primarnega transkripta (AAUAAA) odcepi pred encimsko sintezo poli-a (~250 ostankov ob porabi ATP). Rep se ovije okrog več kopij vezavnega proteina z maso 78 kda. Vloga polia: zaščita pred nukleazami, povečuje učinkovitost matrice pri sintezi proteinov. Po sintezi trna se pred dokončnim oblikovanjem s konca in iz sredine izcepita kratki zaporedji, na 3'- koncu pa se pripne trinukleotid, ki nato veže aminokisline. Pri teh procesih sodeluje več encimov. Iz prekurzorske mrna se izcepijo introni z veliko natančnostjo. Meje stikov z eksoni so strukturno podobne pri vseh evkariontih. Intron se začne z GU in konča z AG. Značilna so tudi bližnja zaporedja in razvejitveno mesto b navzgor od mesta cepitve na 3'-koncu introna. Introni so dolgi baz. 5'-cepitveno mesto napade 2'-OH adenozina na razvejitvenem mestu. Nastane nov 3'-konec zgornjega eksona, ki napade 3'-cepitveno mesto. Eksona se povežeta, intron se sprosti v obliki lariata. Reakcije tečejo, ko je mrna vezana na proteine: spliceosom. V jedru in citoplazmi je več vrst malih molekul RNA (<300 b): snrna, scrna, ki se vežejo s proteini v ribonukleoproteinske komplekse (RNPs) sestavne dele spliceosomov.

7 V posebnih primerih lahko izcep delov RNA povzroči sama (katalitska) RNA. Npr. procesiranje prekurzorjev rrna pri bičkarju Tetrahimena (evkariontski enoceličar - protozoj). Katalitska RNA (ribocim) je lahko dolga tudi <50 b in je specifična. Sinteza proteinov Translacija: zaporedno dodajanje AA (=aminokislin) na karboksilni konec polipeptidne verige; sinteza od N- do C-konca. AA se dodajajo preko aktiviranih prekurzorjev (aminoacil-trna), kjer je karboksiskupina AA povezana s 3'-OH trna (sintetaza, ATP). Sinteza: iniciacija (vezava iniciacijske trna na startni signal mrna; mesto P na ribosomu), elongacija (vezava aminoacil-trna na mesto A, tvorba peptidne vezi, preskok na mesto P, iniciacijska trna pa na E; poganja hidroliza GTP), terminacija (sprostitveni faktor prebere signal stop in loči polipeptid od ribosoma). Mesta: P=peptidilno, A= aminoacilno, E=izhodno Ribosomi so veliki ribonukleoproteinski kompleksi iz 2 podenot (E. coli: 30 S+50 S=70 S): 3 RNA, 55 proteinov. Ala-tRNA: prva sekvencirana NA (=nukleinska kislina) (76 b, 7 let dela, 1965). Vse trna so podobne (ker morajo interagirati s podobnimi proteini in RNA na istih mestih ribosoma): l=73-93 b, fosforiliran 5- konec (pg), prosta 3' OH skupina. Veliko baz (7-15) je drugačnih od ACGU (=> se ne parijo in so na voljo za druge interakcije + so bolj hidrofobne, kar je pomembno za interkacije s sintetazami in z ribosomskimi proteini ter za zvitje), ~50% baz je sparjenih, oblika je ~deteljasta, na enem koncu je antikodonska zanka (7 b), ki se s 3 bazami pari z mrna. 3D zgradba (Phe-tRNA, 1974): oblika črke L, dva segmenta z dvojno vijačnico (po ~10 bp=1 zavoj). V nehelikalnih delih se tvorijo neobičajne H-vezi (terciarne interakcije G-G, A-A, A-C); z bazami interagira tudi ribofosfatni skelet, pa tudi sam s sabo; stabilizirajo tudi nalaganja aromatov zaradi baz, ki so ena nad drugo. Razdalja med antikodonom in CCA-koncem, kamor se pripenja aminokislina (ozn. AA), je 80 Å. CCA-konec ima malo interakcij z ostankom molekule in je fleksibilen. Tvorba peptidne vezi je energetsko neugodna. Rešitev je aktivacija karboksilne skupine. Gre za estre aminokislin, pri čemer je karboksilna skupina vezana na trna preko 2'- ali 3'-OH skupine riboze na 3'- koncu: aminoacil-trna. Razen tega se preko trna povežeta aminokislina in genetska informacija. Sintetaza hidrolizira ATP do AMP + 2 Pi (1 Pi za estrsko vez, 1 za poganjanje reakcije). Najprej se AA modificira do aminoacil-adenilata (AA-AMP), nato se ustvari povezava s trna -> aminoacil trna + AMP. Za vsako AA obstaja vsaj 1 aminoacil-trna sintetaza. Razdelimo jih v 2 razreda z različno sestavo značilnih regij. Encimi razreda II aktivirajo manjše in hidrofobne AA in so evolucijsko starejši. Acetilirajo 3'-OH (razen Phe), razred I pa 2'. Struktura Tyr-tRNA sintetaze iz E. coli: dimer razreda I (2x47 kda); N-termin. 320 AA: aktivacija, C- term. 99 AA: vezava trna in tvorba vezi. Encimi so zelo specifični in prepoznajo majhne razlike na trna in AA. Razen tega imajo aktivnost kontrolnega branja in lahko hidrolizirajo premajhne intermediate oz. v acilacijska mesta ne morejo vstopati preveliki intermediati. Nekatere sintetaze prepoznajo trna preko antikodona, druge pa preko specifičnih parov v akceptorskem steblu oz. kombinirano. Antikodon se veže na kodon ne glede na AA, ki bi bila vezana na trna. Nekatere trna pa se vežejo na več kot 1 kodon zaradi ohlapnosti parjenja na 3. bazi.

8 Ribosom E. coli: ~2.700 kda, 2r=200 Å; skupaj v celici ~ ali 25% celotne mase bakterije. Podenota 30 S: 21 P (S1-21) + RNA 16 S; podenota 50 S: 34 P (L1-34) + RNA 23 S + RNA 5 S. Samo L7 in L12 nastopata 2x (L7 = acetiliran L12). Prekurzor 30 S se procesira do posameznih RNA-elementov ribosoma (5 S, 16 S, 23 S). rrna 16 S: 1542 b, 3 domene. Vezavno mesto za mrna je med obema podenotama; v reži sta tudi 2 vezavni mesti za trna. Velika podenota ima 3 izrastke; v dolini med 2 je peptidil-transferazno mesto, na 1 prstu pa je GTPaza, ki skrbi za premikanje trna in mrna; na nasprotni strani je mesto izstopa mrna. S pulznim označevanjem novosintetiziranih proteinov so pokazali, da sinteza teče od N- proti C-koncu polipeptidne verige. mrna se prevaja v smeri 5'->3' (ista kot je smer sinteze mrna); pri prokariontih tečejo postopki sočasno (prepisovanje in prevajanje sta prostorsko in časovno sklopljena procesa). Hkrati prevajanje teče na več ribosomih (poliribosomi = polisomi), ki so med seboj neodvisni. Max. gostota je 1 rbs/80 b. Po končani sintezi proteina ribosom disociira na obe podenoti. Prvi prevedeni kodon ni z začetka mrna, pač pa >25 b navzdol; razen tega so mrna pri prokariontih pogosto policistronske (več proteinov zapisanih na 1 mrna z ločenimi start- in stop-kodoni). Prva AA je formil-metionin (pri bakterijah), ki se vgradi s posredovanjem iniciacijske trna: trnaf (notranji Met: trnam ta se ne more formilirati, vendar za obe obliki obstaja le ena sintetaza, le da v 1. primeru naknadno deluje še transformilaza). Start je AUG (Met), redko tudi GUG (Val), pred katerim je zaporedje, bogato s purini, oddaljeno ~10 b. Imenuje se Shine-Dalgarnovo zaporedje in se veže na rrna 16 S (3'-konec). Gre torej za parjenje mrna s 16S-rRNA in parjenje antikodona z iniciacijskim kodonom. Najprej se na podenoto 30S vežejo 3 proteini: iniciacijski faktorji (IF) 1-3. Po vezavi GTP na IF2 se kompleksu pridružita še mrna in inciacijska trna, IF3 pa se sprosti. Tedaj se lahko veže podenota 50 S, IF1 in IF2 pa se sprostita ob hidrolizi GTP in nastane iniciacijski kompleks 70 S. fmet-trna je na mestu P, mesti A in E pa sta nezasedeni. Začne se faza elongacije: aminoacil-trna se veže na prosto mesto A (katera aa-trna je odvisno od kodona na mrna na tem mestu) s posredovanjem elongacijskega faktorja Tu (EF-Tu, 5% vseh bakterijskih proteinov), ki ima vezan GTP. Po postavitvi v mesto A pride do hidrolize GTP, kompleks disociira z ribosoma, na kompleks se veže EF-Ts in povzroči disociacijo GDP. Na EF-Tu se veže GTP, EF-Ts pa se loči od kompleksa. Hitrost sinteze proteinov je odvisna od GTPazne aktivnosti EF-Tu. Znotraj nekaj milisekund, kolikor traja ta faza, se tudi napačno postavljena aminoaciltrna loči iz kompleksa in naredi prostor pravi. (EF-Tu torej ne interagira s fmet-trnaf in ta torej nikoli ne pride na mesto A. Met-tRNAm pa se obnaša kot vsaka druga AA in vstopa v A. Tako tudi notranjih AUG ne prebere iniciacijska trna.) Tvorbo peptidne vezi katalizira peptidil-transferaza znotraj 50S-podenote. 3'-CCA na trna interagira s 23S-rRNA, ki tvori aktivno mesto encima. Aktiviran fmet se prenese na amino-skupino aa-trna in nastane dipeptidil-trna. S tvorbo peptidne vezi se zmanjša afiniteta trna do 50S-podenote. Deacilirana trna na 50S podenoti je vezana na mestu E, na mestu P pa še vedno na P; dipeptidil-trna je na mestu P na podenoti 50 S in na mestu A na podenoti 30 S. Zdaj pride do faze translokacije 3 premikov: deacilirana trna se umakne z mesta P na podenoti 30 S, dipetidil-trna se na 30 S premakne z A na P, mrna pa se premakne za 1 kodon naprej. Pri premikih posreduje translokaza = EF-G ob razgradnji GTP in sodelovanju več proteinov iz podenote 50 S. Ko se na sproščeno mesto A veže nova aminoacil-trna, se z mesta E sprosti deacilirana trna obe mesti hkrati ne moreta biti zasedeni. Stop-kodonov ne prepozna trna, pač pa proteini - sprostitveni faktorji (release factor, RF), sodeluje pa tudi rrna 16 S. Vezava RF na mesto A aktivira peptidil-transferazo, da hidrolizira vez med polipeptidom in trna na mestu P. mrna in trna zapustita ribosom, ki nato razpade na posamezni podenoti. Antibiotik puromicin inhibira sintezo proteinov zaradi predčasne terminacije, saj je analog dela aminoaciltrna. Veže se na mesto A in preprečuje vstop pravi aminoacil-trna, hkrati pa povzroči vgradnjo antibiotika na C-konec polipeptidne verige. Tudi več drugih antibiotikov deluje na nivoju translacije pri prokariontih, pa tudi evkariontih.

9 Pri evkariontih je proces sinteze proteinov podoben, čeprav so ribosomi večji (60 S + 40 S = 80 S, kda; 40 S = rrna 18 S + proteini; 60 S = 5 S+23 S+5,8 S + proteini) in tu sodeluje še več drugih proteinov. Iniciacijska AA je Met (ne fmet), vendar je trna prav tako posebna Met-tRNAi. Start je vedno AUG brez Shine-Dalgarnovega zaporedja in do prevajanja pride na prvem AUG v mrna. Pritrditev na podenoto 40 S poteka preko kapice. Evkar. mrna ima vedno samo 1 startno mesto, prokariontska mrna pa lahko več. Iniciacijskih faktorjev je več (9) in so kompleksno sestavljeni. Evkar. homolog EF-Tu je EF1α, EF-TS pa EF1βγ. Translacijo regulirajo protein-kinaze, ki inaktivirajo enega od IF. Difterija-toksin (gen je preko faga prisoten v nekaterih sevih povzročitelja oslovskega kašlja) je inhibitor sinteze proteinov. Deluje na EF2 (ADP ribozilacija) in tako prepreči translokacijo, kar ustavi sintezo proteinov in povzroči celično smrt. Pozor: 4. izdaja učbenika (Stryer 4) ima poglavje 35: Protein targeting, ki ga v novi izdaji (Stryer 5) ni. Sledijo poglavitni podatki: Ciljanje proteinov Biosinteza proteinov poteka na prostih ribosomih v citoplazmi z izjemo tistih, ki so zapisani na mitohondrijski in kloroplastni DNA. Pri evkariontskih proteinih, ki vsebujejo signalna zaporedja, se ribosomi prbiližajo ER. SRP kompleks, ki prepozna signal, je ribonukleoproteinske narave in se veže na receptor na ER. Signalna zaporedja imajo lahko tudi prokariontski proteini. Skupna značilnost je, da so dolgi okrog 20 aminokisl. ostankov in imajo več hidrofobnih ostankov ter nekaj bazičnih. Prevedeni protein prehaja membrano ER, signalno zaporedje pa se odcepi. V ER prihaja do zvitja proteina ob pomoči šaperonov proteinov, ki prehodno vežejo novonastale proteine in jim olajšujejo pravilno zvitje. V ER prihaja tudi do glikozilacije nekaterih proteinov. Aminokislina, ki se glikozilira, je Asp. Na stransko verigo se pripne 14 sladkornih ostankov z dolihol-pirofosfata, vendar se 4 kmalu odcepijo. Preko transportnih veziklov proteini nato pridejo do GA, kjer prihaja do nadaljnje modifikacije glikoproteinov. Proteini, namenjeni v lizosome, vsebujejo konformacijski motiv, ki povzroči pripenjanje manoza-6-fosfatne enote. S pomočjo membranskega receptorja taki glikoproteini pridejo v prelizosom, ta pa se kasneje zlije z lizosomom. Večina mitohondrijskih in kloroplastnih proteinov je sicer zapisana v jedru, sortiranje pa poteka s pomočjo posebnih signalnih zaporedij. V ciljni organel prehajajo lahko samo v (delno) razviti obliki, signalna zaporedja pa se po prehodu odcepijo. Kontrola izražanja genov Bakterije so se sposobne odzivati na razmere v okolju z do 1000x povečano sintezo potrebnih proteinov. Regulacija poteka pretežno na nivoju transkripcije. Geni so pogosto nanizani v operone z usklajeno regulacijo. Transkripcijo blokirajo represorji, pospešujejo pa aktivatorji. Gre za proteine, ki se vežejo na DNA. Klasični primer reguliranega izražanja pri E. coli sta laktozni in triptofanski operon. E. coli lahko porablja laktozo kot edini vir ogljika. Encim β-galaktozidaza (gen lacz) razcepi disaharid laktozo na galaktozo in glukozo. V gojišču z laktozo imajo bakterije več 1000 kopij molekul encima, če pa so na voljo drugi viri ogljika pa <10 inducibilni encim. Hkrati se sintetizirata še 2 encima: galpermeaza (lacy) in tiogalaktozid-transacetilaza (laca). Analog laktoze, ki deluje kot induktor, je IPTG

10 (izopropil-tiogalaktozid), ki pa ga encim ne more razgraditi. S študijem mutant so ugotovili, da za usklajeno sintezo 3 encimov skrbi produkt gena laci; to je proteinski represor. Nastal je operonski model regulacije sinteze RNA: regulatorski gen kodira za represor, ki se veže na operatorsko regijo DNA, temu pa sledijo strukturni geni. Operon sestavljajo samo operator in strukturni geni. Operator razen mesta za vezavo represorja sestavlja še promotorska regija. Represor je homotetramer enot s po 37 kda in s po 1 mestom za vezavo induktorja. Na simetrično zaporedje operatorja (22 bp) se veže 4x10 6 -krat močneje kot na nespecifična mesta DNA. V prisotnosti glukoze se mnogi katabolni encimi ne izražajo. Način regulacije imenujemo katabolna represija in vključuje molekule camp, ki so pogost iniciator transkripcije pri bakterijah, pa tudi pri sesalcih. Glukoza namreč znižuje intracelularno koncentracijo camp in s tem onemogoča aktivacijo mnogih promotorjev. V odsotnosti glukoze pa prihaja do pozitivne regulacije katabolne aktivacije: pri bakterijah se camp veže na protein CAP (katabolni aktivatorski protein), homodimer z enoto 22 kda, ki ima vezavno mesto za DNA in za camp. Kompleks s camp se veže na nekatere promotorje in tako stimulira prepisovanje ~50x. V primeru operona lac se mesto za vezavo represorja delno prekriva s promotorjem, medtem ko je mesto vezave CAP tik pred promotorjem. Stimulacija izražanja je mogoča zato, ker CAP, vezan na DNA, predstavlja dodatno površino za vezavo RNA-polimeraze, razen tega pa CAP nekoliko ukrivlja DNA (2x43 ), tako kot to počne polimeraza. Skupna značilnost regulatornih proteinov, ki se vežejo na DNA, je prisotnost strukturnega motiva α- vijačnica zavoj α-vijačnica s ponovitvijo v oddaljenosti 34 Å; vijačnica prvega dela se veže v veliki žleb DNA in tam interagira z robovi baznih parov, drugi del pa se veže na skelet dvojne vijačnice. Pri regulaciji Trp-operona (sinteza Trp iz prekurzorja) se Trp (korepresor) veže v represorski protein (dimer s po 107 AA) in s tem poveča razdaljo med helikalnima motivoma s 26 Å na 34 Å. Obstajajo pa tudi regulatorni proteini, pri katerih kontaktno regijo z DNA predstavlja β-strukturni element (npr. represor metionina). Možna pa je tudi kontrola izražanja genov na posttranskripcijskem nivoju. Tak primer so operoni za sintezo aminokislin, ki so večinoma kontrolirani preko atenuatorjev. Pri Trp-operonu se na 5'-koncu policistronske mrna, še pred zapisom za prvi protein, pojavlja 162 b dolgo vodilno zaporedje. Ugotovili so, da z mutacijami v tej regiji lahko vplivajo na nivo sinteze encimov, ki so zapisani v strukturnih genih tega operona. Vodilno zaporedje vsebuje značilni regiji: eno, bogato z GC, za njo pa z AT-bogato regijo, vsako z notranjo simetrijo zaporedja, kot je to značilno za terminatorske regije. Tu lahko pride do kontrolirane terminacije atenuacije. Pri Trp-operonu gre za dodaten način regulacije, ob regulaciji z represorjem, ko je v mediju prisoten končni produkt reakcije Trp. Ko se nivo Trp v celici znižuje, represija popusti in RNA-pol začne prepisovati z matrice. Vendar zaradi sekundarne strukture vodilnega zaporedja večina molekul RNA-pol ne more preko tega zaporedja. Bolj, ko se zniža nivo Trp, več molekul polimeraze preide preko atenuatorja. Razlog je v tem, da sta pred terminacijskim signalom dva kodona za Trp in ker v celici zaradi pomanjkanja Trp ni dovolj Trp-tRNA, sinteza proteina na ribosomu nekoliko zastane. Pred ribosomom zato ostane izpostavljena mrna, ki ustvari drugačno zanko, ta pa ne deluje kot terminator. Polimeraza zdaj lahko nadaljuje s sintezo mrna zapisom za encime, ki sodelujejo pri sintezi triptofana. Tak način regulacije je mogoč samo pri prokariontih, kjer sta transkripcija in translacija tesno povezani. Evkariontski kromosomi in izražanje genov Bakterijska celica vsebuje 1000x manj DNA kot človeška. Pri evkariontih je DNA pakirana s pomočjo bazičnih proteinov, histonov, okrog katerih se ovija in tako tvori nukleosome. Kromatin označuje celoten kompleks genomske DNA in proteinov, na katere je navita. Kvasni kromosom je samo 3x večji od bakterijskega, ima pa 16 kromosomov, ki jih med seboj lahko ločimo elektroforezno. Približno 50% mase kromosomov predstavljajo histoni. Poznamo 5 različnih vrst, ki se ločijo po velikosti (11 kda 21 kda) in deležu posameznih bazičnih aminokislin. Histon H1 deluje kot povezovalec med

11 posameznimi enotami, ostali 4 (H2A, H2B, H3 in H4) pa so v sredini klobčiča, ki ga ovija DNA. Histoni (predvsem H3 in H4) imajo zelo filogenetsko ohranjeno aminokislinsko zaporedje, pogoste pa so modifikacije aminokislinskih ostankov (acetiliranje, metiliranje, fosforiliranje, ADP-riboziliranje). Nukleosom sestavljata po 2 H2A, H2B, H3 in H4 (torej proteinski oktamer) z ovitimi ~200 bp DNA (odvisno od vrste; v neposrednem stiku s histoni je vedno 145 bp oz. 1,75 zavoja). Nekaj DNA povezuje posamezne enote med sabo in celotni strukturi zagotavlja fleksibilnost. V sredini sta H3+H4; H1 se povezuje s H2A in veže linkersko DNA. Zaradi ovijanja se dolžina DNA skrajša z 68 nm na 10 nm na enem nukleosomu (pakirno razmerje 7). Metafazni kromosomi pa so kondenzirani v razmerju10 4 (intefazni: ). Obstajajo torej višje stopnje organiziranja DNA: nukleosomi se združujejo v helikalno razmeščene strukture (6 nukleosomov na zavoj, širina 36 nm) s pakirnim razmerjem 40, te pa se razporejajo v zanke ob sodelovanju drugih proteinov. Največje pakiranje je v glavi spermija, kjer namesto histonov nastopajo protamini, bazični proteini, ki po vezavi na DNA zavzamejo helikalno zgradbo. Pri delitvi se histoni prenašajo z vodilno verigo DNA in med delitvijo celo ostanejo vezani na DNA. Mitohondriji in kloroplasti imajo lastno DNA. Človeški mitohondrij vsebuje 16,6 kb DNA in zapisuje za 13 proteinov (7 podenot NADH-Q-reduktaze in podenote citokrom-reduktaze, citokrom-oksidaze in ATPsintaze), 22 trna (nekatere berejo 4 različne kodone) in 2 rrna. Značilnost evkariontskih genomov je prisotnost velikega deleža zaporedij, ki ne zapisujejo za proteine (samo 2-5% jih zapisuje) in veliko ponavljajočih se zaporedij (>30% genoma vsebuje zaporedja, ki se ponovijo vsaj 20x): SINE kratke razpršene ponovitve ( bp) in LINE dolge razpršene ponovitve. Primer SINE so Alu-zaporedja (~300 bp), ki se ponovijo skoraj 10 6 x. Večina SINE izhaja iz zapisov za snrna. Ponovljeni geni pa so lahko tudi nabrani v nizih, npr. geni za rrna, ki so nameščeni na delih kromosomov, povezanih z jedrcem, in geni za histone. Vseeno pa za večino pomembnih proteinov obstaja samo 1 kopija gena. Z enega gena se lahko prepiše več tisoč mrna in če je ta stabilna, lahko vsaka mrna služi kot matrica za biosintezo tudi proteinskih molekul v nekaj dneh (primer fibroina pri sviloprejki). Pri evkariontih poteka regulacija izražanja genov tako kot pri prokariontih na nivoju transkripcije, vendar je tu večina genov utišanih, vse dokler se nanje ne vežejo transkripcijski faktorji. Transkripcijski aktivatorji vsebujejo dve domeni; z eno se vežejo na specifično zaporedje DNA, z drugo pa sodeluje pri tvorbi transkripcijskega kompleksa na škatli TATA. Aktivatorjev pri evkariontih je več in regulacija poteka na nivoju hitrosti tvorbe transkripcijskega kompleksa (RNA-pol ne more začeti prepisovanja, če na škatli TATA niso predhodno vezani pomožni proteini). Strukturni motiv, ki najpogosteje nastopa pri regulatorjih izražanja evkariontskih genov, je cinkov prst. To je zaporedje ~30 AA z 2 Cys in 2 His, ki koordinirajo 1 ion Zn. Na nivoju sekundarne strukture je Zn-prst običajno antiparalelna β-lasnična zanka, ki je preko zavoja povezana z α-vijačnico. Helikalni del prepoznava zaporedje baz in pomnoženi Zn-prsti lahko prepoznajo daljša zaporedja na nivoju DNA. Steroidni hormoni (estradiol, testosteron,...) regulirajo delovanje celic tako, da vstopijo vanjo in se vežejo na specifičen receptorski protein. Kompleks receptor-hormon se v jedru veže na določena nukleotidna zaporedja in jih modulira. Jedrni receptorji so vsi podobno zgrajeni: imajo 66 AA dolgo domeno, ki se veže na DNA in 240 AA dolgo domeno, odgovorno za vezavo hormona. Dokler hormon ni vezan, ta domena preprečuje interakcijo druge domene z DNA. Tarčna zaporedja DNA (odzivni elementi za estrogen ERE) interagirajo z α-vijačnico, ki se veže v veliki žleb DNA. Po vezavi liganda en helikalni element spremeni svojo lego v molekuli receptorja in s tem omogoči vezavo koaktivatorskih proteinov na receptor. Sam receptor namreč ne more modulirati izražanja genov vezava koaktivatorjev je bistvenega pomena. Koaktivatorji imajo v svoji zgradbi strukturni motiv levcinske zadrge, pri katerem dimer stabilizirajo Leuostanki v obvitem klobčiču. Take domene interagirajo z jedrnim hormonskim receptorjem, druge pa so odgovorne za vezavo na DNA in na še druge proteine. Zdravila, ki delujejo na estrogenske receptorje, se

12 vežejo na mesto hormona, a zaradi drugačne zgradbe onemogočajo konformacijsko spremembo na receptorju, s tem pa preprečujejo vezavo koaktivatorja. Primer takega zdravila je tamoksifen, ki zavira rast nekaterih tumorskih celic. Koaktivatorji in korepresorji delujejo na DNA s tem, da kovalentno spremenijo aminske konce histonov (in nekaterih drugih proteinov); pogosto pride do acetiliranja lizinskih ostankov, s čimer se spremeni naboj, to pa povzroči zmanjšanje afinitete histona do DNA. Posledično so deli DNA bolj dostopni za transkripcijo. Razen tega so acetilirani histoni vezavna mesta za regulatorne proteine, tiste, ki se vežejo na TBP, pa tudi kompleksne proteine, ki sodelujejo pri preoblikovanju kromatina. Ponovno vrnitev v začetno stanje omogočajo histon-deacetilaze. Acetiliranje proteinov, ki se vežejo na DNA, ima pri uravnavanju transkripcije podoben pomen kot ga ima fosforiliranje pri prenašanju signalov z membranskih receptorjev na površini celice. Biosinteza nukleotidov Nukleotidi niso samo gradniki nukleinskih kislin, pač pa kot derivati sodelujejo pri sintezi različnih drugih makromolekul (npr. glikogena, fosfogliceridov). ATP je univerzalni prenašalec energije v bioloških sistemih, GTP pa nastopa pri premikih makromolekul (translokacija na ribosomu). Adeninski nukleotidi so tudi sestavni deli najpomembnejših koencimov: NAD + (nikotinamid-adenin-dinukleotid), FAD (flavin-adenin-dinukleotid) in CoA (koencim A). camp uravnava delovanje mnogih hormonov in je torej regulator metabolizma, deluje pa tudi pri regulaciji izražanja genov in kot sekundarni obveščevalec pri prenosu signalov skozi membrane. Nukleotidi v celici nastajajo po dveh poteh: preko sinteze de novo in po reciklažni poti (salvage pathway). Pri tej se purinske baze iz razgrajenih nukleinskih kislin povežejo s fosforibozil-pirofosfatom (PPRP aktivirano ribozo), kar je energetsko bistveno ugodnejše kot je sinteza iz sestavnih delov. PPRP deluje kot splošni aktivator spojin z dušikovim obročem. Nastaja iz riboza-5-fosfata ob pretvorbi ATP v AMP. Ko se na PRPP veže purin, nastane purinski ribonukleotid ob odcepu PPi. Izhodne molekule za sintezo de novo so aminokisline, derivat tetrahidrofolata, NH 4 + in bikarbonat. Pirimidinski obroč nastane iz karbamoil-fosfata (ta je tudi prekurzor pri sintezi uree, a pri evkariontih prva poteka v citoplazmi, slednja pa v mitohondriju ob sodelovanju različnih encimov) in aspartata. Karbamoilfosfat je iz bikarbonata, 2 fosfatnih skupin iz 2 ATP in amonijaka. Ključni encim pri sintezi obroča je aspartat-transkarbamoilaza. Ribozno-fosfatna skupina prihaja iz PRPP (fosforibozil-pirofosfata) in reagira z orotatom; nastane uridilat (UMP). Celotna sinteza pri E. coli zahteva delovanje 6 nepovezanih encimov, pri evkariontih pa je 5 od teh povezanih v dva kovalentna encimska kompleksa s tem se encimi, ki sodelujejo v isti poti, sintetizirajo hkrati, so bolj stabilni in verjetnost stranskih reakcij je zmanjšana. Aktivne oblike nukleotidov so trifosfatne. Monofosfatne prehajajo v difosfatne s pomočjo kinaz; fosfatna skupina prihaja v 1.stopnji z ATP, v drugi pa s kateregakoli NTP (difosfat-kinaze so manj specifične od monofosfat-kinaz). CTP nastaja z aminacijo UTP; pri evkariontih prihaja amino-skupina z glutamina, pri E. coli pa z amonijaka, vsakič ob porabi ATP. Purinski obroč nastaja iz aminokislin (Gly, Asp, Gln), tetrahidrofolatnih derivatov in CO 2. Riboza-fosfatni del pride tudi tu od PRPP; na njem se sintetizira obroč preko 5-fosforibozilamina (ob pretvorbi Gln v Glu). Po vezavi Gly, N 10 -formil-tetrahidrofolata (THF), Gln in ob vložku energije kot ATP nastane 5- členski obroč 5-aminoimidazol-ribonukleotida. Sledi dodajanje komponent drugega, 6-členskega obroča, kar poteka v 5 stopnjah ob dodajanju CO 2, Asp in formil-thf ter ob porabljanju ATP, izločata pa se fumarat in voda. Končni produkt teh reakcij je inozinat (IMP) s ksantinom kot purinsko bazo. IMP nato služi kot osnova za sintezo AMP (ob dodatku Asp in odcepu fumarata) in GMP (dodatek Gln in energije). Regulatorji sinteze purinov so AMP, GMP in IMP, ki delujejo kot povratni inhibitorji v več stopnjah biosinteze.

13 Deoksiribonukleotidi nastajajo z redukcijo ribonukleotid-di- ali tri-fosfatov ob delovanju encima ribonukleotid-reduktaze in z NADPH kot reducentom. Elektroni z NADPH pa prehajajo na substrat preko serije prenosnikov (flavin, mali proteini z SH-skupinami, atomi železa, ki generirajo tirozilni radikal). dtmp nastaja iz dump z metilacijo. Timidilat sintaza prenaša metilno skupino z metilen-thf, ki pri tem preide v dihidrofolat. Slednji se z reducentom NADPH regenerira v THF (+NADP + ). Več zdravil proti raku deluje na nivoju sinteze dtmp (npr. fluorouracil) ali regeneracije THF (aminopterin). NAD + (nikotinamid-adenin-dinukleotid) se sintetizira iz nikotinata (=niacin, izhaja iz triptofana) in PRPP ter amida, ki izvira iz Gln. Razgradnja nukleotidov poteka do sestavnih enot. Del baz se obnavlja skozi reciklažno pot za sintezo novih nukleotidov, del riboza-fosfata gre za prekurzorje sinteze PRPP. Purini se pri človeku v več stopnjah razgradijo do urata. Zaradi nizke topnosti (7 mg/100 ml seruma) se pri nekaterih ljudeh odlaga v ledvicah in sklepih putika. Zgradba in dinamičnost membran Membrane omejujejo celice in razdelke. Sestavljene so iz lipidov in proteinov in so selektivno prepustne. Kanali in črpalke uravnavajo sestavo celice, receptorji pa uravnavajo pretok informacij med okoljem in celico. Na membranah, bogatih z encimi, potekajo tudi procesi pretvorbe energije, kot je to pri fotosintezi in oksidativni fosforilaciji. Memebrane so debele 6-10 nm. Delež proteinov je % mase lipidov. Ogljikovi hidrati so lahko vezani na lipide ali proteine. Membranski lipidi so majhne molekule s hidrofobnim in hidrofilnim delom (amfipatične molekule): polarna glava, 2 nepolarna repa. Lipidni dvosloj se lahko ustvari spontano in predstavlja bariero za polarne molekule. Membrane so nekovalentni združki proteini in lipidi so povezani z nekovalentnimi interakcijami. Notranja in zunanja stran membrane imata različno sestavo (asimetričnost membran). Molekule v membrani niso čvrsto vezane gre za tekočo strukturo: so dvodimenzionalne raztopine orientiranih molekul. Večina membran je električno polariziranih (notranjost je 60 mv glede na zunanjost), kar je pomembno za transport, pretvorbo energije in vzdražnost. Lipidi so v vodi netopne molekule, ki v organizmu služijo kot zaloga energije, signalne molekule in sestavine membran. V membranah nastopajo predvsem fosfolipidi, glikolipidi in holesterol. Pri fosfolipidih in glikolipidih nastopajo maščobne kisline z običajno parnim številom C-atomov (14-24; najpogosteje 16 ali 18); lahko so nasičene ali nenasičene. Dolžina in nasičenost vplivata na topnost. Fosfolipidi so derivati glicerola (fosfogliceridi) ali sfingozina. Najenostavnejši fosfoglicerid je fosfatidat, pri katerem pa se fosfatna skupina pogosto zaestri z različnimi alkoholi, tako da dobimo fosfatidil-serin, f.-etanolamin, f.-inozitol, f.-holin, itd. Edini negliceridni fosfolipid v membranah je sfingomielin, pri katerem kot alkohol nastopa sfingozin, amino-alkohol z dolgo nenasičeno verigo iz ogljikovodikov, na aminsko skupino pa je vezana 1 molekula maščobne kisline. Glikolipidi imajo na sifingozin vezan mono- (cerebrozid) ali oligosaharid (do 7 enot; gangliozidi). Holesterol je evkariontski lipid, prisoten v celičnih membranah večine živalskih celic in spada med steroide iz 4 povezanih ogljikovodikovih obročev. V vodi lipidi spontano tvorijo micele (2r<20 nm) ali dvoslojne membrane (2r~1 mm) - za večino fosfo- in glikolipidov je ugodnejša tvorba membran, ker so repi preveliki za stiskanje v notranjosti micela. Membrane same težijo k zapiranju v vezikle (liposome). V laboratoriju jih lahko pripravimo sami in vanje vključimo snovi, ki jih hočemo spraviti v celico ali snovi, ki jih hočemo preučevati, kako prehajajo skozi lipidni dvosloj. Membrane so slabo prepustne za ione in polarne molekule, kar pa ne velja za vodo, ker je majhna in je njena koncentracija v celici in izven nje visoka. Prehajanje polarnih snovi omogočajo črpalke in kanalčki.

14 Večino membranskih funkcij opravljajo proteini. Integralni proteini večinoma prehajajo skozi membrano in interagirajo z ogljikovodiki lipidov. Periferni proteini pa so vezani na membrano predvsem preko elektrostatskih in vodikovih vezi; pogosto se vežejo na integralne proteine. Lipidi v membrani so mobilni; lateralna difuzija poteka hitro, transverzalna (flip-flop) pa redko (vsakih nekaj ur). Singer in Nicholson sta 1972 zato predlagala 'fluidni mozaični model' bioloških membran: membrane so dvodimenzionalne raztopine orientiranih lipidov in globularnih proteinov. Vse biološke membrane so asimetrične. Značilen primer je Na-K črpalka, ki lahko črpa Na samo iz celice in K samo v celico ob prisotnosti ATP v celici. Tudi membrane so različno zgrajene; npr. celična membrana pri Gramnegativnih in Gram-pozitivnih bakterijah. Ogljikovodikovi repi lipidov v membranah so lahko v urejeni, rigidni obliki, ali pa v neurejenem, fluidnem stanju, kar je odvisno od temperature. Temperatura prehoda med oblikama je odvisna od dolžine in stopnje nenasičenosti ogljikovodikovih verig. Rigidna oblika je bolj stabilna pri dolgih in pri nasičenih verigah kot pri nenasičenih, kjer pride do tvorbe kolena in s tem krajše regije interagiranja s sosednjim lipidom T m se zniža. Prokarionti uravnavajo fluidnost membran preko spreminjanja dolžine in nasičenosti lipidov (rast pri nižji temperaturi več nenasičenih maščobnokislinskih verig). Pri evkariontih ima regulatorno vlogo tudi holesterol; ki interagira s sosednjimi lipidnimi molekulami. Za študij evkariontskih membran so zelo primerni eritrociti, ki nimajo notranjih membran, vsebino celic pa lahko sprostimo s osmoznim šokom. Analiza membran je pokazala, da vsebujejo tudi ogljikove hidrate. Večinoma so vezani na transmembranski protein glikoforin A, ki ima na N-koncu (zunanja stran membrane) 16 glikozilacijskih mest, ki skupaj prispevajo 60% mase glikoproteina (skupaj ~100 monosaharidnih enot; pogosta je sialinska kislina, ki je negat. nabita in daje eritrocitom anionski plašč in preprečuje prijemanje na stene žil ali na druge celice). Transmembranske regije je mogoče z gotovostjo napovedati na osnovi aminokislinskega zaporedja nepolarne helikalne regije dolžine ~20 ostankov. Graf hidropatičnosti pokaže regije na proteinu, ki ustrezajo kriterijem za transmembransko regijo. Transmembranske regije pa se lahko oblikujejo tudi iz prečno razporejenih β-struktur. Membranski kanalčki in črpalke Prepustnost membran zagotavljata dve skupini alosteričnih proteinov: kanalčki in črpalke. Kanalčki omogočajo pretok ionov skozi membrano v termodinamsko ugodni smeri (olajšana difuzija ali pasivni transport), črpalke pa prenašajo ione ali molekule preko membrane ob porabi energije (kot ATP ali svetloba; aktivni transport). Acetilholin je nevrotransmiter, ki posreduje živčne impulze preko sinaps. Sinaptična reža (50 nm) ločuje predsinaptično membrano s sinaptičnimi vezikli od postsinaptične. Vezikli vsebujejo po ~ molekul acetilholina. Ob impulzu se sprosti vsebina ~300 vezikov v sinapso in koncentracija acetilholina v reži se dvigne z 10 nm na 0,5 mm v manj kot 1 milisekundi. Acetilholin se veže na postsinaptično membrano in spremeni njeno prepustnost za Na in K-ione. Na-ioni vstopajo v celico, s tem depolarizirajo membrano in sprožijo akcijski potencial. Acetilholin povzroči odprtje kationskega kanala, ki je enako prepusten za Na in K, vendar Na vstopa hitreje kot izstopa K, to pa zaradi večje razlike v koncetraciji. Acetilholinski receptor iz elektr. skata je 5-mer s 4 različnimi podenotami (skupna masa 268 kda) razmeščenimi okrog kanalčka. Vezavni mesti za acetilholin sta na sinaptični strani. Kanalček ima na konceh premer ~20 Å, v sredini, kjer je najožji, pa 10 Å. Po dodatku acetilholina se receptorski kanal prehodno odpre; steče tok 4 pa pri membranskem potencialu 100 mv, to pa ustreza pretoku 2.5 x 10 7 Na-ionov/s. Acetilholinski receptor je predstavnik z ligandom uravnavanih kanalčkov. V kratkem času po dodatku nevrotransmiterja pride do večkratnega odprtja in zaprtja kanalčka. Do vezave acetilholina pride v <100 µs. Vezava povzroči strukturno spremembo in kanalček se odpre za ~1 ms, saj acetilholin v sinaptični reži hitro razpade do acetata in holina ob delovanju acetilholin-esteraze, ki je