Molecular Cloning, Isolation and Characterization of a Pectate Lyase Gene from Grape (Vitis vinifera L. cv. Bidaneh Sefid) Berry Tissue

Transcript

1 فنآری زیستی در کشارزی/ جلد یازدهم/ شماره ال/ تابستان Summary 19 AGRICULTURAL BIOTECHNOLOGY, Vol.,11 No.1, 2012 Molecular Cloning, Isolation and Characterization of a Pectate Lyase Gene from Grape (Vitis vinifera L. cv. Bidaneh Sefid) Berry Tissue Haddad 1*, R., Moosavi, S. S., Garoosi 2, Gh., Hoseini 2, R., and Heidari Japelaghi, R. Abstract One of the important activities of the plant cell on the life cycle is to promot genes and enzyms involved in degradation of the storage components at the bigining of the fruit formation. Based on the researches, different enzymes take part in the cell wall modification and fruit tissue softening. Pectate lyase is one of the most important enzymes involved in such activities. Partial cdna of a pectate lyase gene was isolated from grape (Vitis vinifera L. cv. Bidaneh Sefid) berry tissue by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) technique and then was cloned into a puc19 plasmid. Then, molecular structur, biochemical and phylogenetic characteristics were analyzed. Nucleotide sequence of the gene, called, revealed a 429 bp long, encoding a protein of 14 amino acid residues. The calculated molecular mass and the predicted isoelectric point of the deduced polypeptide were and 6.5 kda, respectively. Analysis of secondary and three dimensional structures of the deduced polypeptide sequence for was shown that is similar to those of previouly reported pectate lyase proteins from other organisms. The deduced protein sequence was indicated a high similarity to pectate lyases isolated from plants such as Ricinus communis, Fragaria ananassa, Prunus persica, and Populus trichocarpa. Phylogenetic study was also demonstrated that gene belongs to the subgroup I of plant pectate lyases. Keywords: Grape, Pectate lyase, Softening, Cell wall, Cloning References Ashkenazy, H., Erez, E., Martz, E., Pupko, T. and Ben-Tal, N ConSurf 2010: calculating evolutionary conservation in sequence and structure of proteins and nucleic acids. Bannai, H., Tamada, Y., Maruyama, O., Nakai, K. and Miyano, S Extensive feature detection of N-terminal protein sorting signals. Bioinformatics 18(2): Barnavon, L., Doco, T., Terrier, N., Ageorges, A., Romieu, C. and Pellerin, P Analysis of cell wall neutral sugar composition, β-galactosidase activity and a related cdna clone throughout the development of Vitis vinifera grape berries. Plant Physiology and Biochemistry 8(4): Benitez-Burraco, A., Blanco-Portales, R., Redondo-Nevado, J., Bellido, M. L., Moyano, E., Caballero, J. L. and Munoz-Blanco, J Cloning and characterization of two ripening-related strawberry (Fragaria ananassa cv. Chandler) pectate lyase genes. Journal of Experimental Botany 54(8): Briesemeister, S., Rahnenführer, J. and Kohlbacher, O Going from where to why-interpretable prediction of protein subcellular localization. Bioinformatics 26(9): Czerwinski, E. W., Midoro-Horiuti, T., White, M. A., Brooks, E. G. and Goldblum, R. M Crystal structure of jun a 1, the major cedar pollen allergen from Juniperus ashei, reveals a parallel β-helical core. Journal of Biology and Chemistry 280(5): Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G. and Nielsen, H Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP, and related tools. Nature Protein 2: Felsenstein, J Confidence limit on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution 9: Gasteiger, E., Hoogland, C., Gattiker, A., Duvaud, S., Wilkins, M. R., Appel, R. D. and Bairoch, A Protein identification and analysis tools on the ExPASy server. pp: In: John M, Walker, editor. The proteomics protocols handbook. Totowa, NJ: Humana Press. Geourjon, C. and Deleage, G SOPMA: significant improvement in protein secondary structure prediction by consensus prediction from multiple alignments. Cabios 11: Heidari Japelaghi, R., Haddad, R., and Garoosi, G. A Rapid and efficient isolation of high quality nucleic acids from plant tissues rich in polyphenols and polysaccharides. Molecular Biotechnology 49: Jimenez-Bermudez, S., Redondo-Nevado, J., Munoz-Blanco, J., Caballero, J. L., Lopez-Aranda, J. M, Valpuesta, V., Pliego-Alfaro, F., Quesada, M. A. and Mercado, J. A Manipulation of strawberry fruits softening by antisense expression of a pectate lyase gene. Plant Physiology 128: , 2 and. Associate Professor, Assistant Professors and Graduate Students respectively, Department of Agricultural Biotechnology, Technical and Engineering Faculty, Imam Khomeini International University, Qazvin *: Corresponding author raheemhaddad@ikiu.ac.ir 21 7

2 2012 همسانهسازی No.1,,11 ملکلی Vol. جداسازی تصیف یک BIOTECHNOLOGY, ژن پکتات لیاز از... AGRICULTURAL Summary Kim, Y. J., Shim, J. S., Krishna, P. R., Kim, S. Y., In, J. G., Kim, M. K. and Kim, D. C Isolation and characterization of a glutaredoxin gene from Panax ginseng C. A. Meyer. Plant Molecular Biology Report 26: Kudla, U., Milac, A. L., Qin, L., Overmars, H., Roze, E., Holterman, M., Petrescu, A. J., Goverse, A., Bakker, J., Helder, J. and Smant, G Structural and functional characterization of a novel, host penetration-related pectate lyase from the potato cyst nematode Globodera rostochiensis. Molecular Plant Pathology 8(): Kyte, J. and Doolittle, R. F A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. Journal Molecular Biology 157: Nimrod, G., Schushan, M., Steinberg, D. M. and Ben-Tal, N Detection of functionally important regions in hypothetical proteins of known structure. Structure 16: Nunan, K. J., Davies, C., Robinson, S. P. and Fincher, G. B Expression patterns of cell wall-modifying enzymes during grape berry development. Planta 214: Popeijus, H., Overmars, H., Jones, J., Blok, V., Goverse, A., Helder, J., Schots, A., Bakker, J. and Smant, G Degradation of plant cell walls by a nematode. Nature 406: 6 7. Pua, E. C., Ong, C. K., Liu, P. and Liu, J. Z Isolation and expression of two pectate lyase genes during fruit ripening of banana (Musa acuminata). Physiologia Plantarum 11(1): Rychlik, W OLIGO 7 primer analysis software. Methods in Molecular Biology 402: Sambrook, J. and Russell, D. W Molecular cloning: a laboratory manual. nd ed. Vol:1-. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA. Seymour, G. B. and Gross, K. C Cell wall disassembly and fruit softening. Postharv News Information 7: 45N 52N. Tamura, K., Dudley, J., Nei, M. and Kumar, S MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology Evolution 24: Truong, L. V., Tuyen, H., Helmke, E., Binh, L. T. and Schweder, T Cloning of two pectate lyase genes from the marine Antarctic bacterium Pseudoalteromonas haloplanktis strain ANT/505 and characterization of the enzymes. Extremophiles 5: Xiao, Z., Bergeron, H., Grosse, S., Beauchemin, M., Garron, M. L., Shaya, D., Sulea, T., Cygler, M. and Lau, P. C. K Improvement of the thermostability and activity of a pectate lyase by single amino acid substitutions, using a strategy based on melting-temperature-guided sequence alignment. Applied Environ Microbiology 74(4): Zhang, Y I-TASSER server for protein D structure prediction. BMC Bioinformatics 9:40. Zhao, Q., Yuan, S., Zhang, Y., Zhu, H., Dai, C., Yang, F. and Han, F Expression, purification and characterization of pectate lyase A from Aspergillus nidulans in Escherichia coli. World Journal of Microbiology and Biotechnology 2:

3 فنآری زیستی در کشارزی/ جلد یازدهم/ شماره ال/ تابستان 19 همسانهسازی ملکلی جداسازی تصیف یک ژن پکتات لیاز از بافت حبه انگر بیدانه سفید (Vitis vinifera L. cv. Bidaneh Sefid) Molecular Cloning, Isolation and Characterization of a Pectate Lyase Gene from Grape (Vitis vinifera L. cv. Bidaneh Sefid) Berry Tissue رحیم حداد سید شرف الدین مسی قاسمعلی گرسی رامین حسینی رضا حیدری جاپلقی چکیده یکی از فعالیتهای مهم سللهای گیاهی در دره رشد آن فعال نمدن ژنهای عامل آنزیمهای مثر در تجزیه برخی ماد ذخیره شده در مراحل الیه تشکیل میه است. بر اساس مطالعات انجام شده آنزیمهای مختلفی در تخریب دیاره سللی نرم شدن بافت میه نقش دارند. از مهمترین این آنزیمها آنزیم پکتات لیاز میباشد. در این مطالعه cdna ناقص یکی از ژنهای پکتات لیاز از بافت حبه انگر بیدانه سفید معکس )Vitis vinifera L. cv. Bidaneh Sefid( )Reverse Transcriptase-PCR( جداسازی در ناقل puc19 فیلژنتیکی آن مرد بررسی قرار گرفت. تالی نکلئتیدی این ژن تحت عنان با استفاده از تکنیک اکنش زنجیرهای پلیمراز نسخهبرداری همسانهسازی ساختار ملکلی یژگیهای بیشیمیایی 94 بده یک پرتئین با 92 bp بهطل اسیدآمینه را رمز میکند. زن ملکلی محاسبه شده نقطه ایزالکتریک پیشبینی شده این پرتئین بهترتیب برابر 1/87 کیل دالتن 6/12 میباشد. بررسی ساختارهای دم سم تالی پرتئینی نشان داد که این پرتئین از نظر ساختاری مشابه با تالیهای پکتات لیاز گزارش شده از مجدات دیگر میباشد. تالی پرتئینی بهدست آمده شباهت زیادی را با تالیهای پکتات لیاز سایر گیاهان از قبیل Prunus persica Fragaria ananassa Ricinus communis فیلژنتیکی نیز مشخص کرد که این ژن به زیرگره Populus trichocarpa I پکتات لیازهای گیاهی تعلق دارد. نشان داد. بررسی کلمات کلیدی: انگر پکتات لیاز نرمشدگی دیاره سللی همسانهسازی 2 )ره( قزین 2. بهترتیب دانشیار استادیاران دانشآمختگان کارشناسی ارشد گره بیتکنلژی کشارزی دانشکده فنی مهندسی دانشگاه بینالمللی امام خمینی *: نیسنده مسئل raheemhaddad@ikiu.ac.ir

4 همسانهسازی ملکلی جداسازی تصیف یک ژن پکتات لیاز از... مقدمه یکی از یژگیهای مهم میهها نرم شدن بافت آنها است که حاصل مجمعهای از تغییرات آنزیمی غیر آنزیمی در سخت ساز ساختار دیاره سللی بده تغییر بافت را در پی دارد.)Barnavon et al. 2000( دیارههای سللی مسل یکپارچگی شکلدهی بافتها بده عاله بر عامل تعیین کننده در عملآری میه بهعنان مانعی فیزیکی در برابر تهاجم عامل بیماریزا عمل نمده با تامین قطعات پکتیکی نیز مجب پاسخهای نمی دفاعی در سللهای میه نارس میشند.)Seymour & Gross, 1996( در گیاهان عالی در حدد %49 از ماد الیه دیاره سللی شامل پلی ساکاریدهای سللز همیسللز پکتین بده مابقی آن را پرتئینهای ساختاری تشکیل میدهد Nunan et al. ( در فرآیند 2001(. رسیدگی میهها پلیمرهای پکتیکی همیسللزی شکسته شده زنجیره طیل پکتین هضم شده قندهای خاصی مانند گاالکتز آرابینز از دیاره سللی جدا میشند. این تغییرات استحکام دیاره سللی اتصاالت بین سللی را کاهش داده منجر به نرم شدن بافت میه رسیدن آن تسط عمل هماهنگ هیدرالزهای مختلف دیاره بهیژه سللی پکتات لیازها )EC (.)Nunan et al. 2001( میشد این حادث در رشد نم حبه انگر ).L )Vitis vinifera قابل تجه میباشند بهیژه در مرحله دگرفرمی که با نرم شدگی سریع سایر تغییرات از قبیل افزایش رشد تجمع گلکز فرکتز کاهش سطح اسیدهای آلی آغاز تغییر رنگ در رقمهای رنگی همراه است.)Barnavon et al. 2000( تاکنن پژهشهای زیادی در زمینه همسانهسازی بررسی فعالیت کاتالیتیکی جداسازی آنزیمهای تخریب کننده دیاره سللی نیز به تاخیر انداختن نرمشدگی بافت میه با استفاده از تکنیک بازداری آنتیسنس در گیاهان مختلف انجام شده است. ننان همکاران ( al. Nunan et 2001( با بررسی فعالیت آنزیمهای درگیر در تخریب دیاره سللی در طل رشد نم حبه انگر رقم کرد نشان دادند که رنشتهای آنزیم پکتات لیاز در طل فرآیند رسیدگی به میزان زیادی جد داشته نشان دهنده نقش مهم این آنزیم در فرآیند تخریب دیاره سللی نرمشدگی بافت میه 2 است. در پژهش دیگری در گیاه تتفرنگی رقم چاندلر بنیتز براک همکاران )200 al. )Benitez-Burraco et د ژن پکتات لیاز تحت عناین را از بافت FaPelB FaPelA میه جداسازی همسانهسازی نمده با بررسی لکه گذاری سادرن نشان دادند که برخالف ژن FaPelB که تنها دارای یک نسخه میباشد ژن FaPelA تسط یک خاناده چند ژنی کچک رمز میگردد. همچنین بررسی گیاهان تراریخته این رقم تسط جیمنز برمدز همکاران ( Jimenez-Bermudez )et al ژن پکتات لیاز از نشان داد که آنها حای یک تالی آنتیسنس بده بهطریکه میههای مرحله رسیدگی کامل در مقایسه با شاهد تراریخته در هیچگنه تفات معنیداری از نظر رنگ اندازه شکل زن نداشته حتی در اغلب الینهای تراریخته میههای رسیده بهطر معنیداری سفتتر از میههای شاهد بدند. تالی هدف از این مطالعه جداسازی همسانهسازی یک رمز ناقص cdna کننده پکتات لیاز تحت عنان از بافت حبه انگر بیدانه سفید )Vitis vinifera L. cv. Bidaneh Sefid( تا در میباشد پژهشهای آتی بتان از آن در جهت به تاخیر انداختن نرم- شدگی بافت حبه انگر با استفاده از تکنیک بازداری آنتی- سنس استفاده ساختارهای د همچنین نمد. بعدی سه خصصیات بیشیمیایی بعدی تالی پرتئینی بهدست آمده با استفاده از یک ژن پکتات لیاز بهعنان الگ از گیاه سر )Juniperus ashei( پیشبینی شد. بررسی هملژی فیلژنتیکی ژن همسانه شده نیز برای تعیین جایگاه آن در گره ژنهای پکتات لیاز انجام شد. ماد رشها ماد گیاهی استخراج RNA کل سفید بافت حبه در مرحله دگرفرمی از مزارع انگر سازمان تحقیقات ایستگاه کشارزی از گیاه انگر بیدانه تحقیقات انگر ابسته به منابع طبیعی استان قزین اقع در شهر تاکستان )استان قزین( جمعآری پس از تزین یک نمنههای گرمی درن رقههای آلمینیمی بستهبندی شده بالفاصله درن ازت مایع تثبیت گردید. نمنهها سریعا به آزمایشگاه انتقال داده شده در دمای 79- درجه سانتیگراد تا زمان استفاده نگهداری شدند. RNA کل از با استفاده استخراج گردید مبتنی بر رش CTAB.)Heidari Japelaghi et al. 2011( در مقیاس کچک 9 1. Veraison 2. V. vinifera cv. Gordo. Fragaria ananassa cv.chandler

5 فنآری زیستی در کشارزی/ جلد یازدهم/ شماره ال/ تابستان 19 سنتز رشته ال cdna اکنش Reverse Transcriptase -PCR رشته ال cdna کل تیمار شده با آنزیم آنزیم نسخهبردار معکس با استفاده از 1µg محلل RNA )Fermentas( RNase-free DNase I RevertAid TM M-MuiV )Fermentas( آغازگرهای )Qiagen( Oligo (dt) 18 سنتز گردید. اکنش نسخهبرداری در دمای 9 درجه سانتیگراد بهمدت یک ساعت انجام عمل غیر فعالسازی آنزیم نسخه- بردار معکس (RT) در دمای 89 درجه سانتیگراد به مدت 9 دقیقه صرت گرفت. بدین ترتیب از رشته ال ملکل cdna اکنش ژن ملکل RNA-DNA Reverse Transcriptase-PCR با استفاده از آنزیم ساخته شده بهعنان الگ در استفاده گردید. تکثیر )Fermentas( Pfu آغازگرهای الیگنکلئتیدی طراحی شده بر اساس تالی نکلئتیدی ژن پکتات لیاز )با شماره دستیابی با استفاده از نرمافزار )AY نسخه Oligo.)Rychlik, 2007( انجام شد آغازگرهای اختصاصی شامل سه نکلئتید اضافی جایگاه شناسایی آنزیم برشی بدند که تسط شرکت مخلط اکنش در حجم نهایی 1 در انتهای BamHI Metabion 19µl آلمان سنتز شدند. حای Tris- )ph 8.8( 2 mm 10 mm KCl 10 mm (NH 4 ) 2 SO 4 20 mm 0.1 mg/ml BSA 0.1% Triton X-100 HCl MgSO µm برگشت( از هر 50 pm dntp DNA 100 ng الگ از هر آغازگر 1.25 pfu DNA polymerase Reverse Transcriptase-PCR ترمسایکلر مرد استفاده قرار گرفت. Techne-TC512( انگلستان( 21 با استفاده از )رفت احد از آنزیم اکنش دستگاه قابل برنامهریزی در چرخه دمایی انجام شد که شرایط دمایی زمانی هر چرخه شامل: مرحله اسرشتگی در دمای 49 درجه سانتی- گراد بهمدت 29 ثانیه مرحله اتصال در دمای درجه 17 سانتیگراد بهمدت یک دقیقه مرحله تکثیر در دمای 8 درجه سانتیگراد بهمدت یک دقیقه بد. اسرشتگی الیه در دمای 49 همچنین مرحله درجه سانتیگراد بهمدت 2 دقیقه مرحله تکثیر نهایی در دمای 8 درجه سانتیگراد به مدت استفاده تالی 9 دقیقه انجام گرفت. شامل آغازگرهای اختصاصی مرد آغازگر رفت با 5'-TACGGATCCGTCAATGTCCACATTGCTAA-' آغازگر برگشت با تالی بد. از همسانهسازی تالییابی cdna رمزکننده پس خالصسازی محصل Reverse Transcriptase-PCR از کیت استخراج اسید نکلئیک ( با اندازه مرد نظر از ری ژل با استفاده GF-1 PCR Clean Up )Kit-Vivantis ژن مرد نظر ناقل پالسمیدی puc19 )Fermentas( گردیده تیمار تسط آنزیم برشی مجددا )Fermentas( BamHI خالصسازی شدند. اتصال با استفاده از آنزیم DNA لیگاز سپس اکنش )Fermentas( T4 انجام گرفته محلل اتصال به رش شک حرارتی به سللهای مستعد باکتری شد Escherichia coli.)sambrook & Russell, 2001( سیه DH5α انتقال داده با انجام آزمن سفید- آبی تعدادی کلنی بهعنان کلنیهای نترکیب انتخاب شده پالسمیدهای نترکیب استخراج گردیده آنزیمی مرد بررسی رش تحلیل با با استفاده از د تکنیک قرار گرفتند دقیقتر قلیایی با SDS PCR ( برش Sambrook &.)Russell, 2001 تالییابی DNA استفاده از آغازگرهای راهانداز باکتریفاژ برگشت تسط شرکت پالسمید نترکیب با T7 Seqlab آلمان انجام شد. در د جهت رفت بررسی تالی پیشبینی ساختارهای دم سم پرتئین به دست آمده از تالی نکلئتیدی حاصل از فرآیند تالییابی با استفاده از برنامه Translate ) مرد ترجمه قرار گرفته خصصیات بیشیمیایی تالی اسیدآمینهای بهدست آمده با استفاده از برنامههای ProtScale )Gasteiger et al. 2005( ProtParam ( TMHMM ( services/) ml) بررسی قرار گرفت. زیرسللی ژن TargetP همچنین مرد پیشبینی مقعیت با استفاده از ترکیبی از سه برنامه ipsort )Emanuelsson et al. 2007( )Bannai et al. 2002( Briesemeister et al. ( YLOC )2010 انجام گرفت. ساختار دم تالی پرتئینی استفاده از برنامههای ( SOPMA با Geourjon & Deleage, 1995( ( PSIpred گردیده ساختار سم تسط برنامه تعیین I-TASSER )Zhang, 2008( پکتات لیاز از گیاه سر الگ یک با استفاده از ساختار کریستالی پرتئین )J. ashei: PDB ID 1PXZ( مرد پیشبینی قرار گرفت. بهعنان اسیدهای آمینه 5'-ATCGGATCCCACCACATGGAAATATCCAT-' 1. Sequence Laboratories Gottingen 1

6 همسانهسازی ملکلی جداسازی تصیف یک ژن پکتات لیاز از... 6 مهم از نظر ساختاری فعالیت حفظ شده در طی تکامل نیز تسط برنامههای )Ashkenazy et al. 2010( Conseq 2008( al. )Nimrod et شناسایی شدند. PatchFinder بررسی فیلژنتیکی تالی اسیدآمینهای بهدست آمده بهمنظر یافتن پرتئینهای مشابه در بانکهای اطالعاتی با استفاده از الگریتم BLASTp در مرکز ملی اطالعات بیتکنلژی مرد جستج قرار گرفته تعدادی تالی پرتئینی از منابع مختلف که بیشترین شباهت را با تالی مرد نظر داشتند انتخاب شدند. همردیفسازی چندگانه تالی پرتئینی تالیهای بهدست آمده بهمنظر شناسایی ناحی حفظ شده در طی تکامل با استفاده از نرمافزار ClustalW2 در مسسه بیانفرماتیک ارپا ( انجام شد. یک درخت فیلژنتیکی بهرش با استفاده از نرمافزار Neighbor Joining MEGA4.1 Beta 2 (Tamura et al. 2007) ساخته شده بررسی Bootstrap 999 شاخهها نیز تکرار بهمنظر بهدست آمدن انجام گردید حدد اطمینان.)Felsenstein, 1985( با برای شماره دستیابی تالیهای پرتئینی مجد در پایگاههای اطالعات تالی SwissProt NCBI EMBL مرد استفاده جهت بررسیهای همردیفسازی چندگانه رابط فیلژنتیکی در جدل یک آمده است. نتایج بحث همسانهسازی بررسی تالی نکلئتیدی بیشیمیایی پرتئین به دست آمده cdna رمزکننده Reverse Transcriptase-PCR سفید جداسازی در ناقل پالسمیدی شده نتایج تالییابی بررسی با برنامه خصصیات با استفاده از تکنیک از بافت حبه انگر بیدانه puc19 nblast همسانهسازی نشان داد که قطعه همسانهسازی شده در جهت معملی یک ژن پکتات لیاز میباشد )شکل (. cdna ثبت شده در پایگاه تالی نکلئتیدی شماره دستیابی کدن رمزکننده NCBI GenBank HQ522 بهطل 94 bp GTC )رمزکننده اسیدآمینه الین( با بده که با آغاز شده با کدن GTG )رمزکننده اسیدآمینه الین( خاتمه یافته یک پرتئین با اسیدآمینه را 92 )شکل مینماید رمز بررسی خصصیات بیشیمیایی پرتئین بهدست آمده با استفاده از برنامه محاسبه ProtParam زن ملکلی نشان داد که شده نقطه ایزالکتریک پیشبینی شده پرتئین با فرمل ملکلی C 689 H 1054 N 206 O 202 S 10 بهترتیب برابر 1/87 کیل دالتن 6/12 میباشد. شاخص آلیفاتیک آن بهعنان یک عامل مهم بهمنظر برآرد مقامت پرتئین ها در برابر حرارت 7/91 محاسبه گردید که نشان دهنده مقام بدن ژن.)Kim et al. 2008( آزمایش محاسبه شده در برابر حرارت میباشد همچنین شاخص ناپایداری آن در لله با استفاده از برنامه در ProtParam حدد 2/8 بده در رسته پرتئینهای پایدار تقسیمبندی 2 میشد 2005( al..)gasteiger et شاخص آبگریزی محاسبه شده به رش کیت دلیتل ( Doolittle, Kyte & 1982( نشان داد که پرتئین با داشتن ناحی آب- 9 گریز به میزان زیادی آبگریز بده )شکل B( از مجمع کل اسیدهای آمینه اسیدآمینه با بار منفی )Asp+Glu( داشته در حالیکه تعداد کل اسیدهای آمینه با بار مثبت آن )Arg+Lys( برابر 7 میباشد. بررسی تالی اسیدآمینهای متیفهای ساختاری پرتئین به دست آمده تالی پلیپپتیدی بهدست آمده از مشابه با سایر تالیهای پکتات لیاز گیاهان حای یک جایگاه فعال با شش اسیدآمینه R 11 MPRCR 16 )Arg11-Met12-Pro1-Arg14-Cys15-Arg16( میباشد. نشان میدهد به هر حال بررسی تالیهای پکتات لیاز گیاهان چهار که تنها اسیدآمینه Pro1 Arg11 Arg14 Arg16 بنابراین جایگاه فعال شکل RxPRxR جایگاه فعال تالی جایگاه فعال در طی تکامل حفظ شدهاند در تالیهای پکتات لیاز گیاهی نشان داده میشد به.(Czerwinski et al. 2005) )Arg + ( دارای سه اسیدآمینه با بار مثبت میباشد که نقش مهمی را در اکنش آنزیم با غشای میانی دیاره سللی در نتیجه تخریب هضم دیاره ایفا مینمایند.)Czerwinski et al. 2005( فعال پرتئین تالیهای پرتئینی برخالف تالی جایگاه CuPel )Citrus unshiu( از سر JaPel جای اسیدهای آمینه حفظ شده متئنین )J. ashei( )Met( )Cys( ایزلسین در جایگاه فعال خدشان )Ile( آالنین )Ala( دارای میباشند. از نارنگی بهترتیب به سیستئین اسیدهای آمینه تالی همچنین. Hydropathy 4. Hydrophobic.)A 1. National Center for Biotechnology Information (NCBI) 2. European Bioinformatics Institute

7 فنآری زیستی در کشارزی/ جلد یازدهم/ شماره ال/ تابستان 19 G. rostochiensis جایگاه فعال ( 210 )G 205 LTLYG لیاز نماتد در تالی پرتئینی پکتات با پرتئین Globodera rostochiensis سایر تالیهای پکتات لیاز گیاهان متفات بده فاقد هر.)Popeijus et al. 2000( گنه اسیدآمینه با بار مثبت میباشد بر اساس همردیف سازی چندگانه تالی پرتئینی با تالیهای پرتئینی پکتات لیاز از سایر گیاهان چهار Asp75 Asp5 Asp51 اسیدآمینه آسپارتات با مقعیتهای Asp79 شناسایی شدند که با اسیدهای آمینه آسپارتات حفظ شده در طی تکامل مجد در تالیهای پرتئینی پکتات لیاز گیاهان منطبق میباشند )شکل 6B(. اسیدهای آمینه آسپارتات ظیفه اتصال ین 2+ Ca به تالی پرتئینی آنزیم را ایفا نمده بهدنبال آن مجب فعال شدن آنزیم می- گردند 2007( al..)benitez-burraco et al. 200; Kudla et بررسی تالیهای پرتئینی قارچها باکتریها نماتد آسپارتات درگیر در اتصال با ین نشان داد که تعداد اسیدهای آمینه 2+ Ca در مقایسه با تالی پرتئینی گیاهان کمتر بده بهترتیب شامل 2 2 اسیدآمینه میباشند. متیفهای ساختاری حفظ شده در طی تکامل در تالیهای پرتئینی پکتات لیاز گیاهان در تالی پرتئینی نیز مشاهده میشند )2001 al..)truong et بر این اساس سه متیف ساختاری در تالی پرتئینی شناسایی گردید که عبارتند از: )W 64 VDH 67 ( I )D 75 GLVDAVMGSTAITISNNHF 94 ( II )L 128 IQRMPRCRHGYFHVV 14 ( III II Asp79 Asp75 - متیف - متیف - متیف اسیدهای آمینه به متیف تعلق دارند. به متیف جایگاه فعال III جدل : مشخصات تالیهای پرتئینی مرد استفاده برای تهیه همردیفسازی چندگاانه ساخت درخت فیلژنتیکی به همراه شماره دستیابی مجد در پایگاههای اطالعات تالی SwissProt NCBI EMBL Table 1. The protein sequences characteristics on NCBI, SwissProt and EMBL used for preparation of multiple alignment and construction of phylogenetic tree with their accession Nos نام علمی نام ژن شماره دستیابی Accession Number NP_ CAE02420 AAY85180 AF9025 AF9024 NP_ XP_ BAE PXZ_A ACU21247 AAQ84042 XP_ ADD6292 XP_ ABQ45845 AJ2761 CH CH AF15698 AF05262 P29155 P18210 AL99110 AF Gene Name AtPel OsPel GhPel FaPelA FaPelB ZmPel SbPel PmPel JaPel GmPel MdPel RcPel PpPel PtPel CuPel AnPelA AtPelB AtPelC CgPel1 GcPelB EcPelA EcPelE ScPel GrPel1 Scientific Name Arabidopsis thaliana Oryza sativa Gossypium hirsutum Fragaria ananassa Zea mays Sorghum bicolor Prunus mume Juniperus ashei Glycine max Malus domestica Ricinus communis Prunus persica Populus trichocarpa Citrus unshiu Aspergillus niger Aspergillus terreus Colletotrichum gloeosporioides Glomerella cingulata Erwinia chrysanthemi Streptomyces coelicolor Globodera rostochiensis نام گیاه Plant Name Arabidopsis Rice Cotton Strawberry Maize Giant millet Apricot Cypress Soybean Apple Castor been Peach Poplar Tangerine Fungi Bacteria Nematode ردیف No

8 همسانهسازی ملکلی جداسازی تصیف یک ژن پکتات لیاز از... A B C شکل : RT-PCR تایید کلنیهای نترکیب ساختار ناقل نترکیب A( puc19- تکثیر ژن الکترفرز ری ژل آگارز / درصد که منجر به تلید یک تک باند منفرد شده است. M( نشانگر ملکلی با استفاده از تکنیک ) ژن kb تکثیر شده از بافت حبه ( ژن تکثیر شده از بافت برگ. B( تایید کلنیهای نترکیب با استفاده از هضم آنزیمی ( پالسمید غیر نترکیب هضم نشده ( پالسمید غیر نترکیب BamHI kb RT-PCR الکترفرز ری ژل آگارز / درصد. M( نشانگر ملکلی 2( پالسمید نترکیب هضم نشده 9( پالسمید نترکیب حای ژن هضم شده با آنزیم BamHI ناقل نترکیب حای ژن در جهت معملی ری جایگاه چندگانه برای همسانهسازی هضم شده با آنزیم )MCS( میباشد. )Ap R ( lacz ژنهای )pmb1( )1 ژن )C. تالی مسئل رنشتبرداری ناقل نترکیب مقامت به آمپیسیلین سازی ری ناقل نترکیب نیز نشان داده شدهاند جایگاه چندگانه برای همسانه- Figure 1: The RT-PCR, analysis of recombinant clones and structure of puc19- recombinant vector. A) The amplification of the gene using RT-PCR and 1.2% agarose gel electrophoresis that it has produced a single band. M) 1 kb DNA ladder, 1) The gene from berry tissue, 2) The gene from leaf tissue. B) Analysis of recombinant clones by enzymatic digestion and 1.2% agarose gel electrophoresis. M) 1 kb DNA ladder, 1) Nonrecombinant and non-digested plasmid, 2) Non-recombinant plasmid digested by BamHI, ) Recombinant and nondigested plasmid, 4) Recombinant plasmid digested by BamHI, 5) gene. C) The recombinant vector contains gene in correct direction into multiple cloning site (MCS). The pmb1 sequence, lacz gene, Ap R gene, and MCS have been also indicated on recombinant vector. پیشبینی مقعیت زیرسللی ترکیبی از سه برنامه با استفاده از YLOC نشان داد TargetP ipsort که متعلق به اندامکهای سللی نبده به احتمال %44/41 به مسیرهای ترشحی تعلق دارد. همچنین بررسیها با برنامه TMHMM نشان داد که با داشتن یک دمین غشایی در انتهای آمینی خد به عنان یک پرتئین خارج سللی شناخته میشد )شکل 2A(. مقعیت اسیدهای آمینه مهم از نظر ساختاری فعالیت حفظ شده در طی PatchFinder تکامل که تسط برنامههای ConSeq تالی پرتئینی در شناسایی شدهاند 2B( )شکل عبارتند از: Val1- Val- Ile20- Asp51- Gly52- Asp5- Trp64- Asp66- His67- Asp75- Gly76- Asp79- Ser84- Thr85- Thr88- Ser90- His97- Leu102- Gly104- Asp107- Asp112- Met115- Ala120- Asn122- Gln10- Arg11- Pro1- Arg14- Arg16-Gly18- His141- Val Secreted Pathway

9 فنآری زیستی در کشارزی/ جلد یازدهم/ شماره ال/ تابستان 19 A B شکل : تالی نکلئتیدی پرتئینی شاخص Hydropathic ژن )A. تالی نکلئتیدی پرتئینی ژن نکلئتیدها اسیدهای آمینه به ترتیب در سمت چپ راست آرده شدهاند. متیفهای ساختاری. شماره II I III آبی قرمز سبز اسیدهای آمینه مجد در جایگاه فعال اسیدهای آمینه آسپارتات درگیر در اتصال با ین کادرهای مستطیلی دایرهای شکل نشان داده شدهاند. B( بررسی شاخص به ترتیب با رنگهای Ca +2 Hydropathic تالی پرتئین در باال دمینهای آبدست در زیر خط قرمز رنگ قرار دارند.. نیز به ترتیب با دمینهای آبگریز Figure 2: Nucleotide and deduced amino acid sequences, and Hydropathic index of gene. A) Nucleotide and deduced amino acid sequences of gene. Nucleotide and amino acid residue numbers are shown on the left and right, respectively. The structural motifs of I, II, and III are indicated in blue, red, and green, respectively. The putative active site sequence and aspartate (Asp) residues involved in binding with Ca +2 are shown by rectangular and circular boxes. B) Hydropathic index analysis of deduced protein sequence. Hydrophobic domains are indicated by positive numbers; hydrophobic domains are above the line, and hydrophilic domains are below. بررسی ساختار دم تالی پرتئینی بررسی ساختار دم تالی پرتئینی استفاده از برنامه PSIpred با نشان داد که این پرتئین مشابه با سایر تالیهای پکتات لیاز از مجدات دیگر حای 4 صفحه کچک میباشد β تنها یک مارپیچ با آرایش α مابین صفحات β8 β9 در ناحیه مارپیچ پیچیده اقع شده اسیدهای آمینه آسپارتات درگیر در اتصال با ین 2+ Ca به جز اسیدآمینه Asp79 تشکیل دهنده صفحه β5 همگی در ناحیه مارپیچ پیچیده قرار دارند. همچنین متیف- های ساختاری II I III به گنهای سازماندهی شدهاند که بخشی از تالی آنها تشکیل دهنده صفحه یا صفحات β بخش دیگر تشکیل دهنده مارپیچهای پیچیده میباشند. ββαβββββββ Czerwinski et al. Benitez-Burraco et al. 200;( جایگاه فعال.)9A )شکل )2005; Xiao et al Coiled Coil 4

10 همسانهسازی ملکلی جداسازی تصیف یک ژن پکتات لیاز از....)Benitez-Burraco et al. 200; Zhao et al. 2007( ساختار دم تالی پرتئینی تسط برنامه SOPMA نیز مرد بررسی قرار گرفته مشاهده شد که این آنزیم حای 6 مارپیچ پیچ 9 )%24/6( )%/4( 16 صفحه β )%4/84( 18 مارپیچ تصادفی )%24/76( میباشد α β )شکل 9B(. این نتایج با ساختار دم تالی پلیپپتیدی FaPelA از تتفرنگی )F. ananassa( که حای 7 مارپیچ α )%24/6( متصل شده تسط 2 پیچ PtPel )%1/14( 16 صفحه β )%4/94( 66 مارپیچ تصادفی )%96/1( ژن β صنبر صفحه )Populus trichocarpa( با 4 مارپیچ α از مقایسه با مارپیچهای JaPel ژن از سر )J. ashei( α در حای کمتری میباشد. این ژن شامل مارپیچ α )%99( متصل شده تسط 2 پیچ β )%9/64( 17 صفحه β )%7/48( 82 مارپیچ تصادفی )%19/29( میباشد.)Czerwinski et al. 2005( دبعدی همچنین مقایسه ساختار با ژنهای پکتات لیاز از نماتد rostochiensis قارچها باکتریها نشان داد که تشابه زیادی با نماتد G. G. rostochiensis قارچها داشته اما در مقایسه با باکتریها مارپیچ پیچیده کمتری دارد.)9B )شکل )Popeijus et al. 2000( 16 )%6/4( )%7/24( )%24/6( متصل شده تسط پیچ β 66 مارپیچ تصادفی )%96/1( تشابه زیادی را نشان داد β B A شکل 2: بررسی شاخص TMHMM شناسایی اسیدهای آمینه مهم از نظر ساختاری فعالیت در تالی پرتئینی. A( بررسی دمینهای غشایی تالی پرتئینی با استفاده از شاخص.TMHMM تالی پرتئینی به دست آمده با داشتن یک دمین غشایی میتاند به غشای پالسمایی متصل شده مجب تخریب دیاره سللی شد. B( شناسایی اسیدهای آمینه مهم از نظر ساختاری فعالیت بررسی میزان حفظشدگی آنها در طی تکامل. حفظشدگی اسیدهای آمینه از متغیر تا کامال حفظ شده به ترتیب از رنگ سبز تیره تا قرمز تیره نشان داده شده است. e: نشان دهنده یک اسیدآمینه قرار گرفته در معرض حالل b: نمایانگر یک اسیدآمینه مخفی شده در از حالل f: یک اسیدآمینه مهم از نظر فعالیت s: یک اسیدآمینه مهم از نظر ساختاری Figure : TMHMM index analysis and identification of functional and structural important residues in deduced protein sequence. A) Analysis of membrane domains of deduced protein sequence by TMHMM program. The deduced protein sequence contains a membrane domain, binding to plasma membrane and modifying cell wall. B) Identification of functional and structural important residues and conserved residue analysis of. Residue conservation from variable to conserved is shown in green to dark red, respectively. e: An exposed residue according to the neural-network algorithm; b: A buried residue according to the neural-network algorithm, f, A predicted functional residue (highly conserved and exposed), s: A predicted structural residue (highly conserved and buried) بررسی ساختار سم تالی پرتئینی با استفاده از ژن JaPel به عنان یک الگ برای مدل- سازی مقایسهای یک ساختار سهبعدی برای تالی پرتئینی گرفت. تسط برنامه I-TASSER پکتات لیاز از مجدات مختلف مرد پیشبینی قرار مشابه با ساختار سهبعدی تمام تالیهای Czerwinski et al. 2005; ( )Xiao et al شامل 4 صفحه کچک β α یک مارپیچ بده که به شکل یک مارپیچ راستگرد با 4 صفحه β مرکزی احاطه شده تسط یک مارپیچ α طری در فضای سهبعدی آرایش مییابد که جایگاه فعال R 11 MPRCR 16 در انتهای آمینی صفحه ربان β9 قرار میگیرد )شکل 1A(. مدل به همراه مقعیت قرارگیری صفحات β مارپیچ α جایگاه فعال متیفهای ساختاری اسیدهای آمینه آسپارتات درگیر در اکنش با ین Ca در شکل +2 1B نمایش داده شدهاند. اسیدهای آمینه باردار آبدست آب- گریز تزیع اسیدهای آمینه مهم از نظر ساختاری فعالیت به همراه سطح اندرالس در پرتئین شکلهای 1C 1D به ترتیب در نشان داده شدهاند. همچنین شکل مقعیت قرارگیری متیفهای ساختاری )I سطح پرتئین را نشان میدهد. 1E در )III II 29

11 فنآری زیستی در کشارزی/ جلد یازدهم/ شماره ال/ تابستان 19 A B شکل 9: بررسی ساختار دم تالی پرتئینی A(. ساختار دم تالی پرتئینی های ساختاری با استفاده از برنامه.PSIpred II I درگیر در اتصال با ین III متیف- به ترتیب با رنگهای آبی قرمز سبز اسیدهای آمینه مجد در جایگاه فعال اسیدهای آمینه آسپارتات 2+ Ca نیز به ترتیب با کادرهای مستطیلی دایرهای شکل نشان داده شدهاند. B( ساختار دم تالی پرتئینی با استفاده از برنامه SOPMA مقایسه آن با تالیهای پکتات لیاز ازمجدات دیگر. مارپیچهای α صفحات β پیچهای مارپیچهای تصادفی به ترتیب با خطط آبی قرمز سبز بنفش نشان داده شدهاند β Figure 4: Analysis of secondary structure of deduced protein sequence. A) The secondary structure of deduced protein sequence by PSIpred program. The structural motifs of I, II, and III are indicated in blue, red, and green, respectively. The putative active site sequence and aspartate (Asp) residues involved in binding with Ca +2 are shown by rectangular and circular boxes. B) The secondary structure of deduced protein sequence by SOPMA program and its comparison with pectate lyase sequencesfrom other organisms. The α helix, β sheet, β turn, and coiled coil are indicated by blue, red, green, and purple lines, respectively بررسی هملژی فیلژنتیکی ژن با سایر ژنهای پکتات لیاز از مجدات دیگر بررسی فیلژنتیکی تالی پرتئینی با تالی- های پلیپپتیدی پکتات لیاز از مجدات مختلف با استفاده از نرمافزار Mega4 به رش Neighbor Joining نشان داد که درخت فیلژنتیکی به دست آمده به سه گره عمده شامل: گیاهان باکتریها-قارچها نماتد تقسیمبندی شده به طری که گره باکتریها-قارچها خد شامل د زیرگره مجزا باکتریها قارچها میباشد )شکل 6A(. گره پکتات لیازهای گیاهی به سه زیرگره شد. زیرگره II I ژن JaPel I شامل یک شاخه از ژن تفکیک می- سایر تالیهای پکتات لیاز از گیاهان دلپهای یک شاخه از تالیهای پکتات لیاز گیاهان تکلپهای از قبیل: برنج Oryza ( )Sorghum bicolor, SbPel( ذرت خشهای )sativa, OsPel ذرت ژنهای )Zea mays, ZmPel( میباشد. ژن FaPelB FaPelA RcPel در زیرگره به همراه I یک زیرشاخه مجزا را تشکیل داده به نظر میرسد که این ژنها از یک جد مشترک مشتق شده باشند. نتایج به دست آمده از بررسی فیلژنتیکی مشابه با تعدادی از پژهشهای مجد میباشد بر اساس نتایج به دست آمده از بررسی فیلژنتیکی تالی اسیدآمینهای با تالیهای پلیپپتیدی پکتات لیاز از گیاهان مرد مقایسه قرار گرفت نشان داده شد که تالی پرتئینی شباهت زیادی را با گیاهانی از قبیل: کرچک %46 یکسانی %47 :RcPel Ricinus communis( شباهت( تتفرنگی %47 شباهت( هل %46 یکسانی %41 :FaPelA F. ananassa( یکسانی %47 شباهت( صنبر :PpPel Prunus persica( :PtPel P. trichocarpa( %41 یکسانی %47 شباهت( دارد. میزان یکسانی شباهت با ژن JaPel از گیاه سر که به عنان یک الگ در مدلسازی مقایسهای ساختار سهبعدی پیشبینی شده مرد استفاده قرار گرفت به )Xiao et al. 2008( ترتیب برابر %19 %67 میباشد. در بین تالیهای پکتات لیاز گیاهی ژن زیرگره پرتئینی I سپس تالیهای زیرگره بیشترین تشابه را با پکتات لیازهای II باکتریها نماتد نشان میدهد. تالی با تالیهای پکتات لیاز از قارچها G. rostochiensis نیز مرد مقایسه قرار گرفت نشان داده شد که بیشترین تشابه را با قارچها %27 یکسانی %11 :AtPelC Aspergillus terreus( شباهت( کمترین تشابه را با نماتد G. rostochiensis %4 یکسانی %2 شباهت( دارد ( et Popeijus :GrPel1(.)Pua et al. 2001; Zhao et al. 2007( 2

12 همسانهسازی ملکلی جداسازی تصیف یک ژن پکتات لیاز از... عاله بر تالی جایگاه فعال اسیدهای آمینه Ca +2.)al آسپارتات درگیر در اکنش با ین ساختاری همردیفسازی چندگانه متیفهای با سایر تالیهای پکتات لیاز از گیاهان ناحی حفظ شده در طی تکامل را نشان میدهد )شکل 6B(. B A E D C β شکل 1: ساختار سم تالی پرتئینی A(. مدل ربان به همراه مارپیچ α صفحات ناحی مارپیچ پیچیده. اسیدآمینه الین آغازین )Val1( اسیدآمینه الین پایانی )Val14( اسیدهای آمینه مجد در جایگاه فعال اسیدهای آمینه II I آسپارتات درگیر در اتصال با ین 2+ Ca به ترتیب به شکل کرههای سبز قرمز آبی سفید نشان داده شدهاند. B( مدل ربان مقعیت قرارگیری مارپیچ α صفحات β جایگاه فعال آسپارتاتهای درگیر در اکنش با ین 2+ Ca نسبت به هم در فضای سهبعدی. فلشها بلندترین مارپیچ پیچیده بین صفحات متیفهای ساختاری را نشان میدهند. C( بررسی اسیدهای آمینه )D. β β2 باردار )مثبت: آبی رنگ منفی: قرمز رنگ( آبدست )خاکستری رنگ( آبگریز )سفید رنگ( در پرتئین اسیدهای آمینه مهم از نظر ساختاری )آبی رنگ( فعالیت )قرمز رنگ( به همراه %9 سطح اندرالس در پرتئین بررسی. III II I مقعیت قرارگیری متیفهای ساختاری در سطح پرتئین. قرمز سبز نشان داده شدهاند متیفهای ساختاری به ترتیب با رنگهای آبی Figure 5: Three-dimensional models for deduced protein sequence. A) Cartoon display of the three-dimensional structure of with α-helix, β-sheets, and coiled coil regions. The initial valine (Val1) residue, end valine (Val4) residue, putative active site sequence, and aspartate (Asp) residues involved in binding with Ca +2 are shown by green, red, blue, and white spheres, respectively. B) Cartoon display of and placement position of α-helix, β-sheets, putative active site sequence, aspartate (Asp) residues involved in binding with Ca +2, and structural motifs of I and II. The longest of coiled coil between β2 and β sheets is indicated by narrows. C) Analysis of positively charged (blue), negatively charged (red), hydrophilic (gray), and hydrophobic (white) residues of. D) Analysis of functional (red) and structural (blue) important residues of as 10% of van der Waals. E) The placement position of structural motifs in deduced protein sequence. The structural motifs of I, II, and III are indicated in blue, red, and green, respectively )E 2

13 فنآری زیستی در کشارزی/ جلد یازدهم/ شماره ال/ تابستان 19 A B شکل 6: بررسی فیلژنتیکی همردیفسازی چندگانه تالی پرتئینی بررسی فیلژنتیکی با تالیهای پرتئینی پکتات لیاز از مجدات دیگر. با تالیهای پرتئینی پکتات لیاز از مجدات مختلف شامل: گیاهان قارچها باکتریها نماتد. Neighbor Joining MEGA4.1 Beta 2 )A درخت فیلژنتیکی با استفاده از نرمافزار تالی پرتئینی به رش تالیهای پرتئینی پکتات لیاز از سایر گیاهان. تالی پرتئینی به دست آمده از رسم گردید. B( همردیفسازی چندگانه با تالیهای )III II ClustalW2 II I پکتات لیاز گیاهی از زیرگرههای اسیدهای آمینه آسپارتات درگیر در اتصال با ین با استفاده از نرمافزاز همردیف شدند. متیفهای ساختاری )I به ترتیب با کادرهای سیاه رنگ عالمتهای مثلث نشان داده شدهاند. شماره دستیابی تالیهای پرتئینی مرد استفاده در ساخت درخت فیلژنتیکی تهیه همردیفسازی چندگانه در جدل آمده است Figure 6: Phylogenetic analysis and multiple sequence alignment of deduced protein sequence with pectate lyase protein sequences from other organisms. A) Phylogenetic analysis of with pectate lyase protein sequences from different organisms including plants, fungi, bacteria, and nematode. The Neighbor Joining tree was constructed using MEGA4.1 Beta 2 software. B) Multiple sequence alignment of deduced protein sequence and pectate lyase protein sequences from other plants. The protein sequence deduced from the was aligned with plant pectate lyase protein sequences from subgroups I and II using the ClustalW2. The structural motifs (I, II, and III) and aspartate (Asp) residues involved in binding with Ca +2 are indicating by black boxes and triangles, respectively. Accession numbers of used protein sequences for construction of phylogenetic tree and multiple sequence alignment are given in Table 1 Ca +2 22

14 همسانهسازی ملکلی جداسازی تصیف یک ژن پکتات لیاز از... در این بررسی یک cdna ناقص پکتات لیاز تحت عنان از بافت حبه گیاه انگر )V. vinifera( رقم ایرانی )بیدانه سفید( با استفاده از اکنش که یک Reverse Transcriptase-PCR جداسازی همسانهسازی گردیده یژگیهای بیشیمیایی آن مرد بررسی قرار گرفت. با استفاده از بررسیهای مدل سازی ساختاری نشان داده شد از نظر ساختارهای دم سم مشابه با سایر تالیهای پکتات لیاز از مجدات دیگر بده بررسیهای هملژی فیلژنتیکی نشان داد که این ژن شباهت باالیی با تالیهای پرتئینی پکتات لیاز گیاهان دیگر داشته به I زیرگره پکتات لیازهای گیاهی تعلق دارد. با تجه به تنع دخالت پکتات لیاز در فرآیند سخت ساز سللی جداسازی شناسایی بررسی فعالیت کاتالیتیکی بیان آنها در سطح RNA پرتئین در دره زایشی به یژه در سایر میهها تصیه شده تا بتان دیدگاه مناسبی از این آنزیم به دست آرده اطالعات به دست آمده را بهبد بخشید. ممکن است در آینده بتان با دگرگنی ژنی طل مدت مرحله رسیدگی اضمحالل سلل را بهبد بخشید. 29