c-kit pharmdx Κωδικός K εξετάσεις για µη αυτόµατη χρήση Προοριζόµενη χρήση Για in vitro διαγνωστική χρήση.

Transcript

1 c-kit pharmdx Κωδικός K εξετάσεις για µη αυτόµατη χρήση Προοριζόµενη χρήση Για in vitro διαγνωστική χρήση. Η δοκιµασία προσδιορισµού c-kit pharmdx είναι κιτ ενός συστήµατος ανοσοϊστοχηµικής ποιοτικής ανάλυσης (IHC) που χρησιµοποιείται για την αναγνώριση έκφρασης της πρωτεΐνης c-kit /αντιγόνου CD117 (πρωτεΐνη c-kit) σε φυσιολογικούς και νεοπλαστικούς ιστούς µονιµοποιηµένους µε φορµαλίνη και εγκλεισµένους σε παραφίνη µε σκοπό την ιστολογική αξιολόγηση. Τα πολυκλωνικά αντισώµατα κουνελιού c-kit pharmdx ανιχνεύουν ειδικά την πρωτεΐνη c-kit σε κύτταρα που εκφράζουν το αντιγόνο CD117. Το c-kit pharmdx προορίζεται ως βοήθηµα για τη διαφορική διάγνωση των όγκων του γαστρεντερικού στρώµατος (GIST). Μετά τη διάγνωση των GIST, τα αποτελέσµατα του c-kit pharmdx µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως βοήθηµα για την αναγνώριση εκείνων των ασθενών για τους οποίους είναι κατάλληλη η θεραπεία µε Gleevec /Glivec (imatinib mesylate). Τα αποτελέσµατα των χρώσεων αιµατοξυλίνης και ηωσίνης (H&E) και µιας σειράς αντισωµάτων µπορούν να βοηθήσουν για τη διαφορική διάγνωση των GIST. Η ερµηνεία πρέπει να γίνεται από ειδικό παθολόγο στα πλαίσια του κλινικού ιστορικού του ασθενούς, κατάλληλων µαρτύρων και άλλων διαγνωστικών εξετάσεων. Σηµείωση: Η παρούσα εξέταση δεν προορίζεται ούτε ως αποκλειστικός γνώµονας για τη διάγνωση των GIST ούτε προορίζεται ως αποκλειστικός γνώµονας για την επιλογή της θεραπείας Gleevec/Glivec. Η θεραπευτική έκβαση των ασθενών µε GIST που είναι αρνητικοί στο c-kit και λαµβάνουν θεραπεία Gleevec/Glivec δεν έχει προσδιοριστεί. Ένα αρνητικό αποτέλεσµα δεν αποκλείει απαραιτήτως τη διάγνωση GIST ούτε θα πρέπει να αποκλείει θεραπεία Gleevec/Glivec 1,2,3 Όλα τα άτοµα που υποβλήθηκαν στις κλινικές δοκιµές της Novartis Gleevec/Glivec επιλέχθηκαν µε χρήση ενός διερευνητικού Πρωτοκόλλου Κλινικών οκιµών της Novartis (NCTP). Το αντιδραστήριο πρωτογενούς πολυκλωνικού αντισώµατος κουνελιού αντι-c-kit που χρησιµοποιήθηκε µε το NCTP αγοράστηκε από την Dako. Το αντιδραστήριο πρωτογενούς πολυκλωνικού αντισώµατος c-kit pharmdx υποβλήθηκε στην ίδια µέθοδο παραγωγής, αποµόνωσης και ποιοτικού ελέγχου µε το πολυκλωνικό αντιδραστήριο αντι-c-kit του NCTP. Περίληψη και επεξήγηση Εισαγωγή Το πρωτοογκογονίδιο c-kit, γνωστό και ως αντιγόνο CD117 ή υποδοχέας παράγοντα βλαστοκυττάρων, αποτελεί έναν διαµεµβρανικό υποδοχέα της κινάσης της τυροσίνης 145 kd τύπου III. Το γονίδιο c-kit κωδικοποιεί έναν διαµεµβρανικό υποδοχέα της κινάσης της τυροσίνης ο οποίος είναι δοµικά παρόµοιος µε τους υποδοχείς των παραγόντων ανάπτυξης A και B που προέρχονται από αιµοπετάλια όπως και µε τον υποδοχέα του παράγοντα διέγερσης αποικιών 1 και θεωρείται ότι παίζει σηµαντικό ρόλο στην παραγωγή αίµατος, σπερµατογένεση και τον σχηµατισµό µελανίνης. Η πρωτεΐνη c-kit περιέχει εξωκυτταρικές περιοχές µε βρόγχους παρεµφερείς µε 5 Ig, µια υψηλά υδρόφοβη διαµεµβρανική περιοχή, και µια ενδοκυτταρική περιοχή µε ενεργότητα κινάσης τυροσίνης η οποία µε την εισαγωγή κινάσης χωρίζεται σε µια περιοχή πρόσδεσης ATP και µια περιοχή φωσφοτρανσφεράσης. Η ενεργοποίηση του υποδοχέα συνοδεύεται από τον διαχωρισµό σε δύο µέρη του υποδοχέα, τη φωσφορυλίωση του υποστρώµατος και την αυτοφωσφορυλίωση, την εσωτερίκευση του υποδοχέα, την ενεργοποίηση πρωτεϊνών κινάσης και φωσφολιπάσης, και τη µεταγραφή διαφορετικών πρωτοογκογονιδίων. 4 Η µεταβολική ατραπός του υποδοχέα της κινάσης της τυροσίνης c-kit έχει αποδειχθεί σηµαντική για την ανάπτυξη και πορεία των όγκων σε αρκετά είδη καρκίνου. 5 Μεταλλάξεις του γονιδίου c-kit ενδέχεται να οδηγούν σε φωσφορυλίωση ανεξαρτήτως συνδέσµου (ενεργοποίηση) της κινάσης της τυροσίνης c-kit, που πιστεύεται ότι έχουν κεντρικό παθογονικό ρόλο, π.χ. στους όγκους του γαστρεντερικού στρώµατος. 6 Παραδοσιακά, η διαφοροποίηση και διάγνωση των µεσεγχυµατικών γαστρεντερικών όγκων παρουσιάζει δυσκολίες. Το 2001, εγκρίθηκε το imatinib mesylate (Gleevec, Novartis, Βασιλεία, Ελβετία) από την Αµερικανική ιαχείριση Τροφών και Φαρµάκων (US Food and Drug Administration) για τη θεραπεία των όγκων του γαστρεντερικού στρώµατος (GIST). Η έγκριση βασίστηκε σε µια κλινική µελέτη κατά την οποία ενήλικες µε GIST που εξέφραζαν πρωτεΐνη c-kit, όπως αποδείχθηκε ανοσοϊστοχηµικώς (Πρωτόκολλο Κλινικών οκιµών της Novartis) εγγράφηκαν και έλαβαν θεραπεία µε imatinib mesylate. 7 Οι περιπτώσεις GIST περιγράφονται σε τρεις µορφολογικές κατηγορίες: ατρακτοειδών κυττάρων, επιθηλιοειδών και µεικτών τύπων. Ανεξαρτήτως, όµως, µορφολογίας, η πλειοψηφία των GIST εκφράζει πρωτεΐνη c-kit σε σηµαντική αναλογία των κυττάρων του όγκου Σηµειωτέον, ότι ένα µικρό ποσοστό των GIST δεν εκφράζει πρωτεΐνη c-kit. Σχετικά λίγοι άλλοι όγκοι µπορεί να είναι θετικοί στη πρωτεΐνη c-kit. Τέτοιοι όγκοι περιλαµβάνουν το µεταστατικό µελάνωµα, το αγγειοσάρκωµα, το σάρκωµα Ewing, το ιστιοκύτωµα, το σεµίνωµα και το πνευµονικό µικροκυτταρικό καρκίνωµα. Επίσης οι GIST είναι συνήθως θετικοί σε υψηλού µοριακού βάρους πρωτεΐνη caldesmon, συχνά θετικοί σε CD34 (60-80%), και γενικά αρνητικοί σε δεσµίνη και πρωτεΐνη S ( ) GR_001 σελ. 1/16

2 Ειδικότητα Τα πολυκλωνικά αντισώµατα κουνελιού αντι-c-kit προέκυψαν από την υποδόρια έγχυση πεπτιδίου 14 αµινοξέων (aa) (θέσεις του ενδοκυτταρικού C άκρου της πρωτεΐνης c-kit) σε συνδυασµό µε θυρεοσφαιρίνη. Ο αντιορός καθαρίσθηκε ειδικότερα µε χρωµατογραφία συγγένειας δέσµευσης αντιγόνου και ενεργοποίησης θειόλης AvidGel F. Ένας µικρός αριθµός σαρκωµάτων µαλακών ιστών έχει βρεθεί επίσης θετικός στη πρωτεΐνη c-kit. 6 Κάποια από αυτά τα δείγµατα (π.χ. λειοµυοσαρκώµατα) εξετάστηκαν για έκφραση πρωτεΐνης c-kit. Η µελέτη αφορούσε στη σύγκριση της δοκιµασίας προσδιορισµού c-kit pharmdx και του Πρωτοκόλλου Κλινικών οκιµών της Novartis (NCTP) όπως χρησιµοποιήθηκαν για την επιλογή ασθενών για θεραπεία µε Gleevec κατά την διάρκεια των κλινικών δοκιµών που διενεργήθηκαν από τη Novartis. ύο δείγµατα σε σύνολο είκοσι οκτώ που εξετάστηκαν παρουσίασαν θετική χρώση. Το αποτέλεσµα ήταν παρόµοιο µεταξύ των δύο πρωτοκόλλων. Όλες οι θετικές χρώσεις καταργήθηκαν µετά την απορρόφηση του πρωτογενούς αντισώµατος µε ένα συνθετικό πεπτίδιο (16 αµινοξύ του C-άκρου της πρωτεΐνης c-kit). Εποµένως το πρωτογενές αντίσωµα που χρησιµοποιείται στη δοκιµασία προσδιορισµού c-kit pharmdx αντέδρασε ειδικά µε την πρωτεΐνη c-kit στα δύο θετικά χρωµατισµένα σαρκώµατα µαλακών ιστών. Εσωτερικές µελέτες µε χρήση c-kit pharmdx διαπίστωσαν την έκφραση της πρωτεΐνης c-kit σε µια ποικιλία φυσιολογικών κυττάρων. Αυτά τα κύτταρα περιλαµβάνουν κύτταρα πόρου και µυοεπιθηλιακά του µαστού, κυτταρικές επεξεργασίες purkinje, κύτταρα του κύριου υµένα του παχέος εντέρου, του σωληνώδους επιθηλίου του νεφρού, µελανοκύτταρα και µυοεπιθηλιακά κύτταρα του δέρµατος, ενδιάµεσα κύτταρα Cajal του λεπτού εντέρου και ιστιοκύτταρα. Η κυτταροπλασµατική δραστικότητα σε κοκκιοκύτταρα προκλήθηκε από ενδογενή ενεργότητα υπεροξειδάσης και ήταν ορατή µε αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα. Αντιδραστήρια Ο κωδικός K1906 χρησιµοποιείται σε µη αυτόµατη χρώση. Τα υλικά που παραθέτονται επαρκούν για 25 εξετάσεις (25 αντικειµενοφόροι ασθενούς και 10 αντικειµενοφόροι µάρτυρες επωασµένες µε το αντιδραστήριο πρωτογενούς αντισώµατος για την πρωτεΐνη c-kit και 25 αντικειµενοφόροι επωασµένες µε το αντίστοιχο αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα). Ο αριθµός των εξετάσεων βασίζεται στη χρήση του πρωτοκόλλου c-kit pharmdx µη αυτόµατης χρώσης µε όλα τα έτοιµα για χρήση αντιδραστήρια. Το κιτ παρέχει επαρκή υλικά για έως 10 µεµονωµένους κύκλους χρώσης. Υλικά που παρέχονται Ποσότητα 1x4 ml Περιγραφή c-kit pharmdx IgG πολυκλωνικό κουνελιού 1x4 ml Αντι-ανθρώπινο πολυκλωνικό κουνελιού c-kit IgG σε ρυθµιστικό διάλυµα Tris-HCl που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και νατραζίδιο 0,015 mol/l. Αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα IgG κουνελιού 2x5 αντικειµενοφόροι πλάκες Πολυκλωνικό IgG κουνελιού σε συγκέντρωση υψηλότερη ή ίση µε τη συγκέντρωση θετικού αντιc-kit σε ρυθµιστικό διάλυµα Tris-HCl που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και νατραζίδιο 0,015 mol/l. c-kit pharmdx αντικειµενοφόροι πλάκες Κάθε αντικειµενοφόρος περιέχει τοµές δύο πεπιεσµένων κυτταρικών σειρών µονιµοποιηµένων µε φορµαλίνη και εγκλεισµένων σε παραφίνη ποντικού (+) και ανθρώπινων (-), οι οποίες αντιπροσωπεύουν τόσο το µέτριο επίπεδο όσο και το µηδενικό επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης c-kit. Η βαθµολόγηση της IHC χρώσης των κυτταρικών συµπυκνωµάτων είναι 2+ και 0. Αρχή της διαδικασίας Το κιτ IHC c-kit pharmdx περιέχει αντικειµενοφόρους µε πολυκλωνικά αντισώµατα και αντικειµενοφόρους- µάρτυρες για την ολοκλήρωση µιας διαδικασίας IHC για δείγµατα µονιµοποιηµένα µε φορµαλίνη και εγκλεισµένα σε παραφίνη. Μετά από την επώαση µε τα πρωτοταγή πολυκλωνικά αντίσωµατα προς την ( ) GR_001 σελ. 2/16

3 ανθρώπινη πρωτεΐνη c-kit, το παρόν κιτ χρησιµοποιεί ένα έτοιµο προς χρήση αντιδραστήριο οπτικής παρουσίασης που στηρίζεται σε τεχνολογία δεξτράνης. Το αντιδραστήριο αυτό αποτελείται τόσο από δευτερογενή µόρια αντισωµάτων αίγας αντι-κουνελιού όσο και από µόρια υπεροξειδάσης του χρένου, τα οποία είναι συνδεδεµένα σε ένα κοινό σκελετό πολυµερισµένης δεξτράνης, εξαλείφοντας έτσι την ανάγκη επακόλουθης εφαρµογής του αντισώµατος σύνδεσης και του συζεύγµατος της υπεροξειδάσης. Η ενζυµική µετατροπή του χρωµογόνου που προστίθεται στη συνέχεια έχει σαν αποτέλεσµα την παραγωγή ορατού προϊόντος αντίδρασης, στη θέση του αντιγόνου. Κατόπιν το δείγµα µπορεί να αντιχρωµατιστεί και να καλυφθεί µε καλυπτρίδα. Η ερµηνεία των αποτελεσµάτων γίνεται µε τη χρήση κοινού µικροσκοπίου. Για τον ποιοτικό έλεγχο της απόδοσης του κιτ του αντιδραστηρίου, παρέχονται δύο αντικειµενοφόροι µάρτυρες που περιέχουν δύο κυτταρικές σειρές, ανθρώπινες και ποντικού, µονιµοποιηµένες σε φορµαλίνη και εγκλεισµένες σε παραφίνη, µε ένταση χρώσης που βαθµολογείται µε 2+ και 0 αντίστοιχα. Υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται Το πρωτόκολλο IHC c-kit pharmdx επικυρώθηκε µε χρήση των εξής αντιδραστηρίων χρώσης της Dako: Wash Buffer (κωδικός S3006) Dual Endogenous Enzyme Block (κωδικός S2003) Target Retrieval Solution (κωδικός S1699 ή S1700) EnVision+ HRP, Anti-Rabbit (κωδικός K4002 ή K4003) DAB+ (κωδικός K3467 ή K3468) Σηµείωση: Για να διασφαλιστούν κατάλληλα αποτελέσµατα χρώσης, πρέπει να χρησιµοποιούνται µόνο αυτά τα αντιδραστήρια χρώσης µε το c-kit pharmdx. Οι παρεκκλίσεις από αυτό το συνιστώµενο πρωτόκολλο δεν έχουν επικυρωθεί. Άλλα υλικά που απαιτούνται για την εκτέλεση του c-kit pharmdx περιλαµβάνουν τα εξής: Αιµατοξυλίνη, αλκοόλη ή µε βάση το νερό όπως η Dako s Hematoxylin (κωδικός S3301 ή S3302) Καλυπτρίδες Υδατόλουτρο, καταλλήλως ρυθµισµένο και ικανό να διατηρεί θερµοκρασία C ή συσκευή θέρµανσης υπό πίεση καταλλήλως ρυθµισµένη και ικανή να διατηρεί θερµοκρασία έως 125 C Αποσταγµένο ή απιονισµένο νερό (νερό ποιότητας αντιδραστηρίου) Ξηραντήρας, µε δυνατότητα να διατηρεί θερµοκρασία C Αιθανόλη, απόλυτη και 95% Κοινό µικροσκόπιο (µε αντικειµενικούς φακούς µεγέθυνσης 4x 40x) Υλικό επικάλυψης όπως το Dako s Faramount (κωδικός S3025) ή Dako s Glycergel (κωδικός C0563) ή Dako s Ultramount (κωδικός S1964) Θετικοί και αρνητικοί ιστοί για χρήση ως µάρτυρες επεξεργασίας (βλ. ενότητα Ποιοτικού ελέγχου) Αντικειµενοφόροι, Fisher s SuperFrost Plus, αντικειµενοφόροι πλάκες καλυµµένες µε πολυ-l-λυσίνη, φορτισµένες αντικειµενοφόροι, ή Dako Silanized Slides (κωδικός S3003) (βλ. ενότητα Προετοιµασία δείγµατος) Τρυβλία ή λουτρά χρώσης Χρονόµετρο (µε δυνατότητα µέτρησης χρονικών διαστηµάτων 2 30 λεπτών) Φιάλη πλύσης Ξυλένιο, τολουένιο ή υποκατάστατα ξυλενίου Πιπέττα 1 ml Θάλαµος υγρασίας Σηµείωση: Όλα τα αντιδραστήρια που περιλαµβάνονται ή διατίθενται ξεχωριστά, όπως το Dako s Wash Buffer (κωδικός S3006), είναι ειδικά παρασκευασµένα ώστε να χρησιµοποιούνται µε την εξέταση αυτή. Για την πραγµατοποίηση της εξέτασης όπως καθορίζεται, δεν πρέπει να χρησιµοποιηθούν υποκατάστατα. Προφυλάξεις 1. Για επαγγελµατίες χρήστες. Για in vitro διαγνωστική χρήση. 2. Το προϊόν αυτό περιέχει νατραζίδιο (NaN 3), µια ιδιαίτερα τοξική χηµική ουσία σε καθαρή µορφή. Σε συγκεντρώσεις του προϊόντος, αν και δεν έχει ταξινοµηθεί ως επικίνδυνο, η συσσώρευση NaN 3 ενδέχεται να αντιδράσει µε µολύβδινες ή χάλκινες υδραυλικές σωληνώσεις και να δηµιουργήσει ιδιαίτερα εκρηκτικά µεταλλικά αζίδια. Κατά την απόρριψη, ξεπλύνετε µε άφθονο νερό για να αποτρέψετε τη συσσώρευση µεταλλικών αζιδίων στις σωληνώσεις. 3. Όπως ισχύει για κάθε προϊόν βιολογικής προέλευσης, πρέπει να τηρούνται οι σωστές διαδικασίες χειρισµού τόσο για τα δείγµατα όσο και για τα αντιδραστήρια. 4. Όταν ακολουθείτε χρόνους επώασης, θερµοκρασίες ή µεθόδους, διαφορετικές από αυτές που καθορίζονται ενδέχεται να σηµειωθούν εσφαλµένα αποτελέσµατα. 5. Μην υποκαθιστάτε τα πρωτογενή αντισώµατα ή τα αντιδραστήρια αρνητικών µαρτύρων µε παρτίδες πρωτογενών αντισωµάτων ή αντιδραστήρια αρνητικών µαρτύρων διαφορετικής κατασκευής (ο αριθµός παρτίδας βρίσκεται στην ετικέτα του φιαλιδίου) ή µε αντιδραστήρια άλλων κατασκευαστών. Ενδέχεται να προκύψουν λανθασµένα αποτελέσµατα. 6. Τα αντιδραστήρια του κιτ έχουν αραιωθεί βέλτιστα για χρήση µε τα συνιστώµενα αντιδραστήρια. Περαιτέρω αραίωση δεν συνιστάται και ενδέχεται να έχει ως αποτέλεσµα την απώλεια χρώσης του αντιγόνου. Ο χρήστης πρέπει να εξακριβώνει οποιαδήποτε αλλαγή αυτού του είδους. 7. Φορέστε κατάλληλο εξοπλισµό προσωπικής προστασίας για να αποφύγετε την επαφή µε τα µάτια και το δέρµα. 8. Όσο διάλυµα δεν χρησιµοποιηθεί πρέπει να απορρίπτεται σύµφωνα µε τους τοπικούς, κρατικούς και οµοσπονδιακούς κανονισµούς. 9. Το Φύλλο δεδοµένων ασφαλείας διατίθεται σε επαγγελµατίες χρήστες κατόπιν αίτησης. ( ) GR_001 σελ. 3/16

4 ηλώσεις κινδύνου και ασφάλειας DAB Chromogen* Περιέχει: ιφαινυλ-3,3,4,4 -τετραχλωριούχο τετραϋλτετρααµµώνιο 1-5% / Σύµβολο κινδύνου: Επιβλαβές R 40 Περιορισµένες ενδείξεις καρκινογόνου δράσεως. R43 Επαφή µε το δέρµα µπορεί να προκαλέσει ευαισθητοποίηση. R68 Πιθανός κίνδυνος µη αναστρέψιµων παρενεργειών. S35 Το υλικό αυτό και το δοχείο του πρέπει να απορρίπτονται µε ασφαλή τρόπο. S 36/37 Φοράτε τον κατάλληλο προστατευτικό ρουχισµό και γάντια. Ως γενικός κανόνας, δεν επιτρέπεται σε άτοµα κάτω των 18 ετών να εργάζονται µε το προϊόν αυτό. Οι χρήστες πρέπει να λαµβάνουν οδηγίες για τις σωστές διαδικασίες εργασίας, τις επικίνδυνες ιδιότητες του προϊόντος και τις απαραίτητες οδηγίες ασφαλείας. (κατά Οδηγία Ευρωπαϊκής Ένωσης 94/33/ΕΕ). Ανατρέξτε στο Φύλλο δεδοµένων ασφαλείας υλικού για πρόσθετες πληροφορίες. (*Το DAB Chromogen είναι υλικό απαιτούµενο που όµως δεν συµπεριλαµβάνεται στο παρόν κιτ). Αποθήκευση Αποθηκεύστε το κιτ c-kit pharmdx στους 2 8 C. Οι αντικειµενοφόροι-µάρτυρες πρέπει να αποθηκεύονται στους 2 8 C. Μην χρησιµοποιείτε το κιτ µετά την ηµεροµηνία λήξης που βρίσκεται εκτυπωµένη στο εξωτερικό της συσκευασίας του κιτ. εν υπάρχουν εµφανείς ενδείξεις που να υποδηλώνουν αστάθεια του προϊόντος αυτού, εποµένως, οι θετικοί και αρνητικοί µάρτυρες πρέπει να εξετάζονται ταυτόχρονα µε τα δείγµατα του ασθενούς. Αν τα αντιδραστήρια φυλάσσονται σε συνθήκες διαφορετικές από εκείνες που προδιαγράφονται στο ένθετο συσκευασίας, πρέπει να εξακριβώνονται από τον χρήστη. 13 ήλωση ποιότητας Προετοιµασία δειγµάτων Τα αντιδραστήρια του κιτ c-kit pharmdx έχουν υποβληθεί σε ποιοτικό έλεγχο ανοσοϊστοχηµικώς χρησιµοποιώντας τις παρακάτω συνθήκες: ανάκτηση στόχου σε συσκευή θέρµανσης υπό πίεση Pascal (κωδικός S2800) προγραµµατισµένη επί 30 δευτερόλεπτα στους 125 C, ψύξη στους 90 C, και κατόπιν στο EnVision+ Rabbit, HRP system. Ο χειρισµός των δειγµάτων των βιοψιών πρέπει να είναι τέτοιος ώστε να διατηρούν τον ιστό για την IHC χρώση. Οι τυπικές µέθοδοι επεξεργασίας ιστών πρέπει να χρησιµοποιούνται σε όλα τα δείγµατα. 14 Τοµές εγκλεισµένες σε παραφίνη Ιστοί µονιµοποιηµένοι σε φορµαλίνη και εγκλεισµένοι σε παραφίνη είναι κατάλληλοι προς χρήση. Εναλλακτικά µονιµοποιητικά δεν έχουν επικυρωθεί και ενδέχεται να δώσουν λανθασµένα αποτελέσµατα. Τα δείγµατα της βιοψίας πρέπει να εγκλείονται σε τεµάχια πάχους 3 ή 4 mm και να µονιµοποιούνται στην ενδεδειγµένη για το µονιµοποιητικό χρονική διάρκεια. Κατόπιν οι ιστοί αφυδατώνονται και καθαρίζονται µέσα σε µια σειρά διαλυµάτων αλκοόλης και ξυλενίου, και ακολουθεί εµποτισµός σε λιωµένη παραφίνη. Η θερµοκρασία παραφίνης δεν πρέπει να υπερβαίνει τους 60 C. Τα κατάλληλα µονιµοποιηµένα και εγκλεισµένα τεµάχια των ιστών που εκφράζουν την πρωτεΐνη c-kit διατηρούνται επ' αόριστον πριν τεµαχιστούν και τοποθετηθούν σε 14, 15 αντικειµενοφόρους, εφόσον φυλάσσονται σε δροσερό µέρος (15 25 C). Τα δείγµατα των ιστών πρέπει να τεµαχίζονται σε τοµές πάχους 3 5 µm. Μετά τον τεµαχισµό, οι ιστοί πρέπει να τοποθετούνται σε Fisher SuperFrost Plus, Dako Silanized (κωδικός S3003), φορτισµένες αντικειµενοφόρους ή αντικειµενοφόρους επικαλυµµένες µε πολυ-l-λυσίνη και να τοποθετούνται σε σχάρες ξήρανσης. Οι σχάρες των αντικειµενοφόρων πρέπει να χτυπηθούν πάνω σε απορροφητικό χαρτί για να αποµακρυνθεί το νερό που είναι παγιδευµένο κάτω από την παραφίνη και το γυαλί και µετά να στεγνώσουν σε θερµοκρασία δωµατίου επί µία ώρα. Κατόπιν η σχάρα µε τις αντικειµενοφόρους πρέπει να τοποθετηθεί σε θάλαµο επωάσεως στους C επί µία ώρα. Κάθε επιπλέον ποσότητα νερού που έχει αποµείνει στις αντικειµενοφόρους µετά την αφαίρεσή τους από το θάλαµο επωάσεως, πρέπει να αποµακρυνθεί χτυπώντας τις ελαφρά πάνω σε µια πετσέτα και να αφεθούν να στεγνώσουν στο θάλαµο επωάσεως επί µία επιπλέον ώρα. Μετά την αφαίρεσή τους από το θάλαµο επωάσεως, οι αντικειµενοφόροι πρέπει να µείνουν σε θερµοκρασία δωµατίου έως ότου κρυώσει και σκληρύνει η παραφίνη. Για να διατηρηθεί η αντιγονικότητα, οι τοµές ιστών, που έχουν τοποθετηθεί σε αντικειµενοφόρους, πρέπει να χρωµατίζονται εντός 2 µηνών από την τοµή όταν διατηρούνται σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Συµβουλευτείτε το Εγχειρίδιο της Dako: "Immunochemical Staining Methods" 16 (Μέθοδοι ανοσοχηµικής χρώσης) ή τις παραποµπές 14 και 15 για περαιτέρω λεπτοµέρειες σχετικά µε την παρασκευή των δειγµάτων. Η χρήση απασβεστωµένων ιστών δεν έχει επικυρωθεί και δεν συνιστάται. Οι αντικειµενοφόροι που απαιτούνται για την αξιολόγηση της πρωτεΐνης c-kit και την εξακρίβωση της παρουσίας όγκου πρέπει να παρασκευάζονται ταυτόχρονα. Πρέπει να προετοιµάζονται 5 τουλάχιστον αντικειµενοφόρες, 1 αντικειµενοφόρος για την παρουσία όγκου, 2 αντικειµενοφόρες για την αξιολόγηση της πρωτεΐνης c-kit και 2 αντικειµενοφόρες για υποστήριξη. Προετοιµασία αντιδραστηρίου Πριν τη χρώση πρέπει να παρασκευάζονται τα ακόλουθα αντιδραστήρια: Target Retrieval Solution (κωδικός S1699) Για τα στάδια της πλύσης, παρασκευάστε µια επαρκή ποσότητα Target Retrieval Solution, αραιώνοντας το Target Retrieval Solution 10x 1:10 χρησιµοποιώντας απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό (νερό ποιότητας ( ) GR_001 σελ. 4/16

5 αντιδραστηρίου). Απορρίψτε το Target Retrieval Solution µετά τη χρήση. Σηµείωση: Κατά τη χρήση του Target Retrieval Solution της Dako (κωδικός S1700) δεν χρειάζεται αραίωση. Wash Buffer Solution (κωδικός S3006) Για τα στάδια της πλύσης, παρασκευάστε µια επαρκή ποσότητα Wash Buffer αραιώνοντας το Wash Buffer 10x 1:10 χρησιµοποιώντας απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό (νερό ποιότητας αντιδραστηρίου). Φυλάσσετε όσο διάλυµα δεν χρησιµοποιηθεί στους 2 8 C επί όχι περισσότερες από 7 ηµέρες. Απορρίψτε το διάλυµα αν είναι νεφελώδες στην εµφάνιση. Substrate-Chromogen Solution (DAB+) (κωδικός 3467 ή K3468) Πριν από τη χρήση, το διάλυµα πρέπει να ανακατευτεί καλά. Η κατακρήµνιση ιζήµατος στο διάλυµα δεν επηρεάζει την ποιότητα της χρώσης. Για την παρασκευή του DAB+ Substrate-Chromogen Solution, προσθέστε 1 σταγόνα του Liquid DAB+ Chromogen σε ένα ml DAB+ Substrate Buffer και αναδέψτε. Απορρίψτε όσο διάλυµα παραµείνει αχρησιµοποίητο. Η σταθερότητα του προετοιµασµένου DAB+ είναι περίπου 5 ηµέρες όταν αποθηκεύεται στους 2 8 C Σηµαντική σηµείωση: Το χρώµα του Liquid DAB+ Chromogen στη φιάλη µπορεί να ποικίλει από διαυγές έως ανοιχτό µοβ-καφέ. Αυτό δεν επηρεάζει την απόδοση του προϊόντος. Αραιώστε σύµφωνα µε τις παραπάνω οδηγίες. Η προσθήκη επιπλέον Liquid DAB+ Chromogen στο DAB+ Substrate Buffer έχει ως αποτέλεσµα τη χειροτέρευση του θετικού σήµατος. Υλικό επικάλυψης Συνιστάται µη υδατικό, µόνιµο υλικό επικάλυψης όπως το Dako Ultramount (κωδικός S1964). Τα υλικά υγρής επικάλυψης όπως το Dako Faramount Mounting Medium, έτοιµο προς χρήση (κωδικός S3025) ή Dako Glycegel Mounting Medium (κωδικός C0563), είναι επίσης κατάλληλα. Πριν χρησιµοποιήσετε το Glycergel, υγροποιήστε το, ζεσταίνοντάς το στους 40 (±5) C περίπου. ιαδικασία χρώσης για µη αυτόµατη χρήση Σηµειώσεις διαδικασίας Πριν από τη χρήση, ο χρήστης οφείλει να διαβάσει τις οδηγίες αυτές προσεκτικά και να εξοικειωθεί µε όλα τα εξαρτήµατα (βλ. Προφυλάξεις). Όλα τα αντιδραστήρια πριν από την ανοσοχρώση, πρέπει να εξισορροπούν σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Οµοίως, όλες οι επωάσεις πρέπει να πραγµατοποιούνται σε θερµοκρασία δωµατίου. Κατά τη διαδικασία της χρώσης, µην αφήνετε τις τοµές των ιστών να στεγνώσουν. Οι στεγνές τοµές ιστών ενδέχεται να παρουσιάσουν αυξηµένη µη ειδική χρώση. Για να αποφύγετε το στέγνωµα των ιστών, τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρους σε θάλαµο υγρασίας. Σηµείωση: Τα αντιδραστήρια και οι οδηγίες που παρέχονται µε το παρόν σύστηµα έχουν σχεδιαστεί για βέλτιστη απόδοση µε χρήση των συνιστώµενων αντιδραστηρίων και υλικών. Η περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων ή η αλλαγή στους χρόνους επώασης ή στις θερµοκρασίες, µπορεί δώσουν εσφαλµένα ή αντικρουόµενα αποτελέσµατα. Αποπαραφίνωση και επανυδάτωση Πριν από τη χρώση, οι αντικειµενοφόροι των ιστών πρέπει να αποπαραφινώνονται για να αφαιρεθεί το υλικό εγκλεισµού και να επανυδατώνονται. Αποφύγετε την ατελή αποµάκρυνση της παραφίνης. Υπολείµµατα υλικού εγκλεισµού έχουν ως αποτέλεσµα αυξηµένη µη ειδική χρώση. ΒΗΜΑ 1. Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρους σε λουτρό ξυλενίου και επωάστε επί 5 (±1) λεπτά. Αλλάξτε λουτρά και επαναλάβετε άλλη µία φορά. ΒΗΜΑ 2. Κτυπήστε τις αντικειµενοφόρους ελαφρά για να αποµακρυνθεί η περίσσεια του υγρού και τοποθετήστε τις σε απόλυτη αιθανόλη επί 3 (±1) λεπτά. Αλλάξτε λουτρά και επαναλάβετε µία φορά. ΒΗΜΑ 3. Κτυπήστε τις αντικειµενοφόρους ελαφρά για να αποµακρυνθεί η περίσσεια του υγρού και τοποθετήστε τις σε αιθανόλη 95% επί 3 (±1) λεπτά. Αλλάξτε λουτρά και επαναλάβετε µία φορά. ΒΗΜΑ 4. Κτυπήστε τις αντικειµενοφόρους ελαφρά για να αποµακρυνθεί η περίσσεια του υγρού και τοποθετήστε τις σε νερό ποιότητας αντιδραστηρίου επί 5 (±1) λεπτά. ΒΗΜΑ 5. Κτυπήστε τις αντικειµενοφόρους ελαφρά για να αποµακρυνθεί η περίσσεια του υγρού και τοποθετήστε τις στο Wash Buffer. Αρχίστε τη δοκιµασία προσδιορισµού όπως περιγράφεται στην ενότητα " ιαδικασία χρώσης". Τα διαλύµατα ξυλενίου και αλκοόλης πρέπει να αλλάζονται µετά από 40 αντικειµενοφόρους. Στη θέση του ξυλενίου µπορούν να χρησιµοποιηθούν υποκατάστατα τολουενίου και ξυλενίου, όπως είναι το Histoclear. Ανάκτηση στόχου Συνιστώµενη διαδικασία: Υδατόλουτρο ΒΗΜΑ 1. Γεµίστε τρυβλία χρώσης, π.χ. τρυβλία Coplin, µε το αραιωµένο Target Retrieval Solution (βλ. Προετοιµασία αντιδραστηρίου). Τοποθετήστε τα τρυβλία χρώσης που περιέχουν το Target Retrieval Solution σε υδατόλουτρο. Ζεστάνετε το υδατόλουτρο και το Target Retrieval Solution στους C (µην φέρετε σε βρασµό). Σκεπάστε τα τρυβλία µε πώµατα για να σταθεροποιήσετε τη θερµοκρασία και να αποφύγετε την εξάτµιση. ( ) GR_001 σελ. 5/16

6 ΒΗΜΑ 2. Βυθίστε τις αποπαραφινωµένες τοµές σε θερµοκρασία δωµατίου στο προθερµασµένο Target Retrieval Solution στα τρυβλία χρώσης. Ισορροπήστε εκ νέου τη θερµοκρασία του υδατόλουτρου και του Target Retrieval Solution στους C. Επωάστε επί 20 (±1) λεπτά στους C. ΒΗΜΑ 3. Αποµακρύνετε όλα τα τρυβλία µε τις αντικειµενοφόρους από το υδατόλουτρο. Αφήστε τις αντικειµενοφόρους να κρυώσουν στο Target Retrieval Solution για 20 (±1) λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. ΒΗΜΑ 4. Αποστραγγίξτε το Target Retrieval Solution και ξεπλύνετε τις τοµές σε Wash Buffer (βλ. Προετοιµασία αντιδραστηρίου). ΒΗΜΑ 5. Για βέλτιστη απόδοση, διαποτίστε τις τοµές σε Wash Buffer επί 5 (±1) λεπτά µετά την ανάκτηση στόχου και πριν την χρώση. Ανάκτηση στόχου Συσκευή θέρµανσης υπό πίεση (30 δευτερόλεπτα στους 125 C) Είναι πολύ σηµαντικό να υπάρχει συνέπεια στην τήρηση του πρωτοκόλλου ανάκτησης στόχου για να διασφαλιστεί η επαναληψιµότητα των αποτελεσµάτων χρώσης. Η συσκευή θέρµανσης υπό πίεση που χρησιµοποιείται πρέπει να είναι ικανή να ανέλθει και να διατηρήσει 125 C και κάθε κύκλος της χύτρας ταχύτητας πρέπει να περιλαµβάνει τον ίδιο συνολικό όγκο υγρού (Target Retrieval Solution και νερό στο δίσκο της χύτρας ταχύτητας ) καθώς και τον ίδιο συνολικό αριθµό αντικειµενοφόρων. Το βέλτιστο πρωτόκολλο έχει ως εξής: ΒΗΜΑ 1. Για κάθε κύκλο προσθέτετε σταθερό όγκο νερού ποιότητας αντιδραστηρίου στο δίσκο της χύτρας ταχύτητας (500 ml ή συµβουλευτείτε τις οδηγίες του κατασκευαστή). ΒΗΜΑ 2. Γεµίστε δύο πλαστικά δοχεία χρώσης ανθεκτικά στη θερµότητα που µπορούν να χωρέσουν µια σχάρα 24 αντικειµενοφόρων µε 250 ml προετοιµασµένου Target Retrieval Solution (βλ. Προετοιµασία αντιδραστηρίου). ΒΗΜΑ 3. Βυθίστε τις αποπαραφινωµένες τοµές σε θερµοκρασία δωµατίου σε Target Retrieval Solution στα δοχεία χρώσης. Σηµείωση: Προς χάριν της συνέπειας, στη διάρκεια κάθε κύκλου πρέπει να τοποθετούνται 48 αντικειµενοφόρες στη χύτρα ταχύτητας, µε χρήση κενών αντικειµενοφόρων για να συµπληρώσουν τις σχάρες χρώσης αν πρόκειται να γίνει επεξεργασία λιγότερων από 48 αντικειµενοφόρων δείγµατος. Αν πρόκειται να γίνει επεξεργασία λιγότερων από 24 αντικειµενοφόρων, το δεύτερο δοχείο χρώσης µπορεί να συµπληρωθεί µε 250 ml νερού έτσι ώστε να εξοικονοµηθεί Target Retrieval Solution. ΒΗΜΑ 4. Τοποθετείστε τα δύο δοχεία χρώσης σε συσκευή θέρµανσης υπό πίεση και σφίξτε καλά το καπάκι. ΒΗΜΑ 5. Ρυθµίστε τη συσκευή θέρµανσης υπό πίεση να θερµανθεί στους 125 C. Επωάστε τις αντικειµενοφόρες στους 125 C επί δευτερόλεπτα. Αφήστε την χύτρα ταχύτητας να κρυώσει επί 30 λεπτά πριν την ανοίξετε, χωρίς να εκτονώσετε την πίεση. ΒΗΜΑ 6. Πριν ανοίξετε τη συσκευή θέρµανσης υπό πίεση, σιγουρευτείτε ότι η πίεση έχει εκτονωθεί. Αφαιρέστε τα δοχεία χρώσης, αποµακρύνετε το Target Retrieval Solution και ξεπλύνετε τις τοµές σε Wash Buffer ή νερό ποιότητας αντιδραστηρίου. ΒΗΜΑ 7. Μουσκέψτε τις τοµές σε Wash Buffer επί 5 (±1) λεπτά µετά την ανάκτηση στόχου και πριν την χρώση. Σηµείωση: Το Target Retrieval Solution έχει σχεδιαστεί µόνο για µία χρήση. Μην το χρησιµοποιήσετε ξανά. Πρωτόκολλο µη αυτόµατης χρώσης ΒΗΜΑ 1. Dual Endogenous Enzyme Block (κωδικός S2003) Κτυπήστε για να αφαιρεθεί η περίσσεια του υγρού. Χρησιµοποιώντας ύφασµα χωρίς χνούδι, σκουπίστε προσεκτικά γύρω από το δείγµα για να αφαιρέσετε τυχόν υπόλειµµα υγρού και για να κρατήσετε το αντιδραστήριο εντός της καθορισµένης περιοχής. Χρησιµοποιείστε επαρκή ποσότητα Dual Endogenous Enzyme Block για να καλύψετε το δείγµα [τουλάχιστον 3 σταγόνες (100 µl)] Επωάστε επί 5 (±1) λεπτά. Ξεπλύνετε απαλά µε Wash Buffer από φιάλη πλύσης (µην εστιάσετε τη ροή του υγρού κατευθείαν επάνω στον ιστό γιατί ενδέχεται να γλιστρήσει ο ιστός εκτός της αντικειµενοφόρου). Τοποθετήστε σε φρέσκο λουτρό Wash Buffer επί 5 (±1) λεπτά. ΒΗΜΑ 2. Πρωτογενές αντίσωµα ή αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα Κατά τη διάρκεια της επώασης πρωτογενούς αντισώµατος / αντιδραστηρίου αρνητικού µάρτυρα και επισηµασµένου πολυµερούς τοποθετείστε τις αντικειµενοφόρους σε θάλαµο υγρασίας για να αποφύγετε το στέγνωµα των ιστών. Κτυπήστε ελαφρά για να αποµακρύνετε την περίσσεια ρυθµιστικού διαλύµατος και σκουπίστε τις αντικειµενοφόρους όπως προηγουµένως. Χρησιµοποιείστε επαρκή ποσότητα πρωτογενούς αντισώµατος ή αντιδραστηρίου αρνητικού µάρτυρα ώστε να καλύψετε το δείγµα [τουλάχιστον 3 σταγόνες (100 µl)]. Επωάστε επί 30 (±1) λεπτά σε θάλαµο υγρασίας. Ξεπλύνετε τις αντικειµενοφόρους όπως στο βήµα 1. ( ) GR_001 σελ. 6/16

7 ΒΗΜΑ 3. EnVision+ HRP, Anti-Rabbit (κωδικός K4002 ή K4003) Κτυπήστε ελαφρά για να αποµακρύνετε την περίσσεια ρυθµιστικού διαλύµατος και σκουπίστε τις αντικειµενοφόρους όπως προηγουµένως. Χρησιµοποιείστε αρκετή ποσότητα επισηµασµένου πολυµερούς για να καλύψετε το δείγµα [τουλάχιστον 3 σταγόνες (100 µl) ]. Επωάστε επί 30 (±1) λεπτά σε θάλαµο υγρασίας. Ξεπλύνετε τις αντικειµενοφόρους όπως στο βήµα 1. ΒΗΜΑ 4. DAB+ Substrate-Chromogen Solution (κωδικός K3467 ή K3468) Κτυπήστε ελαφρά για να αποµακρύνετε την περίσσεια ρυθµιστικού διαλύµατος και σκουπίστε τις αντικειµενοφόρους όπως προηγουµένως. Προσθέστε αρκετή ποσότητα προετοιµασµένου DAB+ Substrate-Chromogen Solution για να καλύψετε το δείγµα. [τουλάχιστον 3 σταγόνες (100 µl)]. Επωάστε επί 10 (±1) λεπτά. Ξεπλύνετε απαλά µε νερό ποιότητας αντιδραστηρίου από φιάλη πλύσης (µην εστιάσετε τη ροή του υγρού κατευθείαν επάνω στον ιστό γιατί ενδέχεται να γλιστρήσει ο ιστός εκτός της αντικειµενοφόρου). Συλλέξτε τα απόβλητα DAB+ Substrate-Chromogen Solution σε δοχείο επικίνδυνων υλικών για κατάλληλη απόρριψη. Τοποθετήστε σε υδατόλουτρο µε νερό ποιότητας αντιδραστηρίου επί 2 5 λεπτά. Προχωρήστε µε την Αντίχρωση και την Επικάλυψη. Αντίχρωση (οδηγίες για την αιµατοξυλίνη) Το έγχρωµο τελικό προϊόν της αντίδρασης χρώσης είναι αδιάλυτο στην αλκοόλη και το νερό. Μπορεί να χρησιµοποιηθεί αιµατοξυλίνη, µε βάση είτε κάποια αλκοόλη είτε το νερό όπως η Hematoxylin της Dako (κωδικός S3301, αυτοµατοποιηµένη, ή S3302, µη αυτοµατοποιηµένη). Μην χρησιµοποιείτε φθίνουσες αντιχρωστικές. ΒΗΜΑ 1. Βυθίστε τις αντικειµενοφόρους σε λουτρό αιµατοξυλίνης. Επωάστε επί 2 5 λεπτά, αναλόγως της περιεκτικότητας της αιµατοξυλίνης που χρησιµοποιείτε. ΒΗΜΑ 2. Ξεπλύνετε ήπια σε λουτρό νερού ποιότητας αντιδραστηρίου. Βεβαιωθείτε ότι έχουν αφαιρεθεί τυχόν υπολείµµατα αιµοτοξυλίνης. Σηµείωση: Προτείνεται ανεπιφύλακτα η χρήση της Hematoxylin (κωδικός S3302) της Dako. Με µια τρίλεπτη επώαση, η αντίχρωση αυτή παράγει ένα ήπιο µοβ/µπλε τελικό προϊόν που δεν παρεµποδίζει την ειδική ανοσοχρώση. Ισχυρή αντίχρωση µπορεί να καλύψει µια ασθενή έκφραση του c-kit/cd117. ΒΗΜΑ 3. Ξεπλύνετε ήπια σε υδατόλουτρο µε νερό ποιότητας αντιδραστηρίου επί 2 5 λεπτά. Επικάλυψη Συνιστάται µη υδατικό, µόνιµο υλικό επικάλυψης όπως το Dako Ultramount (κωδικός S1964). Τα υλικά υγρής επικάλυψης όπως το Dako Faramount Mounting Medium, έτοιµο προς χρήση (κωδικός S3025) ή Dako Glycegel Mounting Medium (κωδικός C0563), είναι επίσης κατάλληλα. Πριν χρησιµοποιήσετε το Glycergel, υγροποιήστε το, ζεσταίνοντάς το στους 40 (±5) C περίπου. Σηµείωση: Συνιστάται να παρατηρηθούν οι αντικειµενοφόροι εντός έξι εβδοµάδων από τη χρώση. Ωστόσο, µπορεί να παρατηρηθεί κάποιος αποχρωµατισµός, που εξαρτάται από αρκετούς παράγοντες που περιλαµβάνουν, αλλά δεν εξαντλούνται από, την αντίχρωση, τα υλικά και µεθόδους επικάλυψης και τις συνθήκες αποθήκευσης των αντικειµενοφόρων. Για να ελαχιστοποιήσετε τον αποχρωµατισµό, αποθηκεύστε τις αντικειµενοφόρους σε σκοτεινό µέρος και σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Ποιοτικός έλεγχος Οι αποκλίσεις του εργαστηρίου του χρήστη από τις προτεινόµενες διαδικασίες µονιµοποίησης, επεξεργασίας και εγκλεισµού του ιστού, ενδέχεται να προκαλούν σηµαντικές διακυµάνσεις στα αποτελέσµατα, και επιβάλλουν την τακτική εξέταση, πέραν των αντικειµενοφόρων-µαρτύρων που παρέχει η Dako, και εσωτερικών µαρτύρων σε κάθε εργαστήριο. Για τις Η.Π.Α., συµβουλευτείτε τις οδηγίες ποιοτικού ελέγχου του College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry (Πρόγραµµα πιστοποίησης για την ανοσοϊστοχηµεία του συλλόγου Αµερικανών παθολόγων). Για περισσότερες πληροφορίες, βλ. επίσης το CLIS Quality Assurance for Immunocytochemistry Approved Guideline, 17 (Εγκεκριµένες οδηγίες διασφάλισης ποιότητας για την ανοσοϊστοχηµεία) καθώς και τις παραποµπές c-kit pharmdx αντικειµενοφόροι πλάκες (παρέχονται) Κάθε µια από τις παρεχόµενες αντικειµενοφόρους µάρτυρες, περιέχει δύο πεπιεσµένες σειρές κυττάρων, ποντικού (+) και ανθρώπινες (-), µονιµοποιηµένων σε φορµαλίνη και εγκλεισµένων σε παραφίνη, µε ένταση χρώσης που βαθµολογείται µε 2+ και 0. Σε κάθε διαδικασία χρώσης πρέπει να χρωµατίζεται µία αντικειµενοφόρος. Η αξιολόγηση των κυτταρικών σειρών στις αντικειµενοφόρους-µάρτυρες που παρέχει η Dako αποτελεί ένδειξη της εγκυρότητας του κύκλου χρώσης. εν πρέπει να χρησιµοποιούνται ως βοήθηµα για την ερµηνεία των αποτελεσµάτων των ασθενών. Ιστός θετικού µάρτυρα Οι µάρτυρες πρέπει να είναι νωπά δείγµατα από αυτοψίες/βιοψίες/χειρουργικές επεµβάσεις που έχουν µονιµοποιηθεί, επεξεργαστεί και εγκλειστεί το συντοµότερο δυνατό και µε τον ίδιο τρόπο όπως το(τα) δείγµα(τα) του ασθενούς. Οι ιστοί θετικού µάρτυρα αποτελούν ένδειξη για τους ιστούς που έχουν παρασκευαστεί καταλλήλως και για τις σωστές τεχνικές χρώσης. Σε κάθε κύκλο χρώσης πρέπει να περιλαµβάνεται ένας ιστός θετικού µάρτυρα για κάθε κύκλο χρώσης. ( ) GR_001 σελ. 7/16

8 Οι ιστοί που χρησιµοποιούνται για θετικοί µάρτυρες πρέπει να εµφανίζουν ασθενή θετική χρώση έτσι ώστε να µπορούν να εντοπίσουν τις λεπτές αλλαγές στην ευαισθησία του πρωτογενούς αντισώµατος. Οι αντικειµενοφόροι-µάρτυρες που παρέχονται µε το σύστηµα αυτό ή τα δείγµατα που υποβάλλονται σε διαφορετική επεξεργασία από το δείγµα(τα) του ασθενούς επικυρώνουν µόνον την απόδοση του αντιδραστηρίου και δεν προορίζονται για να επαληθεύουν την προετοιµασία των ιστών. Οι γνωστοί ιστοί θετικού µάρτυρα πρέπει να χρησιµοποιούνται µόνο για την παρακολούθηση της σωστής απόδοσης των επεξεργασµένων ιστών και των αντιδραστηρίων της εξέτασης, και ΟΧΙ ως βοήθηµα στο σχηµατισµό κάποιας συγκεκριµένης διάγνωσης των δειγµάτων του ασθενούς Αν οι ιστοί θετικού µάρτυρα δεν παρουσιάσουν κατάλληλη θετική χρώση, τα αποτελέσµατα µε τα δείγµατα της εξέτασης πρέπει να θεωρούνται άκυρα. Οι φυσιολογικοί τύποι κυττάρων που µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως ασθενείς θετικοί µάρτυρες c-kit περιλαµβάνουν τα βασικά επιδερµικά µελανοκύτταρα και τα αδενικά µυοεπιθηλιακά κύτταρα του δέρµατος όπως και τα επιθηλιακά και µυοεπιθηλιακά κύτταρα του µαστού. Ισχυροί εσωτερικοί µάρτυρες µπορεί να είναι τα νευρωνικά κύτταρα (ενδιάµεσα κύτταρα του Cajal) και τα ιστιοκύτταρα του εντέρου. Ιστός αρνητικού µάρτυρα Σε κάθε κύκλο χρώσης, χρησιµοποιήστε ιστό αρνητικού µάρτυρα (γνωστό ως αρνητικό στην πρωτεΐνη c-kit) και ο οποίος έχει µονιµοποιηθεί, επεξεργαστεί και εγκλειστεί µε τρόπο παρόµοιο µε αυτόν του(ων) δείγµατος(ων) του ασθενούς, για επαλήθευση της ειδικότητας του πρωτογενούς αντισώµατος και παροχή µιας ένδειξης για την ειδική χρώση του υποβάθρου. Η ποικιλία των διαφορετικών κυτταρικών τύπων που υπάρχουν στις περισσότερες τοµές των ιστών, προσφέρουν εσωτερικές θέσεις αρνητικών µαρτύρων (αυτό πρέπει να επαληθευτεί από τον χρήστη). Αν οι ιστοί αρνητικού µάρτυρα δείξουν ειδική χρώση, τα αποτελέσµατα των δειγµάτων της εξέτασης πρέπει να θεωρηθούν άκυρα. Στοιχεία ιστών τα οποία µπορεί να χρησιµοποιηθούν ως αρνητικοί µάρτυρες περιλαµβάνουν τα καρδιακά µυοκύτταρα. Τα παγκρεατικά κυψελοειδή κύτταρα είναι επίσης αρνητικά σε c-kit, ενώ το επιθήλιο του χοληφόρου πόρου του παγκρέατος χρωµατίζεται θετικά. Μη ειδικό αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα Η χρήση του παρεχόµενου αντιδραστηρίου αρνητικού µάρτυρα αντί του πρωτογενούς αντισώµατος σε µια τοµή κάθε δείγµατος του ασθενούς, προορίζεται για την αξιολόγηση της µη ειδικής χρώσης και επιτρέπει καλύτερη ερµηνεία της ειδικής χρώσης στην θέση του αντιγόνου. Η περίοδος επώασης του αντιδραστηρίου αρνητικού µάρτυρα πρέπει να είναι αντίστοιχη µε αυτή του πρωτογενούς αντισώµατος. Αν χρησιµοποιήσετε σειρές αντισωµάτων σε σειρές τοµών, οι αρνητικά χρωµατισµένες περιοχές µιας αντικειµενοφόρου µπορεί να εξυπηρετούν ως αρνητικοί/µη ειδικής πρόσδεσης µάρτυρες υποβάθρου για άλλους αντιορούς. Επαλήθευση δοκιµασίας προσδιορισµού Πριν το αντίσωµα ή το σύστηµα ανοσοχρώσης χρησιµοποιηθεί για πρώτη φορά σε διαγνωστικές διαδικασίες, ο χρήστης πρέπει να επαληθεύσει την ειδικότητα του αντισώµατος εξετάζοντάς το µε µια σειρά ιστών του εργαστηρίου που έχουν γνωστά χαρακτηριστικά απόδοσης σε IHC και αντιπροσωπεύουν γνωστούς θετικούς και αρνητικούς ιστούς. Ανατρέξτε στις διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου, που περιγράφηκαν παραπάνω στην ενότητα αυτή του ένθετου του προϊόντος και στις Quality control requirements of the CAP Certification Program for Immunohistochemistry (Προϋποθέσεις ποιοτικού ελέγχου του προγράµµατος πιστοποίησης CAP για την ανοσοϊστοχηµεία) ή/και στις CLIS Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (Εγκεκριµένες οδηγίες διασφάλισης ποιότητας για την ανοσοϊστοχηµεία). 17 Οι διαδικασίες αυτές ποιοτικού ελέγχου πρέπει να επαναλαµβάνονται για κάθε καινούρια παρτίδα αντισώµατος, ή οποτεδήποτε επέλθει µεταβολή στις παραµέτρους της δοκιµασίας προσδιορισµού. Κατάλληλοι ιστοί για την επαλήθευση της δοκιµασίας προσδιορισµού είναι όγκοι του γαστρεντερικού στρώµατος (GIST) µε γνωστή ένταση χρώσης της πρωτεΐνης c-kit καθώς και αρνητικοί ιστοί. Πίνακας 1: Ο σκοπός του καθηµερινού ποιοτικού ελέγχου Ιστός: Μονιµοποιηµένος και επεξεργασµένος µε τρόπο όµοιο µε αυτό του δείγµατος του ασθενούς Παρεχόµενη αντικειµενοφόρος µάρτυρας της Dako Σύστηµα ειδικού αντισώµατος & εντοπισµού Ελέγχει µόνο τη διαδικασία χρώσης. Η αξιολόγηση των κυτταρικών σειρών στις αντικειµενοφόρους µάρτυρες που παρέχει η Dako αποτελεί ένδειξη της εγκυρότητας του κύκλου χρώσης. Θετικός µάρτυρας: Ιστοί ή κύτταρα Ελέγχει όλα τα βήµατα της που περιέχουν το προς ανάλυση ανάλυσης. Επικυρώνει αντιγόνο-στόχο (µπορεί να αντιδραστήρια και διαδικασίες που εντοπίζεται στον ιστό του ασθενούς). χρησιµοποιούνται για τη χρώση της Υπόβαθρο: Μη ειδικό αντίσωµα (Rabbit Negative Control Reagent) Ανίχνευση µη ειδικής χρώσης υποβάθρου. ( ) GR_001 σελ. 8/16

9 Ο ιδανικός µάρτυρας είναι ιστός µε ασθενή θετική χρώση έτσι ώστε να είναι πολύ ευαίσθητος στην αποσύνθεση του αντισώµατος ή του αντιγόνου. πρωτεΐνης c-kit. Αρνητικός µάρτυρας: Ιστοί ή κύτταρα που αναµένεται να είναι αρνητικά (µπορεί να εντοπίζονται στον ιστό του ασθενούς ή στον ιστό θετικού µάρτυρα). Ανίχνευση ακούσιας διασταυρούµενης αντίδρασης του αντισώµατος µε κύτταρα/κυτταρικά συστατικά. Ανίχνευση µη ειδικής χρώσης υποβάθρου. Ιστός ασθενούς. Ανίχνευση ειδικής χρώσης. Ανίχνευση µη ειδικής χρώσης υποβάθρου. Ερµηνεία της διαδικασίας χρώσης Η αξιολόγηση της αντικειµενοφόρου πρέπει να πραγµατοποιείται από παθολόγο µε χρήση κοινού µικροσκοπίου. Όλες οι εκτιµήσεις πρέπει να γίνονται στην περιοχή του όγκου του δείγµατος. Για την αξιολόγηση της ανοσοκυτταροχηµικής χρώσης και την ερµηνεία απαιτείται αντικειµενικός φακός µεγέθυνσης 10X ή 20X. Για την ερµηνεία των αποτελεσµάτων της χρώσης, χρησιµοποιείτε άθικτα κύτταρα διότι τα νεκρωτικά ή εκφυλισµένα κύτταρα συχνά εµφανίζουν µη ειδική χρώση. 14,17 Σε κάθε κιτ c-kit pharmdx περιλαµβάνονται θετικές και αρνητικές κυτταρικές σειρές χρώσης για την επαλήθευση της απόδοσης της δοκιµασίας προσδιορισµού. Η κατάλληλη χρώση των αντικειµενοφόρων µαρτύρων αποτελεί απόδειξη ότι τα αντιδραστήρια c-kit pharmdx λειτουργούν καταλλήλως και ότι το πρωτόκολλο έχει εκτελεστεί µε ακρίβεια. Η απουσία χρώσης της κυτταρικής σειράς µάρτυρα HT-29 (0) καθώς και η µέτρια καφέ κυτταροπλασµατική ή παραπυρηνική χρώση της κυτταρικής σειράς µάρτυρα P815 (2+) αποτελούν ένδειξη ότι ο κύκλος χρώσης είναι έγκυρος. Απόκλιση από την βέλτιστη ένταση της χρώσης στην κυτταρική σειρά θετικού µάρτυρα (υπερβολικά ασθενής ή υπερβολικά έντονη) µπορεί να καταλήξει σε ψευδώς αρνητικό ή ψευδώς θετικό αποτέλεσµα και υποδεικνύει ότι η εξέταση πρέπει να επαναληφθεί. Πρέπει να γίνει αξιολόγηση του ιστού θετικού µάρτυρα. Ασθενής χρώση των µυοεπιθηλιακών κυττάρων του δέρµατος υποδεικνύει ότι τα αντιδραστήρια λειτουργούν καταλλήλως. Αν οι ιστοί θετικού µάρτυρα δεν παρουσιάσουν θετική χρώση, τα αποτελέσµατα µε τα δείγµατα της εξέτασης πρέπει να θεωρούνται άκυρα. Ο ιστός αρνητικού µάρτυρα πρέπει να εξετάζεται µετά από τον ιστό θετικού µάρτυρα για να επαληθεύει την ειδικότητα της σήµανσης του αντιγόνου από το πρωτογενές αντίσωµα. Απουσία ειδικής χρώσης στον ιστό αρνητικό µάρτυρα επιβεβαιώνει την έλλειψη διασταυρούµενης δραστικότητας του αντισώµατος στα κύτταρα/κυτταρικά συστατικά. Αν οι ιστοί αρνητικού µάρτυρα εµφανίσουν ειδική χρώση, τα αποτελέσµατα των εξεταζόµενων δειγµάτων της ασθενούς πρέπει να θεωρηθούν άκυρα. Η µη ειδική χρώση, όταν υπάρχει, έχει συνήθως διάχυτη εµφάνιση. Σε τοµές ιστών που υπεβλήθησαν σε υπερβολική µονιµοποίηση µε φορµαλίνη, ενδέχεται να παρατηρηθεί σποραδική χρώση του συνδετικού ιστού. Για την ερµηνεία των αποτελεσµάτων της χρώσης, χρησιµοποιείτε άθικτα κύτταρα. Τα νεκρωτικά ή εκφυλισµένα κύτταρα παρουσιάζουν συχνά µη ειδική χρώση. 18 Εξετάστε τα δείγµατα ασθενούς τελευταία. Η ένταση της θετικής χρώσης πρέπει να αποτιµάται µέσα στο πλαίσιο οποιασδήποτε µη ειδικής χρώσης υποβάθρου του αντιδραστηρίου αρνητικού µάρτυρα. Η ερµηνεία της έκφρασης της πρωτεΐνης c-kit/cd117 πρέπει να γίνεται µέσα στο γενικό µορφολογικό και κλινικό πλαίσιο του όγκου. Υπάρχουν τρεις µορφολογικές κατηγορίες GIST: ατρακτοειδών κυττάρων (70%), επιθηλιοειδών (20%) ή µεικτών τύπων. 22 Ανεξαρτήτως, όµως, µορφολογίας, η πλειοψηφία των GIST εκφράζει πρωτεΐνη c-kit σε σηµαντική αναλογία των κυττάρων του όγκου. Οµοιόµορφη ανοσοχρώση µε c-kit pharmdx συναντάται κυρίως στο κυτταρόπλασµα, µε ή χωρίς Golgi / παραπυρηνικό (κοκκώδες) πρότυπο, και στις κυτταρικές µεµβράνες, είτε µε πλήρη είτε µε ατελή περιφερειακή χρώση. Κάποιες περιπτώσεις εµφανίζουν ένα ετερογενές (µίγµα ισχυρού ή ασθενούς κυτταροπλασµατικού ή/και µεµβρανικού) πρότυπο χρώσης. Χρώση έχει επίσης παρατηρηθεί στους εξωκυτταρικούς χώρους. Τα αποτελέσµατα της εξέτασης του c-kit pharmdx αναφέρονται ως θετικά ή αρνητικά, χρησιµοποιώντας τη χρώση της κυτταροπλασµατικής µεµβράνης ως την προς αξιολόγηση δοµή (Πίνακας 2). Η θετικότητα ως προς την έκφραση της πρωτεΐνης c-kit καθορίζεται όπως οποιαδήποτε ειδική κυττραροπλασµατική ή/και µεµβρανική χρώση στα κύτταρα όγκων. Εστιασµένη θετικότητα ή χρώση σε λιγότερο από το 10% των κυττάρων του όγκου πρέπει να ερµηνεύονται µε επιφύλαξη. 23 Όπως και µε κάθε εξέταση ανοσοϊστοχηµείας, αρνητικό αποτέλεσµα σηµαίνει ότι το αντιγόνο δεν ανιχνεύθηκε και όχι ότι το αντιγόνο δεν υπάρχει στα κύτταρα/ιστούς που εξετάζονται. Θα πρέπει επίσης να σηµειωθεί ότι ένα µικρό ποσοστό των GIST δεν εκφράζει πρωτεΐνη c-kit. Εποµένως, η απουσία της χρώσης της πρωτεΐνης c-kit δεν αποκλείει αναγκαστικά την διάγνωση GIST. ( ) GR_001 σελ. 9/16

10 Πίνακας 2: Αποτελέσµατα χρώσης c-kit pharmdx Αναφορά προς τον θεράποντα ιατρό αρνητικό στην πρωτεΐνη c-kit θετικό στην πρωτεΐνη c-kit Ορισµός Απουσία χρώσης στα κύτταρα του όγκου. Η θετική χρώση ορίζεται όπως οποιαδήποτε χρώση IHC του κυτταροπλάσµατος ή/και των µεµβράνων των κυττάρων του όγκου πέραν του επιπέδου του υποβάθρου. Ένταση χρώσης: 1+, 2+ ή 3+ Αν είναι απαραίτητο, χρησιµοποιήστε σειρά αντισωµάτων ως βοήθηµα για την αναγνώριση των ψευδώς αρνητικών αντιδράσεων. Όταν η χρώση είναι εστιασµένα θετική, πρέπει να εκτιµηθεί η ανάγκη επιπλέον εξετάσεων για την επιβεβαίωση της διάγνωσης GIST. Η γενετική εξέταση όπως και τα πρότυπα χρώσης που καθορίζονται στον Πίνακα 3 βοηθούν στη διαφοροποίηση µεταξύ των GIST και των άλλων µεσεγχυµατικών σαρκωµάτων. Ανατρέξτε στην Περίληψη και επεξήγηση και στους Περιορισµούς και χαρακτηριστικά απόδοσης για συγκεκριµένες πληροφορίες σχετικά µε την ανοσοδραστικότητα. Πίνακας 3. Ανοσοϊστοχηµικό σχήµα για την διαφορική διάγνωση των όγκων ατρακτοειδών κυττάρων της GI οδού. 5 SMA c-kit CD34 S -100 εσµίνη Ακτίνη λείου µυός GIST 95% 60-70% 30-40% 5% 2% Όγκος λείου µυός % + Σπάνια + Σβάννωµα - Σύνηθες Ινωµάτωση Αµφιλεγόµενο* Σπάνια + - Σπάνια * Οι περισσότεροι αλλά όχι όλοι οι συγγραφείς αναφέρουν ότι η ινωµάτωση είναι αρνητική στη c-kit. Ανάλογα µε τη διάρκεια της επώασης και την ισχύ της χρησιµοποιηθείσας αιµατοξυλίνης, η αντίχρωση µπορεί να έχει ως αποτέλεσµα ένα ωχρό ή σκούρο µπλε χρωµατισµό των κυτταρικών πυρήνων. Υπερβολική αντίχρωση µπορεί να οδηγήσει σε λανθασµένη ερµηνεία των αποτελεσµάτων. Περιορισµοί Γενικοί περιορισµοί Η IHC είναι µια διαγνωστική διαδικασία, πολλαπλών βηµάτων που απαιτεί ειδική εκπαίδευση στην επιλογή των κατάλληλων αντιδραστηρίων, την επιλογή του ιστού, τη µονιµοποίηση και την επεξεργασία, την προετοιµασία των αντικειµενοφόρων για την IHC και την ερµηνεία των αποτελεσµάτων της χρώσης. Η χρώση του ιστού εξαρτάται από το χειρισµό και την επεξεργασία του ιστού πριν από τη χρώση. Η ακατάλληλη µονιµοποίηση, κατάψυξη, απόψυξη, πλύση, στέγνωµα, θέρµανση, τεµαχισµός ή η µόλυνση µε άλλους ιστούς ή υγρά ενδέχεται να παράγει τεχνουργήµατα, καθήλωση του αντισώµατος ή ψευδώς αρνητικά αποτελέσµατα. Αποτελέσµατα χωρίς συνέπεια ίσως οφείλονται σε διακυµάνσεις των µεθόδων µονιµοποίησης και εγκλεισµού ή εγγενείς ανωµαλίες του ιστού. Η κλινική ερµηνεία κάθε θετικής χρώσης ή η απουσία της θετικής χρώσης, πρέπει να αξιολογείται εντός των πλαισίων της κλινικής εικόνας, της µορφολογίας και άλλων ιστοπαθολογικών κριτηρίων. Η κλινική ερµηνεία κάθε θετικής χρώσης ή η απουσία της θετικής χρώσης, πρέπει να συµπληρώνεται από µελέτες της µορφολογίας και τους σωστούς µάρτυρες όπως επίσης και άλλες διαγνωστικές εξετάσεις. Η ερµηνεία του χρωµατισµένου παρασκευάσµατος αποτελεί ευθύνη ειδικού παθολόγου που είναι εξοικειωµένος µε τα αντισώµατα, τα αντιδραστήρια και τις µεθόδους που χρησιµοποιούνται. Η χρώση πρέπει να πραγµατοποιείται σε πιστοποιηµένα εργαστήρια υπό την επίβλεψη παθολόγου που θα είναι υπεύθυνος για τον έλεγχο των χρωµατισµένων αντικειµενοφόρων και την εξασφάλιση της επάρκειας των θετικών και αρνητικών µαρτύρων. Το παρόν προϊόν δεν προορίζεται για κυτταροµετρία ροής. Τα χαρακτηριστικά απόδοσης δεν έχουν καθορισθεί για κυτταροµετρία ροής. Ιστοί από άτοµα που έχουν µολυνθεί µε τον ιό της ηπατίτιδας Β και περιέχουν το επιφανειακό αντιγόνο της ηπατίτιδας Β (HBsAg), ενδέχεται να εµφανίζουν µη ειδική χρώση µε την υπεροξειδάση του χρένου. 24 ( ) GR_001 σελ. 10/16

11 Τα αντιδραστήρια µπορεί να παρουσιάσουν µη αναµενόµενες αντιδράσεις σε ιστούς που δεν έχουν ποτέ εξεταστεί. Η πιθανότητα µη αναµενόµενων αντιδράσεων, ακόµα και σε οµάδες ιστών που έχουν εξεταστεί προηγουµένως, δεν µπορεί να εξαλειφθεί πλήρως λόγω της βιολογικής διακύµανσης που εµφανίζουν οι νεοπλασίες ή άλλοι παθολογικοί ιστοί στην έκφραση των αντιγόνων. 20 Επικοινωνήστε µε την τεχνική υποστήριξη της Dako µε πιστοποιηµένες µη αναµενόµενες αντιδράσεις. Ειδικοί περιορισµοί προϊόντος Ένα µικρό ποσοστό των GIST δεν εκφράζει πρωτεΐνη c-kit. Εποµένως, η απουσία της χρώσης της πρωτεΐνης c-kit δεν αποκλείει αναγκαστικά την διάγνωση GIST. Ψευδώς θετικά αποτελέσµατα µπορεί να παρατηρηθούν λόγω µη ανοσολογικής πρόσδεσης των πρωτεϊνών ή λόγω προϊόντων αντίδρασης του υποστρώµατος. Μπορεί επίσης να προέλθουν από ενεργότητα της ψευδοϋπεροξειδάσης (ερυθροκύτταρα) και ενεργότητα της ενδογενούς υπεροξειδάσης (κυτόχρωµα C). 19 Για βέλτιστα και επαναλήψιµα αποτελέσµατα, η πρωτεΐνη c-kit απαιτεί ανάκτηση στόχου όταν οι ιστοί µονιµοποιούνται µε το συνήθη τρόπο (ουδέτερη ρυθµισµένη φορµαλίνη) και εγκλείονται σε παραφίνη. Η Dako συνιστά τη χρήση του c-kit pharmdx µε Dako Autostainer ή Autostainer Plus. Η χρήση του c-kit pharmdx σε άλλες αυτοµατοποιηµένες πλατφόρµες δεν έχει επικυρωθεί και ενδέχεται να δώσει λανθασµένα αποτελέσµατα. Οι χρωµατισµένες κυτταρικές σειρές µάρτυρες πρέπει να χρησιµοποιούνται µόνο για την επικύρωση του κύκλου χρώσης και δεν πρέπει να χρησιµοποιούνται ως οδηγός για τη βαθµολόγηση της αντίδρασης χρώσης σε τοµές ιστών. είγµατα διατηρηµένα µε συνήθη επεξεργασία σε ουδέτερα ρυθµισµένη φορµαλίνη είναι κατάλληλα προς εξέταση µε το c-kit pharmdx. Ιστοί µονιµοποιηµένοι σε εναλλακτικά µονιµοποιητικά δεν έχουν επικυρωθεί. Χαρακτηριστικά απόδοσης Ειδικότητα Το αντιδραστήριο αντισώµατος c-kit έχει ελεγχθεί για δραστικότητα έναντι κυτταρικών σειρών που εκφράζουν πρωτεΐνη c-kit. Σε πειράµατα στύπωσης κατά Western του προϊόντος λύσης της κυτταρικής σειράς SY πνευµονικού καρκινώµατος µικρού κυττάρου που υπερ-εκφράζει το c-kit mrna, το αντίσωµα επεσήµανε ζώνη 145 kd που αντιστοιχεί στην πρωτεΐνη c-kit. Η επισηµασµένη ζώνη είναι αρκετά ευρεία, από 120 ως 155 kd. Επισηµάνθηκε µια ακόµα ζώνη 100 kd. 25 Επιπλέον, µε εφαρµογή ενός δεύτερου αντισώµατος αντι-c-kit, επισηµάνθηκε παροµοίως µια πρωτεΐνη 100 kd. Αυτή η επισήµανση καταργήθηκε όταν το αντιδραστήριο του αντισώµατος επωάστηκε µε συνθετικό πεπτίδιο αντιγόνου c-kit που χρησιµοποιείται για την ανοσοποίηση. 26 Σε πρόσθετες µελέτες, το αντιδραστήριο του αντισώµατος c-kit εξετάστηκε µε στύπωση κατά Western για διασταυρούµενη δραστικότητα µε πρωτεΐνες που µοιράζονται δοµική οµολογία, όπως ο υποδοχέας του παράγοντα ανάπτυξης που προέρχεται από αιµοπετάλια (PDGFRa), υποδοχέας παράγοντα διέγερσης αποικίας µακροφάγων (c-fms) και η κινάση τυροσίνης 3 τύπου FMS (FLT-3). Με αυτές τις οµόλογες πρωτεΐνες δεν παρατηρήθηκε διασταυρούµενη δραστικότητα. Ακόµα, σε στύπωση κατά Western το αντιδραστήριο του αντισώµατος της Dako δεν αντέδρασε µε το προϊόν λύσης της κυτταρικής σειράς HS αδενοκαρκινώµατος, που δεν εκφράζει την πρωτείνη c-kit. 25 Συγκριτικές µελέτες ιενεργήθηκε ανοσοχρώση µε χρήση της δοκιµασίας προσδιορισµού c-kit pharmdx σε σαρκώµατα µονιµοποιηµένα σε φορµαλίνη και εγκλεισµένα σε παραφίνη και διατάξεις πολλαπλών ιστών (MTAs) που περιελάµβαναν σαρκώµατα µε θετική και αρνητική έκφραση πρωτεΐνης c-kit. Οι ιστοί εξετάστηκαν µε χρήση της δοκιµασίας προσδιορισµού c-kit pharmdx µετά τη χρήση των δύο συνιστώµενων µεθόδων θερµικά επαγόµενης ανάκτησης επιτόπων (HIER). Εν συντοµία, χρησιµοποιήθηκαν υδατόλουτρο (95 99 C) επί 20 λεπτά και συσκευή θέρµανσης υπό πίεση (121 C) επί 5 λεπτά για θέρµανση, και ακολούθησαν 20 λεπτά για να κρυώσουν. Τα υπόλοιπα βήµατα της διαδικασίας χρώσης ήταν πανοµοιότυπα. Αυτές οι δοκιµασίες προσδιορισµού συγκρίθηκαν µε έναν ταυτόχρονο κύκλο προσοµοίωσης του Πρωτοκόλλου Κλινικών οκιµών της Novartis (NCTP) που είχε πρωτύτερα χρησιµοποιηθεί για την επιλογή ασθενών για την κλινική δοκιµή που είχε σαν αποτέλεσµα την έγκριση της FDA για χρήση της Gleevec/Glivec µε ασθενείς µε διάγνωση GIST. Το NCTP χρησιµοποίησε µια 2X υψηλότερη συγκέντρωση του πρωτογενούς πολυκλωνικού αντισώµατος της Dako έναντι της c-kit (A4502) (το ίδιο αντιδραστήριο που χρησιµοποιείται στο c-kit pharmdx) και καµιά HIER. Τα αποτελέσµατα της σύγχρονης σύγκρισης των δοκιµασιών προσδιορισµού NCTP και c-kit pharmdx µε χρήση χύτρας ταχύτητας ως πηγή θερµότητας παρατίθενται στον Πίνακα 4 και παρόµοια ήταν τα αποτελέσµατα (γενική συµφωνία = 98,7%) µε χρήση υδατόλουτρου ως πηγή θερµότητας. Τα ποσοστά θετικής και αρνητικής συµφωνίας ήταν παρόµοια και για τις δύο συγκρίσεις. ( ) GR_001 σελ. 11/16