PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. SK εξετάσεις για χρήση µε το Autostainer Link 48. Προβλεπόµενη χρήση Για in vitro διαγνωστική χρήση.

Transcript

1 PD-L1 IHC 28-8 pharmdx SK εξετάσεις για χρήση µε το Autostainer Link 48 Προβλεπόµενη χρήση Για in vitro διαγνωστική χρήση. Το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx είναι µια ποιοτική ανοσοϊστοχηµική δοκιµασία που χρησιµοποιεί το Monoclonal Rabbit Anti-PD-L1, Clone 28-8 και προορίζεται για την ανίχνευση της πρωτεΐνης PD-L1 σε µονιµοποιηµένους σε φορµαλίνη, εγκλεισµένους σε παραφίνη (FFPE) ιστούς µη πλακώδους, µη µικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύµονα (ΜΜΚΠ) και ιστούς µελανώµατος, µε χρήση του συστήµατος οπτικοποίησης EnVision FLEX στο Autostainer Link 48. Η έκφραση της πρωτεΐνης PD-L1 ορίζεται ως το ποσοστό κυττάρων όγκων που εµφανίζουν θετική χρώση µεµβράνης σε οποιαδήποτε ένταση. Η έκφραση της PD-L1, που ανιχνεύεται µε το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx στο µη πλακώδη ΜΜΚΠ, ενδέχεται να συσχετίζεται µε ενισχυµένη επιβίωση µε τη λήψη του OPDIVO (νιβολουµάµπη). Η έκφραση της PD-L1, που ανιχνεύεται µε το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx στο µελάνωµα, µπορεί να χρησιµοποιηθεί ως βοήθηµα στην αξιολόγηση ασθενών για τους οποίους εξετάζεται το ενδεχόµενο υποβολής τους σε συνδυαστική θεραπεία µε OPDIVO (νιβολουµάµπη) και YERVOY (ιπιλιµουµάµπη). Περίληψη και επεξήγηση Η πρόσδεση των προσδεµάτων PD-1, PD-L1 και PD-L2 στον υποδοχέα PD-1 που βρίσκεται στα T κύτταρα, αναστέλλει τον πολλαπλασιασµό των T κυττάρων και την παραγωγή κυτοκίνης. Σε ορισµένους όγκους παρατηρείται αυξορρύθµιση των προσδεµάτων PD-1. Η σηµατοδότηση µέσω αυτής της οδού µπορεί να συµβάλει στην αναστολή της ανοσοεπιτήρησης των ενεργών T κυττάρων των όγκων (1). Το OPDIVO (νιβολουµάµπη) είναι ένα µονοκλωνικό αντίσωµα ανθρώπινης ανοσοσφαιρίνης G4 (IgG4) που δεσµεύεται στον υποδοχέα PD1 και εµποδίζει την αλληλεπίδρασή του µε τα PD-L1 και PD-L2, απελευθερώνοντας διαµεσολαβούµενη από την οδό PD1 αναστολή της ανοσοαπόκρισης, συµπεριλαµβανοµένης της αντιογκικής ανοσοαπόκρισης (2). Σε συγγενή µοντέλα όγκων ποντικών, ο αποκλεισµός της δραστηριότητας του PD-1 είχε ως αποτέλεσµα τη µειωµένη ανάπτυξη όγκων (3). Το κλινικό όφελος του OPDIVO και η κλινική χρησιµότητα του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx έχουν διερευνηθεί για το ΜΜΚΠ και το µελάνωµα. Μη πλακώδης ΜΜΚΠ: Η ανίχνευση κυττάρων όγκων µε έκφραση του PD-L1 σε δείγµα ασθενών µε µη πλακώδη, µη µικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύµονα ενδέχεται να υποδεικνύει όφελος ενισχυµένης επιβίωσης µε τη θεραπεία µε OPDIVO (νιβολουµάµπη) για τον ασθενή. Εξετάστηκαν δείγµατα ασθενών σε κλινικές µελέτες µε το OPDIVO που χρηµατοδοτήθηκαν από την Bristol-Myers Squibb, µε χρήση του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Στην κλινική µελέτη CA διερευνήθηκε η κλινική εγκυρότητα του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx για την αξιολόγηση της κατάστασης του PDL1 σε ασθενείς µε µη πλακώδη ΜΜΚΠ που έλαβαν θεραπεία µε OPDIVO (5,11). Μελάνωµα: Το κυτταροτοξικό αντιγόνο 4 που σχετίζεται µε τα T-λεµφοκύτταρα (CTLA-4) είναι αρνητικός ρυθµιστής της δραστηριότητας των T κυττάρων. Το YERVOY (ιπιλιµουµάµπη) είναι ένα µονοκλωνικό αντίσωµα που δεσµεύεται στο CTLA-4 και εµποδίζει την αλληλεπίδραση του CTLA-4 µε τα προσδέµατά του, CD80/CD86. Ο αποκλεισµός του CTLA-4 έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει τη δραστηριότητα και τον πολλαπλασιασµό των T κυττάρων, γεγονός που συµβάλλει στη γενική αύξηση της αντιογκικής ανοσοαπόκρισης (4). Τα PD-1 και CTLA-4 αναστέλλουν την αντιογκική ανοσοαπόκριση µέσω συµπληρωµατικών και µη πλεοναζόντων µηχανισµών. Η µονοθεραπεία µε το OPDIVO και η συνδυαστική θεραπεία µε το OPDIVO και το YERVOY έχει καταδείξει σηµαντικά µεγαλύτερη βελτίωση της επιβίωσης χωρίς εξέλιξη της νόσου σε σύγκριση µε τη µονοθεραπεία µε το YERVOY σε ασθενείς µε προχωρηµένο µελάνωµα, οι οποίοι δεν είχαν λάβει στο παρελθόν θεραπεία (8-10). Εξετάστηκαν δείγµατα ιστών µελανώµατος από ασθενείς που είχαν λάβει θεραπεία µε OPDIVO σε κλινικές µελέτες που χρηµατοδοτήθηκαν από την Bristol-Myers Squibb, µε χρήση του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Στην κλινική µελέτη CA διερευνήθηκε η κλινική εγκυρότητα του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx για την αξιολόγηση της έκφρασης του PDL1 σε ασθενείς µε µελάνωµα που έλαβαν µονοθεραπεία µε το OPDIVO,συνδυαστική θεραπεία µε το OPDIVO και το YERVOY και µονοθεραπεία µε το YERVOY. Το OPDIVO και το YERVOY αποτελούν εµπορικά σήµατα της Bristol-Myers Squibb. Αρχή της διαδικασίας Το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx περιέχει βελτιστοποιηµένα αντιδραστήρια και το απαιτούµενο πρωτόκολλο για την ολοκλήρωση µιας διαδικασίας χρώσης IHC δειγµάτων FFPE χρησιµοποιώντας το Autostainer Link 48 και τη µονάδα προεπεξεργασίας PT Link (6). Μετά την επώαση µε το πρωτοταγές µονοκλωνικό αντίσωµα έναντι του PD-L1 ή του αντιδραστηρίου αρνητικού µάρτυρα (NCR), τα δείγµατα επωάζονται µε ένα συνδετικό αντίσωµα ειδικό προς το είδος του ξενιστή του πρωτοταγούς αντισώµατος και, στη συνέχεια, επωάζονται µε ένα έτοιµο προς χρήση αντιδραστήριο οπτικοποίησης που αποτελείται από µόρια δευτεροταγών αντισωµάτων και µόρια υπεροξειδάσης χρένου συζευγµένα µε µια κύρια αλυσίδα πολυµερούς δεξτράνης. Η ενζυµική µετατροπή του χρωµογόνου που προστίθεται στη συνέχεια έχει ως αποτέλεσµα την κατακρήµνιση ενός ορατού προϊόντος αντίδρασης στη θέση του αντιγόνου. Το χρώµα της χρωµογόνου αντίδρασης τροποποιείται από ένα αντιδραστήριο ενίσχυσης χρωµογόνου. Στη συνέχεια, το δείγµα είναι δυνατό να υποβληθεί σε επίχρωση και να καλυφθεί µε καλυπτρίδα. Τα αποτελέσµατα ερµηνεύονται µε τη βοήθεια µικροσκοπίου φωτός. Για την επικύρωση των αναλύσεων χρώσης, παρέχονται αντικειµενοφόροι πλάκες µάρτυρα που περιέχουν δύο µονιµοποιηµένες σε φορµαλίνη και εγκλεισµένες σε παραφίνη ανθρώπινες κυτταρικές σειρές. Υλικά που παρέχονται PD-L1 IHC 28-8 pharmdx (Κωδικός SK005) Τα υλικά που αναφέρονται ακολούθως επαρκούν για 50 εξετάσεις (50 αντικειµενοφόροι πλάκες επωασµένες µε πρωτοταγές αντίσωµα για το PD-L1 και 50 αντικειµενοφόροι πλάκες επωασµένες µε το αντίστοιχο αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα, συνολικά 100 πλάκες εξέτασης). Το συµπληρωµατικό πρωτοταγές αντίσωµα για το PD-L1 παρέχεται στο κιτ για τη χρώση 15 αντικειµενοφόρων πλακών κυτταρικής σειράς µάρτυρα. Ο αριθµός των εξετάσεων βασίζεται στη χρήση 2 x 150 µl ανά αντικειµενοφόρο κάθε αντιδραστηρίου, εκτός του DAB+ και του διαλύµατος ανάκτησης στόχου. ( ) P03914GR_02/SK / σελ. 1/18

2 Το κιτ περιλαµβάνει υλικά που επαρκούν για 15 ανεξάρτητες αναλύσεις χρώσης το πολύ. Ποσότητα Περιγραφή 1 x 34,5 ml Peroxidase-Blocking Reagent PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT Ρυθµιστικό διάλυµα που περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου, απορρυπαντικό και 0,015 mol/l νατραζίδιο. 1 x 19,5 ml Πρωτοταγές αντίσωµα: Monoclonal Rabbit Anti-PD-L1, Clone 28-8 MONOCLONAL RABBIT ANTI-PD-L1 CLONE 28-8 Μονοκλωνικό αντίσωµα κουνελιού έναντι του PD-L1 σε ρυθµιστικό διάλυµα που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και 0,015 mol/l νατραζίδιο. 1 x 15 ml Negative Control Reagent* NEGATIVE CONTROL REAGENT Μονοκλωνικό αντίσωµα IgG µάρτυρα κουνελιού σε ρυθµιστικό διάλυµα που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και 0,015 mol/l νατραζίδιο. *Το µονοκλωνικό IgG µάρτυρα κουνελιού πωλείται µε εκχώρηση άδειας από τη Cell Signaling Technology. 1 x 34,5 ml LINKER, Anti-Rabbit LINKER, ANTI-RABBIT ευτεροταγές αντίσωµα ποντικού έναντι ανοσοσφαιρινών κουνελιού σε ρυθµιστικό διάλυµα που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και 0,015 mol/l νατραζίδιο. 1 x 34,5 ml Visualization Reagent-HRP VISUALIZATION REAGENT-HRP εξτράνη συζευγµένη µε µόρια υπεροξειδάσης και µόρια δευτεροταγών αντισωµάτων αίγας έναντι ανοσοσφαιρινών κουνελιού και ποντικού σε ρυθµιστικό διάλυµα που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και αντιµικροβιακό παράγοντα. 15 x 7,2 ml DAB+ Substrate Buffer DAB+ SUBSTRATE BUFFER Ρυθµιστικό διάλυµα που περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου και αντιµικροβιακό παράγοντα. 1 x 5 ml DAB+ Chromogen DAB+ CHROMOGEN 3,3 -τετραϋδροχλωρική διαµινοβενζιδίνη σε οργανικό διαλύτη. 1 x 34,5 ml DAB Enhancer DAB ENHANCER Θειικός χαλκός σε νερό. 6 x 30 ml EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) EnVision FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW ph (50X) Ρυθµιστικό διάλυµα, ph 6,1, που περιέχει απορρυπαντικό και αντιµικροβιακό παράγοντα. 15 αντικει- µενοφόροι πλάκες PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Control Slides CONTROL SLIDES Κάθε αντικειµενοφόρος πλάκα περιέχει τοµές δύο πεπιεσµένων, µονιµοποιηµένων σε φορµαλίνη και εγκλεισµένων σε παραφίνη κυτταρικών σειρών: NCI-H226** µε θετική έκφραση της πρωτεΐνης PD-L1 και MCF-7 µε αρνητική έκφραση της πρωτεΐνης PD-L1. PD-L1, SK005 pharmdx XXXXX MCF-7: PD-L1 αρνητικό NCI-H226: PD-L1 θετικό **Οι ρ. AF Gazdar και ρ. JD Minna στο Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) αναγνωρίζονται για τη συνεισφορά τους στην ανάπτυξη του NCI-H226 (Αρ. ATCC: CRL-5826 )(7) ( ) P03914GR_02/SK / σελ. 2/18

3 Σηµείωση: Όλα τα αντιδραστήρια που περιλαµβάνονται έχουν παρασκευαστεί για χρήση ειδικά µε το κιτ αυτό. Για να γίνει η δοκιµή, δεν πρέπει να γίνει καµία αντικατάσταση, µε εξαίρεση το EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) (Κωδικός K8005). Το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx προορίζεται ειδικά για χρήση µε το Autostainer Link 48. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στις Οδηγίες χρήσης για το Autostainer Link 48 και το PT Link. Υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται PT Link Pre-treatment Module (Κωδικός PT100/PT101) Autostainer Link 48 (Κωδικός AS480) EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (Κωδικός K8007) EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (Κωδικός K8008) Αποσταγµένο ή απιονισµένο νερό (νερό ποιότητας αντιδραστηρίου) Χρονόµετρο Θετικοί και αρνητικοί ιστοί για χρήση ως µάρτυρες επεξεργασίας (βλ. ενότητα Έλεγχος ποιότητας και Πίνακα 1) Αντικειµενοφόροι πλάκες µικροσκοπίου: Αντικειµενοφόροι πλάκες µικροσκοπίου Dako FLEX IHC (Κωδικός K8020) ή φορτισµένες αντικειµενοφόροι πλάκες Fisherbrand Superfrost Plus. Καλυπτρίδες Για την επικάλυψη µε καλυπτρίδες απαιτούνται βοηθητικά αντιδραστήρια και µέσο µόνιµης επικάλυψης Κοινό µικροσκόπιο (µε αντικειµενικούς φακούς µεγέθυνσης 4x-40x) Προφυλάξεις 1. Για in vitro διαγνωστική χρήση. 2. Για επαγγελµατίες χρήστες. 3. Το προϊόν αυτό περιέχει νατραζίδιο (NaN3), µια χηµική ουσία που είναι ιδιαίτερα τοξική σε καθαρή µορφή. Σε συγκεντρώσεις του προϊόντος, αν και δεν έχει ταξινοµηθεί ως επικίνδυνο, το NaN3 ενδέχεται να αντιδράσει µε µολύβδινες ή χάλκινες υδραυλικές σωληνώσεις και να δηµιουργήσει ιδιαίτερα εκρηκτικά µεταλλικά αζίδια. Κατά την απόρριψη, εκπλύνετε µε άφθονη ποσότητα νερού για την πρόληψη συσσώρευσης αζιδίων µετάλλων στις υδραυλικές σωληνώσεις (12). 4. Το πρωτοταγές αντίσωµα, το αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα, το συνδετικό αντίσωµα και το αντιδραστήριο οπτικοποίησης περιέχουν υλικό ζωικής προέλευσης. 5. Πριν από και µετά τη µονιµοποίηση, πρέπει να χειρίζεστε τα δείγµατα και όλα τα υλικά που έχουν εκτεθεί σε αυτά, ως ικανά για τη µετάδοση λοιµώξεων και εποµένως πρέπει να τα απορρίπτετε µε τις κατάλληλες προφυλάξεις (13). 6. Τυχόν εφαρµογή χρόνων, θερµοκρασιών ή µεθόδων επώασης διαφορετικών από εκείνων που καθορίζονται στις οδηγίες ενδέχεται να δώσει εσφαλµένα αποτελέσµατα. 7. Τα αντιδραστήρια έχουν αραιωθεί µε βέλτιστο τρόπο. Κάθε περαιτέρω αραίωση ενδέχεται να προκαλέσει µείωση της αντιγονικής χρώσης. 8. Το αντιδραστήριο οπτικοποίησης, το υγρό DAB+ χρωµογόνο και το παρασκευασµένο διάλυµα χρωµογόνου-υποστρώµατος DAB+ µπορεί να επηρεαστεί αρνητικά εάν εκτεθεί σε έντονο φως. Μη φυλάσσετε τα µέρη του συστήµατος και µην εκτελείτε χρώση σε έντονο φως, όπως π.χ. το άµεσο ηλιακό φως. 9. Τα υπολείµµατα παραφίνης µπορεί να οδηγήσουν σε ψευδή αρνητικά αποτελέσµατα. 10. Η χρήση όγκων αντιδραστηρίων διαφορετικών από τους συνιστώµενους ενδέχεται να οδηγήσει σε απώλεια της ορατής ανοσοαντιδραστικότητας του PD-L Για µεγάλες τοµές ιστού που καλύπτουν τα 2/3 της αντικειµενοφόρου πλάκας µπορεί να απαιτούνται 3x150 µl αντιδραστηρίου. 12. Ως γενικός κανόνας, άτοµα ηλικίας κάτω των 18 ετών δεν επιτρέπεται να εργάζονται µε το προϊόν αυτό. Οι χρήστες πρέπει να λαµβάνουν οδηγίες για τις σωστές διαδικασίες εργασίας, τις επικίνδυνες ιδιότητες του προϊόντος και τις απαραίτητες οδηγίες ασφαλείας. Ανατρέξτε στο Φύλλο δεδοµένων ασφαλείας (SDS) για πρόσθετες πληροφορίες. 13. Πρέπει να φοράτε κατάλληλα Μέσα ατοµικής προστασίας για να αποφύγετε την επαφή µε τα µάτια και το δέρµα. 14. Το αχρησιµοποίητο διάλυµα θα πρέπει να απορρίπτεται σύµφωνα µε τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισµούς. 15. Το Φύλλο δεδοµένων ασφαλείας διατίθεται σε επαγγελµατίες χρήστες κατόπιν αίτησης. Κίνδυνος DAB+ Χρωµογόνο: 1 5% διφαινυλο-3,3,4,4 -τετραχλωριούχο τετραϋλοτετραµµώνιο H350 Μπορεί να προκαλέσει καρκίνο. H341 Υπάρχει υποψία ότι προκαλεί γενετικές βλάβες. P201 Λάβετε ειδικές οδηγίες πριν από τη χρήση. P202 Μην το χρησιµοποιείτε µέχρι να διαβάσετε και κατανοήσετε όλες τις προφυλάξεις ασφαλείας. P280 Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε συσκευή προστασίας µατιών ή προσώπου. Να φοράτε προστατευτική ενδυµασία. P308 + P313 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ έκθεσης ή ανησυχίας: Ζητήστε ιατρική φροντίδα. P405 Να φυλάσσεται κλειδωµένο. P501 Απορρίψτε τα περιεχόµενα και τον περιέκτη σύµφωνα µε όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισµούς. Προειδοποίηση EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x): 1-5% κιτρικό οξύ H319 Προκαλεί σοβαρό ερεθισµό των οφθαλµών. H411 Τοξικό για τους υδρόβιους οργανισµούς, µε µακροχρόνιες επιπτώσεις. P280 Να φοράτε συσκευή προστασίας µατιών ή προσώπου. P273 Αποφύγετε την απελευθέρωσή του στο περιβάλλον. P264 Πλύνετε καλά τα χέρια σας µετά τη χρήση. P305 + P351 + P338 ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΠΟΥ ΕΡΘΕΙ ΣΕ ΕΠΑΦΗ ΜΕ ΤΟΥΣ ΟΦΘΑΛΜΟΥΣ: Ξεπλύνετε προσεκτικά µε νερό για αρκετά λεπτά. Αφαιρέστε τους φακούς επαφής, εάν φοράτε και εάν είναι εύκολη η αφαίρεσή τους. Συνεχίστε την έκπλυση. P337 + P313 Εάν ο ερεθισµός των οφθαλµών παραµένει: Ζητήστε ιατρική φροντίδα. P501 Απορρίψτε τα περιεχόµενα και τον περιέκτη σύµφωνα µε όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισµούς. ( ) P03914GR_02/SK / σελ. 3/18

4 Φύλαξη Αποθηκεύστε όλα τα συστατικά του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, συµπεριλαµβανοµένων των αντικειµενοφόρων πλακών µάρτυρα, στο αρχικό δοχείο σε σκοτεινό χώρο, σε θερµοκρασία 2-8 C, όταν δεν χρησιµοποιούνται στο Autostainer Link 48. Μην χρησιµοποιείτε το κιτ µετά την ηµεροµηνία λήξης που βρίσκεται εκτυπωµένη στο εξωτερικό της συσκευασίας του κιτ. Εάν τα αντιδραστήρια φυλάσσονται σε διαφορετικές συνθήκες από εκείνες που προδιαγράφονται στο παρόν ένθετο συσκευασίας, η καταλληλότητά τους πρέπει να επικυρώνεται από το χρήστη. εν υπάρχουν εµφανείς ενδείξεις που υποδηλώνουν αστάθεια του προϊόντος αυτού. Εποµένως, οι θετικοί και αρνητικοί µάρτυρες θα πρέπει να εξετάζονται ταυτόχρονα µε τα δείγµατα του ασθενούς. Παρασκευή δειγµάτων Ο χειρισµός των δειγµάτων πρέπει να είναι τέτοιος ώστε να διατηρούν τον ιστό για τη χρώση IHC. Οι τυπικές µέθοδοι επεξεργασίας ιστών πρέπει να χρησιµοποιούνται σε όλα τα δείγµατα. Τοµές εγκλεισµένες σε παραφίνη Ιστοί µονιµοποιηµένοι σε φορµαλίνη και εγκλεισµένοι σε παραφίνη είναι κατάλληλοι προς χρήση. Οι συνιστώµενες συνθήκες χειρισµού και επεξεργασίας είναι οι εξής: Χρόνος ισχαιµίας <30 λεπτά πριν από τη βύθιση σε µέσο µονιµοποίησης και χρόνος µονιµοποίησης ώρες σε ουδέτερο ρυθµιστικό διάλυµα φορµαλίνης 10%. Εναλλακτικά µονιµοποιητικά δεν έχουν επικυρωθεί και ενδέχεται να δώσουν λανθασµένα αποτελέσµατα. Τα δείγµατα θα πρέπει να τεµαχίζονται σε πάχος 3 ή 4 mm, να µονιµοποιούνται σε ουδέτερο ρυθµιστικό διάλυµα φορµαλίνης 10%, καθώς και να αφυδατώνονται και να καθαρίζονται σε µια σειρά διαλυµάτων αλκοόλης και ξυλενίου και, στη συνέχεια, να εµποτίζονται µε τηγµένη παραφίνη. Η θερµοκρασία της παραφίνης δεν πρέπει να ξεπερνά τους 60 C. Τα δείγµατα ιστού πρέπει να κόβονται σε τοµές 4-5 µm. Μετά τον τεµαχισµό, οι ιστοί θα πρέπει να τοποθετούνται σε φορτισµένες αντικειµενοφόρους πλάκες Fisherbrand Superfrost Plus ή αντικειµενοφόρους πλάκες µικροσκοπίου Dako FLEX IHC (Κωδικός K8020) και, στη συνέχεια, να τοποθετούνται σε φούρνο στους 58 ± 2 C για 1 ώρα. Για να διατηρηθεί η αντιγονικότητα, οι τοµές ιστών, µόλις τοποθετηθούν σε αντικειµενοφόρους πλάκες, θα πρέπει να αποθηκεύονται σε σκοτεινό χώρο, σε θερµοκρασία 2-8 C ή σε θερµοκρασία δωµατίου έως και 25 C και να χρωµατίζονται εντός 4 µηνών από τον τεµαχισµό. Οι συνθήκες χειρισµού και φύλαξης των αντικειµενοφόρων πλακών δεν θα πρέπει να υπερβαίνουν τους 25 C ανά πάσα στιγµή µετά την επικάλυψη, προκειµένου να διασφαλίζεται η αντιγονικότητα και η ακεραιότητα των ιστών. Η χρήση του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx σε απασβεστωµένους ιστούς δεν έχει επικυρωθεί και δεν συνιστάται. Προετοιµασία αντιδραστηρίων Πριν από τη χρώση πρέπει να παρασκευάζονται τα ακόλουθα αντιδραστήρια: EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) Παρασκευάστε επαρκή ποσότητα Target Retrieval Solution, Low ph αραιώνοντας το Target Retrieval Solution, Low ph (50x) σε αναλογία 1:50 χρησιµοποιώντας νερό ποιότητας αντιδραστηρίου. Το ph του 1x Target Retrieval Solution θα πρέπει να είναι 6,1 ± 0,2. Μία φιάλη 30 ml του Target Retrieval Solution, Low ph (50x) αραιωµένη σε αναλογία 1:50, θα παρέχει 1,5 L 1x αντιδραστηρίου, επαρκούς για την πλήρωση ενός δοχείου PT Link, το οποίο θα χρησιµοποιηθεί σε έως και 24 αντικειµενοφόρους πλάκες ανά χρήση. Απορρίψτε 1x Target Retrieval Solution µετά από τρεις χρήσεις και όχι αργότερα από 5 ηµέρες µετά την αραίωση. Επιπλέον διάλυµα EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) εάν απαιτείται, διατίθεται µε τον Κωδικό K8005. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) Για τα στάδια της πλύσης, παρασκευάστε µια επαρκή ποσότητα ρυθµιστικού διαλύµατος πλύσης, αραιώνοντας το Wash Buffer (20x) σε αναλογία 1:20 χρησιµοποιώντας νερό ποιότητας αντιδραστηρίου για τα βήµατα πλύσης. Φυλάσσετε όσο ρυθµιστικό διάλυµα δεν χρησιµοποιηθεί στους 2-8 C για διάστηµα όχι µεγαλύτερο από ένα µήνα. Εάν το αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα παρουσιάζει νεφέλωση, απορρίψτε το. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στις Οδηγίες χρήσης για το Autostainer Link 48. Το EnVision FLEX Wash Buffer (20x) διατίθεται µε τον Κωδικό K8007. DAB+ διάλυµα υποστρώµατος χρωµογόνου Το διάλυµα αυτό πρέπει να αναµειγνύεται σχολαστικά πριν από τη χρήση. Τυχόν ίζηµα που έχει σχηµατιστεί στο διάλυµα δεν επηρεάζει δυσµενώς την ποιότητα της χρώσης. Για την παρασκευή του διαλύµατος χρωµογόνου-υποστρώµατος DAB+, προσθέστε 1 σταγόνα υγρού DAB+ χρωµογόνου ανά ml ρυθµιστικού διαλύµατος υποστρώµατος DAB+ και αναδεύστε. Το παρασκευασµένο διάλυµα χρωµογόνου-υποστρώµατος είναι σταθερό για 5 ηµέρες εάν αποθηκευτεί σε σκοτεινό χώρο, σε θερµοκρασία 2-8 C. Σηµαντικές σηµειώσεις: Εάν χρησιµοποιείτε µία ολόκληρη φιάλη ρυθµιστικού διαλύµατος υποστρώµατος DAB+, προσθέστε 9 σταγόνες χρωµογόνου DAB+. Παρόλο που στην ετικέτα αναγράφεται η ένδειξη 7,2 ml, αυτός είναι ο µη χρησιµοποιήσιµος όγκος και δεν προσµετράται στο "νεκρό όγκο" της φιάλης. Το χρώµα του υγρού χρωµογόνου DAB+ στη φιάλη ενδέχεται να ποικίλλει από διαυγές έως ανοιχτό µοβ-καφέ. Αυτό δεν επηρεάζει δυσµενώς την απόδοση του προϊόντος αυτού. Αραιώστε σύµφωνα µε τις παραπάνω οδηγίες. Η προσθήκη επιπλέον υγρού DAB+ χρωµογόνο στο DAB+ ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος έχει ως αποτέλεσµα τη χειροτέρευση του θετικού σήµατος. ( ) P03914GR_02/SK / σελ. 4/18

5 ιαδικασία χρώσης στο Autostainer Link 48 Σηµειώσεις διαδικασίας Ο χρήστης πρέπει να µελετήσει τις οδηγίες αυτές προσεκτικά και να εξοικειωθεί µε όλα τα συστατικά µέρη και όργανα, πριν από τη χρήση (βλ. ενότητα Προφυλάξεις). Πριν από την ανοσοχρώση, όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να ισορροπούν σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C). Με παρόµοιο τρόπο, όλες οι επωάσεις πρέπει να εκτελεστούν σε θερµοκρασία δωµατίου. Μην επιτρέπετε το στέγνωµα των ιστικών τοµών κατά τη διαδικασία χρώσης. Οι στεγνές τοµές ιστών ενδέχεται να παρουσιάσουν αυξηµένη µη ειδική χρώση. Όλα τα απαιτούµενα βήµατα και οι χρόνοι επώασης για τη χρώση έχουν προγραµµατιστεί εκ των προτέρων στο λογισµικό του Dako Link. Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά µε τα πρωτόκολλα προγραµµατισµού και την τοποθέτηση των αντικειµενοφόρων πλακών και των αντιδραστηρίων, ανατρέξτε στις Οδηγίες χρήσης για το Autostainer Link 48 και το PT Link. Σηµείωση: Τα αντιδραστήρια και οι οδηγίες που παρέχονται µε το παρόν σύστηµα έχουν σχεδιαστεί για βέλτιστη απόδοση µε χρήση των συνιστώµενων αντιδραστηρίων και υλικών. Η περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων ή η αλλαγή στους χρόνους επώασης ή στις θερµοκρασίες, µπορεί δώσουν εσφαλµένα ή αντικρουόµενα αποτελέσµατα. Πρωτόκολλο χρώσης Επιλέξτε το πρωτόκολλο χρώσης PD-L1 IHC 28-8 pharmdx από τις επιλογές στο αναπτυσσόµενο µενού του DakoLink. Όλα τα απαιτούµενα βήµατα και οι χρόνοι επώασης για τη χρώση έχουν προγραµµατιστεί εκ των προτέρων στο Dako Link. Εάν τα κατάλληλα πρωτόκολλα PD-L1 IHC 28-8 pharmdx δεν βρίσκονται στο διακοµιστή σας, επικοινωνήστε µε τον τοπικό αντιπρόσωπο της τεχνικής υπηρεσίας. Βήµα 1: ιαδικασία αποπαραφίνωσης, επανυδάτωσης και ανάκτησης στόχου (3 σε 1) Συνιστώµενη διαδικασία: Για λεπτοµέρειες, ανατρέξτε στον οδηγό χρήσης του PT Link. Ορίστε τη θερµοκρασία προθέρµανσης (Preheat) και ψύξης (Cool) του PT Link (Κωδικός PT100/PT101) στους 65 C. Ορίστε τη θερµοκρασία θέρµανσης (Heat) στους 97 C για 20 λεπτά. Γεµίστε τα δοχεία PT Link µε 1,5 L ανά δοχείο από το Target Retrieval Solution, Low ph, 1x διάλυµα εργασίας, για να καλύψετε τις τοµές των ιστών. Προθερµάνετε το Target Retrieval Solution στους 65 C. Εµβαπτίστε τους υποδοχείς Autostainer που περιέχουν τις τοποθετηµένες τοµές ιστών FFPE στο προθερµασµένο Target Retrieval Solution, Low ph (1x διάλυµα εργασίας) στο δοχείο PT Link. Επωάστε για 20 λεπτά στους 97 C. Μόλις ολοκληρωθεί ο χρόνος επώασης ανάκτησης στόχου και η θερµοκρασία µειωθεί στους 65 C, αφαιρέστε κάθε υποδοχέα αντικειµενοφόρων πλακών Autostainer µε τις αντικειµενοφόρους πλάκες από το δοχείο PT Link και τοποθετήστε αµέσως τον υποδοχέα Autostainer µε τις αντικειµενοφόρους πλάκες µέσα σε ένα δοχείο (π.χ., PT Link Rinse Station, Κωδικός PT109) που περιέχει αραιωµένο Wash Buffer (Κωδικός K8007) σε θερµοκρασία δωµατίου. Αφήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε αραιωµένο, σε θερµοκρασία δωµατίου, ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης για 5 λεπτά. Βήµα 2: ιαδικασία χρώσης Μετά τη διαδικασία αποπαραφίνωσης, επανυδάτωσης και ανάκτησης στόχου (3 σε 1), οι υποδοχείς Autostainer µε τις αντικειµενοφόρους πλάκες τοποθετούνται στο Autostainer Link 48. Ενώ φορτώνετε και πριν την έναρξη του κύκλου, βεβαιωθείτε ότι οι αντικειµενοφόροι παραµένουν υγρές µε ρυθµιστικό διάλυµα. Το όργανο διεξάγει τη διαδικασία χρώσης χρησιµοποιώντας το κατάλληλο αντιδραστήριο, παρακολουθώντας το χρόνο επώασης και εκπλένοντας τις αντικειµενοφόρους πλάκες µεταξύ των αντιδραστηρίων. Οι χρόνοι αντιδραστηρίων έχουν προγραµµατιστεί εκ των προτέρων στο λογισµικό του Dako Link. Βήµα 3: Αντίχρωση Οι αντικειµενοφόροι πλάκες θα πρέπει να υποβληθούν σε αντίχρωση µε αιµατοξυλίνη για 7 λεπτά, µε χρήση του EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (Κωδικός K8008). Ο χρόνος επώασης του Hematoxylin έχει προγραµµατιστεί εκ των προτέρων στο πρωτόκολλο. Βήµα 4: Επικάλυψη Απαιτείται µη υδατικό µέσο µόνιµης επικάλυψης. Σηµείωση: Ωστόσο, µπορεί να παρατηρηθεί κάποιος αποχρωµατισµός των χρωµατισµένων αντικειµενοφόρων πλακών µε την πάροδο του χρόνου, ο οποίος εξαρτάται από αρκετούς παράγοντες που περιλαµβάνουν, µεταξύ άλλων, την αντίχρωση, τα υλικά και τις µεθόδους επικάλυψης και τις συνθήκες αποθήκευσης των αντικειµενοφόρων πλακών. Για την ελαχιστοποίηση του ξεθωριάσµατος, φυλάσσετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες στο σκοτάδι σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C). Ποιοτικός έλεγχος Τα αντιδραστήρια στο PD-L1 IHC 28-8 pharmdx έχουν υποβληθεί σε ποιοτικό έλεγχο ανοσοϊστοχηµικώς, χρησιµοποιώντας τις διαδικασίες χρώσης και ανάκτησης στόχου που περιγράφονται παραπάνω. Οι αποκλίσεις του εργαστηρίου του χρήστη από τις προτεινόµενες διαδικασίες µονιµοποίησης, επεξεργασίας και εγκλεισµού του ιστού ενδέχεται να προκαλούν σηµαντικές διακυµάνσεις στα αποτελέσµατα. Θα πρέπει να πραγµατοποιούνται έλεγχοι ποιότητας σε κάθε κύκλο χρώσης. Αυτοί οι έλεγχοι ποιότητας καθορίζονται στον Πίνακα 1 και περιλαµβάνουν τα εξής: ένα δείγµα ιστού ασθενούς κεχρωσµένο µε H&E, ιστούς αρνητικού και θετικού µάρτυρα παρεχόµενους από το εργαστήριο, καθώς και µία αντικειµενοφόρο πλάκα µάρτυρα που παρέχεται από την Dako (15). Στις Η.Π.Α., συµβουλευτείτε τις οδηγίες ποιοτικού ελέγχου του College of American Pathologists (CAP) Accreditation Program for Immunohistochemistry (Πρόγραµµα πιστοποίησης για την ανοσοϊστοχηµεία από το Σύλλογο Αµερικανών Παθολογοανατόµων). Για περισσότερες πληροφορίες, βλ. επίσης το CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (14) (Εγκεκριµένη κατευθυντήρια οδηγία διασφάλισης ποιότητας για την ανοσοϊστοχηµεία του CLSI). ( ) P03914GR_02/SK / σελ. 5/18

6 Επαλήθευση δοκιµασίας προσδιορισµού Πριν το σύστηµα χρώσης χρησιµοποιηθεί σε διαγνωστικές διαδικασίες, ο χρήστης θα πρέπει να επαληθεύσει την απόδοση της δοκιµασίας, εξετάζοντάς την µε µια σειρά ιστών του εργαστηρίου που έχουν γνωστά χαρακτηριστικά απόδοσης σε τεχνικές IHC και οι οποίοι να αντιπροσωπεύουν γνωστούς θετικούς και αρνητικούς ιστούς. Ανατρέξτε στις διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου που περιγράφηκαν προηγουµένως στην ενότητα αυτή του ένθετου προϊόντος. Αυτές οι διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου πρέπει να επαναλαµβάνονται για κάθε νέο κιτ ή σε κάθε περίπτωση µεταβολής των παραµέτρων του προσδιορισµού. Οι επιλογές αντιµετώπισης προβληµάτων για ενδεχόµενα προβλήµατα, οι αιτίες τους και οι προτεινόµενες διορθωτικές ενέργειες περιγράφονται στον Πίνακα 12. Ερµηνεία χρώσης - Μη πλακώδης ΜΜΚΠ και µελάνωµα Η αξιολόγηση της αντικειµενοφόρου πρέπει να πραγµατοποιείται από παθολόγο µε χρήση κοινού µικροσκοπίου. Για την αξιολόγηση της ανοσοϊστοχηµικής χρώσης και της βαθµολόγησης του PD-L1, µπορεί να χρησιµοποιηθεί ένας αντικειµενικός φακός µεγέθυνσης 4x για την αρχική αξιολόγηση ολόκληρου του δείγµατος, και κατόπιν µπορούν να χρησιµοποιηθούν αντικειµενικοί φακοί µεγέθυνσης 10-20x για τη βαθµολόγηση (εάν είναι απαραίτητο, µπορούν να χρησιµοποιηθούν φακοί µεγέθυνσης 40x για επιβεβαίωση). Η χρώση του PD-L1 υποδεικνύεται µε ένα καστανό προϊόν αντίδρασης (3,3 -διαµινοβενζιδίνη, DAB). Η θετική χρώση του PD-L1 ορίζεται ως πλήρης περιφερειακή ή/και µερική γραµµική χρώση της πλασµατικής µεµβράνης των κυττάρων όγκων σε οποιαδήποτε ένταση. Πρέπει να αξιολογηθεί ολόκληρο το δείγµα. Όλα τα βιώσιµα κύτταρα όγκων σε ολόκληρη την κεχρωσµένη αντικειµενοφόρο πλάκα ασθενούς PD-L1 πρέπει να αξιολογηθούν και να συµπεριληφθούν στην αξιολόγηση βαθµολόγησης PD-L1. Θα πρέπει να υπάρχουν τουλάχιστον 100 βιώσιµα κύτταρα όγκων στην κεχρωσµένη αντικειµενοφόρο πλάκα ασθενούς PD-L1, προκειµένου να προσδιοριστεί το ποσοστό των κεχρωσµένων κυττάρων. Τυχόν κυτταροπλασµατική χρώση, εάν παρατηρηθεί, δεν λαµβάνεται υπόψη για σκοπούς βαθµολόγησης. Μη κακοήθη κύτταρα και ανοσοκύτταρα (π.χ., διηθητικά λεµφοκύτταρα ή µακροφάγα) µπορεί επίσης να παρουσιάσουν χρώση µε το PD-L1. Ωστόσο, δεν θα πρέπει να συµπεριληφθούν στη βαθµολογία για τον προσδιορισµό της θετικότητας του PD-L1. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Κατά την ερµηνεία των δειγµάτων µελανωµάτων των ασθενών, ενδέχεται να υπάρχει χρώση µελανίνης καστανού χρώµατος. Η µελανίνη δεν θα πρέπει να περιλαµβάνεται στη βαθµολογία της χρώσης πλασµατικής µεµβράνης. Η σύγκριση µε µια διαδοχική αντικειµενοφόρο πλάκα κεχρωσµένη µε το NCR ενδέχεται να είναι χρήσιµη για τον προσδιορισµό και τον αποκλεισµό του περιεχοµένου µελανίνης. Εάν τα εξαιρετικά αυξηµένα επίπεδα µελανίνης αποκλείουν τη βαθµολογία της χρώσης πλασµατικής µεµβράνης των κυττάρων όγκων, το δείγµα ενδέχεται να µην συµπεριληφθεί στην ερµηνεία και να θεωρηθεί ότι είναι απροσδιόριστο. Για κάθε κύκλο χρώσης, οι αντικειµενοφόροι πλάκες θα πρέπει να εξετάζονται µε τη σειρά που αναφέρεται στον Πίνακα 1, για τον προσδιορισµό της εγκυρότητας του κύκλου χρώσης και την αξιολόγηση της χρώσης στον ιστό του δείγµατος. Για πρόσθετες πληροφορίες, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο ερµηνειών του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx για το µη πλακώδη, µη µικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύµονα ή για το µελάνωµα. Πίνακας 1: Προτεινόµενη σειρά αξιολόγησης των αντικειµενοφόρων πλακών είγµατα Αιτιολογία Απαιτήσεις 1. H&E (Παρέχεται από το εργαστήριο) Αρχικά αξιολογείται µια χρώση αιµατοξυλίνης και ηωσίνης (H&E) του ιστικού δείγµατος, προκειµένου να αξιολογηθεί η ποιότητα της ιστολογικής επεξεργασίας και της διατήρησης του ιστού. 2. Αντικειµενοφόρος πλάκα µάρτυρα (Παρέχεται από την Dako) Η αντικειµενοφόρος πλάκα µάρτυρα, που είναι κεχρωσµένη µε το πρωτοταγές αντίσωµα PD-L1 από το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, θα πρέπει να εξετάζεται για να διασφαλιστεί ότι όλα τα αντιδραστήρια λειτουργούν σωστά. Η χρώση H&E και του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx θα πρέπει να πραγµατοποιείται σε διαδοχικές τοµές από το ίδιο µπλοκ παραφίνης του δείγµατος. Τα δείγµατα ιστού θα πρέπει να είναι ακέραια, κατάλληλα διατηρηµένα και θα πρέπει να επιβεβαιώνουν την ένδειξη όγκου. Θα πρέπει να πραγµατοποιηθεί χρώση µίας αντικειµενοφόρου πλάκας µάρτυρα µε το πρωτοταγές αντίσωµα έναντι του PD-L1 σε κάθε κύκλο χρώσης. Κριτήρια αποδοχής του NCI-H226 (κυτταρική σειρά µάρτυρα θετικού για το PD-L1): Χρώση πλασµατικής µεµβράνης σε ποσοστό 80% των κυττάρων σε µέση ένταση χρώσης 2+. Μη ειδική χρώση σε ένταση <1+. Η αντικειµενοφόρος πλάκα µάρτυρα περιέχει το συµπύκνωµα κυτταρικών σειρών θετικών για PD-L1 και το συµπύκνωµα κυτταρικών σειρών αρνητικών για PD-L1. Κριτήρια αποδοχής του MCF-7 (κυτταρική σειρά µάρτυρα αρνητικού για PD-L1): Μη ειδική χρώση. Μη ειδική χρώση σε ένταση <1+. Λάβετε υπόψη ότι ενδέχεται περιστασιακά να παρατηρείται χρώση λίγων κυττάρων στο συµπύκνωµα κυττάρων MCF-7. Ισχύουν τα ακόλουθα κριτήρια αποδοχής: Η παρουσία 10 συνολικών κυττάρων µε διακριτή χρώση πλασµατικής µεµβράνης ή κυτταροπλασµατική χρώση µε ένταση 1+ εντός των ορίων του συµπυκνώµατος κυττάρων MCF-7 είναι αποδεκτή. Εάν οποιαδήποτε από τις κυτταρικές σειρές µάρτυρα δεν πληροί τα κριτήρια αυτά, όλα τα αποτελέσµατα για τα δείγµατα ασθενών θα πρέπει να θεωρούνται µη έγκυρα. ( ) P03914GR_02/SK / σελ. 6/18

7 3. Αντικειµενοφόροι πλάκες µε ιστό θετικού µάρτυρα (Παρέχεται από το εργαστήριο) Στη συνέχεια, θα πρέπει να εξεταστούν οι αντικειµενοφόροι πλάκες µε ιστό θετικού µάρτυρα, οι οποίες έχουν υποβληθεί σε χρώση µε το πρωτοταγές αντίσωµα PD-L1 και µε το αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα. Αυτές οι αντικειµενοφόροι πλάκες επαληθεύουν ότι η µέθοδος µονιµοποίησης και η διαδικασία ανάκτησης στόχου είναι αποτελεσµατικές. Γνωστοί ιστοί θετικού µάρτυρα θα πρέπει να χρησιµοποιούνται µόνο για την παρακολούθηση της σωστής απόδοσης των επεξεργασµένων ιστών και των αντιδραστηρίων της εξέτασης, και ΟΧΙ ως βοήθηµα στο σχηµατισµό κάποιας συγκεκριµένης διάγνωσης των δειγµάτων του ασθενούς. Οι µάρτυρες θα πρέπει να είναι δείγµατα από βιοψίες/χειρουργικές επεµβάσεις µε την ίδια ένδειξη όγκου µε το δείγµα του ασθενούς, που έχουν µονιµοποιηθεί, επεξεργαστεί και εγκλειστεί το συντοµότερο δυνατό και µε τον ίδιο τρόπο όπως το(τα) δείγµα(τα) ασθενούς. Για την ερµηνεία των αποτελεσµάτων της χρώσης, χρησιµοποιείτε άθικτα δείγµατα, διότι τα νεκρωτικά ή εκφυλισµένα κύτταρα συχνά εµφανίζουν µη ειδική χρώση. Οι ιστοί που επιλέγονται για χρήση ως ιστοί θετικού µάρτυρα θα πρέπει να παρουσιάζουν ασθενή έως µέτρια θετική χρώση όταν υποβάλλονται σε χρώση µε το PD-L1, ώστε να συµβάλλουν στην ανίχνευση ανεπαίσθητων µεταβολών στην ευαισθησία της δοκιµασίας. Σε κάθε κύκλο χρώσης θα πρέπει να περιλαµβάνονται δύο αντικειµενοφόροι πλάκες µε ιστό θετικού µάρτυρα. Αντικειµενοφόρος πλάκα κεχρωσµένη µε PD-L1: Πρέπει να παρατηρηθεί παρουσία καφέ χρώσης της πλασµατικής µεµβράνης. Η µη ειδική χρώση θα πρέπει να είναι 1+. Αντικειµενοφόρος πλάκα κεχρωσµένη µε αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα: Απουσία χρώσης µεµβράνης. Η µη ειδική χρώση θα πρέπει να είναι Αντικειµενοφόροι πλάκες µε ιστό αρνητικού µάρτυρα (Παρέχεται από το εργαστήριο) 5. Αντικειµενοφόρος πλάκα µε ιστό ασθενούς χρωµατισµένο µε το αντιδραστήριο αρνητικό µάρτυρα 6. Αντικειµενοφόρος πλάκα µε δείγµα ασθενούς που έχει υποβληθεί σε χρώση χρησιµοποιώντας το πρωτοταγές αντίσωµα PD-L1 Στη συνέχεια, θα πρέπει να εξεταστούν οι αντικειµενοφόροι πλάκες µε ιστό αρνητικού µάρτυρα (που είναι γνωστό ότι είναι αρνητικός για PD-L1), οι οποίες έχουν υποβληθεί σε χρώση µε το πρωτοταγές αντίσωµα PD-L1 και µε το αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα, για επαλήθευση της ειδικότητας της σήµανσης του αντιγόνου-στόχου από το πρωτοταγές αντίσωµα. Εναλλακτικά, αρνητικά τµήµατα του ιστού αρνητικού-µάρτυρα µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως ιστός αρνητικός-µάρτυρας, αλλά τούτο πρέπει να επαληθεύεται από το χρήστη. Εξετάστε τα δείγµατα ασθενούς που έχουν υποβληθεί σε χρώση µε το αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα από το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Το αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα χρησιµοποιείται αντί του πρωτοταγούς αντισώµατος και συµβάλλει στην ερµηνεία της ειδικής χρώσης στη θέση του αντιγόνου. Εξετάστε στο τέλος ολόκληρη την αντικειµενοφόρο πλάκα των δειγµάτων ασθενών µε το πρωτοταγές αντίσωµα PD-L1 από το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Ανατρέξτε στην Περίληψη και επεξήγηση, τους Περιορισµούς και τα Χαρακτηριστικά απόδοσης για ειδικές πληροφορίες σχετικά µε την ανοσοδραστικότητα του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Αν οι ιστοί θετικού µάρτυρα δεν επιτύχουν να παρουσιάσουν κατάλληλη θετική χρώση, τα αποτελέσµατα µε τα δείγµατα της εξέτασης πρέπει να θεωρούνται άκυρα. Οι µάρτυρες θα πρέπει να είναι δείγµατα από βιοψίες/χειρουργικές επεµβάσεις µε την ίδια ένδειξη όγκου µε το δείγµα του ασθενούς, που έχουν µονιµοποιηθεί, επεξεργαστεί και εγκλειστεί το συντοµότερο δυνατό και µε τον ίδιο τρόπο όπως το(τα) δείγµα(τα) ασθενούς. Σε κάθε κύκλο χρώσης θα πρέπει να περιλαµβάνονται δύο αντικειµενοφόροι πλάκες µε ιστό αρνητικού µάρτυρα. Αντικειµενοφόρος πλάκα κεχρωσµένη µε PD-L1: Απουσία χρώσης µεµβράνης στα κύτταρα όγκων. Η µη ειδική χρώση θα πρέπει να είναι 1+. Αντικειµενοφόρος πλάκα κεχρωσµένη µε αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα: Απουσία χρώσης µεµβράνης. Η µη ειδική χρώση θα πρέπει να είναι 1+. Εάν παρατηρηθεί ειδική χρώση πλασµατικής µεµβράνης στις αντικειµενοφόρους πλάκες µε ιστό αρνητικού µάρτυρα, τα αποτελέσµατα των δειγµάτων ασθενούς θα πρέπει να θεωρηθούν µη έγκυρα. Η απουσία χρώσης πλασµατικής µεµβράνης επαληθεύει την ειδική σήµανση του αντιγόνου-στόχου από το πρωτοταγές αντίσωµα PD-L1. Η µη ειδική χρώση θα πρέπει να είναι 1+. Θα πρέπει να αξιολογηθεί η ένταση της θετικής χρώσης στο πλαίσιο µη ειδικής χρώσης υποβάθρου που παρατηρείται στην αντικειµενοφόρο πλάκα του αντιδραστηρίου αρνητικού µάρτυρα στον ίδιο κύκλο χρώσης. Όπως συµβαίνει µε κάθε ανοσοϊστοχηµική εξέταση, ένα αρνητικό αποτέλεσµα σηµαίνει ότι δεν ανιχνεύτηκε αντιγόνο και όχι απαραίτητα ότι δεν υπήρχε αντιγόνο στα κύτταρα/στον ιστό που υποβλήθηκε στον προσδιορισµό. Όλα τα βιώσιµα κύτταρα όγκων σε ολόκληρη την κεχρωσµένη αντικειµενοφόρο πλάκα ασθενούς PD-L1 πρέπει να αξιολογηθούν και να συµπεριληφθούν στην αξιολόγηση βαθµολόγησης PD-L1. Θα πρέπει να υπάρχουν τουλάχιστον 100 βιώσιµα κύτταρα όγκων στην κεχρωσµένη αντικειµενοφόρο πλάκα ασθενούς PD-L1, προκειµένου να προσδιοριστεί το ποσοστό των κεχρωσµένων κυττάρων. ( ) P03914GR_02/SK / σελ. 7/18

8 Γενικοί περιορισµοί 1. Η ανοσοϊστοχηµεία είναι µια πολυβάθµια διαγνωστική διαδικασία για την οποία απαιτείται εξειδικευµένη εκπαίδευση στην επιλογή των κατάλληλων αντιδραστηρίων, την επιλογή, µονιµοποίηση και επεξεργασία των ιστών, την προετοιµασία της αντικειµενοφόρου πλάκας ανοσοϊστοχηµείας και την ερµηνεία των αποτελεσµάτων χρώσης. 2. Η ιστική χρώση εξαρτάται από το χειρισµό και την επεξεργασία του ιστού πριν από τη χρώση. Τυχόν εσφαλµένη καθήλωση, κατάψυξη, απόψυξη, πλύση, ξήρανση, θέρµανση, τοµή ή µόλυνση από άλλους ιστούς ή υγρά είναι δυνατό να προκαλέσει τεχνήµατα, παγίδευση αντισώµατος ή εσφαλµένως αρνητικά αποτελέσµατα. Τυχόν ασυνεπή αποτελέσµατα ενδέχεται να οφείλονται σε παραλλαγές των µεθόδων µονιµοποίησης και ενσωµάτωσης ή σε εγγενείς ανωµαλίες εντός του ιστού. 3. Τυχόν υπερβολική ή ατελής επίχρωση ενδέχεται να διακυβεύσει την ορθότητα της ερµηνείας των αποτελεσµάτων. 4. Η κλινική ερµηνεία τυχόν θετικής χρώσης ή η απουσία της πρέπει να αξιολογείται στα πλαίσια της κλινικής παρουσίασης, της µορφολογίας και άλλων ιστοπαθολογικών κριτηρίων. Η κλινική ερµηνεία κάθε θετικής χρώσης ή η απουσία της θετικής χρώσης πρέπει να συµπληρώνεται από µελέτες της µορφολογίας και τους σωστούς µάρτυρες όπως επίσης και άλλες διαγνωστικές εξετάσεις. Η ερµηνεία της κεχρωσµένης αντικειµενοφόρου πλάκας αποτελεί ευθύνη κατάλληλα εκπαιδευµένου παθολόγου, που είναι εξοικειωµένος µε τα χρησιµοποιούµενα αντισώµατα και αντιδραστήρια και τις εφαρµοζόµενες µεθόδους. Η χρώση πρέπει να εφαρµόζεται σε εργαστήριο που διαθέτει τις κατάλληλες πιστοποιήσεις και άδειες λειτουργίας, υπό την επίβλεψη παθολόγου που θα φέρει την ευθύνη της εξέτασης των κεχρωσµένων αντικειµενοφόρων πλακών και θα διασφαλίζει την επάρκεια των θετικών και των αρνητικών µαρτύρων. 5. Ιστοί από άτοµα µολυσµένα από τον ιό της ηπατίτιδας Β, που περιέχουν επιφανειακό αντιγόνο της ηπατίτιδας B (HBsAg), ενδέχεται να παρουσιάσουν µη ειδική χρώση µε την υπεροξειδάση του χρένου (15). 6. Η πιθανότητα να λάβουν χώρα απροσδόκητες αντιδράσεις σε τύπους ιστών που έχουν υποβληθεί σε εξέταση στο παρελθόν δεν είναι δυνατό να εξαλειφθεί τελείως, λόγω της βιολογικής παραλλακτικότητας της έκφρασης αντιγόνου στα νεοπλάσµατα ή σε άλλους παθολογικούς ιστούς. Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά µε τεκµηριωµένες µη αναµενόµενες αντιδράσεις, απευθυνθείτε στο Τµήµα τεχνικής υποστήριξης της Dako. 7. Ψευδώς θετικά αποτελέσµατα είναι δυνατό να προκύψουν λόγω µη ανοσολογικής δέσµευσης πρωτεϊνών ή προϊόντων αντίδρασης του υποστρώµατος. Επίσης, είναι δυνατό να προκύψουν από δραστηριότητα ψευδο-υπεροξειδάσης (ερυθροκύτταρα) και ενδογενούς υπεροξειδάσης (κυτόχρωµα C) (14). 8. Τα αντιδραστήρια και οι οδηγίες που παρέχονται στο σύστηµα αυτό έχουν σχεδιαστεί για βέλτιστη απόδοση. Η περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων ή η αλλαγή στους χρόνους επώασης ή στις θερµοκρασίες, µπορεί δώσουν εσφαλµένα ή αντικρουόµενα αποτελέσµατα. Ειδικοί περιορισµοί προϊόντος 1. Ψευδώς αρνητικά αποτελέσµατα είναι δυνατό να οφείλονται στην αποδόµηση του αντιγόνου στους ιστούς µε την πάροδο του χρόνου. Οι τοµές ιστών, µόλις τοποθετηθούν σε αντικειµενοφόρους πλάκες, θα πρέπει να αποθηκεύονται σε σκοτεινό χώρο, σε θερµοκρασία 2-8 C ή σε θερµοκρασία δωµατίου έως και 25 C και να χρωµατίζονται εντός 4 µηνών από τον τεµαχισµό. Οι συνθήκες χειρισµού και φύλαξης των αντικειµενοφόρων πλακών δεν θα πρέπει να υπερβαίνουν τους 25 C ανά πάσα στιγµή µετά την επικάλυψη, προκειµένου να διασφαλίζεται η αντιγονικότητα και η ακεραιότητα των ιστών. 2. Για βέλτιστα και αναπαραγώγιµα αποτελέσµατα, η πρωτεΐνη PD-L1 απαιτεί προεπεξεργασία ανάκτησης στόχου όταν οι ιστοί µονιµοποιούνται µε το συνήθη τρόπο (ουδέτερο ρυθµιστικό διάλυµα φορµαλίνης) και εγκλείονται σε παραφίνη. 3. Μην υποκαθιστάτε αντιδραστήρια από άλλους αριθµούς παρτίδας αυτού του προϊόντος ή από κιτ άλλων κατασκευαστών. Η µοναδική εξαίρεση είναι το EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x), το οποίο, εάν απαιτείται, διατίθεται µε τον Κωδικό K Οι χρωµατισµένες κυτταρικές σειρές µάρτυρες πρέπει να χρησιµοποιούνται µόνο για την επικύρωση του κύκλου χρώσης και δεν πρέπει να χρησιµοποιούνται ως οδηγός για τη βαθµολόγηση της αντίδρασης χρώσης σε τοµές ιστών. 5. Η χρήση του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx σε ιστούς µε µονιµοποιητικά διαφορετικά του ουδέτερου ρυθµιστικού διαλύµατος φορµαλίνης 10% δεν έχει επικυρωθεί. 6. Οι βιοψίες µε χειρουργική εξαίρεση, κατόπιν διάνοιξης ιστού, κυλινδρικής ολικού πάχους δέρµατος ή δια λεπτής βελόνης θεωρήθηκαν αποδεκτοί τύποι δειγµάτων για τις κλινικές δοκιµές, µε χρήση του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Οι αναρροφήσεις δια λεπτής βελόνης ή άλλα κυτταρολογικά δείγµατα ήταν ανεπαρκή για τις αναλύσεις βιοδεικτών και αποκλείστηκαν από τις κλινικές δοκιµές, µε χρήση του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Αξιολόγηση µη κλινικής απόδοσης Αναλυτική ειδικότητα για το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Το πρωτοταγές αντίσωµα για το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx είναι ένα µονοκλωνικό αντίσωµα κουνελιού έναντι του ανθρώπινου PD-L1, κλώνος Το ανοσογόνο που χρησιµοποιείται για τη δηµιουργία του αντισώµατος είναι ένα ανασυνδυασµένο και κεκαθαρµένο ανθρώπινο PD-L1 που περιέχει την εξωκυτταρική περιοχή (Phe19-Thr239) του ανθρώπινου PD-L1. Η χρώση IHC µε το πρωτοταγές αντίσωµα PD-L1 δεν παρουσίασε διασταυρούµενη αντίδραση για το PD-L2 µέσω εξωγενούς έκφρασης σε κύτταρα ωοθηκών κινέζικου χάµστερ (CHO). Το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx ανιχνεύει ειδικά τη µεµβρανική πρωτεΐνη PD-L1 που εκφράζεται σε κύτταρα όγκων σε ιστούς FFPE, που µπορεί να εξαλειφθεί εντελώς µε την προσθήκη του αντιγόνου PD-L1. Το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx δεν ανιχνεύει µεµβρανική πρωτεΐνη PD-L1 σε κύτταρα όγκων επιλεκτικώς αδρανοποιηµένου (knock-out) PD-L1 στα οποία το γονίδιο PD-L1 έχει διαγραφεί γενετικά. Φυσιολογικοί και νεοπλασµατικοί ιστοί Στον Πίνακα 2 συνοψίζεται η ανοσοαντιδραστικότητα του µονοκλωνικού αντισώµατος κουνελιού έναντι του ανθρώπινου PD-L1 στην προτεινόµενη σειρά φυσιολογικών ιστών. Στον Πίνακα 3 συνοψίζεται η ανοσοαντιδραστικότητα του µονοκλωνικού αντισώµατος κουνελιού έναντι του ανθρώπινου PD-L1 σε νεοπλασµατικούς ιστούς σε µικροσυστοιχίες ιστών πολλαπλών όγκων. Όλοι οι ιστοί είχαν µονιµοποιηθεί σε φορµαλίνη και εγκλειστεί σε παραφίνη και κατόπιν υποβλήθηκαν σε χρώση µε το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, σύµφωνα µε τις οδηγίες αυτού του ένθετου συσκευασίας. Το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx ανίχνευσε την πρωτεΐνη PD-L1 που ήταν εντοπισµένη στην πλασµατική µεµβράνη κυτταρικών τύπων οι οποίοι είναι γνωστό ότι εκφράζουν το αντιγόνο PD-L1, π.χ. ανοσοκύτταρα και κύτταρα επιθηλιακής προέλευσης, κυρίως κύτταρα όγκων. ( ) P03914GR_02/SK / σελ. 8/18

9 Πίνακας 2: Σύνοψη της αντιδραστικότητας φυσιολογικών ιστών µε το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Τύπος ιστού (πλήθος που εξετάστηκε) Θετική χρώση πλασµατικής µεµβράνης: Στοιχεία ιστού Θετική κυτταροπλασµατική χρώση: Στοιχεία ιστού Αµυγδαλή (3) 3/3 Επιθήλιο της κρύπτης 0/3 3/3 Ανοσοκύτταρα του βλαστικού κέντρου έρµα (3) 0/3 1/3 Επιθήλιο Επινεφρίδια (3) 3/3 Κύτταρα του µυελού 3/3 Κύτταρα του µυελού Ήπαρ (3) 2/3 Ανοσοκύτταρα 2/3 Ανοσοκύτταρα Θύµος αδένας (3) 3/3 Επιθήλιο του µυελού 0/3 Θυρεοειδής (3) 0/3 0/3 Κυρίως εγκέφαλος (3) 0/3 0/3 Λεπτό έντερο (2) 0/2 0/2 Μαστός (3) 0/3 0/3 Μεσοθηλιακά κύτταρα (3) 0/3 0/3 Μήτρα (3) 0/3 0/3 Μυελός των οστών (3) 3/3 Μεγακαρυοκύτταρα 3/3 Μεγακαρυοκύτταρα Μυς, καρδιακός (3) 0/2 0/2 Μυς, σκελετικός (3) 0/2 0/2 Νεύρο, περιφερικός (3) 0/3 0/3 Νεφρός (3) 3/3 Επιθήλιο σωληναρίων 3/3 Επιθήλιο σωληναρίων Οισοφάγος (3) 0/3 0/3 Όρχις (3) 0/3 1/3 Κύτταρα Leydig Πάγκρεας (3) 3/3 Επιθήλιο (κυρίως κύτταρα νησιδίων) 3/3 Επιθήλιο (κυρίως κύτταρα νησιδίων) Παραθυρεοειδής (3) 3/3 Επιθήλιο 0/3 Παρεγκεφαλίδα (3) 0/3 0/3 Παχύ έντερο (3) 2/3 Μακροφάγα 0/3 Πνεύµονας (3) 3/3 Κυψελιδικά µακροφάγα 0/3 Προστάτης (2) 0/2 0/2 Σιελογόνος αδένας (3) 0/3 0/3 Σπλήνας (3) 1/3 Μακροφάγα 0/3 3/3 ικτυοενδοθηλιακά κύτταρα κοιλοτήτων Στόµαχος (3) 0/3 0/3 Τράχηλος (3) 1/3 Επιθήλιο 1/3 Επιθήλιο Υπόφυση (3) 1/3 Πρόσθια αδενοϋπόφυση 1/3 Πρόσθια αδενοϋπόφυση 3/3 Οπίσθια νευροϋπόφυση Ωοθήκη (3) 0/3 0/3 Πίνακας 3: Σύνοψη της αντιδραστικότητας νεοπλασµατικών ιστών µε το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Τύπος όγκου Θέση / Όργανο Θετικά για PD-L1/σύνολο (N=162) Γαστρεντερικό σύστηµα, µεταστατικό στον πνεύµονα 0/1 Θυρεοειδής, θηλωµατικό 0/3 Θυρεοειδής, θυλακιώδες 0/1 Θυρεοειδής, θυλακιώδες-θηλωµατικό 0/1 Καρκίνωµα βρογχοκυψελίδων, πνεύµονας 0/1 Κεφαλή και αυχένας, σκληρή υπερώα 0/1 Λεπτό έντερο 0/2 Μαστός, DCIS 0/2 Μαστός, πορογενές διηθητικό 3/7 Μαστός, πορογενές διηθητικό µεταστατικό στο λεµφαδένα 1/1 Μήτρα, διαυγοκυτταρικό 1/1 Μήτρα, ενδοµητρίου 1/3 Οισοφάγος 1/1 Ορθό 2/4 Πάγκρεας 1/2 Αδενοκαρκίνωµα Πάγκρεας, πορογενές 0/3 Παχύ έντερο 2/5 Παχύ έντερο, βλεννώδες 0/1 Παχύ έντερο, µεταστατικό στο ήπαρ 1/1 Πνεύµονες 2/5 Προστάτης 2/4 Σιελογόνος/παρωτιδικός αδένας 0/2 Σκωληκοειδής απόφυση 1/1 Στόµαχος 1/6 Στόµαχος, βλεννώδες 0/1 Τραχήλος, ενδοτραχηλικός τύπος 0/1 Χοληδόχος κύστη 2/4 Ωοθήκη 0/1 Ωοθήκη, βλεννώδες 0/1 Ωοθήκη, ενδοµητριοειδές 0/1 Ωοθήκη, ορώδες 0/1 ( ) P03914GR_02/SK / σελ. 9/18

10 Τύπος όγκου Θέση / Όργανο Θετικά για PD-L1/σύνολο (N=162) Αρχέγονο νευροεκτόδερµα Οπισθοπεριτοναϊκό 0/1 Αστροκύτωµα Εγκέφαλος 0/3 Βασικοκυτταρικό καρκίνωµα έρµα 0/1 Γλοιοβλάστωµα Εγκέφαλος 0/1 Εµβρυϊκό καρκίνωµα Όρχεις 0/1 Λεπτό έντερο 0/1 Ενδιάµεσων κυττάρων Ορθό 0/1 Παχύ έντερο 0/1 Επενδύµωµα Εγκέφαλος 0/1 Ηπατοβλάστωµα Ήπαρ 0/1 Ηπατοκυτταρικό καρκίνωµα Ήπαρ 1/5 Θύµωµα Μεσοπνευµόνιο 1/1 Καρκίνωµα Ρινοφαρυγγικό, NPC 0/1 Μεταστατικό καρκίνωµα µε κύτταρα δίκην σφραγιστήρος Καρκίνωµα µε κύτταρα δίκην 0/1 δακτυλίου στην ωοθήκη σφραγιστήρος δακτυλίου Παχύ έντερο 0/1 Καρκίνωµα µεγάλων κυττάρων Πνεύµονες 1/1 Καρκίνωµα µεταβατικών κυττάρων Νεφρός 0/1 Ουροδόχος κύστη 3/6 Καρκίνωµα νεφρικών κυττάρων ιαυγοκυτταρικό Νεφρός 0/6 Θηλωµατικό Νεφρός 0/1 έρµα 1/2 Κεφαλή και αυχένας 0/2 Μεταστατικό καρκίνωµα πλακωδών κυττάρων του 1/1 οισοφάγου στο λεµφαδένα Καρκίνωµα πλακωδών κυττάρων Μήτρα 1/1 Οισοφάγος 4/7 Πνεύµονες 1/3 Τράχηλος της µήτρας 2/4 Κυτταρικοί όγκοι των νησίδων Πάγκρεας 0/1 Λέµφωµα Hodgkin Λεµφαδένας 2/2 Αναπλαστικό µεγάλο κύτταρο Λεµφαδένας 1/1 ιάχυτο B-κύτταρο Λεµφαδένας 2/4 Μη Hodgkin Λεµφαδένας 1/1 Λιποσάρκωµα Κοιλιακή κοιλότητα, βλεννώδες 0/1 Μελάνωµα Ορθό 0/1 Ρινική κοιλότητα 0/1 Μεσοθηλίωµα Περιτόναιο 0/1 Μηνιγγείωµα Εγκέφαλος 0/2 Μικροκυτταρικό καρκίνωµα Πνεύµονες 1/2 Μυελοβλάστωµα Εγκέφαλος 0/1 Μυελοειδές καρκίνωµα Θυρεοειδής 0/1 Νευροβλάστωµα Οπισθοπεριτοναϊκό 0/1 Νευροΐνωµα Μαλακός ιστός, οσφυϊκή µοίρα 0/1 Σάρκωµα Αρθρικό σάρκωµα Πυελική κοιλότητα 0/1 ιαυγοκυτταρικό Κοιλιακό τοίχωµα 0/1 Λειοµυοσάρκωµα Μαλακός ιστός, θωρακικό τοίχωµα 0/1 Ουροδόχος κύστη 0/1 Λιποσάρκωµα Κοιλιακή κοιλότητα, βλεννώδες 0/1 Οστεοσάρκωµα Οστό 0/2 Μαλακός ιστός, εµβρυϊκό 0/1 Ραβδοµυοσάρκωµα Οπισθοπεριτοναϊκό 0/1 Προστάτης 0/1 Χονδροσάρκωµα Οστό 0/1 Σεµίνωµα Όρχεις 0/2 Σπερµατοκκύτωµα Όρχεις 0/2 Φλοιοεπινεφριδιακό καρκίνωµα Επινεφρίδια 0/1 Χόνδρωµα Πυελική κοιλότητα 0/1 Αναλυτική ευαισθησία: Μη πλακώδης ΜΜΚΠ Η αναλυτική ευαισθησία του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx εξετάστηκε σε 112 µοναδικά περιστατικά µη πλακώδους ΜΜΚΠ, σε δείγµατα FFPE, σταδίου I έως IV µε τη χρήση κατασκευασµένης παρτίδας παραγωγής. Η αξιολόγηση της έκφρασης του PD-L1 υπέδειξε χρώση στο εύρος 0-100% θετικών κυττάρων όγκου και σε ένταση χρώσης 0-3. ( ) P03914GR_02/SK / σελ. 10/18

11 Επαναληψιµότητα: Μη πλακώδης ΜΜΚΠ Η επαναληψιµότητα του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx αξιολογήθηκε στην Dako. Τα δεδοµένα απόδοσης παρέχονται στον Πίνακα 4. Η επί τοις εκατό αρνητική συµφωνία (NPA), η επί τοις εκατό θετική συµφωνία (PPA) και η επί τοις εκατό συνολική συµφωνία (OA) της ανεξάρτητης σύγκρισης ζευγών των εξετάσεων προσδιορίστηκαν για κάθε επίπεδο έκφρασης του PD-L1 που αξιολογήθηκε. Η πιο συχνή παρατήρηση εφαρµόστηκε ως αναφορά για τον υπολογισµό των NPA, PPA, OA και των αντίστοιχων διαστηµάτων εµπιστοσύνης 95% κατά τη βαθµολογία Wilson. Εποµένως, ένα από τα αποτελέσµατα αυτής της παρατήρησης αποκλείστηκε από τις συγκρίσεις ζευγών. Πίνακας 4: Επαναληψιµότητα του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx - Μη πλακώδης ΜΜΚΠ Επαναληψιµότητα Μέθοδος Μεταξύ οργάνων Κάθε ένα από τα 10 δείγµατα µη πλακώδους ΜΜΚΠ µε εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε µε τρεις επαναλήψεις σε κάθε ένα από τα τρία όργανα Autostainer Link 48. Συνολικά πραγµατοποιήθηκαν 60 ανεξάρτητες συγκρίσεις ζευγών. Μεταξύ αναλυτών Κάθε ένα από τα 12 δείγµατα µη πλακώδους ΜΜΚΠ µε εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε µε τρεις επαναλήψεις από τρεις αναλυτές σε ένα όργανο Autostainer Link 48. Συνολικά πραγµατοποιήθηκαν 72 ανεξάρτητες συγκρίσεις ζευγών. Μεταξύ ηµερών Κάθε ένα από τα 10 δείγµατα µη πλακώδους ΜΜΚΠ µε εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε µε τρεις επαναλήψεις σε διάστηµα πέντε µη διαδοχικών ηµερών στο όργανο Autostainer Link 48. Συνολικά πραγµατοποιήθηκαν 80 ανεξάρτητες συγκρίσεις ζευγών. Μεταξύ παρτίδων Κάθε ένα από τα 20 δείγµατα µη πλακώδους ΜΜΚΠ µε εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε µε δύο επαναλήψεις µε κάθε µία από τις πέντε παρτίδες αντιδραστηρίου στο όργανο Autostainer Link 48. Συνολικά πραγµατοποιήθηκαν 160 ανεξάρτητες συγκρίσεις ζευγών. Εντός κύκλου ανάλυσης Κάθε ένα από τα 10 δείγµατα µη πλακώδους ΜΜΚΠ µε εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε µε οχτώ επαναλήψεις εντός ενός κύκλου ανάλυσης στο όργανο Autostainer Link 48. Συνολικά πραγµατοποιήθηκαν 70 ανεξάρτητες συγκρίσεις ζευγών. Επίπεδο έκφρασης 1% NPA 100 (82,4, 100) PPA 100 (91,6, 100) OA 100 (94,0, 100) NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (92,6, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (93,6, 100) OA 100 (95,4, 100) NPA 100 (94,3, 100) PPA 100 (96,2, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (84,5, 100) PPA 100 (92,7, 100) OA 100 (94,8, 100) Επί τοις εκατό συµφωνία (95% CI) Επίπεδο έκφρασης 5% NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (90,4, 100) OA 100 (94,0, 100) NPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (88,6, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 100 (89,3, 100) PPA 100 (92,6, 100) OA 100 (95,4, 100) NPA 100 (95,4, 100) PPA 100 (95,4, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (87,9, 100) PPA 100 (91,6, 100) OA 100 (94,8, 100) Επίπεδο έκφρασης 10% NPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (82,4, 100) OA 100 (94,0, 100) NPA 100 (93,4, 100) PPA 100 (82,4, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 98,2 (90,6, 99,7) PPA 100 (86,2, 100) OA 98,8 (93,3, 99,8) NPA 100 (96,4, 100) PPA 100 (93,6, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (92,7, 100) PPA 100 (84,5, 100) OA 100 (94,8, 100) Εξωτερική αναπαραγωγιµότητα: Μη πλακώδης ΜΜΚΠ Η εξωτερική αναπαραγωγιµότητα του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx αξιολογήθηκε σε τρία εξωτερικά κέντρα εξέτασης αντίστοιχα. Η τυφλοποίηση και η τυχαιοποίηση των κεχρωσµένων τοµών πραγµατοποιήθηκαν πριν από τη βαθµολογία των κεχρωσµένων τοµών. Τα δεδοµένα απόδοσης παρέχονται στον Πίνακα 5. Η επί τοις εκατό αρνητική συµφωνία (NPA), η επί τοις εκατό θετική συµφωνία (PPA) και η επί τοις εκατό συνολική συµφωνία (OA) της ανεξάρτητης σύγκρισης ζευγών των εξετάσεων προσδιορίστηκαν για κάθε επίπεδο έκφρασης του PD-L1 που αξιολογήθηκε. Η πιο συχνή παρατήρηση εφαρµόστηκε ως αναφορά για τον υπολογισµό των NPA, PPA, OA και των αντίστοιχων διαστηµάτων εµπιστοσύνης 95% κατά τη βαθµολογία Wilson. Εποµένως, ένα από τα αποτελέσµατα αυτής της παρατήρησης αποκλείστηκε από τις συγκρίσεις ζευγών. ( ) P03914GR_02/SK / σελ. 11/18

12 Πίνακας 5: Αναπαραγωγιµότητα του PD-L1 IHC 22C3 pharmdx - Μη πλακώδης ΜΜΚΠ, βάσει εξέτασης σε τρία εξωτερικά κέντρα Αναπαραγωγιµότητα οκιµασία µεταξύ κέντρων (τρία κέντρα) Ανάλυση εντός κέντρου Μεταξύ παρατηρητών (ένας παρατηρητής σε κάθε ένα από τρία κέντρα) Εντός παρατηρητή (ένας παρατηρητής σε κάθε ένα από τα τρία κέντρα) Μέθοδος Κάθε ένα από τα 10 δείγµατα µη πλακώδους ΜΜΚΠ µε εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε σε διάστηµα πέντε µη διαδοχικών ηµερών. Η ανάλυση µεταξύ κέντρων πραγµατοποιήθηκε µεταξύ τριών κέντρων σε συνολικά 140 ανεξάρτητες συγκρίσεις ζευγών. Κάθε ένα από τα 10 δείγµατα µη πλακώδους ΜΜΚΠ µε εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC εξετάστηκε σε διάστηµα πέντε µη διαδοχικών ηµερών σε κάθε ένα από τρία κέντρα µελέτης. Η ανάλυση εντός κέντρου πραγµατοποιήθηκε για τρία κέντρα σε συνολικά 120 ανεξάρτητες συγκρίσεις ζευγών. Η βαθµολογία 15 δειγµάτων µη πλακώδους ΜΜΚΠ µε εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC, κεχρωσµένων µε το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, πραγµατοποιήθηκε από τρεις παθολογοανατόµους, ένας σε κάθε ένα από τρία κέντρα µελέτης, σε τρεις µη διαδοχικές ηµέρες. Η ανάλυση µεταξύ παρατηρητών πραγµατοποιήθηκε µεταξύ τριών κέντρων σε συνολικά 120 ανεξάρτητες συγκρίσεις ζευγών. Η βαθµολογία 15 δειγµάτων µη πλακώδους ΜΜΚΠ µε εύρος έκφρασης του PD-L1 IHC, κεχρωσµένων µε το PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, πραγµατοποιήθηκε από τρεις παθολογοανατόµους, ένας σε κάθε ένα από τρία κέντρα µελέτης, σε τρεις µη διαδοχικές ηµέρες. Η ανάλυση εντός παρατηρητή πραγµατοποιήθηκε για τρία κέντρα σε συνολικά 90 ανεξάρτητες συγκρίσεις ζευγών. Επί τοις εκατό συµφωνία (95% CI) Επίπεδο έκφρασης 1% Επίπεδο έκφρασης 5% NPA 100 (93,6, 100) PPA 98,8 (93,6, 99,8) OA 99,3 (96,1, 99,9) NPA 100 (92,6, 100) PPA 98,6 (92,5, 99,8) OA 99,2 (95,4, 99,9) NPA 96,9 (89,3, 99,1) PPA 100 (93,6, 100) OA 98,3 (94,1, 99,5) NPA 95,8 (86,0, 98,8) PPA 100 (91,6, 100) OA 97,8 (92,3, 99,4) NPA 91,4 (82,5, 96,0) PPA 97,1 (90,2, 99,2) OA 94,3 (89,1, 97,1) NPA 96,4 (87,9, 99,0) PPA 95,3 (87,1, 98,4) OA 95,8 (90,6, 98,2) NPA 100 (94,3, 100) PPA 89,3 (78,5, 95,0) OA 95,0 (89,5, 97,7) NPA 100 (93,1, 100) PPA 100 (90,8, 100) OA 100 (95,9, 100) Αξιολόγηση κλινικής απόδοσης: Μη πλακώδης ΜΜΚΠ Το κλινικό όφελος του PD-L1 IHC 28-8 pharmdx αξιολογήθηκε στη µελέτη CA209057, µια τυχαιοποιηµένη, ανοικτή µελέτη φάσης 3 της νιβολουµάµπης έναντι της δοσεταξέλης σε ενήλικες ( 18 ετών) µε προχωρηµένο ή µεταστατικό µη πλακώδη ΜΜΚΠ µετά από αποτυχία προηγούµενης χηµειοθεραπείας µε βάση ένα ζεύγος πλατίνης. Συνολικά 582 άτοµα τυχαιοποιήθηκαν σε 112 κέντρα σε 22 χώρες (Αργεντινή, Αυστραλία, Αυστρία, Βραζιλία, Καναδάς, Χιλή, ηµοκρατία της Τσεχίας, Γαλλία, Γερµανία, Χονγκ Κονγκ, Ουγγαρία, Ιταλία, Μεξικό, Νορβηγία, Περού, Πολωνία, Ρουµανία, Ρωσική Οµοσπονδία, Σινγκαπούρη, Ισπανία, Ελβετία και Ηνωµένες Πολιτείες). Οι συµµετέχοντες τυχαιοποιήθηκαν σε αναλογία 1:1 και στρωµατοποιήθηκαν σύµφωνα µε 1) την προγενέστερη λήψη συντηρητικής θεραπείας έναντι της απουσίας λήψης συντηρητικής θεραπείας και 2) τη θεραπεία δεύτερης έναντι τρίτης γραµµής. Συλλέχθηκαν δείγµατα ιστού πριν από τη µελέτη (γραµµή βάσης), πριν από την τυχαιοποίηση και πριν από την πρώτη θεραπεία, για τη διεξαγωγή εκ των προτέρων προγραµµατισµένων αναλύσεων αποτελεσµατικότητας σύµφωνα µε τα προκαθορισµένα επίπεδα έκφρασης του PD-L1 της γραµµής βάσης (δευτερεύων στόχος). Το κύριο καταληκτικό σηµείο ήταν η συνολική επιβίωση (OS). Άλλα δευτερεύοντα καταληκτικά σηµεία ήταν ο αντικειµενικός ρυθµός ανταπόκρισης (ORR), η επιβίωση χωρίς εξέλιξη της νόσου (PFS) και η βελτίωση των συµπτωµάτων που σχετίζονται µε τη νόσο σε διάστηµα 12 εβδοµάδων, σύµφωνα µε µετρήσεις της κλίµακας συµπτωµάτων καρκίνου του πνεύµονα (LCSS- Lung Symptom Cancer Scale). Τα δηµογραφικά στοιχεία γραµµής βάσης και τα χαρακτηριστικά της νόσου ήταν σε γενικές γραµµές ισορροπηµένα µεταξύ των τυχαιοποιηµένων συµµετεχόντων στις οµάδες νιβολουµάµπης και δοσεταξέλης. Η µέση ηλικία ήταν 62 έτη (εύρος: 21 έως 85) µε 34% 65 ετών και 7% 75 ετών. Η πλειοψηφία των ασθενών ήταν λευκοί (92%) και άνδρες (55%). Η κατάσταση απόδοσης γραµµής βάσης κατά ECOG ήταν 0 (31%) ή 1 (69%). Το 79% των ασθενών ήταν πρώην/νυν καπνιστές. Τα δείγµατα όγκων συλλέχθηκαν από όγκους µη πλακώδους ΜΜΚΠ, σύµφωνα µε τις απαιτήσεις συµπερίληψης για τη µελέτη. Οι συχνότητες της έκφρασης του PD-L1 σε κάθε ένα από τα προκαθορισµένα επίπεδα έκφρασης της γραµµής βάσης σε όλους τους τυχαιοποιηµένους συµµετέχοντες στη µελέτη CA παρουσιάζονται στον Πίνακα 6. Πίνακας 6: Συχνότητα έκφρασης του PD-L1 πριν από τη µελέτη σε όλους τους τυχαιοποιηµένους συµµετέχοντες µε µη πλακώδη ΜΜΚΠ - CA Κατηγορία έκφρασης του PD-L1 στον πληθυσµό γραµµής βάσης Νιβολουµάµπη 3 mg/kg οσεταξέλη Σύνολο Σύνολο Μετρήσιµο PD-L1, N (%) 231 (79,1) 224 (77,2) 455 (78,2) Έκφραση του PD-L1 1% 123/231 (53,2) 123/224 (54,9) 246/455 (54,1) Έκφραση του PD-L1 < 1% 108/231 (46,8) 101/224 (45,1) 209/455 (45,9) Έκφραση του PD-L1 5% 95/231 (41,1) 86/224 (38,4) 181/455 (39,8) Έκφραση του PD-L1 < 5% 136/231 (58,9) 138/224 (61,6) 274/455 (60,2) Έκφραση του PD-L1 στη γραµµή βάσης 10% 86/231 (37,2) 79/224 (35,3) 165/455 (36,3) Έκφραση του PD-L1 < 10% 145/231 (62,8) 145/224 (64,7) 290/455 (63,7) Μη µετρήσιµο PD-L1, N (%) 61 (20,9) 66 (22,8) 127 (21,8) ( ) P03914GR_02/SK / σελ. 12/18