ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΗ ΧΗΜΕΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ «ΧΗΜΕΙΑ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ» ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΥΜΒΟΛΗ ΣΤΟΝ ΕΛΕΓΧΟ ΓΝΗΣΙΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΑΡΤΥΜΑΤΟΣ ΣΑΦΡΑΝΙ (Crocus sativus L.) ΜΕ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ: α) ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ C. sativus L. β) ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΝΟΘΕΙΑΣ ΜΕ ΚΟΥΡΚΟΥΜΑ (Curcuma longa L.) ΕΙΡΗΝΗ ΜΠΟΣΜΑΛΗ, ΤΕΧΝΟΛΟΓΟΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ: Καθ. Μαρία Τσιμίδου, ΣΥΝΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ: Δρ. Στεργιανή Ορδούδη ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ, 2016

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΗ ΧΗΜΕΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ «ΧΗΜΕΙΑ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ» ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΥΜΒΟΛΗ ΣΤΟΝ ΕΛΕΓΧΟ ΓΝΗΣΙΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΑΡΤΥΜΑΤΟΣ ΣΑΦΡΑΝΙ (Crocus sativus L.) ΜΕ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ: α) ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ C. sativus L. β) ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΝΟΘΕΙΑΣ ΜΕ ΚΟΥΡΚΟΥΜΑ (Curcuma longa L.) ΕΙΡΗΝΗ ΜΠΟΣΜΑΛΗ, ΤΕΧΝΟΛΟΓΟΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ: Καθ. Μαρία Τσιμίδου, ΣΥΝΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ: Δρ. Στεργιανή Ορδούδη ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ,

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΗ ΧΗΜΕΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ «ΧΗΜΕΙΑ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ» ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΥΜΒΟΛΗ ΣΤΟΝ ΕΛΕΓΧΟ ΓΝΗΣΙΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΑΡΤΥΜΑΤΟΣ ΣΑΦΡΑΝΙ (Crocus sativus L.) ΜΕ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ: α) ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ C. sativus L. β) ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΝΟΘΕΙΑΣ ΜΕ ΚΟΥΡΚΟΥΜΑ (Curcuma longa L.) ΕΙΡΗΝΗ ΜΠΟΣΜΑΛΗ, ΤΕΧΝΟΛΟΓΟΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων του Τομέα Χημικής Τεχνολογίας και Βιομηχανικής Χημείας του Τμήματος Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθηγήτρια ΜΑΡΙΑ ΤΣΙΜΙΔΟΥ - Επιβλέπων Καθηγητής Επίκουρος καθηγητής ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΝΕΝΑΔΗΣ - Μέλος Εξεταστικής Επιτροπής Ερευνητής Γ ΕΚΕΤΑ ΠΑΝΑΓΙΩΤΗΣ ΜΑΔΕΣΗΣ - Μέλος Εξεταστικής Επιτροπής Η τριμελής εξεταστική επιτροπή που ορίστηκε σύμφωνα με την απόφαση της Γ.Σ.Ε.Σ. του Τμήματος στη συνεδρίασή της αριθμ. 286/ , για την κρίση της Μεταπτυχιακής Διπλωματικής Εργασίας της Ειρήνης Μποσμαλή, Πτυχιούχου Τεχνολόγου Τροφίμων, συνήλθε σε συνεδρίαση στο Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης την 2/3/2016, όπου παρακολούθησε την υποστήριξη της εργασίας με τίτλο «Συμβολή στον έλεγχο Γνησιότητας του αρτύματος σαφράνι (Crocus sativus L.) με Μοριακές και Φυσικοχημικές τεχνικές : α) Πιστοποίηση του είδους C. sativus L. και β) Ανίχνευση νοθείας με κουρκουμά (Curcuma longa L.)» και την ενέκρινε με βαθμό 8,5 (ΟΚΤΩ ΚΑΙ ΜΙΣΟ). 3

4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία πραγματοποιήθηκε στο πλαίσιο του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης στη Χημεία και Τεχνολογία Τροφίμων, στο εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, του Τμήματος Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (Α.Π.Θ) υπό την επίβλεψη της καθηγήτριας κ. Μαρίας Τσιμίδου, και τη συνεπίβλεψη της Δρ. Στεργιανής Ορδούδη. Πέρα από κάθε τυπικότητα, νιώθω την ανάγκη να ευχαριστήσω πάνω απ όλα την επιβλέπουσα καθηγήτριά μου, κ. Μαρία Τσιμίδου, για τη συμπαράστασή της σε κάθε τομέα, τη σημαντική καθοδήγηση και τις συμβουλές της κατά τη διάρκεια τόσο του πειραματικού μέρους της εργασίας μας όσο και κατά τη συγγραφή αυτής. Επίσης, την ευχαριστώ για την ευκαιρία που μου έδωσε να ασχοληθώ με αυτό το θέμα στο πλαίσιο του οποίου μου δόθηκε η ευκαιρία να πραγματοποιήσω μια σύντομη επιστημονική επίσκεψη (STSM) στο Πανεπιστήμιο της Δρέσδης (Plant Cell and Molecular Biology, Institute of Botany) με τη χρηματοδότηση του Cost Action FA1101 (Saffronomics). Τις ευχαριστίες μου οφείλω στο προσωπικό του Ινστιτούτου αυτού για την άψογη φιλοξενία και συνεργασία τους και ιδιαίτερα στον καθηγητή Tomas Schmidt, τον ερευνητή Dr. Gerhard Menzel και τη Nadin Fliegner, τεχνικό του εργαστηρίου στο οποίο πραγματοποιήθηκαν τα πειράματα. Ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω και στη διδάκτορα-ερευνήτρια Στεργιανή Ορδούδη του Εργαστηρίου Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, τόσο για την πολύτιμη προσφορά της κατά τη διάρκεια διεξαγωγής των πειραμάτων όσο και για την καθοδήγηση της κατά τη συγγραφή της παρούσας διπλωματικής εργασίας. Θερμά ευχαριστώ τον Δρ. Παναγιώτη Μαδέση, ερευνητή Γ στο Ινστιτούτο Εφαρμοσμένων Βιοεπιστημών (ΕΚΕΤΑ-ΙΝΕΒ) για τις πλούσιες γνώσεις του στον τομέα των μοριακών μεθόδων που μου μετέδωσε κατά τη διάρκεια εκπόνησης των πειραμάτων μου και την άψογη συνεργασία του. Επίσης τον ευχαριστώ για τη βοήθειά του κατά τη συγγραφή της εργασίας μου και για την αμέριστη συμπαράστασή του οποιαδήποτε στιγμή αυτή κρινόταν αναγκαία. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους καθηγητές του Εργαστηρίου Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων του Α.Π.Θ για τις πολύτιμες γνώσεις που μου μετέδωσαν κατά τη διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών ο καθένας ξεχωριστά στο αντικείμενό του. Ωστόσο, δε θα είχα φτάσει ως εδώ χωρίς την αδιάκοπη υποστήριξη της οικογένειάς μου σε κάθε μου βήμα έως τώρα και την αμέριστη συμπαράσταση της αδελφικής μου φίλης Βασιλική ώστε να εκπληρωθεί με επιτυχία αυτή η επιθυμία μου. Ένα μεγάλο ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ σε όλους. Σας Ευχαριστώ θερμά! 4

5 Αριθμός Σελίδες ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ 5 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΠΙΝΑΚΩΝ 7 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΕΙΚΟΝΩΝ 8 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΣΧΗΜΑΤΩΝ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΤΟ ΑΡΤΥΜΑ ΣΑΦΡΑΝΙ ΤΟ ΦΥΤΟ Crocus sativus L ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΚΑΙ ΕΜΠΟΡΙΚΗ ΑΞΙΑ ΤΟΥ ΑΡΤΥΜΑΤΟΣ ΕΙΔΗ ΚΡΟΚΩΝ ΚΑΙ ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ Crocus sativus L ΠΡΑΚΤΙΚΕΣ ΝΟΘΕΙΑΣ ΤΟΥ ΑΡΤΥΜΑΤΟΣ ΣΑΦΡΑΝΙ Γενικά Μέθοδοι ανίχνευσης και προσδιορισμού ξένων φυτικών υλικών στο 28 άρτυμα σαφράνι α Μοριακές μέθοδοι που αξιοποιούνται στην ανίχνευση νοθείας του 31 αρτύματος σαφράνι β Φυσικοχημικές μέθοδοι που αξιοποιούνται στην ανίχνευση νοθείας του 37 αρτύματος σαφράνι 2.6 Η ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΤΟΥ ΚΟΥΡΚΟΥΜΑ Το άρτυμα κουρκουμάς Το φυτό Curcuma longa L ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 3.1 Δείγματα Αντιδραστήρια-Διαλύτες Σχεδιασμός εξειδικευμένων εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν στην 45 ανάλυση HRM 3.3 Όργανα-Συσκευές Αναλυτικές μέθοδοι ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ α Απομόνωση γενετικού υλικού β Ποσοτικός προσδιορισμός του DNA με ηλεκτροφόρηση γ Φασματοφωτομετρικός προσδιορισμός των δειγμάτων DNA δ Ενίσχυση με την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) ε Υψηλής ανάλυσης καμπύλες τήξης (HRM) ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ Προετοιμασία μιγμάτων UV-Vis ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ α Προετοιμασία εκχυλισμάτων των αρτυμάτων και μιγμάτων τους β Λήψη φασμάτων ορατού των εκχυλισμάτων ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ α Προετοιμασία εκχυλισμάτων των αρτυμάτων και μιγμάτων τους β Προετοιμασία εκχυλισμάτων αναφοράς γ Υγροχρωματογραφική ανάλυση των εκχυλισμάτων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ 4.1. Πιστοποίηση του είδους Crocus sativus L. με μοριακές τεχνικές α. Μοριακοί δείκτες ISSR β. MADs box γονίδια Ανίχνευση νοθείας του αρτύματος σαφράνι με Curcuma longa L ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ 65 5

6 4.2.1.α Ποιοτική και ποσοτική ανίχνευση κουρκουμά σε πιθανώς νοθευμένα 65 δείγματα σαφράνι με τη μέθοδο της υψηλής ανάλυσης καμπύλη τήξης ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ α Δοκιμές ανίχνευσης νοθείας με χρήση διαφορετικών διαλυτών εκχύλισης 74 και εφαρμογή UV-Vis φασματομετρίας β Διαχωρισμός και ανίχνευση κροκινών και κουρκουμινοειδών με RP- 77 HPLC-DAD-FL γ Διαδικασία επικύρωσης της μεθόδου δ Εφαρμογή της μεθόδου σε υδατομεθανολικά εκχυλίσματα μιγμάτων σαφράνι-κουρκουμά 82 ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ-ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ 84 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 86 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 88 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 100 6

7 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΠΙΝΑΚΩΝ Πίνακας 1: Εκτίμηση της παγκόσμιας παραγωγής αρτύματος σαφράνι Σελ.18 Πίνακας 2: Πιθανά φυτικά υλικά που χρησιμοποιούνται για νόθευση του Σελ.26 σαφράνι Πίνακας 3: Μοριακοί δείκτες ISSR που χρησιμοποιήθηκαν για την Σελ.44 ενίσχυση τμημάτων μεταξύ μικροδορυφορικών περιοχών Πίνακας 4: Δείκτες που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση των Σελ.44 περιοχών που κωδικοποιούν τα MADs Box γονίδια Πίνακας 5: Εκκινητές που σχεδιάστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για την Σελ.45 ενίσχυση DNA Barcoding περιοχών με την ανάλυση HRM Πίνακας 6: Δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση της PCR με Σελ.59 τους μοριακούς δείκτες ISSR Πίνακας 7: Επίπεδα εμβολιασμού και τιμές ανάκτησης με τον ανιχνευτή φθορισμού Σελ.82 : 7

8 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΕΙΚΟΝΩΝ Εικόνα 1: Το φυτό C. sativus L. Σελ.15 Εικόνα 2: Τα μέρη του φυτού κρόκου Σελ.15 Εικόνα 3: Χημικές δομές κροκίνης-α (διγεντιοβιοσυλεστέρας Σελ.16 κροκετίνης), κροκετίνης, πικροκροκίνης και σαφρανάλης Εικόνα 4: Από το φυτό κρόκος στο άρτυμα σαφράνι Σελ.17 Εικόνα 5: Το φυτό C. hadriaticus Σελ.17 Εικόνα 6: Το φυτό C. cartwrightianus Σελ.17 Εικόνα 7: Το φυτό C. thomasii Σελ.17 Εικόνα 8: Το φυτό C. palassii Σελ.17 Εικόνα 9: Μορφολογικά χαρακτηριστικά του φυτού κρόκου Σελ.18 Εικόνα 10: Καλλιέργεια του κρόκου στην Ελλάδα Σελ.19 Εικόνα 11: Καλλιέργεια του κρόκου σε παγκόσμια κλίμακα Σελ.19 Εικόνα 12: Συγκομιδή κρόκου με το χέρι Σελ.20 Εικόνα 13: Διαχωρισμός πετάλων από στίγματα με αέρα Σελ.20 Εικόνα 14: Αποξηραμένα στίγματα C. sativus L. Σελ.20 Εικόνα 15: Βιολογικός κύκλος του κρόκου Σελ.21 Εικόνα 16: Αρχή λειτουργίας των μοριακών δεικτών ISSR. Η περίπτωση των εκκινητών που εκτός από επαναλήψεις δι-, τρινουκλεοτιδίων φέρουν στο 5 ή στο 3 άκρο μη επαναλήψιμα τμήματα (anchored) Σελ.23 Εικόνα 17: Κορυφαίες τεχνολογίες ανίχνευσης νοθείας στην Σελ.29 επιστημονική βάση δεδομένων Scopus Εικόνα 18: Καμπύλες τήξης υψηλής ανάλυσης έξι διαφορετικών Σελ.35 γενοτύπων. Δεδομένα που παράγει η HRM με βάση τα οποία γίνονται όλες οι παραμετροποιημένες καμπύλες υψηλής ανάλυσης Εικόνα 19: Καμπύλες HRM από τρία διαφορετικά δείγματα οι οποίες Σελ.35 έχουν υποστεί κανονικοποίηση με τη χρήση του λογισμικού της HRM. Εικόνα 20: Συσκευή real time HRM (Corbett Rotor Gene ) Σελ.36 Εικόνα 21: Χημικές δομές των κυριότερων κουρκουμινοειδών Σελ.39 Εικόνα 22: Το φυτό Curcuma Longa L. Σελ.41 Εικόνα 23: Ρίζες Curcuma Longa L. Σελ.41 Εικόνα 24: Το άρτυμα κουρκουμάς Σελ.41 Εικόνα 25: Εκκινητής με βάση την αλληλουχία DNA του είδους Σελ.46 Gardenia jasminoides με φορά 5-3 Εικόνα 26: Εκκινητής (Common F1) με φορά 5-3 σχεδιασμένος σε Σελ.46 Εικόνα 27: Εικόνα 28: ομόλογη περιοχή μεταξύ των ειδών Calendula officinalis, Carthamus tinctorius, Crocus sativus και Curcuma longa και εκκινητής (Gardenia R) με φορά 3-5 μόνο για το είδος Gardenia jasminoides Εκκινητές με φορά 3-5 σχεδιασμένοι σύμφωνα με την Σελ.46 αλληλουχία του DNA του κάθε είδους αντίστοιχα (Calendula officinalis, Carthamus tinctorius Curcuma longa) Εκκινητής με φορά 3-5 σχεδιασμένος σύμφωνα με την Σελ.46 8

9 αλληλουχία του DNA του είδους Crocus sativus Εικόνα 29: Εκκινητής (Common F2) με φορά 5-3 σχεδιασμένος σε ομόλογη περιοχή μεταξύ των ειδών Crocus sativus και Zea mays. Εικόνα 30: Εκκινητές (Crocus R2 και Maize R) με φορά 3-5 σχεδιασμένοι σε ομόλογη περιοχή μεταξύ των ειδών Crocus sativus και Zea mays με διαφορά σε 2 βάσεις του DNA. Εικόνα 31α: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (1-20) C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 807 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Εικόνα 31β: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (21-40) C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 807 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Εικόνα 31γ: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (41-60) C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 807 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Εικόνα 31δ: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (61-80) C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 807 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Εικόνα 31ε: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (81-92) C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 807 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Εικόνα 32: Ανάλυση των κύριων συντεταγμένων των ατόμων των φυτών του είδους C. sativus L. που μελετήθηκαν Εικόνα 33: Ποσοστά της μοριακής διασποράς μεταξύ και εντός των πληθυσμών Εικόνα 34: Γενετικό απο0τύπωμα των ειδών C. sativus L., C. cartwrightianus και μίγματος 1:1 αυτών σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/v με το μοριακό δείκτη UBC 815 Εικόνα 35: Γενετικό αποτύπωμα C. sativus L. και άγριων ειδών Crocus με τους εκκινητές gsep3a-f και SEP3-2R Εικόνα 36α: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 811 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Εικόνα 36β: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 811 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Εικόνα 36γ: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 811 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Εικόνα 36δ: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 811 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Εικόνα 36ε: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 12 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 811 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Εικόνα 37α: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 815 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Σελ.47 Σελ.47 Σελ.60 Σελ.60 Σελ.61 Σελ.61 Σελ.61 Σελ.62 Σελ.62 Σελ.63 Σελ.64 Σελ.104 Σελ.104 Σελ.104 Σελ.105 Σελ.105 Σελ.105 9

10 Εικόνα 37β: Εικόνα 37γ: Εικόνα 37δ: Εικόνα 37ε: Εικόνα 38α: Εικόνα 38β: Εικόνα 38γ: Εικόνα 38δ: Εικόνα 38ε: Εικόνα 39α: Εικόνα 39β: Εικόνα 39γ: Εικόνα 39δ: Εικόνα 39ε: Εικόνα 40α: Εικόνα 40β: Εικόνα 40γ: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 815 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 815 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 815 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 12 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 815 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 827 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 827 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 827 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 827 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 12 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 827 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 834 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 834 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 834 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 834 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 12 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 834 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 841 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 841 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 841 σε Σελ.106 Σελ.106 Σελ.106 Σελ.107 Σελ.107 Σελ.107 Σελ.108 Σελ.108 Σελ.108 Σελ.109 Σελ.109 Σελ.109 Σελ.110 Σελ.110 Σελ.110 Σελ.111 Σελ

11 Εικόνα 40δ: Εικόνα 40ε: Εικόνα 41α: Εικόνα 41β: Εικόνα 41γ: Εικόνα 41δ: Εικόνα 41ε: πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 841 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 12 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 841 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 860 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 860 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 860 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 860 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 12 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. με το μοριακό δείκτη UBC 860 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Σελ.111 Σελ.112 Σελ.112 Σελ.112 Σελ.113 Σελ.113 Σελ

12 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΣΧΗΜΑΤΩΝ Σχήμα 1: Σχηματική απεικόνιση της προετοιμασίας των εκχυλισμάτων που χρησιμοποιήθηκαν στην υγροχρωματογραφική ανάλυση Σχήμα 2: Καμπύλες τήξης δέκα διαφορετικών ειδών (C. sativus L., C. cartwrightianus, C. thomasii, C. palassii, C. oreocreticus, C. hadriaticus, C. asumaniae, C. cansellatus, Carthamus tinctorius και Curcuma longa) και ενός μίγματος των ειδών C. sativus L. και C. cartwrightianus χρησιμοποιώντας τη χλωροπλαστική περιοχή trnl Σχήμα 3: Καμπύλες HRM δέκα διαφορετικών ειδών (C. sativus L., C. cartwrightianus, C. thomasii, C. palassii, C. oreocreticus, C. hadriaticus, C. asumaniae, C. cansellatus, Carthamus tinctorius και Curcuma longa) και ενός μίγματος των ειδών C. sativus L. και C. cartwrightianus χρησιμοποιώντας τη χλωροπλαστική περιοχή trnl οι οποίες έχουν υποστεί κανονικοποίηση (με τη χρήση του λογισμικού της HRM) Σχήμα 4: Καμπύλες τήξης (α) και καμπύλες HRM οι οποίες έχουν υποστεί κανονικοποίηση (με τη χρήση του λογισμικού της HRM) (β) τεσσάρων διαφορετικών ειδών (C. sativus L., Carthamus tinctorius, Calendula officinalis και Gardenia jasminoides L.) και ενός μίγματος 1:1:1:1 των ειδών αυτών χρησιμοποιώντας ειδικά σχεδιασμένους εκκινητές για το κάθε είδος ξεχωριστά Σχήμα 5: Καμπύλες τήξης (α) και καμπύλες HRM οι οποίες έχουν υποστεί κανονικοποίηση (με τη χρήση του λογισμικού της HRM) (β) δύο διαφορετικών ειδών (C. sativus L. και Zea Mays) και ενός μίγματος 1:1 των ειδών αυτών χρησιμοποιώντας ειδικά σχεδιασμένους εκκινητές για το κάθε είδος χωριστά. Σχήμα 6: Καμπύλες τήξης (α) και καμπύλες HRM οι οποίες έχουν υποστεί κανονικοποίηση (με τη χρήση του λογισμικού της HRM) (β) δύο διαφορετικών ειδών (C. sativus L. και Gardenia jasminoides L.) και ενός μίγματος 1:1 των ειδών αυτών χρησιμοποιώντας ειδικά σχεδιασμένους εκκινητές για το κάθε είδος ξεχωριστά Σχήμα 7: Καμπύλες τήξης (α) και καμπύλες HRM οι οποίες έχουν υποστεί κανονικοποίηση (με τη χρήση του λογισμικού της HRM) (β) δύο διαφορετικών ειδών (C. sativus L. και Curcuma longa) και ενός μίγματος 1:1 των ειδών αυτών, χρησιμοποιώντας ειδικά σχεδιασμένους εκκινητές για το κάθε είδος ξεχωριστά. Σχήμα 8: Καμπύλες HRM οι οποίες έχουν υποστεί κανονικοποίηση (με τη χρήση του λογισμικού της HRM) μίγματος των ειδών C. sativus L. και Curucma longa σε επτά διαφορετικά ποσοστά 50, 25, 15, 10, 2, 1 και 0.5 % v/v χρησιμοποιώντας ειδικά σχεδιασμένους εκκινητές για το είδος ξεχωριστά Σχήμα 9: Φάσματα ορατού του εκχυλίσματος κουρκουμά με α) μεθανόλη-νερό 1:1 v/v, β) ακετόνη και γ) εξάνιο Σχήμα 10: Φάσματα ορατού του εκχυλίσματος σαφράνι με α) μεθανόληνερό 1:1 v/v β) ακετόνη και γ) εξάνιο Σελ.56 Σελ.66 Σελ.67 Σελ.68 Σελ.69 Σελ.70 Σελ.72 Σελ.73 Σελ.75 Σελ.75 12

13 Σχήμα 11: Φάσματα ορατού του εκχυλίσματος μίγματος σαφράνικουρκουμά (20 % w/w) με α) μεθανόλη-νερό 1:1 v/v β) ακετόνη και γ) εξάνιο Σχήμα 12: 2 η παράγωγος φάσματος του εκχυλίσματος κουρκουμά με α) μεθανόλη-νερό 1:1 v/v β) ακετόνη και γ) εξάνιο Σχήμα 13: 2 η παράγωγος φάσματος του εκχυλίσματος σαφράνι με α) μεθανόλη-νερό 1:1 v/v β) ακετόνη και γ) εξάνιο Σχήμα 14: 2 η παράγωγος φάσματος του εκχυλίσματος μίγματος σαφράνικουρκουμά (20% w/w) με α) μεθανόλη-νερό 1:1 v/v β) ακετόνη και γ) εξάνιο Σχήμα 15: HPLC-DAD χρωματογραφήματα υδατομεθανολικών εκχυλισμάτων σαφράνι (μπλε) και κουρκουμά (κόκκινο) στα Σχήμα 16: 425 nm HPLC-FL χρωματογράφημα υδατομεθανολικών εκχυλισμάτων σαφράνι (μπλε) και κουρκουμά (κόκκινο) στα στα 426 nm exc., 540 nm em Σχήμα 17: Υγροχρωματογραφήματα υδατομεθανολικού εκχυλίσματος μίγματος 5% w/w κουρκουμά σε σαφράνι (πράσινο) και σύγκριση με τα αντίστοιχα χρωματογραφήματα εκχυλισμάτων κουρκουμά (κόκκινο) και σαφράνι (μπλε) (α) στα 425 nm, (β) στα 426 nm ( exc.), 540 nm ( em) Σχήμα 18: Υγροχρωματογραφήματα υδατομεθανολικού εκχυλίσματος σαφράνι μετά από εμβολιασμό με πρότυπο διάλυμα κουρκουμίνης σε συγκέντρωση 0,1 (μπλε), 0,2 (κόκκινο) και 0,3 % w/w (πράσινο) και ανίχνευση (α) στα 425 nm, (β) στα 426 nm ( exc.), 540 nm ( em) Σχήμα 19: Υγροχρωματογραφήματα υδατομεθανολικού εκχυλίσματος μιγμάτων 5 (γαλάζιο), 1 (μοβ) και 0,5 % w/w κουρκουμά σε σαφράνι (πράσινο) σε σύγκριση με τα αντίστοιχα χρωματογραφήματα εκχυλισμάτων κουρκουμά (κόκκινο) και σαφράνι (μπλε) (α) στα 425 nm, (β) στα 426 nm ( exc.), 540 nm ( em) Σελ.76 Σελ.77 Σελ.77 Σελ.77 Σελ.78 Σελ.79 Σελ.80 Σελ.81 Σελ.83 13

14 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο κρόκος (Crocus sativus Linnaeus) ανήκει στην οικογένεια των ιριδοειδών (Iridaceae) και το γένος Crocus. Είναι πολύ σημαντικό φυτό γιατί από τα αποξηραμένα στίγματά του προκύπτει το γνωστό σε όλους άρτυμα σαφράνι. Το άρτυμα σαφράνι, λόγω της απαιτητικής χειρονακτικής εργασίας που απαιτείται από τη συγκομιδή μέχρι και τη συσκευασία του, είναι το πιο ακριβό άρτυμα στον κόσμο και για το λόγο αυτό πολύ συχνά νοθεύεται με άλλα φυτικά υλικά, μεγαλύτερης διαθεσιμότητας και χαμηλότερης αξίας, που κυκλοφορούν στο εμπόριο με παρόμοιο χρώμα με σκοπό την αύξηση του όγκου και του βάρους των εμπορικών παρτίδων. Η νοθεία του αρτύματος δεν είναι εύκολα ανιχνεύσιμη, ιδιαίτερα όταν το δείγμα είναι σε μορφή σκόνης ή όταν το άρτυμα προστίθεται σε μίγμα αρτυμάτων. Αναγκαία κρίνεται, λοιπόν, τόσο για την πιστοποίηση της γνησιότητας του είδους όσο και για την ανίχνευση πιθανής νοθείας του αλλά και την εκτίμηση του ποσοστού αυτής, η ενίσχυση των εργαλείων ελέγχου αρχικά στην επιστημονική έρευνα και έπειτα στη βιομηχανία τροφίμων. Για το λόγο αυτό, σκοπός της παρούσας εργασίας είναι α) η πιστοποίηση του είδους C. sativus L. και β) η ανίχνευση του αρτύματος κουρκουμά στο σαφράνι σε επίπεδα προσθήκης που κυμαίνονται μεταξύ 50 και 1% w/w. Για την πιστοποίηση του είδους C. sativus L. χρησιμοποιήθηκαν μοριακές μέθοδοι που βασίζονται στην αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης και συγκεκριμένα i) οι καμπύλες τήξης υψηλής ανάλυσης σε συνδυασμό με τις DNA barcoding περιοχές ii) οι μοριακοί δείκτες ISSR (inter-simple sequence repeat) και iii) τα MADs-box γονίδια. Η ανίχνευση νοθείας και ο προσδιορισμός του ποσοστού νοθείας του αρτύματος σαφράνι σε σκόνη με το άρτυμα κουρκουμά σε σκόνη πραγματοποιήθηκε τόσο με τη χρήση των μοριακών δεικτών μικροδορυφόρων, εντός απλών επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών και με τη μοριακή μέθοδο της υψηλής ανάλυσης καμπύλης τήξης όσο και με φυσικοχημικές τεχνικές όπως η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης αντίστροφης φάσης με ανιχνευτή συστοιχίας διόδων λυχνιών σε σειρά με φθορισμομετρικό ανιχνευτή (RP-HPLC-DAD-FL). 14

15 2. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2.1 ΤΟ ΑΡΤΥΜΑ ΣΑΦΡΑΝΙ Το άρτυμα σαφράνι ορίζεται ως «τα στίγματα του C. sativus L. αποξηραμένα, με σκούρο κόκκινο χρώμα και σε σχήμα σάλπιγγας. Σύμφωνα με το ορισμό που δόθηκε από τον FAO (Food and Agricultural Organization), το άρτυμα σχηματίζει «μια χαλαρή, μπερδεμένη μάζα από σκούρες κοκκινωπές και καφέ ίνες, ανάμεσα στις οποίες διακρίνονται μερικές κίτρινες, λεπτότερες. Οι πρώτες αποτελούν το στίγμα του φυτού, ενώ οι δεύτερες αποτελούν τον στύλο» (FAO 1986). Στην Ελλάδα είναι γνωστό ως «κρόκος» (ΚΤΠ 2011) Εικόνα 1: Το φυτό C. sativus L. Εικόνα 2:Τα μέρη του φυτού κρόκου Το όνομα σαφράνι προέρχεται από την αραβική λέξη που σημαίνει κίτρινο, ένα όνομα που αντικατοπτρίζει το χρώμα του εκχυλίσματος στο οποίο απαντούν κυρίως ενώσεις με δομή καροτενοειδούς, γνωστές ως κροκίνες. Οι χρωστικές αυτές υπάρχουν στα στίγματα του κρόκου και συμβάλλουν περισσότερο στο χρώμα του αρτύματος (Alonso et al. 2001). Το σαφράνι ως άρτυμα, αξιοποιείται σε διάφορες παραδοσιακές συνταγές ενώ είναι διαθέσιμο στο εμπόριο με τη μορφή ολόκληρων στιγμάτων ή σε σκόνη. Έχει αποδειχθεί ότι η ποιότητα του αρτύματος δεν είναι ίδια σε διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές παραγωγής του ανά τον κόσμο. Οι περιοχές που παράγουν το σαφράνι, θεωρούν ότι έχουν ένα προϊόν με μοναδικά φυσικοχημικά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Η διακύμανση όμως των τελευταίων στο σαφράνι αποδίδεται στις συνθήκες καλλιέργειας (π.χ. έδαφος, νερό, θερμοκρασία και υψόμετρο) και τις τεχνικές ξήρανσης και αποθήκευσης, ενώ η προέλευση του κόρμου, δηλαδή του πολλαπλασιαστικού υλικού, δεν φαίνεται να αποτελεί παράγοντα υψίστης σημασίας λόγω μικρής γενετικής διαφοροποίησης στο υβρίδιο αυτό (Maggi et al. 2011, Siracusa et al. 2013, Torelli et al. 2014). Το σαφράνι χρησιμοποιείται ως άρτυμα για την προσθήκη αρώματος και χρώματος στα τρόφιμα αλλά και σε παρασκευάσματα όπως αρώματα, χρωστικές, μελάνι. Στη βιομηχανία τροφίμων, μπορεί να χρησιμοποιηθεί αντί 15

16 χημικών και τεχνητών προσθέτων στην παραγωγή ποτών, γαλακτοκομικών και προϊόντων ζαχαροπλαστικής. Με βάση τα διαθέσιμα επιστημονικά ευρήματα, τα κύρια συστατικά των αποξηραμένων στιγμάτων μπορούν να κατηγοριοποιηθούν ως εξής: α) σε χρωστικές (τις κροκίνες) που δομικά είναι εστέρες του αποκαροτενοειδούς κροκετίνη με διάφορα σάκχαρα (γλυκόζη, γεντιοβιόζη), β) μια μονοτερπενική αλδεΰδη, τη σαφρανάλη (2,6,6-trimethyl-1,3-cyclohexadiene-1- carboxaldehyde) που είναι το κύριο συστατικό του αιθερίου ελαίου και υπεύθυνη για το άρωμα και γ) την πικροκροκίνη, πρόδρομη ένωση της σαφρανάλης και προϊόν της αποικοδόμησης της ζεαξανθίνης, που ευθύνεται κυρίως για την πικρή γεύση του αρτύματος (Σταϊκίδου 2014).Παρακάτω στην εικόνα 3 παρουσιάζονται οι χημικές δομές των κυριότερων συστατικών των αποξηραμένων στιγμάτων. Εικόνα 3: Χημικές δομές κροκίνης-α (διγεντιοβιοσυλεστέρας κροκετίνης), κροκετίνης, πικροκροκίνης και σαφρανάλης Φαρμακευτικές έρευνες έχουν δείξει ότι το σαφράνι μπορεί να έχει και ευεργετικές αντικαρκινικές, αντιοξειδωτικές, αναλγητικές, αντι-φλεγμονώδεις, αντικαταθλιπτικές αντισπασμωδικές και υπολιπιδαιμικές ιδιότητες έτσι ώστε να θεωρείται ως λειτουργικό άρτυμα (Kyriakoudi et al. 2013). 16

17 2.2 ΤΟ ΦΥΤΟ Crocus sativus L. Ο κρόκος είναι ένα μονοκοτυλήδονο ποώδες φυτό, που ανήκει στην οικογένεια Iridaceae, είναι πολύ διαδεδομένο στην περιοχή της Μεσογείου και της Δυτικής Ασίας και περιλαμβάνει περίπου 85 είδη (Παράρτημα Ι) με πιο σημαντικό το είδος C. sativus L. γιατί από τα αποξηραμένα στίγματά του προκύπτει το άρτυμα σαφράνι. Εικόνα 4: Από το φυτό κρόκος στο άρτυμα σαφράνι Όλα τα είδη του γένους Crocus είναι διπλοειδή με εξαίρεση τον C. sativus L. που είναι στείρο τριπλοειδές. Η στειρότητα αυτού του είδους οφείλεται στο ότι ο κρόκος είναι τριπλοειδής (3χ). Ο C. sativus L. πολλαπλασιάζεται μόνο αγενώς από κόρμους λόγω της ανικανότητάς του να παράγει γόνιμη γύρη. Στα βιβλιογραφικά δεδομένα υποστηρίζεται η θεωρία ότι το είδος C. sativus L. ίσως έχει προέλθει από την υβριδοποίηση μεταξύ των ειδών C. cartwrightianus και C. hadriaticus ή από την εξέλιξή του είδους C. cartwrightianus ή C. thomasii λόγω μετάλλαξης (Caiola et al. 2010). Ωστόσο, οι Erol et al βρήκαν πολύ μεγάλη ομοιότητα μεταξύ των ειδών C. pallasii subsp. pallasii και C. sativus καθώς και οι Harpke et al και οι Alsayied et al. 2015, κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι οι πρόγονοι του C. sativus L. είναι τα είδη C. cartwrightianus και C. pallasii αφού βρήκαν τις περισσότερες ομοιότητες μεταξύ τους αναλύοντας το γονιδίωμά τους. Εικόνα 5: Το φυτό C. hadriaticus Εικόνα 6: Το φυτό C.cartwrightianus Εικόνα 7: Το φυτό C. thomasii Μερικοί συγγραφείς έχουν καταλήξει στο συμπέρασμα ότι υπάρχει μικρή ή καμία γενετική παραλλακτικότητα στο φυτό του κρόκου (Fluch et al. 2009) αν και άλλες πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει περιορισμένη γενετική ποικιλότητα εντός του είδους (Nemati et al. 2012). 17 Εικόνα 8: Το φυτό C. pallasii

18 1. Ρίζα 2. Κόρμος 3. Κορμός 4. Φύλλα 5. Μπουμπούκι 6. Άνθος 7. Στήμονες 8. Ανθήρες 9. Στίγματα Εικόνα 9: Μορφολογικά χαρακτηριστικά του φυτού κρόκου 2.3. ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΚΑΙ ΕΜΠΟΡΙΚΗ ΑΞΙΑ ΤΟΥ ΑΡΤΥΜΑΤΟΣ Στις μέρες μας, οι χώρες με τις μεγαλύτερες σε έκταση περιοχές καλλιέργειας του C. sativus L. είναι το Ιράν, η Ινδία και η Ελλάδα ενώ σε μικρότερη κλίμακα καλλιεργείται και σε πολλές άλλες χώρες όπως είναι η Ισπανία, το Μαρόκο, η Ιταλία, η Τουρκία, η Γαλλία, η Ελβετία, η Αυστρία, το Ισραήλ, το Πακιστάν, το Αζερμπαϊτζάν, η Κίνα, η Αίγυπτος και η Ιαπωνία. Πρόσφατα έχουν γίνει προσπάθειες για την εισαγωγή του σε χώρες όπως η Αυστραλία, η Νέα Ζηλανδία, οι ΗΠΑ, η Αργεντινή και η Χιλή (Σταϊκίδου 2014). Παρακάτω, παρατίθεται ανεπίσημος πίνακας με την παγκόσμια παραγωγή του αρτύματος σε τρεις χρονολογίες. Πίνακας 1: Εκτίμηση της παγκόσμιας παραγωγής αρτύματος σαφράνι (Παπαδοπούλου 2015) Στην Ελλάδα το φυτό C. sativus L. καλλιεργείται μόνο σε 20 χωριά (Κρόκος, Άνω Κόμη, Κάτω Κόμη, Καρυδίτσα κ.α.) της Δυτικής Μακεδονίας (Κοζάνη). 18

19 Περισσότερες πληροφορίες για την καλλιέργειά του στην Ελλάδα βρίσκονται στη μεταπτυχιακή διατριβή της (Σταϊκίδου 2014). Παρακάτω παρουσιάζεται και γραφικά η έκταση της καλλιέργειας του κρόκου στην Ελλάδα (Εικόνα 10) και παγκοσμίως (Εικόνα 11). Εικόνα 10: Περιοχή καλλιέργειας του κρόκου στην Ελλάδα Εικόνα 11: Περιοχή καλλιέργειας του κρόκου σε παγκόσμια κλίμακα Ο κρόκος (C. sativus L., 2n = 3x = 24) καλλιεργείται για τα στίγματά του που μετά από αποξήρανση χρησιμοποιούνται ως άρτυμα και ως χρωστική. Στην ελληνική γλώσσα, η ονομασία «κρόκος» χρησιμοποιείται μάλιστα τόσο για το φυτό, όσο και για το τελικό προϊόν το οποίο είναι το πιο ακριβό γεωργικό προϊόν ανά γραμμάριο στον κόσμο (Δαλβινίδου 2015). Ο κρόκος ανθίζει μόνο μια φορά το χρόνο κατά τα μέσα Νοεμβρίου και η συγκομιδή του γίνεται αμιγώς με το χέρι (Εικόνα 12). Μετά το διαχωρισμό των τεπάλων με αέρα (Εικόνα 13), τα κόκκινα στίγματα διαχωρίζονται από τους κίτρινους στήμονες με το χέρι. Ως εκ τούτου, η καλλιέργεια του εν λόγω φυτού για τη συγκομιδή των λουλουδιών του, και ειδικά των στιγμάτων του, απαιτεί υψηλό εργατικό δυναμικό αυξάνοντας κατά πολύ το κόστος εργασίας. Για το λόγο αυτό αλλά και εξαιτίας του γεγονότος ότι ανθίζει μόνο μία φορά το χρόνο σε πολύ σύντομο χρονικό διάστημα (Εικόνα 15), το σαφράνι είναι το πιο ακριβό άρτυμα στον κόσμο (Saffron in Europe 2006). 19

20 Εικόνα 12: Συγκομιδή κρόκου με το χέρι Εικόνα 13: Διαχωρισμός τεπάλων από στίγματα με αέρα Αξίζει να σημειωθεί ότι ανάλογα με το μέγεθος του άνθους και ως συνέπεια του βάρους των στιγμάτων, απαιτούνται περίπου άνθη κρόκου ή στίγματα (Εικόνα 14) για να παραχθεί ένα κιλό από το μοναδικό άρτυμα. Το 2009, η τιμή της αγοράς για 1 κιλό σαφράνι ξεπέρασε τα 5.000$. Η παγκόσμια αγορά για το σαφράνι είναι αξίας περίπου 1,000,000,000$. Σήμερα στην Ελλάδα, η τιμή του αρτύματος ξεπερνά τα 2000 ευρώ/κιλό και η τιμή που πληρώνει ο τελικός καταναλωτής είναι γύρω στα 2,50 ευρώ/γραμμάριο (Δαλβινίδου 2015). Εικόνα 14: Αποξηραμένα στίγματα C. sativus L. (Αρχείο Μποσμαλή) Παρά το γεγονός ότι η ζήτηση για σαφράνι στη Μέση Ανατολή και τη Δύση αυξάνεται, η ποσότητα αποξηραμένου κρόκου που παράγεται παγκοσμίως παραμένει σταθερή σε περίπου 300 τόνους ανά έτος ενώ η παραγωγή έχει μειωθεί με ταχείς ρυθμούς σε πολλές χώρες. που παράγεται το σαφράνι παραδοσιακά (Sharafzadeh 2011). Τις τελευταίες δεκαετίες στις ευρωπαϊκές χώρες που καλλιεργείται ο κρόκος οι καλλιεργούμενες εκτάσεις (Ισπανία, Ιταλία και Ελλάδα) υπέστησαν σοβαρή μείωση. Στην Ισπανία, το σαφράνι μειώθηκε από 6000 το 1971 σε 200 εκτάρια σήμερα, στην Ελλάδα από 1600 εκτάρια το 1982 σε 860 εκτάρια, σύμφωνα με τα πλέον πρόσφατα στοιχεία και στην κεντρική Ιταλία μειώθηκε από 300 εκτάρια το 1910 σε 6 εκτάρια πριν από μερικά χρόνια. Αντίθετα, μια τεράστια αύξηση έχει σημειωθεί στο Ιράν τα τελευταία 30 χρόνια (Fernández et al. 2004). 20

21 Εικόνα 15: Βιολογικός κύκλος του κρόκου (Álvarez-Ortí et al. 2004) Ο κύριος λόγος για τη σημαντική αυτή μείωση της καλλιέργειας είναι η υψηλή απαίτηση χειρωνακτικής εργασίας διότι ο κρόκος πρέπει να συλλεχθεί σε λίγες μόνο ημέρες και σε λίγες ώρες μέσα στη μέρα και αυτό έχει ως συνέπεια την αύξηση του κόστους εργασίας (Fernández et al. 2004). Προς το παρόν, το μέλλον της καλλιέργειας κρόκου είναι μάλλον αβέβαιο γιατί παρά τη μεγάλη παραγωγή στη Μέση Ανατολή και τη Νότια Ασία συχνά λείπει ο έλεγχος της ποιότητας (τεχνικές καλλιέργειας και εφαρμογή μεθόδων αξιολόγησης της ποιότητας) (Gresta et al. 2008). 21

22 2.4 ΕΙΔΗ ΚΡΟΚΩΝ ΚΑΙ ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ C. sativus L. Όπως έχει ήδη αναφερθεί παραπάνω τα είδη crocus είναι πάρα πολλά (Παράρτημα I) με το μοναδικό είδος που είναι υψίστης εμπορικής σημασίας το C. sativus L. γιατί τα αποξηραμένα στίγματά του αποτελούν το άρτυμα σαφράνι. Η πιστοποίηση του συγκεκριμένου είδους κρίνεται επομένως αναγκαία και η εφαρμογή μοριακών τεχνικών μπορεί να συμβάλλει σε αυτό το σκοπό. Στη συνέχεια παρουσιάζονται οι κυριότερες από αυτές που έχουν εφαρμοστεί μέχρι σήμερα για την πιστοποίηση του είδους C. sativus L. Μοριακοί δείκτες Οι μοριακοί δείκτες είναι τμήματα DNA, τα οποία στην πλειονότητά τους δε σχετίζονται με φαινοτυπικά χαρακτηριστικά, παρουσιάζουν διαφορές μεταξύ των προς μελέτη ατόμων και χρησιμοποιούνται για την μελέτη της κληρονομικότητας χαρακτηριστικών καθώς και ποικιλομορφίας μεταξύ ατόμων διαφορετικών πληθυσμών. Κάποια παραδείγματα μοριακών δεικτών που χρησιμοποιούνται συχνά είναι: τυχαία ενισχυμένο πολυμορφικό DNA (RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA), ο πολυμορφισμός μήκους ενισχυμένων τμημάτων (AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism), οι αλληλουχημένες χαρακτηριστικές περιοχές (SCAR: Sequence Characterized Regions) οι απλές επαναλαμβανόμενες ακολουθίες (SSR: Simple Sequence Repeats), ο πολυμορφισμός μήκους περιοριστικών τμημάτων με τη χρήση της PCR (PCR-RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism) και οι πολυμορφισμοί μεταξύ απλών επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών (ISSR: Inter-Simple Sequence Repeats) (Τσαυτάρης et al. 2012). Τα ενισχυμένα τμήματα DNA που λαμβάνονται με τη χρήση των παραπάνω δεικτών είναι ικανά να αντανακλούν τη γενετική παραλλακτικότητα μέσα στο είδος αλλά και τη γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των ειδών (Zheng et al. 2013). Έχει αποδειχθεί ότι οι μοριακοί δείκτες είναι ικανοί να ανιχνεύσουν διαφορές στο επίπεδο του DNA επειδή αυτοί είναι σταθεροί και ανιχνεύσιμοι σε όλους τους τύπους ιστών, ανεξάρτητα από τις περιβαλλοντικές συνθήκες όπως είναι το περιβάλλον ανάπτυξης, το στάδιο ανάπτυξης ή η κατάσταση διαφοροποίησης (Marieschi et al. 2010) καθώς δεν επηρεάζονται ούτε από την ηλικία του φυτικού υλικού ούτε από τους περιβαλλοντικούς παράγοντες πριν και μετά τη συγκομιδή. Επιπλέον πλεονεκτήματα είναι ο σχετικά φθηνός εξοπλισμός που απαιτείται ώστε να πραγματοποιηθεί η συγκεκριμένη ανάλυση και η δυνατότητα ανάλυσης πολλών δειγμάτων ταυτόχρονα (Marmiroli et al. 2003). Όσον αφορά τους ISSR, είναι μοριακοί δείκτες και βασίζονται στην ενίσχυση τμημάτων DNA με PCR (η αντίστοιχη αντίδραση PCR είναι γνωστή ως ISSR- PCR) και τη χρήση ενός εκκινητή. Aναπτύχθηκαν από τους Zietkiewicz et al. 22

23 το 1994 και περιελάμβαναν την ενίσχυση αλληλουχιών DNA με τη χρήση ενός και μόνο εκκινητή που περιέχει τμήμα SSR ακολουθίας. Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται σε μια ISSR-PCR αποτελούνται από επαναλήψεις 2-4 βάσεων στη σειρά και έχουν μήκος βάσεις (Bornet et al. 2001). Για να πολλαπλασιαστεί η αλληλουχία του δείκτη ISSR ο εκκινητής θα πρέπει να βρει μια συμπληρωματική ακολουθία και στα δυο άκρα της επαναλαμβανόμενης αλληλουχίας DNA αλλά με αντίθετες διευθύνσεις (δηλαδή στο ένα άκρο στη μια αλυσίδα του DNA και στο άλλο άκρο την άλλη) (Τσαυτάρης και συνεργάτες, 2012). Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται σε μια ISSR-PCR μπορεί να αποτελούνται εκτός από τμήμα ενός μικροδορυφόρου SSR και από ένα σταθεροποιημένο, μη επαναλήψιμο τμήμα (anchored: αγκυροβολημένο ή σταθεροποιημένο) 5' ή 3' άκρο το οποίο αυξάνει την εξειδίκευση για κάποιες περιοχές του DNA (Zietkiewicz et al. 1994). Στην Εικόνα 16 παρουσιάζεται η αρχή λειτουργίας των σταθεροποιημένων στο 5' και στο 3' άκρο εκκινητών. Εικόνα 16: Αρχή λειτουργίας των μοριακών δεικτών ISSR. Η περίπτωση των εκκινητών που εκτός από επαναλήψεις δι-, τρινουκλεοτιδίων φέρουν στο 5 ή στο 3 άκρο μη επαναλήψιμα τμήματα (anchored) Τα πλεονεκτήματα των δεικτών ISSR είναι ότι παρουσιάζουν υψηλή επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων (το 92-95% των ζωνών μπορούν να ανιχνευθούν με τη χρήση των ίδιων συνθηκών και ίδιων δειγμάτων σε διαφορετικά ή και στο ίδιο εργαστήριο), είναι πολυμορφικοί και περισσότεροι σε αριθμό σε σύγκριση με τους φαινοτυπικούς και βιοχημικούς δείκτες, είναι εύκολοι και γρήγοροι στη χρήση τους και παρουσιάζουν σταθερότητα στα διάφορα αναπτυξιακά στάδια του οργανισμού. Έχουν χαμηλό κόστος χρήσης, και δεν είναι προαπαιτούμενη η γνώση της αλληλουχίας (Τσαυτάρης et al. 2012). Οι ISSR δείκτες ανιχνεύουν συνήθως υψηλότερο επίπεδο πολυμορφισμού από ό, τι οι RFLP ή οι RAPD δείκτες (Godwin et al. 1997). Παρέχοντας επαναλαμβανόμενα και σταθερά τμήματα DNA (fragments), είναι οι πιο ευρέως χρησιμοποιούμενοι δείκτες για την κατασκευή του δακτυλικού αποτυπώματος του DNA (Powell et al. 1996). Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι 23

24 οι ISSR δείκτες είναι δυνητικά χρήσιμοι για την ταυτοποίηση ενός είδους (Fang et al. 1997). MADs-box γονίδια Όλα εκείνα τα γονίδια που είναι υπεύθυνα για τις λειτουργίες του φυτού και εμπλέκονται στην ανάπτυξή του ανήκουν σε μια μεγάλη οικογένεια, τα MADs- Box γονίδια (Jack 2001, Theißen 2001, Immink et al. 2002, Jack 2004). Οι Tsaftaris et al απομόνωσαν και κλωνοποίησαν 4 τέτοια γονίδια που βρίσκονται στο γονιδίωμα του C. sativus L. και με βάση τις συγκεκριμένες αλληλουχίες σχεδίασαν ειδικούς εκκινητές για αυτές τις περιοχές του γονιδιώματος. Εφαρμόζοντας λοιπόν τη μέθοδο της ανάλυσης καμπύλης τήξης και χρησιμοποιώντας αυτούς τους εκκινητές, απέδειξαν ότι και αυτός είναι ένας τρόπος πιστοποίησης του είδους C. sativus L. αφού τα συγκεκριμένα γονίδια βρίσκονται μόνο στο γονιδίωμα του C. sativus L. 24

25 2.5 ΠΡΑΚΤΙΚΕΣ ΝΟΘΕΙΑΣ ΤΟΥ ΑΡΤΥΜΑΤΟΣ ΣΑΦΡΑΝΙ Γενικά Η νοθεία των τροφίμων (food fraud) είναι ένας συλλογικός όρος που περιλαμβάνει την εσκεμμένη αντικατάσταση, προσθήκη, αλλοίωση ή παραποίηση τροφίμων, συστατικών τροφίμων ή συσκευασίας τροφίμων ή ακόμα και ψευδείς ή παραπλανητικές δηλώσεις για ένα προϊόν με στόχο το οικονομικό κέρδος (Tsimidou et al. 2016). Οποιαδήποτε νοθεία οδηγεί σε αλλαγή της ταυτότητας και/ή της καθαρότητας του αυθεντικού προϊόντος με αντικατάσταση, αραίωση ή τροποποίηση του με φυσικά ή χημικά μέσα. Συνήθως αυτοί που διαπράττουν τη νοθεία επικεντρώνονται στο οικονομικό κέρδος και στην αποφυγή των συστημάτων ελέγχου ποιότητας χωρίς να ενδιαφέρονται αν το νοθευμένο προϊόν αποτελεί κίνδυνο για τη δημόσια υγεία (Σταϊκίδου 2014). Η γνησιότητα των τροφίμων είναι ένα όλο και πιο σημαντικό ζήτημα για τους καταναλωτές, τα νομοθετικά όργανα και τη βιομηχανία τροφίμων. Αυτή στοχεύει στην ανίχνευση της νοθείας που πραγματοποιείται συχνά σε προϊόντα διατροφής εξαιτίας οικονομικών κίνητρων (οικονομική νοθεία). Η νοθεία αυτού του τύπου γίνεται συνήθως με λιγότερο ακριβά και περισσότερο διαθέσιμα υλικά τα οποία όμως δεν είναι εύκολο να προσδιοριστούν με συνήθεις μεθοδολογίες ανάλυσης (Cubero-Leon et al. 2014). Το σαφράνι θεωρείται ένα από τα τρόφιμα που υπόκεινται συχνότερα σε νοθεία για οικονομικό κέρδος (π.χ ελαιόλαδο, ψάρια, γάλα, μέλι, καφές, χυμός πορτοκαλιού και μήλου). Πιο συγκεκριμένα, το σαφράνι είναι πιθανόν το άρτυμα με τα περισσότερα κρούσματα νοθείας στην ιστορία. Ως συνέπεια της υψηλής τιμής του και της απαιτητικής του παραγωγής, έχουν γίνει προσπάθειες να νοθευτεί με διάφορες ουσίες που έχουν παρόμοιο χρώμα και μορφολογία με σκοπό την αύξηση του όγκου και του βάρους των εμπορικών παρτίδων και αυτό προκαλεί προβλήματα στην εμπορία του (Σταϊκίδου 2014). Το σαφράνι όπως αναφέρεται και παραπάνω είναι διαθέσιμο σε επίπεδο λιανικής πώλησης σε μορφή ολόκληρων στιγμάτων ή σε μορφή σκόνης. Όμως, ενώ στην πρώτη περίπτωση η ταυτοποίησή του είναι μάλλον εύκολη ακόμα και με οπτική εξέταση, στη δεύτερη περίπτωση απαιτείται προσεκτική φαρμακογνωστική ή φυτοχημική αξιολόγηση προκειμένου να εντοπιστεί ενδεχόμενη προσθήκη ξένου υλικού (Σταϊκίδου 2014). Ως εκ τούτου, η νοθεία του αρτύματος δεν είναι πάντα εύκολα αναγνωρίσιμη, ιδιαίτερα όταν το δείγμα είναι σε μορφή σκόνης ή όταν το άρτυμα προστίθεται σε μίγμα αρτυμάτων (Marieschi et al. 2012). 25

26 Τα φυτικά υλικά που θεωρούνται πιο πιθανά για ενδεχόμενη χρήση τους στη νοθεία του αρτύματος παρουσιάζονται στον πίνακα που ακολουθεί (Πίνακας 2). Πίνακας 2: Πιθανά φυτικά υλικά που χρησιμοποιούνται για νόθευση του σαφράνι Πιθανά φυτικά υλικά κομμένοι ή βαμμένοι στήμονες Βιβλιογραφική αναφορά Crocus sativus L. (Κρόκος) Carthamus tinctorius L. (Κάρδαμο) Hemerocallis lilioasphodelus L. (Ημεροκαλλίς) Calendula officinalis L. (Καλέντουλα) Daucus carota L. (Καρότο) Curcuma longa L. (Κουρκουμάς) Zea may L. (Καλαμπόκι) Στίγματα Πέταλλα Πέταλλα Λουλούδια Ρίζες Ρίζες Μουστάκι Στήμονες (Hagh-Nazari et al. 2006) (Ordoudi et al. 2004) (Saffron in (Europe 2006) (Hagh-Nazari et al. 2006) (Che et al. 2007) (Saffron in Europe 2006) (Rekha et al. 2011) (Torelli et al. 2014) (Hagh-Nazari et al. 2006) (Che et al. 2007) (Torelli et al. 2014) (Rekha et al. 2011) (Saffron in Europe 2006) (Hagh-Nazari et al. 2006) (Che et al. 2007) (Rekha et al. 2011) (Saffron in Europe 2006) (Torelli et al. 2014) (Hagh-Nazari et al. 2006) (Che et al. 2007) (Rekha et al. 2011) (Saffron in Europe 2006) (Torelli et al. 2014) (Hagh-Nazari et al. 2006) (Che et al. 2007) (Rekha et al. 2011) (Saffron in Europe 2006) (Torelli et al. 2014) (Hagh-Nazari et al. 2006) (Che et al. 2007) (Rekha et al. 2011) (Saffron in Europe 2006) (Torelli et al. 2014) 26

27 Arnica montana (Άρνικα) Bixa orellana (Ανάττο) Πιθανά φυτικά υλικά Άνθη Σπόροι Βιβλιογραφική αναφορά (Hagh-Nazari et al. 2006) (Che et al. 2007) (Rekha et al. 2011) (Saffron in Europe 2006) (Torelli et al. 2014) (Hagh-Nazari et al. 2006) (Che et al. 2007) (Rekha et al. 2011) (Saffron in Europe 2006) (Torelli et al. 2014) Nelumbo nucifera Gaertn (Νούφαρο) Crocus vernus (Είδος άγριου κρόκου) Στίγματα Στίγματα (Hagh-Nazari et al. 2006) (Che et al. 2007) (Rekha et al. 2011) (Saffron in Europe 2006) (Torelli et al. 2014) (Hagh-Nazari et al. 2006) (Che et al. 2007) (Rekha et al. 2011) (Saffron in Europe 2006) (Torelli et al. 2014) Gardenia jasminoides E. (Γαρδένια) Εκχύλισμα από τους καρπούς (Carmona et al. 2006) (Ordoudi et al. 2004) (Sánchez-Vioque et al. 2012) Ο Maish 1885 ανέφερε επίσης ως περίπτωση νοθείας στο σαφράνι τα φυτικά υλικά της παπαρούνας, της πιπεριάς και το περίβλημα του κρεμμυδιού. Επίσης, έχουν εντοπιστεί και άλλοι τρόποι νοθείας του συγκεκριμένου εμπορικού προϊόντος με σκοπό την αύξηση του βάρους του όπως αναφέρει η (Σταϊκίδου 2014). Η ανίχνευση της εμπορικής νοθείας σε τρόφιμα και αρτύματα είναι ένα δύσκολο έργο, λόγω του γεγονότος ότι οι φυσικές, χημικές και οργανοληπτικές ιδιότητες δεν είναι πάντα εύκολα αναγνωρίσιμες χωρίς να γίνουν κάποια πειράματα ή σε ορισμένες περιπτώσεις να εφαρμοστούν ακόμη και πολυδάπανες τεχνικές (Altschul et al. 1997). Εκτός από τα προφανή θέματα εμπορίου, η νοθεία του αρτύματος μπορεί να αποτελέσει πηγή ανησυχίας και στην περίπτωση που το φυτικό υλικό αξιολογείται για ερευνητικούς σκοπούς, επειδή η χρήση νοθευμένου προϊόντος μπορεί να οδηγήσει σε παραπλανητικά αποτελέσματα σχετικά με τις χημικές, βιολογικές και θεραπευτικές ιδιότητές του (Marieschi et al. 2012). 27

28 2.5.2 ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΚΑΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΞΕΝΩΝ ΦΥΤΙΚΩΝ ΥΛΙΚΩΝ ΣΤΟ ΣΑΦΡΑΝΙ Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση και τον προσδιορισμό νοθείας στα τρόφιμα είναι κυρίως φυσικοχημικές, όμως τα τελευταία χρόνια έχουν αρχίσει να εφαρμόζονται για το σκοπό αυτό και μοριακές μέθοδοι. Πιο συγκεκριμένα, στις βάσεις βιβλιογραφικών δεδομένων έχουν αναφερθεί πολλές αναλυτικές διαχωριστικές και φασματοσκοπικές τεχνικές και συνδυασμοί τους που χρησιμοποιούνται για την πραγματοποίηση των απαραίτητων ελέγχων και για την ανίχνευση της νοθείας σε προϊόντα διατροφής όπως π.χ HPLC σε συνδυασμό με φασματοσκοπίες μαζών (Cordella et al. 2002). Τα τελευταία χρόνια ευρεία εφαρμογή βρίσκουν και οι μέθοδοι που βασίζονται στην Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR- Polymerase Chain Reaction) (Ebbehøj et al. 1991, Ebbehøj et al. 1991, Hunt et al. 1997, Ghovvati et al. 2009) και αυτές είναι η ανάλυση καμπύλης τήξης (melting curve analysis), η υψηλής ανάλυσης καμπύλη τήξης HRM (High Resolution Melting), η μέθοδος DNA Barcoding, οι μοριακοί δείκτες και η τεχνική Bar-HRM (Barcoding-HRM) (Jaakola et al. 2010, Bosmali et al. 2012, Ganopoulos et al. 2012, Madesis et al. 2012). Πιο συγκεκριμένα, η ανάλυση HRM έχει χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση της προσθήκης αγελαδινού γάλακτος σε γαλακτοκομικά βόεια προϊόντα και στη φέτα (Sakaridis et al. 2013), για την ανίχνευση της προσθήκης άλλων ειδών ρυζιού χαμηλότερης αξίας στο ρύζι Basmati και για τον έλεγχο γνησιότητας μαρμελάδων από κεράσι (Ganopoulos et al. 2011). Επίσης, η HRM σε συνδυασμό με τη μέθοδο DNA Barcoding (Bar-HRM) έχει χρησιμοποιηθεί σε αρκετές μελέτες τα τελευταία χρόνια όπως για παράδειγμα για την ανίχνευση της παρουσίας βίκου (Vicia sativa) σε φακές (Bosmali et al. 2012), στη διάκριση του ΠΟΠ προϊόντος ''Φάβα Σαντορίνης'' από άλλα είδη ψυχανθών (Lathyrus, Vicia, Pisum) που χρησιμοποιούνται συνήθως ως νοθεία στη φάβα, στη διάκριση, ταυτοποίηση και ανίχνευση της νοθείας ζωοτροφών και κτηνοτροφικών ειδών με ψυχανθή (Ganopoulos et al. 2012). Επίσης, για τον έλεγχο γνησιότητας διαφόρων ειδών μούρων (Jaakola et al. 2010) και αφεψημάτων από βότανα (Xanthopoulou et al. 2016) και για τον έλεγχο γνησιότητας και την ποσοτική ανίχνευση καλλιεργειών σόγιας (Madesis et al. 2012). Επίσης, η προαναφερθείσα τεχνική έχει χρησιμοποιηθεί και για την ταυτοποίηση μυκήτων (Maeta et al. 2008) και ιχθύων (Dalmasso et al. 2007). Σε ορισμένες από τις παραπάνω μελέτες εκτός από ανίχνευση έχει γίνει και εκτίμηση του ποσοστού της νοθείας σε ένα δείγμα με την τεχνική της HRM (Ganopoulos et al. 2011, Mader et al. 2011, Bosmali et al. 2012, Ganopoulos et al. 2012, Madesis et al. 2012, Sakaridis et al. 2013). Παρακάτω στην εικόνα 17 παρουσιάζεται η συχνότητα εφαρμογής των παραπάνω μεθόδων για την ανίχνευση νοθείας σε διάφορα τρόφιμα (Moore 28

29 et al. 2012) και όπως είναι προφανές μεγαλύτερη εφαρμογή για το σκοπό αυτό βρίσκουν οι χημικές αναλυτικές τεχνικές λόγω χαμηλότερου κόστους και μεγαλύτερης εφαρμογής τους σε ελέγχους ρουτίνας. Εικόνα 17: Κορυφαίες τεχνικές ανίχνευσης νοθείας καταχωρημένες στην επιστημονική βάση δεδομένων Scopus (Moore et al. 2012) HPLC υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης, IR φασματοσκοπία υπερύθρου, NIR φασματοσκοπία εγγύς-υπερύθρου, MIR φασματοσκοπία μέσου-υπερύθρου, GC αέρια χρωματογραφία, IRMS φασματοσκοπία μάζας αναλογίας ισοτόπων, MS ενωτικές μέθοδοι φασματοσκοπίας μάζας, PCR αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, CE τριχοειδής ηλεκτροφόρηση, ELISA ανοσορροφητική δοκιμή συνδεδεμένη με ένζυμα, TLC χρωματογραφία λεπτής στιβάδας, SNIF-NMR site specific natural isotope fractionation, Raman φασματοσκοπία Raman, NMR φασματομετρία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού, HPAEC χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων υψηλής απόδοσης, DSC θερμιδομετρία διαφορικής σάρωσης, Όσον αφορά στο σαφράνι, οι πρακτικές που ακολουθούνται για την ανίχνευση και τον προσδιορισμό ξένων φυτικών υλικών περιλαμβάνουν συνήθως φυτοχημικές αναλύσεις με εφαρμογή χρωματογραφικών και φασματοσκοπικών τεχνικών όμως τα τελευταία χρόνια για το συγκεκριμένο σκοπό έχουν χρησιμοποιηθεί και μοριακές μέθοδοι (Marieschi et al. 2012). Η αυθεντικότητα του αρτύματος σαφράνι στηρίζεται κυρίως σε μικροσκοπικές παρατηρήσεις των ιστο-μορφολογικών χαρακτηριστικών του φυτού, που είναι εξαιρετικά χρονοβόρα διαδικασία, όταν τα δείγματα που πρόκειται να εξεταστούν είναι πολλά. Η διαδικασία αυτή απαιτεί εκπαιδευμένο και έμπειρο προσωπικό καθώς συνεπάγεται και ως ένα βαθμό υποκειμενική ερμηνεία (Marieschi et al. 2010). Επιπλέον, αυτή η προσέγγιση δε μπορεί να εφαρμοστεί άμεσα σε επεξεργασμένα τρόφιμα στα οποία αναμιγνύονται συστατικά διαφορετικής προέλευσης (ζωικής, φυτικής και συνθετικής) και έτσι 29

30 αυτά υποβάλλονται σε τροποποίηση που μπορεί να μεταβάλει ανεπανόρθωτα τα μορφολογικά χαρακτηριστικά ή να παρεμποδίζει τη διαδικασία εκχύλισης και ανάλυσης (Maggi et al. 2011). Οι χημικές τεχνικές που έχουν χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση νοθείας του αρτύματος σαφράνι περιλαμβάνουν UV-Vis φασματοφωτομετρία (Zalacain et al. 2005, Sánchez et al. 2008, Maggi et al. 2011, Ordoudi et al. 2011), υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) (Haghighi et al. 2007, Lage et al. 2009, Ordoudi et al. 2011) με ή χωρίς φασματομετρία μάζας (Caballero- Ortega et al. 2007, Lage et al. 2009, Sabatino et al. 2011), (proton transfer reaction mass spectrometry) φασματομετρία μάζας με αντίδραση μεταφοράς πρωτονίου (PTR-MS) (Nenadis et al. 2016), εγγύς ή μέσου υπέρυθρη φασματοσκοπία (NIR/MIR) (Zalacain et al. 2005), μη υδατική τριχοειδής ηλεκτροφόρηση (Zougagh et al. 2005) και φασματομετρία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) (Petrakis et al. 2015) α Μοριακές τεχνικές που αξιοποιούνται στην ανίχνευση νοθείας του αρτύματος σαφράνι Πολλοί ερευνητές έχουν προσφύγει τα τελευταία χρόνια στην ανάλυση του DNA για τον έλεγχο της ταυτότητας των τροφίμων επειδή αυτή προσφέρει διάφορα πλεονεκτήματα στον ποιοτικό έλεγχο. Ένα πολύ σημαντικό πλεονέκτημα των μοριακών τεχνικών είναι ότι επιτρέπει τον εντοπισμό οποιουδήποτε ξένου φυτικού είδους στην αρχική ύλη ακόμη και σε επεξεργασμένα τρόφιμα, αφού με κατάλληλες μεθόδους είναι δυνατή τόσο η εκχύλιση όσο και η ενίσχυση του DNΑ που περιέχεται (Costa et al. 2012). Στην πραγματικότητα το DNA είναι σχεδόν αμετάβλητο και ανιχνεύσιμο σε κάθε κύτταρο, σχετικά ανθεκτικό στη θερμότητα και επιτρέπει την αναγνώριση των ειδών, όμως ακόμη και στην περίπτωση που είναι κατακερματισμένο λόγω των μεταχειρίσεων της πρώτης ύλης οι μοριακές τεχνικές μπορούν ακόμη να είναι αποτελεσματικές (Perez et al. 2004). Ωστόσο, υπάρχει μικρή πιθανότητα επιμόλυνσης των δειγμάτων DNA η οποία όμως μπορεί να ελεγχθεί αφού πάντα στα δείγματα συμπεριλαμβάνεται και το λευκό το οποίο αποτελείται από όλα τα αντιδραστήρια χωρίς δείγμα DNA. Για την ανίχνευση της νοθείας στο σαφράνι έχουν χρησιμοποιηθεί αρκετές μέθοδοι που βασίζονται στην PCR, συμπεριλαμβανομένων της εξειδικευμένης για ένα αλληλόμορφο γονίδιο PCR, allele-specific PCR (AS-PCR) (Mao et al. 2007), PCR (Sawyer et al. 2003, Zhang et al. 2007), ανάλυση της καμπύλης τήξης (melting curve analysis) (Jiang et al. 2014) και υψηλής ανάλυσης καμπύλη τήξης (HRM) (Villa et al. 2016). Ωστόσο, έχουν χρησιμοποιηθεί από διάφορους ερευνητές και άλλες τεχνικές όπως είναι η ανάλυση της αλληλουχίας του DNA (DNA sequence analysis) (Ma et al. 2001, Che et al. 2007, Mao et al. 2007), η τεχνική του DNA Barcoding (Gugerli et al. 2005, Kress et al. 2007, Kress et al. 2008, Seberg et al. 2009, Yao et al. 2009, 30

31 Gismondi et al. 2012, Jiang et al. 2014) καθώς και η RAPD-PCR (Calvo et al. 2001, Guo et al. 2011, Kumar et al. 2011, Javanmardi et al. 2012) Επιπροσθέτως, με τη βοήθεια της χρήσης διαφόρων μοριακών δεικτών όπως είναι οι ISSR δείκτες (Zheng et al. 2013), οι SCAR δείκτες (Zougagh et al. 2005, Marieschi et al. 2012, Babaei et al. 2014, Torelli et al. 2014) και οι AFLP δείκτες (Zubor et al. 2004) καθίσταται εύκολη η αποτύπωση του γονιδιώματος και άρα η σύγκριση μεταξύ των ειδών με σκοπό την ανίχνευση πιθανής νοθείας. Στο σημείο αυτό, αξίζει να σημειωθεί ότι η τεχνική των δεικτών DNA έχει πιο ευρεία εφαρμογή και για το λόγο αυτό εκτός από την πιστοποίηση των διαφόρων ειδών όπως έχει αναφερθεί προηγουμένως στο κεφάλαιο 2.4 μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για την ανίχνευση πιθανής νοθείας σε οποιοδήποτε φυτικό υλικό ή και τρόφιμο ακόμη και στην περίπτωση που πρόκειται για ποικιλία του ίδιου είδους. Οι μοριακοί δείκτες προσφέρουν πολλά πλεονεκτήματα στον προσδιορισμό της γνησιότητας των τροφίμων σε σχέση με τις συμβατικές μεθόδους που βασίζονται στο φαινότυπο και για το λόγο αυτό μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να διακρίνουν το γνήσιο από το νοθευμένο. Η ποσότητα υλικού που απαιτείται για την ανάλυση είναι ελάχιστη και έτσι αυτή η μέθοδος είναι ιδιαίτερα κατάλληλη για ένα υλικό όπως το σαφράνι (Zheng et al. 2013). Οι δείκτες DNA έχουν γίνει πρόσφατα πολύ δημοφιλές μέσο, για την ταυτοποίηση και την αυθεντικότητα μιας σταθερά αυξανόμενης ποικιλίας προϊόντων διατροφής, φαρμακευτικών και αρωματικών φυτών (Dhanya et al. 2010). Τα αποτελέσματα των μοριακών μεθόδων που έχουν χρησιμοποιηθεί μέχρι στιγμής για την ανίχνευση φυτικών προσμίξεων στο σαφράνι είναι αρκετά ικανοποιητικά (Marieschi et al. 2012, Babaei et al. 2014, Torelli et al. 2014). Συγκεκριμένα, η χρήση των δεικτών DNA σε εμπορικά δείγματα σαφράνι επέτρεψε την ανίχνευση μικρών ποσοτήτων (μέχρι και 1% w/w) από φυτικά υλικά που χρησιμοποιούνται κυρίως για αύξηση του βάρους του (Curcuma longa L. και Carthamus tinctorius L.) (Marieschi et al. 2012, Guijarro-Díez et al. 2015). Οι δείκτες γνησιότητας είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για την ανίχνευση διάφορων πρακτικών νοθείας, ακόμα και των πιο εκλεπτυσμένων που εφαρμόζονται τα τελευταία χρόνια. Έτσι, η δυνατότητα αυτών των δεικτών μπορεί να αξιοποιηθεί στο μέλλον για να εντοπιστεί γρήγορα μια νοθεία ανεξάρτητα από το είδος της (Guijarro-Díez et al. 2015). 31

32 DNA Barcoding Τα DNA Barcodes είναι σύντομες ορθόλογες αλληλουχίες DNA που χρησιμοποιούνται για την αναγνώριση και ταυτοποίηση των διαφόρων ειδών. Με τη χρήση μιας συγκεκριμένης περιοχής DNA ως ετικέτα, τα DNA barcodes παρέχουν μια ταχεία, ακριβή και αυτοματοποιημένη μέθοδο ταυτοποίησης. Αυτή η μέθοδος έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως στην ταυτοποίηση των φυτών, την αξιολόγηση και τη διατήρηση της βιοποικιλότητας, την ανίχνευση της νοθείας και την παραδοσιακή ιατρική (Gao et al. 2010). Οι πιο συνηθισμένες γονιδιακές περιοχές για DNA barcoding στα φυτά είναι οι περιοχές του χλωροπλαστικού γονιδιώματος trnl, matk, rbcl και συμπληρωματικά η trnh-psba. Αυτές οι τρεις γονιδιακές περιοχές προτάθηκαν από το Consortium for the barcode of life (CBOL_διαδικτυακή κοινότητα η οποία έχει αναλάβει να συγκεντρώσει όλες τις πληροφορίες για το DNA barcoding όλων των οργανισμών που παρέχει οδηγίες για την επιλογή και χρήση γονιδιακών περιοχών και βάσεις δεδομένων για τη μέθοδο DNA barcoding) ως πρότυποι δείκτες barcoding ( Οι περιοχές που επιλέχθηκαν ως πρότυπες έχουν υψηλή κάλυψη, υψηλή ποιότητα ακολουθίας ύστερα από αλληλούχιση και υψηλό επίπεδο διακριτικής ικανότητας μεταξύ των ειδών (Hollingsworth et al. 2009). Πρόσφατα, το δακτυλικό αποτύπωμα του DNA (DNA fingerprinting) έχει εφαρμοστεί ευρέως στον τομέα της φυλογένεσης και των μελετών που σχετίζονται με την ταυτοποίηση μεταξύ των στενών συγγενικών ειδών (Zheng et al. 2013). Παρά τα πλεονεκτήματά της, αυτή η τεχνική απαιτεί επεξεργασία μετά την PCR όπως η αλληλούχιση του DNA, η ευθυγράμμιση της αλληλουχίας και η ανάλυση της αλληλουχίας με το πρόγραμμα Blast Ν ή/και την κατασκευή φυλογενετικών δένδρων. Αυτά τα βήματα κάνουν την ανάλυση του DNA barcoding σχετικά περίπλοκη και χρονοβόρα (Jiang et al. 2014) και για το λόγο αυτό τα τελευταία χρόνια έχουν αναπτυχθεί και συνεχίζουν να βελτιώνονται καινούργιες τεχνικές ανάλυσης του DNA. Τεχνικές βασιζόμενες στη μέθοδο της PCR Οι προαναφερθείσες τεχνικές μοριακής ταυτοποίησης, όπως η ανάλυση της αλληλουχίας του DNA και οι μοριακοί δείκτες, συχνά απαιτούν επιλογή (screening) νέων τμημάτων DNA (fragments) ή αλληλόμορφων ώστε να σχεδιαστούν ειδικοί εκκινητές όταν συναντώνται νέα είδη νοθείας. Έτσι, αυτές οι τεχνικές είναι χρονοβόρες ή έχουν περιορισμένη εφαρμογή. Γι αυτό αναπτύχθηκε μια αξιόπιστη μέθοδος που δε σχετίζεται με την αλληλούχιση, αλλά στηρίζεται στην ανάλυση της καμπύλης τήξης των προϊόντων της PCR (Jiang et al. 2014). 32

33 Η υψηλής ανάλυσης καμπύλη τήξης (HRM) είναι μια ευρέως διαδεδομένη τεχνολογία ταυτοποίησης γενοτύπων και ανίχνευσης μεταλλάξεων που έχει χρησιμοποιηθεί σε πολλά επιστημονικά πεδία, από την εισαγωγή της το 2003 (Gundry et al. 2003). Εγκρίθηκε για πρώτη φορά στην κλινική χημεία και τη παθολογία του ανθρώπου, ενώ στην πορεία χρησιμοποιήθηκε και στις επιστήμες των φυτών για διάφορες χρήσεις, όπως η ταυτοποίηση ποικιλιών (Mackay et al. 2008) η ανίχνευση πολυμορφισμού και γενοτύπιση μικροδορυφορικών περιοχών (Mader et al. 2011, Distefano et al. 2012), η νοθεία των τροφίμων (Ganopoulos et al. 2011, Mader et al. 2011, Vietina et al. 2013) και η ταυτοποίηση παθογόνων (Sanzani et al. 2013). Η HRM είναι μια αυτοματοποιημένη αναλυτική μοριακή τεχνική που μετρά το ρυθμό της αποδιάταξης του δίκλωνου DNA σε μονόκλωνο με την αύξηση της θερμοκρασίας. Για να πραγματοποιηθεί μια ανάλυση HRM, το κομμάτι προς μελέτη πρέπει να ενισχυθεί με PCR πραγματικού χρόνου (real-time PCR) ώστε να αποκτηθεί μία επαρκής ποσότητα του προϊόντος PCR. Η real-time PCR πραγματοποιείται με την παρουσία μιας ειδικής φθορίζουσας χρωστικής (Syto ή SYBR Green Ι ή EVA Green ή κ.ά) που προσδένεται αποκλειστικά και μόνο στη διπλή έλικα του DNA. Αυτή η χρωστική είναι έντονα φθορίζουσα όταν συνδέεται στο δίκλωνο DNA και δίνει ελάχιστο σήμα όταν αποσυνδέεται (Jiang et al. 2014). Για να μπορεί να χρησιμοποιηθεί μια χρωστική στην ανάλυση HRM πρέπει να πληροί ορισμένες προϋποθέσεις: πρέπει να δίνει αναλυτικές πληροφορίες για τη συμπεριφορά του ενισχυμένου τμήματος κατά την τήξη, να μην είναι εξειδικευμένη στο να προσδένεται σε πουρίνες ή πυριμιδίνες, να μην μεταβάλλει τη θερμοκρασία αποδιάταξης του τμήματος DNA (θερμοκρασία τήξης, Tm) ή να αναστέλλει την ενίσχυση του DNA. Η μετάβαση από τη φθορίζουσα στη μη φθορίζουσα κατάσταση επιτρέπει στον αναλυτή να παρακολουθεί την ενίσχυση του DNA κατά τη διάρκεια της PCR ( Η μεταβολή της έντασης φθορισμού, η θερμικά επαγόμενη διάσπαση του DNA με HRM και η παρατηρούμενη συμπεριφορά τήξης είναι χαρακτηριστικά του συγκεκριμένου προϊόντος DNA που προσδιορίζονται με βάση το μήκος της αλληλουχίας, τη διάταξη της αλληλουχίας του DNA σε βάσεις γουανίνης κυτοσίνης (GC), τη συμπληρωματικότητα και της πλησιέστερης θερμοδυναμικής (Reed et al. 2004). Οι παράγοντες που επηρεάζουν τη διαδικασία της PCR, όπως η θερμοκρασία ανόπτησης (annealing) και η συγκέντρωση του DNA (από 5 μέχρι 10 ng/l. είναι η βέλτιστη συγκέντρωση ώστε να μην επηρεάζει την καμπύλη τήξης), θα μπορούσαν να επηρεάσουν και τα αποτελέσματα της καμπύλης τήξης (Jiang et al. 2014). 33

34 Αφού ολοκληρωθεί η PCR, η θερμοκρασία αρχίζει να αυξάνεται αργά και έτσι το ενισχυμένο τμήμα αποδιατάσσεται και προκύπτει μια χαρακτηριστική καμπύλη αποδιάταξης, δηλαδή η υψηλής ανάλυσης καμπύλη τήξης. Καθώς αυξάνεται η θερμοκρασία η ένταση του φθορισμού της χρωστικής ελαττώνεται (αποδιάταξη του DNA οδηγεί στην αποσύνδεση της χρωστικής και επομένως μείωση του φθορισμού). Στην HRM ανάλυση η θερμοκρασία μπορεί να ανεβαίνει κατά 0,008-0,2 ο C παρέχοντας μεγαλύτερη ακρίβεια των αποτελεσμάτων ( Στην Εικόνα 18 εμφανίζεται η ένταση φθορισμού σε συνάρτηση με τη θερμοκρασία χωρίς να έχει γίνει κανονικοποίηση (normalization). Τα στοιχεία αυτού του διαγράμματος αποτελούν τα δεδομένα που χρησιμοποιούνται από το λογισμικό της συσκευής HRM για την εξαγωγή συμπερασμάτων αλλά και τη δημιουργία άλλων πληροφοριακών διαγραμμάτων. Να σημειωθεί εκτός από τα δείγματα τα οποία μελετώνται χρησιμοποιείται και ένα πρότυπο δείγμα με γνωστό σημείο τήξης (Wittwer et al. 2003). Εικόνα 18: Καμπύλες τήξης υψηλής ανάλυσης έξι διαφορετικών γενοτύπων. Δεδομένα που παράγει η HRM με βάση τα οποία γίνονται όλες οι παραμετροποιημένες καμπύλες υψηλής ανάλυσης (Wittwer et al. 2003) Στην Eικόνα 19 παρουσιάζονται οι καμπύλες HRM από τρία διαφορετικά δείγματα στα οποία έχει γίνει ομαλοποίηση του φθορισμού στα σημεία έναρξης και λήξης των μετρήσεων με το λογισμικό της HRM. Με την κανονικοποίηση (normalization) επιτυγχάνεται η ομαλότερη έναρξη του φθορισμού αλλά και ο μηδενισμός του ώστε όλες οι μετρήσεις να έχουν ένα κοινό σημείο έναρξης και λήξης. Έτσι τυχόν διαφορές μεταξύ των υψηλής ανάλυσης καμπυλών τήξης γίνονται περισσότερο ορατές στο ενδιάμεσο των καμπυλών δηλαδή στις ενδιάμεσες μετρήσεις. Διαφορετικού τύπου κανονικοποιήσεις μπορούν να δώσουν και πιο εμφανείς διαφορές στους 34

35 συγκρινόμενους γενοτύπους σε περίπτωση που απαιτείται μεγαλύτερη διάκριση μεταξύ αυτών ( Εικόνα 19: Καμπύλες HRM από τρία διαφορετικά δείγματα οι οποίες έχουν υποστεί κανονικοποίηση με τη χρήση του λογισμικού της HRM. ( Η ανάλυση HRM έχει πολλά πλεονεκτήματα. Με τη βοήθειά της μπορούν να ταυτοποιηθούν και διαφοροποιηθούν δείγματα σε επίπεδο είδους με βάση τα συγκεκριμένα προϊόντα της PCR. Επίσης, δεν απαιτεί επισημασμένους εκκινητές, κλασμάτωση των προϊόντων ή περαιτέρω ανάλυση της επιμέρους αλληλουχίας. Αυτό καθιστά την τεχνική ιδανική για μελέτες ταυτοποίησης ειδών (Ganopoulos et al. 2011, Ganopoulos et al. 2012). Με την HRM μειώνονται οι πιθανότητες επιμόλυνσης των δειγμάτων αφού δεν απαιτείται μετά το πέρας της ανάλυσης, ούτε επεξεργασία ούτε στάδια διαχωρισμού του ενισχυμένου τμήματος σε πηκτές. Επιπλέον δεν απαιτούνται καρκινογόνες ουσίες όπως το ακρυλαμίδιο ή το βρωμιούχο αιθίδιο τα οποία χρησιμοποιούνται σε ηλεκτροφορήσεις πηκτών για την εύρεση πολύ μικρών διαφορών μεταξύ κομματιών (Wittwer 2009). Είναι γρήγορη και ανέξοδη μέθοδος και τα αποτελέσματα μπορούν να ληφθούν χωρίς πρόσθετη επεξεργασία μετά το τέλος της PCR σε λιγότερο από 2 ώρες. Αυτά τα χαρακτηριστικά καθιστούν την προαναφερθείσα μέθοδο ευρέως χρησιμοποιούμενη στην ταυτοποίηση παθογόνων (Cheng et al. 2013), τη γνησιότητα των τροφίμων (Şakalar et al. 2012) και τα βιολογικά διαγνωστικά (biological diagnostics) (Chang et al. 2008). Επίσης το λογισμικό που χρησιμοποιείται αυξάνει την αντικειμενικότητα του εξαγόμενου αποτελέσματος κατά τη διαδικασία της γενοτύπησης (Wittwer 2009, Ganopoulos et al. 2012). Αξίζει να σημειωθεί ότι παλαιότερα για την ανίχνευση πολυμορφισμών ή σημειακών μεταλλάξεων με υψηλή ανάλυση, για τη μέτρηση της 35

36 απορρόφησης στο υπεριώδες απαιτούνταν αρκετές ώρες προκειμένου να επιτευχθεί ανάλυση διαφορών 0,1-1 ο C/s (Zhou et al. 2005). Όσον αφορά το κόστος της ανάλυσης, αν και απαιτείται ένα αρχικό κεφάλαιο για την απόκτηση του θερμοκυκλοποιητή (Εικόνα 20) σε πραγματικό χρόνο, η περιγραφόμενη μέθοδος έχει πλεονεκτήματα σε σχέση με την αλληλούχιση, καθώς η χρωστική Syto -9 είναι το μόνο πρόσθετο κόστος σε μια κανονική PCR. Σε αντίθεση με την αλληλούχιση νουκλεοτιδίων, η ανάλυση HRM έχει αποδειχθεί ότι είναι ταχύτερη και ποιο αξιόπιστη. από άλλες σχετικές τεχνικές, όπως για παράδειγμα η PCR. Ένα επιπλέον όφελος της ανάλυσης HRM είναι ότι μπορεί να εκτελεστεί αυτόματα, καθιστώντας περιττή την περαιτέρω αποσαφήνιση των ευρημάτων. Επιπλέον, με κάθε άγνωστο δείγμα, μπορεί να Εικόνα 20: Συσκευή real time HRM (Corbett Rotor Gene ) χρησιμοποιηθεί μια βιβλιοθήκη πρωτότυπων προφίλ για να διευκολύνει τον προσδιορισμό της ταυτότητας του άγνωστου δείγματος (Robertson et al. 2010). 36

37 2.5.2.β Φυσικοχημικές μέθοδοι που αξιοποιούνται στην ανίχνευση νοθείας του αρτύματος σαφράνι Μια σειρά από αναλυτικές μεθοδολογίες έχουν αναπτυχθεί όχι μόνο για να καθορίσουν την ποιότητα αλλά και να προσδιορίσουν το είδος και το επίπεδο της νοθείας του αρτύματος (Hagh-Nazari et al. 2006). Από το 1980 τα ποιοτικά χαρακτηριστικά του και η γνησιότητά του καθορίζονται από το πρότυπο ISO 3632 (International Organization for Standardization) όπου προσδιορίζεται η εμπορική ποιότητά του ως άρτυμα. H ποιότητα του αρτύματος σχετίζεται με: 1. τη χρωστική του ικανότητα (περιεκτικότητα σε κροκίνες) 2. τη γεύση (περιεκτικότητα σε πικροκροκίνη) και 3. το άρωμα (περιεκτικότητα σε σαφρανάλη) Σύμφωνα με το εμπορικό πρότυπο ISO 3632:1 (2011) σχετικά με την οργανοληπτική εξέταση του δείγματος, αναφέρεται ότι θα πρέπει να έχει χαρακτηριστική ελαφρώς πικρή γεύση, η οποία να είναι απαλλαγμένη από άλλες ξένες. Η ποιότητα του σαφράνι καθορίζεται από τη χρωστική του ικανότητα. Καλύτερης ποιότητας σαφράνι θεωρείται εκείνο που επιπροσθέτως υπερέχει στο άρωμα και στη γεύση, περιέχει δηλαδή μεγαλύτερα επίπεδα πικροκροκίνης και σαφρανάλης. Αυτά επηρεάζονται αφ' ενός μεν από τις συνθήκες ξήρανσης και αφ' ετέρου δε από τις συνθήκες αποθήκευσης του προϊόντος (Δαλβινίδου 2015). Μέθοδοι κατά ISO :2011 Η φασματοφωτομετρία UV-Vis αξιοποιείται στο ISO :2011 για τον προσδιορισμό των κύριων οργανοληπτικών χαρακτηριστικών του αρτύματος, τα οποία συνδέονται με την περιεκτικότητά του σε κροκίνες, πικροκροκίνη και σαφρανάλη, αλλά όχι και για την ανίχνευση ξένων φυτικών υλικών. Αξίζει να σημειωθεί το γεγονός ότι η παραγώγιση του φάσματος απορρόφησης δίνει τη δυνατότητα καλύτερης αξιοποίησης της πληροφορίας που υπάρχει στα φάσματα (Παπαδοπούλου 2015). Για την ανίχνευση φυτικών προσμίξεων στο σαφράνι έχουν αναπτυχθεί και διάφορες χρωματογραφικές τεχνικές όπως χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC), υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC) (Villa et al. 2016) και αέρια χρωματογραφία (GC) (Anastasaki et al. 2009). Από αυτές η τεχνική που έχει βρει τις περισσότερες εφαρμογές στην ανάλυση του αρτύματος είναι η HPLC με ανίχνευση συστοιχίας διόδου λυχνίων (HPLC-DAD) (Winterhalter et al. 2000). 37

38 Η τεχνική TLC προτείνεται επίσης για τον προσδιορισμό νοθειών, αλλά χρειάζεται εξακρίβωση μέσω της HPLC που είναι πιο ευαίσθητη τεχνική. Επομένως, η μέθοδος χρησιμοποιείται για την ταυτοποίηση των χρωστικών του κρόκου, και όχι για την ανίχνευση πιθανής νοθείας του (Σταϊκίδου 2014). Όσον αφορά την τεχνική HPLC μέχρι σήμερα έχουν γίνει αρκετές δημοσιεύσεις που αφορούν την ταυτόχρονη ανίχνευση των κυριότερων συστατικών (πικροκροκίνη, cis/trans-κροκινών και σαφρανάλη) του αρτύματος σαφράνι (Σταϊκίδου 2014). Η ευαισθησία των κατά ISO προτεινόμενων αναλυτικών μεθόδων είναι συνήθως χαμηλή με αποτέλεσμα αυτές οι μέθοδοι να μη μπορούν να διακρίνουν επαρκώς το καθαρό σαφράνι από το νοθευμένο (Javanmardi et al. 2012) Για παράδειγμα, η μέθοδος που στηρίζεται σε εφαρμογή της UV-Vis φασματομετρίας για την κατάταξη του εμπορικού προϊόντος σε κατηγορίες ποιότητας (ISO 2011) δεν είναι αρκετά ευαίσθητη ή εξειδικευμένη ώστε να είναι δυνατή η ανίχνευση προσθήκης έως και 10-20% (w/w) ξένων φυτικών υλικών όπως είναι τα άνθη Calendula, Carthamus, ή σκόνη από ρίζες Curcuma (turmeric). Έτσι, η προσθήκη στο σαφράνι φυτικών υλικών που είναι πλούσια σε καροτενοειδή μπορεί εύκολα να περάσει απαρατήρητη (Sabatino et al. 2011, Marieschi et al. 2012). Το 2011 προτάθηκε από τους Sabatino et al. μια HPLC-DAD-MS μέθοδος για την ταυτοποίηση ουσιών που χρησιμοποιούνται συχνά στη νοθεία του αρτύματος (Carthamus tinctorius, Calendula officinalis και Curcuma longa). Η επιλογή χαρακτηριστικών ιόντων για κάθε μόριο δείκτη επέτρεψε την ανίχνευση της νοθείας σε επίπεδο προσθήκης 5% w/w για τα Carthamus tinctorius και Calendula officinalis και έως 2% για το Curcuma longa. Η μεγάλη χρωστική ικανότητα του Curcuma longa επέτρεψε την ανίχνευσή του σε επίπεδο προσθήκης 2% w/w ακόμα και μόνο με τη χρήση του HPLC- DAD. Επίσης, αξιολογήθηκε η αξιοπιστία της προτεινόμενης από το ISO , UV-Vis μεθόδου στην κατάταξη δειγμάτων κρόκου στα οποία προστέθηκαν αυξανόμενες ποσότητες των παραπάνω ουσιών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι με τη συγκεκριμένη μέθοδο ήταν δυνατή η ανίχνευση της προσθήκης σε ποσοστό μέχρι και 10-20% w/w. Για επίπεδο προσθήκης 20-50% w/w τα δείγματα κατατάχθηκαν σε λάθος κατηγορία, ενώ σε επίπεδο προσθήκης μεγαλύτερο του 50% w/w δεν ήταν δυνατή η κατάταξη των δειγμάτων ως σαφράνι (Sabatino et al. 2011). Ως εκ τούτου, οι χημικές μέθοδοι για την ανίχνευση χαμηλών επιπέδων νοθείας στα εμπορικά δείγματα σαφράνι δεν είναι επαρκείς (Jiang et al. 2014) και για το λόγο αυτό πολλοί ερευνητές τα τελευταία χρόνια προσέφυγαν στις μοριακές μεθόδους όπως έχουν αναφερθεί παραπάνω λεπτομερώς. 38

39 2.6 Η ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΤΟΥ ΚΟΥΡΚΟΥΜΑ Το άρτυμα κουρκουμάς Ο κουρκουμάς ανήκει σε μια ομάδα από αρωματικά αρτύματα και έχει ιδιαίτερη σημασία για τους ανθρώπους γιατί όταν προστίθεται σε διάφορα παρασκευάσματα διατροφής δρα ως συντηρητικό και προσδίδει μια χαρακτηριστική γεύση. Αρχικά χρησιμοποιήθηκε ως πρόσθετο στο κάρυ για να βελτιώσει το προϊόν κατά την αποθήκευσή του και έπειτα ως βελτιωτικό γεύσης κατά τη συντήρηση των τροφίμων (Govindarajan et al. 1980). Είναι ευρέως γνωστός για τις εφαρμογές του ως καλλυντικό, καρύκευμα και ενισχυτικό γεύσης. Στην Αγιουρβέδα, ο κουρκουμάς έχει χρησιμοποιηθεί εσωτερικά ως τονωτικό και αιμοκαθαρτικό και εξωτερικά στην πρόληψη και τη θεραπεία διαφόρων ασθενειών του δέρματος (Bhanumathy et al. 2013). Το ενδιαφέρον για τον κουρκουμά ξεκίνησε το 1970, όταν οι ερευνητές βρήκαν στοιχεία που δείχνουν ότι το άρτυμα μπορεί να έχει αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες. Οι ρίζες του κουρκουμά είναι γνωστό ότι έχουν αντισηπτικές ιδιότητες και είναι αρωματικές. Κλινικές δοκιμές έχουν αποδείξει τις βακτηριοκτόνες ιδιότητες του κουρκουμά και τώρα η χρήση του έχει επεκταθεί και πέρα από την κοσμετολογία (Jayaprakasha et al. 2005). Χρησιμοποιείται επίσης και για τη διατήρηση των τροφίμων καθώς δρα ως αντιμικροβιακό (Jayaprakasha et al. 2005). Η εμπορική αξία των προϊόντων από κουρκουμά βασίζεται στο περιεχόμενό τους σε κουρκουμινοειδή (Antony 2003). Πρόκειται για τρεις ενώσεις (κουρκουμίνη, η απομεθοξυκουρκουμίνη και η διςαπομεθοξυκουρκουμίνη) που απαντούν σε μη πολικά εκχυλίσματα κουρκουμά σε επίπεδα 70-77%, 18-20% και 5-10%, αντίστοιχα, και των οποίων οι χημικές δομές φαίνονται στην Εικόνα 21. Τα Eικόνα 21: Χημικές δομές των κυριότερων κουρκουμινοειδών κουρκουμινοειδή είναι κίτρινες χρωστικές ουσίες και είναι υπεύθυνες για το κίτρινο χρώμα των ριζών του κουρκουμά. Η κουρκουμίνη, η κύρια φυσική κίτρινη χρωστική και το κύριο συστατικό των κουρκουμινοειδών, χρησιμοποιείται ευρέως για την προσθήκη χρώματος σε τρόφιμα, όπως πίκλες και σνακς (Jayaprakasha et al. 2002). Τέλος, μελέτες έχουν δείξει ότι τα κουρκουμινοειδή και κυρίως η κουρκουμίνη εκδηλώνουν διάφορες φαρμακολογικές δράσεις π.χ. αντιοξειδωτική, αντιβακτηριακή και αντικαρκινική (Srimal 1997, Zhang et al. 2009). 39

40 2.6.2 Το φυτό Curcuma longa L. Το φυτό Curcuma longa L. ανήκει στην οικογένεια των ζιγγιβεροειδών (Zingiberaceae) μαζί με το τζίντζερ, το κάρδαμο και το galangal. Ανήκει στο γένος Curcuma, που αποτελείται από εκατοντάδες είδη φυτών που διαθέτουν ριζώματα και υπόγεια ρίζα όπως μίσχους (Govindarajan et al. 1980). Τα ριζώματά του που είναι τα μόνα τμήματα του φυτού με εμπορική αξία είναι επιμήκη, ωοειδή, απιοειδή και συχνά ελάχιστα διακλαδισμένα (Eigner et al. 1999). Ο κουρκουμάς καλλιεργείται σε ζεστές περιοχές με υψηλή βροχόπτωση ανά τον κόσμο όπως η Κίνα, η Ινδία, η Ινδονησία, η Τζαμάικα και το Περού (Govindarajan et al. 1980). Η Ινδία είναι ο μεγαλύτερος παραγωγός και καταναλωτής των ριζών κουρκουμά (Eigner et al. 1999). Οι διαφορετικές ποικιλίες του είδους C. longa L. που καλλιεργούνται σε διάφορες περιοχές των ηπείρων και το περιεχόμενο των ριζών σε κουρκουμίνη είναι ένας σημαντικός παράγοντας για την αξιολόγηση της ποιότητάς του αρτύματος καθώς επίσης και για τον καθορισμό της τιμής (Li et al. 2011). Το περιεχόμενο του προϊόντος σε κουρκουμινοειδή ποικίλει ανάλογα με τις περιβαλλοντικές συνθήκες καλλιέργειας του φυτού, κάτι που οδηγεί και σε διακύμανση των φαρμακολογικών δράσεων εμπορικών σκευασμάτων που περιέχουν κουρκουμά (Anubala et al. 2014). Τα κουρκουμινοειδή που παραλαμβάνονται από τις ρίζες του φυτού C. longa κατά την εκχύλιση με οργανικούς διαλύτες εμφανίζουν ισχυρή απορρόφηση μεταξύ nm σε οργανικούς διαλύτες. Οι επίσημες μέθοδοι για τον προσδιορισμό κουρκουμίνης ή προϊόντων από κουρκουμά, ως πρόσθετο χρώματος των τροφίμων, βασίζονται στην άμεση μέτρηση απορρόφησης στο ορατό. Τα κουρκουμινοειδή έχουν μικρή διαλυτότητα στο νερό σε όξινο και ουδέτερο ph ενώ διαλύονται εύκολα σε αλκαλικά διαλύματα αλλά και οργανικούς διαλύτες, όπως είναι το διμεθυλ-σουλφοξείδιο (DMSO), η ακετόνη και η αιθανόλη. Επίσης, αποσυντίθενται πολύ γρήγορα όταν εκτεθούν σε έντονο φως, υψηλή θερμοκρασία ή οξειδωτικές συνθήκες (Schieffer 2002). Εικόνα 22: Το φυτό Curcuma Longa L. Εικόνα 23: Ρίζες 40 Curcuma Longa L. Εικόνα 24: Το άρτυμα κουρκουμάς

41 Δεδομένου ότι τα κουρκουμινοειδή έχουν εγγενή φθορισμό, μια πιο ευαίσθητη και επιλεκτική μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού για τα παράγωγα της κουρκουμίνης είναι η μέθοδος ανίχνευσης με φθορισμό που αναφέρεται από τους Tønnesen et al και υποστηρίζουν ότι είναι 10 φορές πιο ευαίσθητη από εκείνη της μεθόδου ανίχνευσης με UV. Η ιδιότητα αυτή των συστατικών του κουρκουμά θα μπορούσε να αξιοποιηθεί προκειμένου να ανιχνευθεί τυχόν παρουσία τους στο σαφράνι. 41

42 3. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 3.1 Δείγματα Φυτικό Μέρος Αριθμός Έτος Είδος Περιοχή υλικό φυτού δειγμάτων σοδειάς 60 Κοζάνη 2013 C. sativus L. Φύλλα 20 Κοζάνη-Πλάκα Κοζάνη-Πλάκα 1 Κοζάνη- Σαμιά Κοζάνη- C. sativus L. Τέπαλα Μαγούλα Κοζάνη- 1 Καισαριά Κρόκος 1 Κοζάνη-Πλάκα 1 Κοζάνη- Σαμιά Κοζάνη- 1 Μαγούλα C. sativus L. Στίγματα 2014 Κοζάνη- 1 Καισαριά Κοζάνη-Δωρεά 1 ΔΕΔΕ Crocus cansellatus 1 subsp. Mazziricus Crocus pallasii 1 subsp. Pallasii Αθήνα Crocus hadriaticus 1 (Εθνικό και Κρόκος Crocus Φύλλα Καποδιστριακό cartwrightiaticus Πανεπιστήμιο Crocus thomasii 1 Αθηνών) Crocus 1 oreocreticus Crocus asumaniae 1 Κουρκουμάς Curcuma longa L. Ρίζες 1 Συλλογή ΕΧΤΤ 2015 Αριστοτέλειο Gardenia Γαρδένια Φύλλα 1 Πανεπιστήμιο 2015 jasminoides Θεσσαλονίκης Κάρδαμο Καλέντουλα Carthamus tinctorius Calendula officinalis Φύλλα 1 Φύλλα 1 Καλαμπόκι Zea mays Φύλλα 1 *USDA: ( *USDA (Υπουργείο Γεωργίας Ηνωμένων Πολιτειών) *USDA (Υπουργείο Γεωργίας Ηνωμένων Πολιτειών) *USDA (Υπουργείο Γεωργίας Ηνωμένων Πολιτειών)

43 3.2 Αντιδραστήρια-Διαλύτες Α) Μοριακές μέθοδοι Για τη λειοτρίβηση των φυτικών ιστών (κρόκος, κουρκουμάς, κάρδαμο) χρησιμοποιήθηκε υγρό άζωτο (θερμοκρασίας -80 o C) και αποστειρωμένα γουδιά από πορσελάνη. Για την απομόνωση του DNA των δειγμάτων κρόκου χρησιμοποιήθηκε ένα τροποποιημένο πρωτόκολλο των Doyle Σύμφωνα με αυτό χρησιμοποιήθηκε διάλυμα λύσης CTAB (hexadecyl-trimethyl-ammoniumbromide) του οποίου η σύσταση είναι: 2% w/v CTAB, 100 mm Tris (2-Amino- 2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol), 0,50 mm EDTA (Ethylene-diamine-tetraacetic acid) με ph=8, 500 mm NaCl (Sodium chloride) και επιπλέον προσθήκη 1% w/v PVP (polyvinyl-pyrrolidone). Επίσης, για την εφαρμογή του πρωτοκόλλου απαραίτητα ήταν και τα εξής αντιδραστήρια: 2- μερκαπτοαιθανόλη (2-Hydroxy-1-ethanethiol) (Panreac Applichem, Darmstadt, Germany), ισοπροπανόλη (2-propanol) (Merck, Darmstadt, Germany), αιθανόλη 70% (Scharlau (Barcelona, Spain), χλωροφόρμιο (trichloromethane) (Panreac, Darmstadt, Germany), οξικό νάτριο (CH 3 COONa) (Panreac Applichem, Darmstadt, Germany), Tris (Duchefa Biochemie, Haarlem, The Netherlands), EDTA (Scharlau, Barcelona, Spain) και Rnase (Ribonuclease) (Panreac Applichem, Darmstadt, Germany). Ενώ για την απομόνωση του DNA από τις ρίζες κουρκουμά, χρησιμοποιήθηκε ειδικό κιτ Nucleospin Food της εταιρίας (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG) (Düren, Germany) σχεδιασμένο για απομόνωση του DNA από τρόφιμα εξαιτίας της ανικανότητας απομόνωσης του γενετικού του υλικού με την προαναφερθείσα μέθοδο. Για τη διαδικασία της ηλεκτροφόρησης τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αγαρόζη (Duchefa, Haarlem, The Netherlands) σε ρυθμιστικό διάλυμα ΤΑΕ (Tris-Acetic acid-edta) του οποίου η σύσταση ήταν: 40 mm Tris, 20 mm Οξικό οξύ, 1 mm EDTA, ph 8), βρωμιούχο αιθίδιο (3, 8- Diamino-5-ethyl-6-phenylphenanthridiniumbromide) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany) και χρωστική Orange G (Panreac Applichem, Darmstadt, Germany). Επίσης για τη βαθμονόμηση των ζωνών στις πηκτές αγαρόζης χρησιμοποιήθηκε η μοριακή σκάλα Quick-Load 2-log DNA Ladder της εταιρίας New England Biolabs Inc (Ipswich, MA). Τόσο για τη βαθμονόμηση του φασματοφωτόμετρου όσο και για τις αραιώσεις των δειγμάτων DNA ήταν απαραίτητο μόνο αποστειρωμένο νερού. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν για την προετοιμασία της PCR αντίδρασης με μοριακούς δείκτες ISSR ήταν τα εξής: ρυθμιστικό διάλυμα 10x με σύσταση (20 mm Tris-HCl, 50 mm KCl, ph 8,4), MgCl 2 (magnesium 43

44 chloride), dntp s (δεοξυριβονουκλεοτίδια), ένζυμο πολυμεράση (Taq DNA Polymerase) και μοριακοί δείκτες ISSR (Invitrogen, Carlsbad, CA). Οι ονομασίες και οι θερμοκρασίες υβριδισμού των εκκινητών εμφανίζονται στον Πίνακα 3. Χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 7 εκκινητές: οι UBC 807, UBC 811, UBC 815, UBC 827, UBC 834, UBC 841 και UBC 860. Πίνακας 3: Μοριακοί δείκτες ISSR που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση τμημάτων μεταξύ μικροδορυφορικών περιοχών Όνομα Θερμοκρασία Αλληλουχία (5-3 ) εκκινητή υβριδισμού ( ο C) UBC 807 AGA GAG AGA GAG AGA GT 50 UBC 811 GAG AGA GAG AGA GAG AC 48 UBC 815 CAC ACA CAC ACA CAC AG 54 UBC 827 ACA CAC ACA CAC ACA CG 52 UBC 834 AGA GAG AGA GAG AGA GYT 46 UBC 841 GAG AGA GAG AGA GAG AYC 56 UBC 860 TGT GTG TGT GTG TGT GRA 54 Επίσης, τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν για την προετοιμασία της PCR για ενίσχυση των περιοχών που κωδικοποιούν τα MADs Box γονίδια ήταν αυτά που αναφέρθηκαν παραπάνω με διαφορετικό ζευγάρι εκκινητών. Οι ονομασίες και οι θερμοκρασίες υβριδισμού των εκκινητών εμφανίζονται στον Πίνακα 4. Πίνακας 4: Δείκτες που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση των περιοχών που κωδικοποιούν τα MADs Box γονίδια Όνομα Θερμοκρασία Αλληλουχία (5-3 ) εκκινητή υβριδισμού ( ο C) gsep3a-f CTTGAAAGACAACTGATTCATCA 56 SEP3-2R ATCGAAGGGCTGATAATTAACC 56 Για την ανάλυση HRM χρησιμοποιήθηκαν τα ίδια αντιδραστήρια με την PCR της εταιρίας KAPABiosystems (Wilmington, USA), η χρωστική Syto 9 και εκκινητές (Invitrogen, Carlsbad, CA) οι οποίοι σχεδιάστηκαν σε ομόλογες περιοχές μεταξύ των ειδών στις οποίες υπήρχαν κάποιες μικρές διαφορές στην αλληλουχία του DNA. Οι ονομασίες και οι θερμοκρασίες υβριδισμού των εκκινητών παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα 5. 44

45 3.2.1 Σχεδιασμός εξειδικευμένων εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση HRM Πίνακας 5: Εκκινητές που σχεδιάστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση DNA Barcoding περιοχών με την ανάλυση HRM Όνομα εκκινητή Αλληλουχία (5-3 ) Θερμοκρασία υβριδισμού ( ο C) 1 Common F1 GGTTCAAGTCCCTCTATCCCC 58 2 Calendula R GCTCAGATCCCTTTAGTAGTGAG 58 3 Carthamus R CCCATTTGTATAAAGAGTAGTGAATGA 58 4 Crocus R CGACTATTTCCCGCGCATCATCCTAATAG 58 5 Curcumas R AATTAAAGGGACTAAAAAGTAGTAAAAAAT 58 6 Gardenia F GCCATTTGGAATTCTTTTTTTATACTTC 58 7 Gardenia R TATATATATCTCCCTGTCAGCTTTCC 58 8 Common F2 GATAGGTGCAGAGACTCAATGG 57 9 Crocus R2 TCTCTCTTTATTCTCTTCCGATTAATC Maize R CTCTTTATCCTCGTCCGATTAATC 57 Παρακάτω παρουσιάζονται οι αλληλουχίες των εκκινητών που εμφανίζονται στον πίνακα 5 καθώς και ο τρόπος με τον οποίο σχεδιάστηκαν. Υπάρχουν 3 τρόποι για να σχεδιαστούν εκκινητές. 1) ένας εκκινητής ανοδικός και ένας καθοδικός σε ομόλογη περιοχή μεταξύ όλων των προς εξέταση ειδών 2) ένας εκκινητής ανοδικός σε ομόλογη περιοχή μεταξύ όλων των ειδών και διαφορετικοί καθοδικός για το κάθε είδος ξεχωριστά και 3) διαφορετικοί ανοδικοί και διαφορετικοί καθοδικοί για το κάθε είδος. Ο πιο εύκολος και πιο εξυπηρετικός τρόπος είναι ο πρώτος, όμως δεν εξυπηρετούσε στην συγκεκριμένη περίπτωση λόγω του σκοπού για τον οποίο σχεδιάστηκαν οι συγκεκριμένοι εκκινητές που ήταν ο εντοπισμός πιθανής ύπαρξης (εκούσια ή ακούσια) ξένου φυτικού υλικού στο άρτυμα σαφράνι και η αναγνώριση του συγκεκριμένου είδους από το οποίο προήρθε η νοθεία. Παράλληλα τα προς ανάλυση είδη είναι τόσο διαφορετικά μεταξύ τους σε επίπεδο DNA με αποτέλεσμα να είναι πολύ δύσκολο έως ακατόρθωτο να βρεθούν ομόλογες περιοχές στο DNA όλων των ειδών που να έχουν μικρές διαφορές ώστε να σχεδιαστούν οι εκκινητές σε εκείνη την περιοχή. Για το λόγο αυτό, λοιπόν, οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν σχεδιάστηκαν σύμφωνα με το δεύτερο τρόπο. 45

46 Εικόνα 25: Εκκινητής με βάση την αλληλουχία DNA του είδους Gardenia jasminoides με φορά 5-3. Εικόνα 26: Εκκινητής (Common F1) με φορά 5-3 σχεδιασμένος σε ομόλογη περιοχή μεταξύ των ειδών Calendula officinalis, Carthamus tinctorius, Crocus sativus και Curcuma longa και εκκινητής (Gardenia R) με φορά 3-5 μόνο για το είδος Gardenia jasminoides Εικόνα 27: Εκκινητές με φορά 3-5 σχεδιασμένοι σύμφωνα με την αλληλουχία του DNA του κάθε είδους αντίστοιχα (Calendula officinalis, Carthamus tinctorius Curcuma longa) Εικόνα 28: Εκκινητής με φορά 3-5 σχεδιασμένος σύμφωνα με την αλληλουχία του DNA του είδους Crocus sativus Όπως φαίνεται παραπάνω στις εικόνες σχεδιάστηκε ένας εκκινητής ανοδικός για τα είδη Calendula officinalis, Carthamus tinctorius, Curcuma 46

47 longa και Crocus sativus και ξεχωριστοί καθοδικοί για το κάθε είδος. Ωστόσο, όπως έχει ήδη αναφερθεί λόγω της μεγάλης ετερογένειας μεταξύ των ειδών ήταν αδύνατον να βρεθεί ομόλογη περιοχή του είδους Gardenia jasminoides με τα προαναφερόμενα είδη και για το λόγο αυτό σχεδιάστηκε διαφορετικός εκκινητής ανοδικός για το συγκεκριμένο είδος όπως και καθοδικός. Παρακάτω παρουσιάζεται η δεύτερη κατηγορία εκκινητών που σχεδιάστηκαν για την αναγνώριση του είδους Zea mays όταν αυτό έχει χρησιμοποιηθεί ως νοθεία στο άρτυμα σαφράνι. Ο τρόπος με τον οποίο σχεδιάστηκαν οι παρακάτω εκκινητές είναι ίδιος όπως στην περίπτωση της γαρδένιας που αναφέρθηκε προηγουμένως για τον ίδιο λόγω της δυσκολίας εύρεσης ομόλογης περιοχής του συγκεκριμένου είδους με τα υπόλοιπα. Εικόνα 29: Εκκινητής (Common F2) με φορά 5-3 σχεδιασμένος σε ομόλογη περιοχή μεταξύ των ειδών Crocus sativus και Zea mays. Στην εικόνα 29 παρουσιάζεται η ομόλογη περιοχή των δύο ειδών στην οποία σχεδιάστηκε ο ανοδικός εκκινητής των συγκεκριμένων ειδών. Εικόνα 30: Εκκινητές (Crocus R2 και Maize R) με φορά 3-5 σχεδιασμένοι σε ομόλογη περιοχή μεταξύ των ειδών Crocus sativus και Zea mays με διαφορά σε 2 βάσεις του DNA. Στην εικόνα 30 παρατηρείται η εξής διαφορά στον τρόπο που σχεδιάστηκαν οι καθοδικοί εκκινητές σε σχέση με προηγουμένως: Σχεδιάστηκαν σε περιοχή που θα μπορούσε να ονομαστεί και σχεδόν ομόλογη μεταξύ των δύο ειδών γιατί η μόνη διαφορά που παρατηρείται είναι σε δύο βάσεις του DNA. Ωστόσο, όπως παρουσιάζεται στο κεφάλαιο των αποτελεσμάτων η ανάλυση HRM είναι ικανή με βάση αυτές τις δύο μικρές διαφορές να διαχωρίσει και να αναγνωρίσει τα δύο είδη. Συμπερασματικά, χρησιμοποιώντας τα παραπάνω ζεύγη εκκινητών κατά περίπτωση καθίσταται πολύ εύκολη όχι μόνο η ανίχνευση πιθανής νοθείας 47

48 αλλά και η αναγνώριση του συγκεκριμένου είδους που χρησιμοποιήθηκε για τη νοθεία στην περίπτωση ενός από τα προαναφερόμενα είδη. Β) Φυσικοχημικές μέθοδοι Για την εκχύλιση των αποξηραμένων στιγμάτων χρησιμοποιήθηκαν οι εξής διαλύτες: ακετόνη (HPLC grade) και εξάνιο 95% (HPLC grade) της εταιρίας Chem-Lab (Zedelgen, Belgium) καθώς και μεθανόλη (LC-MaScan) της εταιρίας LAB-SCAN (Gliwice, Poland) και απιονισμένο νερό. Για τη υγροχρωματογραφική ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν διαλύτες της μέγιστης απαιτούμενης καθαρότητας: ακετονιτρίλιο (HPLC gradient grade) της εταιρίας Chem-Lab (Zedelgen, Belgium), οξικό οξύ (glacial, PA-ACS-ISO) της εταιρίας Panreac (Barcelona, Spain) και απιονισμένο νερό υψηλής καθαρότητας που παραγόταν στο εργαστήριο στη συσκευή τύπου SG Ultra Basic UV system (SG Wasseraufbereitung Und Regenerierstation GmbH, Barsbuttel, Germany). 3.3 Όργανα-Συσκευές Α) Μοριακές μέθοδοι Ο προσδιορισμός της ποσότητας του DNA αλλά και η καθαρότητά του πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση φασματοφωτόμετρου διπλής δέσμης της εταιρίας Ultrospec 2000 (Pharmacia Biotech, Cambridge, UK). Για τη λήψη των μετρήσεων χρησιμοποιήθηκε κυψελίδα χαλαζία πάχους 1cm (Starna Brand, Essex, UK). Για την εμφάνιση των εικόνων της ηλεκτροφόρησης τόσο μετά την απομόνωση του DNA όσο και μετά την ανάλυση της PCR χρησιμοποιήθηκε συσκευή UV Minibis Pro της εταιρίας DNR Bio-Imaging Systems (Jerusalem, Israel). Ο θερμοκυκλοποιητής στον οποίο πραγματοποιήθηκε η PCR ήταν Veriti 96 θέσεων της εταιρίας (Applied Biosystems, CA, USA) ενώ η HRM πραγματοποιήθηκε σε θερμοκυκλοποιητή Rotor Gene-6000 της εταιρίας Corbett Life Science (Mortlake, Australia). Για την καταγραφή, αποθήκευση και επεξεργασία των καμπυλών πολλαπλασιασμού και τήξης χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό της ίδιας εταιρίας. Επίσης, χρησιμοποιήθηκε ζυγός ακριβείας με τέσσερα δεκαδικά ψηφία της εταιρίας KERN (Balingen,Germany) κυκλομείκτης της εταιρίας Snijders (Tilburg, The Netherlands), φυγόκεντρος της εταιρίας eppendorf (Hamburg, Germany), υδατόλουτρο medingen WB 12 της εταιρίας medingen (Bad 48

49 Bevensen, Germany ) και αυτόματες πιπέτες των 1000, 200, 20 και 2 μl τύπου Gilson. Β) Φυσικοχημικές μέθοδοι Η μέτρηση της απορρόφησης στο ορατό έγινε σε φασματοφωτόμετρο της εταιρίας Shimadzu (Kyoto, Japan) μοντέλο UV-1601, το οποίο συνοδευόταν από λογισμικό πρόγραμμα UV-1601PC (Personal Spectroscopy Software, v.3.9, Shimadzu). Για τη λήψη των μετρήσεων χρησιμοποιήθηκαν κυψελίδες χαλαζία πάχους 1cm (Starna Brand, Essex, UK). Το υγροχρωματογραφικό σύστημα αποτελούνταν από αντλία P4000 Finnigan MAT (Thermoseparation Products Inc., San Jose, USA), αυτόματο δειγματολήπτη (Midas 830, Spark, Emmen, Holland) και ανιχνευτή συστοιχίας διόδων λυχνιών (UV 6000 LP, Thermoseparation Products Inc., San Jose, CA, USA) σε σειρά με SSI 502 φθορισμομετρικό ανιχνευτή (Scientific Systems Inc., State College, PA). Για την καταγραφή, αποθήκευση και επεξεργασία των χρωματογραφημάτων χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό Chrom Quest (version 3.0, copyright , Thermo Quest Inc., San Jose, CA, USA). Επίσης, χρησιμοποιήθηκε ζυγός ακριβείας με τέσσερα δεκαδικά ψηφία (ΑΒ 204-SGbBH, Mettler-Toledo, Greifensee, Germany), κυκλομείκτης (Snijders Tilburg, The Netherlands), μαγνητικός αναδευτήρας (MR 3003 control, Heidolph, Germany), (με ρύθμιση στις 1000 στροφές/min), φυγόκεντρος (Thermoscientific, Germany), SL 16R, υδατόλουτρο με υπερήχους (Bandelin Sonorex, Berlin, Germany), συσκευή εξάτμισης υπό κενό Vacuum Pump V- 700 (BUCHI, Flawil, Switzerland), αυτόματες πιπέτες των 200 και 20 μl τύπου Labmmate (Pzhtls A., Warsaw, Poland), διάφορα γυάλινα σκεύη όπως ποτήρια ζέσεως, ογκομετρικές φιάλες, σιφώνια πλήρωσης και μέτρησης, απιοειδείς φιάλες και ιγδίο από αχάτη. 3.4 Αναλυτικές μέθοδοι Μοριακές μέθοδοι α. Απομόνωση γενετικού υλικού Προκειμένου να γίνει η απομόνωση του γενετικού υλικού (DNA) από όλα τα δείγματα κρόκου (C. saticus L. και άγρια είδη) αρχικά πραγματοποιήθηκε λειοτρίβηση του φυτικού υλικού. Το κάθε δείγμα τοποθετήθηκε σε γουδί από πορσελάνη πληρώθηκε με υγρό άζωτο (N 2 ) και κονιορτοποιήθηκε μέχρις ότου να υπάρχουν ελάχιστα έως καθόλου ορατά κομμάτια ιστού. Η σκόνη τοποθετήθηκε σε σωληνάρια και αποθηκεύτηκε σε υπερκατάψυξη για να αποτραπεί η δράση νουκλεασών. Τα κονιορτοποιημένα δείγματα παρέμειναν 49

50 στην κατάψυξη μέχρι να ξεκινήσει η απομόνωση του DNA. Για την απομόνωση του DNA χρησιμοποιήθηκε το πρωτόκολλο των Doyle 1987 με κάποιες τροποποιήσεις. Ο φυτικός ιστός επωάστηκε με ποσότητα διαλύματος λύσης (διάλυμα CTAB) και ελάχιστη ποσότητα ριβονουκλεάσης (για διάσπαση του RNA). Ακολούθησε καθαρισμός του μίγματος με χλωροφόρμιο και κατακρήμνιση του DNA με ισοπροπανόλη και οξικό νάτριο. Μετά την απομάκρυνση της ισοπροπανόλης προστέθηκε αιθανόλη για καθαρισμό του DNA και αφού απομακρύνθηκε και αυτή το DNA διατηρήθηκε σε διάλυμα Tris-EDTA και τελικό όγκο 100 μl. Η ίδια ακριβώς διαδικασία ακολουθήθηκε και για την απομόνωση του γενετικού υλικού από τα είδη Carthamus tinctorius, Gardenia jasminoides, Zea mays και Calendula officinalis. Η απομόνωση του γενετικού υλικού από σκόνη από τις ρίζες του φυτού C. longa L. πραγματοποιήθηκε με τη χρήση κιτ β. Ποσοτικός προσδιορισμός του DNA με ηλεκτροφόρηση Αφού ολοκληρώθηκε η διαδικασία της απομόνωσης του DNA πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση του DNA σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v με σκοπό να επιβεβαιωθεί η απομόνωση του DNA αλλά και να εκτιμηθεί η ποιότητά του. Στην πηκτή προστέθηκαν 5 μl/100 ml βρωμιούχο αιθίδιο το οποίο προσδένεται στο DNA κάνοντας το ορατό κάτω από υπεριώδη φωτισμό με απορρόφηση στα μέγιστα μήκη κύματος 210 και 285 nm. Πριν τα δείγματα φορτωθούν στην πηκτή αναμειγνύονταν με τη χρωστική Orange G. Η εμφάνιση των εικόνων της ηλεκτροφόρησης πραγματοποιήθηκε σε συσκευή UV και η επεξεργασία αυτών έγινε με τη χρήση του προγράμματος DNR Gelcapture γ. Φασματοφωτομετρικός προσδιορισμός των δειγμάτων DNA Πριν την ενίσχυση των δειγμάτων με PCR προηγείται ποσοτικός προσδιορισμός του DNA σε κάθε δείγμα με μέτρηση αυτού σε φασματοφωτόμετρο διπλής δέσμης. Ο λόγος της απορρόφησης Α 260 /Α 280 θα πρέπει να είναι 1,8 δείχνοντας έτσι ότι το δείγμα είναι καθαρό. Εάν ο λόγος αυτός είναι μικρότερος από την προαναφερθείσα τιμή τότε υπάρχουν προσμίξεις με πρωτεΐνες ενώ αν είναι μεγαλύτερος τότε υπάρχει πρόσμιξη με RNA. Η απορρόφηση στα 260 nm χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του DNA στο δείγμα (OD 1 αντιστοιχεί σε συγκέντρωση 50 μg/ml). Επειδή με τη μέθοδο της απομόνωσης του CTAB το διάλυμα του DNA που λαμβάνεται είναι αρκετά υψηλής συγκέντρωσης ακολούθησε αραίωση του DNA σε τελικό όγκο 20 ng/μl (διάλυμα εργασίας). Σκοπός της αραίωσης ήταν όλα τα δείγματα να έχουν την ίδια συγκέντρωση για την ανάλυση μέσω της PCR αντίδρασης ώστε να μπορούν να είναι συγκρίσιμα τα τελικά αποτελέσματα. 50

51 3.4.1.δ. Ενίσχυση με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Μοριακοί δείκτες ISSR Η PCR πραγματοποιήθηκε σε τελικό όγκο 20 μl. Η τελική συγκέντρωση σε κάθε αντιδραστήριο ήταν: ρυθμιστικό διάλυμα 1x, 1,5 mm MgCl 2, 0,2 mm dntp s, 0,2 μm εκκινητή, 5 U/μl Taq DNA πολυμεράση και 20 ng/μl του εκάστοτε δείγματος και για την συμπλήρωση του όγκου 15 μl αποστειρωμένο νερό. Οι συνθήκες της PCR για τους μοριακούς δείκτες ISSR ήταν: αρχική αποδιάταξη στους 94 ο C για 5 min, 35 κύκλοι αντιδράσεων πολλαπλασιασμού με 94 ο C για 30 sec, 46 ο C-56 ο C αναλόγως τον εκκινητή (βλ. πίνακα 3) για 30 sec και στους 72 ο C για 90 sec και τελική επέκταση στην ίδια θερμοκρασία για 5 min. Προκειμένου να ελεγχθεί εάν η ενίσχυση των ζητούμενων κομματιών ήταν επιτυχής πραγματοποιούνταν ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/v σε ρυθμιστικό διάλυμα 1x TAE. Για τον υπολογισμό και τη γραφική απεικόνιση των γενετικών αποστάσεων έγινε καταγραφή των αποτελεσμάτων της ηλεκτροφόρησης από κάθε εκκινητή. Μόνο οι ζώνες που είχαν έντονο σήμα λήφθηκαν υπόψη στη καταγραφή. Για την καταγραφή, σε αρχείο Excel δημιουργήθηκε πίνακας όπου καταγράφηκαν οι ζώνες της πηκτής. Ο πίνακας αυτός αποτελεί τον πίνακα αλληλομόρφων. Η παρουσία των ζωνών σημειώθηκε με 1 ενώ η απουσία με 0. Στην περίπτωση που σε κάποιο από τα δείγματα η PCR δεν λειτούργησε και δεν υπήρχε πολλαπλασιασμός ζωνών, σημειωνόταν με -1. Το αρχείο αυτό χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια για τον υπολογισμό των δυαδικών αποστάσεων μεταξύ των ατόμων του πληθυσμού. Από τον πίνακα των δυαδικών αποστάσεων (παράρτημα ΙΙΙ) πραγματοποιήθηκε ανάλυση κύριων συντεταγμένων PCoA (Principal Coordinates Analysis). Τόσο ο πίνακας δυαδικών αποστάσεων όσο και το διάγραμμα PCoA δημιουργήθηκαν με τη βοήθεια του λογισμικού Gen Al Ex 6.5 (Genetic Analysis in Excel, Peakall & Smouse 2012) το οποίο λειτουργεί ως πρόσθετο σε αρχείο Excel. Η PCoA δημιουργήθηκε για την γραφική απεικόνιση των γενετικών αποστάσεων μεταξύ ατόμων με ίδιο γενότυπο αλλά διαφορετικό περιβάλλον ανάπτυξης. MADs-box γονίδια Χρησιμοποιώντας τα ίδια αντιδραστήρια όπως αναφέρονται και για τους μοριακούς δείκτες, με τη μόνη διαφορά το ζευγάρι των εκκινητών που ήταν οι gsep3a-f και SEP3-2R (βλ. πίνακα 4), πραγματοποιήθηκε και η PCR με προϊόν στόχο αυτή τη φορά τα MADs-box γονίδια. Προκειμένου να ελεγχθεί εάν η ενίσχυση των ζητούμενων κομματιών DNA ήταν επιτυχής πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/v σε ρυθμιστικό διάλυμα 1x TAE. 51

52 3.4.1.ε. Υψηλής ανάλυσης καμπύλες τήξης (HRM) Η ανάλυση HRM πραγματοποιήθηκε σε τελικό όγκο 20 μl. Η τελική συγκέντρωση σε κάθε αντιδραστήριο ήταν: 1x PCR buffer, 1,5 mm Syto, 0,2 mm dntp s, 0,2 μm από κάθε εκκινητή, 5 U/μl Taq DNA πολυμεράση και 20 ng/μl του εκάστοτε δείγματος, και για την συμπλήρωση του όγκου 15 μl αποστειρωμένο νερό. Οι συνθήκες της HRM ήταν: αρχική αποδιάταξη στους 95 ο C για 3 min, 35 κύκλοι αντιδράσεων πολλαπλασιασμού με 95 ο C για 30 sec, 46 ο C-56 ο C ανάλογα με τη θερμοκρασία υβριδισμού του εκάστοτε εκκινητή (βλ. πίνακα 5) για 20 sec και στους 72 ο C για 30 sec. Τα τεχνητώς νοθευμένα δείγματα κρόκου που περιείχαν κουρκουμά σε ποσοστά προσθήκης 50, 25, 15,10, 2% w/w παρασκευάστηκαν σύμφωνα με το μέθοδο των τριών δεδομένου την αρχική συγκέντρωση των διαλυμάτων DNA που ήταν 20 ng/μl και τον τελικό όγκο των μιγμάτων που ήταν 5 μl. Στα μίγματα 1 και 0,5% w/w έγινε μια μικρή τροποποίηση στον τελικό όγκο (10 μl αντί 5 μl) του μίγματος λόγω του ελάχιστου όγκου εκχυλίσματος κουρκουμά που έπρεπε να μετρηθεί και ως εκ τούτου για ελαχιστοποίηση του ποσοστού λάθους. Καθώς για τον ίδιο λόγο χρησιμοποιήθηκαν και διαλύματα DNA με αρχική συγκέντρωση 10 ng/μl αντί 20 ng/μl. Συνολικά χρησιμοποιήθηκαν τα εξής ποσοστά νοθείας κουρκουμά σε κρόκο: 50, 25, 15,10, 2, 1, 0.5 % w/w σε επίπεδο DNA. 52

53 Φυσικοχημικές μέθοδοι Προετοιμασία μιγμάτων Για την παρασκευή των μιγμάτων από σαφράνι και κουρκουμά αρχικά πραγματοποιήθηκε λειοτρίβηση των αποξηραμένων στιγμάτων και των ριζών κουρκουμά ξεχωριστά σε ιγδίο από αχάτη. Στη συνέχεια, κατάλληλες ποσότητες σκόνης από σαφράνι και κουρκουμά αφού μετρήθηκαν σε ζυγό ακριβείας τεσσάρων δεκαδικών ψηφίων μεταφέρθηκαν ποσοτικά σε σωλήνα τύπου eppendorf για να προκύψουν 0,1 g μίγματος. Τέλος για την καλύτερη ομογενοποίηση του μίγματος πραγματοποιήθηκε ανάμιξη με τη βοήθεια κυκλομείκτη. Συνολικά, παρασκευάστηκαν μίγματα που περιείχαν 5 διαφορετικά επίπεδα κουρκουμά σε σαφράνι: 20, 5, 2, 1 και 0,5% w/w UV-Vis ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ α Προετοιμασία εκχυλισμάτων των αρτυμάτων και μιγμάτων τους Το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε για τον καθαρισμό και την προετοιμασία των εκχυλισμάτων των φυτικών υλικών στηρίχθηκε στο πρωτόκολλο εκχύλισης των κροκινών που περιγράφεται στο ISO (ISO 2011) χρησιμοποιώντας ως διαλύτη εξάνιο αντί για νερό. Συνοπτικά, ορισμένη ποσότητα (0,025 g) σκόνης φυτικού υλικού ζυγίστηκε και μεταφέρθηκε ποσοτικά σε ογκομετρική φιάλη των 50 ml που καλύφθηκε με αλουμινόχαρτο για την αποφυγή έκθεσης στο φως. Προστέθηκαν περίπου 40 ml εξανίου και ακολούθησε μαγνητική ανάδευση (περίπου 1000 στροφές/min) του διαλύματος για 1 ώρα. Μετά την ανάδευση, η φιάλη συμπληρώθηκε με εξάνιο ως την χαραγή, πωματίστηκε και ανακινήθηκε καλά για την ομογενοποίηση του διαλύματος. Η φιάλη αφέθηκε σε ηρεμία και μετά το πέρας περίπου 10 λεπτών μεταφέρθηκε ορισμένος όγκος (1 ml) από το πυκνό εκχύλισμα, στο οποίο η συγκέντρωση του δείγματος ήταν 0,05% (w/v), σε ογκομετρική φιάλη των 10 ml και συμπληρώθηκε με εξάνιο ως την χαραγή. Με την ίδια ακριβώς διαδικασία προετοιμάστηκαν και εκχυλίσματα με ακετόνη, και μεθανόλη-νερό σε αναλογία 1:1, v/v τα οποία υποβλήθηκαν σε φασματομετρική εξέταση β Λήψη φασμάτων ορατού των εκχυλισμάτων Οι απορροφήσεις των εκχυλισμάτων καταγράφηκαν στην περιοχή του ορατού ( nm) με ταχύτητα 500 nm/min [medium mode] και τα αντίστοιχα φάσματα αποθηκεύτηκαν με τη βοήθεια του λογισμικού. Ως διάλυμα αναφοράς χρησιμοποιήθηκε ο διαλύτης του εκάστοτε εκχυλίσματος του 53

54 φυτικού υλικού. Κάθε διάλυμα εργασίας μετρήθηκε συνολικά δύο φορές και υπολογίστηκε η μέση τιμή των απορροφήσεων. Μετά από κάθε δείγμα, γινόταν διόρθωση της βασικής γραμμής, με κατάλληλη εντολή του λογισμικού [baseline]. Ο υπολογισμός της 2 ης παραγώγου έγινε επίσης με τη βοήθεια του λογισμικού (Δλ=10, scaling = 1000) ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ α Προετοιμασία εκχυλισμάτων των αρτυμάτων και μιγμάτων τους Το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε για την προετοιμασία εκχυλισμάτων των αρτυμάτων και μιγμάτων τους υιοθετήθηκε από τους Long et al., (2014) με κατάλληλες τροποποιήσεις οι οποίες αφορούν την επαναδιάλυση και επανεκχύλιση (σε μεθανόλη) των καθαρισμένων με εξάνιο φυτικών υλικών, για απομάκρυνση τυχόν λιπιδίων ή άλλων ισχυρά μη πολικών συστατικών, πριν τη διήθηση των εκχυλισμάτων. Αρχικά έγινε καθαρισμός κάθε αρτύματος χωριστά και των μιγμάτων τους με εξάνιο ως εξής: Ορισμένη ποσότητα (0,1 g) από το κάθε φυτικό υλικό ζυγίστηκε χωριστά και μεταφέρθηκε ποσοτικά σε διαφορετικούς σωλήνες φυγοκέντρησης όπου προστέθηκαν στον καθένα από 5 ml εξανίου. Ακολούθησε ανάδευση όλων για 1 ώρα μετά το πέρας της οποίας έγινε φυγοκέντρηση (4.000 στροφές για 10 λεπτά), απομάκρυνση του υπερκείμενου διαλύτη και ξήρανση με ρεύμα αζώτου. Από το καθαρισμένο υλικό των μιγμάτων των δύο φυτικών υλικών ζυγίστηκε ποσότητα 0,01 g, προστέθηκαν 50 ml μεθανόλης και ακολούθησε εκχύλιση σε λουτρό υπερήχων για χρονικό διάστημα 30 λεπτών. Από τα καθαρισμένα φυτικά υλικά σαφράνι και κουρκουμά ζυγίστηκε ποσότητα 0,05 g, προστέθηκαν 25 ml μεθανόλης και ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία όπως και στην περίπτωση των μιγμάτων που περιγράφεται παραπάνω. Τέλος έγινε διήθηση των εκχυλισμάτων με χρήση RC (Regenarated Cellulose) φίλτρων από αναγεννημένη κυτταρίνη (25 mm, 0.45 μm) της εταιρίας Schleicher & Schuell (Dassel, Germany) πριν την υγροχρωματογραφική ανάλυση και ένεση στην HPLC. Στο σχήμα 1 απεικονίζεται η διαδικασία προετοιμασίας των μεθανολικών εκχυλισμάτων. 54

55 Σχήμα 1: Σχηματική απεικόνιση της προετοιμασίας των εκχυλισμάτων που χρησιμοποιήθηκαν στην υγροχρωματογραφική ανάλυση β Προετοιμασία εκχυλισμάτων αναφοράς Για τα εκχυλίσματα αναφοράς ως προς εκείνο του μίγματος 5% w/w σε κουρκουμά ζυγίστηκαν ορισμένες ποσότητες από σαφράνι και κουρκουμά που αντιστοιχούσαν σε 0,095 g και 0,01 g, στις οποίες προστέθηκαν 5 και 10 ml εξανίου, αντίστοιχα. Στη συνέχεια ακολουθήθηκε η διαδικασία ανάδευσης και φυγοκέντρησης που αναφέρθηκε ήδη, έγινε απομάκρυνση του διαλύτη και στη συνέχεια παραλαβή 0,005 g καθαρισμένου φυτικού υλικού τα οποία μεταφέρθηκαν ποσοτικά σε ογκομετρική φιάλη των 25 ml όπου έγινε πλήρωση του όγκου με μεθανόλη και εκχύλιση σε λουτρό υπερήχων για χρονικό διάστημα 30 λεπτών γ Υγροχρωματογραφική ανάλυση των εκχυλισμάτων Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός των κροκινών και των κουρκουμινοειδών έγινε σύμφωνα με το πρωτόκολλο των Kyriakoudi et al. (2013) μετά από κατάλληλες τροποποιήσεις. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκε χρωματογραφική στήλη Luna C18 (2) 100Å (150 x 4,6 mm i.d., 5 μm) της εταιρίας Phenomenex, (California, U.S). Ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε μίγμα νερού-οξικού οξέος (2% v/v, ph=2,95) (Α) και ακετονιτρίλιο (Β) με ροή 0,5 ml/min. Η σύσταση των διαλυτών στο μίγμα ACN-H 2 O μεταβάλλονταν βαθμιαία ώστε η περιεκτικότητά τους σε ACN να κυμαίνεται από 20 έως 100% 55

56 σε 20 min.ο ενέσιμος όγκος ήταν 10 μl και για κάθε δείγμα έγιναν 3 ενέσεις με τη βοήθεια αυτόματου δειγματολήπτη. Ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισμός κουρκουμινοειδών Η καταγραφή των χρωματογραφημάτων έγινε με σάρωση της περιοχής nm. Η ανίχνευση έγινε στα 425 nm με τη χρήση του ανιχνευτή DAD και στα 426 nm (λexc), 540 nm (λem) με τη χρήση του ανιχνευτή FL. Για τον προσδιορισμό των κουρκουμινοειδών που απαντούν τόσο στο άρτυμα του κουρκουμά όσο και στα μίγματά του με σαφράνι κατασκευάστηκε καμπύλη αναφοράς με χρήση προτύπου μεθανολικού διαλύματος κουρκουμίνης συγκέντρωσης 100 ppm. Από αυτό το πυκνό διάλυμα έγιναν 5 αραιώσεις (0,5:10, 1:10, 1:50, 1:100, 0,5:100) με σκοπό την παρασκευή διαλυμάτων με συγκεντρώσεις 0,5, 1, 2, 5 και 10 ppm και καταγραφή των αντίστοιχων χρωματογραφημάτων. Διαδικασία επικύρωσης της μεθόδου Οι εξισώσεις των αντίστοιχων καμπυλών αναφοράς ήταν y=76149x (R 2 =0,999) και y=1745,6x 1697,5 (R 2 =0,999). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν τη γραμμικότητα της απόκρισης στο ορατό και του φθορισμού αντίστοιχα στο εύρος που μετρήθηκε. Η επικύρωση της μεθόδου πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με την απόφαση 2002/657/EC (European Comission 2002). Το όριο ανίχνευσης (LOD) και όριο ποσοτικοποίησης (LOQ) υπολογίστηκαν από τις σχέσεις 3s/b και 10s/b αντίστοιχα, όπου s είναι η τυπική απόκλιση της τεταγμένης επί την αρχή και b είναι η κλίση της κάθε καμπύλης αναφοράς. Επιπλέον, για να εξεταστεί κατά πόσο οι ενδογενείς χρωστικές του αρτύματος παρεμποδίζουν τον ακριβή προσδιορισμό των κουρκουμινοειδών μελετήθηκε η ανάκτηση των συστατικών αυτών μετά τον εμβολιασμό (spiking) του δείγματος αυθεντικού αρτύματος με πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις των προσδιοριζόμενων ενώσεων που αντιστοιχούσαν σε 0,1, 0,2 και 0,3 w/w ξηρού φυτικού υλικού. 56

57 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ 4.1 Πιστοποίηση του είδους C. sativus L. με μοριακές τεχνικές 4.1.α. Μοριακοί δείκτες ISSR Παρακάτω στον πίνακα 6 παρουσιάζονται τα δείγματα κρόκου (C.sativus L.) που χρησιμοποιήθηκαν για να πραγματοποιηθεί η ανάλυση της PCR με τους μοριακούς δείκτες ISSR με σκοπό να καταγραφεί το γενετικό αποτύπωμα του συγκεκριμένου είδους. 57

58 Πίνακας 6: Δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση της PCR με τους μοριακούς δείκτες ISSR. Πληθυσμός (C.sativus L.) Α (Κοζάνη 2013) Β (Κοζάνη 2014) Κοζάνη 2014 Κοζάνη 2014 Δείγμα Μέρος φυτού 58 Πληθυσμός (C.sativus L.) Δείγμα Γ 50 Φύλλα 11 (Κοζάνη 2014) Δ 70 Φύλλα 31 (Κοζάνη 2014) Ισπανία Ισπανία Τέπαλλα 83 Ιράν (GONABAD) Ιράν (TORBAT) Στίγματα 88 Μέρος φυτού Φύλλα Φύλλα Στίγματα

59 Με τη βοήθεια επτά μοριακών δεικτών ISSR (βλ. 3.2.Α) καταγράφηκε το γενετικό αποτύπωμα του είδους C. sativus L. με σκοπό τη δυνατότητα διάκρισής του από τα άλλα είδη Crocus. Στις Εικόνες 31α-31ε παρουσιάζεται το γενετικό αποτύπωμα ενός από τους επτά μοριακούς δείκτες (UBC 807) από όλα τα διαφορετικά άτομα (1-92) C. sativus L., όπως παρουσιάζονται στον πίνακα 7, σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/v. Στην πρώτη θέση βρίσκεται βαθμονομημένη μοριακή σκάλα. Εικόνα 31α: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. (No. 1-20) με το μοριακό δείκτη UBC 807 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. Εικόνα 31β: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. (No ) με το μοριακό δείκτη UBC 807 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. 59

60 Εικόνα 31γ: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. (No ) με το μοριακό δείκτη UBC 807 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. Εικόνα 31δ: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. (No ) με το μοριακό δείκτη UBC 807 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. Εικόνα 31ε: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων C. sativus L. (No ) με το μοριακό δείκτη UBC 807 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. Στις παραπάνω Εικόνες 31α-31ε παρατηρείται μεγάλη ομοιότητα μεταξύ των διαφορετικών ατόμων του είδους C. sativus L. Μόνο σε κάποια άτομα παρατηρούνται ελάχιστες διαφορές στις ζώνες. Όπως για παράδειγμα στα άτομα 15, 16, 31, 33, 36, 40 εμφανίζεται μια ζώνη στα περίπου 1300 ζεύγη 60

61 βάσεων που στα υπόλοιπα άτομα δεν υπάρχει. Επίσης, η ζώνη στα περίπου 600 ζεύγη βάσεων δεν υπάρχει σε όλα τα άτομα. Από τη χρήση των επτά εκκινητών για την ανάλυση του πολυμορφισμού με δείκτες ISSR προέκυψαν 41 ζώνες συνολικά. Από την καταγραφή των αποτελεσμάτων της ηλεκτροφόρησης δημιουργήθηκε ο πίνακας αλληλομόρφων, ο οποίος χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια, για τη δημιουργία του πίνακα δυαδικών αποστάσεων από τον οποίο προέκυψε το διάγραμμα PCoA καθώς επίσης και το διάγραμμα γενετικής παραλλακτικότητας (μοριακή διασπορά) μεταξύ των πληθυσμών και εντός των πληθυσμών (βλ. εικόνες 32 και 33). Από αυτές τις εικόνες επιβεβαιώνεται η ύπαρξη μικρής παραλλακτικότητας μεταξύ των πληθυσμών καθώς επίσης και η ύπαρξη μικρής γενετικής παραλλακτικότητας συνολικά. Η μικρή αυτή γενετική παραλλακτικότητα εντοπίζεται μέσα στα άτομα του κάθε πληθυσμού. Εικόνα 32: Ανάλυση των κύριων συντεταγμένων των ατόμων των φυτών του είδους C. sativus L. που μελετήθηκαν Εικόνα 33: Ποσοστά της μοριακής διασποράς μεταξύ και εντός των πληθυσμών Στην Εικόνα 32 παρατηρείται ότι οι πληθυσμοί του κρόκου συγκεντρώνονται σε δύο μεγάλες ομάδες χωρίς ιδιαίτερες διαφορές μεταξύ των ατόμων των πληθυσμών αλλά και μεταξύ των ίδιων των πληθυσμών. Ωστόσο, κάποια άτομα απέχουν από το σύνολο δηλώνοντας έτσι τη μικρή παραλλακτικότητα που υπάρχει μεταξύ των πληθυσμών και εντός του κάθε πληθυσμού χωρίς όμως ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Αυτό φαίνεται και στο γράφημα της εικόνας 33 όπου το ποσοστό 4% αντιστοιχεί στη διαφορά μεταξύ των πληθυσμών ενώ το ποσοστό 96% αντιστοιχεί στην γενετική διαφορά μεταξύ των ατόμων μέσα στον κάθε πληθυσμό. Παρά το γεγονός ότι φαίνεται μεγάλη (96%) στην πραγματικότητα αφορά την γενετική παραλακτικότητα συνολικά που όμως είναι πολύ μικρή και στατιστικά μη σημαντική. Το συμπέρασμα που προκύπτει μετά την παραπάνω ανάλυση είναι ότι η γενετική παραλλακτικότητα του C. sativus L. είναι ελάχιστη και για το λόγο 61

62 αυτό είναι αποτελεσματική και εύκολη η χρήση των μοριακών δεικτών ISSR για την πιστοποίηση του συγκεκριμένου είδους. Συνεπώς η χρήση οποιουδήποτε άλλου είδους κρόκου είναι εμφανής αφού το γενετικό αποτύπωμα κάθε είδους είναι μοναδικό και χαρακτηριστικό καθώς και αυτό του C. sativus L. είναι σχεδόν σταθερό. Παρομοίως πραγματοποιήθηκε η ανάλυση της PCR με τους υπόλοιπους έξι μοριακούς δείκτες ISSR (UBC 811, UBC815, UBC 827, UBC 834, UBC 841, UBC 860) των οποίων οι εικόνες σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/v παρουσιάζονται στο παράρτημα II. Παρόμοια μελέτη για την κατασκευή του γενετικού αποτυπώματος του σαφράνι πραγματοποιήθηκε από τους ερευνητές (Zheng et al. 2013) οι οποίοι χρησιμοποίησαν μόνο 3 δείκτες ISSR (UBC868, UBC859, UBC818) για το σκοπό αυτό. Απέδειξαν έτσι ότι είναι δυνατός ο διαχωρισμός του γνήσιου αρτύματος σαφράνι από το πιθανώς νοθευμένο. Στη συγκεκριμένη μελέτη, οι Zheng et al διαφοροποίησαν 10 παρτίδες πιστοποιημένου σαφράνι από 10 παρτίδες πιθανώς νοθευμένου εμπορικού σαφράνι που διατέθηκε από καταστήματα βοτάνων στην Κίνα. Με επιπλέον ανάλυση πέραν των μοριακών δεικτών, οι νοθευμένες παρτίδες σαφράνι βρέθηκε ότι περιείχαν είδος μούχλας. Η παρούσα μελέτη συμφωνεί με τα ευρήματα των Zheng et al. 2013, καθώς αποκτήθηκε το γενετικό αποτύπωμα του ελληνικού σαφράνι και επιπλέον οι ISSR εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ανίχνευσαν τη νοθεία του σαφράνι με τον άγριο κρόκο C. cartwrightianus Στην Εικόνα 34 φαίνεται το γενετικό αποτύπωμα του είδους C. sativus L., του άγριου είδους C. cartwrightianus και το γενετικό αποτύπωμα μίγματος DNA αυτών χρησιμοποιώντας το μοριακό δείκτη UBC 815. Εικόνα 34: Γενετικό αποτύπωμα των ειδών C. sativus L., C. cartwrightianus και μίγματος 1:1 αυτών σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/v με το μοριακό δείκτη UBC

63 Αυτό που παρατηρείται στην Εικόνα 34 είναι ότι το είδος C. sativus L. μετά από ανάλυσή του με μοριακούς δείκτες ISSR εμφανίζει τρεις ζώνες πολύ έντονες και χαρακτηριστικές στα 490, 650 και 750 ζεύγη βάσεων καθώς και 2 ζώνες λιγότερο έντονες στα 1100 και 1300 ζεύγη βάσεων. Το είδος C. cartwrightianus αντίστοιχα παρουσιάζει 2 χαρακτηριστικές ζώνες στα 490 και 500 ζεύγη βάσεων. Ωστόσο, το μίγμα των δύο ειδών εμφανίζει σαφώς ζώνες και από τα δύο είδη. Συγκεκριμένα, έχει όλες τις χαρακτηριστικές ζώνες του είδους C. sativus L. σε μικρότερη ένταση εκτός από αυτή των 750 ζεύγη βάσεων και τις δύο χαρακτηριστικές του είδους C. cartwrightianus. Από τη συγκεκριμένη ανάλυση με τους μοριακούς δείκτες ISSR συμπεραίνεται ότι το γενετικό αποτύπωμα του C. sativus L. είναι σχεδόν σταθερό και διαφέρει κατά πολύ από το αντίστοιχο του C. cartwrightianus ενώ από αυτό του μίγματος των δύο ειδών κρόκου η διαφορά των ζωνών είναι μικρότερη. Ωστόσο, η γνησιότητα του είδους C. sativus L. γίνεται εύκολα αντιληπτή με τη χρήση των μοριακών δεικτών ISSR λόγω της ικανότητας των τελευταίων να ανιχνεύουν υψηλό επίπεδο πολυμορφισμού σε ένα είδος, άρα και η πιστοποίηση ενός προϊόντος καθίσταται δυνατή αφού με την παραπάνω μέθοδο είναι δυνατή η ανίχνευση νοθείας. 4.1.β MADs box γονίδια Η ανάλυση της PCR με τη χρήση εξειδικευμένων εκκινητών όπως αναφέρεται στο πειραματικό μέρος (βλ δ.) αποδείχθηκε ένας επιπλέον τρόπος με τον οποίο μπορεί να επιτευχθεί η πιστοποίηση του είδους C. sativus L. Στην Εικόνα 35 φαίνεται ο διαχωρισμός του είδους C. sativus L. από άλλα άγρια είδη κρόκου με τη βοήθεια των ειδικά σχεδιασμένων εκκινητών gsep3a-f και SEP3-2R. Εικόνα 35: Γενετικό αποτύπωμα C. sativus L. και άγριων ειδών Crocus με τους εκκινητές gsep3a-f και SEP3-2R. Στην εικόνα 35 φαίνεται ο διαχωρισμός του είδους C. sativus L. από τα άγρια είδη κρόκου αφού στην μεν πρώτη περίπτωση οι ζώνες που εμφανίζονται, μετά από ηλεκτροφόρηση του προϊόντος της PCR σε πηκτή αγαρόζης, είναι 63

64 περίπου στα 1600 και 1700 ζεύγη βάσεων ενώ αντίστοιχα το είδος C. asumaniae έχει 2 ζώνες στα 1636 και 1750 ζεύγη βάσεων. Τα είδη C. cartwrightianus, C. oreocreticus και C. hadriaticus εμφανίζουν μόνο μία ζώνη στα 1636, 1600 και 1550 ζεύγη βάσεων αντίστοιχα. Από τα παραπάνω αποτελέσματα διαπιστώθηκε ότι με τη χρήση των συγκεκριμένων δεικτών και με τη βοήθεια της ανάλυσης PCR καθίσταται εύκολη η πιστοποίηση του είδους C. sativus L. και ο διαχωρισμός του από άλλα είδη crocus σύμφωνα και με τους (Tsaftaris et al. 2011). 64

65 4.2 Ανίχνευση νοθείας του αρτύματος σαφράνι με Curcuma longa L Μοριακές μέθοδοι α Ποιοτική και ποσοτική ανίχνευση κουρκουμά σε πιθανώς νοθευμένα δείγματα σαφράνι με την υψηλής ανάλυσης καμπύλη τήξης (HRM) Σχήμα 2: Καμπύλες τήξης δέκα διαφορετικών ειδών (C. sativus L., C. cartwrightianus, C. thomasii, C. palassii, C. oreocreticus, C. hadriaticus, C. asumaniae, C. cansellatus, Carthamus tinctorius και Curcuma longa) και ενός μίγματος των ειδών C. sativus L. και C. cartwrightianus χρησιμοποιώντας τη χλωροπλαστική περιοχή trnl Στο παραπάνω σχήμα παρουσιάζονται οι καμπύλες τήξης καθενός από τα 10 διαφορετικά είδη που αναγράφονται παραπάνω μετά από ανάλυσή τους με τη μέθοδο HRM χρησιμοποιώντας ως περιοχή πολλαπλασιασμού τη χλωροπλαστική περιοχή trnl. Αυτό που παρατηρείται είναι ότι το κάθε είδος έχει τη δική του χαρακτηριστική καμπύλη τήξης και το δικό του μοναδικό σημείο τήξης πράγμα το οποίο σημαίνει ότι η διάκριση μεταξύ των ειδών καθίσταται εύκολη με τη συγκεκριμένη μέθοδο. Για μεγαλύτερο και πιο ευδιάκριτο διαχωρισμό των ειδών μεταξύ τους, παρακάτω παρουσιάζεται και η ανάλυση της HRM. 65

66 Σχήμα 3: Καμπύλες HRM δέκα διαφορετικών ειδών (C. sativus L., C. cartwrightianus, C. thomasii, C. palassii, C. oreocreticus, C. hadriaticus, C. asumaniae, C. cansellatus, Carthamus tinctorius και Curcuma longa) και ενός μίγματος των ειδών C. sativus L. και C. cartwrightianus χρησιμοποιώντας τη χλωροπλαστική περιοχή trnl οι οποίες έχουν υποστεί κανονικοποίηση (με τη χρήση του λογισμικού της HRM) Στο σχήμα 3 παρουσιάζονται οι καμπύλες HRM καθενός από τα 10 διαφορετικά είδη και ενός μίγματος των ειδών C. sativus L. και C. cartwrightianus που αναγράφονται δίπλα στο σχήμα χρησιμοποιώντας ως περιοχή πολλαπλασιασμού τη χλωροπλαστική περιοχή trnl, με διαφορετική γραφική παράσταση. Παρατηρώντας το παραπάνω σχήμα φαίνεται ότι το κάθε είδος έχει τη δική του χαρακτηριστική καμπύλη HRM γεγονός το οποίο σημαίνει ότι η αλληλουχία του DNΑ τμήματος που αντιστοιχεί στη χλωροπλαστική περιοχή trnl κάθε είδους που πολλαπλασιάστηκε με τους αντίστοιχους εκκινητές, είναι μοναδική στο κάθε είδος και συνεπώς καθίσταται εύκολη η διάκριση των διαφόρων ειδών μεταξύ τους συμπεριλαμβανομένου και του εν λόγω είδους C. sativus L. Όπως παρατηρείται η καμπύλη HRM που αντιστοιχεί στο είδος Carthamus tinctorius είναι πολύ διαφορετική από όλες τις υπόλοιπες γιατί πολύ διαφορετική είναι εξίσου και η αλληλουχία του DNA της χλωροπλαστικής περιοχής trnl του συγκεκριμένου είδους σε σχέση με τα υπόλοιπα είδη. 66

67 *mix: Calendula officinalis + Curucma longa + Carthamus tinctorius + Gardenia jasminoides + Crocus sativus L. Σχήμα 4: Καμπύλες τήξης (α) και καμπύλες HRM οι οποίες έχουν υποστεί κανονικοποίηση (με τη χρήση του λογισμικού της HRM) (β) τεσσάρων διαφορετικών ειδών (C. sativus L., Carthamus tinctorius, Calendula officinalis και Gardenia jasminoides L.) και ενός μίγματος 1:1:1:1 αυτών των ειδών χρησιμοποιώντας ειδικά σχεδιασμένους εκκινητές για το κάθε είδος ξεχωριστά Στο σχήμα 4 παρατηρείται η ανάλυση των καμπυλών τήξης (α) και η ανάλυση HRM (β) τεσσάρων διαφορετικών ειδών και μίγματος αυτών. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4α το σημείο τήξης του κάθε είδους είναι σχεδόν ίδιο με αυτό του αντίστοιχου μίγματος που αναγνωρίζεται από τους ειδικά σχεδιασμένους εκκινητές για το συγκεκριμένο είδος. Επίσης, παρατηρείται μεγάλη διαφορά των καμπυλών τήξης μεταξύ των ειδών και των αντίστοιχων μιγμάτων κάτι το οποίο σημαίνει ότι ο διαχωρισμός τους τόσο στα καθαρά δείγματα όσο και όταν αυτά βρίσκονται σε μίγμα μπορεί να πραγματοποιηθεί με ευκολία. Ωστόσο, πολλές φορές μπορεί η καμπύλη τήξης του καθαρού δείγματος να μη διαχωρίζεται ευδιάκριτα από αυτή του μίγματος και για το λόγο αυτό καλό θα ήταν να γίνει σύγκριση των αποτελεσμάτων και με τις αντίστοιχες καμπύλες 67

68 HRM. Παρατηρώντας λοιπόν το σχήμα 4β προκύπτει το συμπέρασμα ότι χρησιμοποιώντας τους παραπάνω εξειδικευμένους εκκινητές (ανοδικός Common F1 και καθοδικοί Crocus R, Calendula R, Carthamus R και Gardenia R) για το κάθε είδος οι καμπύλες HRM του καθαρού δείγματος και μίγματος αυτού με άλλα φυτικά υλικά, μοιάζουν που σημαίνει ότι έχει αναγνωριστεί η ύπαρξη του αντίστοιχου είδους και στο μίγμα. *mix: Crocus sativus L. + Zea mays Σχήμα 5: Καμπύλες τήξης (α) και καμπύλες HRM οι οποίες έχουν υποστεί κανονικοποίηση (με τη χρήση του λογισμικού της HRM) (β) δύο διαφορετικών ειδών (C. sativus L. και Zea Mays) και ενός μίγματος 1:1 των ειδών αυτών χρησιμοποιώντας ειδικά σχεδιασμένους εκκινητές για το κάθε είδος χωριστά. Στο σχήμα 5 παρουσιάζονται η ανάλυση των καμπυλών τήξης (α) και η ανάλυση HRM (β) των ειδών C. sativus L. και Zea Mays καθώς και του μίγματος των δύο ειδών. Πιο συγκεκριμένα, στο σχήμα 5α παρατηρείται ότι κάθε κορυφή αντιστοιχεί στο σημείο τήξης των αντίστοιχων προϊόντων. Αυτό φαίνεται να είναι διαφορετικό λόγω της διαφορετικής αλληλουχίας του DNA των δύο ειδών. Όσο πιο μεγάλη είναι η διαφορά μεταξύ των δύο καμπυλών των διαφορετικών 68

69 ειδών τόσο μεγαλύτερη είναι και η διαφορά της αλληλουχίας αυτών σε επίπεδο DNA. Ενώ η μικρότερη έως ελάχιστη διαφορά των καμπυλών αυτών πολλές φορές σημαίνει διαφορά μόνο σε κάποιες βάσεις του DNA. Επιπλέον, στο σχήμα 5α παρατηρείται μεγάλη ομοιότητα στο σημείο τήξης του κάθε είδους με το αντίστοιχο του μίγματος αυτού δηλώνοντας έτσι ότι χρησιμοποιώντας τους εξειδικευμένους εκκινητές (ανοδικός Common F2 και καθοδικοί Crocus R2 και Maize R) για το κάθε είδος είναι δυνατόν η ανίχνευση του συγκεκριμένου είδους στο μίγμα DNA που περιέχει τα διαφορετικά φυτικά είδη τα οποία μπορεί να χρησιμοποιούνται για τη νοθεία του σαφράνι. Ωστόσο, πολλές φορές μπορεί η καμπύλη τήξης του καθαρού δείγματος να μη διαχωρίζεται ευδιάκριτα από αυτή του μίγματος και για το λόγο αυτό καλό θα ήταν να γίνει σύγκριση των αποτελεσμάτων και με τις αντίστοιχες καμπύλες HRM που συνήθως παρουσιάζουν μεγαλύτερη διακριτική ικανότητα. Παρατηρώντας, λοιπόν, το σχήμα 5β προκύπτει το συμπέρασμα ότι χρησιμοποιώντας τους παραπάνω εξειδικευμένους εκκινητές για τα συγκεκριμένα είδη οι καμπύλες HRM του καθαρού δείγματος και μίγματος αυτού επίσης μοιάζουν που σημαίνει ότι έχει αναγνωριστεί η ύπαρξη του αντίστοιχου είδους και στο μίγμα διαφέρουν όμως μεταξύ των διαφορετκών ειδών. Επομένως, οι παραπάνω εκκινητές θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση ύπαρξης καλαμποκιού (Zea mays) στο άρτυμα σαφράνι. *mix: Calendula officinalis + Curucma longa + Carthamus tinctorius + Gardenia jasminoides + Crocus sativus L. 69

70 Σχήμα 6: Καμπύλες τήξης (α) και καμπύλες HRM οι οποίες έχουν υποστεί κανονικοποίηση (με τη χρήση του λογισμικού της HRM) (β) δύο διαφορετικών ειδών (C. sativus L. και Gardenia jasminoides L.) και ενός μίγματος 1:1 των ειδών αυτών χρησιμοποιώντας ειδικά σχεδιασμένους εκκινητές για το κάθε είδος ξεχωριστά Στο σχήμα 6 παρουσιάζονται η ανάλυση των καμπυλών τήξης (α) και η ανάλυση HRM (β) των ειδών C. sativus L. και Gardenia jasminoides L. καθώς και του μίγματος των δύο ειδών. Όπως φαίνεται και από τις εικόνες στην παράγραφο 3.2A όπου παρουσιάζονται οι περιοχές του DNA στις οποίες σχεδιάστηκαν οι εξειδικευμένοι εκκινητές (ανοδικοί Gardenia F και Common F1 και καθοδικοί Gardenia R και Crocus R) για το κάθε είδος αυτά είναι τελείως διαφορετικά μεταξύ τους σε επίπεδο αλληλουχίας γι αυτό και παρουσιάζουν διαφορετικές καμπύλες τήξης. Επίσης, παρατηρείται ακόμη ομοιότητα των καμπυλών τήξης του καθαρού είδους με την αντίστοιχη του μίγματος χρησιμοποιώντας τους αντίστοιχους εξειδικευμένους εκκινητές για την αναγνώριση του κάθε είδους και διαφορετικές καμπύλες για τα διαφορετικά είδη. Συνεπώς, η ανίχνευση του είδους Gardenia jasminoides L. καθίσταται εύκολη και γρήγορη χρησιμοποιώντας τους παραπάνω εκκινητές σε περίπτωση χρήσης του συγκεκριμένου φυτικού υλικού για νοθεία στο άρτυμα σαφράνι αφού όπως φαίνεται και στο σχήμα το κάθε είδος έχει τη δική του χαρακτηριστική καμπύλη. Στο σχήμα 6β παρουσιάζονται οι καμπύλες HRM των αντίστοιχων ειδών του σχήματος 6α. Σε περίπτωση που οι καμπύλες τήξης από μόνες τους δε δίνουν ξεκάθαρο αποτέλεσμα σε μια ανάλυση, όπως και στις προηγούμενες περιπτώσεις, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν οι καμπύλες HRM για μεγαλύτερη διευκρίνιση του αποτελέσματος. 70

71 *mix: Calendula officinalis + Curucma longa + Carthamus tinctorius + Gardenia jasminoides + Crocus sativus L. Σχήμα 7: Καμπύλες τήξης υψηλής ανάλυσης (α) και καμπύλες HRM οι οποίες έχουν υποστεί κανονικοποίηση (με τη χρήση του λογισμικού της HRM) (β) δύο διαφορετικών ειδών (C. sativus L. και Curcuma longa) και ενός μίγματος 1:1 των ειδών αυτών, χρησιμοποιώντας ειδικά σχεδιασμένους εκκινητές για το κάθε είδος ξεχωριστά. Στο σχήμα 7 παρουσιάζονται η ανάλυση των καμπυλών τήξης (α) και η ανάλυση HRM (β) των ειδών C. sativus L. και Curcuma longa καθώς και του μίγματος των δύο ειδών. Όπως φαίνεται στο σχήμα 7α τα δύο είδη παρουσιάζουν το καθένα τη δική του χαρακτηριστική καμπύλη τήξης λόγω της διαφορετικής αλληλουχίας που 71

72 έχουν στην περιοχή του DNA που σχεδιάστηκαν οι εξειδικευμένοι εκκινητές (ανοδικός Common F1 και καθοδικοί Crocus R και Curcuma R παράγραφος 3.2 A) για το κάθε είδος. Οι παραπάνω εκκινητές αναγνωρίζουν σε κάθε περίπτωση το είδος για το οποίο έχουν σχεδιαστεί τόσο στο καθαρό δείγμα όσο και στο μίγμα. Γι αυτό στην περίπτωση του κουρκουμά και του μίγματός του οι καμπύλες είναι ίδιες όπως και του κρόκου. Ωστόσο, μεταξύ τους οι 2 καμπύλες είναι ευδιάκριτα διαφορετικές δηλώνοντας ότι πρόκειται για 2 διαφορετικά είδη και έτσι μπορεί εύκολα να ανιχνευθεί η νοθεία από ένα συγκεκριμένο είδος όπως στην περίπτωση αυτή του Curcuma longa στο είδος Crocus sativus L. Στο σχήμα 7β φαίνονται οι καμπύλες HRM των ειδών C.sativus L. και Curcuma longa οι οποίες χρησιμεύουν ως μια περαιτέρω αποσαφήνιση του αποτελέσματος της ανάλυσης των καμπυλών τήξης. Σχήμα 8: Καμπύλες HRM οι οποίες έχουν υποστεί κανονικοποίηση (με τη χρήση του λογισμικού της HRM) μίγματος των ειδών C. sativus L. και Curucma longa σε επτά διαφορετικά ποσοστά 50, 25, 15, 10, 2, 1 και 0.5 % v/v χρησιμοποιώντας ειδικά σχεδιασμένους εκκινητές για το είδος ξεχωριστά Στο σχήμα 8 παρουσιάζονται οι καμπύλες HRM μιγμάτων σαφράνικουρκουμά 7 διαφορετικών ποσοστών τεχνητής νοθείας με καθαρό κουρκουμά ως δείγμα αναφοράς. Με τη συγκεκριμένη ανάλυση έγινε όχι μόνο ανίχνευση της πιθανής νοθείας του αρτύματος σαφράνι με το άρτυμα κουρκουμά αλλά εκτιμήθηκε και το ποσοστό αυτής. Αυτό σημαίνει ότι με τη συγκεκριμένη ανάλυση μπορεί να γίνει και προσδιορισμός του ποσοστού του διαφορετικού φυτικού υλικού που χρησιμοποιήθηκε για να επιτευχθεί η νοθεία. Το μικρότερο ποσοστό νοθείας σαφράνι με κουρκουμά που ανιχνεύτηκε με τη μέθοδο της HRM και τη χρήση ειδικά σχεδιασμένων εκκινητών ήταν 0,5% v/v. 72

73 Παρόμοιες μελέτες που να αποδεικνύουν με μοριακές μεθόδους τρόπους εντοπισμού ξένου φυτικού υλικού στο άρτυμα σαφράνι έχουν πραγματοποιηθεί στο παρελθόν. Πιο συγκεκριμένα, οι ερευνητές (Jiang et al. 2014) εφάρμοσαν την ανάλυση καμπύλης τήξης σε καθαρά και πιθανώς νοθευμένα εμπορικά δείγματα σαφράνι καθώς και σε άλλα φυτικά υλικά όπως Dendranthema morifolium, Calendula offcinalis, Carthamus tinctorius, Nelumbo nucifera, Hemerocallis fulva, Zea mays, Daucus carota χρησιμοποιώντας τις barcoding περιοχές rbcl, matk, trnh, trnl και ITS2. Ωστόσο, η παρούσα μελέτη σε σχέση με την προαναφερθείσα παρουσιάζει μια διαφορά στο ότι το ενδιαφέρον εστιάζεται σε ένα συγκεκριμένο είδος αυτό του Curcuma longa το οποίο δεν αναλύθηκε από τους (Jiang et al. 2014) και συνεπώς δεν υπάρχουν αποτελέσματα για το συγκεκριμένο είδος το οποίο είναι σημαντικό γιατί χρησιμοποιείται πολύ συχνά ως νοθεία στο άρτυμα σαφράνι έχοντας ενοχοποιηθεί πολλές φορές. Επιπλέον, οι (Jiang et al. 2014) διαχώρισαν τα είδη μεταξύ τους με βάση το σημείο τήξης των αντίστοιχων προϊόντων ενώ στην παρούσα μελέτη σχεδιάστηκαν εξειδικευμένοι εκκινητές για το κάθε είδος που αναλύθηκε καθώς εφαρμόστηκε και η υψηλής ανάλυσης καμπύλη τήξης σε συνδυασμό με την ανάλυση καμπύλης τήξης. Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο πραγματοποιείται όχι μόνο ανίχνευση ξένου φυτικού υλικού στο άρτυμα σαφράνι αλλά και αναγνώριση του συγκεκριμένου είδους εύκολα και γρήγορα. Ακόμη μια επιπλέον μελέτη που αφορά τον εντοπισμό ξένου φυτικού υλικού στο άρτυμα σαφράνι πραγματοποιήθηκε πολύ πρόσφατα από τους ερευνητές οι οποίοι χρησιμοποίησαν την barcoding περιοχή του πυρηνικού γονιδιώματος ITS. Με τη μέθοδο αυτή ανίχνευσαν την παρουσία άγριων ειδών κρόκου στο άρτυμα σαφράνι (Villa et al. 2016). Στην παρούσα μελέτη όμως χρησιμοποιήθηκαν οι μοριακοί δείκτες ISSR οι οποίοι είναι γενικής χρήσης δείκτες και εύκολα μπορούν να ανιχνεύσουν το διαφορετικό γενετικό υλικό σε ένα μίγμα ιδιαίτερα όταν έχει πραγματοποιηθεί και η γενοτύπιση των ειδών. Μάλιστα παρουσιάζουν μεγαλύτερη διακριτική ικανότητα καθώς στοχεύουν σε όλο το γονιδίωμα και όχι σε μια μόνο περιοχή. 73

74 4.2.2Φυσικοχημικές μέθοδοι Δοκιμές ανίχνευσης νοθείας με χρήση διαφορετικών διαλυτών εκχύλισης και εφαρμογή UV-Vis φασματομετρίας Αρχικά εξετάστηκαν τα εκχυλίσματα των αρτυμάτων και μιγμάτων τους που είχαν προετοιμαστεί με συγκεκριμένους διαλύτες διαφορετικής πολικότητας (μεθανόλη-νερό, ακετόνη, εξάνιο) με σκοπό την εύρεση εκείνου του διαλύτη που είναι περισσότερο εκλεκτικός για τον προσδιορισμό των κουρκουμινοειδών. Τα φάσματα ορατού καθώς και οι δεύτερες παράγωγοι των αντίστοιχων εκχυλισμάτων παρουσιάζονται στα σχήματα Σχήμα 9: Φάσματα ορατού του εκχυλίσματος κουρκουμά με α) μεθανόληνερό 1:1 v/vβ) ακετόνη και γ) εξάνιο Σχήμα 10: Φάσματα ορατού του εκχυλίσματος σαφράνι με α) μεθανόλη-νερό 1:1 v/v β) ακετόνη και γ) εξάνιο 74

75 Σχήμα 11: Φάσματα ορατού του εκχυλίσματος μίγματος σαφράνι-κουρκουμά (20 % w/w) με α) μεθανόλη-νερό 1:1 v/v β) ακετόνη και γ) εξάνιο Συγκρίνοντας τα φάσματα κάθε υλικού σε καθένα από τους τρεις διαλύτες προκύπτουν οι εξής παρατηρήσεις: οι χρωστικές του αρτύματος κουρκουμά (κουρκουμινοειδή) φαίνεται να απορροφούν πολύ ισχυρότερα στην ακετόνη από ότι στο λιγότερο πολικό εξάνιο ή στο περισσότερο πολικό μίγμα μεθανόλης-νερού. Οι τιμές max που καταγράφηκαν είναι χαρακτηριστικές του υλικού σε κάθε διαλύτη και μεταβάλλονται ανάλογα με την πολικότητα του τελευταίου (βλ. σχήμα 9). Από την άλλη πλευρά, οι χρωστικές του αρτύματος σαφράνι (κροκίνες) που είναι υδατοδιαλυτές, απορροφούν ισχυρότερα στο μίγμα μεθανόλης-νερού απ όσο στους άλλους δύο διαλύτες, όπως αναμένεται με βάση τη βιβλιογραφία (Tsimidou et al. 1993). Οι τιμές max σε αυτή την περίπτωση βρέθηκε να είναι μεγαλύτερες από εκείνες που παρατηρήθηκαν στα αντίστοιχα εκχυλίσματα κουρκουμά. Η αξιολόγηση των φασμάτων του μίγματος των δύο υλικών (βλ. σχήμα 11) έδειξε ωστόσο ότι η πιθανή προσθήκη κουρκουμά σε σαφράνι ακόμα και σε επίπεδο 20 % w/w δε μεταβάλλει σημαντικά τα χαρακτηριστικά μήκη κύματος των κορυφών του δεύτερου σε κανένα από τους τρεις διαλύτες που εξετάστηκαν. Μικρές ποιοτικές διαφορές που παρατηρήθηκαν μεταξύ των φασμάτων των τριών δειγμάτων σε εξάνιο δε μπορούσαν να αξιολογηθούν εύκολα λόγω των πολύ χαμηλών τιμών απορρόφησης. Επειδή η απλή παρατήρηση των φασμάτων μηδενικής τάξης συχνά δεν είναι αρκετή για την πλήρη διερεύνηση των πληροφοριών που παρέχει η φασματομετρική εξέταση υπολογίστηκε και η δεύτερη παράγωγος των αντίστοιχων φασμάτων με σκοπό τον εντοπισμό και άλλων χαρακτηριστικών μηκών κύματος που συμπληρώνουν το γενικότερο προφίλ του φάσματος με περισσότερες λεπτομέρειες.στα σχήματα παρουσιάζονται τα αντίστοιχα φάσματα κάθε υλικού στους τρεις διαλύτες που επιλέχθηκαν. Σε κάθε φάσμα σημειώνονται τα μήκη κύματος ελάχιστης απορρόφησης ( min ) για καλύτερη ανάγνωση και αποτίμηση της πληροφορίας. 75

76 Σχήμα 12: 2 η παράγωγος φάσματος του εκχυλίσματος κουρκουμά με α) μεθανόλη-νερό 1:1 v/v β) ακετόνη και γ) εξάνιο Σχήμα 13: 2 η παράγωγος φάσματος του εκχυλίσματος σαφράνι με α) μεθανόλη-νερό 1:1 v/v β) ακετόνη και γ) εξάνιο Σχήμα 14: 2 η παράγωγος φάσματος του εκχυλίσματος μίγματος σαφράνικουρκουμά (20% w/w) με α) μεθανόλη-νερό 1:1 v/v β) ακετόνη και γ) εξάνιο Ο υπολογισμός της δεύτερης παραγώγου και ο εντοπισμός των χαρακτηριστικών ( min ) σε κάθε περίπτωση οδήγησε στις ακόλουθες παρατηρήσεις: (α) τα φάσματα εκχυλισμάτων κουρκουμά και σαφράνι παρουσιάζουν σημαντικές ποιοτικές διαφορές σε καθένα από τους τρεις διαλύτες και (β) τα φάσματα εκχυλισμάτων μίγματος σαφράνι-κουρκουμά ακόμα και σε επίπεδο προσθήκης 20 % w/w δε διαφοροποιούνται σημαντικά από τα αντίστοιχα του αρτύματος σαφράνι, παρά μόνο στην περίπτωση που ο χρησιμοποιούμενος διαλύτης είναι το εξάνιο. Στην τελευταία περίπτωση 76

77 φαίνεται να αναγνωρίζονται τα χαρακτηριστικά min του κουρκουμά (π.χ. 407, 432 nm). Θα μπορούσε λοιπόν να διατυπωθεί ότι η ανίχνευση κουρκουμά σε σαφράνι με απευθείας φασματομετρική εξέταση είναι ίσως δυνατή μόνο σε μη πολικό διαλύτη όπως είναι το εξάνιο. Ωστόσο, μια τέτοια μελέτη απαιτεί ιδιαίτερα υψηλές συγκεντρώσεις εκχυλισμάτων (>1000 mg/l), άρα και ποσότητες υλικού, λόγω της ιδιαίτερα χαμηλής τιμής απορρόφησης των κουρκουμινοειδών σ αυτό το διαλύτη, κάτι που αυξάνει πολύ το κόστος της ανάλυσης. Τα παραπάνω αποτελέσματα έδειξαν ότι η ταυτόχρονη παρουσία κροκινών και κουρκουμινοειδών σε εκχύλισμα πιθανά νοθευμένου δείγματος σαφράνι καθιστά αδύνατη την εκλεκτική ανίχνευση των τελευταίων με απλή φασματομετρική εξέταση. Για το λόγο αυτό επιχειρήθηκε στη συνέχεια διαχωρισμός των δύο ομάδων ενώσεων με υγροχρωματογραφική ανάλυση β Διαχωρισμός και ανίχνευση κροκινών και κουρκουμινοειδών με RP- HPLC-DAD-FL Το πρωτόκολλο που επιλέχθηκε (βλ γ) βρέθηκε να είναι κατάλληλο για το διαχωρισμό μίγματος κροκινών και κουρκουμινοειδών που απαντούν σε πιθανά νοθευμένο δείγμα σαφράνι. Στο σχήμα 15 παρουσιάζονται τα υγροχρωματογραφήματα υδατομεθανολικών εκχυλισμάτων δειγμάτων των δύο αρτυμάτων. Σχήμα 15: HPLC-DAD χρωματογραφήματα υδατομεθανολικών εκχυλισμάτων σαφράνι (μπλε) και κουρκουμά (κόκκινο) στα 425 nm Στο σχήμα αυτό φαίνεται ότι ενώ οι κροκίνες εκλούονται ήδη από τα πρώτα 6 min της ανάλυσης και μέχρι περίπου τα 13 min, η έκλουση των κουρκουμινοειδών αρχίζει λίγο αργότερα, περίπου από τα 15 min της ανάλυσης και ολοκληρώνεται σε λιγότερο από ένα min. 77

78 Επειδή η απορρόφηση των κουρκουμινοειδών σε μίγμα μεθανόλης-νερού δεν είναι ιδιαίτερα υψηλή (βλ ) και προκειμένου να ενισχυθεί η ευαισθησία των μετρήσεων κρίθηκε σκόπιμο να αξιοποιηθεί και η ιδιότητά τους να φθορίζουν. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε ανιχνευτής φθορισμού (FL) σε σειρά με τον ανιχνευτή DAD και ρυθμίστηκαν τα κατάλληλα μήκη κύματος απορρόφησης, διέγερσης exc (425 nm) και εκπομπής em (540 nm) που βρέθηκαν από τη βιβλιογραφία (Zhang et al. 2009). Στο σχήμα 16 παρουσιάζονται τα αντίστοιχα υγροχρωματογραφήματα των υδατομεθανολικών εκχυλισμάτων κουρκουμά και σαφράνι. Σχήμα 16: HPLC-FL χρωματογράφημα υδατομεθανολικών εκχυλισμάτων σαφράνι (μπλε) και κουρκουμά (κόκκινο) στα 426 nm exc., 540 nm em Από τα χρωματογραφήματα του σχήματος 16 φαίνεται καθαρά ότι η φθορισμομετρική ανίχνευση των κουρκουμινοειδών σε πιθανά νοθευμένο δείγμα σαφράνι είναι εκλεκτική καθώς κανένα από τα συστατικά του αρτύματος αυτού σε υδατομεθανολικό εκχύλισμα δεν φάνηκε να φθορίζει στα επιλεγμένα μήκη κύματος. Οι παραπάνω παρατηρήσεις επιβεβαιώθηκαν όταν έγινε υγροχρωματογραφική ανάλυση δείγματος από μίγμα των δύο αρτυμάτων σε αναλογία 95:5 σαφράνι-κουρκουμά (w/w), όπως φαίνεται στα υγροχρωματογραφήματα του σχήματος

79 Σχήμα 17: Υγροχρωματογραφήματα υδατομεθανολικού εκχυλίσματος μίγματος 5% w/w κουρκουμά σε σαφράνι (πράσινο) και σύγκριση με τα αντίστοιχα χρωματογραφήματα εκχυλισμάτων κουρκουμά (κόκκινο) και σαφράνι (μπλε) (α) στα 425 nm, (β) στα 426 nm ( exc.), 540 nm ( em) Τα έως τώρα αποτελέσματα έδειξαν ότι στις αναλυτικές συνθήκες που επιλέχθηκαν είναι δυνατή η ανίχνευση κουρκουμινοειδών που απαντούν σε εκχύλισμα του αρτύματος σαφράνι ως αποτέλεσμα δόλιας προσθήκης κουρκουμά. Καθώς όμως το τελευταίο είναι επίσης φυσικό προϊόν του οποίου το περιεχόμενο σε κουρκουμινοειδή μπορεί να ποικίλλει (Jayaprakasha et al. 2002) θεωρήθηκε σημαντικό να εξεταστεί κατά πόσο είναι δυνατός ο προσδιορισμός των επιπέδων αυτών των ενώσεων σε πιθανά νοθευμένο δείγμα σαφράνι αντί να γίνει απευθείας εκτίμηση του επιπέδου προσθήκης κουρκουμά σε σαφράνι. Πριν να επιχειρηθεί ο ποσοτικός προσδιορισμός των ενώσεων, η υγροχρωματογραφική μέθοδος επικυρώθηκε όπως περιγράφεται στις ακόλουθες παραγράφους. 79

80 4.2.2.γ Διαδικασία επικύρωσης της μεθόδου Εκτίμηση παρεμποδίσεων από το υπόστρωμα Όπως παρουσιάζεται στο πειραματικό μέρος (βλ γ) βρέθηκε ότι η ελάχιστη ποσότητα συστατικού που μπορεί να ανιχνευτεί ποιοτικά (LOD) στα 425 nm είναι 1,06 ng ή 0,63 ng στα 426 nm (λexc), 540 nm (λem). Από την άλλη πλευρά η ελάχιστη ποσότητα που μπορεί να προσδιοριστεί ποσοτικά (LOQ) είναι 3,54 ng και 2,09 ng, αντιστοίχως. Με αυτό τον τρόπο επιβεβαιώθηκε η σχετικά μεγαλύτερη ευαισθησία του φθορισμομετρικού ανιχνευτή. Σύμφωνα με τα παραπάνω αποτελέσματα φαίνεται ότι στις συνθήκες της συγκεκριμένης μεθόδου που επιλέχθηκε είναι εφικτή η ανίχνευση και ο ποσοτικός προσδιορισμός κουρκουμινοειδών σε σαφράνι, ακόμα και σε αρκετά χαμηλά επίπεδα προσθήκης. Ωστόσο, στο σημείο αυτό προκύπτει το εύλογο ερώτημα αν οι συγκεκριμένες τιμές παραμένουν ανεπηρέαστες από την παρουσία πιθανού υποστρώματος. Δηλαδή κατά πόσο οι ενδογενείς χρωστικές του αρτύματος σαφράνι παρεμποδίζουν τον ακριβή προσδιορισμό των κουρκουμινοειδών όταν τα δύο αρτύματα αναμιχθούν. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε εμβολιασμός (spiking) του δείγματος αυθεντικού αρτύματος σαφράνι με πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις των προσδιοριζόμενων ενώσεων όπως περιγράφηκε στην γ (πειραματικό μερος). Στο σχήμα 18 παρουσιάζονται τα αντίστοιχα υγροχρωματογραφήματα με ανιχνευτή DAD και FL. 80

81 Σχήμα 18: Υγροχρωματογραφήματα υδατομεθανολικού εκχυλίσματος σαφράνι μετά από εμβολιασμό με πρότυπο διάλυμα κουρκουμίνης σε συγκέντρωση 0,1 (μπλε), 0,2 (κόκκινο) και 0,3 % w/w (πράσινο) και ανίχνευση (α) στα 425 nm, (β) στα 426 nm ( exc.), 540 nm ( em) Παρατηρώντας τα δύο χρωματογραφήματα φαίνεται ξεκάθαρα ο ακριβής και εύκολος διαχωρισμός των κουρκουμινοειδών από τις κροκίνες σε όλες τις συγκεντρώσεις με τον ανιχνευτή φθορισμού (βλ. σχήμα 18 2 ο γράφημα) ενώ η ανίχνευση των κουρκουμινοειδών στο ορατό (βλ. σχήμα 18 1 ο γράφημα) είναι πιο δύσκολη καθώς τα τελευταία αρχίζουν να διαχωρίζονται σε συγκέντρωση 0.2% w/w και άνω με ελάχιστη δυνατότητα διάκρισης. Στη συνέχεια έγινε υπολογισμός των τιμών ανάκτησης όπως περιγράφηκε στην γ (πειραματικό μέρος) και με αξιοποίηση του φθορισμού. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον Πίνακα 7 που ακολουθεί. Πίνακας 7: Επίπεδα εμβολιασμού και τιμές ανάκτησης με τον ανιχνευτή φθορισμού. Επίπεδο εμβολιασμού (% w/w ) Βαθμός ανάκτησης (FL) ± 12.6 (CV=7.3%) ± 7.5 (CV=5.8%) ± 5.1 (CV=4.1%) Από τον παραπάνω πίνακα παρατηρείται ότι τα ποσοστά ανάκτησης των κουρκουμινοειδών στα συγκεκριμένα επίπεδα εμβολιασμού είναι υψηλά, κοντά στα ανώτερα όρια των προτεινόμενων αποδεκτών ορίων που είναι %. Αυτό σημαίνει ότι υπάρχουν παρεμποδίσεις από τις ενδογενείς χρωστικές του υποστρώματος και συγκεκριμένα όσο πιο χαμηλή είναι η περιεκτικότητα σε κουρκουμινοειδή τόσο ισχυρότερες παρεμποδίσεις συμβαίνουν. Συνεπώς τόσο πιο δύσκολη γίνεται η ανίχνευση των προσδιοριζόμενων ενώσεων. Σε αντίθεση με τα αποτελέσματα των Sabatino et al που αναφέρουν ότι η ανίχνευση των κουρκουμινοειδών δεν 81

82 επηρεάστηκε από την παρουσία του σαφράνι στα προς ανάλυση μίγματα χωρίς βέβαια να έχουν υπολογίσει την τιμή για το όριο ανίχνευσης (LOD) δ Εφαρμογή της μεθόδου σε υδατομεθανολικά εκχυλίσματα μιγμάτων σαφράνι-κουρκουμά Η μέθοδος που επικυρώθηκε όπως περιγράφηκε στην προηγούμενη παράγραφο εφαρμόστηκε στη συνέχεια σε μίγματα σαφράνι-κουρκουμά και επίπεδα προσθήκης 5, 1 και 0,5% w/w. Το σχήμα 19 απεικονίζει τα αντίστοιχα υγροχρωματογραφήματα. Σχήμα 19: Υγροχρωματογραφήματα υδατομεθανολικού εκχυλίσματος μιγμάτων 5 (γαλάζιο), 1 (μοβ) και 0,5 % w/w κουρκουμά σε σαφράνι (πράσινο) σε σύγκριση με τα αντίστοιχα χρωματογραφήματα εκχυλισμάτων κουρκουμά (κόκκινο) και σαφράνι (μπλε) (α) στα 425 nm, (β) στα 426 nm ( exc.), 540 nm ( em) Από τα παραπάνω σχήματα φαίνεται ότι η ανίχνευση των κουρκουμινοειδών είναι δυνατή σε επίπεδο νοθείας 5% w/w ακόμα και με τη χρήση του φασματομετρικού ανιχνευτή. Στο επίπεδο αυτό μπορούσε να γίνει και ποσοτικός προσδιορισμός των ενώσεων (φθορισμομετρικά) καθώς η υπολογισθείσα ποσότητα αυτών ήταν κατά μεγαλύτερη του LOQ (2.23 ng κουρκουμίνης). Έτσι υπολογίστηκε ότι το δείγμα που περιέχει 5% w/w 82

83 κουρκουμά περιέχει 1,12 mg κουρκουμίνης/g. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι με τη βοήθεια του φθορισμομετρικού ανιχνευτή έγινε δυνατή η ανίχνευση κουρκουμινοειδών και στο μίγμα συγκέντρωσης 1 % w/w σε κουρκουμά (που περιέχει περίπου 0,75 mg κουρκουμίνης/g) αλλά όχι στο χαμηλότερο επίπεδο νοθείας (0,5% w/w). Συνοπτικά, η υγροχρωματογραφική μέθοδος με φθορισμομετρικό ανιχνευτή που εφαρμόστηκε για την ανάλυση των κουρκουμινοειδών σε πιθανά νοθευμένα δείγματα του αρτύματος σαφράνι φάνηκε να είναι κατάλληλη για την ανίχνευση αλλά και τον ποσοτικό προσδιορισμό αυτών των ενώσεων όταν η συγκέντρωσή τους στο μίγμα ξεπερνά το 1,1 mg/ g. Στην παρούσα εργασία η συγκεκριμένη συγκέντρωση αντιστοιχούσε σε επίπεδο νοθείας ίσο με 5.0 % w/w. Τα παραπάνω αποτελέσματα δε συμφωνούν με αυτά των Sabatino et al οι οποίοι αναφέρουν ότι η ύπαρξη κουρκουμά σε σαφράνι είναι δυνατό να ανιχνευτεί, λόγω της παρουσίας των κουρκουμινοειδών, σε ποσοστό προσθήκης έως και 2 % w/w μόνο με φασματομετρικό ανιχνευτή ενώ στην παρούσα έρευνα με το συγκεκριμένο ανιχνευτή έγινε ανίχνευση σε ποσοστό προσθήκης μόνο έως 5 % w/w. Ωστόσο, ανίχνευση σε μικρότερο ποσοστό προσθήκης (1 και 0.5 % w/w) πραγματοποιήθηκε μόνο με τη χρήση του φθορισμομετρικού ανιχνευτή. 83

84 ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ-ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε ανίχνευση πιθανής νοθείας του εν λόγω αρτύματος C.sativus L. με το άρτυμα κουρκουμά εφαρμόζοντας τη χημική ανάλυση HPLC σε συνδυασμό με τη μοριακή ανάλυση HRM. Τα ευρήματα έδειξαν ότι η υγροχρωματογραφική ανάλυση με ανιχνευτή φθορισμού είναι δυνατό να εφαρμοστεί για την ανίχνευση των συστατικών του κουρκουμά σε πιθανώς νοθευμένα δείγματα του αρτύματος όταν το επίπεδο νοθείας είναι μεγαλύτερο από 5% w/w που σημαίνει 1,1 mg κουρκουμά / g σαφράνι. Ενώ η μοριακή ανάλυση HRM είναι δυνατό να εφαρμοστεί για την ανίχνευση νοθείας κουρκουμά στο άρτυμα σαφράνι σε επίπεδο νοθείας 0,5% w/w. Αυτό σημαίνει ότι είναι πολύ πιο ευαίσθητη τεχνική σε σχέση με την HPLC και επιτρέπει την ανίχνευση ακόμη και πολύ μικρών ποσοστών νοθείας (εκούσιας ή ακούσιας) αν και στην περίπτωση του κρόκου το πολύ μικρό ποσοστό ανίχνευσης της νοθείας ίσως να μην είναι σημαντικό, αντίθετα είναι ιδιαίτερης σημασίας αν το προϊόν χρησιμοποιείται για ιατρική η φαρμακευτική χρήση. Ο λόγος που για το συγκεκριμένο σκοπό χρησιμοποιήθηκε η μοριακή ανάλυση HRM είναι γιατί παρουσιάζει μεγαλύτερη ευαισθησία σε σχέση με την ανάλυση καμπύλης τήξης και είναι ικανή να ανιχνεύει αλλαγές στο DNA ακόμη και αυτές που αφορούν την αφαίρεση, την προσθήκη ή την αντικατάσταση μιας μόνο βάσης του DNA και επιπλέον μπορεί να αναγνωρίσει το συγκεκριμένο είδος το οποίο αποτελεί το υλικό με το οποίο έχει νοθευτεί το σαφράνι. Ο συνδυασμός των δύο παραπάνω τεχνικών θα ήταν ο ιδανικότερος για την εξαγωγή ενός συμπεράσματος που αφορά τέτοιου είδους προβληματισμούς. Ωστόσο, πολλές φορές δεν είναι εφικτή η ταυτόχρονη χρήση και των δύο μεθόδων λόγω περιορισμένου διαθέσιμου χρόνου, οικονομικών πόρων, εξοπλισμού καθώς και λόγω έλλειψης εξειδικευμένου προσωπικού. Οι μοριακές μέθοδοι χρησιμοποιούνται σε αναλύσεις τροφίμων λόγω του πλεονεκτήματος που έχουν να ολοκληρώνονται σε πολύ μικρό χρονικά διάστημα και να δίνουν αξιόπιστα αποτελέσματα. Ωστόσο εφαρμόζονται με πολύ μικρότερη συχνότητα, σε σχέση με τις χημικές, λόγω έλλειψης εξειδικευμένου προσωπικού αλλά και λόγω μεγαλύτερου κόστους του απαιτούμενου εξοπλισμού για την πραγματοποίηση μιας ανάλυσης ρουτίνας, αν και η εφαρμογή τους δεν έχει περιορισμούς όπως στις χημικές αναλύσεις γιατί το DNA είναι το ίδιο σε όλα τα μέρη του φυτού και δεν αλλοιώνεται ούτε χάνεται με την πάροδο του χρόνου. Ενώ το ίδιο το φυτό που χρησιμοποιείται στις χημικές αναλύσεις δεν είναι πάντοτε διαθέσιμο αλλά ούτε και μπορεί να διατηρηθεί σε καλή κατάσταση για μεγάλο χρονικό διάστημα. 84

85 Συμπερασματικά, σε επίπεδο έρευνας είναι χρήσιμες αλλά και απαραίτητες και οι δύο μέθοδοι σε περίπτωση που απαιτείται περισσότερο λεπτομερής και ενδελεχής ανάλυση όμως ανάλογα με την αναγκαιότητα της κατάστασης επιλέγεται και η αντίστοιχη μέθοδος. Στην παρούσα μελέτη, το ενδιαφέρον εστιάστηκε στο φυτικό υλικό κουρκουμάς που χρησιμοποιείται ως νοθεία στο άρτυμα σαφράνι σε μορφή σκόνης. Μελλοντική εργασία μπορεί να επεκταθεί στη συνδυαστική εφαρμογή των δύο τεχνικών HRM και HPLC για την ανίχνευση και ποσοτική εκτίμηση του ποσοστού νοθείας οποιουδήποτε άλλου φυτικού υλικού το οποίο χρησιμοποιείται ως νοθεία στο άρτυμα σαφράνι. 85

86 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Το άρτυμα σαφράνι, προκύπτει από τα αποξηραμένα στίγματα του φυτού κρόκος (Crocus sativus Linnaeus) το οποίο ανήκει στην οικογένεια των ιριδοειδών (Iridaceae) και το γένος Crocus. Λόγω της απαιτητικής χειρονακτικής εργασίας που απαιτείται από τη συγκομιδή μέχρι και τη συσκευασία του, είναι το πιο ακριβό άρτυμα στον κόσμο και για το λόγο αυτό πολύ συχνά νοθεύεται με άλλα φυτικά υλικά, μεγαλύτερης διαθεσιμότητας και χαμηλότερης αξίας, που κυκλοφορούν στο εμπόριο. Η νοθεία του αρτύματος σε μορφή σκόνης ή όταν το άρτυμα προστίθεται σε μίγμα αρτυμάτων, δεν είναι εύκολα ανιχνεύσιμη. Για το λόγο αυτό κρίνεται αναγκαία η ενίσχυση των εργαλείων ελέγχου, τόσο για την πιστοποίηση της γνησιότητας του είδους όσο και για την ανίχνευση πιθανής νοθείας του και εκτίμησης του ποσοστού αυτής με άλλα είδη. Για το σκοπό αυτό στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε α) πιστοποίηση του είδους C. sativus L. με μοριακές μεθόδους που βασίζονται στην αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης και συγκεκριμένα i) οι καμπύλες τήξης υψηλής ανάλυσης σε συνδυασμό με τις DNA barcoding περιοχές ii) οι μοριακοί δείκτες ISSR (inter-simple sequence repeat) και iii) τα MADs-box γονίδια και β) ανίχνευση του αρτύματος κουρκουμά στο σαφράνι σε επίπεδα προσθήκης που κυμαίνονται μεταξύ 50 και 1% w/w με τη χρήση των μοριακών δεικτών μικροδορυφόρων (ISSR), εντός απλών επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών και τη μοριακή μέθοδο της υψηλής ανάλυσης καμπύλης τήξης (HRM) όσο και με φυσικοχημικές τεχνικές όπως η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης αντίστροφης φάσης με ανιχνευτή συστοιχίας διόδων λυχνιών σε σειρά με φθορισμομετρικό ανιχνευτή (RP- HPLC-DAD-FL). Τα ευρήματα έδειξαν ότι η υγροχρωματογραφική ανάλυση με ανιχνευτή φθορισμού είναι δυνατό να εφαρμοστεί για την ανίχνευση των συστατικών του κουρκουμά σε πιθανώς νοθευμένα δείγματα του αρτύματος όταν το επίπεδο νοθείας είναι μεγαλύτερο από 5% w/w, ενώ η μοριακή ανάλυση HRM είναι δυνατό να εφαρμοστεί για την ανίχνευση νοθείας κουρκουμά στο άρτυμα σαφράνι σε επίπεδο νοθείας 0,5% w/w. 86

87 ABSTRACT Crocus sativus L. belongs to Iridaceae family and the Crocus genus. The dried stigmas of Crocus sativus L. are commonly known as saffron. It is considered to be the most expensive spice in the world due to demanding manual labor from harvest to packaging. As a consequence, saffron has been frequently a target of adulteration, performed in both ground and whole stigma, with the most diverse plant materials and strategies. The fraud is not easily detectable therefore additional control tools are necessary for C. sativus L. both for authenticity fraud detection and also for the estimation of the adulterant percentage. For this reason, we applied PCR-based methods such as molecular markers ISSR (inter-simple sequence repeat) and MADs-boxes genes for the authenticity of C. sativus L. from allied Crocus species. Furthermore, using molecular and chemical analysis we detected turmeric adulteration in saffron in percentages varying from 50 to 1% by weight of each adulterant. Furthermore, we applied High Resolution Melting analysis HRM and RP- HPLC-DAD-FL (Reversed Phase-High Pressure Liquid Chromatography- Diode Array-Fluorescence) respectively in order to detect adulterants in saffron. The findings above showed that HPLC analysis with Fluorescent detector can be applied for detecting turmeric in saffron only in case the level of fraud is greater than 5% w/w while HRM analysis can be applied for detecting lower percentage adulteration of 0,5% w/w 87

88 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Ξενόγλωσση βιβλιογραφία Alonso, G. L., Salinas M. R., Garijo J. and SÁNchez FernÁNdez M. A. (2001). "Composition of crocins and picrocrocin from Spanish saffron (Crocus sativus L.)." Journal of Food Quality 24(3): Alsayied, N. F., Fernández J. A., Schwarzacher T. and Heslop-Harrison J. S. (2015). "Diversity and relationships of Crocus sativus and its relatives analysed by inter-retroelement amplified polymorphism (IRAP)." Annals of botany 116(3): Altschul, S. F., Madden T. L., Schäffer A. A., Zhang J., Zhang Z., Miller W. and Lipman D. J. (1997). "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic acids research 25(17): Álvarez-Ortí, M., Gómez-Gómez L., Rubio A., Escribano J., Pardo J., Jiménez F. and Fernández J.-A. (2004). "Development and Gene Expression in saffron corms." ACTA HORTICULTURAE.: Anastasaki, E., Kanakis C., Pappas C., Maggi L., del Campo C. P., Carmona M., Alonso G. L. and Polissiou M. G. (2009). "Geographical differentiation of saffron by GC MS/FID and chemometrics." European Food Research and Technology 229(6): Antony, M. B. (2003). "Indigenous Medicinal Plants: their extracts and isolates as a value added export product." Journal Agro bios 1: Anubala, S., Sekar R. and Nagaiah K. (2014). "Development and validation of an analytical method for the separation and determination of major bioactive curcuminoids in Curcuma longa rhizomes and herbal products using nonaqueous capillary electrophoresis." Talanta 123: Babaei, S., Talebi M., Bahar M. and Zeinali H. (2014). "Analysis of genetic diversity among saffron (Crocus sativus) accessions from different regions of Iran as revealed by SRAP markers." Scientia Horticulturae 171: Bhanumathy, M., Shivaprasad H. N. and Nargund L. V. G. (2013). "Protective Effect of Curcuma Longa Rhizomes against Physical Stress-induced Perturbations in Rats." Journal of Natural Remedies 14(1):

89 Bornet, B. and Branchard M. (2001). "Nonanchored inter simple sequence repeat (ISSR) markers: reproducible and specific tools for genome fingerprinting." Plant molecular biology reporter 19(3): Bosmali, I., Ganopoulos I., Madesis P. and Tsaftaris A. (2012). "Microsatellite and DNA-barcode regions typing combined with high resolution melting (HRM) analysis for food forensic uses: a case study on lentils (Lens culinaris)." Food research international 46(1): Caballero-Ortega, H., Pereda-Miranda R. and Abdullaev F. I. (2007). "HPLC quantification of major active components from 11 different saffron (Crocus sativus L.) sources." Food Chemistry 100(3): Caiola, M. G. and Canini A. (2010). "Looking for saffron s (Crocus sativus L.) parents." In: Husaini AM (Ed) Saffron. Functional Plant Science and Biotechnology 4: Calvo, J. H., Zaragoza P. and Osta R. (2001). "Technical note: A quick and more sensitive method to identify pork in processed and unprocessed food by PCR amplification of a new specific DNA fragment." Journal of animal science 79(8): Carmona, M., Zalacain A., Sánchez A. M., Novella J. L. and Alonso G. L. (2006). "Crocetin esters, picrocrocin and its related compounds present in Crocus sativus stigmas and Gardenia jasminoides fruits. Tentative identification of seven new compounds by LC-ESI-MS." Journal of Agricultural and Food Chemistry 54(3): Chang, H.-W., et al. (2008). "High-throughput avian molecular sexing by SYBR green-based real-time PCR combined with melting curve analysis." BMC biotechnology 8(1): 12. Che, J., Tang L., Liu Y. J., He W. and Chen F. (2007). "[Molecular identity of Crocus sativus and its misused substitutes by ITS sequence]." Zhongguo Zhong yao za zhi= Zhongguo zhongyao zazhi= China journal of Chinese materia medica 32(8): Cheng, J., Jiang Y., Rao P., Wu H., Dong Q., Wu Z., Ding X. and Guo J. (2013). "Development of a single-tube multiplex real-time PCR for detection and identification of five pathogenic targets by using melting-curve analysis with EvaGreen." Archives of virology 158(2): Cordella, C., Moussa I., Martel A.-C., Sbirrazzuoli N. and Lizzani-Cuvelier L. (2002). "Recent developments in food characterization and adulteration 89

90 detection: technique-oriented perspectives." Journal of Agricultural and Food Chemistry 50(7): Costa, J., Mafra I. and Oliveira M. B. P. P. (2012). "Advances in vegetable oil authentication by DNA-based markers." Trends in Food Science & Technology 26(1): Cubero-Leon, E., Peñalver R. and Maquet A. (2014). "Review on metabolomics for food authentication." Food research international 60: Dalmasso, A., Fontanella E., Piatti P., Civera T., Secchi C. and Bottero M. T. (2007). "Identification of four tuna species by means of real-time PCR and melting curve analysis." Veterinary research communications 31: Dhanya, K. and Sasikumar B. (2010). "Molecular marker based adulteration detection in traded food and agricultural commodities of plant origin with special reference to spices." Current Trends in Biotechnology and Pharmacy 4(1): Distefano, G., Caruso M., La Malfa S., Gentile A. and Wu S.-B. (2012). "High resolution melting analysis is a more sensitive and effective alternative to gelbased platforms in analysis of SSR An Example in Citrus." Doyle, J. J. (1987). "A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue." Phytochem bull 19: Ebbehøj, K. F. and Thomsen P. D. (1991). "Differentiation of closely related species by DNA hybridization." Meat Science 30(4): Ebbehøj, K. F. and Thomsen P. D. (1991). "Species differentiation of heated meat products by DNA hybridization." Meat Science 30(3): Eigner, D. and Scholz D. (1999). "Ferula asa-foetida and Curcuma longa in traditional medical treatment and diet in Nepal." Journal of ethnopharmacology 67(1): 1-6. Erol, O., Kaya H. B., Azik L., Tuna M., Can L. and Tanyolac M. B. (2014). "The genus Crocus, series Crocus (Iridaceae) in Turkey and 2 East Aegean islands: a genetic approach." Turkish Journal of Biology 38(1). Europe, S. i. (2006). "White Book."

91 Fang, D. Q. and Roose M. L. (1997). "Identification of closely related citrus cultivars with inter-simple sequence repeat markers." Theoretical and Applied Genetics 95(3): FAO (1986). "Food and Agricultural Organization." Fernández, J.-A. and Pandalai S. G. (2004). "Biology, biotechnology and biomedicine of saffron." Recent research developments in plant science. Vol. 2: Fluch, S., Hohl K., Stierschneider M., Kopecky D. and Kaar B. (2009). Crocus sativus L.-molecular evidence on its clonal origin. Ganopoulos, I., Argiriou A. and Tsaftaris A. (2011). "Microsatellite high resolution melting (SSR-HRM) analysis for authenticity testing of protected designation of origin (PDO) sweet cherry products." Food Control 22(3): Ganopoulos, I., Madesis P. and Tsaftaris A. (2012). "Universal ITS2 barcoding DNA region coupled with high-resolution melting (HRM) analysis for seed authentication and adulteration testing in leguminous forage and pasture species." Plant molecular biology reporter 30(6): Gao, T., Yao H., Song J., Liu C., Zhu Y., Ma X., Pang X., Xu H. and Chen S. (2010). "Identification of medicinal plants in the family Fabaceae using a potential DNA barcode ITS2." Journal of ethnopharmacology 130(1): Ghovvati, S., Nassiri M. R., Mirhoseini S. Z., Moussavi A. H. and Javadmanesh A. (2009). "Fraud identification in industrial meat products by multiplex PCR assay." Food Control 20(8): Gismondi, A., Rolfo M. F., Leonardi D., Rickards O. and Canini A. (2012). "Identification of ancient Olea europaea L. and Cornus mas L. seeds by DNA barcoding." Comptes rendus biologies 335(7): Godwin, I. D., Aitken E. A. B. and Smith L. W. (1997). "Application of inter simple sequence repeat (ISSR) markers to plant genetics." Electrophoresis 18(9): Govindarajan, V. S. and Stahl W. H. (1980). "Turmeric chemistry, technology, and quality." Critical Reviews in Food Science & Nutrition 12(3):

92 Gresta, F., Lombardo G. M., Siracusa L. and Ruberto G. (2008). "Saffron, an alternative crop for sustainable agricultural systems. A review." Agronomy for sustainable development 28(1): Gugerli, F., Parducci L. and Petit R. J. (2005). "Ancient plant DNA: review and prospects." New Phytologist 166(2): Guijarro-Díez, M., Nozal L., Marina M. L. and Crego A. L. (2015). "Metabolomic fingerprinting of saffron by LC/MS: novel authenticity markers." Analytical and Bioanalytical Chemistry 407(23): Gundry, C. N., Vandersteen J. G., Reed G. H., Pryor R. J., Chen J. and Wittwer C. T. (2003). "Amplicon melting analysis with labeled primers: a closed-tube method for differentiating homozygotes and heterozygotes." Clinical chemistry 49(3): Guo, X., Wang X., Su W., Zhang G. and Zhou R. (2011). "DNA barcodes for discriminating the medicinal plant Scutellaria baicalensis (Lamiaceae) and its adulterants." Biological and Pharmaceutical Bulletin 34(8): Hagh-Nazari, S. and Keifi N. (2006). Saffron and various fraud manners in its production and trades. Haghighi, B., Feizy J. and Kakhki A. H. (2007). "LC determination of adulterated saffron prepared by adding styles colored with some natural colorants." Chromatographia 66(5-6): Harpke, D., Carta A., Tomović G., Ranđelović V., Ranđelović N., Blattner F. R. and Peruzzi L. (2015). "Phylogeny, karyotype evolution and taxonomy of Crocus series Verni (Iridaceae)." Plant Systematics and Evolution 301(1): Hollingsworth, P. M., et al. (2009). "A DNA barcode for land plants." Proceedings of the National Academy of Sciences 106(31): Hunt, D. J., Parkes H. C. and Lumley I. D. (1997). "Identification of the species of origin of raw and cooked meat products using oligonucleotide probes." Food Chemistry 60(3):

93 Immink, R. G. H. and Angenent G. C. (2002). "Transcription factors do it together: the hows and whys of studying protein protein interactions." Trends in plant science 7(12): ISO (2011). "Spices - Saffron (Crocus sativus L.)." (3632-1). Jaakola, L., Suokas M. and Häggman H. (2010). "Novel approaches based on DNA barcoding and high-resolution melting of amplicons for authenticity analyses of berry species." Food Chemistry 123(2): Jack, T. (2001). "Relearning our ABCs: new twists on an old model." Trends in plant science 6(7): Jack, T. (2004). "Molecular and genetic mechanisms of floral control." The Plant Cell 16(suppl 1): S1-S17. Javanmardi, N., Bagheri A., Moshtaghi N., Sharifi A. and Hemati Kakhki A. (2012). "Identification of Safflower as a fraud in commercial Saffron using RAPD/SCAR." Journal of Cell and Molecular Research 3(1): Jayaprakasha, G. K., Jagan Mohan Rao L. and Sakariah K. K. (2002). "Improved HPLC method for the determination of curcumin, demethoxycurcumin, and bisdemethoxycurcumin." Journal of Agricultural and Food Chemistry 50(13): Jayaprakasha, G. K., Rao L. J. M. and Sakariah K. K. (2005). "Chemistry and biological activities of C. longa." Trends in Food Science & Technology 16(12): Jiang, C., Cao L., Yuan Y., Chen M., Jin Y. and Huang L. (2014). "Barcoding Melting Curve Analysis for Rapid, Sensitive, and Discriminating Authentication of Saffron (Crocus sativus L.) from Its Adulterants." BioMed research international. Kress, W. J. and Erickson D. L. (2007). "A two-locus global DNA barcode for land plants: the coding rbcl gene complements the non-coding trnh-psba spacer region." PLoS one 2(6): e508. Kress, W. J. and Erickson D. L. (2008). "DNA barcodes: genes, genomics, and bioinformatics." Proceedings of the National Academy of Sciences 105(8):

94 Kumar, S., Kahlon T. and Chaudhary S. (2011). "A rapid screening for adulterants in olive oil using DNA barcodes." Food Chemistry 127(3): Kyriakoudi, A., Tsimidou M. Z., O'Callaghan Y. C., Galvin K. and O'Brien N. M. (2013). "Changes in Total and Individual Crocetin Esters upon in Vitro Gastrointestinal Digestion of Saffron Aqueous Extracts." Journal of Agricultural and Food Chemistry 61(22): Lage, M. and Cantrell C. L. (2009). "Quantification of saffron (Crocus sativus L.) metabolites crocins, picrocrocin and safranal for quality determination of the spice grown under different environmental Moroccan conditions." Scientia Horticulturae 121(3): Li, M., Cao H., But P. P. H. and Shaw P. C. (2011). "Identification of herbal medicinal materials using DNA barcodes." Journal of Systematics and Evolution 49(3): Ma, X. Q., Zhu D. Y., Li S. P., Dong T. T. and Tsim K. W. (2001). "Authentic identification of stigma Croci (stigma of Crocus sativus) from its adulterants by molecular genetic analysis." Planta Medica 67(2): Mackay, J. F., Wright C. D. and Bonfiglioli R. G. (2008). "A new approach to varietal identification in plants by microsatellite high resolution melting analysis: application to the verification of grapevine and olive cultivars." Plant Methods 4(1): 8. Mader, E., Ruzicka J., Schmiderer C. and Novak J. (2011). "Quantitative highresolution melting analysis for detecting adulterations." Analytical biochemistry 409(1): Madesis, P., Ganopoulos I., Anagnostis A. and Tsaftaris A. (2012). "The application of Bar-HRM (Barcode DNA-High Resolution Melting) analysis for authenticity testing and quantitative detection of bean crops (Leguminosae) without prior DNA purification." Food Control 25(2): Maeta, K., Ochi T., Tokimoto K., Shimomura N., Maekawa N., Kawaguchi N., Nakaya M., Kitamoto Y. and Aimi T. (2008). "Rapid species identification of cooked poisonous mushrooms by using real-time PCR." Applied and environmental microbiology 74(10): Maggi, L., Sánchez A. M., Carmona M., Kanakis C. D., Anastasaki E., Tarantilis P. A., Polissiou M. G. and Alonso G. L. (2011). "Rapid determination 94

95 of safranal in the quality control of saffron spice (Crocus sativus L.)." Food Chemistry 127(1): Maish, J. M. (1885). "On the adulteration of saffron." The Analyst: Mao, S. G., Luo Y. M., Shen J. and Ding X. Y. (2007). "Authentication of Crocus sativus L. and its adulterants by rdna ITS sequences and allelespecific PCR." Journal of Nanjing Normal University 30(2): Marieschi, M., Torelli A. and Bruni R. (2012). "Quality control of saffron (Crocus sativus L.): development of SCAR markers for the detection of plant adulterants used as bulking agents." Journal of Agricultural and Food Chemistry 60(44): Marieschi, M., Torelli A., Poli F., Bianchi A. and Bruni R. (2010). "Quality control of commercial Mediterranean oregano: Development of SCAR markers for the detection of the adulterants Cistus incanus L., Rubus caesius L. and Rhus coriaria L." Food Control 21(7): Marmiroli, N., Peano C. and Maestri E. (2003). "Advanced PCR techniques in identifying food components." Food authenticity and traceability: Moore, J. C., Spink J. and Lipp M. (2012). "Development and application of a database of food ingredient fraud and economically motivated adulteration from 1980 to 2010." Journal of Food Science 77(4): R118-R126. Nemati, Z., Zeinalabedini M., Mardi M., Pirseyediand S. M., Marashi S. H. and Nekoui S. M. K. (2012). "Isolation and characterization of a first set of polymorphic microsatellite markers in saffron, Crocus sativus (Iridaceae)." American journal of botany 99(9): e340-e343. Nenadis, N., Heenan S., Tsimidou M. Z. and Van Ruth S. (2016). "Applicability of PTR-MS in the quality control of saffron." Food Chemistry 196: Ordoudi, S. A. and Tsimidou M. Z. (2004). Saffron quality: Effect of agricultural practices, processing and storage. Production Practices and Quality Assessment of Food Crops Volume 1, Springer: Ordoudi, S. A. and Tsimidou M. Z. (2011). "Consideration of fluorescence properties for the direct determination of erythrosine in saffron in the presence of other synthetic dyes." Food Additives and Contaminants 28(4):

96 Perez, J. and Garcia-Vazquez E. (2004). "Genetic identification of nine hake species for detection of commercial fraud." Journal of Food Protection 67(12): Petrakis, E. A., Cagliani L. R., Polissiou M. G. and Consonni R. (2015). "Evaluation of saffron (Crocus sativus L.) adulteration with plant adulterants by 1 H NMR metabolite fingerprinting." Food Chemistry 173: Powell, W., Morgante M., Andre C., Hanafey M., Vogel J., Tingey S. and Rafalski A. (1996). "The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis." Molecular breeding 2(3): Reed, G. H. and Wittwer C. T. (2004). "Sensitivity and specificity of singlenucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis." Clinical chemistry 50(10): Rekha, K., Koul S. and Ram G. (2011). "Adulteration and marketing of saffron (Crocus sativus Linn.)." Journal of Tropical Medicinal Plants 12(1): Robertson, T., Bibby S., O Rourke D., Belfiore T., Agnew-Crumpton R. and Noormohammadi A. H. (2010). "Identification of chlamydial species in crocodiles and chickens by PCR-HRM curve analysis." Veterinary microbiology 145(3): Sabatino, L., Scordino M., Gargano M., Belligno A., Traulo P. and Gagliano G. (2011). "HPLC/PDA/ESI-MS evaluation of saffron (Crocus sativus L.) adulteration." Natural product communications 6(12): Şakalar, E. and Abasıyanık M. F. (2012). "The devolopment of duplex realtime PCR based on SYBR Green florescence for rapid ıdentification of ruminant and poultry origins in foodstuff." Food Chemistry 130(4): Sakaridis, I., Ganopoulos I., Argiriou A. and Tsaftaris A. (2013). "High resolution melting analysis for quantitative detection of bovine milk in pure water buffalo mozzarella and other buffalo dairy products." International Dairy Journal 28(1): Sánchez-Vioque, R., Rodríguez-Conde M. F., Reina-Ureña J. V., Escolano- Tercero M. A., Herraiz-Peñalver D. and Santana-Méridas O. (2012). "In vitro antioxidant and metal chelating properties of corm, tepal and leaf from saffron (Crocus sativus L.)." Industrial Crops and Products 39:

97 Sánchez, A. M., Carmona M., Zalacain A., Carot J. M., Jabaloyes J. M. and Alonso G. L. (2008). "Rapid determination of crocetin esters and picrocrocin from saffron spice (Crocus sativus L.) using UV visible spectrophotometry for quality control." Journal of Agricultural and Food Chemistry 56(9): Sanzani, S. M., Montemurro C., Di Rienzo V., Solfrizzo M. and Ippolito A. (2013). "Genetic structure and natural variation associated with host of origin in Penicillium expansum strains causing blue mould." International journal of food microbiology 165(2): Sawyer, J., Wood C., Shanahan D., Gout S. and McDowell D. (2003). "Realtime PCR for quantitative meat species testing." Food Control 14(8): Schieffer, G. W. (2002). "Pressurized liquid extraction of curcuminoids and curcuminoid degradation products from turmeric (Curcuma longa) with subsequent HPLC assays." Journal of liquid chromatography & related technologies 25(19): Seberg, O. and Petersen G. (2009). "How many loci does it take to DNA barcode a crocus." PLoS one 4(2): e4598. Sharafzadeh, S. (2011). "Saffron: a concise review of researches." Advances in Environmental Biology 5(7): Siracusa, L., Gresta F., Avola G., Albertini E., Raggi L., Marconi G., Lombardo G. M. and Ruberto G. (2013). "Agronomic, chemical and genetic variability of saffron (Crocus sativus L.) of different origin by LC-UV vis-dad and AFLP analyses." Genetic resources and crop evolution 60(2): Srimal, R. C. (1997). "Turmeric: a brief review of medicinal properties." Fitoterapia 68(6): Theißen, G. (2001). "Development of floral organ identity: stories from the MADS house." Current opinion in plant biology 4(1): Tønnesen, H. H. and Karlsen J. (1986). "Studies on curcumin and curcuminoids VII. Chromatographic separation and quantitative analysis of curcumin and related compounds." Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und Forschung 182(3):

98 Torelli, A., Marieschi M. and Bruni R. (2014). "Authentication of saffron (Crocus sativus L.) in different processed, retail products by means of SCAR markers." Food Control 36(1): Tsaftaris, A., Pasentsis K., Makris A., Darzentas N., Polidoros A., Kalivas A. and Argiriou A. (2011). "The study of the E-class SEPALLATA3-like MADSbox genes in wild-type and mutant flowers of cultivated saffron crocus (Crocus sativus L.) and its putative progenitors." Journal of plant physiology 168(14): Tsimidou, M., Ordoudi S., Nenadis N. and Mourtzinos I. (2016). "Food fraud." Encyclopedia of Food and Health: Tsimidou, M. and Tsatsaroni E. (1993). "Stability of saffron pigments in aqueous extracts." Journal of Food Science 58(5): Vietina, M., Agrimonti C. and Marmiroli N. (2013). "Detection of plant oil DNA using high resolution melting (HRM) post PCR analysis: A tool for disclosure of olive oil adulteration." Food Chemistry 141(4): Villa, C., Costa J., Meira L., Oliveira M. B. P. P. and Mafra I. (2016). "Exploiting DNA mini-barcodes as molecular markers to authenticate saffron (Crocus sativus L.)." Food Control. Winterhalter, P. and Straubinger M. (2000). "Saffron renewed interest in an ancient spice." Food Reviews International 16(1): Wittwer, C. T. (2009). "High resolution DNA melting analysis: advancements and limitations." Human mutation 30(6): Wittwer, C. T., Reed G. H., Gundry C. N., Vandersteen J. G. and Pryor R. J. (2003). "High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen." Clinical chemistry 49(6): Xanthopoulou, A., Ganopoulos I., Kalivas A., Osathanunkul M., Chatzopoulou P., Tsaftaris A. and Madesis P. (2016). "Multiplex HRM analysis as a tool for rapid molecular authentication of nine herbal teas." Food Control 60:

99 Yao, H., Song J.-Y., Ma X.-Y., Liu C., Li Y., Xu H.-X., Han J.-P., Duan L.-S. and Chen S.-L. (2009). "Identification of Dendrobium species by a candidate DNA barcode sequence: the chloroplast psba-trnh intergenic region." Planta Medica 75(6): Zalacain, A., Ordoudi S. A., Blazquez I., Díaz-Plaza E. M., Carmona M., Tsimidou M. Z. and Alonso G. L. (2005). "Screening method for the detection of artificial colours in saffron using derivative UV-Vis spectrometry after precipitation of crocetin." Food Additives and Contaminants 22(7): Zalacain, A., Ordoudi S. A., Díaz-Plaza E. M., Carmona M., Blázquez I., Tsimidou M. Z. and Alonso G. L. (2005). "Near-infrared spectroscopy in saffron quality control: determination of chemical composition and geographical origin." Journal of Agricultural and Food Chemistry 53(24): Zhang, C.-L., Fowler M. R., Scott N. W., Lawson G. and Slater A. (2007). "A TaqMan real-time PCR system for the identification and quantification of bovine DNA in meats, milks and cheeses." Food Control 18(9): Zhang, J., Jinnai S., Ikeda R., Wada M., Hayashida S. and Nakashima K. (2009). "A simple HPLC-fluorescence method for quantitation of curcuminoids and its application to turmeric products." Analytical Sciences 25(3): Zheng, H.-j., Liu M.-h., Yang C.-p., Su C. and Su W. (2013). "Construction of DNA finger printing for dry saffron." African Journal of Pharmacy and Pharmacology 7(43): Zhou, L., Wang L., Palais R., Pryor R. and Wittwer C. T. (2005). "Highresolution DNA melting analysis for simultaneous mutation scanning and genotyping in solution." Clinical chemistry 51(10): Zietkiewicz, E., Rafalski A. and Labuda D. (1994). "Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification." Genomics 20(2): Zougagh, M., Ríos A. and Valcárcel M. (2005). "An automated screening method for the fast, simple discrimination between natural and artificial colorants in commercial saffron products." Analytica chimica acta 535(1):

100 Zubor, A. A., Suranyi G., Gyori Z., Borbély G. and Prokisch J. (2004). "Molecular biological approach of the systematics of Crocus sativus L. and its allies." ACTA HORTICULTURAE.: Ελληνική βιβλιογραφία Δαλβινίδου, Δ. (2015). "Ανίχνευση νοθείας του αρτύματος σαφράνι (Crocus sativus L.) με φυτικά υλικά με τη βοήθεια φασματοσκοπίας FT-IR." (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης). ΚΤΠ (2011). Έκδοση 3 Αρτυματικές ύλες και αιθέρια έλαια(άρθρο 42): 42 Παπαδοπούλου, Δ. (2015). "Δημιουργία βάσης φασματοσκοπικών δεδομένων (UV-Vis, FT-IR) για τη διαπίστωση νοθείας του αρτύματος σαφράνι με συνθετικές χρωστικές - εφαρμογή σε εμπορικά δείγματα." (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης). Σταϊκίδου, Χ. (2014). "ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑΣ ΤΟΥ ΚΑΡΜΙΝΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ ΣΤΟ ΑΡΤΥΜΑ ΣΑΦΡΑΝΙ." (Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης). Τσαυτάρης, Α., Νιάνιου-Ομπειντάτ Ε. and Πολύδωρος Α. (2012). "Βελτίωση φυτών."

101 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Παράρτημα I: Τα διάφορα είδη του άγριου κρόκου (Crocus) Όνομα 1. C. abantensis T.Baytop & B.Mathew 2. C. aerius Herb. 3. C. alatavicus Regel & Semen. 4. C. aleppicus Baker 5. C. almehensis C.D.Brickell & B.Mathew 6. C. ancyrensis (Herb.) Maw 7. Crocus angustifolia Weston 8. Crocus angustifolius Weston 9. Crocus antalyensis B.Mathew 10. Crocus asumaniae B.Mathew & T.Baytop 11. Crocus autranii Albov 12. Crocus banaticus J.Gay 13. Crocus baytopiorum B.Mathew 14. Crocus biflorus Mill. 15. Crocus boissieri Maw 16. Crocus boryi J.Gay 17. Crocus boulosii Greuter 18. Crocus cambessedesii J.Gay 19. Crocus cancellatus Herb. 20. Crocus candidus E.D.Clarke 21. Crocus carpetanus Boiss. & Reut. 22. Crocus cartwrightianus Herb. 101

102 Όνομα 23. Crocus caspius Fisch. & C.A.Mey. ex Hohen. 24. Crocus chrysanthus (Herb.) Herb. 25. Crocus corsicus Vanucchi 26. Crocus cvijicii Kosanin 27. Crocus cyprius Boiss. & Kotschy 28. Crocus dalmaticus Vis. 29. Crocus danfordiae Maw 30. Crocus etruscus Parl. 31. Crocus flavus Weston 32. Crocus fleischeri J.Gay 33. Crocus gargaricus Herb. 34. Crocus gilanicus B.Mathew 35. Crocus goulimyi Turrill 36. Crocus graveolens Boiss. & Reut. 37. Crocus hadriaticus Herb. 38. Crocus hartmannianus Holmboe 39. Crocus herbertii (B.Mathew) B.Mathew 40. Crocus hermoneus Kotschy ex Maw 41. Crocus hyemalis Boiss. & Blanche 42. Crocus imperati Ten. 43. Crocus karduchorum Kotschy ex Maw 44. Crocus kerndorffiorum Pasche 45. Crocus korolkowii Maw & Regel 46. Crocus kosaninii Pulevic 47. Crocus kotschyanus K.Koch 102

103 Όνομα 48. Crocus laevigatus Bory & Chaub. 49. Crocus leichtlinii (Dewer) Bowles 50. Crocus ligusticus Mariotti 51. Crocus longiflorus Raf. 52. Crocus malyi Vis. 53. Crocus mathewii Kerndorff & Pasche 54. Crocus michelsonii B.Fedtsch. 55. Crocus minimus DC. 56. Crocus moabiticus Bornm. 57. Crocus naqabensis Al-Eisawi & Kiswani 58. Crocus nerimaniae Yüzb. 59. Crocus nevadensis Amo & Campo 60. Crocus niveus Bowles 61. Crocus nudiflorus Sm. 62. Crocus ochroleucus Boiss. & Gaill. 63. Crocus olivieri J.Gay 64. Crocus oreocreticus B.L.Burtt 65. Crocus pallasii Goldb. 66. Crocus paschei Kerndorff 67. Crocus pelistericus Pulevic 68. Crocus pestalozzae Boiss. 69. Crocus pulchellus Herb. 70. Crocus reticulatus Steven ex Adam 71. Crocus robertianus C.D.Brickell 72. Crocus rujanensis Randjel. & D.A.Hill 103

104 Όνομα 73. Crocus sativus L. 74. Crocus scardicus Kosanin 75. Crocus scharojanii Rupr. 76. Crocus serotinus Salisb. 77. Crocus sieberi J.Gay 78. Crocus sieheanus Barr ex B.L.Burtt 79. Crocus speciosus M.Bieb. 80. Crocus suaveolens Bertol. 81. Crocus suwarowianus K.Koch 82. Crocus thomasii Ten. 83. Crocus tommasinianus Herb. 84. Crocus tournefortii J.Gay 85. Crocus vallicola Herb. 86. Crocus veluchensis Herb. 87. Crocus veneris Tapp. ex Poech 88. Crocus vernus (L.) Hill 89. Crocus versicolor Ker Gawl. 90. Crocus vitellinus Wahlenb. 91. Crocus wattiorum (B.Mathew) B.Mathew 104

105 Παράρτημα II Παρακάτω στις εικόνες 36α-41ε παρουσιάζονται οι ηλεκτροφορήσεις των προϊόντων της PCR 92 διαφορετικών ατόμων του είδους C. sativus L. με 7 μοριακούς δείκτες ISSR σε πηκτή αγαρόζης 1,5 % w/v. Στην πρώτη στήλη εμφανίζεται η σκάλα DNA Εικόνα 36α: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (No. 1-20) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 811 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Εικόνα 36β: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (No ) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 811 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Εικόνα 36γ: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (No ) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 811 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. 105

106 Εικόνα 36δ: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (No ) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 811 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Εικόνα 36ε: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 12 διαφορετικών ατόμων (No ) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 811 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Εικόνα 37α: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (No. 1-20) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 815 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. 106

107 Εικόνα 37β: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (No ) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 815 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Εικόνα 37γ: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (No ) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 815 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w Εικόνα 37δ: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (No ) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 815 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. 107

108 Εικόνα 37ε: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 12 διαφορετικών ατόμων (No ) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 815 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. Εικόνα 38α: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (No. 1-20) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 827 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. Εικόνα 38β: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (No ) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 827 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. 108

109 Εικόνα 38γ: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (No ) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 827 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. Εικόνα 38δ: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (No ) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 827 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. Εικόνα 38ε: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 12 διαφορετικών ατόμων (No ) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 827 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. 109

110 Εικόνα 39α: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (No. 1-20) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 834 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. Εικόνα 39β: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (No ) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 834 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. Εικόνα 39γ: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (No ) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 834 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. 110

111 Εικόνα 39δ: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (No ) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 834 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. Εικόνα 39ε: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 12 διαφορετικών ατόμων (No ) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 834 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. Εικόνα 40α: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (No. 1-20) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 841 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. 111

112 Εικόνα 40β: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (No ) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 841 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. Εικόνα 40γ: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (No ) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 841 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. Εικόνα 40δ: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (No ) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 841 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. 112

113 Εικόνα 40ε: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 12 διαφορετικών ατόμων (No ) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 841 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. Εικόνα 41α: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (No. 1-20) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 860 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. Εικόνα 41β: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (No ) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 860 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. 113

114 Εικόνα 41γ: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (No ) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 860 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. Εικόνα 41δ: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 20 διαφορετικών ατόμων (No ) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 860 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. Εικόνα 41ε: Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR 12 διαφορετικών ατόμων (No ) C. sativus L., με το μοριακό δείκτη UBC 860 σε πηκτή αγαρόζης 1,5% w/w. 114