NGS-ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗ ΣΤΗΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΠΡΑΚΤΙΚΗ ΤΟΥ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΟΥ

HTML
DOWNLOAD

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "NGS-ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗ ΣΤΗΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΠΡΑΚΤΙΚΗ ΤΟΥ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΟΥ"

Αμάραντος Γερμανός
7 χρόνια πριν
Προβολές:

1 NGS-ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗ ΣΤΗΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΠΡΑΚΤΙΚΗ ΤΟΥ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΟΥ Δημήτρης Χατζηδημητρίου Επικ. Καθηγητής Ιατρικής Μικροβιολογίας, Ιατρικό Τμήμα, ΑΠΘ

Όταν ανακαλύφθηκε το τηλεσκόπιο, οι επιστήμονες ανακάλυψαν νέους κόσμους, νέους πλανήτες που δεν γνώριζαν αλλά και τη συνολική λειτουργία του σύμπαντος Όταν ανακαλύφθηκε το μικροσκόπιο, οι

2 Όταν ανακαλύφθηκε το τηλεσκόπιο, οι επιστήμονες ανακάλυψαν νέους κόσμους, νέους πλανήτες που δεν γνώριζαν αλλά και τη συνολική λειτουργία του σύμπαντος Όταν ανακαλύφθηκε το μικροσκόπιο, οι επιστήμονες αποκάλυψαν ένα εσωτερικό νέο κόσμο, σε μια σταγόνα νερού Με το NGS μπορούμε πλέον να ανακαλύψουμε και να μελετήσουμε με μεγάλη ακρίβεια νέες πληροφορίες για τον οργανισμό μας που θα μας οδηγήσουν στην καλύτερη αντιμετώπιση κληρονομικών και επίκτητων νοσημάτων

The Human Genome Project Άρχισε το 1990 Ολοκληρώθηκε το 2003 Κόστος 2.700.000.

3 The Human Genome Project Άρχισε το 1990 Ολοκληρώθηκε το 2003 Κόστος $ Το γονιδίωμα του καθενός είναι μοναδικό To HGP Αποτελεί ένα μωσαϊκό από διαφορετικές επιμέρους αλληλουχήσεις. Χρηματοδοτήθηκε από NIH, DEO Science Feb 16;291(5507): The sequence of the human genome. Venter JC, et al.

4 The Human Genome Project

5 We now know how God wrote the book of life Bill Clinton

6 Μέθοδος αλληλούχησης Sanger Chain termination method ddntps ενσωματώνονται τυχαία σε διάφορες θέσεις Δημιουργείται μίγμα από τυχαία τμήματα DNA Το μήκος τους εξαρτάται από τη θέση ενσωμάτωσης των ddntps

7 Περιορισμοί Sanger Αλληλούχηση μικρών τμημάτων DNA μεγέθους <1000 bp Υψηλό κόστος για μεγάλα τμήματα DNA Αλληλούχηση ενός δείγματος σε κάθε τρέξιμο Χαμηλή ευαισθησία (20%)

8 Next generation sequencing (NGS) Deep Sequencing Ultra Deep Sequencing High throughput Massively parallel

9 Next Generation Sequencing Βασική αρχή: Sanger Sequencing Αναγνώριση βάσεων μικρών τμημάτων DNA καθώς το τμήμα επανασυντίθεται Παράλληλη ογκώδης αλληλούχηση Εκατομμύρια τμήματα DNA

10 NGS: Πλεονεκτήματα Απόδοση μεγάλης ποσότητας δεδομένων - 3Tb Υψηλή επικάληψη (High Coverage) Υψηλή ακρίβεια Ταχεία αλληλούχηση ολόκληρων γονιδιωμάτων Αλληλούχηση πολλών δειγμάτων ταυτόχρονα To ανθρώπινο γονιδίωμα αποτελείται από 3 δισεκατομμύρια βάσεις σε απλοειδία ή 6 δισεκατομμύρια βάσεις σε διπλοειδία, τότε με το 1 Τb δεδομένων έχουμε διαβάσει το ανθρώπινο γονιδίωμα περίπου 300 φορές.

12 Sequencing, Then and Now THEN 1 Genome 13 Years NOW 100K Genomes 4 Years

Recent Trends in Sequencing Sequencing Cost per Genome $1,000 1. National Human Genome Research Institute.

13 Recent Trends in Sequencing Sequencing Cost per Genome $1, National Human Genome Research Institute. DNA Sequencing Costs accessed 10/22/2015. Updated October 2, 2015.

15 1000 Genomes Project 1KGP Άρχισε 2008 Μελέτησε την Ανθρώπινη γενετική ποικιλία 1000 συμμετέχοντες από διάφορες χώρες Τυχαία δειγματοληψία γαμετών Δομικές παραλλαγές (insertions/deletions) Παραλλαγές των αντιγράφων (CNV) Single nucleotide polymorphisns (SNPs) Φυσική επιλογή A map of human genome variation from population-scale sequencing Genomes Project Consortium, Abecasis GR, Altshuler D, Auton A, Brooks LD, Durbin RM, Gibbs RA, Hurles ME, McVean GA. Nature. 2010

17 454 Roche Pyrosequencing

18 32ο Μετεκπαιδευτικό Σεμινάριο Ιατρικής 3 4 Φεβρουαρίου 2018 Μέγαρο Μουσικής θεσσαλονίκης

19 32ο Μετεκπαιδευτικό Σεμινάριο Ιατρικής 3 4 Φεβρουαρίου 2018 Μέγαρο Μουσικής θεσσαλονίκης

20 10ο Πανελλήνιο Συνέδριο

21 Διαδικασία ανάλυσης NGS 10ο Πανελλήνιο Συνέδριο

22 NGS - Applications DNA Whole Genome Whole exome Targeted Re-Sequencing Epigenetics Metagenomics Reproductive & Genetic Health RNA mrna Whole Transcriptome Targeted Re-sequencing mirna Ribosomal Profiling

23 Precision Medicine - NGS Microbiome

25 NGS Διαγνωστικό εργαλείο

26 NGS - Ογκολογία

27 NGS - Ογκολογία

28 NGS - Ογκολογία

30 NGS Non Invasive Prenatal Testing NIPD, NIPS, cfdna, cffdna, DNA based noninvasive prenatal screening

31 NGS Non Invasive Prenatal Testing

35 NGS Non Invasive Prenatal Testing Verifi (Truseq Nano DNA library Preparation kit). Illumina HiSeq 2000 Materni T21 (Sequenom) Harmony (Ariosa) Panorama (Natera)

36 NGS Non Invasive Prenatal Testing

37 NGS - ΚΑΡΔΙΑΓΓΕΙΑΚΕΣ ΠΑΘΗΣΕΙΣ Ασθένειες που ανήκουν σε αυτήν την ομάδα περιλαμβάνουν Καρδιομυοπάθεια Πρωτογενείς αρρυθμίες Ανεύρυσμα θωρακικής αορτής Οικογενή υπερχοληστερολαιμία Συγγενείς καρδιοπάθειες (CHD) Η διαχείριση ασθενών με ορισμένες καρδιαγγειακές παθήσεις απαιτεί γενετική συμβουλευτική σχετικά με τον ιδιαίτερο κληρονομικό χαρακτήρα τους και την αναγκαιότητα αξιολόγησης του κινδύνου για ασυμπτωματικά μέλη της οικογένειας.

38 Σκοπός μελέτης πρόβλεψη εμφάνισης καρδιαγγειακών συμβαμάτων εκτίμηση της βαρύτητας της στεφανιαίας νόσου εκτίμηση της πολυπλοκότητας της στεφανιαίας νόσου εξατομικευμένη θεραπευτική καθοδήγηση των ασθενών. Για το σκοπό αυτό θα γίνει: διερεύνηση της παρουσίας >207 γενετικών πολυμορφισμών με NGS συσχέτιση γονοτύπου με την πολυπλοκότητα και βαρύτητα της στεφανιαίας νόσου (βάσει του SYNTAX score) και την ανταπόκριση στη φαρμακευτική αγωγή με κλοπιδογρέλη και στατίνες. Ο συνδυασμός γενετικών, φαρμακογενετικών, κλινικών και εργαστηριακών δεδομένων με σκοπό τη δημιουργία ενός Αλγορίθμου Πρόβλεψης Καρδιαγγειακών Συμβαμάτων (GEnetic Syntax Score-GESS) βάσει του οποίου θα είναι δυνατή η Εξατομικευμένη θεραπευτική προσέγγιση ασθενών με στεφανιαία νόσο. Αποτελεί την πρώτη ερευνητική προσπάθεια σε παγκόσμιο επίπεδο και στοχεύει στην ανάπτυξη πακέτου (panel) γενετικών πολυμορφισμών βιοδεικτών (GEnetic Syntax Score diagnostics-gessx), ως εργαλείο πρόβλεψης καρδιαγγειακών συμβαμάτων

39 NGS - Μικροβιολογία

42 NGS - HIV 32ο Μετεκπαιδευτικό Σεμινάριο Ιατρικής 3 4 Φεβρουαρίου 2018 Μέγαρο Μουσικής θεσσαλονίκης

44 32ο Μετεκπαιδευτικό Σεμινάριο Ιατρικής 3 4 Φεβρουαρίου 2018 Μέγαρο Μουσικής θεσσαλονίκης

45 EKAABE / HIV - NGS 32ο Μετεκπαιδευτικό Σεμινάριο Ιατρικής 3 4 Φεβρουαρίου 2018 Μέγαρο Μουσικής θεσσαλονίκης

46 illumina Workflow Streamlined end-to-end solution Library Prep Sequencing Analysis Suite of DNA, RNA & Targeted Solutions Industry s leading NGS instruments Storage, Processing, Analysis & Collaboration

47 Απεικόνιση Millions of Clusters Per Flow Cell 20 Microns 100 Microns

48 EKAABE - NGS Σε 20 δείγματα PR: M46l, F53L, D30N, D67G, F227L = 2% RT: M184l, D67N, E138A, F227L = 2% INT =R263K 3.53%, L74I 97%, 32ο Μετεκπαιδευτικό Σεμινάριο Ιατρικής 3 4 Φεβρουαρίου 2018 Μέγαρο Μουσικής θεσσαλονίκης

49 Εφαρμογές του WGS σε νοσοκομειακά βακτήρια

50 Έλεγχος πολυανθεκτικών Μέχρι σήμερα βασίζεται: στο αντιβιόγραμμα σε φαινοτυπικές δοκιμασίες για την ύπαρξη καρβαπενεμασών (EDTA test, boronic acid test, Hodge test) ή ESBLs (double disc synergy test) επιλεκτικά στη διενέργεια PCR για την στοχευμένη ανίχνευση γονιδίων ανθεκτικότητας. Με το WGS και την μετέπειτα επεξεργασία από ειδικό λογισμικό (πχ Resfinder) είναι εφικτή η πλήρης ανάλυση του συνόλου των γονιδίων ανθεκτικότητας ενός στελέχους (resistome). Παρέχεται έτσι ένας πλήρης κατάλογος των γονιδίων ανθεκτικότητας που ενδεχομένως να περιλαμβάνει ακόμη και γονίδια που δεν εκφράζονται ή εκφράζονται σε μικρό βαθμό με αποτέλεσμα να μην γίνεται αντιληπτή η ύπαρξη τους από το αντιβιόγραμμα ή τις φαινοτυπικές δοκιμασίες. Θα μπορούσαν να εκφραστούν σε δεύτερο χρόνο υπό την πίεση φυσικής επιλογής λόγω της χρήσης κάποιου αντιβιοτικού ή να διασπαρούν σε άλλα στελέχη του νοσοκομείου μέσω μεταθετών γενετικών στοιχείων.

51 Ανίχνευση θέσεως στο γονιδίωμα για τα γονίδια ανθεκτικότητας Τα γονίδια ανθεκτικότητας βρίσκονται πολύ συχνά σε πλασμίδια και έχουν τη δυνατότητα να διασπείρονται μεταξύ των Gram - βακτηρίων σε χώρους νοσηλείας μέσω βακτηριακής σύζευξης. Η ύπαρξη μεταφερόμενης εκτεταμένου φάσματος β-λακταμάσης (ESBL), καρβαπενεμάσης ή του νεότερου γονιδίου mcr-1 που παρέχει ανθεκτικότητα στην κολιστίνη απαιτεί τη λήψη άμεσων μέτρων προφύλαξης και απομόνωση ασθενούς για την αποφυγή διασποράς Υπάρχουν σήμερα εργαλεία βιοπληροφορικής για τη μελέτη πλασμιδίων από δεδομένα WGS (πχ Plasmidfinder), οι δυνατότητες τους όμως χρειάζονται ενίσχυση

52 Έλεγχος κλωνικής συγγένειας Διερεύνηση επιδημιών από πολυανθεκτικά βακτήρια και βασιζόταν παλαιότερα στην PFGE ενώ σήμερα χρησιμοποιείται κυρίως το Multilocus Sequence Typing (MLST) μέσω του οποίου κατηγοριοποιούνται τα στελέχη σε Sequence Types (ST) με βάση την αλληλούχιση συγκεκριμένων house keeping genes Ο καθορισμός του ST πραγματοποιείται πλέον εύκολα από τα δεδομένα του WGS και τη χρήση κατάλληλου λογισμικού βιοπληροφορικής το οποίο εντοπίζει τα συγκεκριμένα house keeping genes αναλύει τις αλληλουχίες τους και κατατάσσει το προς εξέταση στέλεχος στον τύπο που ανήκει

53 Έλεγχος λοιμογονικότητας Σήμερα πρακτικά δεν εξετάζεται Με τα δεδομένα του WGS είναι δυνατό να βρεθούν γονίδια που σχετίζονται με τη λοιμογονικότητα του στελέχους όπως ο τύπος του καψιδίου και οι τοξίνες που μπορεί να παράγει, παρέχοντας χρήσιμες πληροφορίες για τις νόσους που ενδέχεται να προκαλέσει σε ασθενείς και κατ επέκταση στην πιο αποτελεσματική αντιμετώπιση τους πέρα από την αντιβιοτική θεραπεία.

Σχετικά έγγραφα

Μαριάνθη Γεωργίτση Επίκουρη Καθηγήτρια Ιατρικής Βιολογίας-Γενετικής

Μαριάνθη Γεωργίτση Επίκουρη Καθηγήτρια Ιατρικής Βιολογίας-Γενετικής Τομέας Βιολογικών Επιστημών και Προληπτικής Ιατρικής Σχολή Επιστημών Υγείας Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης E-mail: margeorgitsi@auth.gr