Φυλοεπιλογή στο χερσαίο γαστερόποδο Helix aspersa: αναπαραγωγική συµπεριφορά και ιστολογική µελέτη του οργάνου αποθήκευσης σπέρµατος

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΖΩΟΛΟΓΙΑΣ Ευριπίδης Κοεµτζόπουλος ΒΙΟΛΟΓΟΣ Φυλοεπιλογή στο χερσαίο γαστερόποδο Helix aspersa: αναπαραγωγική συµπεριφορά και ιστολογική µελέτη του οργάνου αποθήκευσης σπέρµατος Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2007

2 Στους γονείς µου Λάζαρο και Σοφία

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Ζωολογίας του Βιολογικού Τµήµατος της Σχολής Θετικών Επιστηµών του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης από το 2001 έως το Ευχαριστώ εκ καρδίας την επιβλέπουσα της διατριβής Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Αλεξάνδρα Στάїκου για τη συνεχή παρακολούθηση και καθοδήγησή της σε όλες τις φάσεις της εργασίας αυτής. Η παρουσία της ήταν ανεκτίµητη τόσο για την µύησή µου στην επιστηµονική µέθοδο σκέψης και πράξης, όσο και για την καλλιέργεια πολλών πτυχών του χαρακτήρα µου, ώστε να προκύψει πολύ µεγάλη ωφέλεια αυτά τα δηµιουργικά έτη. Ευχαριστώ θερµά την Καθηγήτρια και διευθύντρια του Εργαστηρίου Ζωολογίας κ. Μαρία Λαζαρίδου για τις πολύτιµες συµβουλές και τις κριτικές παρατηρήσεις της στο κείµενο. Επίσης, ευχαριστώ θερµά τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Νικόλαο Λουµπουρδή για την ενθάρρυνσή του, τη βοήθειά του στα θέµατα ιστολογίας και τις εύστοχες παρατηρήσεις του στο κείµενο. Θερµές ευχαριστίες εκφράζω στα µέλη της Εξεταστικής Επιτροπής, τον Καθηγητή του Πανεπιστηµίου Κρήτης κ. Μωϋσή Μυλωνά, τον Καθηγητή κ Χαρίτωνα Χιντήρογλου, την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Πασχαλίνα Κυριακοπούλου-Σκλαβούνου και την Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Μαρία Αργυροπούλου του Τµήµατος Βιολογίας του Α.Π.Θ. που δέχθηκαν να συµµετάσχουν στην Εξεταστική Επιτροπή, καθώς και για τις χρήσιµες παρατηρήσεις και υποδείξεις τους. Ιδιαίτερα ευχαριστώ την υποψήφια διδάκτορα Μαρίνα-Έλενα Γαρεφαλάκη για την αµέριστη συµπαράστασή της καθόλη τη διάρκεια της εκπόνησης της διατριβής και τις ωφέλιµες συµβουλές της στα στάδια συγγραφής και παρουσίασης. 2

4 Ευχαριστώ θερµά τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Βασίλειο Μιχαηλίδη και τον κ. Αθανάσιο Γκόγκα για τη σηµαντική βοήθειά τους στην εργασία στο πεδίο και την ουσιαστική συµβολή του πρώτου στην εύρεση κατάλληλου χώρου για τη διεξαγωγή των πειραµάτων. Την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Ελένη Βουλτσιάδου ευχαριστώ για τη συµπαράστασή της και τη διαµόρφωση ενός ιδιαίτερα ευχάριστου κλίµατος στο χώρο εργασίας. Τον κ. Παναγιώτη Αποστολόπουλο ευχαριστώ για τη διάθεση του κτήµατός του για τις εργασίες στο πεδίο. Επίσης, ευχαριστώ τους Χαράλαµπο Βλαχάτη, Βασιλική Αντωνίου, Χαρά Χατζηκαµάρη, Ελευθέριο Πατεράκη, έσποινα Μίγκλη και ιδιαίτερα τον Ανδρέα Ανέστη για τη βοήθειά τους κατά τη διάρκεια των παρατηρήσεων, καθώς και τους Μελποµένη Αποστολίδου, Κωνσταντίνο Φειδάντση και Άννα Κουτσοκέρα για τη βοήθειά τους στη λήψη του φωτογραφικού υλικού. Ευχαριστώ τους φίλους µου Βασίλειο Μαυροµατίδη, Άννα Ζιάκα, Άννα Τσιώρα, Απόστολο Τατόλα, Ναούµ Λιώτα, Χαρίλαο Σκούµπα, Μαρία ρυδάκη, ήµητρα αλαµπύρα, Αθανάσιο Θεοδοσιάδη, Φανούλα Φωκαΐδου, Τηλέµαχο Λαΐτσα και Ελένη Μανωλοπούλου για την ηθική συµπαράστασή τους και βοήθεια, ιδιαίτερα σε δύσκολες στιγµές της εργασίας. Τον κ. Θεοδόσιο Σουλή ευχαριστώ για τις κριτικές παρατηρήσεις του στο κείµενο. Θερµές ευχαριστίες οφείλω στους γονείς µου Λάζαρο και Σοφία, τις αδελφές µου Ευγενία και Μαριάνθη, τη θεία µου Ερωφίλη και όλη την οικογένειά µου για την πολύπλευρη βοήθεια, κατανόηση και συµπαράστασή τους σε όλη τη διάρκεια της διατριβής. Ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω στον πνευµατικό µου πατέρα π. Νικήτα Χατζηγαβριήλ για την τέλεια πνευµατική του καθοδήγηση, η οποία έδωσε τις κατάλληλες προϋποθέσεις για την εκπόνηση της διατριβής και τον π. Γεώργιο Καψάνη για την πολύτιµη συµπαράστασή του. Τέλος, ευχαριστώ το Ίδρυµα Κρατικών Υποτροφιών για την οικονοµική ενίσχυση που µου προσέφερε κατά την περίοδο

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1.ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σελίδα 1.1 Φυλοεπιλογή Ιστορική ανασκόπηση Φυλοεπιλογή στα ταυτόχρονα ερµαφρόδιτα ζώα Φυλοεπιλογή στα χερσαία πνευµονοφόρα γαστερόποδα Συστηµατική κατάταξη, γεωγραφική εξάπλωση και βιολογία αναπαραγωγής του Helix aspersa Σκοπός της διατριβής 29 2.YΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 2.1 Eργασία στο πεδίο (προέλευση και συλλογή δειγµάτων) Εργασία στο εργαστήριο (συνθήκες παρατηρήσεων και εκτροφής) Καταγραφές των παρατηρούµενων αναπαραγωγικών χαρακτήρων Ιστολογική µελέτη του οργάνου αποθήκευσης σπέρµατος οκιµασία επιλογής συντρόφου µε κριτήριο τη συγγένεια Επεξεργασία δεδοµένων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ - ΣΥΖΗΤΗΣΗ 3.1. Συµπεριφορά αναπαραγωγής στις γενιές Ρ και F 1 Αποτελέσµατα.. 49 Πυκνότητα πληθυσµών και µέγεθος σαλιγκαριών ιάθεση για σύζευξη 51 4

6 ιάρκεια σύζευξης ιάρκεια προσυζευκτικής συµπεριφοράς 63 ιάρκεια αναπαραγωγικών φάσεων. 65 Συζήτηση Βιολογία αναπαραγωγής Αποτελέσµατα.. 83 Πληθυσµιακές διαφορές στα ποσοστά ωοαποθέσεων των σαλιγκαριών. 83 ιάρκεια και πρότυπο χρονικής κατανοµής ωαποθέσεων Μέγεθος ωαποθέσεων και µέγεθος αβγών...88 Επιτυχία εκκόλαψης-βιωσιµότητα.. 90 Σχέση µεγέθους ζώων, συµπεριφοράς και βιολογίας αναπαραγωγής..92 Συζήτηση Μελέτη σπερµατοθήκης Αποτελέσµατα 105 οµή της σπερµατοθήκης Πληθυσµιακή διαφοροποίηση της δοµής της σπερµατοθήκης Βαθµός κληρονόµισης των χαρακτηριστικών της σπερµατοθήκης Συζήτηση Τυχαία ή µη σύζευξη σε σχέση µε το βαθµό συγγένειας Αποτελέσµατα 131 Συζήτηση 136 5

7 4. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

8 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Φυλοεπιλογή Η έρευνα του αρβίνου σχετικά µε τη δράση της φυσικής επιλογής εστιάστηκε κυρίως στον αγώνα των ζωντανών οργανισµών για επιβίωση και βασίστηκε σε δύο απλές παρατηρήσεις: τα άτοµα διαφέρουν µεταξύ τους, και οι απόγονοί τους είναι πολύ περισσότεροι από αυτούς που µπορεί να στηρίξει το φυσικό περιβάλλον. Έτσι, τα άτοµα µε µορφολογικά, φυσιολογικά και ηθολογικά χαρακτηριστικά που τα βοηθούν να προσαρµοσθούν στο εκάστοτε περιβάλλον τους τείνουν να επιβιώνουν και να αναπαράγονται. Ωστόσο, αυτή η θεώρηση της φυσικής επιλογής µπορεί να οδηγήσει στο απλοϊκό συµπέρασµα ότι οι ζωντανοί οργανισµοί είναι παθητικά πιόνια της γενετικής τους σύστασης και είτε επιβιώνουν στις συνθήκες που έτυχε να βρεθούν, είτε πεθαίνουν. Στην πραγµατικότητα η επιβίωση ή ακόµη και η αναπαραγωγή δεν αρκούν για την εξελικτική επιτυχία ενός οργανισµού η εξελικτική επιτυχία ενός φυτού ή ζώου µετριέται µε τον αριθµό και κυρίως την ποιότητα των απογόνων του (Gould & Gould, 1996). Πιο συγκεκριµένα, η αναπαραγωγική επιτυχία ενός ατόµου, από γενετική σκοπιά, εξαρτάται από το πόσο προσαρµοσµένη θα είναι η επόµενη γενιά ώστε να είναι ικανή να ανταποκρίνεται στις τυχόν µεταβολές του περιβάλλοντος και από πόσα µέλη θα αποτελείται. Τα παραπάνω εξαρτώνται σε µεγάλο βαθµό από το συνδυασµό των γονιδίων που προσλαµβάνουν οι οργανισµοί από τους γονείς τους, δηλαδή η εξελικτική επιτυχία ενός ατόµου που αναπαράγεται αµφιγονικά εξαρτάται σε µεγάλο βαθµό και από τα γονίδια που συνεισφέρει ο σύντροφός του. Ένας «µειονεκτικός» σύντροφος, ένας οργανισµός π.χ. που δεν είναι επαρκώς προσαρµοσµένος στις εκάστοτε συνθήκες, µπορεί να µειώσει ή να µην επιτρέψει την αναπαραγωγική επιτυχία, ενώ αντίθετα ένας «πλεονεκτικός» σύντροφος θα συνεισφέρει γονίδια που 7

9 θα ευνοήσουν την επιβίωση των απογόνων, αυξάνοντας την αναπαραγωγική επιτυχία του ατόµου (Gould & Gould, 1996). Τα παραπάνω οδηγούν στο συµπέρασµα ότι στη φύση η σύζευξη σπάνια είναι τυχαία. Οι οργανισµοί που καταφέρνουν να βρουν πολλούς συντρόφους ή συντρόφους µε ιδιαίτερη ποιότητα γενετικών χαρακτήρων (ή και τα δύο) έχουν αναπαραγωγικό πλεονέκτηµα και αναµένεται να αφήσουν περισσότερους και πιο προικισµένους απογόνους στην επόµενη γενιά από τους ανταγωνιστές τους. Οποιαδήποτε διαδοχική µορφολογική ή φυσιολογική µεταβολή ή µεταβολή συµπεριφοράς που προάγει την απόκτηση ή/και την επιλογή συντρόφου συνιστά εξελικτική µεταβολή µέσω φυλοεπιλογής (Gould & Gould, 1996). Η φυλοεπιλογή (sexual selection), λοιπόν, είναι η διεργασία της φυσικής επιλογής η οποία ευνοεί οποιοδήποτε χαρακτηριστικό δίνει σε ένα άτοµο αναπαραγωγικό πλεονέκτηµα σε σχέση µε τα υπόλοιπα. Σύµφωνα µε το αρβίνο, (1871) η φυλοεπιλογή δρα µέσω δύο διαδικασιών: α) την ενδοφυλοεπιλογή (intrasexual selection), η οποία αναφέρεται στον ανταγωνισµό µεταξύ των ατόµων του επιλεγόµενου φύλου για την πρόσβαση στα άτοµα του επιλέγοντος (ο ανταγωνισµός συνήθως εµφανίζεται µεταξύ των αρσενικών) και β) τη διαφυλοεπιλογή (intersexual selection), η οποία αναφέρεται στην επιλογή ελκυστικών συντρόφων από τα άτοµα του επιλέγοντος φύλου, συνήθως από τα θηλυκά. Ο παραπάνω διαχωρισµός είχε γίνει µε δεδοµένο ότι η φυλεοεπιλογή απορρέει µόνο από τη διακύµανση του αριθµού των θηλυκών ατόµων µε τα οποία ζευγαρώνει ένα αρσενικό και ότι τα θηλυκά είναι µονογαµικά. Κάτι τέτοιο όµως δεν ισχύει στη φύση, µια και στο ζωικό βασίλειο είναι ιδιαίτερα διαδεδοµένη η επανειληµµένη σύζευξη των θηλυκών µε διαφορετικούς συντρόφους (McFarland, 1999). Η πρακτική 8

10 αυτή οδηγεί στη θεώρηση µιας ακόµη διαδικασίας µέσω της οποίας δρα η φυλοεπιλογή: γ) το σπερµατικό ανταγωνισµό (sperm competition). Ο σπερµατικός ανταγωνισµός αποτελεί σηµαντική συνιστώσα της φυλοεπιλογής και έχει οριστεί από τον Parker (1970) ως ο ανταγωνισµός µεταξύ των σπερµατοζωαρίων διαφορετικών αρσενικών ατόµων για τη γονιµοποίηση των ωαρίων ενός θηλυκού. ιαπιστώθηκε από τον Parker ότι υπάρχει πιθανότητα τα φύλα να λειτουργούν ανταγωνιστικά κατά την αναπαραγωγική διαδικασία. Θεωρήθηκε ότι οι επιλεκτικές πιέσεις είναι ισχυρότερες στα αρσενικά από ό,τι στα θηλυκά άτοµα, εφόσον στα αρσενικά η επιτυχία κατά το σπερµατικό ανταγωνισµό επιδρά άµεσα στον αριθµό των απογόνων τους, ενώ στα θηλυκά επηρεάζει µόνο την ποιότητα των απογόνων τους. Ο παραπάνω ορισµός αντανακλά την άποψη ότι η φυλοεπιλογή στην ουσία καθοδηγείται από τα αρσενικά, ενώ τα θηλυκά λειτουργούν ως παθητικοί αποδέκτες γαµετών. Πιο πρόσφατες απόψεις θεωρούν ότι το πεδίο του σπερµατικού ανταγωνισµού θα πρέπει να εξετάζεται πιο σφαιρικά και να συµπεριλαµβάνει και τη µελέτη των µορφολογικών, φυσιολογικών και ηθολογικών χαρακτηριστικών που σχετίζονται µε τις επανειληµµένες συζεύξεις των θηλυκών ατόµων. Επίσης θα πρέπει να συµπεριλαµβάνει και την αρχή ότι τα θηλυκά άτοµα είναι πιθανό να εξασκούν κάποιο έλεγχο στην πατρότητα των απογόνων τους. Η παθητική ή ενεργητική επιλογή γαµετών κάποιου αρσενικού από το θηλυκό αναφέρεται ως άδηλη επιλογή του θηλυκού (cryptic female choice) σε αντιδιαστολή µε τη µη άδηλη επιλογή (διαφυλοεπιλογή), η οποία αναφέρεται στην επιλογή από το θηλυκό κάποιου αρσενικού ως σεξουαλικού συντρόφου (Eberhard, 1996). Από τα παραπάνω φαίνεται ότι στην ουσία η φυλοεπιλογή είναι µια συνεχής διεργασία η οποία συµβαίνει σε πολλά διαφορετικά στάδια της αναπαραγωγικής 9

11 διαδικασίας, από το αρχικό στάδιο της απόκτησης σεξουαλικού συντρόφου έως και τα στάδια της σύζευξης, της επακόλουθης γονιµοποίησης των ωαρίων, της βιωσιµότητας των απογόνων, δηλαδή της βιωσιµότητας των εµβρύων (Birkhead, 1995). Σύγχρονες µελέτες της αναπαραγωγικής συµπεριφοράς, της µορφολογίας και ανατοµίας παρέχουν ισχυρές ενδείξεις ότι η φυλοεπιλογή διαδραµατίζει σηµαντικό ρόλο στην εξέλιξη χαρακτήρων που σχετίζονται µε την αναπαραγωγική επιτυχία. (Holland & Rice, 1999). Παράλληλα, µια σχετικά σύντοµη εξέλιξη των χαρακτήρων που σχετίζονται µε την αναπαραγωγή (37-42 γενιές για τη µύγα Drosophila melanogaster) αποδίδεται στην φυλοεπιλογή και στις αλληλεπιδράσεις µεταξύ των φύλων (Miller & Pitnick, 2002) Ιστορική ανασκόπηση Πρώτος ο Αριστοτέλης από παρατηρήσεις της αναπαραγωγικής διαδικασίας σε κοτόπουλα ανέφερε ότι όταν µία όρνιθα ζευγαρώσει µε δύο διαφορετικούς πετεινούς, οι απόγονοι της µοιάζουν µε τον δεύτερο. (ἐάν τε ὑφ ἑτέρου ὠχευµένη <ᾖ> καὶ ἔτι ὠχροὕ ὄντος, κατὰ τὸν ὕστερον ὀχεύσαντα τὸ γένος άποβαίνει πᾶν τὸ τῶν νεοττῶν. κι αν, ενώ το αβγό είναι ακόµα κίτρινο, ζευγαρώσει µε άλλο αρσενικό, όλα τα κοτοπουλάκια µοιάζουν µε το δεύτερο κόκορα) (Αριστοτέλους, Περί ζώων γενέσεως 730α 7-9). Αυτή είναι µια σαφής δήλωση της παρουσίας σπερµατικού ανταγωνισµού στο κοτόπουλο, επιπλέον, µε τη χρήση γενετικών δεικτών, όπως θα τους αποκαλούσαµε σήµερα, πιστοποιήθηκε η πατρότητα των απογόνων και έγινε αναφορά στο φαινόµενο της προτεραιότητας του τελευταίου αρσενικού (Birkhead, 2000). 10

12 ύο χιλιάδες χρόνια αργότερα, ο Έρασµος αρβίνος αναφέρθηκε στην ύπαρξη κεράτων, σπιρουνιών και άλλων παρόµοιων εξαρτηµάτων ως εξελικτικών βοηθηµάτων στη µάχη για την απόκτηση θηλυκών. Αργότερα, ο εγγονός του Κάρολος συµπλήρωσε τις παραπάνω παρατηρήσεις λαµβάνοντας υπόψη του άλλα χαρακτηριστικά των αρσενικών που δεν σχετίζονται µε τη µαχητική τους ικανότητα, όπως το πλούσιο πτέρωµα και τα λειριά. Θεώρησε, δηλαδή, ότι τα θηλυκά έχουν µια αίσθηση της οµορφιάς των αρσενικών, εποµένως συµµετέχουν στην επιλεκτική διαδικασία (Birkhead, 2000). Στα τέλη της δεκαετίας του 1960, ο Robert Trivers διετύπωσε την επαναστατική, για την εποχή, ιδέα ότι η φυλοεπιλογή δρα εντονότερα στο φύλο που επενδύει λιγότερο στην ανατροφή των απογόνων, το οποίο είναι συνήθως το αρσενικό. Θεωρούσε ότι το φύλο που επενδύει περισσότερο στην ανατροφή, αποτελεί περιοριστικό παράγοντα για το άλλο, το οποίο ανταγωνίζεται έντονα για τους εναποµείναντες συντρόφους. Η ιδέα αυτή στηρίχθηκε στα πειράµατα του Bateman (1948) πάνω στη Drosophila melanogaster, ο οποίος απέδειξε ότι ενώ τα αρσενικά ωφελούνται από τις πολλαπλές συζεύξεις αυξάνοντας την αναπαραγωγική τους επιτυχία ανάλογα µε τον αριθµό των συζεύξεων, τα θηλυκά κερδίζουν ελάχιστα από αυτές. Το 1970 ο Parker εισήγαγε τον όρο «σπερµατικός ανταγωνισµός», ο οποίος είχε πρωτοαναφερθεί από τον Otto Winge το 1937 (Birkhead, 2000) για να περιγράψει τον ανταγωνισµό των αρσενικών ατόµων στο ψάρι λεβιστής. Όµως, ο Parker ήταν εκείνος που, πέρα από τη διατύπωση του ορισµού, συνειδητοποίησε και την εξελικτική σηµασία του σπερµατικού ανταγωνισµού. Ενώ ο Κάρολος αρβίνος θεωρούσε επαρκή τη σύζευξη για την εκπροσώπηση του αρσενικού στην επόµενη γενιά, ο Parker θεώρησε απαραίτητη τη γονιµοποίηση των ωαρίων του θηλυκού. 11

13 Εποµένως η διαδικασία της φυλοεπιλογής επεκτείνεται έως το στάδιο της γονιµοποίησης και ευνοεί τα αρσενικά που γονιµοποιούν περισσότερα ωάρια. Ο παραπάνω ορισµός υποστηρίζει την άποψη ότι η φυλοεπιλογή στην ουσία καθοδηγείται από τα αρσενικά, ενώ τα θηλυκά λειτουργούν ως παθητικοί αποδέκτες γαµετών. Μάλιστα, όταν εξελιχθεί στα αρσενικά ένας µηχανισµός αύξησης της αναπαραγωγικής τους επιτυχίας, όπως π.χ. η αύξηση της ποσότητας σπέρµατος ανά εκσπερµάτωση, τότε, κατά ένα γενικό πρότυπο της εξελικτικής διαδικασίας, αυτά θα αναπτύξουν και νέους µηχανισµούς, όπως π.χ. την καλύτερη περιφρούρηση των θηλυκών. Αξιοσηµείωτα σε αυτόν τον τοµέα είναι τα αποτελέσµατα των ερευνών των Robin Baker και Mark Bellis (Birkhead, 2000), οι οποίοι απέδειξαν ότι πολλές από τις διαφορετικές µορφές σπερµατοζωαρίων στα ζώα αποσκοπούν στην εξόντωση σπερµατοζωαρίων από ανταγωνιστές συντρόφους (kamikaze sperm hypothesis), φαινόµενο που παρατηρείται και στον άνθρωπο (Birkhead, 2000) Βασιζόµενοι στις ιδέες του Parker, πολλοί επιστήµονες, όπως οι E.O.Wilson και R. Dawkins θεώρησαν ότι η φυλοεπιλογή δρά µάλλον σε ατοµικό παρά σε πληθυσµιακό επίπεδο και ότι τα δύο φύλα ανταγωνίζονται µεταξύ τους για να µεγιστοποιήσουν τα οφέλη και να ελαχιστοποιήσουν τις απώλειες. Το φαινόµενο αυτό αποτελεί τη σύγκρουση των φύλων (sexual conflict), τη διαµάχη δηλαδή µεταξύ θηλυκού και αρσενικού ώστε να κερδίσει το καθένα το καλύτερο δυνατό αναπαραγωγικό αποτέλεσµα. Αυτή η «εγωїστική» διάθεση του κάθε φύλου καθώς και η αντιπαλότητα µεταξύ τους οδήγησε σε µια ποικιλία φυσιολογικών ανατοµικών και ηθολογικών χαρακτήρων που σχετίζονται µε την αναπαραγωγή. Έτσι όµως, άρχισε να γίνεται αντιληπτό ότι τα θηλυκά δεν είναι παθητικοί αποδέκτες σπέρµατος, αλλά συµβάλλουν ενεργά στην επιλογή γαµετών και καθορίζουν το αναπαραγωγικό αποτέλεσµα (Birkhead, 2000, Arnqvist & Rowe, 2005). 12

14 Η έννοια της άδηλης επιλογής του θηλυκού έγινε ευρύτερα γνωστή µε τη δηµοσίευση του βιβλίου «Female Control» από τον B. Eberhard (1996). Στο βιβλίο αυτό τεκµηριώνονται δεκάδες περιπτώσεις σε ολόκληρο το ζωικό βασίλειο όπου τα θηλυκά ασκούν µετασυζευκτικό (post-copulatory) έλεγχο στο ποιο αρσενικό ή ποιο σπέρµα θα γονιµοποιήσει τα ωάριά τους. Βέβαια, ήδη από τις δεκαετίες 1940 και 1950 ορισµένοι βιολόγοι είχαν την υποψία ότι ο θηλυκός αναπαραγωγικός αγωγός αποτελεί κάτι περισσότερο από απλό κανάλι µεταφοράς σπέρµατος και ωαρίων. Στη δεκαετία του 1980, ο R. Thornhill (Birkhead, 2000) εισήγαγε την ιδέα ότι τα θηλυκά ζευγαρώνουν µε πολλούς συντρόφους και µόνο αφού δεχθούν σπερµατοζωάρια από όλους ασκούν κάποια διαδικασία επιλογής τους. Παρά το γεγονός ότι η εργασία του Thornhill αποτελεί ορόσηµο, δεν εξιχνιάσθηκε τότε το κατά πόσον η ιδέα της άδηλης επιλογής είναι και πραγµατικότητα, γεγονός που οφείλεται είτε στο ότι οι ηθολόγοι της εποχής εκείνης ασχολούνταν µε την προσυζευκτική (pre-copulatory) επιλογή, είτε στο ότι οι τότε κοινωνικές αντιλήψεις περιχαρακώνονταν από τη θεώρηση της φυλοεπιλογής αλλά µόνο από την «αρσενική» σκοπιά. Από τότε το πεδίο της άδηλης επιλογής του θηλυκού παρουσίασε έντονη ερευνητική δραστηριότητα. ηµοσιεύθηκαν εργασίες που ανέφεραν τη λειτουργία της άδηλης επιλογής του θηλυκού σε διάφορα είδη. Στο κτενοφόρο Berοe, για παράδειγµα, ο προπυρήνας του ωαρίου διαλέγει µε ποιον προπυρήνα σπέρµατος θα ενωθεί για τη δηµιουργία ζυγωτού (Birkhead, 2000). Επίσης σε διάφορα είδη ζώων όπως µύγες, ορτύκια, ποντίκια και ζέβρες, τα θηλυκά αποβάλλουν σπέρµα µετά τη σύζευξη, γεγονός που αποτελεί ένδειξη άδηλης επιλογής. Οι πιο πρόσφατες έρευνες στο πεδίο αυτό γίνονται σε συνεργασία µε τη γενετική και µοριακή βιολογία και αφορούν στην ιδέα των Jeanne και David Zeh ότι τα θηλυκά επιλέγουν το σπέρµα που θα τα γονιµοποιήσει µε βάση τη γενετική συµπληρωµατικότητα (Birkhead, 2000). 13

15 1.3. Φυλοεπιλογή στα ταυτόχρονα ερµαφρόδιτα ζώα Οι περισσότερες µελέτες που έγιναν και οι περισσότερες εργασίες που δηµοσιεύτηκαν εντός του θεωρητικού πλαισίου της φυλοεπιλογής αφορούσαν κυρίως σε γονοχωριστικά είδη, δηλαδή είδη των οποίων τα άτοµα φέρουν ξεχωριστά αρσενικό ή θηλυκό αναπαραγωγικό σύστηµα. Σε αυτά τα ζώα έχουν ερευνηθεί διάφορες πτυχές της συζευκτικής συµπεριφοράς όπως η συχνότητα σύζευξης (Curtsinger, 1991, Tregenza & Wedell, 1998, Yamane & Miyatake, 2005), η διάρκεια της σύζευξης (Andres & Rivera, 2000, Schafer & Uhl, 2002, Ward et al., 2002), και το χρονικό διάστηµα µεταξύ των διαδοχικών συζεύξεων (Eady et al. 2004, Pai et al., 2005), σε σχέση µε την αναπαραγωγική επένδυση που γίνεται κάτω από συνθήκες διαφορετικής έντασης σπερµατικού ανταγωνισµού. Ωστόσο, στο ζωικό βασίλειο είναι ευρύτατα διαδεδοµένο το φαινόµενο του ερµαφροδιτισµού, της ταυτόχρονης δηλαδή παρουσίας τόσο αρσενικού όσο και θηλυκού αναπαραγωγικού συστήµατος κατά τη διάρκεια µέρους ή ολόκληρης της ζωής κάποιου ατόµου. Έτσι, πολλές σύγχρονες µελέτες που διεξάγονται εντός του θεωρητικού πλαισίου της φυλοεπιλογής στρέφονται και σε ερµαφρόδιτα είδη. Παρόλά το γεγονός ότι στα είδη αυτά η ανάγκη συµβιβασµού των διαφορετικών συµφερόντων των δύο φύλων σε ένα άτοµο µπορεί να περιορίσει την ένταση της φυλοεπιλογής (Greeff & Michiels, 1999), η αφθονία και η ποικιλότητα των αναπαραγωγικών προτύπων που παρατηρούνται φανερώνει ότι οι πιέσεις της φυλοεπιλογής αποτελούν σηµαντικό παράγοντα της εξέλιξής τους (Rice, 1996). Ο ερµαφροδιτισµός ευνοείται όταν η ολική αναπαραγωγική επιτυχία του ερµαφρόδιτου ατόµου είναι µεγαλύτερη από αυτή που θα είχε το άτοµο αν ήταν γονοχωριστικό. Σύµφωνα µε το µοντέλο καταµερισµού των πόρων (resource allocation model) που κατασκευάστηκε από τον Charnov το 1979, όταν οι γαµέτες 14

16 που παράγονται κατά τη λειτουργία του αναπαραγωγικού συστήµατος (αρσενικού ή θηλυκού) ενός ατόµου είναι ιδιαίτερα ακριβοί από ενεργειακή άποψη -συµβαίνει δηλαδή ελαττούµενη ανταπόδοση (diminishing returns) από το σύστηµα αυτόείναι συµφερότερο να περιοριστεί η επένδυση σε αυτό το σύστηµα και το άτοµο να γίνει ερµαφρόδιτο. Έτσι, οι εναποµείναντες ενεργειακοί πόροι µπορούν να επενδυθούν στο άλλο αναπαραγωγικό σύστηµα που βρίσκεται στο ίδιο άτοµο, δεδοµένου ότι το επιπλέον ενεργειακό κόστος της ταυτόχρονης συντήρησης δύο αναπαραγωγικών συστηµάτων δεν υπερβαίνει το κέρδος που παρέχει στο άτοµο και στον πληθυσµό ο ερµαφροδιτισµός. Ελαττούµενη ανταπόδοση δηµιουργείται κυρίως από το αρσενικό αναπαραγωγικό σύστηµα και παρατηρείται συνήθως σε συνθήκες που δεν ευνοείται η σύζευξη µε πολλούς συντρόφους και η µεταφορά σπέρµατος σε πολλά άτοµα είναι είτε ιδιαίτερα δαπανηρή, είτε αδύνατη λόγω περιορισµένης κινητικότητας ή χαµηλής πληθυσµιακής πυκνότητας. Πολλά ερµαφρόδιτα ζώα είναι µικρόσωµα και δυσκίνητα ασπόνδυλα που αναπαράγονται σε τέτοιες συνθήκες (π.χ. πολύχαιτοι, βαλανοειδή κ.α.). Ωστόσο, σε περιπτώσεις που η πληθυσµιακή πυκνότητα είναι µεγάλη και η κινητικότητα δεν παρουσιάζει περιορισµούς η ελαττούµενη ανταπόδοση δεν µπορεί παρά να είναι αποτέλεσµα της ύπαρξης έντονης επιλεκτικής πίεσης κατά την εύρεση συντρόφου και τη γονιµοποίηση των ωαρίων, φαινόµενο που απορρέει από τη φυλοεπιλογή (Michiels, 1998). Στα ταυτόχρονα ερµαφρόδιτα ζώα (simultaneous hermaphrodites) αυτά δηλαδή που διαθέτουν ταυτόχρονα ώριµο και λειτουργικό αρσενικό και θηλυκό αναπαραγωγικό σύστηµα κατά το µεγαλύτερο µέρος της ζωής τους, τα αναπαραγωγικά συµφέροντα των δύο φύλων είναι συνήθως διαφορετικά και πολλές φορές αντικρουόµενα µε συνέπεια τα αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά των δύο φύλων να µην εξελίσσονται συµµετρικά. Πρόσφατες έρευνες τονίζουν την ύπαρξη 15

17 ανταγωνιστικής συνεξέλιξης µεταξύ αρσενικών και θηλυκών χαρακτηριστικών στα ζώα αυτά (Arnqvist & Rowe, 2005). ιάφορα θεωρητικά πρότυπα έχουν χρησιµοποιηθεί για να διαφωτίσουν την αναπαραγωγική συµπεριφορά των ταυτόχρονα ερµαφρόδιτων ζώων σε σχέση µε τα χαρακτηριστικά του αναπαραγωγικού τους συστήµατος, δεδοµένου ότι η αναλογία των αναπαραγωγικών πόρων που επενδύουν στην αρσενική και θηλυκή λειτουργία είναι µια σηµαντική στρατηγική για τη µεγιστοποίηση της αρµοστικότητάς τους (Charnov, 1982). Το µοντέλο ανταλλαγής γαµετών (gamete trading model, Leonard & Lukowiak, 1984), σύµφωνα µε το οποίο το φύλο που διατηρεί το µεγαλύτερο έλεγχο της µοίρας των γαµετών του είναι ο προτιµούµενος σεξουαλικός ρόλος, φαίνεται να έχει τη µεγαλύτερη προβλεπτική ισχύ (Leonard, 2005). Σύµφωνα µε αυτό το µοντέλο, τα ερµαφρόδιτα ζώα προτιµούν να ζευγαρώνουν στο σεξουαλικό ρόλο που δίνει τη µεγαλύτερη βεβαιότητα γονιµοποίησης εφόσον οποιαδήποτε επένδυση γίνεται στη σύζευξη από άποψη ενέργειας, χρόνου, κινδύνου θήρευσης κ.λπ. θα αυξήσει την αναπαραγωγική επιτυχία του ατόµου (Leonard, 2005). Ένα σοβαρό µειονέκτηµα των παραπάνω µοντέλων είναι η υπόθεση και από τα δύο ότι η προτίµηση σεξουαλικού ρόλου αποτελεί σταθερό χαρακτηριστικό του είδους. Η σοβαρή αυτή αδυναµία, δεδοµένου ότι σε πολλά ερµαφρόδιτα ζώα έχει παρατηρηθεί εναλλαγή ρόλων (Leonard, 2005, Anthes et al., 2006), ενισχυόµενη από το γεγονός ότι τα µοντέλα αυτά δεν έχουν εφαρµοστεί σε ευρύ φάσµα συνθηκών, περιορίζει την προβλεπτική τους ισχύ σε ορισµένα µόνο ερµαφροδιτικά συστήµατα αναπαραγωγής. Πιο πρόσφατα η υπόθεση αναλογίας σεξουαλικού ρόλου (gender ratio hypothesis) που προτάθηκε από τους Anthes et al., (2006) προσδίδει σηµαντικό ρόλο στη δυνατότητα εκτίµησης της ποιότητας του πιθανού σεξουαλικού συντρόφου αλλά και των συνθηκών που επικρατούν ανά πάσα στιγµή. Σύµφωνα µε αυτή την 16

18 υπόθεση η προτίµηση σεξουαλικού ρόλου εξαρτάται από την εκτίµηση της κατάστασης την οποία αντιµετωπίζει το ζώο πριν την κάθε σύζευξη και µπορεί να είναι διαφορετική τόσο µεταξύ πληθυσµών όσο και µεταξύ ατόµων του ίδιου πληθυσµού. Η υπόθεση αυτή παρέχει ένα ευρύτερο θεωρητικό πλαίσιο στις σχετικές έρευνες το οποίο ξεπερνάει το µειονέκτηµα που προαναφέρθηκε. Η βέλτιστη αναλογία επένδυσης στην αρσενική ή θηλυκή λειτουργία µπορεί να ποικίλει µε την πληθυσµιακή πυκνότητα. Σε πυκνότερους πληθυσµούς τα άτοµα ενδέχεται να εκτεθούν σε αυξηµένο κίνδυνο σπερµατικού ανταγωνισµού (Simmons & Siva - Jothy, 1998) εφόσον είναι πιθανό να αυξηθεί και ο µέσος αριθµός συζεύξεων, και ο µέσος αριθµός δοτών σπέρµατος ανά άτοµο. Η ένταση του σπερµατικού ανταγωνισµού µπορεί επίσης να ποικίλει στους διαφορετικούς πληθυσµούς λόγω επίδρασης περιβαλλοντικών παραγόντων. Έχει αναφερθεί ότι υπό αυτές τις συνθήκες αναµένεται αυξανόµενη συχνότητα σύζευξης καθώς και µεταφορά µεγαλύτερου αριθµού σπερµατοζωαρίων και συνεπώς, µεγαλύτερη επένδυση στην αρσενική αναπαραγωγική λειτουργία (Locher & Baur, 2000). Ωστόσο, άλλοι ερευνητές υποστηρίζουν ότι σε συνθήκες αυξηµένου σπερµατικού ανταγωνισµού η επένδυση σε µεγάλους αριθµούς σπερµατοζωαρίων µπορεί να µην οδηγήσει σε αύξηση της αρµοστικότητας και υπάρχει πιθανότητα τα ζώα να αναπτύξουν άλλους µηχανισµούς βελτιστοποίησης της αναπαραγωγικής τους επιτυχίας (Wade et al., 2003). Οι µέχρι τώρα έρευνες για τις στρατηγικές σύζευξης και τις προτιµήσεις σεξουαλικών ρόλων στα διάφορα ερµαφροδιτικά συστήµατα αναπαραγωγής έχουν εστιάσει την προσοχή τους στην επίδραση α) του σωµατικού µεγέθους (Angeloni et al., 2002, Angeloni 2003, Gianguzza et al., 2004), β) του µεγέθους της κοινωνικής οµάδας (Tan et al., 2004), και γ) της πληθυσµιακής πυκνότητας στους αναπαραγωγικούς χαρακτήρες των ερµαφρόδιτων ζώων (Michiels, 1999). Τέλος, άλλες έχουν στοχεύσει στη δηµιουργία µοντέλων πρόβλεψης της αναπαραγωγικής 17

19 συµπεριφοράς των ταυτόχρονα ερµαφρόδιτων ζώων που διαθέτουν ποικίλα συστήµατα σύζευξης (Leonard, 1990, 1999, Leonard & Lukowiak, 1984, 1991) Φυλοεπιλογή στα χερσαία πνευµονοφόρα γαστερόποδα Παράδειγµα ερµαφρόδιτων ζώων που εµφανίζονται σε µεγάλες πυκνότητες στη φύση και των οποίων η κινητικότητα είναι αρκετά µεγάλη είναι τα χερσαία πνευµονοφόρα γαστερόποδα (τάξη Stylommatophora). Αυτά, λοιπόν, αποτελούν κατάλληλη οµάδα για τη µελέτη των διαδικασιών της φυλοεπιλογής. Τα χερσαία πνευµονοφόρα γαστερόποδα είναι στην πλειονότητά τους ταυτόχρονα ερµαφρόδιτα ζώα Στις αναπαραγωγικές λειτουργίες συνήθως συµµετέχει τόσο το αρσενικό όσο και το θηλυκό γεννητικό σύστηµα του κάθε ατόµου. Τα ζώα αυτά εκτελούν τις δραστηριότητές τους µόνο όταν οι συνθήκες του περιβάλλοντος το επιτρέπουν, δηλαδή όταν η ατµοσφαιρική υγρασία είναι υψηλή συνήθως κατά τις νυχτερινές ώρες (Tompa, 1984). Επιπλέον, η διάρκεια της συζευκτικής συµπεριφοράς είναι µεγάλη (3 έως 12 ώρες) και το γεγονός αυτό αναγκάζει συνήθως τα χερσαία γαστερόποδα να επιλέγουν τυχαία το σύντροφό τους, εφόσον η διαδικασία µη τυχαίας επιλογής µπορεί να καταλήξει είτε σε αποτυχία εύρεσης συντρόφου, είτε σε θάνατο από έκθεση στις αντίξοες περιβαλλοντικές συνθήκες που επικρατούν την ηµέρα στην περίπτωση που η σύζευξη δεν προλάβει να ολοκληρωθεί στη διάρκεια της ευνοϊκής νυχτερινής περιόδου. Συνεπώς, η επένδυση που γίνεται στη σύζευξη από τα γαστερόποδα ποικίλει στους διαφορετικούς πληθυσµούς. Το γεγονός αυτό µπορεί να µεταβάλει την προτίµηση των σαλιγκαριών να ζευγαρώνουν µε έναν ιδιαίτερο σεξουαλικό ρόλο και τη σχετική επένδυση σε εκείνο τον ρόλο αν και το µοντέλο ανταλλαγής γαµετών, όπως και τα περισσότερα άλλα µοντέλα, υποθέτει ότι ένας ενιαίος σεξουαλικός ρόλος 18

20 θα είναι προτιµητέος για όλα τα άτοµα του είδους. Πολλοί παράγοντες, εν τούτοις, µπορούν να οδηγήσουν στην υιοθέτηση διαφορετικών στρατηγικών µεταξύ πληθυσµών ή ακόµα και µεταξύ ατόµων του ίδιου πληθυσµού, αντί µιας ενιαίας κοινής για το είδος στρατηγικής (Leonard, 2005). Το τυχαίο πρότυπο σύζευξης στα χερσαία πνευµονοφόρα γαστερόποδα δεν σηµαίνει αυτόµατα τυχαία γονιµοποίηση των ωαρίων τους. Η σύζευξη µε πολλούς συντρόφους και η ύπαρξη στο αναπαραγωγικό τους σύστηµα ενός γαµετολυτικού αδένα (σπερµατοκύστη) και ενός συµπλόκου οργάνου αποθήκευσης και γονιµοποίησης σπέρµατος (Εικόνα 1) αποτελούν ενδείξεις για τη λειτουργία σπερµατικού ανταγωνισµού καθώς και για τη δυνατότητα επιλογής του σπέρµατος που θα χρησιµοποιηθεί για τη γονιµοποίηση των ωαρίων. Αναλυτικά, όπως φαίνεται στην Εικόνα 1, τo αναπαραγωγικό σύστηµα των χερσαίων πνευµονοφόρων γαστεροπόδων (Tompa, 1984), αποτελείται από: 1. τη γονάδα (ovotestis), η οποία είναι υπεύθυνη για την παραγωγή τόσο του σπέρµατος όσο και των ωαρίων του ατόµου. 2. τον ερµαφροδιτικό αγωγό (hermaphroditic duct), µέσω του οποίου µεταφέρονται τα γεννητικά προϊόντα στη σπερµατοθήκη και στο µεσαίο τµήµα του οποίου, το σπερµατικό κυστίδιο (seminal vesicle), αποθηκεύεται το σπέρµα του ατόµου. 3. τη σπερµατοθήκη (fertilization pouch spermatheca complex), στην οποία λαµβάνει χώρα η γονιµοποίηση των ωαρίων αλλά και η αποθήκευση του ξένου σπέρµατος. 4. τον αδένα αλβουµίνης (albumen gland), στον οποίο παράγεται το αλβουµινικό υγρό που καλύπτει τα γονιµοποιηµένα αυγά κατά την έξοδό τους από τη σπερµατοθήκη. 19

21 5. τη σπερµατοκύστη (bursa copulatrix), η οποία είναι υπεύθυνη για την αποικοδόµηση και απορρόφηση της περίσσειας του σπέρµατος που παράγει το άτοµο, καθώς και του σπερµατοφόρου που δέχεται κατά τη σύζευξη. Αποτελείται από έναν σφαιρικό γαµετολυτικό αδένα και ένα ή περισσότερα στελέχη για την υποδοχή των σπερµατοφόρων. 6. το σπερµοωαγωγό (spermoviduct) δια µέσου του οποίου κινείται τόσο σπέρµα από και προς τη σπερµατοθήκη (αναλόγα µε το αν προέρχεται από το ίδιο το άτοµο ή από το σύντροφο του), όσο και ωάρια που κατέρχονται από τη σπερµατοθήκη στο γεννητικό άνοιγµα κατά την ωαπόθεση. 7. H µεταφορά των σπερµατοζωαρίων του ατόµου από το σπερµοωαγωγό στον επίφαλλο, όπου θα σχηµατιστεί το σπερµατοφόρο, γίνεται µέσω του απαγωγού καναλιού του σπέρµατος (vas deferens). 8. τα βοηθητικά γεννητικά όργανα (σάκος του ακοντίου, πρόσθιος αδένας κ.α.), κυριότερο εκ των οποίων είναι ο σάκος του ακοντίου (dart sac), όπου παράγεται το ακόντιο (dart), µια σκληρή βελονοειδής δοµή από χιτίνη ή ασβεστιο, η οποία εκτοξεύεται κατά τη σύζευξη και διατρυπά το σώµα του δέκτη. Το ακόντιο του δέκτη µεταφέρει ενα βλεννώδες έκκριµα που προετοιµάζει το γεννητικό του σύστηµα για την υποδοχή του σπερµατοφόρου, αυξάνοντας τη συχνότητα των περισταλτικών κινήσεων του στελέχους της σπερµατοκύστης (Koene & Chase, 1998a, Koene & Chase, 1998b). 9. το πέος (penis), το οποίο είναι ένα µυώδες όργανο που εισέρχεται στο γεννητικό άνοιγµα του συντρόφου κατά τη σύζευξη και διαµέσου του οποίου µεταφέρεται το σπερµατοφόρο του δότη στο στέλεχος του γαµετολυτικού αδένα του δέκτη. Η σύσπαση του πέους επιτυγχάνεται µε τη συστολή του ανελκτήρα µυ του πέους (penial retractor). 20

22 10. τον επίφαλλο (epiphallus) και το µαστίγιο (flagellum) στα οποία παρατηρείται ο σχηµατισµός του σπερµατοφόρου, µιας χιτινώδους δοµής στην οποία περικλείεται το σπέρµα που πρόκειται να µεταφερθεί κατά τη σύζευξη. Αλβουµινικός αδένας Μαστίγιο Γονάδα Ερµαφροδιτικός αγωγός Σπερµατοθήκη Σπερµατοκύστη Στέλεχος σπερµατοκύστης Σπερµοωαγωγός Βοηθητικός αγωγός Επίφαλλος Ανελκτήρας µυς πέους Πέος Απαγωγό κανάλι του σπέρµατος Γεννητικό άνοιγµα Βλεννογόνοι αδένες Ακόντιο Σάκος ακοντίου Εικόνα 1. Αναπαραγωγικό σύστηµα τoυ χερσαίου γαστερόποδου Helix aspersa. Figure 1. Reproductive system of the landsnail Helix aspersa. Η κύρια λειτουργία της σπερµατοκύστης θεωρείται ότι είναι η διάσπαση και απορρόφηση του επιπλέον σπέρµατος, τόσο του ίδιου του ζώου (αυτόσπερµα), όσο και του σπέρµατος που προέρχεται από τους σεξουαλικούς του συντρόφους (αλλόσπερµα) (Lind, 1973). Η υπόθεση αυτή ενισχύεται από την εύρεση κάποιων 21

23 ενζύµων (RNAσες, δεσοξυριβονουκλεάσες και υδρολάσες) µέσα στη σπερµατοκύστη (Rogers et al., 1980) Η σπερµατοθήκη βρίσκεται στο τελικό άκρο του ερµαφροδιτικού αγωγού, είτε ενσωµατωµένη στον αλβουµινικό αδένα (όπως συµβαίνει στο Helix aspersa), είτε ανεξάρτητη από αυτόν (όπως στην Aguispira alternate). Αποτελείται από δύο τµήµατα: α) το χώρο γονιµοποίησης (fertilization chamber) και β) ένα ή περισσότερα τυφλά σωληνάρια (spermathecal tubules). Ο χώρος γονιµοποίησης είναι ένας πεπλατυσµένος σάκος που έχει κοινή είσοδο µε τα σωληνάρια της σπερµατοθήκης. Τα σωληνάρια αποτελούνται από κιονοειδές επιθήλιο και περιβάλλονται από µυϊκό ιστό. Εξωτερικά η σπερµατοθήκη περικλείεται από συνδετικό ιστό και παρουσιάζει πλούσια νεύρωση (Tompa, 1984). Τα σωληνάρια έχουν ως κύρια λειτουργία την αποθήκευση του ξένου σπέρµατος µετά τη σύζευξη. Έχει αποδειχθεί ότι άτοµα που δεν συζεύχθηκαν ή που αφέθηκαν να συζευχθούν αλλά εµποδίσθηκε η µετακίνηση του ξένου σπέρµατος στον σπερµοωαγωγό, κόβοντας τις ουρές των σπερµατοφόρων, δεν διαθέτουν σπέρµα στα σωληνάρια της σπερµατοθήκης τους, γεγονός που υποδηλώνει ότι η σπερµατοθήκη δεν αποθηκεύει σπέρµα του ίδιου του ατόµου. Το σπέρµα του κάθε ατόµου περνά κατευθείαν από τον ερµαφροδιτικό αγωγό µέσω του χώρου γονιµοποίησης στον σπερµοωαγωγό χωρίς να εισέλθει στα τυφλά σωληνάρια της σπερµατοθήκης (Lind, 1973). Ιστολογική µελέτη της σπερµατοθήκης στο είδος Arianta arbustorum έδειξε ότι το τµήµα που συνδέει το χώρο γονιµοποίησης µε το κύριο σωληνάριο καλύπτεται µε πυκνό βλεφαριδοφόρο επιθήλιο, το οποίο εµποδίζει την αναστροφή των σπερµατοζωαρίων και την είσοδό τους στα σωληνάρια επιτρέποντας τα να κινηθούν µόνο προς την κατεύθυνση του σπερµοωαγωγού (Bojat et al., 2001). 22

24 Το αποθηκευµένο σπέρµα µπορεί να παραµείνει στη σπερµατοθήκη για µεγάλο χρονικό διάστηµα χωρίς να χάσει τη λειτουργικότητά του. Στο τροπικό σαλιγκάρι Limicolaria flammea βρέθηκε λειτουργικό σπέρµα 108 ηµέρες µετά την τελευταία σύζευξη, ενώ οι αντίστοιχοι χρόνοι για τα Limicolaria martensiana, Achatina fulica, Macrochlamys indica και Cepaea nemoralis είναι 520 ηµέρες, 341 ηµέρες, 476 ηµέρες και 4 χρόνια (Baur, 1998). Ο αριθµός των τυφλών σωληναρίων που περιέχει η σπερµατοθήκη ποικίλλει µεταξύ των διαφόρων ειδών των σαλιγκαριών. Έτσι τα διάφορα είδη σαλιγκαριών που έχουν µελετηθεί έχουν διαιρεθεί σε τέσσερις κατηγορίες ανάλογα µε το αν διαθέτουν σπερµατοθήκη µε: α) απλό χώρο γονιµοποίησης και ένα τυφλό σωληνάριο χωρίς θύλακες (π.χ. Bradybaena fruticum) β) χώρο γονιµοποίησης µε θύλακες και ένα τυφλό σωληνάριο χωρίς θύλακες (π.χ. Trichia hispida) γ) απλό χώρο γονιµοποίησης και πολλά τυφλά σωληνάρια (π.χ. Oreohelix strigosa) δ) χώρο γονιµοποίησης µε θύλακες και πολλά τυφλά σωληνάρια (π.χ. Triodopsis multilineata) (Tompa, 1984). Όπως προαναφέρθηκε, η πολυπλοκότητα που παρατηρείται στις σπερµατοθήκες των γαστεροπόδων τόσο στα διάφορα είδη όσο και µεταξύ των ατόµων του ίδιου είδους αποτελεί ισχυρή ένδειξη για τη λειτουργία σπερµατικού ανταγωνισµού ή και πιθανή επιλεκτική λειτουργία του θηλυκού αναπαραγωγικού συστήµατος εφόσον καθιστά δυνατή την αποθήκευση σπέρµατος περισσοτέρων του ενός ατόµων. Το τελευταίο, βέβαια, προϋποθέτει το γεγονός της πολλαπλής σύζευξης στην πλειονότητα των ειδών. Πολλαπλή σύζευξη µε διαφορετικούς συντρόφους κατά τη διάρκεια µιας αναπαραγωγικής περιόδου έχει αναφερθεί για τα είδη Helix pomatia (Lind, 1988), 23

25 Cepaea nemoralis (Wolda, 1963, Murray, 1964), Helix aspersa (Madec & Daguzan 1993) και Arianta arbustorum (Baur, 1988). Ανάλυση πατρότητας σε αυγά της Arianta arbustorum έδειξε ότι τουλάχιστον το 63% των ατόµων που µελετήθηκαν χρησιµοποίησαν σπέρµα από δύο ή περισσότερους συντρόφους (Baur, 1998). Από τα παραπάνω φαίνεται ότι η οµάδα των χερσαίων γαστερόποδων δίνει πολλές δυνατότητες για µελέτη της φυλοεπιλογής στα ζώα αυτά. Ωστόσο πολύ λίγες έρευνες επικεντρώθηκαν σε θέµατα φυλοεπιλογής µε εξαίρεση µελέτες στην Arianta arbustorum, oι οποίες έδειξαν ότι η βιωσιµότητα των απογόνων είναι µεγαλύτερη στα άτοµα που ζευγαρώνουν µε πολλούς συντρόφους (Baur, 1988), ότι σε αναπαραγωγικά αποµονωµένους πληθυσµούς υπάρχει προτίµηση στα άτοµα της ίδιας περιοχής κατά την επιλογή συντρόφου (Baur & Baur, 1992), ότι στη φύση απαντάται πολλαπλή πατρότητα σε αυτό το είδος (Baur, 1994), ότι τα άτοµα που παράγουν µεγαλύτερες ποσότητες σπέρµατος παράγουν επίσης και περισσότερα αβγά (Baur et al., 1998), ότι η ένταση του σπερµατικού ανταγωνισµού δεν επηρεάζει την πολυπλοκότητα της σπερµατοθήκης αυτού του είδους (Baminger & Haase, 1999) και ότι η ενέργεια που δαπανάται για την παραγωγή γαµετών επηρεάζεται σε µεγάλο βαθµό από το θηλυκό τµήµα του γεννητικού συστήµατος (Locher & Baur, 2000). Πρόσφατες εργασίες στην Arianta arbustorum έδειξαν σηµαντική ενδοειδική διαφοροποίηση στον αριθµό των σωληναρίων της σπερµατοθήκης και τον όγκο της, αλλά όχι στο µήκος της (Beese et al., 2006a). Επίσης αναφέρθηκε θετική αλλοµετρική συυσχέτιση, του µήκους του στελέχους της σπερµατοκύστης (bursa duct diverticulum) µε το µέγεθος του σαλιγκαριού καθώς και µεγάλη φαινοτυπική ποικιλότητα της δοµής αυτής (Beese et al., 2006b). Αντίστοιχες µελέτες στο Helix aspersa έδειξαν παρόµοια αποτελέσµατα, δηλαδή ότι υπάρχει τάση των σαλιγκαριών να ζευγαρώνουν µε άτοµα ίδιας διάθεσης για σύζευξη (Fearnley, 1996), και ότι παρουσιάζεται αύξηση του αποθηκευµένου 24

26 σπέρµατος στα άτοµα που δέχονται ακόντιο από το σύντροφό τους στη διάρκεια της ερωτοτροπίας, υποδηλώνοντας επιρροή του ακοντίου στη µετασυζευκτική φυλοεπιλογή (Rogers & Chase, 2001). Επίσης πειράµατα διπλής σύζευξης µε τη χρησιµοποίηση ώριµων γεννητικών ζώα που είχαν ήδη ζευγαρώσει στο πεδίο έδειξαν ότι η πιθανότητα πατρότητας του τελευταίου σεξουαλικού συντρόφου (P 2 ) είναι µικρότερη από αυτήν του αµέσως προηγούµενου (Rogers & Chase, 2002). Τα ίδια αποτελέσµατα έδωσαν και πειράµατα διπλής σύζευξης µε τη χρησιµοποίηση παρθένων σαλιγκαριών. Και σε αυτή τη περίπτωση επιβεβαιώθηκε η προτεραιότητα του πρώτου σεξουαλικού συντρόφου (P 1 > P 2 ) σε σχέση µε τον δεύτερο (Evanno et al., 2005) Συστηµατική κατάταξη, γεωγραφική εξάπλωση και βιολογία αναπαραγωγής του Helix aspersa To είδος Helix aspersa Müller, (oνοµάζεται επίσης καφέ σαλιγκάρι ή σαλιγκάρι του κήπου, Εικόνα 2), περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον O.F. Müller το Σήµερα υπάρχουν δύο αντικρουόµενες απόψεις για την ονοµασία του είδους αυτού. Σύµφωνα µε τον κατάλογο των Ευρωπαϊκών ειδών χερσαίων Μαλακίων (CLECOM, 2001 edition, Bank et al., 2001) το είδος τοποθετείται στο γένος Cornu BORN 1778 και αναφέρεται ως Cornu aspersum aspersum (O.F.MÜLLER, 1774). Αντίθετα σύµφωνα µε τους Giusti et al. (1996), το είδος αυτό τοποθετείται µαζί µε το είδος Cantareus apertus (BORN 1778) σε ένα κοινό για τα δύο είδη γένος, το γένος Cantareus RISSO Έχει εισαχθεί σε πολλά µέρη του κόσµου είτε εκούσια, ως εδώδιµο είδος, είτε ακούσια. Βρίσκεται σχεδόν σε όλες τις Μεσογειακές χώρες και στις Ευρωπαϊκές ακτές του Ατλαντικού (Chevallier, 1980). Όσον αφορά στην αναπαραγωγή του είναι 25

27 ταυτόχρονα ερµαφρόδιτο και υποχρεωτικά ετερογονιµοποιούµενο είδος. εν έχει παρατηρηθεί ποτέ αυτογονιµοποίηση στο συγκεκριµένο είδος, µια και το σπέρµα που παράγει το χρησιµοποιεί κατά την ανταλλαγή σπέρµατος µε ένα άλλο άτοµο. Εικόνα 2. Το σαλιγκάρι των κήπων Helix aspersa Figure 2. The garden snail Helix aspersa Η συστηµατική του κατάταξη είναι: Βασίλειο Φύλο Κλάση Τάξη Υποτάξη : Animalia (Ζώα) : Mollusca (Μαλάκια) : Gastropoda (Γαστερόποδα) : Pulmonata (Πνευµονοφόρα) : Stylommatophora (Στυλοµµατοφόρα) Οικογένεια : Helicidae (Ελικοειδή) Γένος Είδος : Helix : Helix aspersa Όσον αφορά στην κατανοµή του σύµφωνα µε τον Burch (1960), το Helix aspersa απαντάται στις περιοχές της Μεγάλης Βρετανίας, της υτικής Ευρώπης και στις χώρες που βρίσκονται γύρω από τη Μεσόγειο και τη Μαύρη Θάλασσα. 26

28 Επιπρόσθετα το είδος αυτό έχει εισαχθεί και στα νησιά του Ατλαντικού, στη Νότιο Αφρική, στην Αϊτή, στη Νέα Ζηλανδία, στην Αυστραλία, στο Μεξικό, στη Χιλή και στην Αργεντινή, αποτελεί δηλαδή πλέον κοσµοπολίτικο είδος. Όσον αφορά στην περιοχή των Ηνωµένων Πολιτειών, το Helix aspersa απαντάται στην Καλιφόρνια και κατά µήκος των δυτικών ακτών βόρεια της Βρετανικής Κολοµβίας και του Καναδά, καθώς επίσης και στις περισσότερες από τις νότιες πολιτείες και κατά µήκος της ανατολικής ακτής βόρεια του New Jersey. Στις περιοχές αυτές θεωρείται επικίνδυνο παράσιτο των καλλιεργειών σιτηρών και των καλλωπιστικών φυτών, όπως καταγράφηκε στην Καλιφόρνια (Capinera, 2001). Το Helix aspersa είναι ίσως το πλέον µελετηµένο είδος χερσαίου γαστερόποδου σε θέµατα βιολογίας, οικολογίας και γενετικής πληθυσµών. Είναι είδος που διατηρείται, αυξάνεται και αναπαράγεται µε ευκολία σε εργαστηριακές συνθήκες. Όσον αφορά στη βιολογία αναπαραγωγής του, έχουν γίνει λεπτοµερείς καταγραφές της προσυζευκτικής και συζευκτικής συµπεριφοράς του από τους Giusti & Lepri (1978), Tompa (1984), Chung (1987) και Adamo & Chase (1988). Επίσης σηµαντικές έρευνες έχουν δηµοσιευθεί πρόσφατα σχετικά µε τη λειτουργική σηµασία της εκτόξευσης του ακοντίου πριν τη σύζευξη (Adamo & Chase, 1990, Koene & Chase, 1998a,b, Rogers & Chase, 2001, Landolfa et al., 2001). Τέλος έχουν γίνει εκτεταµένες µελέτες στη γεωγραφική διακύµανση, τη φαινοτυπική ποικιλότητα και την ποσοτική γενετική των αναπαραγωγικών χαρακτήρων του (Madec & Daguzan, 1993; Madec et al., 1998, 2000; Dupont-Nivet et al., 1998). Στόχος των περισσότερων από αυτές τις εργασίες ήταν η εκτίµηση της αναπαραγωγικής απόδοσης των µελετούµενων πληθυσµών, σε σχέση µε τις στρατηγικές του βιολογικού κύκλου σε µεγάλο τµήµα της γεωγραφικής εξάπλωσης του είδους. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, το Helix aspersa είναι ένα από τα είδη για το οποίο υπάρχουν αναφορές για πολλαπλές συζεύξεις κατά τη διάρκεια της 27

29 αναπαραγωγικής περιόδου. Ωστόσο η δοµή της σπερµατοθήκης δεν έχει µελετηθεί επαρκώς. Η πολυπλοκότητα της σπερµατοθήκης, η οποία είναι και το αποθηκευτικό όργανο του σπέρµατος, αντικατοπτρίζει τη δυνατότητα επιλογής σπέρµατος και δίνει πληροφορίες για ενδεχόµενο σπερµατικό ανταγωνισµό µεταξύ των σπερµατοζωαρίων που προέρχονται από διαφορετικούς συντρόφους, καθώς και άδηλης επιλογής που ασκείται στα σπερµατοζωάρια από το θηλυκό αναπαραγωγικό σύστηµα. Επίσης, παρόλες τις πολυάριθµες πληροφορίες που υπάρχουν, λείπουν λεπτοµερείς έρευνες στη πληθυσµιακή ποικιλότητα αναπαραγωγικών χαρακτήρων, όπως η διάρκεια σύζευξης και/ή η διάθεση για σύζευξη, η οποία οδηγεί σε διαφορετικά επίπεδα σπερµατικού ανταγωνισµού στους τοπικούς πληθυσµούς. Ακόµη, πολύ λίγα είναι γνωστά για τους παράγοντες που επηρεάζουν τους παραπάνω χαρακτήρες ή την επίδραση των διαφορετικών επιπέδων έντασης σπερµατικού ανταγωνισµού στην αναπαραγωγική απόδοση των ατόµων και τη βιωσιµότητα των πληθυσµών. 28

30 1.6. Σκοπός της διατριβής Θέµα της παρούσας διατριβής αποτελεί η µελέτη ηθολογικών και µορφολογικών αναπαραγωγικών χαρακτηριστικών του χερσαίου γαστερόποδου Helix aspersa στο θεωρητικό πλαίσιο της φυλοεπιλογής. Πιο συγκεκριµένα, σκοπός της διατριβής ήταν η µελέτη της πληθυσµιακής ποικιλότητας των χαρακτηριστικών αυτών και η συσχέτισή της µε κλιµατικούς ή κοινωνικούς παράγοντες που επηρεάζουν ή και καθορίζουν το επίπεδο της έντασης του σπερµατικού ανταγωνισµού. Επιµέρους στόχους της διατριβής αποτελούσαν τα παρακάτω ερωτήµατα αν και µε ποιο τρόπο τα σαλιγκάρια διαφοροποιούν τη συζευκτική τους συµπεριφορά σε πληθυσµούς στους οποίους αντιµετωπίζουν διαφορετικά επίπεδα σπερµατικού ανταγωνισµού, αν τα ηθολογικά και µορφολογικά χαρακτηριστικά του κάθε πληθυσµού διαµορφώνονται οντογενετικά ή αποτελούν σταθερά κληρονοµήσιµα χαρακτηριστικά, αν η µορφολογία του οργάνου αποθήκευσης σπέρµατος παρουσιάζει διαφορές στα διαφορετικά επίπεδα σπερµατικού ανταγωνισµού, αν η δοµή της σπερµατοθήκης καθορίζεται γενετικά, αν στους διαφορετικούς πληθυσµούς η σύζευξη είναι τυχαία αναφορικά µε τη συγγένεια των σεξουαλικών συντρόφων και αν παρατηρείται οµοµικτικός υποβιβασµός στο είδος. 29

31 2.YΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 2.1 Eργασία στο πεδίο (προέλευση και συλλογή των δειγµάτων) Μελετήθηκαν πέντε πληθυσµοί του είδους Ηelix aspersa (Εικόνα 3): οι πληθυσµοί Α, Β και C από την ευρύτερη περιοχή της Ναυπάκτου κοντά στο χωριό Καστράκι και οι πληθυσµοί D και Ε από την ευρύτερη περιοχή του Ναυπλίου κοντά στο χωριό Ασίνη Οι πληθυσµοί διέφεραν ως προς την πυκνότητα (αριθµό ατόµων ανά m 2 ) και τις συνθήκες του µικροκλίµατος. Εικόνα 3. Χάρτης των περιοχών δειγµατοληψίας Figure 3. Map of the sampling regions Ο πληθυσµός Α (Εικόνα 4) προερχόταν από έναν εγκαταλειµµένο κήπο δίπλα σε έναν επαρχιακό δρόµο, µε δέντρα, θάµνους, φτέρες και τσουκνίδες. Οι πληθυσµοί Β και C (Εικόνες 5 και 6 αντίστοιχα) προέρχονταν από τις δύο απέναντι πλευρές ενός αγρού µε τριφύλλι, το οποίο βρισκόταν σε απόσταση περίπου 3 km από τον πληθυσµό Α. Συγκεκριµένα, ο πληθυσµός Β βρισκόταν στην πλευρά του χωραφιού που συνόρευε µε το δρόµο, η οποία καλυπτόταν από χαµηλούς θάµνους και µικρά 30

32 ελαιόδενδρα, ενώ ο πληθυσµός C βρισκόταν στην απέναντι πλευρά, σε απόσταση περίπου 200 m από το δρόµο, συνόρευε µε ένα ρυάκι και καλύπτονταν από µεγάλα ελαιόδενδρα και οπωροφόρα δένδρα. Οι πληθυσµοί του Ναυπλίου (D και Ε, Εικόνες 7 και 8 αντίστοιχα) προερχόταν από ποτιζόµενα χωράφια µε εσπεριδοειδή, τα οποία απείχαν περίπου 1 km το ένα από το άλλο. Τα χωράφια αυτά ποτίζονταν µε αυτόµατο σύστηµα συνεχώς κατά τους εαρινούς και φθινοπωρινούς µήνες. Συνεπώς, κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής περιόδου η καλλιεργητική αυτή πρακτική δηµιουργούσε στο ενδιαίτηµα των σαλιγκαριών πολύ ευνοϊκές συνθήκες υγρασίας για την επιτέλεση των αναπαραγωγικών δραστηριοτήτων τους. Η αρχική επίσκεψη και επιλογή των πληθυσµών έγινε το Μάιο του Κατά το τέλος του καλοκαιριού 2001, πριν την έναρξη της αναπαραγωγικής περιόδου του φθινοπώρου, έγινε εκτίµηση της πυκνότητας του κάθε πληθυσµού µε τη µέθοδο των τυχαίων τετραγώνων. Tο µέγεθος του τετραγώνου που χρησιµοποιήθηκε ήταν 0,25 x 0,25 m. Η πυκνότητα των πληθυσµών µετρήθηκε δύο φορές, µία στις αρχές του φθινοπώρου, οπότε αρχίζει η αναπαραγωγική δραστηριότητα στο πεδίο και µία το Μάιο, όπου έχουµε το µέγιστο της δραστηριότητάς τους. Εικόνα 4. Άποψη του εγκαταλειµµένου κήπου έξω από το χωριό Καστράκι της ευρύτερης περιοχής της Ναυπάκτου από τον οποίο προήλθε ο πληθυσµός Α Figure 4. The abandoned garden outside Kastraki village in the region of Nafpaktos where snails of population A were collected 31

33 Εικόνα 5. Άποψη της άκρης του καλλιεργούµενου αγρού έξω από το χωριό Καστράκι από όπου προήλθε ο πληθυσµός Β Figure 5. The road edge of the cultivated field outside Kastraki village where snails of population B were collected Εικόνα 6. Άποψη της αντίθετης πλευράς του καλλιεργούµενου αγρού έξω από το χωριό Καστράκι από όπου προήλθε ο πληθυσµός C Figure 6. The opposite edge of the cultivated field outside Kastraki village where snails of population C were collected 32

34 Εικόνα 7. Άποψη του πορτοκαλεώνα έξω από το χωριό Ασίνη στην ευρύτερη περιοχή του Ναυπλίου από όπου προήλθε ο πληθυσµός D Figure 7. The orange tree field outside Asini village near Nafplion where snails of population D were collected Εικόνα 8. Άποψη του πορτοκαλεώνα έξω από το χωριό Ασίνη στην ευρύτερη περιοχή του Ναυπλίου από όπου προήλθε ο πληθυσµός Ε Figure 8. The orange tree field outside Asini village near Nafplion where snails of population Ε were collected 33

35 2.2 Εργασία στο εργαστήριο (συνθήκες παρατηρήσεων και εκτροφής) Πατρική γενεά (P) Από τους πέντε πληθυσµούς που επιλέχθηκαν συλλέχθηκαν ώριµα γεννητικά άτοµα (ως ένδειξη ωριµότητας εκλήφθηκε το γυρισµένο χείλος του περιστοµίου) και µεταφέρθηκαν στο εργαστήριο, όπου µετρήθηκε η µέγιστη διάµετρος (D) και το ύψος (Η) του κελύφους µε τη βοήθεια παχυµέτρου ακρίβειας 0,05 mm. Τα ζώα τοποθετήθηκαν σε γυάλινα κιβώτια διαστάσεων 40 cm x 50 cm x 20 cm και για χρονικό διάστηµα 3 µηνών παρακολουθήθηκε η αναπαραγωγική τους δραστηριότητα. Πιο συγκεκριµένα, για κάθε έναν από τους πέντε πληθυσµούς υπήρχαν 5-7 κιβώτια µεγέθους 20 cm x 20 cm x 40 cm µε 14 ζώα στο κάθε κιβώτιο, ώστε η πυκνότητα της βιοµάζας ανά κιβώτιο να είναι περίπου 26 kg/m 3 σε όλους τους πληθυσµούς. Παρόµοια πυκνότητα έχει χρησιµοποιηθεί σε πειράµατα ξένων ερευνητών (Madec et al., 1998). Η επιλογή της πυκνότητας µέσα στα κιβώτια είναι σηµαντική επειδή είναι γνωστό ότι σε µεγάλες πυκνότητες παρατηρείται πτώση της αναπαραγωγικής δραστηριότητας (Daguzan & Verly, 1989, Fearnley, 1996). Επίσης η πυκνότητα επιλέχθηκε µε κριτήριο τη δυνατότητα σύγκρισης των αποτελεσµάτων που θα προέκυπταν µε άλλα προηγούµενων µελετών. Εδώ θα πρέπει να τονισθεί ότι η πυκνότητα διέφερε µεταξύ των πληθυσµών που µελετήθηκαν και ένας από τους στόχους της έρευνας αφορούσε στην αναζήτηση πυκνοεξαρτώµενων διαφορών στη συµπεριφορά. Στο σχεδιασµό του πειράµατος χρησιµοποιήθηκαν ίδιες πυκνότητες στα κιβώτια όλων των πληθυσµών µε το σκεπτικό ότι οποιαδήποτε παρατηρούµενη διαφορά θα οφειλόταν σε οντογενετική προσαρµογή της συµπεριφοράς των σαλιγκαριών κάτω από συνθήκες διαφορετικής πυκνότητας κατά τη διάρκεια της αύξησής τους στο πεδίο. 34

36 Τα άτοµα του κάθε πληθυσµού σηµαδεύτηκαν µε διαφορετικά χρώµατα και αριθµούς. Η υγρασία µέσα στα κιβώτια διατηρούνταν σε υψηλά επίπεδα (περίπου 90%) µε τη βοήθεια υγρού σπόγγου που τοποθετήθηκε στον πυθµένα του κάθε κιβωτίου. Τα κιβώτια τοποθετήθηκαν σε δωµάτιο όπου επικρατούσαν φυσικές συνθήκες θερµοκρασίας και φωτοπεριόδου. Κατά τα τέλη Νοεµβρίου και το εκέµβριο, η θερµοκρασία διατηρούνταν σταθερή στους 16 ο C, µε τη βοήθεια θερµαντικού σώµατος. Η τροφή αποτελούνταν από διάφορα λαχανικά (µαρούλι, λάχανο, καρότο) και προσφερόταν σε περίσσεια. Σε κάθε κιβώτιο υπήρχε ένα δοχείο µε νερό και µαρµαρόσκονη για την παροχή ασβεστίου. Χρησιµοποιήθηκαν 5 κιβώτια για τον πληθυσµό A, 7 για τον B, 6 για τον C, 6 για τον D και 7 για τον E. 2.3 Καταγραφές των παρατηρούµενων αναπαραγωγικών χαρακτήρων Η συνεχής παρακολούθηση της αναπαραγωγικής δραστηριότητας άρχιζε τις απογευµατινές ώρες (18:00 µµ) και συνεχιζόταν µέχρι τις πρώτες πρωινές ώρες (8:00 µµ). Κατά τις νυχτερινές ώρες οι παρατηρήσεις γινόταν µε τη βοήθεια ερυθρού φωτός. Κατά τη διάρκεια της ηµέρας η παρακολούθηση γινόταν κάθε 1 ώρα µέχρι το επόµενο απόγευµα ώστε να εντοπισθούν τυχόν απόπειρες σύζευξης. Στις περιπτώσεις εκείνες όπου εντοπιζόταν τέτοια συµπεριφορά η παρατήρηση ήταν συνεχής ώστε να εντοπισθεί ο ακριβής χρόνος έναρξης και τερµατισµού της σύζευξης. Για κάθε σαλιγκάρι καταγραφόταν ο αριθµός και η χρονική διάρκεια των συζεύξεων, ο χρόνος από την έναρξη της δραστηριότητας µέχρι την πρώτη σύζευξη, ο χρόνος µεταξύ των διαδοχικών συζεύξεων και ο χρόνος µεταξύ της τελευταίας σύζευξης και της πρώτης ωοαπόθεσης. Η διάρκεια της προσυζευκτικής συµπεριφοράς δεν συµπεριλήφθηκε στη διάρκεια της σύζευξης. Ως αρχή της σύζευξης ορίστηκε η αµοιβαία εισχώρηση 35

37 του πλήρως εκτεταµένου πέους του ενός συντρόφου στη γεννητική οπή του άλλου, ενώ ως τέλος της σύζευξης η αµοιβαία απόσυρση των πεών. Επίσης, καταγράφονταν οι ηµεροµηνίες θανάτων. ύο εβδοµάδες µετά την έναρξη της αναπαραγωγικής δραστηριότητας των σαλιγκαριών, µέσα στα κιβώτια τοποθετήθηκαν γλαστράκια µε ροκανίδι για να αποθέσουν τα ζώα τα αβγά τους. Τα ζώα που εντοπίζονταν να ωoαποθέτουν δεν ενοχλούνταν, αλλά απλώς σηµειωνόταν η θέση τους στο γλαστράκι έτσι ώστε µετά την αποµάκρυνση τους να είναι δυνατή η αναγνώριση της µητρότητας της κάθε ωoαπόθεσης Στη συνέχεια τα αβγά συλλέγονταν, και τοποθετούνταν σε δοχείο εκκόλαψης, όπου αναγράφονταν ο γονέας, η ηµεροµηνία της ωοαπόθεσης και εάν ήταν η πρώτη ή η δεύτερη της συγκεκριµένης αναπαραγωγικής περιόδου για το συγκεκριµένο ζώο. Ως δοχεία εκκόλαψης χρησιµοποιήθηκαν πλαστικά δοχεία petri καλυµµένα µε υγρό διηθητικό χαρτί και σκεπασµένα µε καπάκι. Σε κάθε ωαπόθεση µετρήθηκε η διάµετρος του 30% των αβγών τουλάχιστον, µε τη βοήθεια παχυµέτρου ακρίβειας 0,05 mm. Τα δοχεία εκκόλαψης ελέγχονταν καθηµερινά και τα νεοεκκολαφθέντα σαλιγκάρια αποµακρύνονταν αµέσως για να αποφευχθούν φαινόµενα κανιβαλισµού. Για την κάθε ωοαπόθεση σηµειώθηκε ο ρυθµός εκκόλαψης και η εκκολαπτική επιτυχία. Τα νεαρά σαλιγκάρια τοποθετήθηκαν σε πλαστικά δοχεία εκτροφής µεγέθους 5cm x 6cm x 5cm για να αυξηθούν και καταγράφηκε η βιωσιµότητα τους µετά τις πρώτες 40 ηµέρες. Η αναπαραγωγική περίοδος διαιρέθηκε σε διαδοχικές φάσεις, οι οποίες υπολογίστηκαν ξεχωριστά για το κάθε σαλιγκάρι και είναι οι εξής: α) ο χρόνος µεταξύ πρώτης και τελευταίας σύζευξης (χρονική περίοδος συζεύξεων, Χ.Π.Σ.), β) ο χρόνος µεταξύ τελευταίας σύζευξης και πρώτης ωοαπόθεσης (Χ.Π.Σ.Ω.), γ) ο χρόνος µεταξύ ωοαπόθεσης και της αρχής της εκκόλαψης (Χ.Π.Ω.Ε.) και δ) η διάρκεια 36