Γαρεφαλάκη Μαρίνα-Έλενα ΒΙΟΛΟΓΟΣ. Μελέτη της διαπληθυσμιακής ποικιλότητας της. συμπεριφοράς αναπαραγωγής και του σπερματικού

Transcript

1 ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Γαρεφαλάκη Μαρίνα-Έλενα ΒΙΟΛΟΓΟΣ Μελέτη της διαπληθυσμιακής ποικιλότητας της συμπεριφοράς αναπαραγωγής και του σπερματικού ανταγωνισμού στο εδώδιμο σαλιγκάρι Helix aspersa ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2010 I

2 FACULTY OF SCIENCES SCHOOL OF BIOLOGY Garefalaki Marina-Elena BIOLOGIST Study of intraspecific differentiation of mating behaviour and sperm competition in the edible snail Helix aspersa DOCTORAL THESIS THESSALONIKI 2010 II

3 Συμβουλευτική Επιτροπή: Αμπατζόπουλος Θεόδωρος Λαζαρίδου Μαρία Στάικου Αλεξάνδρα Εξεταστική Επιτροπή: Αμπατζόπουλος Θεόδωρος Κυριακοπούλου-Σκλαβούνου Πασχαλίνα Λαζαρίδου Μαρία Σκούρας Ζαχαρίας Στάικου Αλεξάνδρα Στάμου Γεώργιος Τριανταφυλλίδης Αλέξανδρος Καθηγητής ΑΠΘ Καθηγήτρια ΑΠΘ Επίκουρη Καθηγήτρια ΑΠΘ Καθηγητής ΑΠΘ Αναπληρώτρια Καθηγήτρια ΑΠΘ Καθηγήτρια ΑΠΘ Καθηγητής ΑΠΘ Επίκουρη Καθηγήτρια ΑΠΘ Καθηγητής ΑΠΘ Επίκουρος Καθηγητής ΑΠΘ Το έργο συγχρηματοδοτείται κατά: 75% της Δημόσιας Δαπάνης από την Ευρωπαϊκή Ένωση Ευρωπαϊκό Κοινοτικό Ταμείο 25% της Δημόσιας Δαπάνης από το Ελληνικό Δημόσιο Υπουργείο Ανάπτυξης Γενική Γραμματεία Έρευνας και Τεχνολογίας και από τον Ιδιωτικό Τομέα στα πλαίσια του Μέτρου 8.3 του Ε.Π. Ανταγωνιστικότητα Γ Κοινοτικό Πλαίσιο Στήριξης. «Η έγκριση της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής από το Τμήμα Βιολογίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως» (Ν. 5343/1932, άρθρο 202, παρ.2) III

4 «Αποσπασμένες από τον οργανισμό οι αλληλουχίες του DNA δεν αποτελούν τίποτα περισσότερο ή λιγότερο ενδιαφέρον από ότι τα οστά και τα άνθη. Ειδωμένες μέσα στο πλαίσιο του οργανισμού δίνουν όμως θεμελιώδη επίγνωση τη ζωής και την ιστορίας της.» Futuyma, Εξελικτική Βιολογία IV

5 στο Γιώργο μου V

6 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η διδακτορική αυτή διατριβή πραγματοποιήθηκε στον τομέα Ζωολογίας του τμήματος Βιολογίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Σημαντικό μέρος της έρευνας έγινε σε συνεργασία με τον τομέα Γενετικής Ανάπτυξης και Μοριακής Βιολογίας του ίδιου τμήματος. Ένα μεγάλο ευχαριστώ θα ήθελα να απευθύνω στην επιβλέπουσα καθηγήτρια της διδακτορικής διατριβής, την κυρία Αλεξάνδρα Στάικου για την ευκαιρία που μου προσέφερε να δοκιμάσω τις δυνάμεις που στο χώρο της έρευνας. Στα χρόνια αυτά με την υπομονή και την συμπαράσταση που έδειξε κατάφερε ως καθηγήτρια που συνδυάζει την έρευνα αλλά και την εκπαίδευση να εκμαιεύσει τα βέλτιστα των δυνατοτήτων μου και να αγαπήσω αυτό που κάνω. Στη διάρκεια αυτών των χρόνων αναπτύχθηκε μια σχέση εμπιστοσύνης που θεωρώ πολύ σημαντική στο χώρο της έρευνας, αλλά και μια σχέση αγάπης που θεωρώ πολύ σημαντική για τη ζωή. Επίσης, ένα μεγάλο ευχαριστώ θα ήθελα να απευθύνω στα μέλη της συμβουλευτικής επιτροπής, τον κύριο Αμπατζόπουλο Θεόδωρο, καθηγητή του τμήματος Βιολογίας, και την κυρία Λαζαρίδου Μαρία, καθηγήτρια του τμήματος Βιολογίας για τις πολύτιμες υποδείξεις στη συγγραφή της διατριβής. Ιδιαίτερα, ευχαριστώ τον κύριο Αμπατζόπουλο για την πολύτιμη συμβολή του στη συγγραφή της εργασίας που δημοσιεύτηκε σε διεθνές περιοδικό. Για την παραπάνω εργασία ευχαριστώ θερμά τον κύριο Τριανταφυλλίδη Αλέξανδρο, επίκουρο καθηγητή του τμήματος Βιολογίας, για τις υποδείξεις κατά τη συγγραφή και κυρίως για τη βοήθεια στην πραγματοποίηση των πειραμάτων που αφορούσαν στην ταυτοποίηση της πατρότητας. Από τα μέλη της εξεταστικής επιτροπής, ευχαριστώ ιδιαίτερα την αναπληρώτρια καθηγήτρια Κυριακοπούλου- Σκλαβούνου Πασχαλίνα, που όλα αυτά τα χρόνια με το χαμόγελο και την αισιοδοξία της μου έδινε δύναμη να προχωρήσω όταν οι στιγμές ήταν δύσκολες, καθώς και τους καθηγητές κύριο Στάμου Γεώργιο και Σκούρα Ζαχαρία για τις πολύτιμες υποδείξεις στην τελική διαμόρφωση της διατριβής. Στην κυρία Βουλτσιάδου Ελένη, αναπληρώτρια καθηγήτρια του τμήματος Βιολογίας θα ήθελα να πω ένα μεγάλο ευχαριστώ για όλα. Για την συμπαράστασή της στις δύσκολες στιγμές, για την ενθάρρυνσή της στις περιόδους επιτυχίας ώστε να συνεχίσω, αλλά κυρίως για τα μαθήματα ζωής που προσφέρει μέσα από έναν συνδυασμό της επιστήμης και της φιλοσοφίας. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τους παρακάτω συναδέλφους που στην πορεία έγιναν φίλοι: τον διδάκτορα Ευριπίδη Κοεμτζόπουλο που με εκπαίδευσε στα πρώτα βήματα της διατριβής στην ιστολογία και την παρακολούθηση της συμπεριφοράς των σαλιγκαριών, την Σοφία Καλύβα που επίσης με βοήθησε ιδιαίτερα στις νυχτερινές παρακολουθήσεις όταν δεν ήταν δυνατή η παρουσία μου στο εργαστήριο, τον διδάκτορα Ανδρέα Ανέστη και τον υποψήφιο διδάκτορα Κώστα Φειδάντση για την πολύτιμη βοήθεια τους στις παρακολουθήσεις της συμπεριφοράς κατά τη διάρκεια της μέρας, τη φοιτήτρια Μαρία Ρεντζή για το VI

7 υπέροχο κλίμα στο υπόγειο όταν κάναμε ανατομίες αλλά και το εργαστήριο ιστολογίας. Επιπλέον, από τον τομέα Γενετικής Ανάπτυξης και Μοριακής Βιολογίας θα ήθελα να ευχαριστήσω τη συνάδελφο και φίλη Πανωραία Αλεξανδρή που με εκπαίδευσε ουσιαστικά στη γενετική ταυτοποίηση των ατόμων στα πειράματα ταυτοποίησης πατρότητας και την διδάκτορα Νικολέτα Καραΐσκου για την πολύτιμη συμβολή της στο χώρο αυτό και όχι μόνο. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τις φίλες μου Ελένη Αλεξοπούλου, Ηρώ Σίψα, Αναστασία Καρασαρλίδου, Ντίνα Νικολάου, Πηνελόπη Αμοιρίδου για την πολύτιμη συμπαράστασή τους όλα αυτά τα χρόνια και τη συμβολή τους σε όλα τα στάδια διεξαγωγής της διατριβής. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω το σύζυγο μου Γιώργο Σκλαβούνη για την αγάπη του, την κατανόηση και τη συμπαράστασή του στην εκπόνηση της διατριβής, την οικογένειά του και ιδιαίτερα τη γιαγιά Αφροδίτη και, τέλος, την οικογένειά μου και ιδιαίτερα τη μητέρα μου Σοφία Γαρεφαλάκη που από μικρή μου έμαθε πως η γνώση είναι πολύτιμη. VII

8 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Μελέτη της συμπεριφοράς αναπαραγωγής Φυλοεπιλογή και εξέλιξη αναπαραγωγικών χαρακτήρων Σπερματικός ανταγωνισμός Αναπαραγωγικό σύστημα του Cornu aspersum Αναπαραγωγική συμπεριφορά του Cornu aspersum Συστηματική κατάταξη και γεωγραφική εξάπλωση του Cornu aspersum Οικονομική σημασία του Cornu aspersum Στόχος της διατριβής 20 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Δειγματοληψίες 22 Συνθήκες εργαστηρίου 25 Συμπεριφορά και βιολογία αναπαραγωγής 27 Καταγραφή μεταβλητών συμπεριφοράς αναπαραγωγής 27 Σπερματικός ανταγωνισμός 29 Σπερματικός ανταγωνισμός & συζευκτική συμπεριφορά 30 Σπερματικός ανταγωνισμός & δομή του αναπαραγωγικού συστήματος 31 Μορφομετρία αναπαραγωγικού συστήματος 31 Ιστολογική μελέτη σπερματοθήκης 32 Σπερματικός ανταγωνισμός &ταυτοποίηση της πατρότητας των απογόνων 35 Ανάλυση πατρότητας 36 Απομόνωση DNA 36 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction-PCR) 38 Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 39 Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμίδης 41 Προσδιορισμός πατρότητας (πρόγραμμα CERVUS) 43 Στατιστική ανάλυση 50 VIII

9 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Συμπεριφορά αναπαραγωγής 52 Διάρκεια και κατανομή αναπαραγωγικής δραστηριότητας 52 Διάθεση για σύζευξη 59 Διάρκεια σύζευξης 67 Βιολογία αναπαραγωγής 75 Σπερματικός ανταγωνισμός 86 Σπερματικός ανταγωνισμός & συζευκτική συμπεριφορά 86 Σπερματικός ανταγωνισμός & δομή του αναπαραγωγικού συστήματος 95 Σπερματικός ανταγωνισμός & ταυτοποίηση της πατρότητας των απογόνων 105 Πολλαπλή πατρότητα 105 Επιτυχία πατρότητας 107 Χαρακτηριστικά που επηρεάζουν την επιτυχία πατρότητας 109 Αμοιβαία γονιμοποίηση 112 ΣΥΖΗΤΗΣΗ Συμπεριφορά αναπαραγωγής 114 Βιολογία αναπαραγωγής 119 Σπερματικός ανταγωνισμός 123 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 132 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 143 IX

10 Εισαγωγή ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Μελέτη της συμπεριφοράς αναπαραγωγής Η μελέτη της συμπεριφοράς των ζώων αφορά στην επιστημονική διερεύνηση της σχέσης όλων των ζώων από τους μονοκύτταρους οργανισμούς, τα ασπόνδυλα, τα ψάρια, τα αμφίβια, τα ερπετά, τα πτηνά ως και τα θηλαστικά με το φυσικό τους περιβάλλον και τους άλλους οργανισμούς. Πραγματεύεται δηλαδή την συμπεριφορά των ζώων ως προς την εύρεση και υπεράσπιση της τροφής, την αποφυγή των θηρευτών, την επιλογή των συντρόφων για την αναπαραγωγή και τη γονική φροντίδα. Σύμφωνα με τον ηθολόγο Niko Tinbergen (Krebs & Davies 1997), η ηθολογία διερευνά την αιτία, την εκδήλωση, την ανάπτυξη και την εξέλιξη μιας συμπεριφοράς. Η αιτία μιας συμπεριφοράς περιλαμβάνει τόσο τα εξωτερικά ερεθίσματα που επιδρούν σε αυτήν όσο και την εσωτερική διέγερση που οφείλεται σε ορμονικούς παράγοντες και παράγοντες του νευρικού συστήματος. Η εκδήλωση μιας συμπεριφοράς περιλαμβάνει την άμεση επενέργεια ενός συγκεκριμένου ενδιαιτήματος στη συμπεριφορά του ζώου και την προσαρμοστική της αξία στην επιβίωση και την αναπαραγωγική του επιτυχία. Η ανάπτυξη μιας συγκεκριμένης συμπεριφοράς άπτεται του τρόπου με τον οποίο η συμπεριφορά μεταβάλλεται σε όλη τη διάρκεια της ζωής του οργανισμού και πως αυτή η αλλαγή επηρεάζεται από το γενετικό υλικό και την εμπειρία. Τέλος, η εξέλιξη μιας συμπεριφοράς σχετίζεται με την προέλευση ενός συγκεκριμένου προτύπου συμπεριφοράς και πως αυτό μεταβάλλεται από γενιά σε γενιά. Είναι φανερό λοιπόν ότι η μελέτη της συμπεριφοράς των ζώων διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην κατανόηση της απόκρισης των οργανισμών στο περιβάλλον τους μέσα από μια διαδικασία αλληλεπιδράσεων μοριακών, φυσιολογικών και οικολογικών. Η ενδοειδική ποικιλότητα (intra-specific variation) ως προς τις στρατηγικές αναπαραγωγής έχει μελετηθεί σε πολλές ταξινομικές ομάδες (Gross 1996, Foster & Endler 1999, Brockmann 2001, Shuster & Wade 2003). Παρόλα αυτά, λίγες έρευνες έχουν συσχετίσει τη γεωγραφική ποικιλότητα ως προς τις εναλλακτικές στρατηγικές αναπαραγωγικής συμπεριφοράς με συγκεκριμένους περιβαλλοντικούς παράγοντες, πέρα από την ένταση της θήρευσης (Carroll 1993, Carroll & Corneli 1995). Για παράδειγμα, ένα θηλυκό μπορεί να ακολουθήσει μια στρατηγική όπου θα παράγει πολλά αβγά και θα τα αποθέσει σε ένα ενδιαίτημα όπου τουλάχιστον κάποια από αυτά θα μπορέσουν να εκκολαφθούν και τελικά να επιβιώσουν. Εναλλακτικά, μπορεί να παράγει λιγότερα αβγά και στα οποία θα επενδύσει περισσότερο ούτως ώστε να αυξήσει σε καθένα από αυτά την πιθανότητα επιβίωσης. Στην πρώτη περίπτωση η επιλογή των συντρόφων μπορεί να είναι τυχαία ενώ στη δεύτερη, το θηλυκό ενδέχεται να είναι περισσότερο επιλεκτικό ως προς την εύρεση κατάλληλου συντρόφου. Παραδείγματα και των δυο φαινοτύπων υπάρχουν στο ζωικό βασίλειο, ενώ στα περισσότερα είδη είναι ευρέως 1

11 Εισαγωγή διαδεδομένοι ενδιάμεσοι φαινότυποι καθώς η καλύτερη στρατηγική ενός είδους καθορίζεται ως επί το πλείστον από τις οικολογικές συνθήκες (Isvaran 2005). Επομένως, η φαινοτυπική ποικιλότητα (phenotypic diversity) που παρατηρείται στην αναπαραγωγική συμπεριφορά των ζώων βασίζεται στην απόκρισή τους σε διαφορετικά ερεθίσματα, υιοθετώντας υπό συνθήκη στρατηγικές (conditional strategies) οι οποίες περιλαμβάνουν εναλλακτικές τακτικές (Taborsky 1994, Gross 1996, Brockmann 2001). Έτσι, ανάλογα με εσωτερικά ή εξωτερικά ερεθίσματα, τα άτομα ενός πληθυσμού μπορούν: α) να υιοθετήσουν μόνο μια στρατηγική (ανάμεσα σε πολλές πιθανές στρατηγικές) σε όλη τη διάρκεια της ζωής τους, ή β) να ακολουθήσουν πολλαπλές στρατηγικές κατά τη διάρκεια της ζωής τους, που περιλαμβάνουν είτε διαδοχικά διαφορετικές τακτικές, ή δυο συνεχώς εναλλασσόμενες τακτικές. Η παρουσία των εναλλακτικών τακτικών μπορεί να αποδοθεί στην διακύμανση της αρμοστικότητας των εναλλακτικών φαινοτύπων. Αν δυο φαινότυποι ποικίλουν κατά μήκος ενός διαβαθμισμένου περιβάλλοντος με τέτοιον τρόπο ώστε σε κάποιες περιοχές η αρμοστικότητα του ενός φαινοτύπου να είναι μεγαλύτερη, ενώ σε άλλα σημεία η σχετική αρμοστικότητά τους εναλλάσσεται, τότε αναμένεται και οι δυο φαινότυποι να παραμείνουν στον πληθυσμό (Isvaran 2005). Για παράδειγμα, έχει διατυπωθεί ότι η διαβαθμισμένη διαθεσιμότητα της τροφής επηρεάζει την αναπαραγωγική στρατηγική των αρσενικών στο είδος Poecilia reticulate, όπου οι εναλλακτικές μορφές απόκρισης έχουν γενετικό υπόβαθρο αλλά καθορίζονται και από το περιβάλλον στα πλαίσια της φαινοτυπικής πλαστικότητας (Kolluru et al. 2007). Σε ότι αφορά την επιλογή δυο εναλλακτικών φαινοτύπων στο πλαίσιο των υπό συνθήκη στρατηγικών αναπαραγωγής, φαίνεται πως η ετερογένεια του περιβάλλοντος στο είδος Protoneura amatoria επηρεάζει τις εναλλακτικές στρατηγικές των αρσενικών στο είδος αυτό (Larison 2007). Ένα εξαιρετικό παράδειγμα για την υπό συνθήκες εξαρτώμενη γονιδιακή έκφραση αποτελεί η επίδραση των πρώτων συνθηκών κατά τη διάρκεια της ζωής στη D. melanogaster στο μετάγραφο (transcriptome) και κατ επέκταση στο φυλετικό διμορφισμό των ενηλίκων (Wyman et al. 2010). Η συμπεριφορά των ζώων παρέχει συχνά τις πρώτες έμμεσες ενδείξεις για αλλαγές στο περιβάλλον. Συγκεκριμένα, μεταβολές στην αναπαραγωγική συμπεριφορά θα μπορούσαν να χαρακτηριστούν ως «αισθητήρας» σε μικρής κλίμακας αλλαγές του περιβάλλοντος, καθώς συχνά εμφανίζονται πολύ νωρίτερα ως απόκριση στις μεταβολές του ενδιαιτήματος. Αντίθετα, το τελικό αποτέλεσμα σε βάθος χρόνου μιας αλλαγής του περιβάλλοντος αντικατοπτρίζεται στην μείωση της αναπαραγωγικής απόδοσης των οργανισμών που συνεπάγεται την μείωση του μεγέθους των πληθυσμών και την ενδεχόμενη κατ επέκταση απειλή ή /και εξαφάνιση των ειδών. Είναι ευνόητο ότι η όσο το δυνατόν ταχύτερη αντίληψη της μεταβολής στη συμπεριφορά αναπαραγωγής των ζώων μπορεί να οδηγήσει στην έγκαιρη 2

12 Εισαγωγή λήψη των κατάλληλων μέτρων διαχείρισης και προστασίας των υπό εξαφάνιση ειδών. 1.2 Φυλοεπιλογή και εξέλιξη αναπαραγωγικών χαρακτήρων Η συμπεριφορά αναπαραγωγής δεν αποτελεί ένα ανεξάρτητο και αυθυπόστατο χαρακτηριστικό ενός είδους. Αντιθέτως βρίσκεται σε διαρκή αλληλεπίδραση με το περιβάλλον, το φαινότυπο και το γενότυπο και, επομένως, επηρεάζει την αρμοστικότητα. Η διεργασία της φυσικής επιλογής η οποία ευνοεί οποιοδήποτε χαρακτηριστικό και δίνει σε ένα άτομο αναπαραγωγικό πλεονέκτημα σε σχέση με τα υπόλοιπα ορίστηκε από τον Δαρβίνο, (1871) ως φυλοεπιλογή (sexual selection) και δρα μέσω δύο διαδικασιών: α) της ενδοφυλοεπιλογής (intrasexual selection), η οποία αφορά στον ανταγωνισμό μεταξύ των ατόμων του επιλεγόμενου φύλου (συνήθως μεταξύ των αρσενικών ατόμων) για την πρόσβαση στα άτομα που επιλέγουν (συνήθως τα θηλυκά άτομα) και β) της διαφυλοεπιλογής (intersexual selection), η οποία αναφέρεται στην επιλογή ελκυστικών συντρόφων από τα άτομα του επιλέγοντος φύλου, συνήθως από τα θηλυκά. Η διατύπωση αυτή του Δαρβίνου έγινε με δεδομένο ότι στη φύση τα θηλυκά είναι μονογαμικά, επομένως ο ρόλος τους στην φυλοεπιλογή είναι μόνο η επιλογή του συντρόφου με τα καλύτερα χαρακτηριστικά, ενώ τα αρσενικά υφίστανται εντονότερες πιέσεις λόγω της μεγάλης διακύμανσης του αριθμού των θηλυκών ατόμων με τα οποία μπορούν να έρθουν σε σύζευξη. Για την εποχή εκείνη η θεώρηση της φυλοεπιλογής με αυτές τις συνιστώσες ήταν σε αρμονία με τις τότε κοινωνικές και θρησκευτικές αντιλήψεις. Το δεύτερο μισό του 20 ου αιώνα ήταν ευρέως διαδεδομένη έγινε πλέον αποδεκτή η σύζευξη των θηλυκών ατόμων με περισσότερα του ενός αρσενικά θέτοντας έτσι το ερώτημα αν η σύζευξη επαρκεί για την γονιμοποίηση των ωαρίων του θηλυκού ή αν εξαιτίας των πολλαπλών συζεύξεων δημιουργείται ανταγωνισμός στο επίπεδο της γονιμοποίησης των ωαρίων ενός θηλυκού. Το 1970 ο Geoff Parker εισήγαγε τον όρο «σπερματικός ανταγωνισμός» (sperm competition) ως τον ανταγωνισμό μεταξύ των σπερματοζωαρίων διαφορετικών αρσενικών ατόμων για την γονιμοποίηση των ωαρίων ενός θηλυκού. Με τον όρο αυτό μεταθέτει τον ανταγωνισμό μεταξύ των αρσενικών ατόμων για την πρόσβαση στα θηλυκά από το επίπεδο της επιλογής συντρόφου (mating success) στο επίπεδο της γονιμοποίησης των ωαρίων (fertilization success). Παρόλα αυτά ο σπερματικός ανταγωνισμός θεωρεί τα θηλυκά ως παθητικούς αποδέκτες των γαμετών καθώς η φυλοεπιλογή καθορίζεται από τα χαρακτηριστικά των αρσενικών που καθορίζουν το ανταγωνιστικό δυναμικό τους. Πιο πρόσφατες απόψεις αποκαλύπτουν τον 3

13 Εισαγωγή πιθανό έλεγχο από τα θηλυκά της πατρότητας των απογόνων τους μέσω μορφολογικών, φυσιολογικών, ηθολογικών και γενετικών χαρακτηριστικών. Η επιλογή αυτή των γαμετών των αρσενικών αναφέρεται ως άδηλη επιλογή από το θηλυκό (cryptic female choice) καθώς αναφέρεται σε μετασυζευκτικό επίπεδο και δεν είναι φανερή στα υπό επιλογή αρσενικά. Σύγχρονες μελέτες της αναπαραγωγικής συμπεριφοράς, της μορφολογίας και ανατομίας στη Drosophila melanogaster παρέχουν ισχυρές ενδείξεις ότι η φυλοεπιλογή διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη χαρακτήρων που σχετίζονται με την αναπαραγωγική επιτυχία. Για παράδειγμα, αφαιρώντας πειραματικά τις πιέσεις της φυλοεπιλογής σε πληθυσμούς της D. melanogaster τα μεν αρσενικά άτομα εξελίχθηκαν να μη βλάπτουν τα θηλυκά κατά το ζευγάρωμα (τοξικότητα του σπερματικού υγρού) και ταυτόχρονα τα δε θηλυκά ελάττωσαν την αντίστασή τους κατά το ζευγάρωμα (Holland & Rice, 1999). Μια σχετικά σύντομη εξέλιξη των χαρακτήρων που σχετίζονται με την αναπαραγωγή αποδόθηκε στην φυλοεπιλογή και στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των φύλων. Συγκεκριμένα, σε πληθυσμούς D. melanogaster η αναπαραγωγική επιτυχία των αρσενικών καθορίζεται από την αλληλεπίδραση μεταξύ του μήκους του σπέρματος και του μήκους του οργάνου αποθήκευσης σπέρματος του θηλυκού (Miller & Pitnick, 2002). Σπερματοζωάρια με γιγάντιες ουρές εξελίχθηκαν ως απόκριση στις πιέσεις της φυλοεπιλογής απέναντι στα μεγάλου μήκους όργανα αποθήκευσης σπέρματος των θηλυκών. Οι γιγάντιες ουρές των σπερματοζωαρίων (Pitnick et al. 1995) απορρέουν από τις πιέσεις της φυλοεπιλογής, όπως ακριβώς οι γιγάντιες ουρές του παγωνιού (Εικόνα 1.1). Η εξέλιξη των χαρακτήρων που σχετίζονται με την αναπαραγωγική διαδικασία είτε αυτοί είναι πρωτογενείς (γονάδες, αγωγοί, όργανα σύζευξης), είτε δευτερογενείς (γιγάντιες ουρά του παγωνιού, χρωματικά πρότυπα των παραδείσιων πουλιών), υπόκεινται στις πιέσεις της φυσικής επιλογής αλλά και της φυλοεπιλογής. Σε τι βαθμό οι πιέσεις αυτές συντελούν στην εξέλιξη αποτελεί σπουδαίο ερώτημα στην εξελικτική βιολογία και ιδιαίτερα στο πεδίο έρευνας των χαρακτήρων αναπαραγωγής. Έχουν, για το λόγο αυτό διατυπωθεί πολλές θεωρίες και υποθέσεις που αντανακλούν την οπτική γωνία από την οποία οι ερευνητές μελετούν τον φαινόμενο αυτό (μοριακή, ανατομία, μορφολογία και ηθολογία). Η θεωρία των καλών γονιδίων από ηθολογική σκοπιά υποστηρίζει ότι χαρακτηριστικά που φαίνονται μειονεκτικά για την επιβίωση του οργανισμού (όπως η ουρά του παγωνιού) αποτελούν δείγμα ευρωστίας του οργανισμού που μπορούν να κληρονομηθούν στην επόμενη γενιά. Η άποψη αυτή δέχτηκε κριτική από πολλούς εξελικτικούς, ενώ σύγχρονες έρευνες σε γενετικό επίπεδο αποκάλυψαν ότι τα θηλυκά επιλέγουν τα αρσενικά που θα ζευγαρώσουν σύμφωνα με το αν τα τελευταία φέρουν καλά γονίδια (good genes). Ο όρος «καλά γονίδια» σημαίνει τα αλληλόμορφα εκείνα που αυξάνουν την αρμοστικότητα (fitness) ανεξάρτητα από την αρχιτεκτονική του 4

14 Εισαγωγή υπόλοιπου γενώματος, η οποία στους διπλοειδείς οργανισμούς σημαίνει το ομόλογο του «καλού γονιδίου» (Neff & Pitcher 2005). Εικόνα 1.1 Η δράση της φυλοεπιλογής στην εξέλιξη χαρακτήρων που σχετίζονται με την αναπαραγωγική επιτυχία. Αριστερά: η γιγάντια ουρά του αρσενικού παγωνιού Pavo cristatus για την προσέλκυση των θηλυκών. Δεξιά: Η ουρά του σπερματοζωαρίου (58,3 mm) της Drosophila melanogaster (Pitnick et al. 1995) ως απόκριση στο μεγαλύτερου μήκους όργανο αποθήκευσης του σπέρματος του θηλυκού. Figure 1.1 Evolution of reproductive traits under sexual selection. Left: giant tail of the male Pavo cristatus to attract females. Right: Giant tail (58,3 mm) of sperm in Drosophila melanogaster (Pitnick et al. 1995) as a response to the enlarged sperm storing organ of the female. Αν, για παράδειγμα, σε ένα σύστημα σύζευξης που δεν βασίζεται στην παροχή αγαθών, όπως τροφή (nonresource-based mating system) έχουμε ένα απλό μοντέλο που περιλαμβάνει έναν γονιδιακό τόπο (single-locus model) με δυο αλληλόμορφα Α και Β. Αν το Α είναι το καλό γονίδιο που προβάλλει για παράδειγμα αντίσταση σε κάποιο παθογόνο, τότε το αρσενικό με γενότυπο ΑΑ θα έχει την μεγαλύτερη γενετική ποιότητα, η οποία περιλαμβάνει και την επιβίωση αλλά και τη βέλτιστη αναπαραγωγική επιτυχία των απογόνων (LRS-life time reproductive success; LRS = Σ l x m x, όπου l x είναι η βιωσιμότητα στην ηλικία x, m x είναι η αναπαραγωγική επιτυχία (αριθμός απογόνων που παράγονται) στην ηλικία x, και το άθροισμα αφορά όλη τη διάρκεια ζωής του ατόμου. Έτσι όλα τα θηλυκά θα μεγιστοποιήσουν την αρμοστικότητα των απογόνων τους ζευγαρώνοντας με ΑΑ αρσενικά (Εικ. 1.2). 5

15 Εισαγωγή Εικόνα 1.2 Γενετική ποιότητα των καλών γονιδίων. Αν το Α αλληλόμορφο είναι ένα καλό γονίδιο, όλα τα θηλυκά θα μεγιστοποιήσουν την αρμοστικότητα των απογόνων τους ζευγαρώνοντας με ΑΑ αρσενικά. Figure 1.2 Genetic quality of good genes. If the allele A is a good gene all females will maximize their offsprings fitness by mating with males of AA genotype. Η θεωρία του Fisher (1930), που αναφέρεται ως «runaway process» υποστηρίζει ότι αρχικά τα θηλυκά προσελκύονται από χαρακτηριστικά που έχουν κάποια αξία επιβίωσης (survival value) και ότι αυτά τα χαρακτηριστικά στη συνέχεια εξελίσσονται μέσω της δράσης της φυλοεπιλογής. Για παράδειγμα, τα θηλυκά πτηνά μπορεί να επιλέγουν εκείνα τα αρσενικά που διατηρούν το πτέρωμά τους σε καλή κατάσταση, γιατί αυτό δείχνει αφενός καλή πτητική ικανότητα και, επομένως, έχει σημασία για την επιβίωσή τους, αφετέρου όμως δείχνει ότι το αρσενικό είναι σε θέση να ξοδέψει ενέργεια και χρόνο για την καλή διατήρηση του πτερώματός του. Από τη στιγμή που μια τέτοια προτίμηση εγκαθιδρυθεί μέσα σε έναν πληθυσμό, σχεδόν κάθε τυχαίο χαρακτηριστικό του πτερώματος θα μπορούσε να υπεραναπτυχθεί και να εξελιχθεί υπερβολικά χωρίς αυτό να δίνει κάποιο πλεονέκτημα επιβίωσης στο αρσενικό. Ο Fisher αναγνώρισε ότι η αμφίδρομη σχέση μεταξύ ελκυστικότητας των αρσενικών και των προτιμήσεων των θηλυκών θα έπρεπε να οδηγεί σε μια μορφή βαθμιαίας εξέλιξης η οποία τελικά θα ελεγχθεί από τις δυνάμεις της φυσικής επιλογής. Η υπόθεση κλειδαριάς κλειδιού: για πρώτη φορά χρησιμοποιήθηκε στην προ Δαρβινική εποχή και για μεγάλο χρονικό διάστημα θεωρήθηκε μια έγκυρη εξήγηση της εξέλιξης του γεννητικού συστήματος (Dufour 1844). Σύμφωνα με αυτήν την υπόθεση, τα αρσενικά γεννητικά όργανα επιλέγονται ώστε να ταιριάζουν με την αντίστοιχη μορφολογία του θηλυκού αναπαραγωγικού συστήματος. Η βέλτιστη μορφολογία του αρσενικού αναπαραγωγικού συστήματος είναι αυτή που ταιριάζει περισσότερο στη μέση διαμόρφωση του θηλυκού αναπαραγωγικού συστήματος. Καθώς λοιπόν φαίνεται να δρα η σταθεροποιούσα φυσική επιλογή (Alexander et al. 1996), αναμένεται να έχουμε μικρή γενετική ποικιλότητα, όσον αφορά στα σεξουαλικά χαρακτηριστικά και μικρό βαθμό φαινοτυπικής ποικιλότητας. Σύμφωνα με την πλειοτροπική υπόθεση η εξέλιξη του αναπαραγωγικού συστήματος είναι έμμεσο αποτέλεσμα που προέρχεται από την εξέλιξη γενετικά σχετιζόμενων χαρακτήρων (Mayr 1963). Αυτό γίνεται μέσω των πλειοτροπικών επιδράσεων γονιδίων, τα οποία κωδικοποιούν αναπαραγωγικά και μορφολογικά χαρακτηριστικά. Λόγω του πλειοτροπισμού, 6

16 Εισαγωγή η επιλογή μπορεί να πάρει οποιαδήποτε μορφή και άρα η γενετική ποικιλότητα των γεννητικών χαρακτηριστικών, αναμένεται να είναι υψηλή σε σχέση με τα υπόλοιπα χαρακτηριστικά. Επιπλέον, σύμφωνα με την πλειοτροπική υπόθεση, η έκφραση των αναπαραγωγικών χαρακτηριστικών, αναμένεται να εξαρτάται άμεσα από τις περιβαλλοντικές συνθήκες. Με βάση την υπόθεση της φυλοεπιλογής η επιλογή χαρακτήρων που σχετίζονται με την αναπαραγωγή μπορεί να οφείλεται: α) σε αντίθεση συμφερόντων μεταξύ των φύλων (sexual conflict) προκειμένου να αποκτήσουν τον έλεγχο των αναπαραγωγικών αποφάσεων, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει στη συνεξέλιξη των αρσενικών και θηλυκών αναπαραγωγικών χαρακτηριστικών β) στην άδηλη επιλογή από το θηλυκό (cryptic female choice), σύμφωνα με την οποία τα θηλυκά άτομα που εμπλέκονται σε πολλαπλά ζευγαρώματα, επιλέγουν να χρησιμοποιούν σπέρμα από το αρσενικό με τα καλύτερα χαρακτηριστικά σε σχέση με τα άλλα αρσενικά άτομα, προκειμένου να γονιμοποιήσουν τα αυγά τους (Thornhill 1983; Eberhard 1994, 1996), γ) στο γεγονός ότι το αρσενικό αναπαραγωγικό σύστημα μπορεί να ενισχυθεί ως αποτέλεσμα της φυλοεπιλογής που προκύπτει από την ενδοφυλετική επιλογή, ώστε το εκάστοτε αρσενικό να μπορεί να εκτοπίζει το σπέρμα των άλλων αρσενικών ατόμων, με τα οποία έχει ζευγαρώσει το θηλυκό, από το αναπαραγωγικό σύστημα του τελευταίου, ή να μειώνει τη δεκτικότητα του θηλυκού στο σπέρμα άλλων αρσενικών (Smith 1984). Σύμφωνα με την υπόθεση αυτή, η φυλοεπιλογή θα είναι κατευθύνουσα και θεωρητικά η γενετική ποικιλότητα θα είναι τεράστια, αφού τα θηλυκά θα έχουν μεγάλο εύρος επιλογής (Andersson 1994; Pomiankowski & Møller 1995; Anderson & Iwasa 1996). Στην πράξη όμως, μια ποικιλία παραγόντων μπορούν να μεταβάλλουν τα παραπάνω, δημιουργώντας έτσι ενδιάμεσους βαθμούς γενετικής ποικιλότητας για αυτά τα χαρακτηριστικά, υποβάλλοντάς τα στη διαδικασία της φυσικής επιλογής και προωθώντας την εξέλιξή τους. Αυτές οι διαπιστώσεις οδηγούν στο συμπέρασμα ότι στη φύση το ζευγάρωμα σπάνια είναι τυχαίο. Οι οργανισμοί που καταφέρνουν με κάποιον τρόπο να βρουν πολλούς συντρόφους ή συντρόφους με ιδιαίτερή ποιότητα γενετικών χαρακτήρων (ή και τα δύο) έχουν αναπαραγωγικό πλεονέκτημα και θα αφήσουν περισσότερους και πιο «προικισμένους» απογόνους στην επόμενη γενιά από τους ανταγωνιστές τους. Το γεγονός ότι στενά συγγενικά είδη έχουν τυπικά μεγαλύτερες διαφορές σε ό,τι αφορά τα αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά σε σύγκριση με άλλου είδους χαρακτήρες έχει αναγνωριστεί από την εποχή του Δαρβίνου έως και σήμερα. Η παρατήρηση αυτή κινητοποίησε την ιδέα ότι η φυλοεπιλογή μπορεί να ξεκινήσει μια γρήγορη αποκλίνουσα εξέλιξη των αναπαραγωγικών χαρακτήρων σε αλλοπατρικούς πληθυσμούς και με τον τρόπο αυτό να αποτελεί μια μηχανή ειδογένεσης. Μεγάλος αριθμός θεωρητικών μοντέλων επίσης συμφωνούν ότι η διαφυλετική επιλογή είναι αποτελεσματική στη δημιουργία νέων ειδών και υπάρχουν αρκετοί αλληλένδετοι λόγοι που το υποστηρίζουν. Πρώτον, η φυλοεπιλογή εξ ορισμού περιλαμβάνει επιλογή 7

17 Εισαγωγή αναπαραγωγικών χαρακτήρων και στα δυο φύλα. Τέτοιοι χαρακτήρες είναι πιθανό να προκαλέσουν την αναπαραγωγική απομόνωση. Δεύτερον, υπάρχουν αυθαίρετα στοιχεία που περιλαμβάνονται σε πολλά μοντέλα της φυλοεπιλογής, όπως το ότι κάποιο από τα χαρακτηριστικά ενός αρσενικού έχει την ίδια πιθανότητα να αναπτυχθεί ή να αναπτυχθεί με ελαφρώς διαφορετικούς τρόπους. Τέτοια συνεξέλιξη αρσενικού-θηλυκού θα έχει την τάση να αυξήσει την πιθανότητα της αλλοπατρικής ειδογένεσης, ακόμα και στην απουσία περιβαλλοντικών διαφορών μεταξύ των πληθυσμών, επειδή οι συνεξελικτικές τροχιές μπορούν να διαφέρουν ανάμεσα στους διαφορετικούς πληθυσμούς. Τρίτον, η φυλοεπιλογή είναι πιο ισχυρή από τη φυσική επιλογή στο να προκαλεί αναπαραγωγική απομόνωση σε έναν πληθυσμό επειδή η μη τυχαία σύντηξη γαμετών βοηθά στο να έρθουν κοντά επιθυμητοί συνδυασμοί αλληλομόρφων σε διαφορετικές περιοχές του γονιδιώματος. Παρόλο που η αναπαραγωγική απομόνωση και ειδογένεση αποτελούν συχνά παραπροϊόντα της προσαρμογής από τη φυσική επιλογή σε νέες ζώνες προσαρμογής, υπάρχουν πολλοί λόγοι να πιστεύουμε ότι η φυλοεπιλογή παίζει συχνά κεντρικό ρόλο όταν δημιουργούνται νέα είδη. Ένας ακόμη λόγος είναι ότι εμπειρικές μελέτες αποκάλυψαν μια προς έκπληξη απλή γενετική αρχιτεκτονική σημάτων που εμπλέκονται στην αναγνώριση των ειδών για ζευγάρωμα. Η παρατήρηση αυτή αντιτίθεται στην άποψη ότι η αναπαραγωγική απομόνωση είναι μια συμπτωματική παρενέργεια της πολυγovιδιακή προσαρμογής σε νέες περιβαλλοντικές συνθήκες (Arnqvist & Rowe, 2005). Επομένως, η φυλοεπιλογή είναι μια συνεχής διαδικασία που δρα σε διαφορετικά επίπεδα της αναπαραγωγικής διαδικασίας, από το αρχικό στάδιο της επιλογής συντρόφου και το στάδιο του ζευγαρώματος, της επακόλουθης γονιμοποίησης των ωαρίων, της βιωσιμότητας των εμβρύων και τέλος της βιωσιμότητας των απογόνων. 1.3 Σπερματικός ανταγωνισμός Το 1970 ο Geoff Parker εισήγαγε τον όρο «σπερματικός ανταγωνισμός» (sperm competition) ως τον ανταγωνισμό μεταξύ των σπερματοζωαρίων διαφορετικών αρσενικών ατόμων για την γονιμοποίηση των ωαρίων ενός θηλυκού. Με τον όρο αυτό μεταθέτει τον ανταγωνισμό μεταξύ των αρσενικών ατόμων για την πρόσβαση στα θηλυκά από το επίπεδο της επιλογής συντρόφου (mating success) στο επίπεδο της γονιμοποίησης των ωαρίων (fertilization success). Έτσι, ενώ η αναπαραγωγή θα μπορούσε να θεωρηθεί ως μια αρμονική συνεργασία μεταξύ των δυο φύλων όπου ένα θηλυκό άτομο συνεργάζεται με ένα αρσενικό του ίδιου είδους (μονογαμία) για την απόκτηση απογόνων και η αναπαραγωγική επιτυχία κάθε ατόμου είναι ίση με εκείνη του σεξουαλικού του συντρόφου με την προϋπόθεση ότι τα συμφέροντα μεταξύ των δυο φύλων είναι ίδια και ίσα και εκείνα του είδους, αυτό στη φύση συμβαίνει σπάνια, καθώς συχνά η αρμοστικότητα του ενός 8

18 Εισαγωγή φύλου αντιτίθεται σε εκείνη του άλλου φύλου (Arnqvist & Rowe 2005). Αυτό οφείλεται στο θεμελιώδες χαρακτηριστικό της φυλετικής αναπαραγωγής που είναι η σύντηξη δυο γαμετών για την παραγωγή του ζυγωτού το οποίο στη συνέχεια θα εξελιχθεί σε ένα νέο άτομο και, συγκεκριμένα στην ασυμμετρία των γαμετών, δηλαδή στο γεγονός ότι οι αρσενικοί γαμέτες είναι μικρότεροι και πολυπληθέστεροι των θηλυκών (McFarland 1999). Κατά τη μετάβαση από τη μονογονία στην αμφιγονία στην εξελικτική πορεία οι γαμέτες θα πρέπει να ήταν ισομεγέθεις, όπως στο πρωτόζωο Paramecium. Σχετικά νωρίς κατά την εξελικτική πορεία θα πρέπει να υπήρχε ποικιλομορφία ως προς το μέγεθος των γαμετών. Οι μεγαλύτεροι γαμέτες παρήγαγαν μεγαλύτερα ζυγωτά που είχαν περισσότερες πιθανότητες επιβίωσης εξαιτίας των μεγαλύτερων αποθεμάτων τροφής που περιείχαν. Επομένως, οι μεγαλύτεροι γαμέτες θα πρέπει να ευνοήθηκαν μέσω της φυσικής επιλογής. Ακολούθως η φυσική επιλογή θα ευνοούσε μικρούς γαμέτες που θα είχαν τη δυνατότητα να συντηχθούν με έναν μεγάλο γαμέτη και, ουσιαστικά, να «παρασιτήσει» εις βάρος των ενεργειακών αποθεμάτων του μεγάλου γαμέτη. Έτσι, οι μικροί γαμέτες θα μπορούσαν να επιβιώσουν μόνον αν είχαν μεγάλη κινητικότητα και ικανότητα διαχωρισμού μεταξύ μικρών και μεγάλων γαμετών. Αυτή η θεωρία της εξελικτικής προέλευσης των γαμετών (ωαρίων και σπερματοζωαρίων) διατυπώθηκε από τον Geoff Parker και τους συνεργάτες του (1972), και είναι ευρέως αποδεκτή ως εξήγηση καθώς όλα τα μέχρι σήμερα ζώα που αναπαράγονται αμφιγονικά παράγουν ωάρια και σπερματοζωάρια (McFarland 1999). Έτσι, λόγω της ασυμμετρίας των γαμετών των δυο φύλων, τα θηλυκά που επενδύουν περισσότερη ενέργεια σε λίγους θηλυκούς γαμέτες και η αναπαραγωγική τους επιτυχία εξαρτάται από τον αριθμό αλλά και τη βιωσιμότητα των απογόνων, αναμένεται να συμπεριφέρονται πιο επιλεκτικά σε ό,τι αφορά τους συντρόφους που θα γονιμοποιήσουν τα αβγά τους. Αντίθετα, τα αρσενικά που παράγουν πολυάριθμους μικρούς γαμέτες θα τείνουν να ζευγαρώνουν με πολλά θηλυκά προκειμένου να αυξήσουν την αναπαραγωγική τους επιτυχία που αντανακλάται στον αριθμό των απογόνων τους, και θα ανταγωνίζονται μεταξύ τους για την πρόσβαση στα θηλυκά. Μια ακόμα θεμελιώδης ασυμμετρία αφορά στην ένταση της επιλογής για πολλαπλές συζεύξεις ανάμεσα στα δυο φύλα: ενώ τα αρσενικά μπορούν να μεγιστοποιήσουν την αναπαραγωγική τους απόδοση με την απόκτηση όσο το δυνατόν περισσότερων συντρόφων, τα θηλυκά χρειάζονται λιγότερους συντρόφους για να μεγιστοποιήσουν την αναπαραγωγική τους απόδοση (Bateman 1948). Το γεγονός ότι οι διαφορετικοί αυτοί ρόλοι μπορούν να δημιουργήσουν μια αντίθεση συμφερόντων μεταξύ των φύλων (sexual conflict) και να επηρεάσουν το δυναμικό εξέλιξης των αναπαραγωγικών χαρακτηριστικών και συμπεριφορών, είχε αναγνωριστεί από τη δεκαετία του 70 και μέχρι σήμερα έχει εξελιχθεί σε ένα ενδιαφέρον πεδίο έρευνας στην εξελικτική βιολογία (Bernasconi et al. 2006). Αρχικά, η προσέγγιση του ζητήματος της αντίθεσης συμφερόντων μεταξύ των φύλων (sexual conflict) 9

19 Εισαγωγή από εξελικτική σκοπιά έγινε αρχικά από το Δαρβίνο. Σύμφωνα με τις παρατηρήσεις του όλα τα γεγονότα που οδηγούν στη σύζευξη, όπως η επιλογή από τα θηλυκά ενός συγκεκριμένου αρσενικού ή ο ανταγωνισμός των αρσενικών για την πρόσβαση στα θηλυκά, συνεργάζονται στενά με τη φυσική επιλογή με αποτέλεσμα τη βελτίωση της αρμοστικότητας της γενιάς. Η θεωρία του Δαρβίνου φαίνεται να επηρεάστηκε από τις παρατηρήσεις του παππού του Έρασμου Δαρβίνου, ο οποίος στο βιβλίο του Zoonomia (1754) υποστήριζε ότι ο σκοπός του ανταγωνισμού στην αναπαραγωγική διαδικασία είναι η βελτίωση των ειδών. Έτσι, η θεμελιώδης ασυμμετρία των γαμετών, οδηγεί σε περαιτέρω ασυμμετρία των συμφερόντων που έχει κάθε φύλο στην αναπαραγωγική διαδικασία και επομένως στη διαμάχη μεταξύ των φύλων. Σύμφωνα, λοιπόν με την αρχή του Bateman (1948), η αναπαραγωγική επιτυχία των αρσενικών αυξάνει με τον αριθμό των συζεύξεων, καθώς αυξάνεται η πιθανότητα να αποκτήσουν περισσότερους απογόνους, και για το λόγο αυτό τα αρσενικά στη φύση είναι ως επί το πλείστον πολυγαμικά. Στα θηλυκά η αναπαραγωγική επιτυχία, που αντανακλάται στον αριθμό των αβγών και την βιωσιμότητά τους, αυξάνει μέχρι σε ένα σημείο με τον αριθμό των συζεύξεων ενώ στη συνέχεια όσες συζεύξεις παραπάνω και να πραγματοποιήσει, ο αριθμός των απογόνων δεν θα αυξηθεί περαιτέρω (Bateman 1948). Η μείωση αυτή στη γονιμότητα του θηλυκού με την περαιτέρω αύξηση του αριθμού συζεύξεων δείχνει ότι η σύζευξη για το θηλυκό ενέχει κόστος (Arnqvist & Rowe 2005) που μπορεί να προέρχεται είτε από την ίδια τη διαδικασία της σύζευξης (Eberhard 1996) είτε από την αρνητική επίδραση εκ μέρους των αρσενικών, όπως για παράδειγμα τραυματισμοί μηχανικού τύπου (Michiels 1998, Michiels & Koene 2006) ή χημικού τύπου επιδράσεις (Poiani 2006). Σύγχρονα μαθηματικά μοντέλα δείχνουν ότι η αρμοστικότητα του θηλυκού (female fitness) μεγιστοποιείται σε ενδιάμεσους αριθμούς συζεύξεων (Sprenger et al. 2008), ενώ έχει προταθεί ότι το μέγιστο της θηλυκής γονιμότητας παρατηρείται σε αριθμούς συζεύξεων που ταιριάζουν με το μέσο αριθμό συζεύξεων στο πεδίο (Anthes et al. 2006). Η συμπεριφορά των πολλαπλών συζεύξεων είναι ευρέως διαδεδομένη στο ζωικό βασίλειο, κυρίως στα έντομα και στα χορδωτά (Birkhead 2000). Σε οργανισμούς όπου η γονιμοποίηση των ωαρίων δεν πραγματοποιείται ταυτόχρονα με τη σύζευξη, εκτός από τη συμπεριφορά των πολλαπλών συζεύξεων και η αποθήκευση του σπέρματος φαίνεται να παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στη δράση του σπερματικού ανταγωνισμού. Οι πολλαπλές συζεύξεις συνεπάγονται κόστη, όπως ο χρόνος που θα πρέπει να διαθέσει το άτομο για την επιπρόσθετη σύζευξη, το αυξημένο ρίσκο από τους θηρευτές καθώς και τις αυξημένες πιθανότητες μολύνσεων κατά τις συζεύξεις (Yasui 1998). Το ερώτημα που τίθεται αφορά στα οφέλη που έχουν οι οργανισμοί υιοθετώντας τη συμπεριφορά αυτή. Έχει προταθεί ως προς την αναπαραγωγική επιτυχία των θηλυκών, ότι οι πολλαπλές συζεύξεις αποτελούν ένα τρόπο να αυξήσουν τη γενετική ποικιλότητα των απογόνων τους ούτως ώστε να μειωθεί η διακύμανση της αρμοστικότητας τους σε μη 10

20 Εισαγωγή προβλέψιμα ενδιαιτήματα (Yasui 1998, 2001, Jennions & Petrie 2000, Fox & Rauter 2003). Επίσης, η συμπεριφορά αυτή των πολλαπλών συζεύξεων διασφαλίζει την αποφυγή των στείρων αρσενικών (Chen & Baur 1993). Σε ό,τι αφορά τα αρσενικά, όπου η αναπαραγωγική του επιτυχία αυξάνεται γραμμικά με τον αριθμό των συζεύξεων η αύξηση της αναπαραγωγικής τους επιτυχίας μπορεί να επιτευχθεί με ποικίλες προσαρμογές συμπεριφοράς, όπως με συζεύξεις μεγάλης διάρκειας και την περιφρούρηση της συντρόφου (mate guarding) (Rowe 1994), με διέγερση της ωοαπόθεσης από το θηλυκό, με καθυστέρηση της σύζευξης του θηλυκού ξανά με άλλο άτομο σφραγίζοντας το γεννητικό πόρο του θηλυκού (sperm plugs), ή με την απομάκρυνση του σπέρματος (sperm removal) από το γεννητικό πόρο του θηλυκού (Birkhead & Hunter 1990). Επομένως, ο σπερματικός ανταγωνισμός ως κύρια συνιστώσα της φυλοεπιλογής σε μετα-συζευκτικό επίπεδο θεωρείται μια ισχυρή εξελικτική δύναμη ως προς την επιλογή ποικίλων χαρακτηριστικών (αναπαραγωγικής συμπεριφοράς, φυσιολογίας και ανατομίας του αναπαραγωγικού συστήματος) που σχετίζονται με την αναπαραγωγική επιτυχία των αρσενικών (Smith 1984, Birkhead & Møller 1998). Από την πλευρά των θηλυκών η δυνατότητα αποθήκευσης του σπέρματος δίνει σε αυτά τη δυνατότητα του ελέγχου της διαδικασίας της γονιμοποίησης των ωαρίων τους προκειμένου να αυξήσουν την αναπαραγωγική τους επιτυχία. Η συμπεριφορά των πολλαπλών συζεύξεων είναι επίσης ευρέως διαδεδομένη και στα ερμαφρόδιτα ζώα. Ιδιαίτερα στα ταυτόχρονα ερμαφρόδιτα ζώα η προσέγγιση του ερωτήματος γίνεται ακόμα πιο πολύπλοκη καθώς και τα δυο φύλα συνυπάρχουν και είναι τυτόχρονα λειτουργικά στο ίδιο άτομο. Έτσι, τα χαρακτηριστικά εκείνα που αναμένονται να ορίσουν την αναπαραγωγική επιτυχία του αρσενικού ρόλου του ατόμου, όπως οι πολλαπλές συζεύξεις (Bateman 1948), αναπόφευκτα θα επηρεάσουν ταυτόχρονα και την αναπαραγωγική επιτυχία του θηλυκού ρόλου του ατόμου, καθώς η κατανομή των ενεργειακών αποθεμάτων αφορά στο ίδιο άτομο και μάλιστα και στους δυο ρόλους του. Σύμφωνα με τη Leonard (1991) στα ταυτόχρονα ερμαφρόδιτα με εσωτερική γονιμοποίηση η επιλεγόμενη αναπαραγωγική στρατηγική είναι οι πολλαπλές συζεύξεις σε συνδυασμό με την ανάπτυξη δομών που επιτρέπουν το χειρισμό του αλλοσπέρματος, προκειμένου να βελτιστοποιηθούν και οι δυο ρόλοι του αναπαραγωγικού συστήματος. Ο Δαρβίνος (1871) πίστευε ότι η φυλοεπιλογή δεν θα μπορούσε να δράσει στους ερμαφρόδιτους οργανισμούς, κυρίως επειδή τα δυο φύλα συνυπάρχουν στο ίδιο άτομο. Δεν υπάρχει φυλετικός διμορφισμός στα ερμαφρόδιτα, ούτως ώστε να είναι δυνατή η επιλογή επιθυμητών χαρακτηριστικών πριν από τη σύζευξη, όπως υπάρχει στα γονοχωριστικά είδη. Επιπλέον, με βάση το Δαρβίνο η δράση της φυλοεπιλογής βρίσκεται σε προ-συζευκτικό επίπεδο (ενδοφυλοεπιλογή και διαφυλοεπιλογή) και πράγματι λίγα στοιχεία πέρα από την επιλογή συντρόφου με βάση το μέγεθος (Staub & Ribi 1995, Zahradnik et al. 2008, Erlandsson & Rolán-Alvarez 1998) υπάρχουν στη βιβλιογραφία που να υποστηρίζουν τη δράση της 11

21 Εισαγωγή φυλοεπιλογής σε προ-συζευκτικό επίπεδο στους ερμαφρόδιτους οργανισμούς. Επομένως, είναι πιθανόν ο ερμαφροδιτισμός να προάγει την επιλογή χαρακτήρων σε μετα-συζευκτικό επίπεδο (Charnov 1979, Michiels 1998, Rogers & Chase 2001). Ανάμεσα στα ταυτόχρονα ερμαφρόδιτα, τα χερσαία πνευμονοφόρα γαστερόποδα αποτελούν κατάλληλους οργανισμούς-μοντέλα (model organisms) για τη μελέτη της φυλοεπιλογής και του σπερματικού ανταγωνισμού (Leonard 1991, Baur 1998) γιατί παρουσιάζουν συμπεριφορά πολλαπλών συζεύξεων και παρέχουν τη δυνατότητα της αποθήκευσης του σπέρματος του συντρόφου τους (αλλόσπερμα) (Tompa 1984). Τα περισσότερα είδη των χερσαίων σαλιγκαριών έχουν περιορισμένη δυνατότητα διασποράς, το οποίο θα μπορούσε να οδηγήσει σε αυξημένες πιθανότητες ομομιξίας. Επίσης, οι χαμηλές πυκνότητες των πληθυσμών περιορίζουν την πιθανότητα εύρεσης συντρόφου αυξάνοντας έτσι το κόστος των πολλαπλών συζεύξεων. Εφόσον φαίνεται ότι οι πολλαπλές συζεύξεις αποτελούν κανόνα στη συμπεριφορά αναπαραγωγής των χερσαίων γαστεροπόδων (Tompa 1984), θα μπορούσε να υποτεθεί ότι η αρσενική λειτουργία των ατόμων επωφελείται από τη συμπεριφορά αυτή καθώς αυξάνεται η πιθανότητα της αναπαραγωγικής τους επιτυχίας (Bateman 1948). Από την άλλη πλευρά η θηλυκή λειτουργία των ατόμων μπορεί να έχει άμεσα οφέλη όπως θρεπτικά συστατικά που εμπεριέχονται στο σπερματοφόρο, ή έμμεσα οφέλη που αφορούν στη συμβατότητα μεταξύ των γονέων σε γενετικό επίπεδο, την απόκτηση «καλών γονιδίων» ή την αύξηση της γενετικής ποικιλότητας σε μια ωοαπόθεση (Yasui 1998, Zeh & Zeh 2001, Fox & Rauter 2003, Neff & Pitcher 2005). Η υπόθεση του αν οι πολλαπλές συζεύξεις οδηγούν και στην πολλαπλή πατρότητα των απογόνων δεν έχει διερευνηθεί εκτενώς στα χερσαία πνευμονοφόρα γαστερόποδα. Η πολλαπλή πατρότητα έχει αναφερθεί στα είδη Cepea nemoralis (Murray 1964), Arianta arbustorum (Baur 1994) και Cornu aspersum (Landolfa et al. 2001, Rogers & Chase 2002, Evanno et al. 2005), τα οποία αποτελούν αντικείμενο ερευνών που αφορούν στο θεωρητικό υπόβαθρο της φυλοεπιλογής στους ερμαφρόδιτους οργανισμούς. Οι έρευνες αυτές που πραγματοποιήθηκαν σε σαλιγκάρια με δυο συζεύξεις αποκάλυψαν μεγάλη ποικιλότητα ως προς τα πρότυπα της χρήσης του αλλοσπέρματος (Baur 1994, Landolfa et al. 2001) ή προτεραιότητα πατρότητας του πρώτου συντρόφου (Evanno et al. 2005) η οποία επηρεάζεται από την επιτυχημένη ή όχι εκτόξευση ακοντίου (Rogers & Chase 2002). Πέρα από τη συμπεριφορά εκτόξευσης ακοντίου κατά τη σύζευξη η οποία σε πολλά είδη έχει συσχετιστεί θετικά και με την παρουσία της σπερματοθήκης ως όργανο αποθήκευσης του αλλοσπέρματος (Beese et al. 2009), γενικότερα οι δομές του αναπαραγωγικού συστήματος των χερσαίων γαστεροπόδων που δέχονται, αποθηκεύουν και υδρολύουν το αλλόσπερμα χαρακτηρίζονται από εξαιρετική ποικιλότητα τόσο μεταξύ 12

22 Εισαγωγή διαφορετικών οικογενειών, όσο και μεταξύ διαφορετικών ειδών της ίδιας οικογένειας (Tompa 1984). Η πολυπλοκότητα και η ποικιλότητα των δομών αυτών αντανακλά τη δράση της φυλοεπιλογής σε αυτά. Η κύρια εξελικτική διαδικασία που οδήγησε στην τεράστια αυτή ποικιλότητα των δομών αυτών είναι ο σπερματικός ανταγωνισμός, δηλαδή ο ανταγωνισμός στο επίπεδο της γονιμοποίησης των ωαρίων και όχι στο επίπεδο της επιλογής συντρόφου. Έτσι, στο τροπικό σαλιγκάρι Limicolaria flammea βρέθηκε λειτουργικό σπέρμα 108 ημέρες μετά την τελευταία σύζευξη, ενώ οι αντίστοιχοι χρόνοι για τα Limicolaria martensiana, Achatina fulica, Macrochlamys indica και Cepaea nemoralis είναι 520 ημέρες, 341 ημέρες, 476 ημέρες και 4 χρόνια (Baur 1998). Η συμπεριφορά των πολλαπλών συζεύξεων σε συνδυασμό με την ικανότητα αποθήκευσης του αλλοσπέρματος στα σαλιγκάρια είναι δυνατόν να οδηγήσουν στην πολλαπλή πατρότητα των απογόνων σε μια ωοαπόθεση (Baur 1998, Landolfa et al. 2001, Garefalaki et al. 2010). Φαίνεται λοιπόν ότι το τελικό αποτέλεσμα της αναπαραγωγικής συμπεριφοράς και του σπερματικού ανταγωνισμού, που αντανακλάται στην πολλαπλή πατρότητα και ευρωστία της επόμενη γενιάς στοιχειοθετείται από ένα σύνολο αλληλένδετων παραγόντων γενετικών, συμπεριφοράς, φυσιολογίας και ανατομίας του αναπαραγωγικού συστήματος (Baur 1994, Landolfa et al. 2001, Rogers & Chase 2002, Evanno et al. 2005, Garefalaki et al. 2010). 1.4 Αναπαραγωγικό σύστημα του C. αspersum Το αναπαραγωγικό σύστημα των χερσαίων πνευμονοφόρων γαστεροπόδων είναι εξαιρετικά πολύπλοκο καθώς συμπεριλαμβάνει ταυτόχρονα λειτουργικά τμήματα τόσο του αρσενικού όσο και του θηλυκού αναπαραγωγικού συστήματος. Τα επιμέρους τμήματα του αναπαραγωγικού συστήματος μπορούν να χωριστούν σε εκείνα που ανήκουν και στα δυο φύλα (ερμαφρόδιτα), και σε εκείνα που επιτελούν λειτουργίες του αρσενικού ή του θηλυκού αναπαραγωγικού συστήματος χωριστά (Εικόνα 1.3). 13

23 Εισαγωγή Εικόνα 1.3. Αναπαραγωγικό σύστημα του C. aspersum (Tompa 1984). Τα «αρσενικά» μέρη του αναπαραγωγικού συστήματος απεικονίζονται με γαλάζιο, τα «θηλυκά» με ροζ ενώ τα ερμαφρόδιτα μέρη του αναπαραγωγικού συστήματος με το συνδυασμό των δυο παραπάνω χρωμάτων. Figure 1.3 Reproductive system of C. aspersum (Tompa 1984). The male parts are indicated in blue, the female parts in pink and the hermaphroditic parts by the combination of these two colors. Ο γεννητικός πόρος εξυπηρετεί τον αρσενικό ρόλο του ατόμου καθώς μέσα από αυτόν εξέρχεται το πέος που θα μεταφέρει το σπερματοφόρο, ενώ ταυτόχρονα εξυπηρετεί και το θηλυκό του ρόλο καθώς αποτελεί σημείο εισόδου του πέους του συντρόφου που θα μεταφέρει αντίστοιχα ένα σπερματοφόρο. Η γονάδα (hermaphroditic gland) παράγει γαμέτες και των δυο φύλων, δηλαδή και ωάρια και σπερματοζωάρια από τα επιθηλιακά κύτταρα τα οποία διαφοροποιούνται σε γαμέτες. Όπως συμβαίνει στη φύση ο αριθμός των σπερματοζωαρίων που παράγονται είναι εξαιρετικά μεγαλύτερος από εκείνο των ωαρίων. Τα σπερματοζωάρια που παράγονται στην γονάδα (αυτόσπερμα) κατέρχονται ενεργητικά μέσω του ερμαφροδιτικού αγωγού και διαμέσου της σπερματοθήκης περνούν στον σπερμοωαγωγό. Παράλληλα, από τον ερμαφροδιτικό αγωγό κατέρχονται και τα ωάρια που θα φτάσουν στο χώρο γονιμοποίησης της σπερματοθήκης. Ο σπερμοωαγωγός με περισταλτικές κινήσεις ωθεί τα σπερματοζωάρια στο απαγωγό κανάλι του σπέρματος. Κατά μήκος του σπερμοωαγωγού τα γονιμοποιημένα ωάρια λαμβάνουν τα εξωτερικά στρώματα του κελύφους και εξέρχονται κατά την 14

24 Εισαγωγή ωοαπόθεση από το γεννητικό πόρο. Επίσης από τον σπερμοωαγωγό περνάει και το αλλόσπερμα προκειμένου να αποθηκευτεί στη σπερματοκύστη. Τα τμήματα του αναπαραγωγικού συστήματος που αφορούν στην αρσενική λειτουργία των σαλιγκαριών είναι το απαγωγό κανάλι του σπέρματος, ο επίφαλλος, το μαστίγιο, το πέος, ο ανελκτήρας μυς του πέους και ο σάκος το ακοντίου. Συγκεκριμένα, στο απαγωγό κανάλι του σπέρματος το σπέρμα ακινητοποιείται και εμπλουτίζεται με θρεπτικά συστατικά από τον προστάτη αδένα που είναι προσαρτημένος στο απαγωγό κανάλι. Στη συνέχεια το σπέρμα περνάει στον επίφαλλο στον αγωγό του οποίου σχηματίζεται το σπερματοφόρο (Εικόνα 1.4). Εικόνα 1.4 Σπερματοφόρο του C. aspersum. Φαίνεται το σώμα του σπερματοφόρου γεμάτο με σπέρμα και η ουρά του σπερματοφόρου. Figure 1.4 Spermatophore of C. aspersum. The body of spermatophore filled with sperm is illustrated as well as the spermatophore tail. Το σπερματοφόρο εξυπηρετεί αρχικά στη μεταφορά του σπέρματος κατά τη σύζευξη. Αποτελείται από την κεφαλή, το κυρίως σώμα που περιέχει το σπέρμα, και την ουρά η οποία σχηματίζεται στο μαστίγιο. Ο ανελκτήρας μυς του πέους εγείρει το πέος το οποίο με περισταλτικές κινήσεις συμβάλλει στον τελικό σχηματισμό της κεφαλής και του λαιμού του σπερματοφόρου. Τα μη παρθένα άτομα είναι δυνατό να εκτοξεύσουν το ακόντιο με αποτέλεσμα τη διάτρηση του σωματικού τοιχώματος του συντρόφου. Η συμπεριφορά αυτή καλείται εκτόξευση ακοντίου (dart shooting). Συγκεκριμένα, το ακόντιο αποβάλλεται από μια δυνατή ανύψωση του βλεννώδους σάκου του ακοντίου, όταν τα άτομα έχουν έρθει σε στενή σωματική επαφή (Adamo & Chase 1988; Chung 1987). Φυσιολογικά το ακόντιο αποκόβεται από το σάκο του όταν τρυπήσει η άκρη του το δέρμα του συντρόφου. Συνήθως, όταν ο ένας από τους δύο συντρόφους έχει ρίξει το ακόντιό του, ο σύντροφος του θα κάνει το ίδιο, μετά από χρονικό διάστημα 8 περίπου λεπτών (Adamo & Chase 1988). Η πραγματική σημασία της εκτόξευσης ακοντίου, είναι ακόμη άγνωστη, επειδή τα σαλιγκάρια μπορούν να ζευγαρώσουν και να ανταλλάξουν σπέρμα, επιτυχώς, χωρίς ποτέ να απελευθερώσουν ή να δεχτούν ακόντιο (Jeppensen 1976). Έχει διατυπωθεί ότι η επιτυχημένη εκτόξευση του ακοντίου αυξάνει την αναπαραγωγική επιτυχία του «δότη» σπέρματος καθώς μειώνονται η 15

25 Εισαγωγή περισταλτικές κινήσεις του γαμετολυτικού αδένα του «δέκτη» σπέρματος. (Adamo & Chase 1990, Koene & Chase 1998, Rogers & Chase 2001, Landolfa et al. 2001). Η θηλυκή λειτουργία του αναπαραγωγικού συστήματος περιλαμβάνει τα εξής όργανα: τη σπερματοκύστη, το βοηθητικό αγωγό της σπερματοκύστης, τη σπερματοθήκη και τον αλβουμινικό αδένα. Κατά τη σύζευξη τα σαλιγκάρια ανταλλάσουν σπερματοφόρα. Η υποδοχή του σπερματοφόρου γίνεται στο στέλεχος της σπερματοκύστης, ενώ η σπερματοκύστη δρα ως γαμετολυτικός αδένας εκκρίνοντας υδρολυτικά ένζυμα. Τα ένζυμα αυτά αποικοδομούν το σπερματοφόρο και το μεγαλύτερο μέρος των σπερματοζωαρίων που αυτό φέρει. Όσα καταφέρουν να διαφύγουν περνούν από το σπερμοωαγωγό και αποθηκεύονται στη σπερματοθήκη. Η σπερματοθήκη βρίσκεται στο τελικό άκρο του ερμαφροδιτικού αγωγού, ενσωματωμένη στον αλβουμινικό αδένα. Αποτελείται από έναν απλό χώρο γονιμοποίησης και έναν αριθμό τυφλών σωληναρίων που κυμαίνονται από δυο ως 11 (Koemtzopoulos & Staikou 2007). Ο χώρος γονιμοποίησης είναι ένας πεπλατυσμένος σάκος που έχει κοινή είσοδο με τα σωληνάρια της σπερματοθήκης. Τα σωληνάρια αποτελούνται από κιονοειδές επιθήλιο και περιβάλλονται από μυϊκό ιστό. Εξωτερικά η σπερματοθήκη περικλείεται από συνδετικό ιστό και παρουσιάζει πλούσια νεύρωση (Tompa 1984). Τα σωληνάρια έχουν ως κύρια λειτουργία την αποθήκευση του ξένου σπέρματος μετά τη σύζευξη. Έχει αποδειχθεί ότι άτομα που δε συζεύχθηκαν ή που αφέθηκαν να συζευχθούν αλλά εμποδίστηκε η μετακίνηση του ξένου σπέρματος στον σπερμοωαγωγό δε διαθέτουν σπέρμα στα σωληνάρια της σπερματοθήκης τους, γεγονός που υποδηλώνει ότι η σπερματοθήκη δεν αποθηκεύει σπέρμα του ίδιου του ατόμου. Το σπέρμα του κάθε ατόμου περνά κατευθείαν από τον ερμαφροδιτικό αγωγό στο σπερμοωαγωγό χωρίς να παραμείνει στη σπερματοθήκη (Lind 1973). Τα ωάρια που φεύγουν από τη γονάδα καταφθάνουν μέσω του ερμαφροδιτικού αγωγού στο χώρο γονιμοποίησης της σπερματοθήκης. Μετά τη γονιμοποίηση, ο αλβουμινικός αδένας παρέχει στο ζυγωτό ωοαλβουμίνη, γλυκολιπίδια και πλήθος θρεπτικών ουσιών. Στη συνέχεια κατά μήκος του σπερμοωαγωγού λαμβάνουν τα εξωτερικά στρώματα του κελύφους του αβγού και εξέρχονται κατά την ωοαπόθεση από το γεννητικό πόρο. 1.5 Αναπαραγωγική συμπεριφορά του C. aspersum Το αριστερό και το δεξί τμήμα του μέσου εγκεφάλου θεωρούνται υπεύθυνα για την αναπαραγωγική συμπεριφορά (Chase 1986). Το δεξί τμήμα είναι μεγαλύτερο, δικαιολογώντας το γεγονός ότι οι περισσότερες αναπαραγωγικές δομές του σαλιγκαριού βρίσκονται στη δεξιά πλευρά της σωματικής κοιλότητας. Θεωρείται ότι τα κύτταρα του τμήματος αυτού 16

26 Εισαγωγή συμμετέχουν στην εκτόξευση του ακοντίου και στη διέγερση του πέους (Koene & Chase 1998). Το σαλιγκάρι Cornu aspersum (προηγουμένως: Helix aspersa και Cantareous aspersus) είναι ένα ταυτόχρονα ερμαφρόδιτο χερσαίο πνευμονοφόρο γαστερόποδο. Είναι ένα υποχρεωτικά ετερογονιμοποιούμενο είδος όπου κατά την σύζευξη πραγματοποιείται αμοιβαία ανταλλαγή σπέρματος με εσωτερική γονιμοποίηση και χαρακτηρίζεται από αυστηρή αμοιβαιότητα (strict reciprocity) κατά τη σύζευξη. Κατά τη διάρκεια μιας αναπαραγωγικής περιόδου πραγματοποιεί πολλαπλές συζεύξεις με το ίδιο ή με διαφορετικά άτομα οι οποίες είναι κατά μέσο όρο τρείς (με μέγιστο επτά φορές) σε πληθυσμούς της Βρετανίας που παρατηρήθηκαν στο πεδίο (Fearnley 1993, 1996) και σε εργαστηριακές συνθήκες (Madec & Daguzan 1993, Fearnley 1996). Σε εργαστηριακές παρατηρήσεις της αναπαραγωγικής συμπεριφοράς του είδους από πληθυσμούς της Ελλάδας τα σαλιγκάρια πραγματοποιούσαν κατά μέσο όρο τρεις συζεύξεις (με μέγιστο τις επτά συζεύξεις με πέντε διαφορετικά άτομα) κατά τη διάρκεια μιας αναπαραγωγικής περιόδου. Η συχνότητα σύζευξης φαίνεται να έχει γενετικό υπόβαθρο καθώς σε σαλιγκάρια της F1 γενιάς που μεγάλωσαν στο εργαστήριο το πρότυπο ως προς τη συχνότητα σύζευξης παρέμεινε σταθερό (Κοεμτζόπουλος 2007). Στο πεδίο τα περισσότερα σαλιγκάρια πέφτουν σε νάρκη κατά τη διάρκεια της ξηρής περιόδου που χαρακτηρίζει τα Μεσογειακά οικοσυστήματα (Ιούνιος- Σεπτέμβριος) και με τις πρώτες βροχές του Οκτώβρη ξυπνούν από τη νάρκη και ξεκινούν αμέσως την αναπαραγωγική δραστηριότητα. Η αναπαραγωγική περίοδος διαρκεί για δυο μήνες περίπου. Η διάρκεια της κάθε σύζευξης ποικίλλει από δυο ως δώδεκα ώρες (Κοεμτζόπουλος 2007) κατά τη διάρκεια της οποίας κάθε άτομο μεταφέρει ένα σπερματοφόρο στο σύντροφό του που περιέχει από 10 6 ως 14 Χ 10 6 σπερματοζωάρια (Rogers & Chase 2001). Ο βοηθητικός αγωγός της σπερματοκύστης υποδέχεται το σπερματοφόρο, και η σπερματοκύστη υδρολύει το σπερματοφόρο και το μεγαλύτερο ποσοστό των σπερματοζωαρίων που αυτό περιέχει. Μόνο ένα μικρό ποσοστό από αυτά διαφεύγει και περνώντας από το σπερμοωαγωγό καταλήγει και αποθηκεύεται στη σπερματοθήκη, (Rogers & Chase 2001). Η γονιμοποίηση των ωαρίων πραγματοποιείται μερικές ώρες ή μέρες αργότερα (Madec et al. 1998). Φαίνεται λοιπόν, ότι η αλληλεπίδραση των δομών του αναπαραγωγικού συστήματος με την αναπαραγωγική συμπεριφορά αποτελούν επιτρέπουν τη δράση της φυλοεπιλογής μέσω του σπερματικού ανταγωνισμού καθώς και μέσω της άδηλης επιλογής του θηλυκού. Το C. aspersum είναι ένα ποικιλόθερμο, υγρόφιλο ασπόνδυλο, πράγμα που σημαίνει ότι η αύξηση και δραστηριότητα του εξαρτώνται άμεσα από τις περιβαλλοντικές συνθήκες. Παρόλο που οι χαρακτήρες αυτοί ελέγχονται γενετικά, οι διαφορετικές κλιματικές συνθήκες των ενδιαιτημάτων μπορούν να προκαλέσουν σημαντικές διαφορές στο μέγεθος και βάρος των σαλιγκαριών (Lazaridou-Dimitriadou et al. 1983). Οι κυριότεροι αβιοτικοί και βιοτικοί παράγοντες που επηρεάζουν την αύξηση και αναπαραγωγή του C. 17

27 Εισαγωγή aspersum είναι η θερμοκρασία, η υγρασία, η φωτοπερίοδος, το υπόστρωμα, ο συνωστισμός, καθώς και οι διάφοροι θηρευτές ή παράσιτα. Σε γενικές γραμμές, η βέλτιστη θερμοκρασία για την αύξηση και δραστηριότητα του C.aspersum κυμαίνεται στους ο C, ενώ σε θερμοκρασίες μικρότερες των 5-7 ο C ή μεγαλύτερες των o C το σαλιγκάρι πέφτει σε χειμερινή ή θερινή νάρκη, αντίστοιχα. Η σχετική υγρασία του περιβάλλοντος έχει ιδιαίτερη σημασία για τα σαλιγκάρια και ιδιαίτερα για τα νεαρά άτομα. Παρατηρούνται τόσο ημερήσιες όσο και εποχιακές μεταβολές του σωματικού υδατικού περιεχομένου (Klein-Rollais & Daguzan 1990). Η βέλτιστη υγρασία για την αύξηση και αναπαραγωγή του C. aspersum κυμαίνεται μεταξύ 70% ή και 100% (Charrier & Daguzan 1980), ενώ σε επίπεδα κάτω του 60% η δραστηριότητά του ελαττώνεται σημαντικά (Klein-Rollais & Daguzan 1990). Κατά τις περιόδους νάρκης η απώλεια νερού ελαχιστοποιείται, κυρίως λόγω ελάττωσης της διαπερατότητας του μανδύα (Machin, 1966, Klein-Rollais & Daguzan 1988). Αν και τα σαλιγκάρια είναι κυρίως δραστήρια κατά το ημίφως και τη νύχτα (De Matos & Serra 1984), έχει δειχτεί ότι οι φωτοπερίοδος με μεγαλύτερη διάρκεια ημέρας (π.χ. 18:6 ή 13:11 L:D) είναι γενικά πιο ευνοϊκές για την αύξηση και δραστηριότητα του Cornu aspersum (Lazaridou- Dimitriadou & Bailey 1991). Σε γενικές γραμμές η φωτοπερίοδος φαίνεται ότι παίζει καθοριστικό ρόλο σε διάφορες μορφές δραστηριότητας του Cornu aspersum (κίνηση, τροφοληψία, αναπαραγωγή, νάρκη), πράγμα που σχετίζεται με τη ρύθμιση ενδογενώς καθορισμένων ημερήσιων και ετήσιων κύκλων του είδους (Bailey 1981, 1983). Άλλος σημαντικός αβιοτικός παράγοντας που επηρεάζει την αύξηση και αναπαραγωγή του Cornu aspersum είναι το υπόστρωμα πάνω στο οποίο δραστηριοποιείται και κυρίως η περιεκτικότητα του σε ασβέστιο, καθώς και η διαθεσιμότητα του ασβεστίου (Crowell 1973). Από τους βιοτικούς παράγοντες που σχετίζονται άμεσα με την αύξηση και αναπαραγωγή των σαλιγκαριών, κυριότεροι είναι ο συνωστισμός και οι θηρευτές παράσιτα. Στο Cornu aspersum μέχρι ενός ορίου πυκνότητας, ο συνωστισμός έχει θετική επίδραση στην αύξηση και γεννησιμότητα (Charrier 1980), ενώ πάνω από ορισμένα επίπεδα, έχει αρνητική επίδραση τόσο στην αύξηση όσο και στη γεννησιμότητα και τη βιωσιμότητα (Charrier 1980; Staikou & Lazaridou-Dimitriadou 1989). Μεταξύ των κυριότερων θηρευτών των σαλιγκαριών μπορούμε να διακρίνουμε τους αρουραίους, τα ποντίκια, τα κουνάβια, τους σκαντζόχοιρους, τους τυφλοπόντικες κ.α. (από τα θηλαστικά), το κοράκι, την καρακάξα, την τσίχλα, το κοτσύφι (από τα πτηνά), καθώς και τα φίδια και λιγότερο τις σαύρες (από τα ερπετά). Επίσης υπάρχουν και αρκετοί ασπόνδυλοι θηρευτές, όπως έντομα (σαρκοφάγα δίπτερα, κολεόπτερα) και μυριάποδα (Λαζαρίδου- Δημητριάδου & Κάττουλας 1985). Όσο αφορά στα παράσιτα, το άκαρι Riccardoella limacum (στην πνευμονική κοιλότητα), ο διγενής τρηματώδης πλατυέλμινθας Brachylaima migrans (στο νεφρό), καθώς και διάφοροι άλλοι νηματώδεις έλμινθες βρίσκονται στο μυϊκό ιστό του ποδιού. Σε κάθε 18

28 Εισαγωγή περίπτωση, πάντως, τα παραπάνω παράσιτα δεν θεωρούνται επικίνδυνα για τη δημόσια υγεία, όπως π.χ. άλλοι διγενείς τρηματώδεις που παρασιτούν σε λιμναία κυρίως σαλιγκάρια (Λαζαρίδου-Δημητριάδου & Κάττουλας 1985). 1.6 Συστηματική κατάταξη και γεωγραφική εξάπλωση του C. aspersum Η περιγραφή του είδους Cornu aspersum έγινε για πρώτη φορά από το Δανό φυσιοδίφη Otto Friedrich Müller ( ) στο βιβλίο του "Vermium Terrestrium et Fluviatilium seu animalium infusorium, helminthicorum, et testaceorum non marinorum succincta historia" το 1774 με την ονομασία Helix aspersa. Helix aspersa σημαίνει στα λατινικά διάστικτο σαλιγκάρι ή σαλιγκάρι με κηλίδες. Στη Βιέννη το 1778 ο Ignaz von Born ( ) στο βιβλίο του "Index rerum naturalium Musei Caesarei Vindobonensis" δημοσίευσε μια εικόνα ενός δύσμορφου καφέ σαλιγκαριού ως Cornu copiae. Το είδος αυτό έλαβε αργότερα (1837) μια άλλη ονομασία από τον Jean de Charpentier στο βιβλίο του "Catalogue des mollusques terrestres et fluviatiles de la Suisse". Ονομάστηκε Cryptomphalus aspersus, όπου Cryptomphalus (κρυπτό + αφαλός) στα ελληνικά σημαίνει ότι ο αφαλός του κελύφους δεν φαίνεται. Αντιθέτως, o Giusti και οι συνεργάτες του (1996) στο βιβλίο "The non-marine molluscs of the Maltese Islands" τοποθετούν το καφέ σαλιγκάρι στο γένος Cantareus RISSO Συγκεκριμένα, το γένος Cornu θεωρείται αβάσιμο γιατί το δείγμα που περιέγραψε ο von Born ήταν δύσμορφο κάτι που σύμφωνα με την ICZN (International Commission on Zoological Nomenclature) δεν επιτρέπεται. Στην έκδοση του 2001 της CLECOM (Check List of European Continental Mollusca) το είδος καταγράφεται ως Cornu aspersum aspersum (O.F. MÜLLER, 1774). Το αποτέλεσμα είναι σήμερα κάποιοι ερευνητές να χρησιμοποιούν την ονομασία Cantareus aspersus σύμφωνα με τον Giusti, άλλοι λαμβάνουν υπόψη τους τον όρο Cornu aspersum σύμφωνα με την CLECOM. Τέλος άλλοι χρησιμοποιούν την αρχική συστηματική ονομασία Helix aspersa προς τιμή του Müller ( ). Η συστηματική κατάταξη του είδους C. aspersum σήμερα είναι: Βασίλειο : Animalia (Ζώα) Φύλο : Mollusca (Μαλάκια) Κλάση : Gastropoda (Γαστερόποδα) Τάξη : Pulmonata (Πνευμονοφόρα) Υποτάξη : Stylommatophora (Στυλομματοφόρα) Οικογένεια : Helicidae (Ελικοειδή) Γένος : Cornu Είδος : Cornu aspersum 19

29 Εισαγωγή Όσον αφορά στην κατανομή του σύμφωνα με αναφορά του Burch (1960), το C. aspersum απαντάται στη Β. Αφρική, στις περιοχές της Μεγάλης Βρετανίας, της Δυτικής Ευρώπης και στις χώρες που βρίσκονται γύρω από τη Μεσόγειο και τη Μαύρη Θάλασσα. Το είδος αυτό, ωστόσο έχει εισαχθεί και στα νησιά του Ατλαντικού, στη Νότιο Αφρική, στην Αϊτή, στη Νέα Ζηλανδία, στη Αυστραλία, το Μεξικό, τη Χιλή και στην Αργεντινή, αποτελεί δηλαδή πλέον κοσμοπολίτικο είδος. Όσον αφορά στην περιοχή των Ηνωμένων Πολιτειών, ο Capinera (2001) αναφέρει ότι το C. aspersum απαντάται στην Καλιφόρνια και κατά μήκος των δυτικών ακτών βόρεια της Βρετανικής Κολομβίας και του Καναδά, καθώς επίσης και στις περισσότερες από τις νότιες πολιτείες και κατά μήκος της ανατολικής ακτής βόρεια του New Jersey. Στις περιοχές αυτές θεωρείται επικίνδυνο παράσιτο των καλλιεργειών σιτηρών και των καλλωπιστικών φυτών, όπως καταγράφηκε στην Καλιφόρνια. 1.7 Οικονομική σημασία του Cornu aspersum Τα σαλιγκάρια κατείχαν από την αρχαιότητα στοιχείο του πολιτισμού και της λαογραφίας της Ελλάδας. Ο Αριστοτέλης αναφέρεται σε πολλά σημεία των έργων του στους «κοχλίες» ως αναπόσπαστο στοιχείο του πολιτισμού. Πρόσφατες αρχαιολογικές μελέτες αποκάλυψαν την παρουσία και καλλιέργεια εδώδιμων σαλιγκαριών σε σπηλιές της Μεσογείου κατά την προϊστορική εποχή (Lubell 2004). Συγκεκριμένα, το Cornu aspersum αποτελεί βασικό συστατικό της λαογραφίας πολλών περιοχών της Ελλάδας, ιδιαίτερα της Κρήτης ως έδεσμα. Τα τελευταία χρόνια το ενδιαφέρον της Ευρώπης έχει αυξηθεί για το είδος αυτό και οι εκτροφές σαλιγκαριών σε ελεγχόμενο από ευρωπαϊκά πρότυπα επίπεδο έχουν ανθίσει στην Γαλλία, την Ιταλία, την Ισπανία αλλά και στην Ελλάδα καθώς και στη Κύπρο. Το εμπορικό ενδιαφέρον ως προς το είδος αυτό δεν αφορά μόνο στη γαστρονομία αλλά και το χώρο της δερματολογίας και της αισθητικής (Tsoutsos et al. 2009). Επιπλέον, επειδή το συγκεκριμένο είδος αναπαράγεται και μεγαλώνει εύκολα σε εργαστηριακές συνθήκες, χρησιμοποιείται ως αντικείμενο έρευνας σε ποικίλους τομείς της Βιολογίας, όπως είναι Νευροβιολογία, η Γενετική πληθυσμών, η Ηθολογία και η Εξελικτική Βιολογία. 1.8 Στόχος της διατριβής Στην παρούσα διατριβή, που έχει ως αντικείμενο μελέτης την αναπαραγωγική συμπεριφορά και το σπερματικό ανταγωνισμό στο είδος αυτό, έγινε μια προσπάθεια συγκριτικής μελέτης της συμπεριφοράς αναπαραγωγής σε διαπληθυσμιακό επίπεδο με γνώμονα τις διαφορετικές μικροκλιματικές συνθήκες των ενδιαιτημάτων. Η ηθολογική προσέγγιση του θέματος της διατριβής επεκτείνεται και στον σπερματικό ανταγωνισμό ως ισχυρή συνιστώσα της φυλοεπιλογής που μπορεί να επηρεάσει την εξέλιξη της αναπαραγωγικής συμπεριφοράς αλλά και της δομής του αναπαραγωγικού συστήματος (Birkhead & Møller 1998). Έτσι, με κύρια συνιστώσα το 20

30 Εισαγωγή σπερματικό ανταγωνισμό, ο πειραματικός σχεδιασμός περιελάμβανε τρία επίπεδα μελέτης: (α) σε επίπεδο ανατομίας του αναπαραγωγικού συστήματος μελετάται η συσχέτιση της συμπεριφοράς αναπαραγωγής με δομές του αναπαραγωγικού συστήματος που «ελέγχουν» ή/και ορίζονται από της δυνάμεις της φυλοεπιλογής και του σπερματικού ανταγωνισμού, (β) σε επίπεδο ιστολογίας μελετάται η πολυπλοκότητα της σπερματοθήκης σε πληθυσμούς με διαφορετικής έντασης σπερματικό ανταγωνισμό, και (γ) σε γενετικό επίπεδο μελετάται το τελικό αποτέλεσμα της δράσης του σπερματικού ανταγωνισμού που αντανακλάται στην πολλαπλή πατρότητα των απογόνων. 21

31 Υλικά και Μέθοδοι Υλικά και Μέθοδοι Δειγματοληψίες Η επιλογή των πληθυσμών για τη μελέτη της συμπεριφοράς αναπαραγωγής έγινε με βάση τη γεωγραφική του προέλευση και τις διαφορετικές μικροκλιματικές συνθήκες των ενδιαιτημάτων τους. Οι περιοχές δειγματοληψίας βρίσκονταν κυρίως σε περιοχές της Κρήτης (Εικόνα 2.1). Πληθυσμοί ελήφθησαν επίσης από περιοχές της Ηπείρου και της Κέρκυρας. Επιλέχθηκαν φυσικά ενδιαιτήματα με βλάστηση μακί (Εικόνα 2.2), όπου τα σαλιγκάρια βρίσκονταν συναθροισμένα κάτω από πέτρες (Εικόνα 2.3) ή στη βάση των φυτών Sarcopoterium spinosum. Επιπλέον, επιλέχθηκαν ενδιαιτήματα με ανθρώπινη παρέμβαση όπως ποτιζόμενοι ελαιώνες (Εικόνα 2.4) και πορτοκαλεώνες. Οι δειγματοληψίες έγιναν πριν από την έναρξη της αναπαραγωγικής περιόδου, δηλαδή το Σεπτέμβριο. Συλλέχθηκαν αναπαραγωγικά ώριμα άτομα, δηλαδή σαλιγκάρια με γυρισμένο άνοιγμα του περιστομίου τα οποία βρίσκονταν ακόμα σε θερινή νάρκη. Συγκεκριμένα, το φθινόπωρο του 2006 από το νομό Ηρακλείου Κρήτης συλλέχθηκαν τρεις πληθυσμοί από τα βόρεια του νομού (Αρχάνες, Φαράγγι Αλμυρού και Γούβες), δύο από το νότο (Πόμπια και Αγία Μαρίνα) και τέλος τρεις πληθυσμοί στα βόρεια του νομού των Χανίων (δυο από τις Φουρνές και ένας από τα Χανιά). Στη δεύτερη δειγματοληψία που πραγματοποιήθηκε το φθινόπωρο του 2007 συλλέχθηκαν τρεις πληθυσμοί από το ξηρότερο μέρος της Κρήτης που είναι ο Νομός Λασιθίου (Μαρώνια, Ρούσα Εκκλησιά και Σητεία) και δυο πληθυσμοί από το πιο υγρά ενδιαιτήματα στα βόρεια του Νομού Χανίων (Σούδα και Συρίλι) (Εικόνα 2.1). Οι δυο πληθυσμοί από τις Φουρνές (Φουρνές 1 και Φουρνές 2, πορτοκαλεώνες) του Ν. Χανίων καθώς και εκείνος της περιοχής του Πολυτεχνείου (ξηρό ενδιαίτημα) του ίδιου νομού που λήφθηκαν το 2006, εξαιρούνται από την ανάλυση. Αυτό οφείλεται στο γεγονός της υψηλής θνησιμότητας που παρουσίασαν. Ο θάνατος των περισσότερων ατόμων οφείλονταν σε κάποιο πρόβλημα στο μυ του μανδύα που ενώνει το σώμα με το κέλυφος. Τα ζώα κατά την έρπυση δεν κατάφερναν να έλξουν το κέλυφός τους και έμεναν γυμνά με αποτέλεσμα να πεθαίνουν σε διάστημα μερικών ωρών. Στη τελευταία δειγματοληψία που έγινε στις αρχές Σεπτεμβρίου του 2008 συλλέχθηκαν ένας πληθυσμός από την Ηγουμενίτσα, ένας από την Πρέβεζα και ένας από την Κέρκυρα προκειμένου να συγκρίνουμε τη αναπαραγωγική συμπεριφορά των πληθυσμών της Κρήτης με εκείνη των πληθυσμών της Ηπείρου και της Κέρκυρας όπου τα ενδιαιτήματα είναι υγρότερα. Από τους πληθυσμούς αυτούς μόνο εκείνος που προερχόταν από την Ηγουμενίτσα εκδήλωσε συμπεριφορά αναπαραγωγής στο εργαστήριο. Οι υπόλοιποι δυο υποθέτουμε ότι είχαν αναπαραχθεί νωρίτερα στο πεδίο. 22

32 Υλικά και Μέθοδοι Εικόνα 2.1 Χάρτης της Κρήτης όπου φαίνονται οι σταθμοί της δειγματοληψίας (Google Earth). Figure 2.1 Map of Crete with illustrated sampling stations (Google Earth). 23

33 Υλικά και Μέθοδοι Εικόνα 2.2 Περιοχή δειγματοληψίας από ένα φυσικό ξηρό ενδιαίτημα. Figure 2.2 Sampling region of a natural dry habitat. Εικόνα 2.3 Αθροίσματα σαλιγκαριών κάτω από πέτρες στις περιοχές δειγματοληψίας. Figure 2.3 Snail aggregates under stones in the sampling regions. 24

34 Υλικά και Μέθοδοι Εικόνα 2.4 Περιοχή δειγματοληψίας από ένα καλλιεργούμενο ενδιαίτημα (ελαιώνας). Figure 2.4 Sampling region of a cultivated habitat (olive tree field). Συνθήκες εργαστηρίου Τα ώριμα σαλιγκάρια που συλλέχθηκαν μεταφέρθηκαν στο εργαστήριο χωρισμένα ένα προς ένα προκειμένου να παραμείνουν σε νάρκη κατά τη μεταφορά τους και να αποφευχθεί τυχόν ζευγάρωμα σε περίπτωση που ενεργοποιηθούν (Εικόνα 2.5). Ακολούθησε ατομικό μαρκάρισμα των ζώων και η μέτρηση το ύψους (Η) και της διαμέτρου (D) του κελύφους κάθε σαλιγκαριού με παχύμετρο ακριβείας 0,05 χιλιοστών. Εικόνα 2.5 Τρόπος συσκευασίας των σαλιγκαριών για τη μεταφορά τους από το πεδίο στο εργαστήριο. Figure 2.5 Packaging of snails from field to laboratory transfer. Στη συνέχεια τα ζώα τοποθετήθηκαν σε γυάλινα κουτιά εκτροφής διαστάσεων 20cm x 20cm x 40cm (Εικόνα 2.6), σε πυκνότητες αντίστοιχες των φυσικών πυκνοτήτων και σε συνθήκες θερμοκρασίας (20 C) και φωτοπεριόδου (11 h L: 13 h D) που προσομοιάζουν συνθήκες φθινοπώρου στις περιοχές προέλευσης τους. Σε κάθε κουτί σημειώθηκε η ημερομηνία και η 25

35 Υλικά και Μέθοδοι ώρα τοποθέτησης ούτως ώστε να είναι δυνατός ο υπολογισμός του χρόνου ενεργοποίησης των ζώων. Η υγρασία στα κουτιά διατηρούνταν σε υψηλά επίπεδα σε όλη τη διάρκεια του 24ώρου με την τοποθέτηση υγρού σπόγγου στο δάπεδο και η παροχή τροφής ήταν επαρκής (εικόνα 2.6Β). Ως πηγή ασβεστίου, που είναι απαραίτητη κυρίως κατά την αναπαραγωγή, χρησιμοποιήθηκε μαρμαρόσκονη τοποθετημένη σε ξεχωριστό δοχείο. Μέσα σε κάθε κουτί τοποθετήθηκαν επίσης δοχεία με υγρό πριονίδι που αποτελεί πολύ καλό υπόστρωμα για την απόθεση των αυγών (Εικόνα 2.6Α). Τα αβγά που αποθέτονταν συλλέγονταν αμέσως μετά την αποχώρηση του γονέα έτσι ώστε να γίνει δυνατή ατομικά η καταγραφή του αριθμού και του μεγέθους των ωoαποθέσεων για κάθε ένα σαλιγκάρι. Στη συνέχεια τοποθετούνταν σε κουτιά εκκόλαψης για να μετρηθεί η εκκολαπτική επιτυχία. Α Β Εικόνα 2.6 Κουτιά εκτροφής των σαλιγκαριών με τις βέλτιστες συνθήκες για αναπαραγωγή (παροχή τροφής και υγρασία). Figure 2.6 Glass boxes for snail maintenance with optimum conditions for reproduction (food supply and humidity). 26

36 Υλικά και Μέθοδοι Τα νεοεκκολαφθέντα σαλιγκάρια (Εικόνα 2.8) απομακρύνονταν καθημερινά από τα δοχεία εκκόλαψης για να αποφευχθεί ο κανιβαλισμός τους σε αυγά που δεν είχαν ακόμη εκκολαφθεί και τοποθετούνταν σε πλαστικά δοχεία όπου παρακολουθήθηκε η αύξησή τους για χρονικό διάστημα τεσσάρων μηνών. Συμπεριφορά και βιολογία αναπαραγωγής Οι παρατηρήσεις της συμπεριφοράς των σαλιγκαριών άρχιζαν με την ενεργοποίηση των ζώων και ήταν συνεχείς καθ όλη τη διάρκεια της αναπαραγωγικής περιόδου, η οποία διαρκούσε 2-3 μήνες (Οκτώβριο- Δεκέμβριο). Κατά τη διάρκεια της νύχτας οι παρατηρήσεις διευκολύνονταν με τη χρήση ερυθρού φωτισμού. Στη διάρκεια της ημέρας οι παρατηρήσεις γίνονταν σε τακτικά διαστήματα και όταν τα ζώα άρχιζαν να δείχνουν σεξουαλική ενεργοποίηση οι παρακολουθήσεις γίνονταν συνεχείς. Κατά τη διάρκεια της νύχτας όταν τα ζώα εκδήλωναν το μέγιστο της αναπαραγωγικής τους δραστηριότητας η παρακολούθηση ήταν συνεχής από τις οκτώ το απόγευμα ως τις οκτώ το πρωί. Προκειμένου να μελετηθεί η διάρκεια και η κατανομή της αναπαραγωγικής δραστηριότητας, η αναπαραγωγική περίοδος των σαλιγκαριών διαιρέθηκε σε διακριτές διαδοχικές φάσεις προκειμένου να ληφθεί για κάθε πληθυσμό μια ολοκληρωμένη εικόνα. Έτσι καταγράφηκε για κάθε πληθυσμό: η περίοδος συζευκτικής δραστηριότητας μετρώντας για κάθε πληθυσμό το χρονικό διάστημα σε ημέρες από την πρώτη ως την τελευταία σύζευξη που παρατηρήθηκε (Εικόνα 2.7), η περίοδος της δραστηριότητας των ωοαποθέσεων ως το χρονικό διάστημα από την πρώτη ωοαπόθεση που καταγράφηκε στον πληθυσμό ως την τελευταία (Εικόνα 2.8), και η περίοδος της δραστηριότητας των εκκολάψεων (Εικόνα 2.8) ως το χρονικό διάστημα από την πρώτη εκκόλαψη του πληθυσμού ως την τελευταία. Στα χρονικά αυτά διαστήματα υπολογίστηκε το ποσοστό των ατόμων που συμμετείχαν στις διαδικασίες σύζευξης, ωοαπόθεσης και εκκόλαψης από κάθε πληθυσμό. Η εκτίμηση της διάθεσης για σύζευξη έγινε με τις παρακάτω μετρήσεις σε κάθε άτομο του πληθυσμού: της χρονικής περιόδου μεταξύ ενεργοποίησης και πρώτης σύζευξης (Latency Period-LP), που είναι το χρονικό διάστημα από την ενεργοποίηση των σαλιγκαριών με παροχή τροφής και υγρασίας ως τη πρώτη σύζευξη και δείχνει πόσο γρήγορα τα σαλιγκάρια αποκρίνονταν μετά την έξοδο από τη νάρκη και επιδείκνυαν τάση για σύζευξη. Η καταγραφή της χρονική αυτής περιόδου έγινε σε ώρες όταν η 27

37 Υλικά και Μέθοδοι ενεργοποίηση των ζώων πραγματοποιούνταν μέσα στο πρώτο εικοσιτετράωρο, ή σε ημέρες όταν το χρονικό διάστημα ήταν μεγαλύτερο. του χρονικού διαστήματος μεταξύ των διαδοχικών συζεύξεων (Intermating Interval-IMI) για κάθε άτομο σε ώρες όταν οι συζεύξεις πραγματοποιούνταν στο ίδιο εικοσιτετράωρο, ή σε ημέρες όταν το χρονικό διάστημα ήταν μεγαλύτερο. του ποσοστού των ατόμων που ζευγάρωσαν τουλάχιστον μια φορά κατά τη διάρκεια των παρατηρήσεων του αριθμού συζεύξεων (Number of Matings-NM) που πραγματοποίησε το κάθε άτομο κατά τη διάρκεια ολόκληρης της αναπαραγωγικής περιόδου, και, επειδή τα σαλιγκάρια πολλές φορές έκαναν περισσότερες από μια συζεύξεις με το ίδιο άτομο, καταγράφηκε και ο αριθμός των διαφορετικών συντρόφων (Number of partners-np) για κάθε άτομο. Με τον τρόπο αυτό μπορέσαμε να εκτιμήσουμε αν οι πληθυσμοί εκδήλωναν μια συμπεριφορά όπου η επιλογή των συντρόφων ήταν τυχαία, ή αν επέλεγαν συγκεκριμένα άτομα για σύζευξη. της διάρκειας σύζευξης (Mating Duration-MD) καταγράφοντας τις ώρες έναρξης και λήξης της κάθε σύζευξης. Σε ό,τι αφορά τη βιολογία αναπαραγωγής του είδους (Εικόνα 2.8) μετρήθηκε για κάθε σαλιγκάρι: ο αριθμός των ωοαποθέσεων (Number of Clutches-NC) που πραγματοποίησε κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής περιόδου, το μέγεθος της ωοαπόθεσης (Egg Number-EN), που αντικατοπτρίζεται στον αριθμό των αυγών που περιλαμβάνει και δείχνει την γονιμότητα του θηλυκού ρόλου του σαλιγκαριού το μέγεθος των αβγών που αντανακλάται στη διάμετρό τους ο όγκος της ωοαπόθεσης (Egg Volume-EV) που υπολογίστηκε ως το γινόμενο του όγκου μιας σφαίρας (4/3*π*r 3, όπου r η ακτίνα του αβγού), θεωρώντας ότι όλα τα αβγά της ωοαπόθεσης είναι σφαιρικά, επί το μέγεθος της ωοαπόθεσης (αριθμός αβγών). η εκκολαπτική επιτυχία (Hatching Success-HS) ως ποσοστό των αβγών που εκκολάφθηκαν, αλλά και ο αριθμός των αβγών που εκκολάφθηκαν προκειμένου να ληφθεί μια ολοκληρωμένη εικόνα της απόλυτης τιμής του αριθμού των νεοεκκολαφθέντων, και η βιωσιμότητα των νεοεκκολαφθέντων (Survival-S) ως ποσοστό των νεοεκκολαφθέντων που επιβίωσαν τις πρώτες 40 ημέρες (B40) μετά την εκκόλαψη, που είναι ένα χρονικό διάστημα στο οποίο τα μικρά λαμβάνουν μια διάμετρο κελύφους της τάξης μερικών χιλιοστών που τους επιτρέπει μεγαλύτερη βιωσιμότητα. Σε επίπεδο πληθυσμού υπολογίστηκε το ποσοστό των ατόμων που απέθεσαν αβγά σε σχέση με το σύνολο του πληθυσμού αλλά και ως προς το σύνολο το ατόμων που συζεύχθηκαν τουλάχιστον μια φορά. 28

38 Υλικά και Μέθοδοι Εικόνα 2.7 Συζευκτική συμπεριφορά του Cornu aspersum. Figure 2.7 Mating behavior of Cornu aspersum. Σπερματικός ανταγωνισμός Η αναπαραγωγική συμπεριφορά του είδους που περιλαμβάνει πολλαπλές συζεύξεις με τους ίδιους ή και με διαφορετικούς συντρόφους παρέχει έμμεσες ενδείξεις για την παρουσία και δράση του σπερματικού ανταγωνισμού στο είδος αυτό. Έμμεσες ενδείξεις παρέχει επίσης και η μεγάλη διακύμανση σε πολλά μορφομετρικά στοιχεία του αναπαραγωγικού συστήματος στο Cornu aspersum. Παρόλα αυτά, ο τρόπος δράσης του σπερματικού ανταγωνισμού διαφαίνεται από τα άμεσα αποτελέσματα του, δηλαδή από το ποσοστό συμμετοχής του κάθε συντρόφου στην επόμενη γενιά. Για το λόγο αυτό, ο πειραματικός σχεδιασμός για την εκτίμηση της δράσης του σπερματικού ανταγωνισμού έγινε σε τρία επίπεδα, μελετώντας: α) τη συζευκτική συμπεριφορά β) τη δομή του αναπαραγωγικού συστήματος γ) την ταυτοποίηση της πατρότητας των απογόνων. 29

39 Υλικά και Μέθοδοι α) Σπερματικός ανταγωνισμός και συζευκτική συμπεριφορά Μετρήθηκε ο αριθμός των διαφορετικών συντρόφων (NP-Number of Partners) σε σχέση με τον αριθμό των συζεύξεων (NM-Number of Matings) για κάθε πληθυσμό. Όταν ο λόγος NP/NM ισούται με τη μονάδα τότε το σαλιγκάρι πραγματοποίησε όλες του τις συζεύξεις με διαφορετικά άτομα. Όσο πιο κοντά στη μονάδα είναι ο λόγος NP/NM τόσο πιο έντονος ο σπερματικός ανταγωνισμός. Εικόνα 2.8 Βιολογία αναπαραγωγής του Cornu aspersum. Figure 2.8 Reproductive biology of Cornu aspersum. 30

40 Υλικά και Μέθοδοι β) Σπερματικός ανταγωνισμός και δομή του αναπαραγωγικού συστήματος Η δράση του σπερματικού ανταγωνισμού είναι πιθανόν να εξαρτάται από μορφολογικά/ανατομικά χαρακτηριστικά του αναπαραγωγικού συστήματος. Για το λόγο αυτό προσδιορίστηκε η μορφομετρία του αναπαραγωγικού συστήματος όχι μόνο των τμημάτων του αναπαραγωγικού συστήματος που επιτελούν την αρσενική λειτουργία, δηλαδή ο επίφαλλος (EP-epiphallus), το μαστίγιο (FL-flagellum) και το πέος (PEN-Penis) που σχηματίζουν και μεταφέρουν το σπερματοφόρο (Εικόνα 2.17), αλλά και η σπερματοκύστη (BUR-bursa copulatrix tract) το κοινό στέλεχος της σπερματοκύστης (CBUR-common part of the bursa tract) και ο βοηθητικός αγωγός της σπερματοκύστης (DIV-diverticulum) που αφορούν στο θηλυκό ρόλο, δηλαδή την υποδοχή και υδρόλυση του σπερματοφόρου (Εικόνα 2.17). Εικόνα 2.17 Αναπαραγωγικό σύστημα του Cornu aspersum. Τα όργανα του αναπαραγωγικού συστήματος του δέκτη που μετρήθηκαν και αφορούν στο θηλυκό του ρόλο: σπερματκύστη (BUR), κοινό στέλεχος της σπερματοκύστης (CBUR), βοηθητικός αγωγός της σπερματοκύστης (DIV). Τα όργανα του αναπαραγωγικού συστήματος του δότη που μετρήθηκαν και αφορούν στν αρσενικό του ρόλο: ο επίφαλλος (EP-epiphallus), το μαστίγιο (FL-flagellum) και το πέος (PEN-Penis) που σχηματίζουν και μεταφέρουν το σπερματοφόρο. Figure 2.17 Reproductive system of Cornu aspersum. The female parts measured for the sperm recipient include the bursa copulatrix tract (BUR), the diverticulum (DIV) and the common part of the bursa tract (CBUR), while the male parts measured for the sperm donors were the penis (PEN), the epiphallus (EP) and the flagellum (FL), that form and transfer the spermatophore. Επιπλέον, προκειμένου να διερευνηθεί η πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ της ανατομίας του αναπαραγωγικού συστήματος ανάμεσα σε δότη και δέκτη του σπερματοφόρου, υπολογίστηκε ο λόγος των οργάνων του δότη που 31

41 Υλικά και Μέθοδοι σχηματίζουν το σπερματοφόρο προς τα όργανα του δέκτη που το υποδέχονται: EP/BUR, EP/DIV, FL+EP/BUR+CBUR και FL+EP/DIV+CBUR. Έτσι, κάθε άτομο μετά τη φυσιολογική του νάρκη λόγω της αφαίρεση της υγρασίας και της τροφής από τα κουτιά εκτροφής, τοποθετήθηκε στην υπερκατάψυξη στους -25 C προκειμένου να θανατωθεί. Για τον προσδιορισμό της μορφομετρίας του αναπαραγωγικού συστήματος τα ζώα τοποθετούνταν σε θερμοκρασία δωματίου για την ανατομία και εξαγωγή του αναπαραγωγικού τους συστήματος. Ο έλεγχος της επαναληψιμότητας των μετρήσεων έγινε σύμφωνα με τη μέθοδο των Lessels & Boag (1987), όπου οι τιμές επαναληψιμότητας r και F που προκύπτουν από την ανάλυση διακύμανσης μπορούν να περιορίσουν τον παράγοντα της λανθασμένης μέτρησης που οφείλεται σε ανθρώπινο σφάλμα. Επιπλέον, στο πλαίσιο της μελέτης της δράσης του σπερματικού ανταγωνισμού πραγματοποιήθηκε η ιστολογική μελέτη της σπερματοθήκης σε τρεις πληθυσμούς (Ηγουμενίτσα, Σούδα και Μαρώνια) θεωρώντας ότι διαφέρουν ως προς την ένταση του σπερματικού ανταγωνισμού. Συγκεκριμένα, από το αναπαραγωγικό σύστημα αφαιρέθηκε η σπερματοθήκη μαζί με τμήμα του ερμαφροδιτικού αγωγού και μικρό τμήμα του σπερμοωαγωγού. Επειδή η σπερματοθήκη ήταν εγκλεισμένη στον αλβουμινικό αδένα, μικρό υπόλειμμα του αδένα αφαιρέθηκε μαζί με τη σπερματοθήκη. Μετά την απομόνωσή τους οι σπερματοθήκες τοποθετήθηκαν σε αριθμημένα δοχεία που περιείχαν υδατικό διάλυμα αιθανόλης 70 %. Η αφυδάτωση του απομονωμένου ιστού έγινε με την εξής διαδικασία: 1. Παραμονή του ιστού για 15 λεπτά σε αλκοολικό διάλυμα Safranin. Το διάλυμα αυτό χρησιμοποιήθηκε για το χρωματισμό του ιστού, ώστε να είναι ορατός στο μπλοκ της παραφίνης, επειδή ήταν πολύ μικρού μεγέθους. 2. Παραμονή για 5 7 λεπτά σε υδατικό διάλυμα αιθανόλης 95 %. 3. Παραμονή για 7 λεπτά σε απόλυτη αιθανόλη 4. Παραμονή σε methyl benzoate για την απομάκρυνση του νερού για περίπου 10 λεπτά ή για μεγαλύτερο διάστημα έως ότου βυθιστεί ο ιστός. Για την έγκλειση σε παραφίνη ο ιστός τοποθετήθηκε για 2 με 3 ώρες σε λιωμένη παραφίνη με σημείο τήξης ο C (μαλακή παραφίνη) και για τουλάχιστον 4 ώρες σε λιωμένη παραφίνη με σημείο τήξης ο C (σκληρή παραφίνη). Στη συνέχεια κατασκευάστηκαν ορθογώνια μπλοκ που περιείχαν λιωμένη σκληρή παραφίνη όπου τοποθετήθηκε ο ιστός κι αφέθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για τουλάχιστον μία νύχτα, ώστε να σταθεροποιηθεί η παραφίνη. Για την κοπή του ιστού χρησιμοποιήθηκε απλός μικροτόμος. Δημιουργήθηκαν σειρές διαδοχικών τομών πάχους 10 μm η κάθε μία έτσι ώστε οι τομές να ξεκινούν από το ανώτερο τμήμα της σπερματοθήκης στην έξοδο περίπου προς τον σπερμοωαγωγό και να καταλήγουν στο τέλος της σπερματοθήκης. Στη συνέχεια οι σειρές των τομών τοποθετήθηκαν σε αντικειμενοφόρους και ξηράθηκαν σε θάλαμο στους 37 ο C για μια νύχτα. 32

42 Υλικά και Μέθοδοι Τα διαλύματα των χρωστικών παρασκευάστηκαν ως εξής: Αλκοολικό διάλυμα σαφρανίνης (Safranin) g Safranin ml υδατικό διάλυμα αιθανόλης 80 % Προσθήκη της χρωστικής στο απεσταγμένο νερό και ανάδευση έως την πλήρη διάλυση. Nuclear Fast Red (Kernechtrot) - 5 g aluminium sulfate ml απεσταγμένο νερό g Nuclear fast red Διάλυση του aluminium sulfate στο απεσταγμένο νερό και κατόπιν θέρμανση του διαλύματος έως το σημείο βρασμού. Στη συνέχεια προσθήκη της χρωστικής και ανάδευση έως ότου αυτή διαλυθεί πλήρως. Το διάλυμα αφήνεται να κρυώσει και διηθείται πριν να χρησιμοποιηθεί. Lightgreen Orange G (Lichtgrun Orange G) g Lightgreen - 1 g Orange G g phosphor tungsten acid ml απεσταγμένο νερό - 1 ml abs. Acetic acid Προσθήκη των δύο χρωστικών (Lightgreen και Orange G) και του phosphor tungsten acid στο απεσταγμένο νερό και ανάδευση έως την πλήρη διάλυση. Στη συνέχεια προσθήκη του οξικού οξέος. Για τη χρώση των τομών ακολουθήθηκε η εξής διαδικασία: 1. Παραμονή των τομών για 5 λεπτά σε δοχείο που περιείχε ξυλόλη 2. Παραμονή των τομών για 5 λεπτά σε δεύτερο δοχείο που περιείχε ξυλόλη έως ότου διαλυθεί πλήρως η παραφίνη 3. Παραμονή των τομών για 4-5 λεπτά σε δοχείο που περιείχε ισοπροπανόλη 4. Παραμονή των τομών για 4-5 λεπτά σε δοχείο που περιείχε υδατικό διάλυμα αιθανόλης 95% 5. Παραμονή των τομών για 4-5 λεπτά σε δοχείο που περιείχε υδατικό διάλυμα αιθανόλης 70% 6. Παραμονή των τομών για 4-5 λεπτά σε δοχείο που περιείχε αποσταγμένο νερό 7. Χρώση των τομών για λεπτά σε δοχείο που περιείχε υδατικό διάλυμα χρωστικής Nuclear fast red (Kernechtrot). 8. Έκπλυση των τομών σε δοχείο με νερό βρύσης 4 με 5 φορές 9. Χρώση των τομών για 2-3 δευτερόλεπτα σε δοχείο που περιείχε υδατικό διάλυμα χρωστικής Light green orange G. 10. Έκπλυση των τομών σε δοχείο με υδατικό διάλυμα αιθανόλης 95% 33

43 Υλικά και Μέθοδοι 11. Παραμονή των τομών για 1 λεπτό σε δεύτερο δοχείο με υδατικό διάλυμα αιθανόλης 95% 12. Παραμονή των τομών για 3-4 λεπτά σε τρίτο δοχείο με υδατικό διάλυμα αιθανόλης 95% 13. Παραμονή των τομών για 4-5 λεπτά σε δοχείο με απόλυτη αιθανόλη 14. Παραμονή των τομών για 4-5 λεπτά σε δοχείο με Terpenoel 15. Παραμονή των τομών για 4-5 λεπτά σε δοχείο με 1/1 μίγμα Terpenoel και Butyl-acetat 16. Παραμονή των τομών για 4-5 λεπτά σε δοχείο με Butyl-acetat 17. Παραμονή των τομών για 4-5 λεπτά σε δεύτερο δοχείο με Butyl-acetat Στη συνέχεια τοποθετήθηκε πάνω στις αντικειμενοφόρους ρητίνη (Eukitt) και καλύφθηκαν οι τομές με καλυπτρίδες. Παρέμειναν σε θάλαμο στους 37 ο C για τουλάχιστον μία ημέρα ώστε να πολυμερισθεί η ρητίνη και να είναι έτοιμες προς παρατήρηση. Η παρατήρηση των τομών της σπερματοθήκης και η καταγραφή του προτύπου διακλάδωσης των σωληναρίων της έγινε σε οπτικό μικροσκόπιο ως εξής: Παρατηρήθηκε η πορεία του σπερμοωαγωγού στις τομές έως την τομή στην οποία αυτός διαιρείται σε δύο τμήματα. Αυτή η τομή ονομάσθηκε τομή 1 και θεωρήθηκε ότι σηματοδοτεί την αρχή της σπερματοθήκης, με το ένα από τα δύο τμήματα να δίνει το χώρο γονιμοποίησης και το άλλο το κύριο σωληνάριο. Από την τομή 1 και μετά μετρήθηκαν όλες οι τομές έως το τέλος της σπερματοθήκης και σημειώθηκε ο αριθμός της τομής όπου: Το κύριο σωληνάριο διαιρούνταν σε ένα ή περισσότερα πλευρικά σωληνάρια Κάποιο πλευρικό σωληνάριο διαιρούνταν σε ένα ή περισσότερα επιπλέον πλευρικά σωληνάρια Κάποιο πλευρικό σωληνάριο τελείωνε Το κύριο σωληνάριο τελείωνε Ο χώρος γονιμοποίησης τελείωνε Από τα παραπάνω στοιχεία έγινε δυνατός ο υπολογισμός του αριθμού των τομών στις οποίες εμφανίζονται ο χώρος γονιμοποίησης, το κύριο και τα πλευρικά σωληνάρια. Η δομή της κάθε σπερματοθήκης εξετάστηκε μετρώντας τον αριθμό των πλευρικών σωληναρίων της και καταγράφοντας το σχέδιο διακλάδωσής της. Το μήκος κάθε δομής (χώρος γονιμοποίησης και σωληνάρια) υπολογίστηκε μετρώντας τον αριθμό τομών στις οποίες ήταν παρούσα η συγκεκριμένη δομή, ξεκινώντας από την τομή στην οποία η δομή ξεχώριζε πλήρως από την υπόλοιπη σπερματοθήκη, μέχρι εκείνη στην οποία εξαφανίζονταν τελείως. Το ελάχιστο μέγεθος κάθε δομής συμφωνήθηκε να είναι 50 μm, δηλαδή η δομή να είναι παρούσα τουλάχιστον σε 5 τομές. 34

44 Υλικά και Μέθοδοι γ) Σπερματικός ανταγωνισμός και ταυτοποίηση της πατρότητας των απογόνων Ενώ η αναπαραγωγική συμπεριφορά του είδους που περιλαμβάνει πολλαπλές συζεύξεις με τους ίδιους ή και με διαφορετικούς συντρόφους παρέχει έμμεσες ενδείξεις για την παρουσία και δράση του σπερματικού ανταγωνισμού, όπως επίσης και η μεγάλη διακύμανση σε πολλά μορφομετρικά στοιχεία του αναπαραγωγικού συστήματος, ο τρόπος δράσης του σπερματικού ανταγωνισμού διαφαίνεται από τα άμεσα αποτελέσματα του, δηλαδή από το ποσοστό συμμετοχής του κάθε συντρόφου στην επόμενη γενιά. Για την ταυτοποίηση της πατρότητας, που πραγματοποιήθηκε το χειμώνα του 2007, στόχος ήταν η απομόνωση εκείνων των σαλιγκαριών που ζευγάρωσαν με τρία διαφορετικά άτομα του ίδιου πληθυσμού. Έτσι, κάθε φορά που ένα σαλιγκάρι ολοκλήρωνε το ζευγάρωμα μεταφέρονταν σε ένα άλλο κουτί που περιείχε σαλιγκάρια του ίδιου πληθυσμού με τα οποία δεν είχε προηγηθεί ζευγάρωμα. Αυτό γινόταν προκειμένου να αποφευχθεί η πιθανή σύζευξη με το ίδιο άτομο, γεγονός που θα αλλοίωνε τα αποτελέσματα της ανάλυσης πατρότητας, αφού οι πιθανότητες για κάθε σύντροφο που δίνει σπέρμα πρέπει να είναι ίσες. Μετά την ολοκλήρωση και της τρίτης σύζευξης, τα σαλιγκάρια αυτά (δέκτες σπέρματος) τοποθετούνταν στη συνέχεια σε ανεξάρτητο κουτί προκειμένου να αποθέσουν τα αβγά και εξασφαλίζονταν σε πρώτη φάση η «μητρότητα» των απογόνων που θα μελετηθούν. Επειδή ο συνολικός αριθμός των σαλιγκαριών που παρακολουθούνταν συγχρόνως ήταν 263, προκειμένου να είναι δυνατή η συντονισμένη παρακολούθηση της αναπαραγωγικής δραστηριότητας κάθε σαλιγκαριού ξεχωριστά καταγράφονταν όλα τα στοιχεία της αναπαραγωγικής δραστηριότητας (Πίνακας 2.1). Συγκεκριμένα, στην πρώτη στήλη καταγράφονταν ο κωδικός του ατόμου (το οποίο θα δώσει το μητρικό γενότυπο στην ακόλουθη ανάλυση πατρότητας). Στις επόμενες τρεις στήλες καταγράφονταν η ημερομηνία της σύζευξης και ο κωδικός των συντρόφων του (που θα δώσουν τους πατρικούς γενοτύπους, δότες σπέρματος). Έτσι, ήταν δυνατή η καταγραφή της σειράς σύζευξης του κάθε δότη σπέρματος. Στις τελευταίες τρεις στήλες καταγράφονταν τα στοιχεία της ωοαπόθεσης (ημερομηνία και αριθμός αβγών), της εκκόλαψης (ημερομηνία και αριθμός ατόμων) και της βιωσιμότητας των νεοεκκολαφθέντων τις πρώτες σαράντα μέρες (αριθμός ατόμων). Αφού έπεσαν σε νάρκη οι γονείς και οι απόγονοι στα αντίστοιχα κουτιά εκτροφής τους, λόγω της απομάκρυνσης της υγρασίας και της διακοπής παροχής τροφής, τοποθετήθηκαν στην υπερκατάψυξη στους -25 C προκειμένου να θανατωθούν. Πρέπει να σημειωθεί ότι τα σαλιγκάρια που συλλέχθηκαν από το πεδίο είναι δυνατόν να είχαν πραγματοποιήσει συζεύξεις πριν να περιέλθουν σε νάρκη. Για το λόγο αυτό, οι όροι πρώτος δεύτερος και τρίτος δότης σπέρματος στην παρούσα εργασία αναφέρονται στη σειρά 35

45 Υλικά και Μέθοδοι σύζευξης κατά τη διάρκεια της συγκεκριμένης αναπαραγωγικής περιόδου που μελετήθηκε. Ανάλυση πατρότητας Απομόνωση DNA Για την απομόνωση του πυρηνικού γενετικού υλικού (DNA) χρησιμοποιήθηκε το πρωτόκολλο Chelex (Estoup et al. 1996). To Chelex είναι μια ρητίνη που μετουσιώνει τις πρωτεΐνες που συμμετέχουν στην αναδίπλωση του DNA και απομακρύνει ανασταλτικά ιόντα, που θα μπορούσαν να εμποδίσουν την δράση της πολυμεράσης του DNA, στο επόμενο στάδιο της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR-Polymerase Chain Reaction). Συγκεκριμένα, για την απομόνωση του DNA χρησιμοποιήθηκε ένα τεμάχιο μυϊκού ιστού από το πόδι του ώριμου σαλιγκαριού (περίπου 100 mgr), ενώ στην περίπτωση των νεοεκκολαφθέντων ατόμων χρησιμοποιήθηκε όλο το πόδι τους (περίπου 100 mgr). Και στις δυο περιπτώσεις απομακρύνθηκε όσο ήταν δυνατόν η βλέννα από το μυϊκό ιστό με ταμπονάρισμα πάνω σε διηθητικό χαρτί, γιατί οι πολυσακχαρίτες που περιέχονται σε αυτήν παρεμποδίζουν τη δράση της DNA πολυμεράσης. Συγκεκριμένα, η διαδικασία απομόνωσης του DNA περιελάμβανε: α) την τοποθέτηση του ιστού σε σωλήνες Εppendorf (1,5-2 ml) που περιείχαν 500 μl διαλύματος Chelex (10%) β) την προσθήκη 15 μl πρωτεϊνάσης Κ (10 mg/ml) γ) την επώαση των δειγμάτων για 2 ώρες σε υδατόλουτρο συνεχούς ανάδευσης στους 37 C. Επιπρόσθετα, οι σωλήνες Εppendorf αναδεύονταν ισχυρότερα για δευτερόλεπτα ανά 15 λεπτά σε συσκευή Vortex. δ) τη σύντομη φυγοκέντρηση μετά το πέρας της επώασης για 10 δευτερόλεπτα σε στροφές/δευτερόλεπτο. ε) την επώαση των δειγμάτων σε υδατόλουτρο στους 100 C για 10 λεπτά προκειμένου να απενεργοποιηθεί η πρωτεϊνάση Κ. στ) τη φυγοκέντρηση των δειγμάτων προκειμένου το Chelex να περιοριστεί στο ίζημα, ούτως ώστε να είναι δυνατή η λήψη του δείγματος DNA από το υπερκείμενο, καθώς το Chelex μπορεί να καταστρέψει τη δραστικότητα της DNA πολυμεράσης. ζ) τη διατήρηση των δειγμάτων στους -25 C, ούτως ώστε να είναι δυνατή η διάθεσή τους για την περαιτέρω ενίσχυση του DNA. 36

46 Υλικά και Μέθοδοι Πίνακας 2.1 Πίνακας καταγραφής της αναπαραγωγικής συμπεριφοράς του Cornu aspersum για τη μελέτη πολλαπλής πατρότητας σε άτομα που ζευγάρωσαν με τρείς διαφορετικούς συντρόφους (B40-βιωσιμότητα των νεοεκκολαφθέντων 40 μέρες μετά από την εκκόλαψη) Table 2.1 Record table of reproductive behavior for multiple paternity studies in triple mated snails of Cornu aspersum with three different mating partners (B40- offspring survival 40 days after hatching) ΠΛΗΘΥΣΜΟΣ: Άτομο 1 η Σύζευξη Ημερομηνία (Σύντροφος) Ρ1 10/10/07 (Ρ3) 2 η Σύζευξη Ημερομηνία (Σύντροφος) 11/10/07 (Ρ2) 3 η Σύζευξη Ημερομηνία (Σύντροφος) 17/10/07 (Ρ6) Ωοαπόθεση Ημερομηνία (αριθμός αβγών) 25/10/07 (95) Εκκόλαψη Ημερομηνία (αριθμός ατόμων) Βιωσιμότητα (Β40) (αριθμός ατόμων) 6/11/07 (88) (53) 37

47 Υλικά και Μέθοδοι Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction-PCR) Για να επιβεβαιωθεί η επιτυχής απομόνωση του γενετικού υλικού, πραγματοποιήθηκε αρχικά η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης χωρίς τη χρήση επισημασμένων εκκινητών, που έχουν υψηλό κόστος και χρησιμοποιούνται στη γενοτύπηση των δειγμάτων. Στην περίπτωση που η απομόνωση ήταν επιτυχής και ικανοποιητική ακολουθούσε η PCR με τη χρήση επισημασμένων εκκινητών σε πέντε μικροδορυφορικούς τόπους (Ha2, Ha6, Ha7, Ha8 και Ha10) που έχουν σχεδιαστεί για το είδος αυτό (Guiller et al., 2000) (Πίνακας 2.3), ως εξής: α) 1μl DNA, από το υπερκείμενο των δειγμάτων β) 0,5 U Taq DNA πολυμεράση (Qiagen). Η θερμο-ανθεκτική πολυμεράση, που αρχικά απομονώθηκε από το θερμόφιλο βακτήριο Thermus aquaticus (Chien et al., 1976), παρουσιάζει βέλτιστη θερμοκρασία πολυμερισμού στους 72 C, αλλά είναι δυνατόν να διατηρήσει την ενεργότητά της και σε παρατεταμένη επώαση στους 94 C (Saiki et al. 1988). γ) 1 μl Qiagen PCR buffer (10X) που περιέχει Tris Cl, KCl, (NH 4 ) 2 SO 4, 15mM MgCl 2 (ph 8,7). Το ρυθμιστικό αυτό διάλυμα έχει τελική συγκέντρωση 1Χ στο μίγμα αντίδρασης και χρησιμοποιείται για να ρυθμίσει το βέλτιστο ph ενεργότητας της πολυμεράσης. δ) 3mM MgCl 2, όπου τα ιόντα μαγνησίου παίζουν σημαντικό ρόλο στην πιστότητα και την απόδοση της PCR. Επηρεάζουν τη θερμοκρασία στην οποία επιτελείται η θερμική αποδιάταξη, το σωστό υβριδισμό καθώς και την αναγνώριση των νουκλεοτιδίων από την πολυμεράση. ε) 0.1mM dntps (μείγμα διαλύματος dntp s που περιέχει 25 mm από κάθε dntp) στ) 0,5pmol/μl ενός IRD-επισημασμένου προπορευόμενου εκκινητή στο 5 άκρο, και 0,5pmol/μl του καθυστερημένου εκκινητή σε τελικό όγκο αντίδρασης 10μl. Η φθορίζουσα χρωστική IRDye800 TM με φάσμα απορρόφησης στα 800 nm φέρει καρβαμιδικές ομάδες που επιτρέπουν την ομοιοπολική της σύνδεση με τις αζωτούχες βάσεις θυμίνης (Τ) και γουανίνης (G), τόσο μονόκλωνων όσο και δίκλωνων μορίων νουλεϊκού οξέος. Η αλληλουχία των εκκινητών, το μέγεθος και τα μοτίβα επανάληψή τους φαίνονται στον πίνακα 2.2. Πρέπει να σημειωθεί ότι κάθε αντίδραση PCR περιελάμβανε ένα αρνητικό τυφλό, το οποίο αντί για δείγμα DNA περιείχε 1 μl δις αποσταγμένου νερού για τον έλεγχο τυχόν επιμόλυνσης και ένα θετικό τυφλό που περιείχε 1 μl πυρηνικού γενετικού υλικού που είχε ενισχυθεί επιτυχώς σε άλλη αντίδραση πολυμερισμού και έτσι επαληθεύονταν η σωστή προετοιμασία του μίγματος αντίδρασης της PCR. Η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης πραγματοποιήθηκε σε θερμικό κυκλοποιητή στον οποίο οι διαδοχικοί κύκλοι αποδιάταξης, υβριδισμού και επιμήκυνσης πραγματοποιούνται με έναν αυστηρά ελεγχόμενο 38

48 Υλικά και Μέθοδοι τρόπο ως προς τη διάρκειά τους και ως προς τη θερμοκρασία. Συγκεκριμένα, η αποδιάταξη του DNA πραγματοποιείται για 3,5 λεπτά στους 94 C. Ακολουθούν 25 κύκλοι αποδιάταξης (94 C για 30 δευτερόλεπτα), υβριδισμού όπου τα δείγματα εκτίθενται στη βέλτιστη θερμοκρασία υβριδισμού για κάθε μικροδορυφορικό τόπο (Ha2: 57 C; Ha6, Ha7 και Ha8: 55 C; Ha10: 59 C) για 30 δευτερόλεπτα, και επιμήκυνσης (72 C για 25 δευτερόλεπτα). Τέλος, μετά το πέρας των 25 κύκλων, η επιμήκυνση ολοκληρώνεται στους 72 C για 4 λεπτά. Μετά τη διενέργεια της PCR ακολούθησε η ηλεκτροφόρηση του προϊόντος σε πηκτή αγαρόζης (1,5%) και η παρατήρησή του σε υπεριώδες φως. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης Για την παρασκευή της πηκτής προετοιμάζεται αρχικά το ρυθμιστικό διάλυμα (ΤΒΕ 5Χ). Για ένα λίτρο ρυθμιστικού διαλύματος προστίθενται 54gr Tris, 27,5gr Boric acid, 40ml EDTA (ph=8) σε dh 2 O. Για την παρασκευή της πηκτής σε μια κωνική φιάλη τοποθετούνται 125ml ρυθμιστικού διαλύματος (25ml TBE 5x και 100ml H 2 O) και προστίθενται 1,8gr αγαρόζης σε σκόνη (τελική συγκέντρωση 1,5%). Το μείγμα θερμαίνεται σε φούρνο μικροκυμάτων για 4 λεπτά, που είναι χρόνος αρκετός μέχρι το διάλυμα να γίνει διαυγές. Στη συνέχεια η κωνική φιάλη με το περιεχόμενο τοποθετείται κάτω από τη βρύση, προκειμένου η θερμοκρασία του μείγματος της αγαρόζης να φτάσει περίπου τους 60 C οπότε και προστίθενται με μικροπιπέττα 3,8ml βρωμιούχου αιθιδίου και ακολουθεί ήπια ανάδευση. Το βρωμιούχο αιθίδιο έχει την ικανότητα να φθορίζει, λόγω του σχηματισμού συμπλόκων παρεμβολής με το δίκλωνο DNA, όταν διεγερθεί από υπεριώδη ακτινοβολία (UV). Στη συνέχεια το περιεχόμενο της κωνικής φιάλης τοποθετείται στον ειδικό υποδοχέα στον οποίο προηγουμένως έχουν τοποθετηθεί οι «χτένες» σε απόσταση 0,5-1mm πάνω από την επιφάνειά του και οι δυο ανοιχτές πλευρές του έχουν καλυφθεί με μονωτική ταινία. Με τη βοήθεια tip απομακρύνονται προσεκτικά τυχόν φυσαλίδες οι οποίες θα παρεμπόδιζαν τη μετακίνηση του προϊόντος της PCR κατά μήκος της πηκτής. Η αγαρόζη αφήνεται να πήξει για 30 min περίπου σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια αφαιρούνται προσεκτικά οι κολλητικές ταινίες και οι «χτένες» ώστε να αποκαλυφθούν τα πηγαδάκια. Ο υποδοχέας με την πηκτή τοποθετείται στη συσκευή ηλεκτροφόρησης η οποία γεμίζεται με ρυθμιστικό διάλυμα TBE 1x (120ml TBE 5x και 480ml dh 2 O). Ακολούθησε η τοποθέτηση των δειγμάτων με τη χρήση μικροπιπέττας (Εικόνα 2.9), διασφαλίζοντας πρώτα πως δεν υπάρχει φυσαλίδα κάτι που θα παρεμπόδιζε το φόρτωμα του δείγματος. Σε κάθε πηγαδάκι τοποθετούνταν 5μl προϊόντος της PCR αναμεμιγμένα με 1μl χρωστικής διαλύματος φόρτωσης (loading buffer) το οποίο περιείχε: 125 μl/ml κυανούν της βρωμοφαινόλης (2%), 125μl/ml κυανού του ξυλενίου (2%) και 750μl διαλύματος γλυκερόλης σε νερό (30%) το οποίο βοηθά στην παρακολούθηση της κινητικότητας των 39

49 Υλικά και Μέθοδοι Πίνακας 2.2 Μικροδορυφορικοί τόποι που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία και έχουν σχεδιαστεί για το είδος Cornu aspersum (Guiller et al. 2000) Table 2.2 Microsatellite loci used in this study that have been designed for Cornu aspersum (Guiller et al. 2000) Μικροδορυφορικός τόπος (Locus) Αριθμός πρόσβασης GenBank (GenBank Accession no.) Αλληλουχία εκκινητών (5-3 ) Primer Sequence (5-3 ) Ha2 AF CGAAGCCTTTGGCACAATGT TCCCTGACACTGGAAGATGGA Μοτίβο επανάληψης (Repeat motif) Εύρος μεγέθους bp (Size range bp) (CA)7TG(CA)11TA(CA) Ha6 AF TTATCCGCTTGATATATCCT ACTCGTACATGGTTGAAAAC Ha7 AF GCCATATGGGATAAAATACCGGTG CGCCCCTTGTTTACACGAGAAA Ha8 AF AGTTTGCTGGTTTGTACACTCG CGTTTTTAGCTCTTGAATACGG Ha10 AF GCGTTCAATGTAGTTTATGTGCG GAGAACATGCATACAAACAAACATG (GA)23(GGA) (TC)2G(TC) (CA)14CGTG(CA)3AGATG(CA) (CA)6(CGCA)3(CA)4TACACG(CA)

50 Υλικά και Μέθοδοι Εικόνα 2.9 Απεικόνιση τοποθέτησης δειγμάτων σε πηκτή αγαρόζης (Πηγή: delliss.people.cofc.edu/.../loadinggel.html). Figure 2.9 Agarose gel loading illustration (Source: delliss.people.cofc.edu/.../loadinggel.html). νουκλεϊκών μορίων. Σε κάθε περίπτωση μετά το τελευταίο δείγμα τοποθετήθηκε και ένας μάρτυρας μοριακού βάρους (100bp ladder) που δίνει ζώνες γνωστού μεγέθους, ενώ αφήνοντας μια κενή θέση στη συνέχεια τοποθετήθηκε και το αρνητικό τυφλό. Στη συνέχεια, ακολουθεί η εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου 120 Volts και 100mA στη συσκευή ηλεκτροφόρησης για 30 περίπου λεπτά, και η πηκτή παρατηρήθηκε σε τράπεζα υπεριώδους φωτός (UV) προκειμένου να επιβεβαιωθεί η επιτυχής ενίσχυση του μικροδορυφορικού DNA. Γενοτύπηση δειγμάτων Hλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμίδης Μετά από την επιτυχή ενίσχυση των μικροδορυφορικών τόπων με τη χρήση επισημασμένων εκκινητών, ακολούθησε η γενοτύπηση των δειγμάτων. Συγκεκριμένα, η γενοτύπηση των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε με ηλεκτροφόρησή τους σε πηκτή πολυακρυλαμίδης 6,5% σε έναν ημιαυτόματο αναλυτή LI-COR 4200 DNA Analyzer. Η αρχή λειτουργίας του αναλυτή στηρίζεται σε ένα σύστημα ανίχνευσης φθοριζουσών χρωστικών που απορροφούν στην περιοχή του εγγύς υπέρυθρου ( nm). Στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκε η IRDye800 TM φθορίζουσα χρωστική που απορροφά στα 800 nm. Η διέλευση των δειγμάτων που έχουν ενισχυθεί με επισημασμένους εκκινητές μπροστά από τη δίοδο laser, επιτρέπει την ανίχνευση φθορισμού με δυο θερμικά ελεγχόμενες φωτοπεριόδους στερεάς κατάστασης, ανάλογα με τη χρωστική που έχει χρησιμοποιηθεί. Παρασκευή της πηκτής πολυακρυλαμίδης & συναρμολόγηση εξαρτημάτων της συσκευής Li-COR Για την παρασκευή της πηκτής προστέθηκαν 75 μl APS, 15 μl TEMED 20 ml πολυακρυλαμίδη (6,5%) σε μια κωνική φιάλη και το μείγμα μετά από ήπια ανάδευση και αναρρόφηση με σύριγγα προστέθηκε με σταθερό ρυθμό προκειμένου να αποφευχθεί ο σχηματισμός φυσαλίδων στην πηκτή ανάμεσα στις δυο υάλινες πλάκες διαστάσεων 30Χ 25 cm που απείχαν μεταξύ τους 41

51 Υλικά και Μέθοδοι 0,25 mm με την τοποθέτηση ειδικών πλαστικών ελασμάτων πάχους 0,25 mm (spacers) εκατέρωθεν της περιοχής σχηματισμού της πηκτής. Για τη στεγανοποίηση της όλης διάταξης σφιγκτήρες εκατέρωθεν της διάταξης ασκούν ομοιόμορφη πίεση στην πηκτή. Στο πάνω μέρος της πηκτής, τοποθετείται μεταξύ των τζαμιών μια χτένα φορτώματος (casting comb) προκειμένου να σχηματιστεί ομοιόμορφα ένα επίπεδο μέτωπο στην πηκτή. Στο μέτωπο αυτό, αφού έπηξε η πολυακρυλαμίδη μετά το πέρας περίπου 1,5 ώρας, τοποθετήθηκε η χτένα προκειμένου να δημιουργηθούν οι θέσεις για την τοποθέτηση των προς ηλεκτροφόρηση δειγμάτων. Ομοιόμορφη πίεση στο επίπεδο αυτό ασκήθηκε επιπλέον με την τοποθέτηση πλάκας (casting plate) που σταθεροποιήθηκε με τους σφιγκτήρες της συσκευής. Μετά την παρέλευση περίπου 1,5 ώρας ο υποδοχέας που περιείχαν την πηκτή, τοποθετήθηκε κάθετα στη θερμαινόμενη τράπεζα της συσκευής ηλεκτροφόρησης LI-COR, αφού στη θέση της πλάκας (casting plate) τοποθετήθηκε με τη βοήθεια των σφιγκτήρων η δεξαμενή του ρυθμιστικού διαλύματος (buffer tank). Το κάτω μέρος ήταν βυθισμένο σε δεξαμενή που περιέχει 500 ml ρυθμιστικού διαλύματος ΤΒΕ 1Χ, ενώ στο πάνω μέρος η πηκτή ήρθε επίσης σε επαφή με ρυθμιστικό διάλυμα ίδιας σύστασης το οποίο περιείχε η δεξαμενή ρυθμιστικού διαλύματος (buffer tank). Ακολούθησε η σύνδεση των ηλεκτροδίων και ξεκίνησε η ηλεκτροφόρηση. Πριν την ηλεκτροφόρηση Pre Run Πριν ξεκινήσει η ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων είναι απαραίτητη μια διαδικασία που ονομάζεται pre-run (διάρκεια: 25 λεπτά, συνθήκες: 40 W, 40mA, 1500 Volts), στην οποία δίνεται η δυνατότητα στο Laser να εστιάσει, αφού έχουν δοθεί εκ των προτέρων τα εύρη μεγεθών του κάθε γονιδιακού τόπου που θα μελετηθεί. Επίσης, καθίσταται δυνατή η προθέρμανση της πηκτής σε θερμοκρασία 41 C, απαραίτητη προκειμένου να παραμείνουν τα διερχόμενα μόρια DNA σε διαταγμένη μορφή. Αποδιάταξη δειγμάτων Όσο διαρκεί η παραπάνω διαδικασία, τα προϊόντα της PCR αραιώνονται σε διάλυμα φορμαμιδίου (9.5 ml φορμαμίδιο, 500 μl χρωστικής διαλύματος φόρτωσης-loading buffer), ανάλογα με την εικόνα της ενίσχυσης τους στην πηκτή αγαρόζης. Στην πλειονότητα των δειγμάτων η αραίωση ήταν 1/10, ενώ σε κάποιες περιπτώσεις όπου παρατηρούνταν μεγάλη ενίσχυση, η αραίωση έφτανε και 1/20. Στη συνέχεια προκειμένου να γίνει η αποδιάταξη των δειγμάτων, αυτά τοποθετήθηκαν για 10 λεπτά στους 99 C και στη συνέχεια σε πάγο πριν τοποθετηθούν στις θέσεις ηλεκτροφόρησης στην πηκτή πολυακρυλαμίδης. Ηλεκτροφόρηση Μετά την ολοκλήρωση της προεργασίας για την εστίαση του laser και τη θέρμανση της πηκτής αφαιρείται το η χτένα που σχηματίζει το μέτωπο της 42

52 Υλικά και Μέθοδοι πηκτής (casting comb) και καθαρίζεται προσεκτικά από πιθανά υπολείμματα πολυακρυλαμίδης, προκειμένου να τοποθετηθεί η χτένα που παρέχει 48 θέσεις για την τοποθέτηση των δειγμάτων. Πριν την τοποθέτηση των δειγμάτων, πρέπει να εισαχθεί στο πρόγραμμα Saga GT, σε καθεμιά από τις 48 θέσεις, ο κωδικός του δείγματος καθώς και οι θέσεις όπου θα τοποθετηθεί ο μάρτυρας μοριακού βάρους. Αξίζει να σημειωθεί ότι ο μάρτυρας μοριακού βάρους τοποθετείται στις θέσεις 1, 12, 24, 36 και 48 ούτως ώστε να είναι δυνατή η αξιόπιστη γενοτύπηση των δειγμάτων (Εικόνα 2.10). Επιπλέον, για τον ίδιο λόγο, οι γονείς (μία «μητέρα» και οι τρεις διαφορετικοί «πατεράδες») τοποθετούνται τρεις φορές κατά μήκος των θέσεων της πηκτής, μία στην αρχή, μία στη μέση και μια στο τέλος. Ο αριθμός δειγμάτων των απογόνων προκειμένου να γίνει η ταυτοποίηση πατρότητας ήταν κατά μέσο 30. Η πηκτή πολυακρυλαμίδης ήταν δυνατόν να χρησιμοποιηθεί για 3 φορτώματα με μέγιστο αριθμό τα πέντε φορτώματα. Επειδή το εύρος μεγέθους των γονιδιακών τόπων Ha6, Ha7, Ha8 και Ha 10 ήταν ( bp) και η διάρκεια ηλεκτροφόρησης για αυτούς τους γονιδιακούς τόπους που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 1 ώρα και 15 λεπτά. Εξαίρεση αποτέλεσε ο γονιδιακός τόπος Ha2 που έχει μεγαλύτερο εύρος μεγέθους ( bp), και για το λόγο αυτό είχε μεγαλύτερη διάρκεια ηλεκτροφόρησης 1,5 ώρας. Στην εικόνα 2.10 φαίνεται το πρότυπο γενοτύπων των πέντε μικροδορυφορικών τόπων που εξετάστηκαν. Η συλλογή των ηλεκτροφορητικών δεδομένων γίνεται με τη βοήθεια του προγράμματος Saga GT. Το οποίο αφού ολοκληρωθεί η ηλεκτροφόρηση είναι σε θέση να αναλύσει αυτόματα και να προσδιορίσει το μέγεθος των δειγμάτων σε κάθε θέση. Γα την καλύτερη ανάλυση των δειγμάτων ακολούθησε η βαθμονόμηση της εικόνας της πηκτής, όπου ο ερευνητής τοποθετούσε τις κάθετες γραμμές στη μέση του κάθε δείγματος ενώ τις οριζόντιες γραμμές, που αντικατοπτρίζουν διαφορετικά μεγέθη αντίστοιχα εκείνων του μάρτυρα μοριακού βάρους, στις ζώνες του μάρτυρα μοριακού βάρους. Στη συνέχεια με την εντολή REANALYZE ζητείται από το πρόγραμμα να αναλύσει ξανά τα δεδομένα της εικόνας γενοτύπησης. Προσδιορισμός πατρότητας Αρχικά, με βάση τους γενοτύπους των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε ο προσδιορισμός της πιθανής πατρότητας των απογόνων, με βάση την απλή μέθοδο του αποκλεισμού των πατέρων των οποίων τα αλληλόμορφα δεν εμφανίζονταν στους απογόνους. Στη συνέχεια για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων καθώς και για τη διευκρίνιση περιπτώσεων όπου δεν ήταν δυνατή η ταυτοποίηση πατρότητας με τη μέθοδο του αποκλεισμού, χρησιμοποιήθηκε το CERVUS 3.0 (Marshall et al. 1998; Slate et al. 2000), το οποίο είναι ένα πρόγραμμα που βασίζεται στο περιβάλλον των Windows και υπολογίζει τη μέγιστη πιθανότητα πατρότητας (maximum likelihood). Για την ταυτοποίηση της πατρότητας στο CERVUS 3.0 απαιτούνται δυο αρχεία δεδομένων: α) ένα είναι το αρχείο των απογόνων (offspring file) περιλαμβάνει τους κωδικούς των απογόνων, τον κωδικό της μητέρας 43

53 Υλικά και Μέθοδοι εφόσον είναι γνωστή, καθώς και τους κωδικούς των υποψήφιων πατέρων (Εικόνα 2.11), και β) ένα που περιλαμβάνει τους γενοτύπους των παραπάνω ατόμων αρχείο των γενοτύπων (genotype file) (Εικόνα 2.12). Και τα δυο αυτά αρχεία, μπορούν να δημιουργηθούν στο Excel και να αποθηκευτούν στη συνέχεια σε έγγραφο κειμένου οριοθετημένο με Tab. Εικόνα 2.10 Πρότυπο γενοτύπων των πέντε μικροδορυφορικών τόπων (Α. Ha2, B. Ha6, Γ. Ha7, Δ. Ha8, E. Ha10) σε πηκτή πολυακρυλαμίδης (6.5%). Figure 2.10 Genotype pattern of five microsatellite loci (Α. Ha2, B. Ha6, Γ. Ha7, Δ. Ha8, E. Ha10) in polyacrylamide gel (6.5%). 44

54 Υλικά και Μέθοδοι Σε ό,τι αφορά τις αναλύσεις που πραγματοποιούνται στο CERVUS 3.0 για την ταυτοποίηση πατρότητας, αυτές περιλαμβάνουν τρία στάδια. Το πρώτο αφορά στην ανάλυση της συχνότητας των αλληλομόρφων (Allele Frequency Analysis) όπου καθίσταται δυνατός ο υπολογισμός της ισορροπίας Hardy- Weinberg και ο προσδιορισμός μηδενικών αλληλομόρφων. Εικόνα 2.11 Αρχείο απογόνων για το πρόγραμμα CERVUS 3.0 όπου φαίνονται οι κωδικοί των απογόνων, της μητέρας και των υποψήφιων πατέρων. Figure 2.11 Offspring file for CERVUS 3.0 illustrating the IDs of offspring, known mother and candidate fathers. Εικόνα 2.12 Αρχείο των γενοτύπων για το πρόγραμμα CERVUS 3.0 όπου φαίνονται οι γενότυποι των απογόνων, και των γονέων. Τα δυο αλληλόμορφα για κάθε τόπο συμβολίζονται στο τέλος του ονόματος του τόπου με a και b. Figure 2.12 Genotype file for CERVUS 3.0 illustrating the genotypes offspring, known mother and candidate fathers. The two alleles of each locus are recorded as a and b at the end of the locus name. 45

55 Υλικά και Μέθοδοι Κατά την εισαγωγή του αρχείου των γενοτύπων, ζητείται να υπογραμμιστεί αν το αρχείο έχει κεφαλίδα (header row) και σε ποιά στήλη βρίσκεται το πρώτο αλληλόμορφο, καθώς και το συνολικό αριθμό των αλληλομόρφων (Εικόνα 2.13). Έτσι, προκύπτει το αρχείο με τα αποτελέσματα της ανάλυσης συχνότητας των αλληλομόρφων (Εικόνα 2.14), όπου για κάθε γονιδιακό τόπο έχουν υπολογιστεί μεταξύ άλλων, ο αριθμός των αλληλομόρφων, η παρατηρούμενη και αναμενόμενη ετεροζυγωτία και ο βαθμός πολυμορφισμού (Polymorphic Information Content-PIC). Εικόνα 2.13 Παράθυρο ανάλυσης συχνότητας αλληλομόρφων (CERVUS 3.0). Figure 2.13 Allele Frequency Analysis window (CERVUS 3.0). Εικόνα 2.14 Αποτελέσματα ανάλυσης συχνότητας αλληλομόρφων (CERVUS 3.0). Figure 2.14 Allele Frequency Analysis output (CERVUS 3.0). 46

56 Υλικά και Μέθοδοι Το επόμενο βήμα στην ανάλυση αποτελεί η προσομοίωση της ανάλυσης πατρότητας. Από το μενού επιλέγουμε Analysis Simulation of Parentage Analysis Paternity εμφανίζεται το παράθυρο που φαίνεται στην εικόνα Ο προσδιορισμός της πατρότητας πραγματοποιήθηκε σε διάστημα εμπιστοσύνης 95% χρησιμοποιώντας τεχνικές πιθανοτήτων (likelihood techniques). Συγκεκριμένα, με βάση τους γενοτύπους των απογόνων, της μητέρας και του υποψήφιου πατέρα προσδιορίζεται το LOD score (logarithm of odds) για κάθε υποψήφιο πατέρα. Το διάστημα εμπιστοσύνης καθορίζεται μέσω προσομοιώσεων ( επαναλήψεις) και προσδιορίζεται από το στατιστικό Δ, το οποίο είναι η διαφορά ανάμεσα στα LOD scores των δυο πιο πιθανών υποψήφιων πατέρων. Συγκεκριμένα, οι παράμετροι που εφαρμόστηκαν στην ανάλυση της προσομοίωσης στο πρόγραμμα CERVUS 3.0 είναι οι ακόλουθες (Εικόνα 2.15): Αριθμός των απογόνων: Αριθμός των υποψήφιων πατέρων: 4 Ποσοστό των υποψήφιων πατέρων που περιλαμβάνεται στη δειγματοληψία: 0,95 Ποσοστό καταγραφής των μικροδορυφορικών τόπων: 0,79 Ποσοστό εσφαλμένης καταγραφής των μικροδορυφορικών τόπων: 0,01 Ποσοστό σφαλμάτων στους υπολογισμούς πιθανοτήτων: 0,01 Ελάχιστος αριθμός των καταγεγραμμένων μικροδορυφορικών τόπων: 2 Εικόνα 2.15 Προσομοίωση της ανάλυσης πατρότητας (CERVUS 3.0). Figure 2.15 Simulation of parentage analysis (CERVUS 3.0). 47

57 Υλικά και Μέθοδοι Ακολουθεί η αποθήκευση των αποτελεσμάτων της προσομοίωσης σε ένα αρχείο, το οποίο μαζί με τα αποτελέσματα της ανάλυσης συχνότητας των αλληλομόρφων θα χρησιμοποιηθεί στο τελευταίο στάδιο της ανάλυσης. Στο τελευταίο στάδιο της ανάλυσης ακολουθούμε τα βήματα Analysis Parentage Analysis Paternity και εμφανίζεται το πρώτο παράθυρο (Εικόνα 2.16) που ζητάει το αρχείο των απογόνων και τον προσδιορισμό του αριθμού της στήλης όπου βρίσκονται οι κώδικες των απογόνων, της γνωστής μητέρας και του πρώτου υποψήφιου πατέρα. Εικόνα 2.16 Πρώτο παράθυρο για την ανάλυση πατρότητα (CERVUS 3.0). Figure 2.16 First window of parentage analysis (CERVUS 3.0). Με την εντολή Next εμφανίζεται το επόμενο παράθυρο (Εικόνα 2.17) όπου εισάγεται αυτόματα το αρχείο με τους γενοτύπους. Στο επόμενο παράθυρο (Εικόνα 2.18) εισάγονται αυτόματα τα αρχεία που περιλαμβάνουν την ανάλυση συχνοτήτων των αλληλομόρφων και την προσομοίωση της ανάλυσης πατρότητας. Στο τελευταίο στάδιο (Εικόνα 2.19) ζητείται ο προσδιορισμός του πιο πιθανού υποψήφιου πατέρα και αποθηκεύεται το τελικό αρχείο με τα αποτελέσματα της ανάλυσης πατρότητας σε μορφή excel (.xls). Με βάση τα αποτελέσματα από την ταυτοποίηση πατρότητας υπολογίστηκε στη συνέχεια το ποσοστό των κοινών αλληλομόρφων μεταξύ του μητρικού και του πατρικού γενοτύπου (Ps - Proportion of shared alleles) προκειμένου να διερευνηθεί ο ενδεχόμενος ρόλος της γενετικής ομοιότητας στον σπερματικό ανταγωνισμό. 48

58 Υλικά και Μέθοδοι Εικόνα 2.17 Δεύτερο παράθυρο για την ανάλυση πατρότητα (CERVUS 3.0). Figure 2.17 Second window of parentage analysis (CERVUS 3.0). Εικόνα 2.18 Τρίτο παράθυρο για την ανάλυση πατρότητα (CERVUS 3.0). Figure 2.18 Third window of parentage analysis (CERVUS 3.0). 49

59 Υλικά και Μέθοδοι Εικόνα 2.19 Τελευταίο παράθυρο για την ανάλυση πατρότητας (CERVUS 3.0). Figure 2.19 Final window of parentage analysis (CERVUS 3.0). Στατιστική ανάλυση Σε ότι αφορά τη συγκριτική μελέτη των πληθυσμών ως προς τη συμπεριφορά αναπαραγωγής τους, τρεις από αυτούς δεν συμπεριλαμβάνονται στις αναλύσεις που ακολουθούν. Συγκεκριμένα, οι δυο πληθυσμοί (πορτοκαλεώνες) από τις Φουρνές του Ν. Χανίων καθώς και εκείνος της περιοχής του Πολυτεχνείου (ξηρό ενδιαίτημα) του ίδιου νομού που λήφθηκαν το 2006, εξαιρούνται από την ανάλυση. Αυτό οφείλεται στο γεγονός της υψηλής θνησιμότητας που παρουσίασαν, έτσι ώστε το δείγμα των σαλιγκαριών να μειωθεί στο 25% του αρχικού σε διάστημα δέκα ημερών και, επομένως, είναι δυνατόν να επηρεάσει τη συνολική εικόνα της συμπεριφοράς αναπαραγωγής των πληθυσμών αυτών. Ο θάνατος των ατόμων οφείλονταν σε μια πρωτόγνωρη συμπεριφορά, και συγκεκριμένα «έβγαιναν» από το κέλυφός τους με αποτέλεσμα να πεθαίνουν από αφυδάτωση μέσα σε λίγες μέρες. Πιθανά, για κάποιο λόγο ο μανδύας δεν ήταν ισχυρά συνδεδεμένος με το κέλυφος. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με την χρήση του λογισμικού SPSS 14. Αρχικά έγινε έλεγχος όλων των μεταβλητών ως προς την κανονικότητά της κατανομής τους και σε περιπτώσεις μη κανονικής κατανομής ακολούθησε μετασχηματισμός τους σε δεκαδικούς λογάριθμους ή σε arcsin συνημίτονο για τις μεταβλητές που αντιπροσωπεύουν ποσοστά. (Zar 1996). 50

60 Υλικά και Μέθοδοι Καθώς παρατηρήθηκαν και μηδενικές πατρότητες σε κάποιες ωοαποθέσεις, έγινε σύγκριση με t-test (independent sample t-test) μεταξύ των πετυχημένων και μη επιτυχημένων δοτών σπέρματος ως προς τα χαρακτηριστικά της αναπαραγωγική τους συμπεριφοράς, της ανατομίας των αρσενικών τμημάτων του αναπαραγωγικού τους συστήματος και, του ποσοστού των κοινών αλληλομόρφων ως προς τους πέντε μικροδορυφορικούς τόπους που μελετήθηκαν (γενετική ομοιότητα). Τα δεδομένα της πατρότητας αναλύθηκαν με την εφαρμογή της πολλαπλής γραμμικής παλινδρόμησης (multiple linear regression) και, συγκεκριμένα, με τη μέθοδο της backward selection με πιθανότητα εισαγωγής (inclusion probability) στο μοντέλο p=0.05 και πιθανότητα εξαγωγής ή απόρριψης (inclusion probability) στα p=0.1. Όλες οι μεταβλητές συμπεριφοράς, ανατομίας και γενετικής ομοιότητας των δοτών σπέρματος χρησιμοποιήθηκαν ως ανεξάρτητες μεταβλητές προκειμένου να διερευνηθεί η πιθανή σχέση τους με το ποσοστό πατρότητας τους (εξαρτημένη μεταβλητή). Επειδή όμως στη γραμμική παλινδρόμηση δεν πρέπει να εισάγονται στενά συσχετιζόμενες μεταβλητές, καθώς θα αλλοίωναν το μοντέλο λόγω της αθροιστικής τους επίδρασής (additive effect), πραγματοποιήθηκε η ανάλυση συσχέτισης κατά Pearson (Pearson correlation) πριν από τη γραμμική παλινδρόμηση. Έτσι, οι συσχετιζόμενες μεταβλητές δεν εισάγονταν ποτέ μαζί στο μοντέλο της παλινδρόμησης. Η επιλογή της μεθόδου (backward procedure) έγινε προκειμένου νε εισαχθούν ταυτόχρονα όλου του είδους οι μεταβλητές (γενετικές, συμπεριφοράς και ανατομίας) ούτως ώστε να είναι δυνατή η εκτίμηση της συνδυαστικής τους επίδρασης στην προτεραιότητα πατρότητας. 51

61 Αποτελέσματα ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σε ό,τι αφορά τη συγκριτική μελέτη των πληθυσμών ως προς τη συμπεριφορά αναπαραγωγής τους, τρεις από αυτούς δεν συμπεριλήφθηκαν στις αναλύσεις. Συγκεκριμένα, οι δυο πληθυσμοί (πορτοκαλεώνες) από τις Φουρνές (Φουρνές 1 και Φουρνές 2) του Ν. Χανίων καθώς και εκείνος της περιοχής του Πολυτεχνείου (ξηρό ενδιαίτημα) του ίδιου νομού που λήφθηκαν το 2006, εξαιρέθηκαν από την ανάλυση εξαιτίας της υψηλής θνησιμότητας που παρουσίασαν, με αποτέλεσμα το δείγμα των σαλιγκαριών να μειωθεί στο 25% του αρχικού σε διάστημα δέκα ημερών. Πίνακας 1.1 Στοιχεία της αναπαραγωγικής συμπεριφοράς (αριθμός, μέσος όρος, τυπική απόκλιση) από τους πληθυσμούς που δεν συμπεριλήφθηκαν στις αναλύσεις Table 1.1 Components of reproductive behavior (number, mean, standard deviation) obtained from the populations that were excluded in the analyses Περιοχή δειγματοληψίας Φουρνές 1 Φουρνές 2 Πολυτεχνείο Χρονική περίοδος μεταξύ ενεργοποίησης και πρώτης σύζευξης (ημέρες) 4,07±5,77 (n=20) 3,55±4,4 (n=15) 1,82±1,5 (n=22) Αριθμός συζεύξεων 1,00±1,09 (n=42) 0,50±0,67 (n=28) 1,00±0,63 (n=31) Αριθμός διαφορετικών συντρόφων 0,93±1,05 (n=39) 0,56±0,59 (n=28) 1,00±0,63 (n=31) Αριθμός ατόμων που απέθεσαν αβγά Διάμετρος αβγών (mm) 4,22±0,49 (n=5) 4,21±0,34 (n=6) Αριθμός εκκολαφθέντων 60,29±25,67 (n=7) 61,67±11,50 (n=6) Νεοεκκολαφθέντα που επιβίωσαν 13,71±12,89 (n=7) 15,00±20,49 (n=6) ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΗΣ Διάρκεια και κατανομή της αναπαραγωγικής δραστηριότητας Η διαίρεση της αναπαραγωγικής περιόδου σε διακριτές διαδοχικές φάσεις, και ο υπολογισμός της χρονικής διάρκειας της κάθε μίας έδωσε τη δυνατότητα να ληφθεί μια ολοκληρωμένη εικόνα της αναπαραγωγικής διαδικασίας και της ποικιλομορφίας της στους επιμέρους πληθυσμούς. Για τον υπολογισμό των χρονικών αυτών περιόδων λήφθηκαν υπόψη τα σαλιγκάρια 52

62 Αποτελέσματα που έλαβαν μέρος σε μία τουλάχιστον σύζευξη και απέθεσαν αβγά τουλάχιστον μία φορά. Η συνολική διάρκεια της αναπαραγωγικής δραστηριότητας, που περιλαμβάνει τις δραστηριότητες των συζεύξεων, των ωαποθέσεων και των εκκολάψεων, παρουσίασε μεγάλη ποικιλότητα μεταξύ των πληθυσμών που μελετήθηκαν. Συγκεκριμένα, οι πληθυσμοί από την περιοχή του Ηρακλείου παρουσίασαν τη μεγαλύτερη διάρκεια αναπαραγωγικής δραστηριότητας. Ο πληθυσμός από τις Αρχάνες (ενδιαίτημα: ποτιζόμενος ελαιώνας) ήταν για 82 μέρες αναπαραγωγικά ενεργός (Εικόνα 3.1), όσο ήταν και ο πληθυσμός από το φαράγγι του Αλμυρού (φυσικό ενδιαίτημα) (Εικόνα 3.1) ενώ μεγάλη διάρκεια παρατηρήθηκε και στον πληθυσμό από τις Γούβες με 80 μέρες συνολική αναπαραγωγική δραστηριότητα (Εικόνα 3.1). Στα νότια του νομού Ηρακλείου ο πληθυσμός της Πόμπιας είχε συνολική διάρκεια αναπαραγωγικής δραστηριότητας 70 μέρες, ενώ τη μικρότερη διάρκεια παρουσίασε ο πληθυσμός της Αγίας Μαρίνας με 52 μέρες (Εικόνα 3.2). Σε ό,τι αφορά τους δυο πληθυσμούς από το νομό των Χανίων, εκείνος από τη Σούδα που προερχόταν από ένα φυσικό ξηρό ενδιαίτημα είχε σύνολο 69 μέρες αναπαραγωγικής δραστηριότητας, ενώ ο πληθυσμός από το Συρίλι που προερχόταν από ένα καλλιεργούμενο αγρό είχε μικρότερη συνολική διάρκεια αναπαραγωγικής δραστηριότητας, 47 ημέρες (Εικόνα 3.3). Μικρή διάρκεια συνολικής αναπαραγωγικής δραστηριότητας παρουσίασαν και όλοι οι πληθυσμοί από το νομό Λασιθίου. Συγκεκριμένα, οι πληθυσμοί από τη Ρούσα, τα Μαρώνια και τη Σητεία παρουσίασαν 44, 52 και 49 μέρες συνολικής δραστηριότητας αναπαραγωγής, αντίστοιχα (Εικόνα 3.4). Τη μικρότερη διάρκεια συνολικής αναπαραγωγικής δραστηριότητας (38 ημέρες) εμφάνισε ο πληθυσμός από την Ήπειρο που προερχόταν από την Ηγουμενίτσα (Εικόνα 3.5). Ως προς τη συζευκτική δραστηριότητα, με μια πρώτη εκτίμηση η κατανομή της στο χρόνο χαρακτηρίζεται από μια περιοδικότητα σε όλους τους πληθυσμούς που μελετήθηκαν. Συγκεκριμένα, το μεγαλύτερο ποσοστό των ατόμων από όλους τους πληθυσμούς ζευγαρώνει μέσα στις πρώτες τρεις με τέσσερις μέρες. Ακολουθεί ένα διάστημα παύσης της συζευκτικής δραστηριότητας για περίπου δυο με τέσσερις μέρες, μετά από το οποίο τα σαλιγκάρια ενεργοποιούνταν ξανά. Η περιοδικότητα αυτής της ενεργοποίησης και παύσης της συζευκτικής δραστηριότητας συνεχίζεται, σε μικρότερο όμως ποσοστό. Η χρονική διάρκεια της συζευκτικής δραστηριότητας παρουσίασε ποικιλότητα και κυμαινόταν από δυο με τέσσερις βδομάδες στους πληθυσμούς της Κρήτης ενώ ο μοναδικός πληθυσμός της Ηπείρου παρουσίασε συζευκτική δραστηριότητα για δυο εβδομάδες. Συγκεκριμένα, τα σαλιγκάρια από την περιοχή των Γουβών, των Αρχανών, και του Αλμυρού ζευγάρωναν για συνολικά 16, 27 και 38 μέρες, αντίστοιχα (Εικόνα 3.1), ενώ στα νότια του Ηρακλείου ο πληθυσμός από την Αγία Μαρίνα ζευγάρωνε για 22 μέρες και της Πόμπιας για 16 μέρες (Εικόνα 3.2). Στους πληθυσμούς των 53

63 Αποτελέσματα Χανίων η συζευκτική δραστηριότητα διήρκησε για 27 μέρες για τα σαλιγκάρια της Σούδας και 28 μέρες για εκείνα από το Συρίλι (Εικόνα 3.3). Εικόνα 3.1 Ποσοστιαία κατανομή της αναπαραγωγικής δραστηριότητας στο χρόνο για τους πληθυσμούς από την περιοχή του Β. Ηρακλείου. Figure 3.1 Distribution of reproductive activity over time (days) for populations obtained from North Heraklion. (Red indicates mating activity, green oviposition activity and purple indicates egg laying activity). 54

64 Αποτελέσματα Εικόνα 3.2 Ποσοστιαία κατανομή της αναπαραγωγικής δραστηριότητας στο χρόνο για τους πληθυσμούς από την περιοχή του N. Ηρακλείου. Figure 3.2 Distribution of reproductive activity over time (days) for populations obtained from South Heraklion. (Red indicates mating activity, green oviposition activity and purple indicates egg laying activity). Επιπλέον, σε ότι αφορά τους πληθυσμούς από τη Σητεία, τη Ρούσα και τα Μαρώνια του νομού Λασιθίου, η συζευκτική τους δραστηριότητα ήταν 19, 21 και 27 μέρες, αντίστοιχα (Εικόνα 3.4). Ως προς την Ηγουμενίτσα, παρατηρήθηκε μια σύντομη περίοδος συζευκτικής δραστηριότητας 15 ημερών (Εικόνα 3.5). Η συνολική διάρκεια της δραστηριότητας των ωοαποθέσεων παρουσίασε έντονη διαπληθυσμιακή ποικιλότητα. Η μεγαλύτερη διάρκεια παρατηρήθηκε στους πληθυσμούς από το Ηράκλειο (Εικόνες 3.1 και 3.2) από 51 ως και 63 μέρες (Γούβες=51 μέρες, Πόμπια=56 μέρες, Αρχάνες=60 μέρες, Αλμυρός= 63 μέρες) με εξαίρεση τον πληθυσμό της Αγίας Μαρίνας με χρονική 55

65 Αποτελέσματα διάρκεια 32 ημερών. Ακολούθησαν οι πληθυσμοί από το νομό των Χανίων με εκείνον της Σούδας να έχει συνολική διάρκεια δραστηριότητας ωοαποθέσεων 39 μέρες, ενώ του Συριλίου 33 μέρες (Εικόνα 3.3). Ακόμα μικρότερη διάρκεια γύρω στις τρεις εβδομάδες, εμφάνισαν οι πληθυσμοί από το ανατολικότερο άκρο της Κρήτης (Ρούσα=17 μέρες, Μαρώνια=20 μέρες, Σητεία=20 μέρες) (Εικόνα 3.4). Τέλος, ιδιαίτερα μικρή ήταν η διάρκεια για τον πληθυσμό της Ηγουμενίτσας (11 μέρες) (Εικόνα 3.5). Εικόνα 3.3 Ποσοστιαία κατανομή της αναπαραγωγικής δραστηριότητας στο χρόνο για τους πληθυσμούς από την περιοχή των Χανίων. Figure 3.3 Distribution of reproductive activity over time (days) for populations obtained from the region of Chania. (Red indicates mating activity, green oviposition activity and purple indicates egg laying activity). 56

66 Αποτελέσματα Εικόνα 3.4 Ποσοστιαία κατανομή της αναπαραγωγικής δραστηριότητας στο χρόνο για τους πληθυσμούς από την περιοχή του Λασιθίου. Figure 3.4 Distribution of reproductive activity over time (days) for populations obtained from the region of Lasithi. (Red indicates mating activity, green oviposition activity and purple indicates egg laying activity). 57

67 Αποτελέσματα Εικόνα 3.5 Ποσοστιαία κατανομή της αναπαραγωγικής δραστηριότητας στο χρόνο για τους πληθυσμούς από την περιοχή της Ηγουμενίτσας. Figure 3.5 Distribution of reproductive activity over time (days) for populations obtained from the region of Igoumenitsa. (Red indicates mating activity, green oviposition activity and purple indicates egg laying activity). Η δραστηριότητα των εκκολάψεων, παρουσίασε επίσης ποικιλότητα μεταξύ των πληθυσμών που μελετήθηκαν. Οι πληθυσμοί από τα βόρεια του νομού Ηρακλείου παρουσίασαν τη μεγαλύτερη διάρκεια, γύρω στους δυο μήνες (Γούβες=51 μέρες, Αρχάνες=62 μέρες, Αλμυρός=62 μέρες), όπου λάμβαναν χώρα οι εκκολάψεις (Εικόνα 3.1). Το χρονικό αυτό διάστημα ήταν μικρότερο για τους πληθυσμούς από το ξηρότερο και νοτιότερο άκρο του νομού (Αγία Μαρίνα=33 μέρες, Πόμπια=37 μέρες) (Εικόνα 3.2). Από την περιοχή των Χανίων παρατηρήθηκε διαφορά στη διάρκεια μεταξύ των δυο πληθυσμών. Στη Σούδα τα αβγά εκκολάφθηκαν σε 39 ημέρες, ενώ στο Συρίλι, σε 11 ημέρες (Εικόνα 3.3). Ποικιλότητα εμφανίστηκε και στους πληθυσμούς από το Λασίθι (Ρούσα=19 μέρες, Μαρώνια=30 μέρες και Σητεία=20 μέρες) (Εικόνα 3.4). Το μικρότερο όμως χρονικό διάστημα μέσα στο οποίο πραγματοποιήθηκαν οι εκκολάψεις των αβγών παρατηρήθηκε στον πληθυσμό της Ηγουμενίτσας (9 μέρες). Μικρότερα ποσοστά παρατηρήθηκαν στους πληθυσμούς από τις Αρχάνες (7%), Πόμπια (7%), Γούβες (8%), Ρούσα (7%) και Μαρώνια (7%). Ακολούθησαν οι πληθυσμοί Αλμυρός και Αγία Μαρίνα με ποσοστό 9%. Τέλος, τα μεγαλύτερα ποσοστά κατείχαν οι πληθυσμοί Σούδα και Ηγουμενίτσα με ποσοστό 11% και το Συρίλι και η Σητεία με ποσοστό 12% (Πίνακας 3.1). Αξίζει να σημειωθεί ότι ανεξάρτητα από τη συνολική διάρκεια της αναπαραγωγικής δραστηριότητας αλλά και των επιμέρους φάσεών της (σύζευξη, ωοαπόθεση, εκκόλαψη), όλοι οι πληθυσμοί από την Κρήτη χαρακτηρίστηκαν από μια αλληλοεπικάλυψη των φάσεων αυτών (Εικόνες 3.1 ως 3.4). Αυτό σημαίνει ότι υπήρχαν χρονικά διαστήματα όπου άλλα ζώα 58

68 Αποτελέσματα ζευγάρωναν και άλλα απέθεταν αβγά στον ίδιο πληθυσμό. Η ίδια αλληλοεπικάλυψη ίσχυσε και για την επόμενη φάση των εκκολάψεων. Έτσι, υπήρχε ένα κοινό χρονικό διάστημα όπου στον ίδιο πληθυσμό άλλα ζώα απέθεταν αβγά, ενώ ξεκινούσαν οι εκκολάψεις των αβγών των ατόμων που είχαν ήδη ωοαποθέσει. Σε ορισμένους πληθυσμούς όπως στις Αρχάνες, τον Αλμυρό, την Αγία Μαρίνα στο Ηράκλειο και τα Μαρώνια στο Λασίθι, υπήρχε ένα χρονικό διάστημα στο οποίο συνέπιπταν και οι τρεις διαδικασίες (σύζευξη, ωοαπόθεση, εκκόλαψη). Αντίθετα, ο πληθυσμός από την Ηγουμενίτσα παρουσιάζει μια σαφή διαφοροποίηση ως προς εκείνους της Κρήτης. Συγκεκριμένα, κάθε στάδιο της αναπαραγωγικής διαδικασίας διακρίνεται από το επόμενο με ένα χρονικό διάστημα περίπου δυο ημερών (Εικόνα 3.5). Έτσι, παρόλο που στο σύνολο της η αναπαραγωγική περίοδος του πληθυσμού αυτού ήταν σύντομη, τα επιμέρους της στάδια διακρίθηκαν μεταξύ τους χρονικά χωρίς αλληλεπικαλύψεις. Διάθεση για σύζευξη Σε ό,τι αφορά το ποσοστό των σαλιγκαριών που ζευγάρωσαν τουλάχιστον μια φορά κατά τη διάρκεια των παρατηρήσεων, δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των πληθυσμών (ANOVA σε arcsine τροποποιημένα δεδομένα F=0,990, p=0,473, d.f.=10). Όλοι οι πληθυσμοί παρουσίασαν μεγάλη διάθεση για σύζευξη, αφού πάνω από το 80% των ατόμων σε καθέναν από αυτούς συζεύχθηκαν τουλάχιστον για μια φορά κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής περιόδου (Εικόνα 3.6). Εικόνα 3.6 Ποσοστό ατόμων που ζευγάρωσαν σε κάθε πληθυσμό. Figure 3.6 Percentage of mating snails in each population. Η συχνότητα σύζευξης (αριθμός συζεύξεων ανά άτομο) είναι το πιο συχνά χρησιμοποιούμενο κριτήριο για την εκτίμηση της διάθεσης για σύζευξη (Fearnley, 1996; Madec & Daguzan, 1993; Baur & Baur, 1992) και 59

69 Αποτελέσματα χρησιμοποιείται ως άμεσος δείκτης της έντασης του σπερματικού ανταγωνισμού στον πληθυσμό. Σε ότι αφορά τη συχνότητα σύζευξης του κάθε σαλιγκαριού (NM-Number of matings), παρατηρήθηκε διαπληθυσμιακή διαφοροποίηση ως προς αυτό το χαρακτηριστικό αναπαραγωγικής συμπεριφοράς (ANOVA F=31,432, p=0,000, d.f.=10). Συγκεκριμένα, οι δυο πληθυσμοί από την περιοχή των Χανίων παρουσίασαν το μεγαλύτερο αριθμό συζεύξεων με τέσσερα ζευγαρώματα κατά μέσο όρο, ακολούθησαν οι πληθυσμοί από το νομό Λασιθίου με τρία ζευγαρώματα κατά μέσο όρο, οι πληθυσμοί από το νομό Ηρακλείου με δυο, ενώ το μικρότερο αριθμό συζεύξεων είχε ο πληθυσμός από την Ηγουμενίτσα (Εικόνα 3.7). Εικόνα 3.7 Αριθμός των συζεύξεων που πραγματοποίησαν τα άτομα από τους πληθυσμούς που μελετήθηκαν (Πληθυσμοί: 1=Αρχάνες, 2=Αλμυρός, 3=Αγία Μαρίνα, 4=Πόμπια, 8=Γούβες, 9=Σούδα, 10=Συρίλι, 11=Ρούσα, 12=Μαρώνια, 13=Σητεία, και 14=Ηγουμενίτσα). Οι κύκλοι αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο και οι μπάρες το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Figure 3.7 Number of matings that were performed by snails of the following populations (population 1=Arxanes, 2=Almyros, 3=Agia Marina, 4=Pompia, 8=Gouves, 9=Souda, 10= Syrili, 11=Rousa, 12=Maronia, 13=Siteia, and 14=Igoumenitsa. Circles represent the mean and bars the standard error of the mean. 60

70 Αποτελέσματα Ως προς την κατανομή του αριθμού των συζεύξεων στους επιμέρους πληθυσμούς (Εικόνα 3.8) παρατηρούμε ότι στους πληθυσμούς του Ηρακλείου (μωβ ιστογράμματα) το μεγαλύτερο ποσοστό των ατόμων πραγματοποιεί δυο συζεύξεις και οι πληθυσμοί αυτοί προέρχονται από φυσικά ξηρά ενδιαιτήματα, με εξαίρεση αυτόν από τις Αρχάνες (ποτιζόμενος ελαιώνας) όπου το μεγαλύτερο ποσοστό των ατόμων πραγματοποιεί τρεις συζεύξεις. Ο μέγιστος αριθμός των συζεύξεων στους πληθυσμούς από το Ηράκλειο ήταν πέντε, με εξαίρεση τον πληθυσμό από τις Αρχάνες με μέγιστο έξι και τον πληθυσμό από τις Γούβες με μέγιστο τέσσερις συζεύξεις. Όπως φαίνεται στην ίδια εικόνα (πράσινα ιστογράμματα) οι πληθυσμοί από το ανατολικότερο άκρο της Κρήτης (Ρούσα, Μαρώνια, Σητεία) πραγματοποιούσαν ως επί το πλείστον τρείς συζεύξεις, με μέγιστο τις έξι συζεύξεις. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσίασαν οι πληθυσμοί από το νομό Χανίων (μπλε ιστογράμματα, εικόνας 3.8) στους οποίους το μεγαλύτερο ποσοστό των ατόμων πραγματοποιεί από τρείς ως και πέντε συζεύξεις, ενώ σε μικρότερο ποσοστό ο αριθμός των συζεύξεων φτάνει ως και τις επτά. Μια τελείως διαφορετική εικόνα έδωσε ο πληθυσμός της Ηγουμενίτσας, όπου το μεγαλύτερο ποσοστό των ατόμων πραγματοποιεί ένα ζευγάρωμα, με μέγιστο αριθμό τις τέσσερις συζεύξεις. Στην εικόνα 3.8 παρουσιάζονται επιπλέον οι μέσοι όροι, οι τυπικές αποκλίσεις και το μέγεθος του δείγματος από κάθε πληθυσμό που πραγματοποίησε τις συζεύξεις. 61

71 Αποτελέσματα 62

72 Αποτελέσματα 63

73 Αποτελέσματα 64

74 Αποτελέσματα 65

75 Αποτελέσματα Εικόνα 3.8 Κατανομή του αριθμού των συζεύξεων που πραγματοποίησαν τα άτομα από τους πληθυσμούς που μελετήθηκαν. Σε κάθε ιστόγραμμα φαίνεται ο μέσος όρος, η τυπική απόκλιση και ο αριθμός των δειγμάτων για κάθε επιμέρους πληθυσμό. Figure 3.8 Frequency distribution of number of matings (NM) performed by snails of the studied populations. Each histogram includes the mean, the standard deviation and the sample number of each population. 66

76 Αποτελέσματα Διάρκεια σύζευξης Ως προς τη διάρκεια σύζευξης παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των πληθυσμών που μελετήθηκαν (ANOVA F=31,810, p=0,000, d.f.=10). Όλοι οι πληθυσμοί από την Κρήτη είχαν μεγάλες διάρκειες σύζευξης (από επτά ως και εννιά ώρες) σε σχέση με τον πληθυσμό από την Ηγουμενίτσα (5,05±2,02). Μεταξύ των πληθυσμών της Κρήτης, τη μεγαλύτερη μέση διάρκεια σύζευξης είχε ο πληθυσμός από τις Γούβες (9,33±1,93), ακολούθησαν οι πληθυσμοί από τις Αρχάνες (8,05±2,16), τον Αλμυρό (8,69±1,28), την Πόμπια (8,25±1,42), τη Σούδα (8,02±0,79), το Συρίλι (8,13±1,07), τη Ρούσα (8,16±1,29) και τα Μαρώνια (7,98±0,97) με μέση διάρκεια σύζευξης στις οκτώ ώρες, ενώ η διάρκεια αυτή για τους πληθυσμούς της Αγίας Μαρίνας και της Σητείας, αντίστοιχα ήταν της τάξης των επτά ωρών (7,37±1,42 και 7,36±1,63, αντίστοιχα, Εικόνα 3.9). Εικόνα 3.9 Μέση διάρκεια σύζευξης για τους πληθυσμούς που μελετήθηκαν (Πληθυσμοί: 1=Αρχάνες, 2=Αλμυρός, 3=Αγία Μαρίνα, 4=Πόμπια, 8=Γούβες, 9=Σούδα, 10=Συρίλι, 11=Ρούσα, 12=Μαρώνια, 13=Σητεία, και 14=Ηγουμενίτσα). Οι κύκλοι αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο και οι μπάρες το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Figure 3.9 Mean mating duration (hours) for the following populations (population 1=Arxanes, 2=Almyros, 3=Agia Marina, 4=Pompia, 8=Gouves, 9=Souda, 10= Syrili, 11=Rousa, 12=Maronia, 13=Siteia, and 14=Igoumenitsa. Circles represent the mean and bars the standard error of the mean. 67

77 Αποτελέσματα Σε ό,τι αφορά το χρονικό διάστημα μεταξύ της ενεργοποίησης των ζώων και της πρώτης σύζευξης που αυτά πραγματοποίησαν παρατηρήθηκε ότι όλοι οι πληθυσμοί αποκρίθηκαν άμεσα, ζευγαρώνοντας μέσα στο πρώτο 24ωρο, με εξαίρεση τον πληθυσμό 8 από την περιοχή των Γουβών που ενεργοποιήθηκε μια μέρα αργότερα (Εικόνα 3.10). Χρησιμοποιώντας μικρότερη χρονική κλίμακα και υπολογίζοντας το διάστημα ενεργοποίησης σε ώρες, διαπιστώθηκαν διαφορές ανάμεσα στους πληθυσμούς του Ηρακλείου, οι οποίοι παρουσίασαν μεγαλύτερη περίοδο ενεργοποίησης για σύζευξη, και σε όλους τους πληθυσμούς που μελετήθηκαν (ANOVA F=8,734, p=0,000, d.f.=10). Εικόνα 3.10 Χρονικό διάστημα μεταξύ της ενεργοποίησης και της πρώτης σύζευξης για τους πληθυσμούς που μελετήθηκαν (Πληθυσμοί: 1=Αρχάνες, 2=Αλμυρός, 3=Αγία Μαρίνα, 4=Πόμπια, 8=Γούβες, 9=Σούδα, 10=Συρίλι, 11=Ρούσα, 12=Μαρώνια, 13=Σητεία, και 14=Ηγουμενίτσα). Οι κύκλοι αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο και οι μπάρες το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Figure 3.10 Time period between activation and first copulation for the following populations (population 1=Arxanes, 2=Almyros, 3=Agia Marina, 4=Pompia, 8=Gouves, 9=Souda, 10= Syrili, 11=Rousa, 12=Maronia, 13=Siteia, and 14=Igoumenitsa. Circles represent the mean and bars the standard error of the mean. Το χρονικό διάστημα που παρεμβάλλεται μεταξύ των διαδοχικών συζεύξεων παρουσίασε διαπληθυσμιακή ποικιλότητα, όπως φαίνεται στον πίνακα 3.1. Συγκεκριμένα, ως προς το χρονικό διάστημα μεταξύ της πρώτης και δεύτερης σύζευξης παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική 68

78 Αποτελέσματα διαφορά μεταξύ των πληθυσμών (ANOVA F=15,486, p=0,000, d.f.=10). Για τους πληθυσμούς από τα Χανιά (Σούδα και Συρίλι) το χρονικό αυτό διάστημα ήταν σύντομο, δηλαδή παρεμβαλλόταν κατά μέσο όρο μία ημέρα. Ακολούθησαν οι πληθυσμοί από το ανατολικότερο άκρο της Κρήτης (Ρούσα, Μαρώνια, Σητεία) με χρονικό διάστημα μεταξύ πρώτης και δεύτερης σύζευξης κατά μέσο όρο δύο ημερών, ενώ για την Πόμπια το διάστημα αυτό ήταν κατά μέσο όρο τρεις μέρες. Οι πληθυσμοί από τις Αρχάνες, τις Γούβες και την Ηγουμενίτσα, είχαν μεσοδιάστημα πρώτης και δεύτερης σύζευξης τεσσάρων με πέντε ημερών, ενώ το μεγαλύτερο διάστημα (επτά με οχτώ ημέρες) παρουσίασαν οι πληθυσμοί από τις Αρχάνες και την Αγία Μαρίνα (Πίνακας 3.1). Στο χρονικό διάστημα μεταξύ δεύτερης και τρίτης σύζευξης η διαπληθυσμιακή διαφορά ήταν επίσης σημαντική (ANOVA F=7,823, p=0,000, d.f.=10). Για τους πληθυσμούς του Ηρακλείου το διάστημα αυτό δεν παρουσίασε σημαντική διαφορά και κυμαινόταν από επτά ως εννιά μέρες, με εξαίρεση τον πληθυσμό από την Πόμπια στον οποίο το χρονικό διάστημα αυτό διήρκησε περίπου έξι μέρες. Ο πληθυσμός από την Ηγουμενίτσα παρουσίασε παρόμοιες τιμές (περίπου επτά ημέρες) με αυτόν του Ηρακλείου. Αντίθετα, το μεσοδιάστημα μεταξύ της δεύτερης και τρίτης σύζευξης ήταν σαφώς μικρότερο στους δυο πληθυσμούς από τα Χανιά (Συρίλι και Σούδα) με διάρκεια περίπου δυο και τρείς μέρες, αντίστοιχα, ενώ λίγο υψηλότερες τιμές παρουσίασαν οι πληθυσμοί από το Λασίθι (Ρούσα, Μαρώνια, Σητεία) με διάρκεια περίπου τις τέσσερις μέρες (Πίνακας 3.1). Για τα μεσοδιαστήματα που ακολούθησαν, δηλαδή εκείνα μεταξύ της τρίτης-τέταρτης, τέταρτηςπέμπτης, πέμπτης-έκτης, και έκτης-έβδομης σύζευξης αντίστοιχα, δεν ήταν δυνατή η ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) μεταξύ όλων των πληθυσμών, όπως για παράδειγμα στις Γούβες και την Ηγουμενίτσα ο αριθμός του δείγματος ήταν μικρός και έτσι δεν ήταν δυνατή η ανάλυση διακύμανσης (Πίνακας 3.1). Το ίδιο ισχύει και για τους πληθυσμούς των οποίων ο μέγιστος αριθμός συζεύξεων ήταν από πέντε και πάνω, όπου ουσιαστικά ένα άτομο πραγματοποίησε το μέγιστο των συζεύξεων και δεν ήταν δυνατή η ανάλυση διακύμανσης. Όπως φαίνεται και στον πίνακα 3.1 οι περιπτώσεις αυτές σημειώνονται με αστερίσκο. Αξίζει να σημειωθεί ότι ορισμένα σαλιγκάρια ιδιαίτερα τις πρώτες μέρες της αναπαραγωγικής τους δραστηριότητας ζευγάρωναν περισσότερες από μια φορά μέσα στο ίδιο εικοσιτετράωρο. Αυτό σημαίνει ότι το μεσοδιάστημα ιδιαίτερα μεταξύ πρώτης- δεύτερης, δεύτερης- τρίτης αλλά και πολλές φορές τρίτης-τέταρτης σύζευξης ήταν της τάξης των μερικών ωρών για τα σαλιγκάρια αυτά. Συγκεκριμένα, για τον πληθυσμό από τις Αρχάνες, το 5,3% των σαλιγκαριών είχε μεσοδιάστημα μεταξύ της πρώτης και δεύτερης σύζευξης δύο ώρες, ενώ το 8,3% είχε μεσοδιάστημα 9 ωρών μεταξύ της δεύτερης και τρίτης σύζευξης. Για τον πληθυσμό από τον Αλμυρό το 3,7% των σαλιγκαριών είχε χρονικό διάστημα μεταξύ πρώτης και δεύτερης σύζευξης έντεκα ώρες, το 18,2% είχε χρονικό διάστημα μεταξύ δεύτερης και τρίτης σύζευξης ως και τέσσερεις ώρες, ενώ το 20% των ατόμων είχε χρονικό 69

79 Αποτελέσματα διάστημα μεταξύ τρίτης και τέταρτης σύζευξης 5,5 ώρες. Σε ότι αφορά τον πληθυσμό από την Αγία Μαρίνα ένα 7,4% του πληθυσμού είχε μεσοδιάστημα μεταξύ της πρώτης και δεύτερης σύζευξης έξι ώρες. Ο πληθυσμός από την Πόμπια παρουσίασε επίσης μεγάλη διάθεση για σύζευξη καθώς ένα 10,6% των ατόμων του δείγματος είχε μεσοδιάστημα μεταξύ πρώτης και δεύτερης σύζευξης από 2,5 ως και 11 ώρες. Σε ότι αφορά τον πληθυσμό από τις Γούβες ένα 12,5% του πληθυσμού είχε μεσοδιάστημα μεταξύ δεύτερης και τρίτης σύζευξης έντεκα ωρών. Για τον πληθυσμό της Σούδας που εκδήλωσε κατά μέσο όρο το μεγαλύτερο αριθμό συζεύξεων τα μεσοδιαστήματα μεταξύ των ζευγαρωμάτων ήταν μικρά ως και την τρίτη σύζευξη. Συγκεκριμένα, για το 17,8% των ατόμων το μεσοδιάστημα μεταξύ της πρώτης και δεύτερης σύζευξης ήταν από 2,5 ως και 15 ώρες, για το 19% των ατόμων το χρονικό διάστημα μεταξύ της δεύτερης και τρίτης σύζευξης ήταν από μία ως έντεκα ώρες, ενώ για το μεσοδιάστημα ως την τέταρτη σύζευξη ήταν από τρεις ως και δεκατέσσερις ώρες για το 17,9% των ατόμων. Παρόμοια εικόνα έδωσαν και τα σαλιγκάρια από το Συρίλι στο οποίο επίσης παρατηρήθηκε κατά μέσο όρο ένας από τους μεγαλύτερους αριθμούς συζεύξεων σε σχέση με τους υπόλοιπους πληθυσμούς που εξετάστηκαν. Δηλαδή, υψηλό ποσοστό των ατόμων του δείγματος (23,3%) ζευγάρωσε για δεύτερη φορά με μεσοδιάστημα από δυο ως έντεκα ώρες, το 17,1% των ατόμων ζευγάρωσε για τρίτη φορά με παρεμβαλλόμενο χρονικό διάστημα από μία ως δώδεκα ώρες, ενώ για το τέταρτο ζευγάρωμα το μεσοδιάστημα ήταν από τέσσερις ως και έντεκα ώρες για το 9,1% του δείγματος από τον πληθυσμό αυτό. Για τον πληθυσμό από τη Ρούσα το 10,3% είχε χρονικό διάστημα μεταξύ της πρώτης και δεύτερης σύζευξης από επτά ως έντεκα ώρες, και το 11,1% είχε μεσοδιάστημα ως την τρίτη σύζευξη από τέσσερεις ως και δεκατέσσερις ώρες. Για τον πληθυσμό από τα Μαρώνια το 22,5% είχε μεσοδιάστημα ως τη δεύτερη σύζευξη από δυο ως δέκα ώρες, ενώ ως την τρίτη σύζευξη το χρονικό αυτό διάστημα ήταν από τρεις ως οχτώ ώρες για το 10,8% του πληθυσμού. Για τον πληθυσμό της Σητείας το 13,3% των ατόμων του είχαν μεσοδιάστημα ως τη δεύτερη σύζευξη από έξι ως δεκατρείς ώρες, το 31,8% από πέντε ως δεκατρείς ώρες ως την τρίτη σύζευξη και το 11,1% είχε μεσοδιάστημα ως την τέταρτη σύζευξη έξι ωρών. Τέλος, τα 12,5% του δείγματος από την Ηγουμενίτσα είχαν από έξι ως δώδεκα ώρες μεσοδιάστημα μεταξύ της πρώτης και δεύτερης σύζευξης. Φαίνεται ότι στην πλειονότητα των πληθυσμών που μελετήθηκαν ως προς τη διάθεση για σύζευξη, όσο μεγαλύτερος ήταν ο αριθμός των συζεύξεων που πραγματοποιούσαν τα άτομα ενός πληθυσμού, τόσο μικρότερο ήταν το χρονικό διάστημα της ενεργοποίησης τους για ζευγάρωμα, δηλαδή τόσο πιο γρήγορα αποκρίνονταν. Η ίδια αρνητική συσχέτιση παρατηρείται και με τα μεσοδιαστήματα μεταξύ των διαδοχικών συζεύξεων, τόσο στους επιμέρους πληθυσμούς όσο και στο σύνολό τους (Πίνακας 3.2). 70

80 Αποτελέσματα Πίνακας 3.1 Χρονική περίοδος μεταξύ των διαδοχικών συζεύξεων (ημέρες) στους 11 πληθυσμούς που μελετήθηκαν (μέσος όρος ± τυπική απόκλιση). Το μέγεθος του δείγματος δίνεται σε παρένθεση. Με αστερίσκο (*) σημειώνονται οι περιπτώσεις όπου το δείγμα αποτελείται από ένα άτομο και δεν είναι δυνατός ο υπολογισμός μέσου όρου ± τυπικής απόκλισης, αλλά σημειώνεται μόνο η απόλυτη τιμή της μεταβλητής Table 3.1 Intermating intervals (days) of the 11 studied populations (mean±s.d.). Sample sizes are given in parentheses. Asterisks (*) indicate cases were sample size had fewer than two cases and (mean±s.d.) cannot be calculated, thus real values are illustrated in the table ΧΡΟΝΙΚΗ ΠΕΡΙΟΔΟΣ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΔΙΑΔΟΧΙΚΩΝ ΣΥΖΕΥΞΕΩΝ (ημέρες) ΠΛΗΘΥΣΜΟΣ 1 η -2 η 2 η 3 η 3 η - 4 η 4 η - 5 η 5 η - 6 η 6 η 7 η Αρχάνες 4,95±3,799 (38) 8,79±5,556 (24) 12,14±3,436 (7) 7,00* (1) 8,00* (1) Αλμυρός 7,30±5,980 (27) 6,64±4,365 (11) 7,80±6,340 (5) 4,50±4,950 (2) Αγία Μαρίνα 8,30±6,138 (27) 9,43±5,350 (7) 4,50±4,950 (2) 6,00* (1) Πόμπια 2,74±2,674 (47) 6,00±1,643 (21) 8,25±0,957 (4) 7,00* (1) Γούβες 5,66±3,419 (38) 8,13±6,813 (8) 8,00* (1) Σούδα 1,29±1,618 (45) 3,43±2,830 (42) 6,29±4,319 (28) 6,00±3,229 (15) 5,50±1,915 (4) 7,00±1,414 (2) Συρίλι 1,00±1,024 (43) 2,24±2,596 (41) 4,09±2,269 (33) 6,53±2,322 (17) 5,50±0,707 (2) Ρούσα 2,71±3,683 (38) 4,81±2,949 (27) 7,73±2,494 (11) 6,75±0,500 (4) 7,00* (1) Μαρώνια 1,55±2,480 (40) 3,68±4,021 (37) 6,05±4,224 (20) 6,60±1,897 (10) 6,33±0,577 (3) Σητεία 2,33±3,356 (30) 4,36±4,531(22) 6,11±5,442 (9) 11,67±7,506 (3) 7,00* (1) Ηγουμενίτσα 4,75±5,285 (24) 7,17±3,869 (6) 13,00* (1) 71

81 Αποτελέσματα Πίνακας 3.2 Συσχέτιση του αριθμού των συζεύξεων με το χρονικό διάστημα μεταξύ ενεργοποίησης και πρώτης σύζευξης (LP), και των χρονικών διαστημάτων μεταξύ των διαδοχικών συζεύξεων (Intermating Intervals-IMI). Δίνονται οι συντελεστές συσχέτισης των στατιστικά σημαντικών συσχετίσεων (p<0,01) με δυο αστερίσκους (**) (Pearson Correlation) Table 3.2 Correlation of number of matings (NM) with latency period (LP) and with the intermating intervals (IMI) of successive matings. Only coefficients of significant correlations at the p<0,01 level are provided and indicated by two asterisks (**) (Pearson Correlation) ΣΥΝΤΕΛΕΣΤΕΣ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗΣ ΜΕΤΑΞΥ ΑΡΙΘΜΟΥ ΣΥΖΕΥΞΕΩΝ (NM) KAI ΠΛΗΘΥΣΜΟΣ LP IMI1 IMI2 IMI3 IMI4 ΙΜΙ5 Αρχάνες -0,464** (48) -0,564** (38) -0,704** (24) -0,878** (7) Αλμυρός -0,558** (29) -0,602** (27) -0,720** (11) Αγία Μαρίνα -0,729** (27) -0,794** (7) Πόμπια -0,554** (55) -0,674** (47) -0,738** (21) Γούβες -0,540** (60) -0,515** (38) -0,886** (8) Σούδα -0,615** (45) -0,521** (42) -0,730** (28) -0,639** (15) Συρίλι -0,422** (43) -0,472** (33) Ρούσα -0,564** (46) -0,413** (39) -0,675** (11) Μαρώνια -0,578** (40) -0,502** (37) -0,593** (20) -0,760** (10) Σητεία -0,578** (37) -0,538** (30) -0,529** (22) Ηγουμενίτσα -0,511** (24) -0,957** (6) ΣΥΝΟΛΟ -0,433** (501) -0,652** (398) -0,553** (246) -0,611** (121) -0,492** (54) -0,784** (12) 72

82 Αποτελέσματα Χρονική περίοδος μεταξύ τελευταίας σύζευξης και ωοαπόθεσης Το χρονικό διάστημα μεταξύ της τελευταίας σύζευξης που πραγματοποίησε κάθε σαλιγκάρι και της απόθεσης αβγών διέφερε σημαντικά μεταξύ των πληθυσμών που μελετήθηκαν (ANOVA F=4,037, p=0,000, d.f.=10) (Εικόνα 3.11). Εικόνα 3.11 Χρονικό διάστημα (ημέρες) μεταξύ τελευταίας σύζευξης και ωοαπόθεσης (Πληθυσμοί: 1=Αρχάνες, 2=Αλμυρός, 3=Αγία Μαρίνα, 4=Πόμπια, 8=Γούβες, 9=Σούδα, 10=Συρίλι, 11=Ρούσα, 12=Μαρώνια, 13=Σητεία, και 14=Ηγουμενίτσα). Οι κύκλοι αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο και οι μπάρες το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Figure 3.11 Time period (days) between last mating and oviposition (population 1=Arxanes, 2=Almyros, 3=Agia Marina, 4=Pompia, 8=Gouves, 9=Souda, 10= Syrili, 11=Rousa, 12=Maronia, 13=Siteia, and 14=Igoumenitsa. Circles represent the mean and bars the standard error of the mean. Το μεγαλύτερο χρονικό διάστημα μεταξύ τελευταίας σύζευξης και ωοαπόθεσης παρατηρήθηκε στον πληθυσμό της Πόμπιας (20,83±10,89), ακολουθούν οι πληθυσμοί από τον Αλμυρό (18,83±13,69), τις Γούβες (18,68±15,30) και την Ηγουμενίτσα (17,06±6,82), οι πληθυσμοί από τις Αρχάνες (14,39±9,32) και τη Σητεία (14,75±6,50). Ακόμη μικρότερα χρονικά διαστήματα παρατηρήθηκαν στους πληθυσμούς από το Συρίλι (12,60±7,06), τα Μαρώνια (12,50±7,30), τη Ρούσα (12,43±6,72) και τη Σούδα (11,03±10,40), ενώ τη μικρότερη περίοδο εμφάνισε ο πληθυσμός από την 73

83 Αποτελέσματα Αγία Μαρίνα (8,66±5,62). Στο σύνολο των πληθυσμών που μελετήθηκαν, το χρονικό διάστημα μεταξύ της τελευταίας σύζευξης και ωοαπόθεσης συσχετίσθηκε αρνητικά με τον αριθμό των συζεύξεων (Pearson correlation: r= -0,331, p=0,000, n=267) (Εικόνα 3.12Α), καθώς και με τον αριθμό των αβγών που εκκολάπτονταν (Pearson correlation: r= -1,151, p=0,022, n=230) (Εικόνα 3.12Β). Εικόνα 3.12 Χρονικό διάστημα (ημέρες) μεταξύ της τελευταίας σύζευξης και ωοαπόθεσης σε σχέση με (Α) τον αριθμό των συζεύξεων και (Β) τον αριθμό των αβγών που εκκολάπτονται (Πληθυσμοί: 1=Αρχάνες, 2=Αλμυρός, 3=Αγία Μαρίνα, 4=Πόμπια, 8=Γούβες, 9=Σούδα, 10=Συρίλι, 11=Ρούσα, 12=Μαρώνια, 13=Σητεία, και 14=Ηγουμενίτσα). Figure 3.12 Time period (days) between last mating and oviposition in relation to (Α) the number of matings, and (B) the number of hatchlings (population 1=Arxanes, 2=Almyros, 3=Agia Marina, 4=Pompia, 8=Gouves, 9=Souda, 10= Syrili, 11=Rousa, 12=Maronia, 13=Siteia, and 14=Igoumenitsa. 74

84 Αποτελέσματα Βιολογία αναπαραγωγής Η μελέτη της βιολογίας αναπαραγωγής του C. aspersum αφορά στην αναπαραγωγική απόδοση των ζώων ή αλλιώς στη γονιμότητά τους, δηλαδή αντιπροσωπεύει την αναπαραγωγική απόδοση της θηλυκής λειτουργίας σε αυτό το ταυτόχρονα ερμαφρόδιτο σαλιγκάρι. Ένα ενδεικτικό χαρακτηριστικό της γονιμότητας ή της αναπαραγωγικής απόδοσης σε επίπεδο πληθυσμού είναι το ποσοστό των σαλιγκαριών που απέθεσαν αβγά σε σχέση με το σύνολο των σαλιγκαριών καθώς και σε σχέση με τον αριθμό των σαλιγκαριών που συζεύχθηκαν τουλάχιστον μια φορά. Σε ατομικό επίπεδο ένδειξη γονιμότητας αποτελούν β) το μέγεθος των ωοαποθέσεων που εκφράζεται στον αριθμό των αβγών ανά άτομο ή ανά ωοαπόθεση, γ) το μέγεθος των αβγών που αντανακλάται στη διάμετρό τους, (δ) ο όγκος της ωοαπόθεσης (ε) την εκκολαπτική επιτυχία και (στ) τη βιωσιμότητα των νεοεκκολαφθέντων σαλιγκαριών για τις πρώτες σαράντα ημέρες ζωής. Σε ό,τι αφορά το ποσοστό των σαλιγκαριών που απέθεσαν αβγά σε σχέση με το σύνολο των σαλιγκαριών καθώς και σε σχέση με τον αριθμό των σαλιγκαριών που συζεύχθηκαν τουλάχιστον μια φορά, παρατηρείται ποικιλότητα μεταξύ των πληθυσμών και η ανάλυση διακύμανσης έδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά ως προς το ποσοστό των ατόμων που ωοαποθέτουν μεταξύ των πληθυσμών (ANOVA F=6,226, p=0,000, d.f.=10). Όπως φαίνεται και στον πίνακα 3.3, τα μεγαλύτερα ποσοστά ατόμων που αποθέτουν αβγά (70%) παρατηρήθηκαν στους πληθυσμούς από τον Αλμυρό, την Αγία Μαρίνα, τη Σούδα και το Συρίλι, ενώ στους υπόλοιπους πληθυσμούς τα ποσοστά ωοαποθέσεων ήταν της τάξης των 30 με 40%. Επίσης, το μέγεθος των ωοαποθέσεων διέφερε στατιστικά σημαντικά μεταξύ των πληθυσμών ως προς τον αριθμό των αβγών ανά άτομο (ANOVA F=7,510, p=0,000, d.f.=10) ή ανά ωοαπόθεση (ANOVA F=8,155, p=0,000, d.f.=10). Όπως φαίνεται και στην εικόνα 3.13 ο πληθυσμός της Ηγουμενίτσας παρουσίασε το μεγαλύτερο μέγεθος ωοαποθέσεων ανά άτομο (130,29±59,26) σε σχέση με τους άλλους πληθυσμούς. Ακολουθούν οι πληθυσμοί από το Συρίλι (119,10±43,06), τη Σούδα (108,29±39,74) και τον Αλμυρό (111,68±54,12). Οι πληθυσμοί από τη Ρούσα (94,48±42,15), την Αγία Μαρίνα (83,62±43,60) και τις Αρχάνες (79,83±49,33) είχαν ωοαποθέσεις της τάξης των 80 αβγών/άτομο, ενώ τα μικρότερα μεγέθη αυτών παρατηρήθηκαν στους πληθυσμούς από τα Μαρώνια (68,77±25,28), τη Σητεία (66,88±20,44), την Πόμπια (60,45±26,12) και τις Γούβες (55,05±19,48). Στις περιπτώσεις όπου ο αριθμός αβγών ανά άτομο και ανά ωοαπόθεση δεν συμπίπτουν (Εικόνα 3.13). Αυτό σημαίνει ότι τα ορισμένα άτομα σε κάθε πληθυσμό απέθεσαν αβγά περισσότερες από μια φορά. Αυτό συνέβη σε όλους τους πληθυσμούς, πλην εκείνου από το Συρίλι και την Ηγουμενίτσα (Πίνακας 3.4). 75

85 Αποτελέσματα Πίνακας 3.3 Γονιμότητα ή αναπαραγωγική απόδοση των πληθυσμών εκφρασμένη ως το ποσοστό των σαλιγκαριών α) που απέθεσαν αβγά σε σχέση με το σύνολο των σαλιγκαριών που χρησιμοποιήθηκαν, β) σε σχέση με τον αριθμό των σαλιγκαριών που συζεύχθηκαν και γ) το ποσοστό των ατόμων ανά αριθμό ωοαποθέσεων. Δίδεται σε παρένθεση ο αριθμός των ωοαποθέσεων Table 3.3 Snail population fecundity expressed as percentage of snails which laid eggs a) in relation to the total number of snails used in the experiment, b) in relation to the number of snails which mated, and c) percentage of snails which laid eggs in relation to the number of ovipositions laid. The number of ovipositions is provided in parentheses Πληθυσμός % ατόμων που ωοαπέθεσαν ως προς το σύνολο του πληθυσμού % ατόμων που ωοαπέθεσαν ως προς σύνολο των ατόμων που συζεύχθηκαν % ατόμων ανά αριθμό ωοαποθέσεων Αρχάνες 40,35 47,92 95,7 (1) 4,3 (3) Αλμυρός 75,00 79,41 63 (1) 33,3 (2) 3,7 (3) Αγία Μαρίνα 64,15 68,09 93,8 (1) 6,3 (2) Πόμπια 48,33 51, (1) Γούβες 31,42 36,66 95,5 (1) 4,5 (2) Σούδα 65,95 67,39 93,5 (1) 6,5 (2) Συρίλι 65,21 66, (1) Ρούσα 36,84 45,65 95,2 (1) 4,8 (2) Μαρώνια 40,00 48,88 95,5 (1) 4,5 (2) Σητεία 42,11 43,24 93,8 (1) 6,3 (2) Ηγουμενίτσα 29,82 34, (1) Το μέγεθος των αβγών (διάμετρος) διέφερε στατιστικά σημαντικά μεταξύ των πληθυσμών (ANOVA F=5,387, p=0,000, d.f.=10) και, συγκεκριμένα, ο πληθυσμοί από τη Σητεία (5,05±0,52) και τη Ρούσα (4,75±0,42) είχαν τη μεγαλύτερη διάμετρο αβγών από όλους τους πληθυσμούς που μελετήθηκαν, ενώ οι υπόλοιποι πληθυσμοί δεν διέφεραν ως προς το χαρακτηριστικό αυτό (Εικόνα 3.14). 76

86 Αποτελέσματα Εικόνα 3.13 Ραβδόγραμμα που δείχνει το μέγεθος των ωοαποθέσεων ανά άτομο και ανά ωοαπόθεση. Table 3.13 Bar chart illustrating the number of eggs laid/individual and eggs laid/oviposition. Πίνακας 3.4 Ποσοστό ατόμων ανά αριθμό ωοαποθέσεων Table 3.4 Percentage of snails per number of clutches ΑΡΙΘΜΟΣ ΩΟΑΠΟΘΕΣΕΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΟΣ Ν Αρχάνες 23 95,7% 4,3% Αλμυρός 27 63% 33,3% 3,7% Αγία Μαρίνα 34 91,25 8,8% Πόμπια % Γούβες 22 95,5% 4,5% Σούδα 31 93,5% 6,5% Συρίλι % Ρούσα 21 95,2% 4,8% Μαρώνια 22 95,5% 4,5% Σητεία 16 93,8% 6,3% Ηγουμενίτσα % 77

87 Αποτελέσματα Εικόνα 3.14 Μέγεθος αβγών εκφρασμένο στη μέση διάμετρο (Πληθυσμοί: 1=Αρχάνες, 2=Αλμυρός, 3=Αγία Μαρίνα, 4=Πόμπια, 8=Γούβες, 9=Σούδα, 10=Συρίλι, 11=Ρούσα, 12=Μαρώνια, 13=Σητεία, και 14=Ηγουμενίτσα). Οι κύκλοι αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο και οι μπάρες το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Figure 3.14 Egg size in mean values of egg diameter (population 1=Arxanes, 2=Almyros, 3=Agia Marina, 4=Pompia, 8=Gouves, 9=Souda, 10= Syrili, 11=Rousa, 12=Maronia, 13=Siteia, and 14=Igoumenitsa. Circles represent the mean and bars the standard error of the mean. Ο όγκος της ωοαπόθεσης διέφερε μεταξύ των πληθυσμών (ANOVA F=5,387, p=0,000, d.f.=10), με τους πληθυσμούς της Σητείας (69.59 ± 22,33 mm 3 ) και της Ρούσας (57,17± 14,44 mm 3 ) να κατέχουν τους μεγαλύτερους όγκους ωοαπόθεσης, ενώ της Ηγουμενίτσας τον μικρότερο (35,91± 10,14 mm 3 ) (Εικόνα 3.15). 78

88 Αποτελέσματα Εικόνα 3.15 Όγκος ωοαπόθεσης (Πληθυσμοί: 1=Αρχάνες, 2=Αλμυρός, 3=Αγία Μαρίνα, 4=Πόμπια, 8=Γούβες, 9=Σούδα, 10=Συρίλι, 11=Ρούσα, 12=Μαρώνια, 13=Σητεία, και 14=Ηγουμενίτσα). Οι κύκλοι αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο και οι μπάρες το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Figure 3.15 Volume of Oviposiition (population 1=Arxanes, 2=Almyros, 3=Agia Marina, 4=Pompia, 8=Gouves, 9=Souda, 10= Syrili, 11=Rousa, 12=Maronia, 13=Siteia, and 14=Igoumenitsa. Circles represent the mean and bars the standard error of the mean. Το ποσοστό της εκκολαπτικής επιτυχίας που εκφράζεται στο λόγο του αριθμού των ατόμων που εκκολάφθηκαν προς τον αριθμό των αβγών ανά άτομο διέφερε μεταξύ των πληθυσμών (ANOVA F=2,331, p=0,012, d.f.=10). Τα μεγαλύτερα ποσοστά, δηλαδή πάνω από 80%, κατείχαν οι πληθυσμοί από την Αγία Μαρίνα, τη Ρούσα, τη Σούδα και τα Μαρώνια (Εικόνα 3.16), το μικρότερο ο πληθυσμός της Σητείας (59,25%), ενώ οι υπόλοιποι πληθυσμοί είχαν εκκολαπτική επιτυχία από 60 ως 80%. Το ποσοστό της βιωσιμότητας των νεοεκκολαφθέντων, για τις πρώτες σαράντα ημέρες, διέφερε επίσης στατιστικά σημαντικά μεταξύ των πληθυσμών (ANOVA F=6,747, p=0,000, d.f.=10). Οι πληθυσμοί από τη Σητεία, τις Γούβες και τα Μαρώνια κατείχαν τα μεγαλύτερα ποσοστά στη βιωσιμότητα των νεοεκκολαφθέντων (Εικόνα 3.16). Ακολουθούν οι πληθυσμοί από τις Αρχάνες, την Πόμπια και τη Ρούσα, ενώ τα μικρότερα ποσοστά κατείχαν οι υπόλοιποι πληθυσμοί (Εικόνα 3.16). 79

89 Αποτελέσματα Εικόνα 3.16 Ραβδόγραμμα που δείχνει το ποσοστό της εκκολαπτικής επιτυχίας και της βιωσιμότητας των νεοεκκολαφθέντων. Figure 3.16 Bar chart depicting the percentage of hatching success (blue bars) and of juvenile survival (red bars). Εικόνα 3.17 Ραβδόγραμμα που δείχνει το μέσο όρο του αριθμού των ατόμων που εκκολάφθηκαν και που επιβίωσαν από κάθε πληθυσμό. Figure 3.17 Bar chart illustrating the mean values of the number of hatchlings (blue bars) and the number of juveniles (red bars) that survived. Μελετώντας τις απόλυτες τιμές και όχι την εκκολαπτική επιτυχία (ποσοστό) και τη βιωσιμότητα των νεοεκκολαφθέντων (ποσοστό), δίδεται μια πληρέστερη εικόνα του πραγματικού αριθμού των ατόμων στην επόμενη γενιά, που αντανακλά το πραγματικό αποτέλεσμα τις αναπαραγωγικής διαδικασίας. Όπως φαίνεται και στην εικόνα 3.17, η διαφορά μεταξύ των πληθυσμών εξακολουθεί να υπάρχει και είναι στατιστικά σημαντική τόσο σε 80

90 Αποτελέσματα ότι αφορά την εκκόλαψη (ANOVA F=1,956, p=0,039, d.f.=10), όσο και την βιωσιμότητα των νεοεκκολαφθέντων (ANOVA F=6,304, p=0,000, d.f.=10). Ο πραγματικός αριθμός των ατόμων της επόμενης γενιάς δεν ξεπερνά τα σαράντα σε όλους τους πληθυσμούς, ενώ τα λιγότερα άτομα κατέχουν οι πληθυσμοί της Αγίας Μαρίνας, του Αλμυρού και της Ηγουμενίτσας (Εικόνα 3.17). Όλες οι παραπάνω μετρήσεις που αφορούν στη γονιμότητα των σαλιγκαριών ως προς τη θηλυκή τους λειτουργία μπορούν να συσχετιστούν με το μέγεθος των ζώων και την αναπαραγωγική τους συμπεριφορά στο σύνολο των πληθυσμών που μελετήθηκαν. Οι συσχετίσεις έγιναν στο σύνολο των πληθυσμών και όχι ξεχωριστά σε κάθε πληθυσμό γιατί το μέγεθος του δείγματος ήταν μικρό αφού από κάθε πληθυσμό λίγα άτομα απέθεταν αβγά (Πίνακας 3.3), και τα ποσοστά της εκκολαπτικής επιτυχίας και της βιωσιμότητας διέφεραν πολύ μεταξύ τους (Εικόνα 3.16) Τα αποτελέσματα έδειξαν μια θετική συσχέτιση ανάμεσα στο ύψος τους κελύφους και τη γονιμότητα των σαλιγκαριών ως προς τη θηλυκή τους λειτουργία, που αντανακλάται στο συνολικό αριθμό αβγών που απέθεσε κάθε σαλιγκάρι (Εικόνα 3.18Α), καθώς και στον αριθμό των αβγών ανά ωοαπόθεση (Εικόνα 3.18Β). Παράλληλα, το ύψος του κελύφους φαίνεται να συσχετίζεται ισχυρά και με τη βιωσιμότητα των νεοεκκολαφθέντων (Εικόνα 3.19Α). Η βιωσιμότητα των απογόνων παρουσιάζει ισχυρή θετική συσχέτιση και με τον αριθμό των ατόμων που εκκολάφθηκαν (Εικόνα 3.19Β) καθώς και με τον αριθμό των αβγών ανά άτομο (Εικόνα 3.20Α). Επιπλέον, όσο περισσότερα αβγά αποθέτει ένα σαλιγκάρι τόσο περισσότερα εκκολάπτονται, όπως φαίνεται και στην εικόνα 3.20Β. Τέλος, ο αριθμός των συζεύξεων παρουσιάζει θετική συσχέτιση με τη γονιμότητα του θηλυκού ρόλου, δηλαδή με τον αριθμό αβγών ανά άτομο (Εικόνα 3.21Α) ή ανά ωοαπόθεση (Εικόνα 3.21Β). 81

91 Αποτελέσματα Εικόνα 3.18 Συσχέτιση (Pearson Correlation) μεταξύ ύψους του κελύφους και (A) αριθμού αβγών ανά άτομο (r=0,129, p=0,036, n=265), και (B) αριθμού αβγών ανά ωοαπόθεση (r=0,187, p=0,002, n=264). Figure 3.18 Pearson correlation of shell height with (A) egg number per snail (r=0,129, p=0,036, n=265), and (B) egg number per oviposition (r=0,187, p=0,002, n=264). 82

92 Αποτελέσματα Εικόνα 3.19 Συσχέτιση (Pearson Correlation) μεταξύ βιωσιμότητας απογόνων και (A) ύψους κελύφους (r=0,229, p=0,003, n=162), και (B) αριθμού εκκολαφθέντων (r=0,374, p=0,000, n=162). Figure 3.19 Pearson correlation of juvenile survival with (A) shell height (r=0,229, p=0,003, n=162), and (B) number of hatchlings (r=0,374, p=0,000, n=162). 83

93 Αποτελέσματα Εικόνα 3.20 Συσχέτιση (Pearson Correlation) μεταξύ αριθμού αβγών ανά άτομο και (A) βιωσιμότητας απογόνων (r=0,272, p=0,001, n=156), και (B) αριθμού εκκολαφθέντων (r=0,811, p=0,000, n=227). Figure 3.20 Pearson correlation of egg number per snail with (A) juvenile survival (r=0,272, p=0,001, n=156), and (B) number of hatchlings (r=0,811, p=0,000, n=227). 84

94 Αποτελέσματα Εικόνα 3.21 Συσχέτιση (Pearson Correlation) μεταξύ αριθμού συζεύξεων και (A) αριθμού αβγών ανά άτομο (r=0,129 p=0,036, n=263), και (B) αριθμού αβγών ανά ωοαπόθεση (r=0,169, p=0,006, n=262). Figure 3.21 Pearson correlation of mating number with (A) egg number per snail (r=0,129 p=0,036, n=263) and (B) egg number per oviposition (r=0,169, p=0,006, n=262). 85

95 Αποτελέσματα Αντίθετα, το μέγεθος των αβγών, που μετράται από τη μέση διάμετρο των αβγών ή υπολογίζεται από τον όγκο των αβγών δεν φαίνεται να σχετίζεται ούτε με το μέγεθος του ζώου (r=0,112, p=0,107, n=207) ούτε με την εκκολαπτική επιτυχία (r=0,088, p=0,216, n=200) ούτε με τη βιωσιμότητα των νεοεκκολαφθέντων (r=0,059, p=0,444, n=169). Σπερματικός ανταγωνισμός Η παρουσία και η δράση του σπερματικού ανταγωνισμού στο C.aspersum μπορεί να διερευνηθεί στο είδος αυτό καθώς η συμπεριφορά αναπαραγωγής του περιλαμβάνει πολλαπλές συζεύξεις και μάλιστα με περισσότερους του ενός συντρόφους κατά τη διάρκεια μιας αναπαραγωγικής περιόδου. Παράλληλα, το αναπαραγωγικό σύστημα του είδους είναι εξαιρετικά πολύπλοκο καθώς περιλαμβάνει όργανα που εξυπηρετούν το θηλυκό ρόλο, όπως η σπερματοκύστη, και η σπερματοθήκη, και όργανα που εξυπηρετούν τον αρσενικό ρόλο του ατόμου, όπως ο επίφαλλος, το μαστίγιο, το πέος. Παρόλα αυτά, η μελέτη τόσο της συμπεριφοράς αναπαραγωγής όσο και του αναπαραγωγικού συστήματος παρέχει έμμεσες ενδείξεις για την παρουσία και δράση του σπερματικού ανταγωνισμού. Οι άμεσες ενδείξεις προκύπτουν από το αποτέλεσμα της δράσης του σπερματικού ανταγωνισμού, που αντανακλάται στην πατρότητα των απογόνων. Για το λόγο αυτό, η μελέτη της δράσης του σπερματικού ανταγωνισμού πραγματοποιείται στην παρούσα διατριβή σε τρία επίπεδα: α) συζευκτική συμπεριφορά, β) αναπαραγωγικό σύστημα, γ) πατρότητα των απογόνων. Σπερματικός ανταγωνισμός και συζευκτική συμπεριφορά Η αναπαραγωγική συμπεριφορά του είδους C. aspersum έδειξε στην παρούσα διατριβή ότι περιλαμβάνει πολλαπλές συζεύξεις κατά τη διάρκεια μιας αναπαραγωγικής περιόδου. Αυτό το στοιχείο αποτελεί μια έμμεση ένδειξη για τη δράση του σπερματικού ανταγωνισμού. Αν οι πολλαπλές συζεύξεις πραγματοποιούνται με διαφορετικά άτομα τότε ο σπερματικός ανταγωνισμός θεωρείται εντονότερος. Για το λόγο αυτό μετρήθηκε ο αριθμός των διαφορετικών συντρόφων (NP-Number of Partners) σε σχέση με τον αριθμό των συζεύξεων (NM-Number of Matings) για κάθε πληθυσμό. Όταν ο λόγος NP/NM ισούται με τη μονάδα τότε το σαλιγκάρι πραγματοποιεί όλες του τις συζεύξεις με διαφορετικά άτομα. Όσο πιο κοντά στη μονάδα είναι ο λόγος NP/NM τόσο πιο έντονος ο σπερματικός ανταγωνισμός. Όπως φαίνεται στην εικόνα 3.22, στον πληθυσμό από τις Γούβες ο σπερματικός ανταγωνισμός είναι εξαιρετικά έντονος καθώς ο αριθμός των συζεύξεων συμπίπτει με τον αριθμό των διαφορετικών συντρόφων. Αν μάλιστα, εκφράσουμε τη σύγκριση του αριθμού των συντρόφων (Number of Partners- NP) με τον αριθμό των συζεύξεων (Number of Matings-NM) με έναν λόγο NP/NM, τότε ο λόγος αυτός για τον πληθυσμό από τις Γούβες ισούται με 86

96 Αποτελέσματα τη μονάδα. Για τον πληθυσμό από τις Αρχάνες, δε συμβαίνει το ίδιο (Εικόνα 3.22). Συγκεκριμένα, στις δυο συζεύξεις το 90% των ατόμων επιλέγει δυο διαφορετικούς συντρόφους, ενώ το 10% ένα σύντροφο. Στις τρεις συζεύξεις, το 68,2% επιλέγει τρεις συντρόφους, το 28,7% δυο, ενώ ένα 3,1% πραγματοποιεί και τις τρεις συζεύξεις με το ίδιο άτομο. Στις τέσσερις συζεύξεις, το 53,1% τις πραγματοποιεί με τέσσερις διαφορετικούς συντρόφους, το 37,5% με τρεις, ενώ το 9,4% επιλέγει δυο διαφορετικούς συντρόφους. Όσο αυξάνεται ο αριθμός των συζεύξεων τα ποσοστά στο μέγιστο αριθμό συντρόφων σταδιακά αλλάζουν. Έτσι, στις πέντε συζεύξεις το 31% επιλέγει πέντε συντρόφους, το 33,3% τέσσερις, το 33,3% τρεις, ενώ ένα 2,4% των ατόμων του πληθυσμού τις πραγματοποιεί με δυο διαφορετικούς συντρόφους. Στις έξι συζεύξεις, το 15,4% επιλέγει έξι διαφορετικούς συντρόφους, το 30,8% πέντε συντρόφους, το 46,2% τέσσερεις συντρόφους, ενώ τρεις διαφορετικοί σύντροφοι επιλέγονται από το 7,7% του πληθυσμού. Τέλος, σε ότι αφορά τον πληθυσμό από τις Αρχάνες, στο σύνολο των ατόμων που πραγματοποίησαν επτά συζεύξεις, το 50% ήταν με έξι διαφορετικούς συντρόφους, και το άλλο 50% με τέσσερις. Ο λόγος NP/NM για τον πληθυσμό αυτό ήταν 0,91±0,17. Σε ό,τι αφορά των πληθυσμό από το φαράγγι του Αλμυρού (Εικόνα 3.22), στις δυο συζεύξεις το 87,5% επέλεξε δυο διαφορετικούς συντρόφους, ενώ το 12,5% τις πραγματοποίησε με έναν. Στις τρεις συζεύξεις, το 83,3% επέλεξε τρεις συντρόφους, ενώ το 16,7% επέλεξε δυο. Τέλος, στις τέσσερις συζεύξεις όλα τα άτομα επέλεξαν ίσο αριθμό συντρόφων, ενώ στις πέντε συζεύξεις, το 100% των ατόμων ζευγάρωσε με τρεις διαφορετικούς συντρόφους (Εικόνα 3.22). Ο λόγος NP/NM για τον πληθυσμό αυτό είναι 0,94±0,16. Παρόμοια εικόνα έδωσε ο πληθυσμός από την Αγία Μαρίνα (Εικόνα 3.23), όπου στις δυο συζεύξεις το 90% επέλεξε δυο διαφορετικούς συντρόφους, ενώ το 10% τις πραγματοποίησε με έναν. Στις τρεις συζεύξεις, το 60% επέλεξε τρεις συντρόφους, ενώ το 40% επέλεξε δυο. Τέλος, στις τέσσερις συζεύξεις όλα τα άτομα επέλεξαν τρεις συντρόφους, ενώ στις πέντε συζεύξεις, το 100% των ατόμων ζευγάρωσε με τέσσερις διαφορετικούς συντρόφους (Εικόνα 3.23). Ο λόγος NP/NM για τον πληθυσμό αυτό είναι 0,96±0,13. Ο πληθυσμός της Πόμπιας, από ένα ξηρό ενδιαίτημα στα νότια του Ηρακλείου, παρουσίασε την εξής εικόνα: στις δυο συζεύξεις το 88,5% επέλεξε δυο διαφορετικούς συντρόφους, ενώ το 11,5% τις πραγματοποίησε με έναν. Στις τρεις συζεύξεις, το 70,6% επέλεξε τρεις συντρόφους, ενώ το 29,4% επέλεξε δυο. Στις τέσσερις συζεύξεις το 66,7% επέλεξε τρεις συντρόφους, ενώ το 33.3% τέσσερεις. Τέλος, το 100% των ατόμων που ζευγάρωσε πέντε φορές επέλεξε πέντε διαφορετικούς συντρόφους (Εικόνα 3.23). Ο λόγος NP/NM για τον πληθυσμό αυτό είναι 0,93±0,15. 87

97 Αποτελέσματα Εικόνα 3.22 Ποσοστό των ατόμων που ζευγάρωσαν με διαφορετικούς συντρόφους (NP) ανάλογα με τον αριθμό των συζεύξεων, στους τρεις πληθυσμούς από το βόρειο Ηράκλειο. Figure 3.22 Percentage of snails mating with different partners (NP-Number of Partners), in relation to the number of matings, in three populations of North Heraklion. 88

98 Αποτελέσματα Εικόνα 3.23 Ποσοστό των ατόμων που ζευγάρωσαν με διαφορετικούς συντρόφους (NP) ανάλογα με τον αριθμό των συζεύξεων, στους δυο πληθυσμούς από το νότιο Ηράκλειο. Figure 3.23 Percentage of snails mating with different partners (NP-Number of Partners), in relation to the number of matings, in two populations of South Heraklion. Στα Χανιά, ο πληθυσμός από τη Σούδα, που πραγματοποίησε ως και επτά ζευγαρώματα, είχε επίσης υψηλές τιμές στο λόγο NP/NM=0,92±0,13 και έδειξε παρόμοια εικόνα με αυτόν από τις Αρχάνες. Συγκεκριμένα, στις δυο συζεύξεις το 100% επέλεξε δυο διαφορετικούς συντρόφους, καθώς επίσης και στις τρεις συζεύξεις το 100% επέλεξε τρεις συντρόφους. Στις τέσσερις συζεύξεις το 75% επέλεξε τέσσερεις συντρόφους, ενώ το 25% τρείς. Στις πέντε συζεύξεις, το 45,5% ζευγάρωσε με πέντε διαφορετικούς συντρόφους, το 36,4% με τέσσερις, ενώ το 18,2% με τρεις. Όσο αυξάνεται ο αριθμός των συζεύξεων τα ποσοστά στο μέγιστο αριθμό συντρόφων σταδιακά αλλάζουν. Έτσι, στις έξι συζεύξεις το 33.3% επιλέγει πέντε συντρόφους, ενώ το 66,7% επιλέγει τέσσερις. Τέλος, στο σύνολο των ατόμων που πραγματοποίησαν επτά συζεύξεις, το 50% ήταν με έξι διαφορετικούς συντρόφους, και το άλλο 50% με τέσσερις (Εικόνα 3.24). 89

99 Αποτελέσματα Ως προς τον πληθυσμό από το Συρίλι των Χανίων (Εικόνα 3.24), στις δυο συζεύξεις το 100% επέλεξε δυο διαφορετικούς συντρόφους, όπως ακριβώς και ο πληθυσμός από τη Σούδα. Στις τρεις συζεύξεις το 62,5% επέλεξε τρεις συντρόφους και το υπόλοιπο 37,5% επέλεξε δυο. Στις τέσσερις συζεύξεις το 42,9% επέλεξε τέσσερεις συντρόφους, το 50% τρείς ενώ ένα 7,1% επέλεξε δυο διαφορετικούς συντρόφους. Στις πέντε συζεύξεις, το 26,7% ζευγάρωσε με πέντε διαφορετικούς συντρόφους, το 26,7% με τέσσερις, το 40% με τρεις, ενώ το 6,7% ζευγάρωσε με δυο διαφορετικούς συντρόφους. Τέλος, στις έξι συζεύξεις το 75% επιλέγει τέσσερις συντρόφους, ενώ το 25% επιλέγει τρεις (Εικόνα 3.24). Ο λόγος NP/NM για τον πληθυσμό αυτό είναι 0,82±0,18. Σε ό,τι αφορά τους πληθυσμούς από το Λασίθι (Ρούσα, Μαρώνια και Σητεία), όλοι πραγματοποίησαν ως και έξι συζεύξεις κατά τη διάρκεια μιας αναπαραγωγικής περιόδου (Εικόνα 3.25). Ως προς την επιλογή διαφορετικών συντρόφων στις συζεύξεις αυτές, ο πληθυσμός της Ρούσας παρουσίασε την εξής εικόνα: στις δυο συζεύξεις το 81,8% επέλεξε δυο διαφορετικούς συντρόφους, ενώ το 18,2% έναν. Στις τρεις συζεύξεις το 50% επέλεξε τρεις συντρόφους το 37,5% επέλεξε δυο και ένα 12,5% ζευγάρωσε και τις τρεις φορές με το ίδιο άτομο. Στις τέσσερις συζεύξεις το 28,6% επέλεξε τέσσερις συντρόφους, το 57,1% τρείς ενώ το 14,3% επέλεξε δυο διαφορετικούς συντρόφους. Στις πέντε συζεύξεις και στις έξι συζεύξεις όλα τα άτομα ζευγάρωσαν με τέσσερις διαφορετικούς συντρόφους (Εικόνα 3.25). Ο λόγος NP/NM για τον πληθυσμό αυτό είναι 0,85±0,19. Στον πληθυσμό από τα Μαρώνια η εικόνα ήταν διαφορετική σε σχέση με τον πληθυσμό της Ρούσας από την ίδια περιοχή του Λασιθίου (Εικόνα 3.25). Συγκεκριμένα, στις δυο συζεύξεις το 66,7% επέλεξε δυο διαφορετικούς συντρόφους, ενώ το 33,3% έναν. Στις τρεις συζεύξεις το 64,7% επέλεξε τρεις συντρόφους, ενώ το 35,3% επέλεξε δυο. Στις τέσσερις συζεύξεις το 60% επέλεξε τέσσερις συντρόφους, το 30% τρείς ενώ το 10% επέλεξε δυο διαφορετικούς συντρόφους. Στις πέντε συζεύξεις το μεγαλύτερο ποσοστό των ατόμων (42,9%) ζευγάρωσε με τρεις διαφορετικούς συντρόφους, ενώ το 28,6% επέλεξε τέσσερις συντρόφους, και το 28,6% τρεις. Τέλος, είναι αξιοσημείωτο στον πληθυσμό αυτό ότι στις έξι συζεύξεις, το μεγαλύτερο ποσοστό των ατόμων επέλεξε ισάριθμους διαφορετικούς συντρόφους, και το 33,3% ζευγάρωσε με τέσσερεις διαφορετικούς συντρόφους (Εικόνα 3.25). Ο λόγος NP/NM για τον πληθυσμό αυτό είναι 0,90±0,24. Ο πληθυσμός από τη Σητεία παρουσίασε την εξής εικόνα (Εικόνα 3.25): όλα τα άτομα που ζευγάρωσαν δυο φορές επέλεξαν δυο διαφορετικούς συντρόφους. Στις τρεις συζεύξεις το 61,5% επέλεξε τρεις συντρόφους, ενώ το 23,1% επέλεξε δυο, ενώ το 15,4% πραγματοποίησε και τα τρία ζευγαρώματα με το ίδιο άτομο. Στις τέσσερις συζεύξεις τα ποσοστά ήταν ισάριθμα κατανεμημένα, δηλαδή το 33,3% επέλεξε τέσσερις συντρόφους, το 33,3% τρείς και το 33,3% επέλεξε δυο διαφορετικούς συντρόφους. Στις πέντε συζεύξεις τα μισά άτομα (50%) ζευγάρωσαν με τρεις διαφορετικούς 90

100 Αποτελέσματα συντρόφους, ενώ τα άλλα μισά με πέντε. Τέλος, όλα τα άτομα που πραγματοποίησαν έξι συζεύξεις επέλεξαν τέσσερις διαφορετικούς συντρόφους (Εικόνα 3.25). Ο λόγος NP/NM για τον πληθυσμό αυτό είναι 0,88±0,21. Εικόνα 3.24 Ποσοστό των ατόμων που ζευγάρωσαν με διαφορετικούς συντρόφους (NP) ανάλογα με τον αριθμό των συζεύξεων, στους δυο πληθυσμούς από τα Χανιά. Figure 3.24 Percentage of snails mating with different partners (NP-Number of Partners), in relation to the number of matings, in two populations of Chania. Τέλος, σε ό,τι αφορά τον πληθυσμό από την Ηγουμενίτσα, το 94,2% των ατόμων με δυο συζεύξεις επέλεξε ισάριθμους διαφορετικούς συντρόφους, ενώ το 5,6% πραγματοποίησε τις συζεύξεις αυτές με το ίδιο άτομο. Στις τρεις συζεύξεις το 80% επέλεξε δυο διαφορετικούς συντρόφους, ενώ μόλις το 20% επέλεξε τρεις. Τέλος, στις τέσσερις συζεύξεις όλα τα άτομα του πληθυσμού ζευγάρωσαν με τρεις διαφορετικούς συντρόφους. Ο λόγος NP/NM για τον πληθυσμό αυτό είναι 0,95±0,11. 91

101 Αποτελέσματα Εικόνα 3.25 Ποσοστό των ατόμων που ζευγάρωσαν με διαφορετικούς συντρόφους (NP) ανάλογα με τον αριθμό των συζεύξεων, στους τρείς πληθυσμούς από το Λασίθι. Figure 3.25 Percentage of snails mating with different partners (NP-Number of Partners), in relation to the number of matings, in three populations of Lasithi. 92

102 Αποτελέσματα Εικόνα 3.26 Ποσοστό των ατόμων που ζευγάρωσαν με διαφορετικούς συντρόφους (NP) ανάλογα με τον αριθμό των συζεύξεων, στον πληθυσμό της Ηγουμενίτσας. Figure 3.26 Percentage of snails mating with different partners (NP-Number of Partners), in relation to the number of matings, in Igoumenitsa. Οι πληθυσμοί διέφεραν στατιστικά σημαντικά ως προς το λόγο NP/NM (ANOVA σε arcsine τροποποιημένα δεδομένα: F=6,915, p=0,000, d.f.=10) (Εικόνα 3.27Α), αλλά και ως προς τον αριθμό των διαφορετικών συντρόφων (ANOVA: F=22,009, p=0,000, d.f.=10) (Εικόνα 3.27Β). Φαίνεται λοιπόν, ότι στους πληθυσμούς από το Ηράκλειο ο λόγος του αριθμού διαφορετικών συντρόφων προς τον αριθμό των συζεύξεων ήταν πάνω από 0,90, όπως και σε εκείνον από την Ηγουμενίτσα (Εικόνα 3.27Α). Σε απόλυτη τιμή όμως, ο αριθμός των διαφορετικών συντρόφων ήταν κατά μέσο όρο μεγαλύτερος στους δυο πληθυσμούς από τα Χανιά (Εικόνα 3.27Β). 93

103 Αποτελέσματα Εικόνα 3.27 Α) Αριθμός συντρόφων προς τον αριθμό των συζεύξεων (ΝΜ/ΝΡ) Β) Αριθμός των διαφορετικών συντρόφων (Πληθυσμοί: 1=Αρχάνες, 2=Αλμυρός, 3=Αγία Μαρίνα, 4=Πόμπια, 8=Γούβες, 9=Σούδα, 10=Συρίλι, 11=Ρούσα, 12=Μαρώνια, 13=Σητεία, και 14=Ηγουμενίτσα). Οι κύκλοι αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο και οι μπάρες το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Figure 3.27 Α) Number of partners/number of matings (NP/NM), B) Number of different partners (population 1=Arxanes, 2=Almyros, 3=Agia Marina, 4=Pompia, 8=Gouves, 9=Souda, 10= Syrili, 11=Rousa, 12=Maronia, 13=Siteia, and 14=Igoumenitsa. Circles represent the mean and bars the standard error of the mean. 94

104 Αποτελέσματα Σπερματικός ανταγωνισμός και δομή του αναπαραγωγικού συστήματος Η ανατομία του αναπαραγωγικού συστήματος έγινε σε ένα δείγμα από τρεις πληθυσμούς και, συγκεκριμένα, από τα Μαρώνια, τη Σούδα και την Ηγουμενίτσα. Η επιλογή των πληθυσμών έγινε με βάση τις διαφορές στις μικροκλιματικές συνθήκες των ενδιαιτημάτων από τα οποία προέρχονταν. Συγκεκριμένα, ο πληθυσμός της Ηπείρου με περισσότερη ετήσια βροχόπτωση σε σύγκριση με την Κρήτη ήταν η πρώτη επιλογή. Στη συνέχεια στο σύνολο των πληθυσμών από την Κρήτη, η Σούδα βρίσκεται στο δυτικό μέρος του νησιού όπου η μέση ετήσια βροχόπτωση είναι μεγαλύτερη σε σύγκριση με το ανατολικότερο άκρο της Κρήτης, όπου λήφθηκε ο πληθυσμός από τα Μαρώνια. Οι πληθυσμοί δεν διέφεραν ως προς το μέγεθος των ζώων που μετράται από το ύψος (ANOVA: F=1,487, p=0,240, d.f.=2) και τη διάμετρο του κελύφους (ANOVA: F=1,487, p=0,240, d.f.=2). Η δράση του σπερματικού ανταγωνισμού είναι πιθανόν να εξαρτάται από μορφολογικά/ανατομικά χαρακτηριστικά του αναπαραγωγικού συστήματος. Για το λόγο αυτό προσδιορίστηκε η μορφομετρία του αναπαραγωγικού συστήματος όχι μόνο των τμημάτων του αναπαραγωγικού συστήματος που επιτελούν την αρσενική λειτουργία, δηλαδή ο επίφαλλος (EP-epiphallus), το μαστίγιο (FL-flagellum) και το πέος (PEN-Penis) που σχηματίζουν και μεταφέρουν το σπερματοφόρο (Εικόνα 2.17), αλλά και η σπερματοκύστη (BUR-bursa copulatrix tract) το κοινό στέλεχος της σπερματοκύστης (CBUR-common part of the bursa tract) και ο βοηθητικός αγωγός της σπερματοκύστης (DIV-diverticulum) που αφορούν στο θηλυκό ρόλο, δηλαδή την υποδοχή και υδρόλυση του σπερματοφόρου (Εικόνα 2.17). Ως προς τα τμήματα του αναπαραγωγικού συστήματος που αφορούν στον αρσενικό ρόλο των σαλιγκαριών παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των πληθυσμών ως προς το μαστίγιο (ANOVA: F=4,318, p=0,021, d.f.=2) που σχηματίζει την ουρά του σπερματοφόρου, καθώς και ως προς το άθροισμα του μαστιγίου με τον επίφαλλο (ANOVA: F=3,850, p=0,030, d.f.=2) που σχηματίζουν την ουρά και το σώμα του σπερματοφόρου, αντίστοιχα (Πίνακας 3.6). Συγκεκριμένα, το μικρότερο μαστίγιο είχε κατά μέσο όρο ο πληθυσμός από την Ηγουμενίτσα (52,87 ± 7,37), ενώ οι δυο πληθυσμοί από την Κρήτη δεν διέφεραν μεταξύ τους, καθώς στη Σούδα το μήκος του μαστιγίου ήταν κατά μέσο όρο 65,22 ± 18,73, και στα Μαρώνια 74,96 ± 12,08 (Πίνακας 3.6). Ομοίως, ο πληθυσμός από την Ηγουμενίτσα είχε κατά μέσο όρο το μικρότερο άθροισμα μαστιγίου και επίφαλλου (70,83 ± 8,56), ενώ οι δυο πληθυσμοί από την Κρήτη δεν διέφεραν μεταξύ τους καθώς στη Σούδα ο μέσος όρος ήταν 81,89 ± 18,50, και στα Μαρώνια 88,94 ± 14,62 (Πίνακας 3.5). Σε ό,τι αφορά τα όργανα αναπαραγωγής του θηλυκού ρόλου των σαλιγκαριών παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά ως προς τη σπερματοκύστη που υποδέχεται και υδρολύει το σπερματοφόρο. Συγκεκριμένα, οι πληθυσμοί διέφεραν ως προς: α) το βοηθητικό αγωγό της σπερματοκύστης (ANOVA: F=9,375, p=0,001, d.f.=2), με τον πληθυσμό της 95

105 Αποτελέσματα Σούδας να διαφέρει στατιστικά σημαντικά από τους άλλους δυο, β) το κοινό στέλεχος της σπερματοκύστης (ANOVA: F=3,680, p=0,035, d.f.=2), όπου η Ηγουμενίτσα διέφερε μόνο από τον πληθυσμό από τα Μαρώνια, γ) την κεφαλή της σπερματοκύστης (ANOVA: F=12,019, p=0,000, d.f.=2) όπου όλοι οι πληθυσμοί διέφεραν μεταξύ τους, και, δ) ως προς το άθροισμα των δομών που υποδέχονται το σπερματοφόρο, δηλαδή το άθροισμα του βοηθητικού αγωγού και του κοινού στελέχους της σπερματοκύστης (ANOVA: F=5,755, p=0,007, d.f.=2) (Πίνακας 3.5), με τον πληθυσμό της Σούδας να έχει μεγαλύτερο μήκος από τους άλλους δυο. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι συντελεστές ποικιλότητας, που υπολογίστηκαν ως ο λόγος της τυπικής απόκλισης προς το μέσο όρο, είναι μικροί στα χαρακτηριστικά που αφορούν στη μορφομετρία του κελύφους. Αντιθέτως, τόσο τα αναπαραγωγικά όργανα του θηλυκού ρόλου των σαλιγκαριών, όσο και του αρσενικού ρόλου, χαρακτηρίζονται από μεγάλη ποικιλότητα (Πίνακας 3.5). Τόσο το μήκος του μαστιγίου που σχηματίζει την ουρά του σπερματοφόρου, όσο και το άθροισμα των δομών που σχηματίζουν ολόκληρο το σπερματοφόρο, δηλαδή του άθροισμα του μαστιγίου με τον επίφαλλο, που σχηματίζουν την ουρά και το σώμα του σπερματοφόρου, αντίστοιχα, φαίνεται να συσχετίζονται θετικά με τη μέση διάρκεια της σύζευξης (Εικόνα 3.28). Συγκεκριμένα, η μέση διάρκεια σύζευξης παρουσιάζει θετική συσχέτιση με το μήκος του μαστιγίου (r=0,335, p=0,046, n=36) (Εικόνα 3.28Α), καθώς και με το άθροισμα του μήκους του μαστιγίου με το μήκος του επίφαλλου (r=0,380, p=0,022, n=36) (Εικόνα 3.28Β). Επιπλέον, άλλο ένα χαρακτηριστικό της αναπαραγωγικής συμπεριφοράς, ο αριθμός των συζεύξεων φαίνεται να συσχετίζεται ισχυρά με στοιχεία του αναπαραγωγικού συστήματος. Συγκεκριμένα, ο αριθμός των συζεύξεων που πραγματοποίησαν τα σαλιγκάρια παρουσιάζει ισχυρή θετική συσχέτιση με το μήκος του βοηθητικού αγωγού της σπερματοκύστης που υποδέχεται το σπερματοφόρο (r=0,559, p=0,000, n=36) (Εικόνα 3.29Α), καθώς και με το άθροισμα των δομών που υποδέχονται το σπερματοφόρο, δηλαδή το άθροισμα του βοηθητικού αγωγού και του κοινού στελέχους της σπερματοκύστης (r=0,456, p=0,005, n=36) (Εικόνα 3.29Β). Επίσης, οι δομές αυτές που αντανακλούν το θηλυκό ρόλο των σαλιγκαριών, παρουσιάζουν θετική συσχέτιση με τη μέση διάρκεια σύζευξης (r=0,335, p=0,046, n=36) (Εικόνα 3.30). Όπως φαίνεται στην εικόνα 3.30Α, η μέση διάρκεια σύζευξης παρουσιάζει ισχυρή θετική συσχέτιση (r=0,509, p=0,002, n=36) με το μήκος του βοηθητικού αγωγού της σπερματοκύστης, και με το άθροισμα του βοηθητικού αγωγού και του κοινού στελέχους της σπερματοκύστης (r=0,384, p=0,021, n=36) (Εικόνα 3.30Β). 96

106 Αποτελέσματα Πίνακας 3.5 Μέσοι όροι και τυπικές αποκλίσεις (συντελεστές ποικιλότητας) της μορφομετρίας του κελύφους, και των οργάνων αναπαραγωγής του θηλυκού και του αρσενικού ρόλου Table 3.5 Mean and standard deviation (coefficient of variance) of shell morphometry, and female and male reproductive organs Σούδα (n=15) Μαρώνια (n=12) Ηγουμενίτσα (n=13) Μορφομετρία κελύφους Διάμετρος (mm) 32,03 ± 2,15 (6,71) 32,93 ± 1,57 (4,76) 33,21 ± 1,94 (5,84) Ύψος (mm) 30,00 ± 1,69 (5,63) 30,41 ± 1,78 (5,85) 30,47 ± 1,81 (5,94) Όργανα αναπαραγωγής αρσενικού ρόλου Μαστίγιο (mm) 65,22 ± 18,73 (28,71) 74,96 ± 12,08 (16,12) 52,87 ± 7,37 (13,94) Μαστίγιο + Επίφαλλος (mm) 81,89 ± 18,50 (22,59) 88,94 ± 14,62 (16,44) 70,83 ± 8,56 (12,08) Όργανα αναπαραγωγής θηλυκού ρόλου Βοηθητικός αγωγός σπερματοκύστης (mm) 53,98 ± 12,22 (22,64) 43,60 ± 8,89 (20,39) 37,72 ± 6,42 (17,02) Κοινό στέλεχος σπερματοκύστης (mm) 11,09 ± 2,96 (26,69) 9,90 ± 2,07 (20,91) 12,97 ± 2,84 (21,89) Βοηθητικός αγωγός+ Κοινό στέλεχος σπερματοκύστης 65,07 ± 14,35 (22,05) 53,51 ± 9,15 (17,09) 50,71 ± 7,86 (15,49) (mm) Κεφαλή σπερματοκύστης (mm) 4,81 ± 0,99 (20,58) 3,05 ± 0,50 (16,39) 5,87 ± 2,45 (41,74) 97

107 Αποτελέσματα Εικόνα 3.28 Συσχέτιση (Pearson Correlation) μεταξύ διάρκειας συζεύξεων και (A) μήκος του μαστιγίου (r=0,335, p=0,046, n=36), και (B) αθροίσματος μήκους του μαστιγίου και επίφαλλου (r=0,380, p=0,022, n=36). Figure 3.28 Pearson correlation of mating duration with (A) flagellum length (r=0,335, p=0,046, n=36) and (B) sum of flagellum and epiphallus length (r=0,380, p=0,022, n=36). 98

108 Αποτελέσματα Εικόνα 3.29 Συσχέτιση (Pearson Correlation) μεταξύ του αριθμού συζεύξεων και (A) μήκος του βοηθητικού αγωγού της σπερματοκύστης (r=0,559, p=0,000, n=36), και (B) αθροίσματος μήκους του βοηθητικού αγωγού και του στελέχους της σπερματοκύστης (r=0,456, p=0,005, n=36). Figure 3.29 Pearson correlation of number of matings with (A) diverticulum length (r=0,559, p=0,000, n=36) and (B) sum of diverticulum and common part of bursa stalk length (r=0,456, p=0,005, n=36). 99

109 Αποτελέσματα Εικόνα 3.30 Συσχέτιση (Pearson Correlation) μεταξύ της διάρκειας συζεύξεων και (A) μήκος του βοηθητικού αγωγού της σπερματοκύστης (r=0,509, p=0,002, n=36), και (B) αθροίσματος μήκους του βοηθητικού αγωγού και του στελέχους της σπερματοκύστης (r=0,384, p=0,021, n=36). Figure 3.30 Pearson correlation of mating duration with (A) diverticulum length (r=0,509, p=0,002, n=36) and (B) sum of diverticulum and common part of bursa stalk length (r=0,384, p=0,021, n=36). 100

110 Αποτελέσματα Σε ό,τι αφορά την πολυπλοκότητα της σπερματοθήκης, αυτή αντανακλάται στον αριθμό και το μήκος των τυφλών σωληναρίων που τη συγκροτούν, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των πληθυσμών που μελετήθηκαν (Πίνακας 3.6). Όλοι οι πληθυσμοί είχαν κατά μέσο όρο έξι τυφλά σωληνάρια με συνολικό μήκος γύρω στα πέντε χιλιοστά, καθώς το κύριο σωληνάριο είχε μήκος στο ενάμισι χιλιοστό και τα πλάγια σωληνάρια τριάμισι. (Πίνακας 3.6). Ο αριθμός των τυφλών σωληναρίων παρουσίασε θετική συσχέτιση με το μήκος του κύριου σωληναρίου (r=0,332, p=0,048, n=36), των πλάγιων σωληναρίων (r=0,879, p=0,000, n=36) και του αθροίσματος των μηκών του κυρίου και πλάγιων σωληναρίων (r=0,817, p=0,000, n=36). Το κύριο σωληνάριο παρουσίασε θετική συσχέτιση και με τα πλάγια σωληνάρια (r=0,535, p=0,001, n=36) και με το συνολικό μήκος κύριου και πλάγιων σωληναρίων της σπερματοθήκης (r=0,721, p=0,000, n=36) (Εικόνα 3.31). Παράλληλα, το μήκος του κύριου σωληναρίου φαίνεται να συσχετίζεται θετικά και με όλες τις δομές του θηλυκού ρόλου του αναπαραγωγικού συστήματος που υποδέχονται και υδρολύουν το σπερματοφόρο, δηλαδή τη σπερματοκύστη (r=0,362, p=0,030, n=36), το βοηθητικό αγωγό της σπερματοκύστης (r=0,340, p=0,043, n=36), του κοινού στελέχους της σπερματοκύστης (r=0,349, p=0,037, n=36) και, επομένως, των αθροισμάτων κοινού στελέχους και σπερματοκύστης (r=0,433, p=0,008, n=36) καθώς και κοινού στελέχους συν του βοηθητικού αγωγού της σπερματοκύστης (r=0,399, p=0,016, n=36) (Εικόνα 3.32). 101

111 Αποτελέσματα Πίνακας 3.6 Συγκριτική μελέτη των μορφομετρικών χαρακτηριστικών του κελύφους και της δομής της σπερματοθήκης ανάμεσα σε τρεις πληθυσμούς (Σούδα, Μαρώνια και Ηγουμενίτσα). Από την ανάλυση διακύμανσης ( ANOVA) σε λογαριθμισμένα δεδομένα δεν προέκυψαν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p>0,05, d.f.=2) Table 3.6 Shell morphometry traits and spermatheca structure in three populations (Souda, Maronia, Igoumenitsa). Analysis of variance (ANOVA) in log-transformed variables did not reveal any statistically significant difference (p>0,05, d.f.=2) Πληθυσμός Μορφομετρία κελύφους Τυφλά σωληνάρια σπερματοθήκης (mm) Μεγάλη διάμετρος ΣΟΥΔΑ 31,60 (±2,00) ΜΑΡΩΝΙΑ 32,71 (±1,47) ΗΓΟΥΜΕΝΙΤΣΑ 33,21 (±1,94) Anova (F, p) 1,487 P>0,05 Μικρή διάμετρος 29,68 (±1,70) 30,25 (±1,80) 30,47 (±1,81) 0,287 P>0,05 Μέσος όρος (±τυπική απόκλιση) Ελάχιστο- Μέγιστο Κύριο σωληνάριο (mm) Πλάγια σωληνάρια (mm) Συνολικό μήκος σωληναρίων (mm) 6,25 (±2,70) ,62 (±0,58) 3,32 (±2,03) 4,95 (±2,40) 6,80 (±1,99) ,44 (±0,54) 3,36 (±1,88) 4,80 (±2,26) 6,15 (±1,86) ,53 (±0,60) 3,56 (±1,65) 5,10 (±1,99) 2,871 p=0,069 0,201 p=0,819 0,581 p=0,565 0,138 p=0,

112 Αποτελέσματα Εικόνα 3.31 Συσχέτιση (Pearson Correlation) μεταξύ των δομών της σπερματοθήκης (αριθμός τυφλών σωληναρίων, μήκος κύριου σωληναρίου, μήκος πλάγιων σωληναρίων και συνολικό άθροισμα του μήκους των σωληναρίων). Figure 3.31 Pearson correlation of spermatheca structures (number of tubules, main tubule length, lateral tubule length, and total tubule length). 103