ÇÁÅÌÁ/Áßìá The Journal of the Hellenic Society of Haematology

Transcript

1 ÇÁÅÌÁ/Áßìá The Journal of the Hellenic Society of Haematology ISSN National Library of Medicin LCCN OCLC Το παρόν τεύχος επιμελήθηκε ο καθηγητής κ. Δημήτρης Λουκόπουλος Υπεύθυνοι σύνταξης το Διοικητικό Συμβούλιο της Ελληνικής Αιματολογικής Εταιρείας Éäéïêôhôçó: Åëëçíéêç Áéìáôïëïãéêç Åôáéñåéá, Κηφισίας 27, Αθήνα ΕΚΔΟΤΗΣ - ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ ΣΥΝΤΑΞΗΣ: το Διοικητικο Συμβουλιο της Ελληνικης Αιματολογικης Εταιρειας, Κηφισίας 27, Αθήνα Ôηλ./Fax: , infohaema@eae.gr ÅÊÔÕÐÙÓÇ: Ôåxíïãñáììá, Ì. ÁõãÝñç 12, Áã. ÐáñáóêåõÞ, ôçë

2 Owner: Scope: Publishing office and advertising: Production: Hellenic Society of Haematology HAEMA (Αίμα), the Journal of the Hellenic Society of Haematology, is an international journal publishing original papers, reviews, case reports, short papers and letters to the Editor in the field of Haematology. EPSILON, 4 Papadiamantopoulou Str., , Athens, Tel , FAX , epsilonb@hol.gr technogramma: 12 M. Avgeri Str., Agia Paraskevi, Tel , FAX , techn@hol.gr INFORMATION FOR CONTRIBUTORS Submission of manuscripts Manuscripts should be sent to HAEMA Journal, Kifisias str. 27, P.C Athens, Greece, tel: , fax: , infohaema@eae.gr All manuscripts must be submitted in triplicate, including three complete sets of figures and tables, typewritten or printed, double-spaced with margins of at least 1.5 cm. Receipt of manuscript will be acknowledged with a letter indicating the manuscript number, which will be used for any future communication concerning the manuscript. All manuscripts will be reviewed by the Editor, the Associate Editors, members of the Editorial Review Board or other expert reviewers. Acceptance of papers will be decided in meetings of the restricted Editorial Board (Editors and Associate Editors) and authors will be notified by letter of the decision to accept, revise or reject the manuscript. Rejected papers will be returned to the authors. All material in HAEMA represents the opinions of the authors and does not reflect the opinions of the Hellenic Society of Haematology. Authors submitting manuscripts do so with the understanding that if accepted, copyright of the article shall be assigned exclusively to the Hellenic Society of Haematology and authors will be requested to sign a copyright release form. ONLINE MANUSCRIPT SUBMISSION PROCESS This facilitates the reviewing and Editorial process of manuscripts. Organization of the manuscript and instructions for authors are the same as described above. Manuscripts can be submitted on line via to: Journal HAEMA, infohaema@eae.gr Please send the whole document transforming this as a *.doc file before submission. The supported extensions, fonts and other formats are the follows: Supported formats:.doc (MS Office for Windows) Supported fonts: Arial, Times, Helvetica, Times New Roman, and Courier Supported images: JPEG (*.jpg, *.jpeg, *.jpe), CompuServe GIF (*.gif), TIFF (*.tif, *.tiff), BMP (*.bmp), Photoshop (*.psd, *.pdd) 11

3 ÇÁÅÌÁ/Áßìá The Journal of the Hellenic Society of Haematology CONTENTS / ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Editorial Μήνυμα του Διοικητικού Συμβουλίου της Ελληνικής Αιματολογικής Εταιρείας...16 Ανασκοπήσεις Η αξία της κυτταρομετρικής μελέτης του ανοσοφαινότυπου του μυελού των οστών και του περιφερικού αίματος στη διαχείριση αιματολογικών νοσημάτων...17 Νικόλαος Τσαγκαράκης, Γεώργιος Πατεράκης Τα Φυσικά Κυτταροκτόνα Τ-λεμφοκύτταρα (ΝΚΤ) στην αιμοποίηση και στις αιματολογικές κακοήθειες...36 Εμμανουήλ Σπανουδάκης, Ιωάννης Κοτσιανίδης, Αναστάσιος Καραδημήτρης Ανοσολογικής αρχής σύνδρομα υποπλασίας μυελού: Μοριακή παθογένεια και ειδική θεραπεία...44 Αργύρης Συμεωνίδης Σύντομες Ανασκοπήσεις Υποπλαστικά μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα: Από την παθολογική φυσιολογία στη θεραπεία...56 Σταυρούλα Γιαννούλη, Issa J. Dahabreh, Μιχάλης Βουλγαρέλης Κυτταρογενετική ανάλυση χρόνιων λεμφοϋπερπλαστικών συνδρόμων: Δυνατότητες - Περιορισμοί...60 Αναστασία Αθανασιάδου Reviews Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells: Characteristics and therapeutic applications...64 Charalambos Pontikoglou, Helen A. Papadaki Iron chelation in the myelodysplastic syndromes...75 Dimitris Loukopoulos Original Articles Comparative Study Between Conventional Cytogenetic Analysis and Fluorescence In Situ Hybridization for Detection TEL/AML fusion gene among Pediatric Acute Lymphoblastic Leukemia...86 Hoda M. El Gendi, Essmat Abd El Ghaffar, Dina A. Fouad, Azza Ahmed Aly, Rasha Tareef Hamza Measurement of Intraerythrocytic ph by a Noninvasive Fluorometric Method...97 Kostantinos Dukas, Constantine-George Balotis, Theodore Tegos, Panagiotis Karmas, Constantinos Tegos Case Reports Penile Plasmacytoma as a cause of macroscopic hematuria treated by autologous stem cell transplantation Seckin Cagirgan, Filiz Vural, Mustafa Pehlivan, Ayhan Donmez, Murat Tombuloglu Life-threatening intracranial bleeding in a newborn with hemophilia b Basak Yilmaz Taburoglu, Aylin Tarcan, Deniz Anuk, Bulent Alioglu, Berkan Gurakan, Namik Ozbek Periodic Hypereosinophilia and Angioedema (Gleich Syndrome) in an infant Ozlem Yilmaz Ozbek, Alev Conkbayir, Namik Ozbek Flashes Flashes in clinical haematology Nικόλαος Λαουτάρης, Αικατερίνη Παράση, Ευαγγελία Καλαγιάκου Flashes in clinical haematology Dimitrios Maltezas, Xenofon Papanicolaou, Aikaterini Katafygiotou-Lima, Paraskevi Manitarou, Vasilios Chatziantoniou, Panagiotis Repousis, Chrysanthi Mitsouli-Mentzikof 13

4 Copyright Hellenic Society of Haematology HAEMA (Αίμα) ΙSSN: Haema 2008; 11(1-2): 16 Μήνυμα του Διοικητικού Συμβουλίου της Ελληνικής Αιματολογικής Εταιρείας Αγαπητοί συνάδελφοι, Το ΔΣ της ΕΑΕ είχε δεσμευθεί ότι θα γίνουν όλες οι ενέργειες για να επανακυκλοφορήσει το περιοδικό σε νέες βάσεις, εξυπηρετώντας καλύτερα τα ενδιαφέροντα των μελών της Εταιρείας. Το πρώτο τεύχος της νέας περιόδου είναι στα χέρια σας. Χωρίς να έχουν διευθετηθεί όλα τα θέματα. Δύο είναι τα βασικά προβλήματα που παραμένουν. Η εκκρεμότητα στη Συντακτική Επιτροπή και τη Διεύθυνση και η περιορισμένη ανταπόκριση των μελών της Ελληνικής Αιματολογικής Εταιρείας ως συγγραφέων. Στις νέες συνθήκες, η Συντακτική Ομάδα οφείλει να λειτουργεί συλλογικά με σαφή προσανατολισμό και σταθερές αρχές, να υπηρετεί τα καλώς εννοούμενα συμφέροντα της Εταιρείας με αλήθεια και συνέπεια. Να εμπνεύσει και να πείσει τους συναδέλφους ότι αξίζει να στηρίξουν συγγραφικά το περιοδικό. Μόνο αν συμβεί το τελευταίο, το ΑΙΜΑ θα έχει μακρύ, χρήσιμο και αξιοπρεπές μέλλον. Είναι απλό. Το θέλουμε το περιοδικό μας; Εάν ναι, αυτό σημαίνει ότι το στηρίζουμε ειλικρινά και έμπρακτα όλοι. Τα θέματα αυτά θα απασχολήσουν το νέο ΔΣ, οι λύσεις πρέπει να έλθουν γρήγορα. Πάντως, πρόβλημα χρηματοδότησης δεν υπάρχει. Το τεύχος αυτό εκδίδεται με την ευθύνη του ΔΣ της ΕΑΕ, την προσπάθεια και επιμέλεια του καθηγητή κ. Δημήτρη Λουκοπούλου και των μελών της απερχόμενης Συντακτικής Επιτροπής. Τους ευχαριστούμε, όπως ευχαριστούμε και όσους ανταποκρίθηκαν στην πρόσκληση και έστειλαν συγγραφικό έργο. Φιλικά, Για το ΔΣ της Ελληνικής Αιματολογικής Εταιρείας Ο Πρόεδρος Ο Γεν. Γραμματέας Αχ. Αναγνωστόπουλος Γ. Πατεράκης

5 Copyright Hellenic Society of Haematology HAEMA (Αίμα) ΙSSN: Haema 2008; 11(1-2): Aνασκόπηση Η αξία της κυτταρομετρικής μελέτης του ανοσοφαινότυπου του μυελού των οστών και του περιφερικού αίματος στη διαχείριση αιματολογικών νοσημάτων Νικόλαος Τσαγκαράκης, Γεώργιος Πατεράκης Εργαστήριο Κυτταρομετρίας, Ανοσολογικό Τμήμα, ΓΝΑ «Γεώργιος Γεννηματάς» ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η τεχνολογία της κυτταρομετρίας ροής (ΚΡ), από την αρχική της εμφάνιση κατά τη δεκαετία του 1980 έως σήμερα, χρησιμοποιείται ολοένα και περισσότερο στην κλινική πρακτική για τη διαχείριση νοσημάτων, κυρίως αιματολογικών. Η χρήση της ανοσοφαινοτυπικής μελέτης κυττάρων με κυτταρομετρίας ροής επεκτάθηκε από τη μελέτη των CD4 T-κυττάρων κατά την εμφάνιση του AIDS, έως τη μελέτη σήμερα πλειάδας αιματολογικών νοσημάτων, με σαφώς μεγαλύτερη ευαισθησία, ειδικότητα και ταχύτητα στην διεκπεραίωση της διάγνωσης. Η ταχεία εξέλιξη της τεχνολογίας, σε συνδυασμό με την αδυναμία των χειριστών για παράλληλη συνεχή ενημέρωση και με την εξαιρετική ποικιλομορφία στην εκδήλωση των αιματολογικών νοσημάτων, οδήγησε στην ανάγκη συμφωνίας των ειδικών (Bethesda 2006) ως προς συγκεκριμένες κλινικές ενδείξεις χρήσης της κυτταρομετρίας ροής, αλλά και ως προς συγκεκριμένες επιλογές μονοκλωνικών αντισωμάτων. Τόσο η κυτταρομετρία ροής όσο και οι τεχνικές της παραδοσιακής μορφολογίας επιχειρούν να προσδιορίσουν τη φύση ενός κυτταρικού πληθυσμού (αν είναι νεοπλασματικός), σε ποιο στάδιο ωρίμανσης βρίσκεται και τις ομοιότητές του με σαφώς περιγραφέντα αιματολογικά νεοπλάσματα. Ανάλογα με το εξεταζόμενο νόσημα, μπορεί να αποτελεί συμπληρωματική διαγνωστική τεχνική, αλλά και τη βασική εξέταση διάγνωσης. Σήμερα θεωρείται αναπόσπαστο κομμάτι της διαγνωστικής προσέγγισης οξείων μυελογενών και λεμφοβλαστικών λευχαιμιών, ώριμων Τ- και Β- νεοπλασιών, καθώς και μυελοδυσπλαστικών και μυελοϋπερπλαστικών διαταραχών. Παράλληλα, σε συνδυασμό με τις υπόλοιπες εργαστηριακές τεχνικές (μορφολογία, FISH, βιοψίες) συμβάλλει κατά περίπτωση στη σταδιοποίηση, παρακολούθηση, πρόγνωση και θεραπεία αιματολογικών νοσημάτων, με καθοριστική και πολλά υποσχόμενη προσφορά στη μελέτη της ελαχίστης υπολειμματικής νόσου. Λέξεις Κλειδιά: Κυτταρομετρία ροής, ανοσοφαινότυπος αιματολογικών νοσημάτων, ελάχιστη υπολειμματική νόσος * Αλληλογραφία: Γεώργιος Πατεράκης, genpater@gmail.com Εισαγωγικες εννοιες Η κυτταρομετρία ροής (ΚΡ) θεωρείται σήμερα απαραίτητη μέθοδος, αν όχι μέθοδος εκλογής, για τη μελέτη του ανοσο- Received: July 20, 2008; Accepted: October 20, 2008 φαινότυπου των κυττάρων του μυελού και του περιφερικού αίματος. Κατέχει πρωτεύοντα ρόλο σε πλήθος κλινικών πρακτικών εφαρμογών πολλών ειδικοτήτων, με κύρια την Αιματολογία, συμβάλλοντας στη δημιουργία νέων συστημάτων ταξινόμησης των αιματολογικών νοσημάτων και καταλαμβάνοντας καθοριστικό ρόλο στις διαδικασίες διάγνωσης, σταδι-

6 Νικόλαος Τσαγκαράκης, Γεώργιος Πατεράκης οποίησης, παρακολούθησης και πρόγνωσης, αιματολογικών και μη νοσημάτων. 1,2 Η μελέτη του ανοσοφαινότυπου με την ΚΡ γίνεται με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων (CD, cluster determinant), συνδεδεμένων με χημικές ενώσεις που έχουν την ιδιότητα του φθορισμού και λέγονται φθορίζουσες χρωστικές. Ο στόχος είναι τα αντισώματα να συνδεθούν με τα αντίστοιχα αντιγόνα στην επιφάνεια και στο εσωτερικό των κυττάρων. Κάθε αντίσωμα είναι συνδεδεμένο με φθορίζουσα χρωστική που εκπέμπει σε διαφορετικό μήκος κύματος. Κάθε κύτταρο, δεχόμενο την επίδραση διεγείρουσας φωτεινής ενέργειας (δέσμη φωτός laser καθορισμένου μήκους κύματος), εκπέμπει σήματα φθορισμού από τις διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές, τα οποία αντιστοιχούν στα μονοκλωνικά αντισώματα που είναι συνδεδεμένα σε αυτό. Με βάση το φαινόμενο του σκεδασμού (scatter), από τη διασπορά φωτονίων με διαφορετική ένταση στις διάφορες γωνίες του χώρου, λαμβάνουμε σήματα πρόσθιου σκεδασμού (forward scatter, FW-SC, FCS) σε συνάρτηση με το μέγεθος του κυττάρου και ορθογώνιου ή πλάγιου σκεδασμού σε συνάρτηση με τη σύσταση του κυτταροπλάσματος (κοκκίωση, δείκτης διάθλασης). Συνδυαζόμενα τα σήματα φθορισμού, από κάθε διαφορετικό αντιγόνο, και του σκεδασμού, από τα χαρακτηριστικά κάθε κυττάρου, μας παρέχουν τη δυνατότητα πολυπαραμετρικής και πολυδιάστατης ανάλυσης και πολύτιμες πληροφορίες για τον προσδιορισμό της ανοσοφαινοτυπικής ταυτότητας κάθε κυττάρου. Με τη χρήση των κατάλληλων μονοκλωνικών αντισωμάτων και σωστών στρατηγικών ανάλυσης δίνεται η δυνατότητα πλήθους ανοσοφαινοτυπικών προσδιορισμών. 1,3 Με την πρόοδο στην τεχνολογία της ΚΡ και τη διαθεσιμότητα μεγάλου εύρους μονοκλωνικών αντισωμάτων και φθοριοχρωμάτων, την τελευταία δεκαετία η ΚΡ θεωρείται πλέον απαραίτητο διαγνωστικό εργαλείο, παρέχοντας πιο ακριβείς φαινοτυπικούς προσδιορισμούς και αυξάνοντας την διακριτική της ικανότητα όσον αφορά μη φυσιολογικούς κυτταρικούς πληθυσμούς. 4 Η νέα κατάταξη των νεοπλασματικών νοσημάτων του αιμοποιητικού και λεμφικού ιστού από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (WHO) πραγματοποιήθηκε με κριτήρια μορφολογικά, ανοσοφαινοτυπικά και γονοτυπικά, που διακρίνουν με ακρίβεια γνωστές αλλά και νέες ξεχωριστές νοσολογικές οντότητες. 5 Με σκοπό την ιεράρχηση των απαραίτητων εξετάσεων που θα πρέπει να πραγματοποιούνται για την πιο έγκαιρη, έγκυρη και οικονομικότερη, σε σχέση με το αναμενόμενο αποτέλεσμα, διάγνωση και διαχείριση των αιματολογικών νεοπλασματικών νοσημάτων, μία ομάδα ειδικών κατέληξε το 2006 στην Bethesda σε συγκεκριμένες κατευθυντήριες οδηγίες χρήσης της κυτταρομετρίας ροής. 6 Οπότε και προτάθηκαν οι ακόλουθες κλινικές ενδείξεις μελέτης ανοσοφαινότυπου με ΚΡ: παγκυτταροπενία (και δι-πενία), λευκοκυττάρωση (ιδιαίτερα λεμφοκυττάρωση, μονοκυττάρωση και ηωσινοφιλία), παρουσία άτυπων κυττάρων ή βλαστών σε περιφερικό αίμα, μυελό ή άλλο σωματικό υγρό, πλασματοκυττάρωση ή άλλη μονοκλωνική γαμμαπάθεια, οργανομεγαλία και συμπαγείς όγκοι. 7 Στις παραπάνω καταστάσεις η ΚΡ θεωρήθηκε ιδιαίτερα ευαίσθητη μέθοδος ως διαγνωστικό εργαλείο και ως μέθοδος αποκλεισμού της ύπαρξης νόσου. Αντίστοιχα, αντενδείκνυται σε: κοκκιοκυτταραιμία, πολυκλωνική υπεργαμμασφαιριναιμία, πολυκυτταραιμία, θρομβοκυττάρωση και βασεοφιλία. 7 Άλλες προτεινόμενες ενδείξεις χρήσης της κυτταρομετρίας ροής ήταν η παρακολούθηση της εξέλιξης γνωστών αιματολεμφοειδών νεοπλασιών, η παρακολούθηση της ανταπόκρισης σε χορηγούμενη θεραπεία, η ανίχνευση ελαχίστης υπολειμματικής νόσου, άρα και υποτροπής, αλλά και η διάγνωση ασυνήθων αιματολογικών κακοηθειών, όπως το θεραπευτικά προκαλούμενο μυελοδυσπλαστικό σύνδρομο. Οι βασικές αρχές στρατηγικής της κυτταρομετρικής ανάλυσης ενός δείγματος, τις οποίες θα πρέπει να γνωρίζει ο εντέλων κλινικός ιατρός, βασίζονται στις εξής παραμέτρους: στο είδος του δείγματος (αίμα, μυελός κλπ), στις συνοδευτικές κλινικές πληροφορίες (ιστορικό, σημεία, συμπτώματα, υποκείμενο νόσημα, γνωστό αιματολογικό νόσημα υπό παρακολούθηση) και σε πιθανές πρόσθετες εργαστηριακές πληροφορίες (προηγηθείσα κυτταρομετρική ανάλυση, μορφολογική αξιολόγηση). Στη συνάντηση της Bethesda, υπήρξε συμφωνία στο είδος των αιμοποιητικών σειρών και στο σύνολο των αντιγόνων που θα πρέπει να ελεγχθούν σε κάθε προτεινόμενη κλινική ένδειξη. 8 Η ΚΡ, εν συνεχεία, θα προσδιορίσει την αιμοποιητική σειρά του παθολογικού πληθυσμού και το βαθμό ωρίμανσής του, θα διακρίνει παθολογικούς από φυσιολογικούς κυτταρικούς πληθυσμούς, θα μελετήσει εκτενώς φαινοτυπικά τον παθολογικό πληθυσμό και θα καταλήξει σε ορισμένες διαγνωστικές οντότητες, σε συνδυσμό με την επανεξέταση της μορφολογίας. Στην περίπτωση αμφιβολίας ή διαφοροδιαγνωστικής δυσκολίας, θα προτείνει την κατάλληλη πρόσθετη εργαστηριακή εξέταση που θα έχει τη μέγιστη διαγνωστική ή/και προγνωστική αξία (καρυότυπο, in situ υβριδισμό με φθοριοχρώματα ή FISH, ανοσοϊστοχημεία, ανοσοκυτταροχημεία, μοριακές τεχνικές). ΟΞΕΙΕΣ ΛΕΥΧΑΙΜΙΕΣ Επί του παρόντος, η κυτταρομετρία ροής αποτελεί τη μέθοδο εκλογής για τον ανοσοφαινοτυπικό χαρακτηρισμό της οξείας λευχαιμίας κατά τη διάγνωση, καθώς επίσης επιτρέπει την παρακολούθηση ανίχνευσης νόσου κατά τη διάρκεια και μετά τη θεραπεία. Στην οξεία λευχαιμία μπορεί να εμφανίζονται βλάστες ή άτυπα κύτταρα στο περιφερικό αίμα, να υπάρχει παγκυτταροπενία από τη διήθηση του μυελού, αλλά και να υπάρχουν εξωμυελικές διηθήσεις. Ο ανοσοφαινότυπος με ΚΡ μπορεί να αναγνωρίσει άωρα ή μη φυσιολογικά κύτταρα, να διακρίνει φυσιολογικά άωρα από παθολογικά άωρα κύτταρα 18

7 κυτταρομετρικh μελeτη αιματολογικων νοσηματων και να προσανατολίσει στην αιμοποιητική σειρά που πάσχει, διαχωρίζοντας μυελογενείς από λεμφοβλαστικές λευχαιμίες και βοηθώντας στην περαιτέρω κατάταξη της λευχαιμίας σε συγκεκριμένη αναγνωρισμένη νοσολογική οντότητα. Στα βλαστικά κύτταρα εμφανίζονται ανοσοφαινοτυπικοί δείκτες αωρότητας, ενώ απουσιάζουν αντιγόνα ωρίμων κυττάρων της ιδίας σειράς. Οι μυελοβλάστες εμφανίζουν δείκτες αωρότητας (CD34, CD117), ενώ δεν έχουν μυελικούς δείκτες ωριμότητας, όπως CD11b, CD15 και CD16. Τα άωρα Β-κύτταρα, αντίστοιχα, εκφράζουν CD34 και Tdt και δεν έχουν ανοσοσφαιρίνη επιφανείας και CD20, ενώ τα T-κύτταρα εάν εκφράζουν CD34, Tdt ή CD1a ή δεν έχουν CD3 επιφανείας, χαρακτηρίζονται ως άωρα Τ. Η περιοχή που λειτουργεί ως πλατφόρμα ανίχνευσης των βλαστικών πληθυσμών ορίζεται στο διάγραμμα πλάγιου σκεδασμού (side scatter, SS) σε συνδυασμό με το κοινό λευκοκυτταρικό αντιγόνο CD45, οπότε και εμφανίζονται ως χαμηλού πλάγιου σκεδασμού και ασθενούς έκφρασης CD45. Οι πληθυσμοί, βέβαια, που παρεμβαίνουν στο ονομαζόμενο βλαστικό παράθυρο είναι πολλοί, καθώς και η παρεκτόπιση του βλαστικού πληθυσμού προς κάποια κατεύθυνση (π.χ. CD45- λεμφοβλάστες σε ΟΛΛ) ποικίλλει, οπότε και απαιτείται πολυπαραμετρική στρατηγική ανάλυση καθαρισμού του βλαστικού παραθύρου και ανάλογη εμπειρία. Ασφαλώς, οι διαφορές στην ποσοτική αξιολόγηση των βλαστών μεταξύ κυτταρομετρίας και μορφολογικής εξέτασης είναι συνήθεις, λόγω ξηράς αναρρόφησης, λύσης ερυθροβλαστών (με αποτέλεσμα λάθος μετρήσεις επί των εμπύρηνων), μη αναγνώρισης των βλαστών μορφολογικά ή εκτίμησης φυσιολογικών πρόδρομων κυττάρων ως βλάστες ή καταστροφής βλαστών κατά τη λήψη του δείγματος. Η οξεία μυελογενής λευχαιμία (ΟΜΛ) συνήθως εκφράζει αντιγόνα κοκκιοκυτταρικής ή μονοκυτταρικής διαφοροποίησης, όπως CD13, CD15, CD33, CD64, CD117 και MPO. Στις οξείες λεμφοβλαστικές λευχαιμίες (ΟΛΛ), το CD19 έχει τη μεγαλύτερη ευαισθησία και ειδικότητα στη διάκριση της Β-κυτταρικής σειράς, ενώ το κυτταροπλασματικό CD3 στην ανίχνευση της T-κυτταρικής σειράς. Το κυτταροπλασματικό CD79a είναι, επίσης, ειδικό της Β-σειράς, ενώ το επιφανειακό CD22 μπορεί να εμφανιστεί και σε άλλους τύπους κυττάρων. 9,10 Η ανίχνευση μυελικών δεικτών (1 ή 2) σε λεμφοβλάστες δεν έχει προγνωστική αξία και δε θα πρέπει να οδηγεί σε διάγνωση διφαινοτυπικής λευχαιμίας, ενώ συχνή είναι η έκφραση λεμφοκυτταρικών δεικτών σε μυελοβλάστες (CD7, CD56, CD2, CD19). Από πρακτικής άποψης, η απρόσφορη έκφραση συγκεκριμένων δεικτών στα λευχαιμικά κύτταρα (leukemia associated aberrant immunophenotypes, LAIP), παρατηρείται σε όλους σχεδόν τους ασθενείς με T-οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία (>99%), σε B-λεμφοβλαστική λευχαιμία (>95%) και στις περισσότερες περιπτώσεις οξείας μυελογενούς λευχαιμίας (>85%). Οπότε, σε υποψία και επιβεβαίωση λευχαιμικών κυττάρων, η μελέτη του ανοσοφαινότυπου βοηθάει στον ακριβή χαρακτηρισμό και στην ποσοτικοποίηση. Τα τελευταία χρόνια, έντονο ήταν το ενδιαφέρον γύρω από την παρατήρηση ομοιοτήτων μεταξύ λευχαιμικών και φυσιολογικών αιμοποιητικών κυττάρων. Η πληροφορία αυτή χρησιμοποιείται για τον χαρακτηρισμό των λευχαιμικών κυττάρων ως Β- ή T-προέλευσης έναντι μυελογενούς προέλευσης και στο χαρακτηρισμό σταδίου ωρίμανσης αυτών. (π.χ. CD34+ και/ή Tdt+ κύτταρα χαρακτηρίζονται ως άωρα, ενώ κύτταρα που εκφράζουν επιφανεική Ig, επιφανεικό CD3/TCR με απουσία CD34, θεωρούνται πιο ώριμα). Τέτοιου είδους πληροφορίες αποβαίνουν ιδιαίτερα χρήσιμες στην κατάταξη των αιματολογικών νεοπλασιών, χαρακτηρίζοντας φαινοτυπικά την κυτταρική σειρά που εμπλέκεται στην οξεία λευχαιμία, αναγνωρίζοντας διφαινοτυπικές οξείες λευχαιμίες και κατατάσσοντας φαινοτυπικά τις οξείες λεμφοβλαστικές λευχαιμίες (Πίνακας1). Σήμερα, η αυξημένη γνώση περί του φαινοτυπικού προφίλ των φυσιολογικών κυττάρων κάθε αιμοποιητικής κυτταρικής σειράς, ανάλογα και του σταδίου ωρίμανσης αυτών, καθώς και η χρήση δεικτών που αποδεικνύουν τη δέσμευση ενός λευχαιμικού κυττάρου προς μία συγκεκριμένη αιμοποιητική σειρά, έχουν αποβεί χρήσιμα και ευαίσθητα διαγνωστικά εργαλεία στην κατάταξη της οξείας μυελογενούς λευχαιμίας, ανάλογα με τις μυελογενείς σειρές που εμπλέκονται (Πίνακας 2). Όσον αφορά το θέμα της ύπαρξης ή μη οξείας λευχαιμίας από NK-κύτταρα, φαίνεται να υπάρχει μια ομάδα ασθενειών που αναφέρονται ως NK/μυελογενής λευχαιμία από πρόδρομα κυτταρα (ΝΚ/ΑΜL stem cell leukemia) και εκφράζουν τον ιδιαίτερο φαινότυπο: CD56+, CD7+,CD2±, CD13+, CD33+, MPO-, ccd3-, scd3-. Επιπρόσθετα, η κυτταρομετρία έχει συμβάλλει στην αναγνώριση νέων υποτύπων οξείας μη-λεμφοβλαστικής λευχαιμίας (acute non-lymphoblastic leukemias/anll). Σε αυτούς περιλαμβάνονται οι δενδριτικές νεοπλασίες, όπου τα βλαστικά κύτταρα ανευρίσκονται έντονα θετικά στο HLA-DR και στο CD123, θετικά σε CD4 και CD56, TCR-, ccd3ασθ/-, CD43+, CD45RΑ+, TCL-1+, BDCA2 +, με ταυτόχρονη απρόσφορη συνέκφραση CD56 και NG2 (7.1), ενώ απουσιάζουν ενδοκυττάριοι δείκτες άλλων κυτταρικών σειρών (πχ. κυτταροπλασματική MPO και λυσοζύμη). Ομοίως, η συνέκφραση CD64 και CD36 διαφαίνεται ως πιο ευαίσθητος δείκτης από το CD14, στην αναγνώριση της δέσμευσης του μυελικού βλαστικού κυττάρου προς τη μονοκυτταρική σειρά και η κυτταροπλασματική έκφραση της τρυπτάσης έχει συσχετιστεί με συγκεκριμένους υποτύπους οξείας μυελογενούς λευχαιμίας, υποδεικνύοντας άλλοτε άλλο βαθμό δέσμευσης στην κυτταρική σειρά των βασεοφίλων ή των μαστοκυττάρων. H απρόσφορη έκφραση συγκεκριμένων φαινοτυπικών δεικτών ποικίλλει μεταξύ ασθενών με λευχαιμία ιδίας κατηγορίας, ακόμα και μεταξύ διαφορετικών λευχαιμικών υποπληθυσμών. 19

8 Νικόλαος Τσαγκαράκης, Γεώργιος Πατεράκης Γενικότερα, οι οξείες λεμφοβλαστικές λευχαιμίες εμφανίζουν πιο κοινούς φαινότυπους απρόσφορης έκφρασης από ότι οι οξείες μυελογενείς, όπου ο συχνότερος φαινότυπος απρόσφορης έκφρασης (π.χ. CD33έντονο, HLA-DR-, CD34-, CD15-, CD14-, CD11b-) μπορεί να εμφανίζεται σε <30% των περιπτώσεων. Η ανίχνευση συγκεκριμένων γενετικών ανωμαλιών φαίνεται να έχει προτεραιότητα στην κατάταξη της οξείας μυελογενούς λευχαιμίας. Παρ όλα αυτά, η ΚΡ είναι ιδιαίτερα χρήσιμη τόσο στη διάκριση λεμφοβλαστικής από μυελογενή λευχαιμία, όσο και στην ταυτοποίηση μεγακαρυοκυτταρικής διαφοροποίησης (CD41, CD61) ή ερυθρολευχαιμίας (CD235a ή γλυκοφορίνη Α+, καθώς και CD36+, CD64-, MPO-, λοιποί μυελικοί δείκτες-). Μεγάλη ευαισθησία, επίσης, εμφανίζει η ΚΡ στην ανίχνευση μονοκυτταρικής διαφοροποίησης μιας οξείας λευχαιμίας, με την ανίχνευση συνέκφρασης CD36/CD64, CD15/CD33 και θετικότητα αντισωμάτων έναντι διαφορετικών επιτόπων του CD Λεπτομερέστερη ανάλυση των φαινοτύπων που αναγνωρίζονται στις οξείες μυελογενείς λευχαιμίες, όπως και στις οξείες λεμφοβλαστικές από πρόδρομα B-κύτταρα, έχουν καταδείξει την υψηλή συσχέτιση αυτών με συγκεκριμένες γενετικές βλάβες, που καθορίζουν την διαγνωστική ταξινόμηση κατά WHO των υποκατηγοριών των ασθενειών αυτών (Πίνακας 2). Γι αυτό και η ανοσοφαινοτυπική μελέτη με ΚΡ χρησιμοποιείται ολοένα και περισσότερο για την αναγνώριση ασθενών με συγκεκριμένες γενετικές ανωμαλίες, όπου και θα πρέπει να πραγματοποιούνται οικονομικές και ταχείες επιβεβαιωτικές μοριακές μέθοδοι (FISH). Για παράδειγμα, σε απρόσφορη έκφραση CD19, CD56 και μερικές φορές Tdt, αναμένεται να υπάρχει η αναδιάταξη t(8;21)(q22;q22), ενώ βλαστικά κύτταρα οξείας προμυελοκυτταρικής λευχαιμίας με αναδιάταξη t(15;17)(q22;q12) φαίνεται να έχουν δέσμευση προς την κοκκιώδη μυελική σειρά (cmpo+, CD33+, CD13+), με αναστολή ωρίμανσης στο επίπεδο του προμυελοκυττάρου (HLADR-/ ασθ+, CD13+ετερογενώς, CD33έντονα+, CD117-/+, CD11b-, CD34-/ασθ+), αλλά εμφανίζουν ασθενή έκφραση του CD15, που είναι τυπικό σε t(15;17) αρνητικά φυσιολογικά/αντιδραστικά προμυελοκύτταρα. Πρόσφατα, περιγράφηκε μία νοσολογική οντότητα ΟΜΛ, με φαινότυπο CD34-, HLA-DR-, συχνή απρόσφορη έκφραση CD56, CD123+, CD133-, φυσιολογικό κυτταρογενετικό προφίλ, πυρηνικές εισολκές σε μορφή κούπας (cup-shaped nuclear invaginations) και εσωτερικό αναδιπλασιασμό FLT3 (internal tandem duplication) (ITD). 12 Αντίστοιχα, σε ενήλικες με BCR-ABL+ Β-λεμφοβλαστική λευχαιμία, οι βλάστες εμφανίζουν έναν άωρο φαινότυπο (CD34έντονα+, CD19ασθ+, CD13-/+ασθ), αλλά με μη φυσιολογικά ασθενή και ετερογενή έκφραση CD38, ενώ παιδιά με TEL-AML1 τυπικά εμφανίζουν φαινότυπο κοινής/bii Β-ΟΛΛ, με ετερογενή έκφραση CD27 και απουσία CD20 και CD9. Επίσης, περιπτώσεις με MLL αναδιατάξεις εμφανίζουν συχνά ανοσοφαινότυπο pro-b/bi με θετικότητα στο NG2 (7.1) και θετικούς τους μυελικούς δείκτες CD15 και CD65. Η ανίχνευση Β-ΟΛΛ με φαινότυπο κυτταροπλασματική μ+, CD10+, CD19+, CD20-/ασθ+, CD34-, έχει ευαισθησία στην ανίχνευση t(1;19)(q23;p13), αλλά δεν έχει ειδικότητα 13, ενώ B-ΟΛΛ με φαινότυπο CD10-, CD15+, CD24-/ ασθ+, σχετίζεται με την ανωμαλία t(4;11)(q21;q23). 10 Στο άμεσο μέλλον, αναμένεται να επεκταθεί η χρήση της κυτταρομετρίας ροής στη διάγνωση των αιματολογικών νεοπλασιών, αν Πίνακας 1. Ανοσοφαινοτυπική ταξινόμηση Τ- και Β- οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας (ΟΛΛ) από πρόδρομα κύτταρα (EGIL). BI Πρώιμη προ-β (pro-b) ccd79a+, CD19+, CD10-, cμ- BII Κοινή (common) ccd79a+, CD19+, CD10+, cμ- BIII προ-β (pre-b) ccd79a+, CD19+, CD10+/-, cμ+, sκ/λ(-) BIV* Ώριμη Β-βλάστη (βλαστικό κέντρο-burkitt) ccd79a+, CD19+, CD10+, Tdt-, sκ/λ κλωνική 20 TIa Προθυμική (pro-t) ccd3+, CD7++, CD5-, CD2-, scd3- TIb Προθυμική (pro-t) ccd3+, CD7++, CD5+, CD2-, CD1a-, scd3- TII Υποφλοιός (pre-t) ccd3+, CD7++, CD5+, CD2+, CD1a-, scd3- TIII Φλοιός θύμου (cortical T) TIV Μυελός θύμου (mature T) ccd3+, CD7++, CD5+, CD2+, CD1a+, scd3-/+ TCRα/β+/- (TIIIa) ή TCRγ/δ+/- (TIIIb) ccd3+, CD7++, CD5-, CD2-, CD1a-, scd3+ TCRα/β+ (TIVa) ή TCRγ/δ+(TIVb) Σήμερα θεωρείται ότι προέρχεται από τα βλαστικά κέντρα των λεμφαδένων και όχι από το μυελό (περιφερικού τύπου λευχαιμία/λέμφωμα), s: επιφανειακή, c: κυτταροπλασματική

9 κυτταρομετρικh μελeτη αιματολογικων νοσηματων και επί του παρόντος δεν εμφανίζει υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα στην ανίχνευση γενετικών ανωμαλιών. 14 Σκόπιμη θεωρείται η αναφορά σε περιπτώσεις όπου, αν και ανευρίσκονται βλαστόμορφα κύτταρα στο αίμα, ο ανοσοφαινότυπος μπορεί να οδηγεί σε ώριμο Β-κύτταρο (Tdt-, CD34-, CD10-/+, sig+, υψηλός μιτωτικός δείκτης) και να συνδυάζεται με αναδιατάξεις λεμφωμάτων ώριμων Β-κυττάρων, του τύπου: t(14;18)/bcl2 και t(8;14)/c-myc. 32,108,109 Έτσι, ο συνδυασμός ανοσοφαινότυπου (FC) και FISH μπορεί να συμβάλει στη διάκριση οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας τύπου Burkitt και διάχυτου λεμφώματος από μεγάλα Β-κύτταρα (DLBCL), λεμφώματος Burkitt και λεμφώματος οριακής ζώνης με βλαστόμορφα κύτταρα στο περιφερικό αίμα, αλλά και οξείας λευχαιμίας με μορφολογία λεμφώματος π.χ. Burkitt. ΝΕΟΠΛΑΣΙΕΣ ΩΡΙΜΩΝ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ Η ομάδα των λεμφοκυτταρικών νεοπλασιών από ώριμα λεμφοκύτταρα (χρόνια λεμφοϋπερπλαστικά ή chronic lymphoproliferative disorders-lpds) αναγνωρίζονται με την ανεύρεση ανοσοφαινοτύπου ωρίμων φυσιολογικών λεμφοκυττάρων και την έλλειψη αντιγονικών δεικτών αωρότητας, όπως Tdt, CD34 ή ασθενής έκφραση CD45. Με την αναγνώριση των ανάλογων δεικτών κάθε σειράς καθίσταται δυνατή η διάκρισή τους σε νεοπλασίες ωρίμων κυττάρων Β-, Τ- και NK- σειράς. Ο κλινικός θα πρέπει να αναγνωρίζει τις κλινικές ενδείξεις που οδηγούν στην διαγνωστική πιθανότητα λεμφοϋπερπλαστικών διαταραχών και μυελώματος, για τα οποία συνιστάται ΚΡ. Η ΚΡ αποτελεί μία αποδεκτή κλινική πρακτική για την εκτίμηση περιστατικών πιθανής λεμφοειδούς υπερπλασίας. Παίζει καθοριστικό ρόλο στην διάγνωση, ταξινόμηση, σταδιοποίηση και πρόγνωση των χρονίων λεμφοϋπερπλαστικών διαταραχών (LPD) και πλασματοκυτταρικών δυσκρασιών, ενώ παρέχει τη δυνατότητα δυνατότητα διάγνωσης ειδικών κλινικών οντοτήτων σχετιζόμενων με λεμφοϋπερπλαστικές διαταραχές και μυέλωμα. Η Διεθνής συνάντηση των ειδικών σε θέματα ενδείξεων μελέτης ανοσοφαινοτύπου με κυτταρομετρία σε αιματολεμφοειδείς υπερπλασίες περιγράφει μία σειρά κλινικών ενδείξεων κυτταρομετρίας σε περιπτώσεις πιθανού λεμφοειδούς νεοπλάσματος. Στα κλινικά σημεία και συμπτώματα μιας τέτοιας νεοπλασίας περιλαμβάνονται: παγκυτταροπενία, λεμφοκυττάρωση, ηωσινοφιλία, άτυπα κύτταρα σε υγρά του σώματος, οργανομεγαλία ή συμπαγείς όγκοι, πλασματοκύττωση και μονοκλωνική γαμμαπάθεια. Η κυτταρομετρία, επίσης, ενδείκνυται σε γνωστή LPD για σταδιοποίηση, πρόγνωση, ανίχνευση πιθανού θεραπευτικού στόχου, εκτίμηση ανταπόκρισης στη θεραπεία και παρακολούθηση της εξέλιξης της νόσου και πιθανής υποτροπής. Αναιμία, λευκοπενία, μονοκυτταροπενία και παγκυτταροπενία μπορεί να ακολουθούν δευτερογενώς τη νόσο. Στους ασθενείς αυτούς η κυτταρομετρία μπορεί να διακρίνει αν πρόκειται για καλοήθεις ή κακοήθεις κυτταρικούς πληθυσμούς. Στην περίπτωση καλοήθειας, η ανίχνευσή τους μπορεί να οφείλεται σε αίτια όπως λοιμώξεις, λήψη φαρμάκων, περιφερική απώλεια ή καταστροφή κτλ. Στην περίπτωση ανίχνευσης νεοπλασματικών κυττάρων, η κυτταρομετρία συμβάλλει στην ακριβή διάγνωση και την ταξινόμηση της νόσου. Παραδείγματα LPDs που συνοδεύονται από κυτταροπενίες αποτελούν η τριχωτή λευχαιμία (HCL) και η λευχαιμία από μεγάλα κοκκιώδη λεμφοκύτταρα (LGL). Η κυτταρομετρία έχει μεγάλη ευαισθησία και ειδικότητα στη μελέτη πιθανής τριχωτής λευχαιμίας λόγω των ιδιαίτερων ανοσοφαινοτυπικών χαρακτηριστικών της νόσου. 17 Στην περίπτωση των LGL (T-cell Large Granular Leukemia), η μελέτη των T και NK κυττάρων, των NK δεικτών και της κλωνικότητας του TCR υποδοχέα με κυτταρομετρία, προσφέρει τα μέγιστα. 18 Η αύξηση των λευκών μπορεί να αποτελεί σημείο LPD. Η εμμένουσα λεμφοκυττάρωση αποτελεί απόλυτη ένδειξη κυτταρομετρίας ροής. Στην περίπτωση αυτή στη διαφοροδιάγνωση περιλαμβάνονται αντιδραστικές καταστάσεις, χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία και άλλα LPDs. Η ανίχνευση λεμφοκυττάρων με φυσιολογικό ανοσοφαινότυπο και η μη εύρεση κλωνικότητας αποτελούν σημεία επιβεβαιωτικά. Με την ΚΡ εύκολα ανιχνεύεται το CD5(+) μονοκλωνικό B κύτταρο της ΧΛΛ, με τις χαρακτηριστικές ανοσοφαινοτυπικές ιδιαιτερότητες (ασθενές CD20, ασθενές ή αρνητικό FMC7 και CD79b). Η ΚΡ είναι, όμως, χρήσιμη και στη διαφοροποίηση της λευχαιμικής φάσης λεμφωμάτων όπως το λέμφωμα του μανδύα (MCL), το σπληνικό οριακής ζώνης (MZL) και το οζώδες λέμφωμα (FL), καθώς επίσης και στη μακροσφαιριναιμία του Waldenstrom και σε χρόνιες λευχαιμίες όπως η T-προλεμφοκυτταρική λευχαιμία ή LGL λευχαιμία. 19 Η ηωσινοφιλία μπορεί να αποτελεί την πρώτη ένδειξη T λεμφοϋπερπλαστικού νοσήματος και αποτελεί απόλυτη ένδειξη κυτταρομετρικής ανάλυσης, ενώ στην περίπτωση άτυπων μονοκυττάρων στο περιφερικό αίμα, η κυτταρομετρία μπορεί να βοηθήσει στον αποκλεισμό ύπαρξης αντιδραστικών λεμφοειδών κυττάρων και στην ανίχνευση πιθανής νεοπλασίας, λόγω της μεγαλύτερης ευαισθησίας και ειδικότητάς της σε σχέση με τη μεμονωμένη μορφολογική μελέτη. 20 Χρήσιμη είναι επίσης στη διάγνωση και κατηγοριοποίηση ιστικών λεμφοειδών νεοπλασιών, οπότε και συνιστάται σε περιπτώσεις λεμφαδενοπάθειας ή/και οργανομεγαλίας (σπληνομεγαλίας, ηπατομεγαλίας), σε περιπτώσεις διηθήσεων δέρματος, βλεννογόνων και οστών. Β-ΛΕΜΦΙΚΕΣ ΝΕΟΠΛΑΣΙΕΣ Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (WHO) κατατάσσει τα νεοπλάσματα από Β-ώριμα λεμφοκύτταρα σε νοσολογικές 21

10 Νικόλαος Τσαγκαράκης, Γεώργιος Πατεράκης Πίνακας 2. Οξεία μυελογενής λευχαιμία (ΟΜΛ): Διακρινόμενες οντότητες με βάση κυτταρογενετικές, ανοσοφαινοτυπικές και μορφολογικές ιδιαιτερότητες. 15,16 ΟΝΤΟΤΗΤΕΣ ΟΞΕΙΑΣ ΜΥΕΛΟΓΕΝΟΥΣ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΓΕΝΕΤΙΚΑ ΕΥΡΗΜΑΤΑ ΣΥΝΗΘΗ ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΑ ΕΥΡΗΜΑΤΑ DR, CD13, CD33, CD34, CD7- /+, Tdt-/+ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ Μ0 μεταβολές ιδιαίτερα στο 5 ή 7, t(9;22) (σε λεμφικούς δείκτες) Βλάστες τύπου Ι Μ1 όπως Μ0, εκτός CD15-/+ βλάστες >90% Μ2 t(6;9)(p23;q34)(m2baso) DR, CD13, CD33, CD15 t(8;21) (σε CD19+) και CD34 (από M1) βλάστες <90% DR-, CD13, CD15, CD33, Μ3 CD34-/+, ccd66c-, MPO++, CD64, ccd68, CD16ασθ, Βλάστες τύπου ΙΙΙ CD56-, CD14-, CD117 M3v PML/RARa (M3) PLZF/RARa (M3) Μ4/Μ5 Μ6 Αληθής ερυθρολευχαιμία (pure) Μ7 AML1(CBFa)/ETO (9% των ΟΜΛ) ΟΜΛ με άτυπα ηωσινόφιλα στο μυελό (3-6% των ΟΜΛ) 11q23 MLL (4-10% των ΟΜΛ) ΟΜΛ t(15;17)(q22;q11-12) t(11;17) t(8;16)(p11;p13) σε αιμοφαγοκυττάρωση και ΔΕΠ, 11q23 (35%), inv(16) ή t(16;16) στις περισσότερες M4Eo -7 ή del(7q) και/ή -5 ή del(5q) t(1;22)(p13;13) (βρεφική), inv(3)(p21;q23) ή t(3;3) (ενηλίκων) CD56-, DR-, CD14-, CD2, CD34, MPO++ CD56 CD56 DR, CD15,CD14+/-, CD33>CD13, CD34-/+, CD4ασθ, σε CD2(+) υποψία M4Eo DR, CD13-/+, CD33+/-, CD34, CD45ασθ GlyA+, CD36, αντιγόνα ομάδων αίματος DR-/+, CD33+/-, CD34, CD41, CD61, CD71, CD36 CD19ασθ, συνέκφραση CD34/ CD56 ή CD13-,CD33, MPO+ Λεπτή κοκκίωση Απουσία λόβωσης προμυελοκυττάρων, αυξημένα ψευδο-pelger Χιμαιρική κοκκίωση ηωσινοφίλων στο μυελό (inv16) Μυελοειδές και ερυθροβλαστικό στοιχείο διάκριτα Βλάστες αδιαφοροποίητοι τύπου I καθοριστικός ο φαινότυπος, λαμβάνεται υπόψη η προσκόλληση PLT σε βλάστες Βλάστες τύπου III, μεμονωμένα ραβδία Auer inv(16)(p13q22) CD2+ Εικόνα M4 με ηωσινοφιλία 11q23 MLL αναδιατάξεις FLT3-ITD, RARa- CD56+ DR-, CD56, CD123, CD133-, CD34- M5, M4, σπανιότερα Μ2 ή ΜΔΣ Cup-like πυρηνικές εισολκές οντότητες που αφορούν κύτταρα φυσιολογικής ωρίμανσης των B-κυττάρων και περιοχές όπου φυσιολογικά μπορεί αυτά να ανευρεθούν. 5 Η ΚΡ συμβάλλει στην αναγνώριση περιορισμένης έκφρασης ελαφράς αλύσου ή μη φυσιολογικού φαινοτύπου και στην φαινοτυπική ταυτοποίηση των ανάλογων νοσολογικών οντοτήτων. Η έκφραση των CD5 και CD10 χρησιμοποιείται για τη διάκριση τεσσάρων διαφορετικών ομάδων νεοπλασιών με B-ώριμα λεμφοκύτταρα: CD5+/CD10-, CD5-/ CD10+, CD5+/CD10+, CD5-/CD10- (Πίνακας 3). Στην CD5+/CD10- ομάδα ανήκει η Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία (ΧΛΛ), η προλεμφοκυτταρική λευχαιμία (PLL), το λέμφωμα του μανδύα (MCL), και λιγότερο συχνά τα: λέμφωμα οριακής ζώνης (MZL), το διάχυτο λέμφωμα από μεγάλα B- κύτταρα (DLBCL) και το λεμφοπλασματοκυτταρικό λέμφωμα 22

11 κυτταρομετρικh μελeτη αιματολογικων νοσηματων (LPL). Θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη ότι ένα μέρος φυσιολογικών B-κυττάρων είναι CD5 θετικό. 21 Οι περισσότερες ΧΛΛ έχουν τον χαρακτηριστικό φαινότυπο: CD23+, FMC-7- και ασθ. CD20, CD22, CD79b και ασθενώς επιφανειακή ανοσοσφαιρίνη (sig). 22 Οι άτυπες μορφές ΧΛΛ (άτυπος φαινότυπος) απαιτούν διαφορετική προσέγγιση και καθιστούν δύσκολη τη διάκριση από τις άλλες CD5+ Β-νεοπλασίες, ευκολότερη στις περιπτώσεις DLBCL και PLL (μορφολογική διάκριση) και δυσκολότερη σε περιπτώσεις MCL (υπερέκφραση κυκλίνης-d1 ή διαμετάθεση t(11;14)q(13;q32) που οδηγεί σε αναδιάταξη του γονιδίου CCND1) και σε CD5+ MZL (CD23-, μορφολογική εκτίμηση, ανοσοϊστοχημεία με καλοήθη οζώδη βλαστικά κέντρα, κλωνική πλασματοκυτταρική διαφοροποίηση η οποία συναντάται και σε LPL και ΧΛΛ). Η ανεύρεση γενετικών ανωμαλιών, όπως t(11;18)(q21;q21), t(1;14)(p22;q32), t(14;18)(q32;q21) προσανατολίζουν σε εξωλεμφαδενικό MZL ή σπληνικό MZL (MALT1 γονίδιο, έλλειψη 7q31). 23 Επίσης, 5% των LPL εμφανίζουν CD5+ 24,25 και η επιβεβαίωση της διάγνωσης απαιτεί πλασματοκυτταρική κλωνικότητα κυτταροπλασματικής ελαφράς αλύσου, αποκλεισμό MCL κυτταρογενετικά ή ανοσοϊστοχημικά και εκτίμηση της εντόπισης της νόσου 24 (η LPL κυριαρχεί σε περιφερικό αίμα και μυελό των οστών). Ένα ποσοστό των DLBCL που είναι CD5+ είτε πρόκειται για ΧΛΛ με μεγάλα κύτταρα (Richter) είτε για βλαστική παραλλαγή MCL είτε είναι ενδαγγειακό B-λέμφωμα από μεγάλα κύτταρα είτε πρόκειται για μορφή de novo (με ιδιαίτερες γενετικές ανωμαλίες και χειρότερη πρόγνωση). 26 Το προλεμφοκυτταρικό λέμφωμα μπορεί να προκύψει από μετατροπή ΧΛΛ (αύξηση CD20, sig, μειωμένο CD5) και φαίνεται πανομοιότυπο με ΧΛΛ. 27 Η PLL μπορεί να διακριθεί μορφολογικά και λόγω μεγάλης λευκοκυττάρωσης, ηπατομεγαλίας και σπληνομεγαλίας, αν και πρέπει να διακριθεί από τη βλαστική μορφή MCL. 28,29 Στην κατηγορία των CD5-, CD10+ ανήκουν κατά σειρά συχνότητας τα DLBCL, FL (οζώδες λέμφωμα) και BL (λέμφωμα Burkitt), ενώ 10% των περιστατικών τριχωτής λευχαιμίας είναι CD Αναφορές, ωστόσο, υπάρχουν και σε CD10+ LPL 24 και MZL, MCL. Όταν ανευρίσκεται CD10+ ώριμο B-κύτταρο με κυτταρομετρία ροής, η εκτίμηση προς FL ή DLBCL γίνεται μορφολογικά. Η πιο βοηθητική μέθοδος διάκρισης έχει αναφερθεί ότι είναι το CD71 (FL-low intensity, DLBCL και BL-high intensity). 31 Η διάκριση του BL γίνεται φαινοτυπικά (CD10+, CD5-, bcl-2-, CD43+, sig+, Tdt-, CD34-) και ενισχύεται γονοτυπικά (αναδιατάξεις c-myc), αν και υπάρχει DLBCL CD10+, bcl- 2-, bcl-2+ μορφή BL, ΟΛΛ με sig και c-myc+ DLBCL. Η διάκριση BL και DLBCL γίνεται μορφολογικά (ομοιογενής πληθυσμός με ενδιάμεσου μεγέθους κύτταρα, βασεόφιλα, με κενοτόπια, πυρήνια και ετερογενής με μεγάλα κύτταρα, αντίστοιχα), κυτταρομετρικά (υψηλός δείκτης πολλαπλασιασμού-ki-67 και χαμηλός, αντίστοιχα) και γονοτυπικά (μεμονωμένη αναδιάταξη c-myc και αναδιατάξεις c-myc, bcl-2, bcl-6, αντίστοιχα). Οι c- MYC και bcl-2 ανδιατάξεις σχετίζοναι με φτωχή πρόγνωση. 32 Όσον αφορά την τριχωτή λευχαιμία (HCL), CD10+ και CD10- μορφή είναι μορφολογικά και κλινικά όμοιες και θεραπεύονται με τον ίδιο τρόπο. 30 O φαινότυπος CD20+, CD22+, sig+, CD38-, FMC-7+ και ιδιαίτερα η ύπαρξη CD11c+, CD25+, CD103+ επισφραγίζει τη διάγνωση τριχωτής λευχαιμίας. Τα CD5+,CD10+ νεοπλάσματα από Β-κύτταρα είναι ασυνήθη 33,34,35,36 και περιλαμβάνουν κυρίως τα: DLBCL και FL. Η διάκριση γίνεται μορφολογικά (FL, μικρά κύτταρα και DLBCL, μεγάλα κύτταρα), ενώ η γονοτυπική ταυτοποίηση είναι επιτακτική. H έκφραση CD43 και bcl-2 συμβάλλει στη διαφοροδιάγνωση (FL, CD43-, bcl-2+, ενώ DLBCL, ποικιλία έκφρασης CD43, bcl-2). H ομάδα των CD5-, CD10- Β-λεμφικών νεοπλασιών εμφανίζει ετερογένεια και περιλαμβάνει τις εξής νοσολογικές οντότητες: DLBCL, MZL, HCL, LPL, CD10- FL, CD5- MCL. Όσον αφορά την HCL, ο φαινότυπος CD20++, CD22++, CD11c++, CD25+, CD103+, sig+, FMC-7+, CD23-, CD5-, CD10- εμφανίζει μεγαλύτερη ευαισθησία και ειδικότητα στη διάγνωση, από ότι η ανθεκτική στο τρυγικό όξινη φωσφατάση (TRAP) 37 Συχνές είναι οι παρεκκλίσεις από αυτό το φαινότυπο 38,39 οπότε και είναι πιθανή η έλλειψη CD103, CD25 ή CD23. Ωστόσο, η HCL variant (HCLv), όπου υπάρχει υψηλότερη λευκοκυττάρωση, ελλείπει η μονοκυτταροπενία, υπάρχουν ευδιάκριτα πυρήνια και είναι TRAP και CD25 αρνητική, πρέπει να διαφοροδιαγιγνώσκεται από την κλασσική HCL και από σπληνικό MZL. 38 To MZL εμφανίζει χαρακτηριστική μορφολογία, η οποία ανιχνεύεται ευκολότερα σε λεμφαδενικό ιστό από ότι σε μυελό και περιφερικό αίμα (έχει περιγραφεί σπληνικό MZL με τριχωτά κύταρα στο περιφερικό αίμα). Το MZL είναι συχνά CD11c + ή CD ,39, αλλά ελλείπει ο συνδυασμός CD103+, CD11c+ και CD22+, ενώ η ανίχνευση της έλλειψης 7q31 προσανατολίζει σε σπληνικό MZL. Όσον αφορά το LPL, στο 60-80% των ασθενών εμφανίζεται ο φαινότυπος CD5-, CD10- CD ,24 Δύσκολη είναι η διάκρισή του από το MZL, αλλά διακρίνεται από την HCL με το φαινότυπο CD103-. Επίσης, η αναγνώριση των CD10- FL 40,41 και CD5- MCL 42 απαιτεί συνδυασμό μορφολογικών, ανοσοφαινοτυπικών και γονοτυπικών κριτηρίων, ενώ η ύπαρξη CLL/SLL CD5- είναι σπάνια. Ως προγνωστικοί δείκτες των B-λεμφοϋπερπλαστικών νοσημάτων έχουν χρησιμοποιηθεί το CD38 και το ZAP-70, με ιδιαίτερη προγνωστική αξία σε CLL/SLL 43 με την έκφραση του CD38 ως ανεξάρτητου δείκτη φτωχής πρόγνωσης 44 και το ZAP-70 ως τον καλύτερο προγνωστικό δείκτη σε ασθενείς με αμετάλλακτο το γονίδιο της μεταβλητής περιοχής της βαρειάς αλυσίδας της ανοσοσφαιρίνης (IgVH). Να ληφθεί υπόψη ότι υπάρχουν πολλές τεχνικές δυσκολίες στην αξιολόγηση της έκφρασης του ZAP-70 (ασθενής χρώση, ενδοκυττάρια έκφραση, μη ειδική πρόσληψη, μείωση έντασης με την πάροδο του χρόνου, αδυναμία ορισμού του θετικού πληθυσμού) 45,46 23

12 Νικόλαος Τσαγκαράκης, Γεώργιος Πατεράκης Τ- ΚΑΙ ΝΚ-ΛΕΜΦΙΚΕΣ ΝΕΟΠΛΑΣΙΕΣ Τα λεμφοϋπερπλαστικά νοσήματα από T- και NK- κύτταρα αναγνωρίζονται με κυτταρομετρία ροής από την ανίχνευση απρόσφορης έκφρασης αντιγόνων. 48,49 Συχνά εμφανίζουν διαφοροποιημένη έκφραση T- και NK- σχετιζόμενων αντιγόνων. 49,50 Τα CD5 και CD7 είναι τα αντιγόνα που απουσιάζουν συχνότερα σε Τ-νεοπλασίες, ενώ είναι σημαντική η γνώση φυσιολογικών υποπληθυσμών, όπως τα λεμφοκύτταρα με Τ κυτταρικό υποδοχέα (γ/δ) + (T-cell receptor, TCR-γ/δ), στα οποία μπορεί να απουσιάζει το CD5, CD4 και CD8, καθώς και τα φυσιολογικά ΝΚ κύτταρα, στα οποία απουσιάζει συνήθως το CD5 και ποικίλλει η έλλειψη του CD8. 48 Ωστόσο, ποικιλία εμφανίζει ο ανοσοφαινότυπος των T-νεοπλασιών στην ένταση CD3 και CD5 και των ΝΚ-νεοπλασιών στα CD2, CD7, CD56, CD57 (ασθενέστερα) και CD8, CD16 (εντονότερα). 49,50 Τα μυελικά, επίσης, αντιγόνα CD15, CD13, CD33 έχουν περιγραφεί σε ώριμες Τ-νεοπλασίες και μπορεί να προσανατολίσουν προς οξεία μυελογενή λευχαιμία 51,52,53, καθώς και το CD20, που μπορεί να ανιχνευθεί και σε μικρό ποσοστό φυσιολογικών T-κυττάρων. 54,55 Η αναγνώριση T-κυτταρικών νεοπλασιών γίνεται με την ανεύρεση κλωνικής έκπτυξης T-πληθυσμού με περιορισμένη έκφραση αντιγόνων (restricted expression), έναντι φυσιoλογικών ή αντιδραστικών πληθυσμών. Η παρέκκλιση του λόγου CD4/CD8 από τις αναμενόμενες τιμές δημιουργεί υποψίες για ύπαρξη κλωνικού μη φυσιολογικού πληθυσμού Πίνακας 3. Β-ώριμες λεμφικές νεοπλασίες Πιθανή οντότητα Χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (B-CLL) CD5+, CD10- Λέμφωμα μανδύα (MCL) CD5+, CD10-/+ Λέμφωμα μανδύα (MCL) CD5- Προλεμφοκυτταρική λευχαιμία (PLL) CD5+, CD10- B-λέμφωμα οριακής ζώνης (MZL) CD5+/-, CD10- Διάχυτο Β-λέμφωμα από μεγάλα κύτταρα (DLBCL) CD5+/-, CD10+/- Λεμφοπλασματοκυτταρικό λέμφωμα (LPL) CD5+, CD10- Οζώδες λέμφωμα (FL) CD5-/+, CD10+ Οζώδες λέμφωμα (FL) CD10- Λέμφωμα Burkitt (BL) CD5+, CD10+ Τριχωτή λευχαιμία (HCL) CD5-, CD10+/- Διακριτικός φαινότυπος Τυπικός φαινότυπος: CD20 (d), CD22 (d), sig (d), CD23+, FMC-7- Ποικιλία φαινοτύπου, μη άτυπη CLL; συχνά CD20 (i), sig (i), CD23+/-, FMC-7+/- Ποικιλία φαινοτύπου Ποικιλία φαινοτύπου, πιθανή επικάλυψη με CLL και MCL. CD20 (+i), sig (+i), FMC-7+/-, CD5+/- Ποικιλία φαινοτύπου, μη τυπικός CLL: CD23; συχνά CD11c+/-, CD103+/- αλλά όχι τυπικής HCL, μερικές φορές cig μόνο Ποικιλία φαινοτύπου, bcl-2+/-, CD43+/- Φαινότυπος μη τυπικός CLL, συχνά CD23(-/d), μερικές φορές sig- αλλά cig+ Συνήθως bcl-2+, CD43- Ποικιλία φαινοτύπου Συνήθως bcl-2-, CD10 (b), CD43+ Τυπικός φαινότυπος: CD20 (b), CD22 (b), CD11c (b), CD25+, CD103+, sig (i), CD123+_ Συνοδές διαγνωστικές πληροφορίες Χαρακτηριστική μορφολογία Cyclin-D1 IHC, t(11;14)/ccnd1 αναδιάταξη Cyclin-D1 IHC, t(11;14)/ccnd1 αναδιάταξη Μεγάλα κύτταρα με ευδιάκριτα πυρήνια; δ.δ. με βλαστική παραλλαγή μανδύα t(11;14) Περιλεμφοζιδιακή και ενδολεμφοζιδιακή διήθηση, t(11;18), t(1;14), t(14;18)/malt-1 αναδιάταξη Μεγάλα κύτταρα, διάχυτο πρότυπο διήθησης; υπόψιν: εκτροπή Richter-CLL και MCL Μικρά κύτταρα, υπότυπος με πλασμ/κή διαφοροποίηση, κυρίως περιφερικό αίμα και μυελό Οζώδης ανάπτυξη, t(14;18)/bcl-2 αναδιάταξη Οζώδης ανάπτυξη, t(14;18)/bcl-2 αναδιάταξη ομοιόμορφα ενδιάμεσου μεγέθους κύτταρα; MYC αναδιάταξη, Ki-67 περί το 100% Χαρακτηριστική μορφολογία (d): dim ή ασθενής έκφραση, (i): intermediate ή ενδιάμεσης έντασης έκφραση, (b): bright ή έντονη έκφραση, +/-: συνηθέστερα θετικό, -/+: συνηθέστερα αρνητικό, IHC: immunohistochemistry, ανοσοϊστοχημεία

13 κυτταρομετρικh μελeτη αιματολογικων νοσηματων (π.χ. σε αύξηση, διερευνάται η παρουσία συνδρόμου Sezary CD26+, CD7-). 56,57 Η ποιοτική και ποσοτική κυτταρομετρική εκτίμηση του ρεπερτορίου TCR-Vβ υποδοχέα αποτελεί ευαίσθητη και ειδική μέθοδο για την ανίχνευση κλωνικά περιορισμένων πληθυσμών 58, με ψευδώς θετικά αποτελέσματα σε αντιδραστικές καταστάσεις και μικρό αριθμό T-κυττάρων στο δείγμα, καθώς και ψευδώς αρνητικά όταν μικροί κλώνοι αναμιγνύονται με πολλά αντιδραστικά κύτταρα. Επίσης, υπάρχει ο περιορισμός της ανίχνευσης μόνο 24 διαφορετικών οικογενειών Vβ υποδοχέων (TCRαβ), ενώ ο προσδιορισμός του NK υποδοχέα (συμπεριλαμβανομένων των KIRs ή Killer cell immunoglobulin receptors και του συμπλέγματος CD94/NKG2) είναι συνήθως περιορισμένου ρεπερτορίου σε νεοπλασματικούς κλώνους. Οι κλινικές πληροφορίες φαίνεται να είναι περισσότερο απαραίτητες στα T- από ότι στα Β-λεμφοϋπερπλαστικά νοσήματα. Ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα σημεία προσβολής (αίμα, λεμφαδένες, εξωλεμφαδενικές εντοπίσεις), η κατανομή των εξωλεμφαδενικών εντοπίσεων, η επιθετικότητα της νόσου και στοιχεία που προσανατολίζουν προς συγκεκριμένες οντότητες, όπως διάχυτη λεμφαδενοπάθεια, συστηματικά συμπτώματα, ερύθημα δέρματος και υπεργαμμασφαιριναιμία (αγγειοανοσοβλαστικό T-λέμφωμα ή AITCL), κολίτιδα (Τ-λέμφωμα σχετιζόμενο με εντεροπάθεια ή EATCL) ή ουδετεροπενία και ρευματοειδής αρθρίτιδα (Large Granular Leukemia, LGL). Ο συνδυασμός κυτταρομετρίας, μορφολογικής εκτίμησης, ανοσοϊστοχημικής εξέτασης (IHC) και κυτταρογενετικής θεωρείται επιτακτικός για την τελικά κατάταξη ενός νοσήματος. Να σημειωθεί ότι αρκετά είναι τα πλεονεκτήματα της κυτταρομετρίας έναντι της ανοσοϊστοχημείας στην εκτίμηση των T- και NK-λεμφοϋπερπλαστικών νοσημάτων, όπως ο προσδιορισμός του πλήρους συμπλέγματος TCR-CD3 (έναντι CD3ε), ο καλύτερος διαχωρισμός από αντιδραστικά κύτταρα, η μεγαλύτερη ευαισθησία στην ανίχνευση CD56 και CD57 στα NK, η μη ύπαρξη ανοσοϊστοχημικής χρώσης για το CD16 και η αδυναμία ανοσοϊστοχημικής ανίχνευσης του γ/δ TCR υποδοχέα, καθώς και η ανίχνευση του CD103 (που το εκφράζει μέρος φυσιολογικών ενδοεπιθηλιακών T- και το EATCL) μόνο κυτταρομετρικά. 47 Η αρχική ταξινόμηση των T- λεμφοϋπερπλαστικών νοσημάτων γίνεται με βάση την έκφραση CD4 και CD8, οπότε και διακρίνονται 4 ομάδες, ενώ ενισχύεται με τις υπόλοιπες πληροφορίες (κλινικές πληροφορίες, FISH, IHC). Στην κατηγορία των CD4+/CD8- ανήκουν: το σύνδρομο Sezary ή T-δερματικό λέμφωμα (CTCL), η T-προλεμφοκυτταρική λευχαιμία (T-PLL) και η Τ-λευχαιμία/λέμφωμα των ενηλίκων (ATLL), νοσήματα που πρωταρχικά προσβάλλουν το περιφερικό αίμα και πρέπει έχουν προτεραιότητα προς αποκλεισμό, αλλά ανήκουν και: το αναπλαστικό λέμφωμα από μεγάλα (T) κύτταρα (ALCL), το AITCL, περιφερικά T-κυτταρικά λεμφώματα απροσδιόριστα (unspecified, PTCL- U), καθώς και τα σπάνια CD4+ LGL. Η πρόσφατα περιγραφείσα οντότητα του CD4+CD56+ αιματοδερμικού νεοπλάσματος (HDN) ή αλλιώς NK-βλαστικό λέμφωμα ή νεοπλασία πλασματοκυτταροειδών δενδριτικών κυττάρων (DC2), εξετάζεται στις οξείες λευχαιμίες, έχει βλαστική εμφάνιση και απουσιάζουν Τ-κυτταρικοί δείκτες. 59 Η κυτταρομετρική προσέγγιση στη διάγνωση και στην ταξινόμηση των Τ-λεμφικών νεοπλασιών της ομάδας CD4+/CD8-, αλλά και των υπόλοιπων ομάδων, φαίνεται στον Πίνακα 4. ΠΛΑΣΜΑΤΟΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΔΙΑΤΑΡΑΧΕΣ Οι πλασματοκυτταρικές διαταραχές ανιχνεύονται συνήθως από την αυξημένη παρουσία γ-σφαιρινών σε ορό ή ούρα, οπότε και διακρίνονται σε πολυκλωνικές αντιδραστικές και μονοκλωνικές γαμμαπάθειες. Οι μονοκλωνικές με τη σειρά τους διακρίνονται σε μονοκλωνικές γαμμαπάθειες αδιευκρίνιστης αιτιολογίας (MGUS, Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance) και στις πλασματοκυτταρικές νεοπλασίες, που περιλαμβάνουν το πλασματοκύττωμα, το πολλαπλούν μυέλωμα, την πλασματοκυτταρική λευχαιμία, την αμυλοείδωση και τις νόσους ελαφρών και βαρέων αλύσεων. Η διάγνωση μιας τέτοιας νεοπλασίας απαιτεί την ανίχνευση πλασματοκυττάρων >10% στο μυελό, κλωνικότητα ή ανώμαλο φαινότυπο, οπότε και ταξινομείται με μορφολογικά, εργαστηριακά, ακτινολογικά και άλλα κλινικά κριτήρια. Η ΚΡ έχει θέση στην ανίχνευση παθολογικού φαινότυπου πλασματοκυττάρων, στη διάκριση λεμφικών από πλασματοκυταρικές νεοπλασίες και στην πρόσθετη προγνωστική πληροφόρηση. 60,61 Μελέτη των πλασματοκυττάρων με ΚΡ θεωρείται σκόπιμη σε περιπτώσεις μονοκλωνικής γαμμαπάθειας, λυτικών οστικών αλλοιώσεων ή υπερασβεστιαιμίας. Η ΚΡ συμβάλλει ουσιαστικά στη διαγνωστική εκτίμηση πλασματοκυτταρώσεων και μονοκλωνικής γαμμαπάθειας, που συναντώνται σε πλασματοκυτταρικές δυσκρασίες, πολλαπλό μυέλωμα ή χρόνιες λεμφοϋπερπλαστικές διαταραχές. Βοηθάει στη διαφοροδιάγνωση μεταξύ πολλαπλού μυελώματος και μονοκλωνικής γαμμαπάθειας αδιευκρίνιστης αιτιολογίας (MGUS), μελετώντας την κλωνικότητα των πλασματοκυττάρων του μυελού. Να ληφθεί υπόψη ότι η ποσοτική ανίχνευση των πλασματοκυττάρων στο μυελό με ΚΡ από ότι με ανοσοϊστοχημεία είναι δυσανάλογη μικρότερη, λόγω απώλειας στη λήψη ή στην επεξεργασία του δείγματος. Παράλληλα με την ανίχνευση μονοκλωνικών πλασματοκυττάρων, η ΚΡ βοηθάει στην ποσοτική ανίχνευση φυσιολογικών πλασματοκυταρικών πληθυσμών μέσα σε παθολογικά κύτταρα 62 και στη διάκριση των MGUS. Η μελέτη του ανοσοφαινότυπου των πλασματοκυττάρων βοηθάει, επίσης, στην περίπτωση ανεξήγητης αύξησης των πλασματοκυττάρων στο μυελό, ανιχνεύοντας τον παθολογικό φαινότυπο ή πιθανή κλωνικότητα. Μπορεί ακόμα να ενδείκνυται στη μελέ- 25

14 Νικόλαος Τσαγκαράκης, Γεώργιος Πατεράκης Πίνακας 4. Τ-ώριμες λεμφικές νεοπλασίες. 47 Πιθανή οντότητα Διακριτικός φαινότυπος Συνοδές διαγνωστικές πληροφορίες CTCL/σύνδρομο Sézary CD4+, CD8- T-προλεμφοκυτταρική λευχαιμία (T-PLL) CD4+, CD8-/+ T-λευχαιμία/λέμφωμα ενηλίκων (ATLL) CD4+, CD8-/+ Αναπλαστικό λέμφωμα από μεγάλα κύτταρα (ALCL) CD4+, CD8- Αγγειοανοσοβλαστικό TCL (AITCL) CD4+, CD8- Περιφερικό TCL, NOS CD4+, CD8-/+ T-λεμφοκυτταρική λευχαιμία από μεγάλα κοκκιώδη λεμφοκύτταρα (T-LGL) CD4-, CD8+ Συνήθως CD7-, CD26-, CD25+/- (με ετερογένεια έντασης) Συχνά έλλειψη ειδικής απρόσφορης έκφρασης. CD16-, CD56-, CD57-. CD7-, CD25+ (ομοιογενής ένταση) Συχνή απώλεια παν Τ δεικτών. CD30+ ( ένταση), Alk-1+/- CD56+/-, CD13+/, CD15+/-, CD33+/- Cytotoxic granule-associated protein (+). Συχνά απρόσφορος φαινότυπος (π.χ. ένταση CD7και CD3). CD10+/- Ποικιλία φαινοτυπική, συχνά απρόσφορη απώλεια CD5 και/ή CD7. Συχνά απρόσφορη έκφραση CD5 και/ή CD7. CD16+/-, CD56+/-, CD57+. TIA-1+, granzyme-b+, perforin+ Μορφολογική και κλινική επιβεβαίωση. HTLV-I 80% t(14;14)(q11;q32) ή inv(14)(q11;q32). TCL1 υπερέκφραση. HTLV-I+, ενδημεί σε Ιαπωνία και Καραϊβική Αναπλαστική μορφολογία, εκτός της μονομορφικής ποικιλίας με μικρά λεμφοκύτταρα. Αναδιάταξη γονιδίου ALK Χαρακτηριστική μορφολογία, CXCL13+, διάσπαρτα EBV+ B κύτταρα. Διάγνωση εξ αποκλεισμού Συχνά LGL μορφολογία, ήπια πορεία, συσχέτιση με ρευματοειδή αρθρίτιδα και κυτταροπενίες (π.χ. ουδετεροπενία και αναιμία) EBV- TCL με υποδόρια διήθηση CD4-, CD8+ Ηπατοσπληνικό TCL CD4-, CD8+/- TCL με εντεροπάθεια CD4-, CD8- Μη-ηπατοσπληνικό γ/δ TCL CD4-/CD8- Συνήθως μόνο εστιακά CD56, EBV-, TCR α/β, TIA-1-, granzyme-b+, perforin+ Συνήθως CD5- και CD7+. CD16+/-, CD56+, CD57-, TIA-1+, granzyme-b-, perforin-. CD5-, CD3+, CD7+, CD103+, CD56+/-. TIA-1+, granzyme-b+, perforin+ CD5-, CD56+, συνήθως CD57-, TCR γ/δ. TIA-1+, granzyme-b+, perforin+. Χαρακτηριστικού τύπου υποδόρια διήθηση. Διαφορική διάγνωση:σελ Συνήθως TCR γ/δ, EBV-. Συχνό ισοχρωμόσωμα 7q. Επιθετική κλινική πορεία CD30+/-, EBV-. FISH για προσθήκες σε 9q Ιστορικό κοιλιοκάκης. Δέρμα, βλεννογόνοι, εξωλεμφαδενικές εντοπίσεις EBV συχνά (+) σε βλεννογονικό και (-) σε δερματικό λέμφωμα (d): dim ή ασθενής έκφραση, (i): intermediate ή ενδιάμεσης έντασης έκφραση, (b): bright ή έντονη έκφραση, +/-: συνηθέστερα θετικό, -/+: συνηθέστερα αρνητικό, TCL: T cell lymphoma τη της πορείας της νόσου, σε περιπτώσεις πολλαπλού μυελώματος ή LPD (βλ. υπολειμματική νόσο). Ανοσοφαινοτυπικά χρησιμοποιούνται οι δείκτες CD38 (και σε άλλες κυτταρικές σειρές, αλλά μεγαλύτερη ένταση στα πλασματοκύτταρα) και CD138 (ειδικότητα σε πλασματοκυτταρικές νεοπλασίες, αλλά χαμηλή ευαισθησία). Τα νεοπλασματικά πλασματοκύτταρα συνήθως είναι CD38+ και CD138+ (χαμηλότερης έντασης από τα αντιδραστικά) και μετατοπίζονται περισσότερα στο χώρο των CD45- πληθυσμών, ενώ είναι συνήθως CD19-, CD20-. Η έκφραση CD20 στο μυέλωμα έχει συσχετιστεί με μορφολογία περισσότερη λεμφοειδή, με την παρουσία της διαμετάθεσης t(11;14) και με cyclin-d1 θετικότητα στην ανοσοϊστοχημεία (96). Απρόσφορη είναι, επίσης, η έκφραση του CD56 στο μυέλωμα, ενώ η απώλεια ή απουσία του CD27, όπως και του CD45, υποδεικνύει την επιδείνωση της νόσου 63,64 και προσοχή χρειάζεται στην περίπτωση ανίχνευσης CD117 και CD10. Τέλος, η ανίχνευση κυκλοφορούντων πλασματοκυττάρων στο περιφερικό αίμα και η μελέτη του ρυθμού πολλαπλασιασμού 26

15 κυτταρομετρικh μελeτη αιματολογικων νοσηματων αυτών, αποτελούν προγνωστικούς δείκτες επιβίωσης σε ασθενείς με πρόσφατα διαγνωσθέν πολλαπλό μυέλωμα. ΜΥΕΛΟΔΥΣΠΛΑΣΤΙΚΑ ΣΥΝΔΡΟΜΑ Τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (MDS) και οι χρόνιες μυελοϋπερπλαστικές διαταραχές (CMPDs) αποτελούν μία ετερογενή ομάδα νεοπλασιών από ωριμάζουσες αιμοποιητικές κυτταρικές σειρές. Τα MDS συχνά εμφανίζονται με συμπτωματολογία και σημειολογία σχετιζόμενη με αναιμία, θρομβοπενία ή ουδετεροπενία, ενώ στις CMPDs υπερέχει μία τουλάχιστον κυτταρική σειρά και μπορεί να εκδηλώνονται με σπληνομεγαλία και σημεία δυσλειτουργικής κυτταρικής σειράς, όπως π.χ. θρόμβωση ή αιμορραγία. H διάγνωση των MDS βασίζεται κατά κύριο λόγο στο συνδυασμό μορφολογικών, κλινικών και κυτταρογενετικών ευρημάτων. 5 Πολύ πρόσφατα, φάνηκε ότι ο ανοσοφαινότυπος μπορεί να προσφέρει στη διαγνωστική προσέγγιση αυτής της κατηγορίας των νοσημάτων. Αποδείξεις προκύπτουν από σειρά μελετών ότι κοινό χαρακτηριστικό των μυελοδυσπλαστικών συνδρόμων είναι η διακύμανση στο αντιγονικό προφίλ ωρίμανσης των κυττάρων σε σχέση με το φυσιολογικό, γεγονός που αποβαίνει διαγνωστικά χρήσιμο Για παράδειγμα, στη μελέτη μίας σειράς μη επιλεγμένων ασθενών με περιφερική κυτταροπενία 73, η ΚΡ ανέδειξε ευαισθησία 89% και ειδικότητα 88% στη διάγνωση μυελοδυσπλαστικού συνδρόμου, σε σύγκριση με το συνδυασμό μορφολογικών και κυτταρογενετικών δεδομένων. 67 Στη διαγνωστική φαρέτρα αυτής της προσέγγισης περιλαμβάνονται και μυελοδυσπλαστικά με <5% βλάστες, την πιο δύσκολη κατηγορία μυελοδυπλαστικών. Ανοσοφαινοτυπικά, η μη φυσιολογική ωρίμανση της μυελικής ή μονοκυτταρικής σειράς μπορεί να αναγνωριστεί είτε με απρόσφορη έκφραση αντιγόνων 65,67,73,74 (π.χ. των λεμφικών αντιγόνων CD7, CD2, CD5, CD19) είτε με διαφορές (μείωση, αύξηση, μεγαλύτερη ομοιογένεια, ασύγχρονη εμφάνιση ή εξαφάνιση) στην έκφραση αντιγόνων (π.χ. στην ένταση των μυελικών αντιγόνων CD64, CD33, CD16, CD14, CD13, CD11b, CD10 ή των μονοκυταρικών αντιγόνων HLA-DR, CD36, CD33, CD15, CD14, CD13, CD11b). Απαραίτητη, βέβαια, θεωρείται η γνώση της φυσιολογικής διαφοροποίησης στην έκφραση κάθε αντιγόνου σε κάθε στάδιο ωρίμανσης. Για την ουδετεροφιλική σειρά, ένα παθολογικό μοντέλο ωρίμανσης μπορεί να γίνει αντιληπτό σε διάγραμμα CD13/CD16 65,73, όπου φυσιολογικά αναμένουμε σταδιακή αύξηση της έκφρασης του CD16 και αρχική μείωση με μετέπειτα αύξηση του CD13, καθώς επίσης το διάγραμμα ορθογώνιου σκεδασμού (SS) συμβάλλει στην αναγνώριση της υποκοκκίωσης των ουδετεροφίλων, υποδεικνύοντας δυσπλασία στην κοκκιώδη σειρά. Το αξιοσημείωτο που προκύπτει από τις μελέτες που έχουν γίνει είναι ότι απαιτούνται δύο ή περισσότερες παθολογικές εκφράσεις αντιγόνων για τη διάγνωση ενός μυελοδυσπλαστικού. Η απρόσφορη έκφραση μη μυελικών αντιγόνων έχει μεγαλύτερη ισχύ από τη διαφοροποιημένη έκφραση, ενώ η παρουσία πολλαπλών ανωμαλιών έχει μεγαλύτερη προγνωστική αξία από ότι οι μεμονωμένες.. Επίσης, οι ανοσοφαινοτυπικές μεταβολές των MDS φαίνεται να αποτελούν ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη στα άτομα με έλλειψη κυτταρογενετικών ανωμαλιών 75, ενώ η ΚΡ φαίνεται να είναι πιο ευαίσθητη από τη μορφολογία στην εκτίμηση δυσπλαστικής κοκκιώδους σειράς, σε αντίθεση με την ερυθρά και την μεγακαρυοκυτταρική σειρά όπου η μορφολογία υπερέχει 65. Επιπρόσθετα, έχει δειχθεί ότι η έκφραση CD56 στα μονοκύτταρα με ταυτόχρονη υπο-έκφραση δύο μυελικών αντιγονικών δεικτών έχει μεγάλη ειδικότητα στη διάγνωση χρόνιας μυελομονοκυτταρικής λευχαιμίας (CMML), αλλά χαμηλή ευαισθησία. 76 Δυσπλαστικά μορφολογικά χαρακτηριστικά μπορεί να εμφανίζονται και σε έλλειψη B12 ή φυλλικού, σε λοίμωξη, σε τοξική έκθεση, από λήψη φαρμάκων και σε άλλα ανοσολογικώς διαμεσολαβούμενα φαινόμενα. Τα μορφολογικά κριτήρια ταξινόμησης των MDS από τον WHO, βασίζονται στο ποσοστό των βλαστών (<5%, 5%-9%, 10%-19%), στη δυσπλασία πολλαπλών σειρών (επηρεάζοντας >10% των κυττάρων σε 2 ή περισσότερες σειρές) και στους δακτυλιοειδείς σιδηροβλάστες (επηρεάζοντας >15% των προερυθροβλαστών). Παρά το ότι ο ανοσοφαινότυπος χρησιμοποιείται συχνά για την επιβεβαίωση της μορφολογικής δυσπλασίας και την ποσοτικοποίηση των βλαστών και ενώ η μη ανεύρεση κλωνικών ανωμαλιών κυτταρογενετικά δυσχεραίνει τη διάγνωση, η κυτταρομετρία δεν κατέχει πρωτεύοντα ρόλο στην ταξινόμηση των MDS. Στην τελευταία αναφορά του 2006 της Ομάδας Εργασίας επί των MDS, ένας ανώμαλος φαινότυπος προσδιορίζόμενος από την ΚΡ, εντάχθηκε στα ελάσσονα διαγνωστικά κριτήρια των MDS, επί απουσίας μορφολογικής δυσπλασίας ή αυξημένων βλαστών 77. Στην προσπάθεια ποσοτικοποίησης του βαθμού και του εύρους των ανοσοφαινοτυπικών ανωμαλιών, έχει προταθεί ένα σύστημα βαθμολόγησης που συναξιολογεί το ποσοστό των βλαστών και τις ανοσοφαινοτυπικές μεταβολές 66 και εμφανίζει συσχέτιση με το Διεθνή Προγνωστικό Δείκτη Αξιολόγησης (International Prognostic Index) 71 και με την έκβαση μετά από μεταμόσχευση 66 Με τη χρήση του συστήματος βαθμολόγησης και με βάση την απρόσφορη έκφραση αντιγόνων, καθίσταται δυνατή και η διάκριση των νεοπλασιών αυτών από μη-νεοπλασματικές διαταραχές. ΜΥΕΛΟΫΠΕΡΠΛΑΣΤΙΚΑ ΣΥΝΔΡΟΜΑ Παρόμοια με τα μυελοδυσπλαστικά, η διάγνωση στις χρόνιες μυελοϋπερπλαστικές διαταραχές (CMPDs) βασίζεται στο συνδυασμό μορφολογικών, κλινικών και κυτταρογενετικών/ 27

16 Νικόλαος Τσαγκαράκης, Γεώργιος Πατεράκης μοριακών ευρημάτων. 5 Μικρή φαίνεται να είναι η διαγνωστική χρησιμότητα των ανοσοφαινοτυπικών μεταβολών στα CMPDs 78, ενώ δεν υπάρχει μελέτη ευαισθησίας και ειδικότητας. Σύμφωνα με την εμπειρία των Wood et al 73, σπάνιες φαίνεται να είναι οι ανοσοφαινοτυπικές ανωμαλίες στις πρόδρομες και ώριμες μυελομονοκυτταρικές μορφές, στην ιδιοπαθή πολυκυτταραιμία και στην ιδιοπαθή θρομβοκυτταραιμία, χωρίς να έχει μελετηθεί η διαγνωστική χρησιμότητα αντιγονικών ανωμαλιών της ερυθράς ή της μεγακαρυοκυτταρικής σειράς. Παρά τη συχνή έκφραση CD56 στα ωριμάζοντα στοιχεία της κοκκιώδους σειράς στα χρόνια μυελογενή λευχαιμία, η εύρεση της διαμετάθεσης t(9;22) (bcr/abl) (χρωμόσωμα Φιλαδέλφειας), παραμένει ως το βασικό επιβεβαιωτικό διαγνωστικό εύρημα της νόσου. Επίσης, η JAK2 V617 μεταλλαγή είναι χρήσιμη στη διάγνωση πολλών μη-cml μυελοϋπερπλαστικών διαταραχών και η PDGFR-α και -β στην αναγνώριση υπομορφών μυελογενών νεοπλασιών σχετιζόμενων με ηωσινοφιλία. Εναλλακτικά, χρήσιμη φαίνεται να είναι η ΚΡ στην ποσοτική εκτίμηση των αυξημένων ανώμαλων βλαστών στη φάση επιτάχυνσης ή στη βλαστική κρίση, καθώς και στην εκτίμηση της πρόδρομης κυτταρικής σειράς στη βλαστική κρίση, με τις ανάλογες συνέπειες στις θεραπευτικές αποφάσεις. Σύμφωνα με την άποψη του Wood 73, τα λοιπά MDS και τα σύνδρομα επικάλυψης, συμπεριλαμβανομένων της ιδιοπαθούς μυελοϊνωσης, της χρόνιας μυελομονοκυτταρικής λευχαιμίας και των μη τυπικών CMPDs, εμφανίζουν ανοσοφαινοτυπικές ανωμαλίες στις πρόδρομες και τις ωριμάζουσες κυτταρικές μορφές, οπότε και είναι σύντομα πιθανή η διαγνωστική συμβολή της κυτταρομετρίας ροής. ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ ΚΑΙ ΕΛΑΧΙΣΤΗ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΙΚΗ ΝΟΣΟΣ (ΕΥΝ) (Minimal Residual Disease, MRD) Ο ορισμός της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου βασίζεται στη μορφολογία. Το ποσοστό των βλαστών που θεωρείται διαχωριστική τιμή (cut-off) είναι το 5% επί του μυελικού επιχρίσματος (από την βελόνα και όχι στο μυελικό εναιώρημα). Το δείγμα που εξετάζουμε (συνήθως ένα μυελικό εναιώρημα από μία θέση λήψης) δεν είναι κατ ανάγκη αντιπροσωπευτικό ως προς την παρουσία νόοσυ στο μυελό είτε λόγω πρόσμιξης με αίμα είτε λόγω εκλεκτικής απουσίας ορισμένων υποπληθυσμών λόγω σκλήρυνσης ή προσκόλλησης είτε λόγω τμηματικής διήθησης της ίδιας της νόσου. Η βασική αρχή είναι οι άτυπες συνεκφράσεις συνήθως δύο αντιγόνων και πιο πρόσφατα τριών ή τεσσάρων, οι οποίες θεωρούνται ειδικές για λευχαιμικά κύτταρα και απαντώνται σε πολύ μικρά ποσοστά (<0,1%) σε φυσιολογικούς μυελούς, θέτοντας ερωτηματικά που αφορούν, για παράδειγμα, την ετερογένεια στις συνεκφράσεις των λευχαιμικών υποπληθυσμών και τις φαινοτυπικές μεταβολές στην πορεία της νόσου με την επίδραση της θεραπείας. Η ΕΥΝ με ΚΡ δεν είναι ποιοτικός προσδιορισμός αλλά ποσοτικός. Η επικρατέστερη ποσοτικοποίηση της ΕΥΝ είναι εκείνη των δεκαδικών λογαρίθμων (Εικόνα 1). Με απλά λόγια αν η νόσος είναι λχ 1% μιλάμε για επίπεδο 10-2, αν το ποσοστό μας είναι λχ 0,1% έχουμε επίπεδο 10-3, και αντίστοιχα παραδείγματα 0,01% (10-4 ) ή 0,001%(10-5 ). Η έκφραση με δεκαδικούς λογαρίθμους έχει φυσική υπόσταση γιατί μνημονοτεχνικά σχετίζεται αντίστροφα με το φορτίο της νόσου. Κατά τη διάγνωση λχ στην οξεία λευχαιμία με υψηλά ποσοστά διήθησης έχουμε κύτταρα στο σώμα και φορτίο 10 2 στο μυελό. Η πλήρης ύφεση με τη θεραπεία εφόδου και ποσοστό κάτω του 5% ουσιαστικά σημαίνει πτώση του φορτίου κάτω από συνολικά λευχαιμικά κύτταρα, χωρίς όμως αυτό να γίνεται ποσοτικά σαφές. Μπορεί να έχουμε μείωση δύο ή περισσοτέρων λογαρίθμων και η εικόνα της πλήρους ύφεσης με τα κλασικά μορφολογικά μέσα να είναι ταυτόσημη. Για το λόγο αυτό είναι σημαντική η ποσοτικοποίηση της πλήρους υφέσεως και ίσως και ο επαναπροσδιορισμός του ορισμού της ύφεσης με βάση την ΕΥΝ. Δηλαδή δεν μιλάμε πλέον για πλήρη ύφεση αλλά για ύφεση σε επίπεδο λ.χ 3 x10-3 που σημαίνει ότι βρήκαμε λ.χ 0,3% βλάστες με ΚΡ στο μυελό στο τέλος της πρώτης εφόδου. Το δεύτερο στοιχείο που πρέπει να γίνει κατανοητό είναι ότι η προγνωστική αξία που προκύπτει σε επιστημονικές μελέτες αφορά ουσιαστικά διαχωριστικό επίπεδο λογαρίθμου ΕΥΝ παρά απόλυτη διαχωριστική τιμη cut-off. Η διαχωριστική τιμή ΕΥΝ που δίνει ο ερευνητής λχ 3,5 χ10-4 (δηλαδή 0,035%) πιθανόν δίνει καλύτερα στατιστικά αποτελέσματα, αλλά και ένα εύρος άλλων διαχωριστικών τιμών μπορεί να δίνει στατιστικά σημαντικές διαφορές. Τα λογαριθμικά επίπεδα είναι πιο αδρά και καλύτερα κατανοητά ως διαχωριστικά προγνωστικά επίπεδα. Έτσι πολύ συχνά βλέπουμε τη διάκριση προγνωστικών Εικόνα 1. Σύγκριση των μεθόδων ανίχνευσης υπολειμματικής νόσου, ανάλογα με την ευαισθησία της τεχνικής. 28

17 κυτταρομετρικh μελeτη αιματολογικων νοσηματων ομάδων ΕΥΝ λ.χ στην ΟΜΛ σε <0,1% [0,1-1] και >1% δηλαδή κεντρική θέση του επιπέδου 10-3 και προγνωστικές ομάδες μικρότερη ΕΥΝ από 10-3, περί το 10-3 και πάνω από10-3. Τρίτο στοιχείο είναι η αξία όχι μόνο ενός επιπέδου ΕΥΝ έστω και λογαριθμικά εκφρασμένου, αλλά η διαμόρφωση της έννοιας της κινητικής ΕΥΝ. Η παραμονή EYN σε επίπεδο 10-4 σε διαδοχικές μετρήσεις διαφέρει προφανώς από τη μεταπήδηση λογαρίθμων 10-3 σε 10-2, το οποίο πιθανολογεί επικείμενη υποτροπή (impending relapse). Είναι σαφές ότι υποτροπιάζουν ασθενείς με μη ανιχνεύσιμη ΕΥΝ όπως επίσης και ότι ασθενείς σε επίπεδα 10-4 μένουν σταθεροί. Αλλά η σημασία της κινητικής της ΕΥΝ είναι να ανιχνεύσει έγκαιρα ένα λευχαιμικό κύτταρο με δυναμικό ανάκαμψης. Αυτό όμως σημαίνει συχνές δειγματοληψίες μυελού, σε ταλαιπωρημένους ασθενείς, σε φάσεις ελεύθερες νόσου μετά τη θεραπεία. Το επίπεδο συνεπώς της νόσου στο αίμα σε σχέση με το μυελό αποκτά ιδιαίτερη αξία στις περιπτώσεις αυτές. Γενικά φαίνεται ότι στην Β-ΟΛΛ στο μυελό έχουμε ΕΥΝ ένα λογάριθμο υψηλότερο σε σχέση με το αίμα κάτι που δε είναι τόσο σαφές στην Τ-ΟΛΛ. Επίσης στην Β-ΧΛΛ η χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων καθιστά στη φάση της θεραπείας το επίπεδο στο αίμα αρνητικό και αναξιόπιστο σε σχέση με το μυελό, ενώ δεν ισχύει το ίδιο στις περιπτώσεις πέραν του τριμήνου θεραπείας, όπου αίμα και μυελός φαίνονται ισοδύναμα ως προς το φορτίο ΕΥΝ. Η αντιπροσωπευτικότητα του δείγματος του μυελού για την ποσοτικοποίηση του υπολειμματικού φορτίου σε ειδικές περιπτώσεις βάζει αμφιβολίες, όπως πιθανόν στην παραδοκιδώδη διήθηση μη Hodgkin B λεμφωμάτων. Σε αυτές τις περιπτώσεις, θα πρέπει να τονιστεί η θέση της οστεομυελικής βιοψίας ως μέθοδος αναφοράς και ο αιματολόγος να έχει κριτική θέση προς τα αποτελέσματα της ΚΡ. Η B και Τ οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία (Β-ΟΛΛ και Τ- ΟΛΛ) αποτελούν το κυριότερο πεδίο εφαρμογής της ΚΡ στην εκτίμηση της ΕΥΝ. Η οξεία μυελογενής λευχαιμία (ΟΜΛ) εμφανίζεται στη βιβλιογραφία σε αρκετές κλινικές μελέτες ΕΥΝ με ΚΡ, στην πράξη όμως δημιουργεί και τις περισσότερες δυσκολίες. Η Β χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (B-ΧΛΛ) πρόσφατα έγινε πεδίο κυτταρομετρικής εφαρμογής ΕΥΝ με εκτεταμένο κλινικό ενδιαφέρον. Άλλα λεμφοϋπερπλαστικά νοσήματα που εφαρμόζεται ΚΡ στην ΕΥΝ είναι η λευχαιμία από τριχωτά κύτταρα, τα Β μη Hodgkin λεμφώματα και το πολλαπλούν μυέλωμα. Υπάρχουν γενικά στοιχεία που αφορούν την κυτταρομετρική μελέτη της ΕΥΝ όλων των ανωτέρω νοσημάτων, αλλά υπάρχουν και ιδιαιτερότητες για κάθε ένα από αυτά, στις οποίες θα αναφερθούμε χωριστά. Οξεiα Β-Λεμφοβλαστικh Λευχαιμiα Αποτελεί το καλύτερα μελετημένο νόσημα για την εφαρμογή της ΚΡ στην ΕΥΝ. Την περασμένη δεκαετία μπήκαν οι βάσεις της εμπεριστατωμένης μελέτης των φυσιολογικών προδρόμων Β αιμοποιητικών κυττάρων στο μυελό (αιματογονίων), αρχικά στα παιδιά και στη συνέχεια και στους ενήλικες. Αποτέλεσμα ήταν να σχεδιαστούν ικανοποιητικές στρατηγικές και να γίνει ικανοποιητική ποσοτικοποίηση του φορτίου της νόσου. Οι δυνατότητες αυτές κατέστησαν δυνατή την εφαρμογή της ΚΡ στις πρώτες κλινικές μελέτες, όπου σε συνδυασμό με τεχνικές PCR, φάνηκε ότι δεν εμφανίζει σημαντικές διαφωνίες 79-83, είναι ευκολότερο να εφαρμοστεί στην πράξη και έχει μικρότερο κόστος. H εφαρμογή σε κλινικές μελέτες αρχικά στα παιδιά και μετά στους ενήλικες οδήγησε στα πρώτα συμπεράσματα σχετικά με την κλινική της σημασία. Κατ αρχάς, η εφαρμογή της είναι δυνατή πρακτικά σε όλες τις Β-ΟΛΛ από πρόδρομα κύτταρα, ενώ έχουν σημασία οι χρονικές στιγμές που εφαρμόζονται οι μετρήσεις ανάλογα με το πρωτόκολλο, για να αξιολογηθεί η σημασία του φορτίου της ΕΥΝ. Γενικά η παραμονή ΕΥΝ μετά το τέλος της εφόδου στη φάση εδραίωσης είναι ισοδύναμο προογνωστικό σημείο της υποτροπής κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Η ανεύρεση ΕΥΝ στην διάρκεια της εφόδου δεν έχει την ίδια δυσμενή προγνωστική σημασία με την μορφολογική ανίχνευση νόσου κατά τις ίδιες φάσεις (πρβλ. πτωχούς απαντητές), ούτε φαίνεται να είναι προγνωστικά ταυτόσημη, οπότε ακόμη και να υπάρχει ΕΥΝ στο τέλος της εφόδου δεν σημαίνει πρόγνωση απώτερης υποτροπής αν μηδενιστεί στη συνέχεια. Συχνά ανιχνεύουμε στην έφοδο αποπτωτικά κύτταρα με ανοσοφαινοτυπικές μεταβολές που αποδίδονται στη δράση της θεραπείας και μάλιστα των κορτικοειδών Ακόμα, μπορεί να έχουμε όψιμες υποτροπές με αρνητική ΕΥΝ στις φάσεις της θεραπείας, λόγω ανάκαμψης κλωνογενών λευχαιμικών κυττάρων. Στις περιπτώσεις αυτές η ανίχνευση ΕΥΝ σημαίνει ανάκαμψη σε χρονικό διάστημα, το οποίο μπορεί να είναι μερικοί μήνες και να δώσει την ευκαιρία αναζήτησης συμβατών κυττάρων για αλλογενή μεταμόσχευση. Παράλληλα, το φορτίο της νόσου πριν και μετά τη μεταμόσχευση μπορεί να αξιολογηθεί με ακρίβεια και να μελετηθεί η προγνωστική του αξία. Οσον αφορά τα φυσιολογικά πρόδρομα κύτταρα (αιματογόνια), όταν είναι αυξημένα, ειδικά στη φάση εξόδου από την θεραπευτική υποπλασία, εύκολα διακρίνονται με ΚΡ, ενώ μορφολογικά δημιουργούν αμφιβολία και προβληματισμό. Συμπερασματικά, η ΚΡ αποτελεί μέθοδο εκλογής στην μελέτη της ΕΥΝ στην Β-ΟΛΛ, εφαρμόζεται με ακρίβεια, σχετική τυποποίηση και υπάρχει ικανή εμπειρία σε επίπεδο κέντρων αναφοράς. Θα πρέπει να τονιστεί, όμως, ότι η προγνωστική αξία των ευρημάτων της ΕΥΝ μπορεί να αλλάξει με την εφαρμογή πιο εντατικοποιημένων θεραπευτικών πρωτοκόλλων και δε πρέπει να αξιολογείται ή να μεταφέρεται από μια ερευνητική μελέτη στην άλλη γιατί δεν είναι ισοδύναμες. 29

18 Νικόλαος Τσαγκαράκης, Γεώργιος Πατεράκης Οξεiα Τ-Λεμφοβλαστικh Λευχαιμiα Ισχύουν όσα αναφέρθηκαν στην Β-ΟΛΛ. Επί πλέον δεν υπάρχουν φυσιολογικά πρόδρομα Τ ανάλογα με τα αιματογόνια στο μυελό αλλά στο θύμο. Απαιτείται εν τούτοις προσοχή στα κατωτέρω στοιχεία στρατηγικών. Πολλά ΝΚ κύτταρα έχουν LAP φαινοτύπους και αν η στρατηγική δεν περιέχει ενδοκυττάριο CD3 εγκυμονεί κινδύνους. Η συνέκφραση Tdt/CD3 ή CD7 μπορεί να υπάρξει σε φυσιολογικό αίμα και σπανιότερα μυελό σε επίπεδο 10-4 και να δημιουργήσει ψευδώς θετικά αποτελέσματα 87. Η έκφραση Tdt είναι κατά κανόνα στην Τ-ΟΛΛ είναι ασθενέστερη από εκείνη της Β-ΟΛΛ και δεν προσφέρεται παρά για μερική εκτίμηση του φορτίου της νόσου. Η εισαγωγή από τον Dworzak του CD99 εμφανίζει καλύτερα αποτελέσματα. Η κλινική εμπειρία στην Τ-ΟΛΛ είναι μικρότερη από εκείνη της Β λόγω της σπανιότητας της νόσου και απαιτούνται συνεργατικά κλινικά πρωτόκολλα για τη διευκρίνιση της κλινικής σημασίας της ανίχνευσης ΕΥΝ με ΚΡ ώστε να τροποποιηθούν κλινικές αποφάσεις 88. Οξεiα Μυελογενhς Λευχαιμiα Η ΟΜΛ εμφανίζει τους περισσότερους περιορισμούς στην ανίχνευση ΕΥΝ με ΚΡ. Στις περισσότερες δημοσιεύσεις τα πρωτόκολλα LAP αριθμούν τριχρωμίες Η ποσοτικοποίηση του φορτίου της ΕΥΝ είναι προσεγγιστική λόγω των μερικών εκφράσεων, και τα επίπεδα «φυσιολογικών» πληθυσμών με LAP, χαρακτηριστικά δεν είναι σαφές αν είναι σε επίπεδο 10-3 ή και υψηλότερα. Όσο συγκεντρώνεται γνώση για την φυσιολογική ωρίμανση της μυελικής και μονοκυτταρικής σειράς στο μυελό, η ανίχνευση ΕΥΝ στην ΟΜΛ αναμένεται να τελειοποιηθεί. Ο αιματολόγος όμως προς το παρόν πρέπει να είναι ενήμερος για τους περιορισμούς της ΚΡ και τουλάχιστον να μη θεωρεί ισοδύναμη τη δυνατότητα της ΚΡ ΕΥΝ στην ΟΛΛ και την ΟΜΛ. Οι κλινικές μελέτες είναι δυσανάλογα πολλές ανάλογα με την ασφάλεια των κυτταρομετρικών στρατηγικών και τα αποτελέσματα σε πολλές περιπτώσεις αντιφατικά. Η παρουσία ΕΥΝ στην t(8;21) φαίνεται ότι δεν έχει απόλυτη προγνωστική αξία και ότι μάλλον διαφοροποιούνται υπολειμματικά κύτταρα 96. Στην πρόσφατη μελέτη BFM στα παιδιά δεν βρέθηκε ανεξάρτητη προγνωστική αξία της ΕΥΝ σε σχέση με του κλασικούς προγνωστικούς παράγοντες 97. Αντίθετα μια σειρά παλαιότερων μελετών σε ενήλικες εντοπίζει προγνωστική αξία πριν την θεραπεία εδραίωσης 89-95,98. Τα διαχωριστικά επίπεδα ΕΝΥ με προγνωστική αξία διαφέρουν σε απόλυτες τιμές μεταξύ μελετών αλλά φαίνεται ότι κυμαίνονται περί το Η τελειοποίηση της ΚΡ στρατηγικής αναμένεται να επηρεάσει και τα αποτελέσματα των μελλοντικών κλινικών μελετών. Β-Χρονiα Λεμφοκυτταρικh Λευχαιμiα Η πιθανή εκρίζωση της νόσου με τις νεότερες θεραπείες και η συσχέτιση με μεγαλύτερη επιβίωση, δημιούργησε την ανάγκη σχετικά πρόσφατα για την ανίχνευση ΕΥΝ 99. Η ΚΡ φαίνεται να ανταποκρίνεται με επιτυχία στο δεδομένο στόχο, συμφωνεί γενικά με τις τεχνικές PCR, είναι ταχύτερη και φθηνότερη Η ευαισθησία της τοποθετείται σε επίπεδο Οι στρατηγικές που βασίζονταν στην μελέτη των Β λεμφοκυττάρων με έκφραση CD5 δεν φαίνεται να είναι ικανοποιητικές στο μέτρο που πολλά από τα CD5+ Β λεμφοκύτταρα κατά την ύφεση της νόσου είναι αντιδραστικά και πολυκλωνικά. Η πολυχρωματική κυτταρομετρία έδωσε τη δυνατότητα καλύτερης στρατηγικής με περιορισμένο αριθμό τεραπλών ή πενταπλών συνδυασμών, με στόχο τη διάκριση μεταξύ των Β κυττάρων της νόσου και των φυσιολογικών 102. Ειδικότερα όταν εξετάζεται μυελικό εναιώρημα υφίσταται πρόβλημα διάκρισης και από τα αιματογόνια. Πρόσφατα δημοσιεύτηκαν τα πρώτα αποτελέσματα της τυποποιημένης προσέγγισης διεθνούς συνεργατικής μελέτης με βάση την στρατηγική που αρχικά προτάθηκε και αξιολογήθηκε από τον Rawstron και συν 102. Η ποσοτικοποίηση γίνεται με βάση τα μετρικά γεγονότα του ολικού Β στοιχείου όπως εκτιμάται με το CD19 ως προς τα γεγονότα των λευκών με το CD45. Τo άθροισμα της ΕΥΝ ανιχνεύεται με βάση τις διαφορετικές εκφράσει συνδυασμών που περιέχουν τα CD5/CD19, CD20/CD38, CD79b/CD43. Ο ρόλος της κλωνικότητας με τον λόγο κ/λ αναφέρεται ότι χρησιμοποιείται αλλά έρχεται σε δεύτερη προτεραιότητα. Η μελέτη του αίματος φάνηκε πρακτικά ισοδύναμη με εκείνη του μυελικού εναιωρήματος πλην της εξαίρεσης που ήδη αναφέραμε (δηλαδή δεν είναι κατάλληλο για έλεγχο της ανταπόκρισης στην πρόσφατη θεραπεία με μονοκλωνικά αντισώματα CD52 ή CD20). Τα μετρικά γεγονότα του αθροίσματος της ΕΥΝ που απαιτούνται είναι και απαιτούν μέτρηση 5 x 10 5 μετρικών γεγονότων ολικών κυττάρων (~5 λεπτά ανά συνδυασμό και λεπτά περίπου ανά δείγμα). Τα πιθανά μειονεκτήματα της στρατηγικής αφορούν Β-ΧΛΛ μέ άτυπο φαινότυπο (έντονο CD20 και CD79b, ασθενές CD23 και CD43). Στην περίπτωση αυτή ο φαινότυπος της διάγνωσης μπορεί να βοηθήσει στην ανάπτυξη εξειδικευμένης στρατηγικής. Η χρήση της ΚΡ στην ΕΥΝ μετά την αυτόλογη ή αλλογενή μεταμόσχευση στην Β-ΧΛΛ έγινε σε συνδυασμό με δύο μοριακές τεχνικές PCR με διαφορετική βάση: 1) την τεχνική με σύνθεση εξειδικευμένων εκκινητών μετά από αλληλουχία του γονιδίου CDR3 IGV H και ποσοτική μέθοδο πραγματικού χρόνου (real-time) 2) την χρήση γενικών εκκινητών της περιοχής FR3 με στόχο την ανίχνευση μονοκλωνικότητας εν γένει χωρίς ποσοτικοποίηση. H ΚΡ και η ποσοτική PCR φάνηκαν ακριβέστερες της ποιοτικής PCR στην ανίχνευση ΕΥΝ. Είναι ενδιαφέ- 30

19 κυτταρομετρικh μελeτη αιματολογικων νοσηματων ρον ότι η προγνωστική αξία πρόβλεψης της υποτροπής όταν ανιχνευόταν ΕΥΝ μετά τη μεταμόσχευση, αφορούσε την αυτόλογη και όχι την αλλογενή μεταμόσχευση 101. aλλα αιματολογικa νοσhματα στα οποiα η ΚΡ eχει χρησιμοποιηθεi για την ανiχνευση ΕΥΝ σε κλινικeς μελeτες Η λευχαιμία από τριχωτά κύτταρα (ΛΤΚ) έχει υψηλή ολική επιβίωση στα 10 χρόνια (70-90%). Με τo ερώτημα αν είναι εφικτή εκρίζωση της νόσου όπως και στην Β-ΧΛΛ η οποία πιθανόν να έχει σχέση μειωμένη πιθανότητα υποτροπής της νόσου και θεραπεία με μονοκλωνικό αντι CD20, χρησιμοποιήθηκε ΚΡ για την ανίχνευση ΕΥΝ. Κατά τη διαμόρφωση της στρατηγικής ενδιαφέρον εύρημα ήταν η ανεύρεση σε φυιολογικούς μυελούς μάρτυρες B υποπληθυσμού με έντονη έκφραση CD11c και CD22. Αντίθετα η χρήση του ειδικότερου αντιγόνου CD103 φάνηκε πιο κατάλληλη με «φυσιολογικό» επίπεδο 10-4, το οποίο ήταν και το όριο ευαισθησίας. Η εκρίζωση της νόσου στο επίπεδο αυτό διαπιστώθηκε σε 12 από 13 ασθενείς με θεραπευτική αγωγή Cladribin και Rituximab 103. Η ομάδα Catovsky μελέτησε μη Hodgkin B λεμφώματα (B-NHL) και Β-ΧΛΛ με ΚΡ και οστεομυελική βιοψία (ΟΜΒ) 104. Ενώ στην Β-ΧΛΛ η ΚΡ έδειξε μεγαλύτερη ευαισθησία από την ΟΜΒ, στα Β-NHL συνέβη το αντίθετο. Στο 13% των θετικών ΟΜΒ δεν ανιχνεύτηκε νόσος με ΚΡ. Η ερμηνεία που δόθηκε αφορά πιθανή πτωχή αποκόλληση των λεμφωματικών κυττάρων με παραδοκιδώδη διήθηση. Βέβαια οι ερευνητές χρησιμοποίησαν απλή διχρωμία. Αλλη συγκριτική μελέτη Guggan και συν. 105, με τριχρωμία έδειξε ότι η ΚΡ είχε μεγαλύτερη ευαισθησία από την μορφολογία στις περιπτώσεις με μικρή διήθηση. Το μήνυμα προς τον αιματολόγο είναι ότι στα B-NHL δεν πρέπει να θεωρηθεί προς το παρόν ισοδύναμη η δοκιμασία ανίχνευσης νόσου με ΚΡ με την διενέργεια ΟΜΒ, μέχρι να διευκρινιστεί αν επιδρά ο τρόπος δειγματοληψίας ή το είδος της στρατηγικής. Τέλος στο πολλαπλούν μυελωμα (ΠΜ), μετά τη διαμόρφωση αυστηρών κριτηρίων πλήρους υφέσεως από την EBMΤ, εφαρμόστηκε στρατηγική ανίχνευσης ΕΥΝ με στόχο την διάκριση παθολογικών και φυσιολογικών πλασματοκυττάρων και επίπεδο ευαισθησίας Η ποσοτική PCR με σύνθεση εξειδικευμένων εκκινητών μετά από αλληλουχία του γονιδίου CDR3 ήταν εφικτή για τεχνικούς λόγους στο 75% των ασθενών ενώ η ΚΡ στο 90%. Τα πλεονεκτήματα σε χρόνο και κόστος έχουν ήδη αναφερθεί. Συνεπώς και στο ΠΜ συντρέχουν λόγοι να χρησιμοποιηθεί ΚΡ σε κλινικές μελέτες ως μέθοδος ανίχνευσης ΕΥΝ 106. Στον Πίνακα 5 παραθέτουμε την σύγκριση των μεθόδων ανίχνευσης υπολειμματικής νόσου, ανάλογα με το αιματολογικό νόσημα που μελετάται. ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ ΚΑΙ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΕΣ ΑΠΟΦΑΣΕΙΣ Η κυτταρομετρία ροής παρέχει πληροφορίες που βοηθούν στη λήψη θεραπευτικών αποφάσεων. Σε επιθετικά λεμφώματα, η εξέταση ENY, ακόμα και σε απουσία συμπτωμάτων, όχι μόνο προσφέρει προγνωστικές πληροφορίες, αλλά και αποβαίνει χρήσιμη στη λήψη αποφάσεων χημειοπροφύλαξης του ΚΝΣ 6. Με την κυτταρομετρία ροής ανιχνεύονται πιθανοί θεραπευτικοί στόχοι, όπως το CD52 ή το CD20 για θεραπεία με Campath/Alemtuzumab ή Rituxan/Mabthera, αντίστοιχα. Παράλληλα, με την κυτταρομετρία επιτυγχάνεται με μεγάλη ευ- Πίνακας 5. Σύγκριση των μεθόδων ανίχνευσης υπολειμματικής νόσου, ανάλογα με το αιματολογικό νόσημα που μελετάται Πόσο πληροφοριακή είναι η τεχνική ανάλογα με το είδος της λευχαιμίας ΤΕΧΝΙΚΕΣ Ταχύτητα Ευαισθησία ΟΛΛ ΟΜΛ ΧΛΛ ΧΜΛ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ <1 ημέρα ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ 1-2 ημέρες ΚΥΤΤΑΡΟΓΕΝΕΤΙΚΗ 2-3 εβδ ± FISH 2-3 ημέρες ± RQ-PCR υβριδικά μετάγραφα 2-3 ημέρες RQ-PCR των Ig/TCR κλωνοειδικών αλληλουχιών JJM van Dongen ISLH Amsterdam 2006, τροποποιημένο 3-7 ημέρες

20 Νικόλαος Τσαγκαράκης, Γεώργιος Πατεράκης αισθησία η εκτίμηση ανταπόκρισης σε κάποιο θεραπευτικό σχήμα (π.χ. με την ανίχνευση ελαχίστης υπολειμματικής νόσου). Η ανοσοφαινοτυπική έκφραση CD33 αποτελεί, επίσης, χρήσιμο εργαλείο για την απόφαση θεραπευτικής χορήγησης Mylotarg/Gemtuzumab/Ozogamicin 107. Να σημειωθεί ότι η πρόσφατη χορήγηση αντισώματος σε ασθενή μπορεί να έχει ως συνέπεια την αδυναμία ανίχνευσης των αντίστοιχου επιτόπου, λόγω ανταγωνιστικής επικάλυψης, με ΚΡ και να οδηγήσει σε πιθανή υποεκτίμηση υπολειμματικής νόσου. Συμπερασματικά, η ΚΡ μπορεί να αποτελέσει, όχι μόνο δοκιμασία επιβεβαίωσης υποτροπής, ομαλής εξέλιξης ή εκτροπής της νόσου, αλλά και βοηθητικό μέσο στη λήψη θεραπευτικών αποφάσεων. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Shapiro M. Howard. Practical Flow Cytometry. Third Edition, Willey-Liss, Riley S. Rogers. Flow Cytometry and its applications in Hematology and Oncology. Hematology / Oncology Clinics of North America, Λαουτάρης Ν, Πατεράκης Γ, Βοργιάς Ν. Λευχαιμίες, εκδ. Cantrel, Wood B. 9-color and 10-color flow cytometry in the clinical laboratory. Arch Pathol Lab Med. 2006;130: Jaffe ES, Harris NL, Stein H, W. VJ. Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. World Health Organization Classification of Tumours. Lyon, France: IARC Press; Stetler-Stevenson M, Davis B, Wood B, Braylan R Bethesda International Consensus Conference on Flow Cytometry Immunophenotyping of Hematolymphoid Neoplasia. Cytometry B Clin Cytom 2007; 72B: S3. 7. Davis BH, Holden JT, Bene MC, et al Bethesda International Consensus recommendations on the flow cytometric immunophenotypic analysis of hematolymphoid neoplasia: medical indications. Cytometry B Clin Cytom 2007; 72B: S5-S Wood BL, Arroz M, Barnett D, et al Bethesda International Consensus recommendations on the immunophneotypic analysis of hematolymphoid neoplasia by flow cytometry: optimal reagents and reporting for the flow cytometric diagnosis of hematopoietic neoplasia. Cytometry B Clin Cytom 2007; 72B: S14-S Bhargava P, Kallakury BV, Ross JS, Azumi N, Bagg A. CD79a is heterogeneously expressed in neoplastic and normal myeloid precursors and megakaryocytes in an antibody clonedependent manner. Am J Clin Pathol. 2007; 128: Digiuseppe JA. Acute lymphoblastic leukemia: diagnosis and detection of minimal residual disease following therapy. Clin Lab Med. 2007; 27: Krasinskas AM, Wasik MA, Kamoun M, Schretzenmair R, Moore J, Salhany KE. The usefulness of CD64, other monocyte-associated antigens, and CD45 gating in the subclassification of acute myeloid leukemias with monocytic differentiation. Am J Clin Pathol 1998; 110: Kussick SJ, Stirewalt DL, Yi HS, et al. A distinctive nuclear morphology in acute myeloid leukemia is strongly associated with loss of HLA-DR expression and FLT3 internal tandem duplication. Leukemia 2004;18: Borowitz MJ, Hunger SP, Carroll AJ, et al. Predictability of the t(1;19)(q23;p13) from surface antigen phenotype: implications for screening cases of childhood acute lymphoblastic leukemia for molecular analysis: a Pediatric Oncology Group study. Blood 1993; 82: Arber DA. Realistic pathologic classification of acute myeloid leukemias. Am J Clin Pathol 2001;115: C. Darrell Jennings, Kenneth A. Foon Recent Advances in Flow Cytometry: Application to the Diagnosis of Hematologic Malignancy Blood, Vol 90, No 8 (October 15), 1997:pp Γ. Πατεράκης. Κυτταρομετρία ροής, μια τεχνολογία με καθημερινές κλινικές εφαρμογές. Σεμινάριο Καθημερινές εφαρμογές των σύγχρονων εργαστηριακών εξελίξεων. Ετήσιο 28ο Πανελλήνιο Ιατρικό Συνέδριο, Cornfield, B., Mitchell, D.M., Rimsza, L.M., Moller-Patti, D. & Braylan, RC. (2001). The diagnosis of hairy cell leukemia can be established by flow cytometric analysis of peripheral blood, even in patients with low levels of circulating malignant cells. American Journal of Hematology 67, Lima, M., Almeida, J, Santos, AH. et al (2001). Immunophenotypic Analysis of the TCR-V repertoire in 98 persistent expansions of CD3+/TCR large granular lymphocytes. American Journal of Pathology 159, DiGiuseppe JA, B.M.. Clinical utility of flow cytometry in the chronic lymphoid leukemias. Semin Oncol 1998; 25: Hegde, U., Filie, A., Little, R.F., Janik, J.E., Grant, N., Steinberg, S.M., Dunleavy, K., Jaffe, E.S., Abati, A., Stetler-Stevenson, M.,& Wilson, W.H. High Incidence of Occult Leptomeningeal Disease Detected by Flow Cytometry in Aggressive B-Cell Lymphomas at Risk of Central Nervous System Involvement: The Role of Flow Cytometry versus Cytology. Blood 2005; 105: Shirai T, Hirose S, Okada T, et al. CD5+ B cells in autoimmune disease and lymphoid malignancy. Clin Immunol Immunopathol 1991; 59: Rawstron AC, Green MJ, Kuzmicki A, et al. Monoclonal B lymphocytes with the characteristics of indolent chronic lymphocytic leukemia are present in 3.5% of adults with normal blood counts. Blood 2002; 100: Remstein ED, Dogan A, Einerson RR, et al. The incidence and anatomic site specificity of chromosomal translocations in primary extranodal marginal zone B-cell lymphoma of mucosa- associated lymphoid tissue (MALT lymphoma) in North America. Am J Surg Pathol 2006; 30: Lin P, Medeiros LJ. Lymphoplasmacytic lymphoma/waldenstrom macroglobulinemia: an evolving concept. Adv Anat Pathol 2005; 12: Hunter ZR, Branagan AR, Manning R, et al. CD5, CD10, and CD23 expression in Waldenstrom s macroglobulinemia. Clinical Lymphoma 2005; 5: Yamaguchi M, Seto M, Okamoto M, et al. De novo CD5+ diffuse large B-cell lymphoma: a clinicopathologic study of 109 patients. Blood 2002; 99: