Οξεία Λεμφοβλαστική Λευχαιμία και υπολειμματική νόσος. Από τις κατευθυντήριες οδηγίες στην ελληνική πραγματικότητα Μαριάννα Ν.

Transcript

1 Οξεία Λεμφοβλαστική Λευχαιμία και υπολειμματική νόσος. Από τις κατευθυντήριες οδηγίες στην ελληνική πραγματικότητα Μαριάννα Ν. Τζανουδάκη Είναι πλέον κοινός τόπος το ότι η κυτταρομετρία ροής αποτελεί πολύτιμο εργαλείο στη μελέτη της οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας. Οι τελευταίες κατευθυντήριες οδηγίες που έχουν εκδοθεί από διαφόρους φορείς και ομάδες εργασίας βασίζονται στην ταξινόμηση της WHO του 2008 για τις αιματολογικές νεοπλασίες και έχουν ως στόχους: (1) την ανίχνευση παθολογικών βλαστικών πληθυσμών, (2) τη σαφή διάκρισή τους από τις φυσιολογικές προγονικές μορφές, (3) της ταυτοποίηση της κυτταρικής σειράς των βλαστών και την ταξινόμησή τους, (4) την ανεύρεση σχετιζόμενων με τη λευχαιμία ανοσοφαινοτυπικών χαρακτηριστικών (LAPs), με σκοπό τη μελλοντική διευκόλυνση της μελέτης της υπολειμματικής νόσου (MRD) και, τέλος, (5) τη μελέτη ορισμένων δεικτών με προγνωστική σημασία ή με συσχετίσεις με συγκεκριμένες μοριακές βλάβες. Κατά τη διάγνωση, προτείνεται η χρήση αρχικά ενός γενικού διερευνητικού πρωτοκόλλου, για τον καθορισμό της κυτταρικής σειράς των βλαστών, τα αποτελέσματα του οποίου υπαγορεύουν το εξειδικευμένο πρωτόκολλο που θα ακολουθηθεί. Όσον αφορά τη Β-ΟΛΛ, ορισμένοι προτεινόμενοι δείκτες, επιπλέον του παντού απαραίτητου CD45, είναι: CD19, CD10, CD22, CD79α, (καθορισμός σειράς, ταξινόμηση), CD34, CD20, cigm, cκ, cλ, ctdt (ταξινόμηση, ανεύρεση LAPs), CD38, CD58, CD9, CD123, CD13, CD33, CD81, CD24 (ανεύρεση επιπλέον LAPs), CD66 (συσχέτιση με bcr abl). Όσον αφορά την Τ-ΟΛΛ προτείνεται αντίστοιχα η χρήση των ccd3 (ε-αλυσίδα, καθορισμός σειράς), CD7, CD2, CD5, CD1α, CD4, CD8, scd3 (ταξινόμηση, ανεύρεση LAPs), ctdt, CD99, CD13 (αναγνώριση Τ-βλαστών, ανεύρεση επιπλέον LAPs). Η σημασία της μελέτης της MRD έχει πλέον αναβαθμιστεί, δεδομένου ότι, θεωρούμενη ως παράγοντας κινδύνου, χρησιμοποιείται στη λήψη θεραπευτικών αποφάσεων. Η αναγνώριση των LAPs κατά τη διάγνωση, σε συνδυασμό με τη γνώση των ανοσοφαινοτυπικών χαρακτηριστικών των φυσιολογικών προγονικών κυττάρων, είναι σημαντικά εργαλεία στη μέτρησή της. Όμως, το γεγονός ότι, τόσο στα βλαστικά, όσο και στα φυσιολογικά κύτταρα, η έκφραση ορισμένων δεικτών τροποποιείται με τα χημειοθεραπευτικά σχήματα θα πρέπει να λαμβάνεται σοβαρά υπόψη. Η μελέτη της MRD της Β-ΟΛΛ είναι καλύτερα μελετημένη και, παρόλη την αύξηση των προγονικών μορφών της Β-σειράς κατά την ανάπλαση του μυελού, ιδίως στα παιδιά, είναι σε γενικές γραμμές ευχερέστερη από εκείνη της Τ-ΟΛΛ Πολλά από τα διεθνή κατευθυντήρια πρωτόκολλα απαιτούν τη χρήση 8χρωμίας και προτείνουν την εφαρμογή ειδικών λογισμικών συστημάτων. Στον ελληνικό χώρο, όπου γίνεται χρήση κυρίως 4-5χρωμίας, αυτό είναι προς το παρόν ανέφικτο, και η μελέτη όλων των προτεινόμενων συνδυασμών δεικτών έχει, έτσι, υψηλό κόστος. Η σταδιακή μελέτη των δειγμάτων κατά τη διάγνωση (αν και χρονοβόρα) θα μπορούσε να μειώσει τον όγκο των χρησιμοποιούμενων αντιδραστηρίων. Επίσης, κατά τη μελέτη της MRD, η χρήση πρωτοκόλλων ειδικών για τον παθολογικό φαινότυπο της συγκεκριμένης διάγνωσης θα μπορούσε να περιορίσει το φάσμα των απαιτούμενων δεικτών. Όμως, παρά την επιβαλλόμενη από τις

2 σημερινές συνθήκες μείωση των διαθέσιμων αντιδραστηρίων, δεν θα πρέπει να ξεχνά κανείς ότι η εξ αρχής ορθή αντιμετώπιση ενός ασθενούς είναι ιδιαίτερα σημαντική και ότι η προσφυγή σε ενδιάμεσες λύσεις ανάγκης τελικά, μπορεί να είναι και οικονομικά ασύμφορη.

3 ΑΠΟ ΤΙΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΤΗΡΙΕΣ ΟΔΗΓΙΕΣ ΣΤΗΝ ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΟΤΗΤΑ ΟΞΕΙΑ ΜΥΕΛΟΓΕΝΗΣ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ ΚΑΙ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΙΚΗ ΝΟΣΟΣ Δημητρακοπούλου Λίλα Επιμ.Α Τμήμα Ανοσολογίας-Ιστοσυμβατότητας Γ.Ν.Α «Λαϊκό» Εισαγωγή Η Οξεία Μυελογενής Λευχαιμία (ΟΜΛ) είναι μια κλωνική διαταραχή του προγονικού αιμοποιητικού κυττάρου (HSC) που χαρακτηρίζεται απο την επικράτηση άωρων κυττάρων με ελάχιστη ή καμμία ικανότητα ωρίμανσης. Η γενετική βλάβη μπορεί να συμβεί είτε στο επίπεδο του δεσμευμένου προς μια συγκεκριμένη κυτταρική σειρά κυττάρου (lineage commited) είτε στο επίπεδο του πολυδύναμου κυττάρου που μπορεί να διαφοροποιηθεί σε κύτταρο της μυελικής, μονοκυτταρικής, ερυθράς, μεγακαρυοκυτταρικής σειράς (multipotent stem cell) Η ΟΜΛ μπορεί να εμφανιστεί σε άτομα κάθε ηλικίας αλλά είναι πιο συχνή στους ενήλικες: 70-80% των περιπτώσεων οξείας λευχαιμίας στους ενήλικες είναι ΟΜΛ και η επίπτωση της αυξάνει με την ηλικία. Χαρακτηρίζεται από βιολογική, ανοσοφαινοτυπική, κυτταρογενετική και μοριακή ετερογένεια. Η τεράστια εξέλιξη των διαγνωστικών μεθόδων τα τελευταία χρόνια είχε σαν αποτέλεσμα την λεπτομερέστερη κατανόηση των μηχανισμών που οδηγούν στην λευχαιμογένεση. Σήμερα είναι αποδεκτό ότι οι γενετικές διαταραχές που οδηγούν σε λευχαιμία δεν είναι μόνο ετερογενείς αλλά και σύνθετες και ότι συνήθως πολλαπλές και διαδοχικές μεταλλάξεις είναι υπεύθυνες για έναν συγκεκριμένο λευχαιμικό φαινότυπο. Πειραματικά δεδομένα δείχνουν ότι σε πολλές περιπτώσεις αν και ανιχνεύονται αναδιατάξεις γόνων ( όπως RUNX1, CBFB, RARA) που κωδικοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες υπεύθυνους για την αναστολή της φυσιολογικής μυελικής ωρίμανσης, είναι απαραίτητη και μια δεύτερη γενετική ανωμαλία (FLT3, KIT κλπ) για να επάγει τον πολ/σμό και την επιβίωση του παθολογικού κλώνου. Στη 3 η έκδοση της κατάταξης WHO, 2001 για πρώτη φορά ενσωματώθηκαν γενετικές πληροφορίες σε συνδυασμό με μορφολογικές, κυτταροχημικές, ανοσοφαινοτυπικές και κλινικές πληροφορίες σε διαγνωστικούς αλγόριθμους για τα νεοπλάσματα μυελικής προέλευσης, ενώ στην 4 η έκδοση της κατάταξης WHO το 2008, διευρύνθηκαν και ξεκαθάρισαν ακόμα περισσότερο οι ΟΜΛ που χαρακτηρίζονται από συγκεκριμένη γενετική διαταραχή, ενώ παρέμεινε αλλά συρρικνώθηκε η ομάδα που ακολουθεί την κατά FAB ταξινόμηση (AML NOS : 25-30% των ΟΜΛ). Η κυτταρομετρία ροής αποτελεί εδώ και χρόνια πολύτιμο διαγνωστικό εργαλείο πρώτης γραμμής για την διάγνωση, ταξινόμηση και παρακολούθηση των ασθενών με ΟΜΛ. Η μεγάλη τεχνολογική εξέλιξη των τελευταίων χρόνων που έχει σαν αποτέλεσμα την ανακάλυψη νέων φθοριοχρωμάτων, την κατασκευή κυτταρομετρητών που έχουν την δυνατότητα να επεξεργάζονται τα δεδομένα χιλιάδων λευχαιμικών κυττάρων σε λίγο χρόνο σε συνδυασμό με την χρησιμοποίηση της πολυπαραμετρικής ανάλυσης μας δίνει την δυνατότητα να ανιχνεύουμε με μεγάλη ακρίβεια το ανοσολογικό αποτύπωμα συγκεκριμένων λευχαιμικών κυττάρων, να συσχετίσουμε ένα ανοσοφαινοτυπικό προφίλ με μια

4 συγκεκριμένη γενετική διαταραχή και να ανιχνεύσουμε με μεγάλη ευαισθησία (< 1Χ10-4 ) υπολειμματική νόσο (MRD). Η κυτταρομετρία στην διάγνωση της ΟΜΛ Βασικό πλεονέκτημα της κυτταρομετρίας σε σύγκριση με τις υπόλοιπες διαγνωστικές μεθόδους (μορφολογία, κυτταρογενετική, μοριακή μελέτη) που εφαρμόζονται για την διάγνωση της ΟΜΛ, είναι η ταχύτητα (μέσα σε λίγες ώρες) και η ακρίβεια με την οποία αναγνωρίζεται ο βλαστικός πληθυσμός και χαρακτηρίζεται η σειρά στην οποία ανήκουν τα παθολογικά κύτταρα (μυελική, μονοκυτταρική, ερυθρά, μεγακαρυοκυτταρική ). Για την αναγνώριση του βλαστικού πληθυσμού χρησιμοποιείται αρχικά ένα στικτόγραμμα CD45/SSC στο οποίο αναγνωρίζονται τα βλαστικά κύτταρα απο την χαμηλότερη θέση που καταλαμβάνουν στο SSC σε σχέση με τα φυσιολογικά κύτταρα της μυελικής σειράς και την ασθενή έκφραση του CD45 σε σχέση με τα υπόλοιπα κύτταρα του δείγματος. Στη συνέχεια υπολογίζεται το ποσοστό των βλαστών στο σύνολο των κυττάρων του δείγματος για να καθοριστεί αν πρόκειται για ΟΜΛ η για άλλο μυελικό νεόπλασμα (MDS,MPN). Απαραίτητη προυπόθεση για να χαρακτηριστεί το νόσημα σαν ΟΜΛ είναι η ανεύρεση ποσοστού βλαστών >20% στο περιφερικό αίμα η στο μυελό. Εξαίρεση αποτελούν καποιες περιπτώσεις με συγκεκριμένες γενετικές ανωμαλίες όπως οι ΟΜΛ με t(15;17), t(8;21), inv(16) ή t(16;16), και μερικές περιπτώσεις ερυθρολευχαιμίας, όπου το ποσοστό των βλαστών δεν παίζει ρόλο στον χαρακτηρισμό της νόσου σαν ΟΜΛ. Τονίζεται ότι η μέθοδος έκλογής για τον υπολογισμό του ποσοστού των βλαστών είναι η μορφολογία και όχι η κυτταρομετρία. Ο υπολογισμός του ποσοστού των βλαστών με βάσει το ποσοστό των CD34+ κυττάρων δεν συνιστάται γιατί ενώ όλα τα κύτταρα που εκφράζουν CD34 είναι βλάστες, όλοι οι βλάστες δεν εκφράζουν CD34 (π.χ οι CD34- μονοβλάστες στην μονοκυτταρική λευχαιμία). Διάφοροι παράγοντες που αφορούν την τεχνική όπως η αραίωση του δείγματος με αίμα, η λύση των ερυθρών κατα την επεξεργασία των δειγμάτων και τα διάφορα artifacts μπορεί να οδηγήσουν σε λάθος υπολογισμό του ποσοστού διήθησης. Η πολυπαραμετρική κυτταρομετρία ροής με την χρησιμοποίηση 3-4 χρωμάτων το λιγότερο, αποτελεί την μέθοδο εκλογής για τον χαρακτηρισμό της κυτταρικής σειράς στην οποία ανήκουν τα βλαστικά κύτταρα. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιούνται συνδυασμοί MoAbs (panels) που περιέχουν δείκτες που χαρακτηρίζουν τα άωρα κύτταρα σε συνδυασμό με δείκτες που χαρακτηρίζουν την μυελική, την μονοκυτταρική, την ερυθρά και την μεγακαρυοκυτταρική σειρα. Το European LeukemiaNet προτείνει την χρησιμοποίηση μιας σειράς επιλεγμένων δεικτών ( πίνακας 1), για την διάγνωση της ΟΜΛ καθώς και της ΟΛ με μικτό φαινότυπο (MPAL: Mixed Phenotype Acute Leukemia) που αποτελεί ξεχωριστή ομάδα, στην κατάταξη WHO 2008 και αντικατέστησε τις λευχαιμίες που παλαιότερα χαρακτηρίζονταν σαν διφαινοτυπικές.

5 Πίνακας 1 Δεν υπάρχει μια γενική σύσταση για το ποσοστό έκφρασης που καθορίζει την θετικότητα ενός δείκτη σε έναν βλαστικό πληθυσμό (cutt off point). Για τους περισσότερους δείκτες ένα κοινά αποδεκτό κριτήριο θετικότητας είναι η έκφραση του σε ποσοστό >20% των λευχαιμικών κυττάρων, ενώ κάποιοι επιλεγμένοι δείκτες (π.χ cytcd3, MPO, TdT, CD34, CD117) θεωρούνται θετικοί όταν εκφράζονται στο 10% των λευχαιμικών κυττάρων. Τελευταία με την χρήση της πολυπαραμετρικής ανάλυσης υπάρχει η τάση να εκτιμάται το συνολικό μοτίβο άτυπης έντασης φθορισμού του λευχαιμικού πλυθυσμού σε σχέση με την ένταση φθορισμού των ίδιων δεικτών στα αρνητικά κύτταρα του δείγματος. Η επιλογή των δεικτών που χρησιμοποιούμε στο panel διάγνωσης της ΟΜΛ εξαρτάται απο τα φθοριοχρώματα που έχουμε την δυνατότητα να μελετήσουμε ταυτόχρονα. Σε αρκετά κέντρα του εξωτερικού χρησιμοποιούνται πλέον στην ρουτίνα panel των 6-8 φθοριοχρωμάτων. Συνιστάται η χρησιμοποίηση το λιγότερο 3 η 4 φθοριοχρωμάτων και η τοποθέτηση σε όλα τα σωληνάρια του panel δύο τουλάχιστον δεικτών που χαρακτηρίζουν τον βλαστικό πληθυσμό όπως είναι το CD45 και το CD34. Προτείνεται αρχικά η χρησιμοποίηση ένός περιορισμένου panel με συνδυασμό δεικτών που θα ξεκαθαρίσουν αν πρόκειται για ΟΜΛ και στην συνέχεια με ένα πιο ευρύ panel δεικτών θα καθοριστεί σε πια σειρά ανήκει ο βλαστικός πληθυσμός (μυελική, μονοκυτταρική, ερυθρά η μεγακαρυοκυττάρική σειρά) καθώς και το στάδιο ωρίμανσης των λευχαιμικών κυττάρων και θα αναγνωριστούν διάφορα άτυπα πρότυπα έκφρασης αντιγόνων που χαρακτηρίζουν τα λευχαιμικά κύτταρα της ΟΜΛ. Ο πιο ειδικός δείκτης για την μυελική σειρά είναι η MPO. Ο δείκτης CD117 χαρακτηρίζει τους άωρους μυελοβλάστες, αλλά εκφράζεται και στα μαστοκύτταρα,ενώ αναφέρεται σπάνια η ανεύρεση του και στα βλαστικά κύτταρα κάποιων Τ-ΟΛΛ. Οι δείκτες CD13 και CD33 ενώ χαρακτηρίζουν τα κύτταρα της

6 μυελικής σειράς μπορεί να εκφράζονται άτυπα και σε κάποιους βλάστες της Β-λεμφικής σειράς. Οι δείκτες CD15, CD16, CD11b εκφράζονται στα πιο ώριμα κύτταρα της μυελικής σειράς. Από τους δείκτες που χαρακτηρίζουν την μονοκυτταρική σειρά ο συνδυασμός CD36/CD64bright θεωρείται πιο ειδικός γιατί το CD14 μπορεί να μην εκφράζεται στούς μονοβλάστες. Ο ανοσοφαινότυπος θεωρείται απαραίτητος για την διάγνωση της ΟΜΛ με ελάχιστη διαφοροποίηση, της οξείας μεγακαρυοβλαστικής λευχαιμίας και της οξείας λευχαιμίας αδιευκρίνιστης σειράς. Στην ΟΜΛ με ελάχιστη διαφοροποίηση δεν υπάρχουν μορφολογικές και κυτταροχημικές αποδείξεις μυελικής διαφοροποίησης. Στις περισσότερες περιπτώσεις οι βλάστες εκφράζουν δείκτες αωρότητας (π.χ CD34, CD38, HLA-DR) και δεν εκφράζουν κανένα δείκτη μυελικής ή μονοκυτταρικής ωρίμανσης. Η MPO ενώ είναι αρνητική στην κυτταροχημική χρώση μπορεί να ανιχνεύεται κυτταροπλασματικά με κυτταρομετρία έστω σε ένα μικρό ποσοστό (<3%) των βλαστών. Η οξεία μεγακαρυοβλαστική λευχαιμία χαρακτηρίζεται απο την παρουσία >20% βλαστών εκ των οποίων >50% ανήκουν στην μεγακαρυοκυτταρική σειρά. Οι μεγακαρυοβλάστες εκφράζουν μία η περισσότερες απο τις γλυκοπρωτείνες των αιμοπεταλίων: CD41 ή/και CD61 και λιγότερο συχνά CD42. Τα αιμοπετάλια έχουν την τάση να προσκολλώνται στα μονοκύτταρα γι αυτό χρειάζεται προσοχή για την αποφυγή ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων. Ένας τρόπος αποφυγής τέτοιων λαθών είναι η ταυτόχρονη χρώση με τον συνδυασμό CD61/CD64 ή η κυτταροπλασματική χρώση του CD61. Οι οξείες λευχαιμίες αδιευκρίνιστης σειράς (acute leukemias of ambiguous lineage) είναι σπάνιες λευχαιμίες που περιλαμβάνουν περιπτώσεις που τα λευχαιμικά κύτταρα δεν εκφράζουν κανένα δείκτη διαφοροποίησης προς συγκεκριμένη σειρά (CD34+HLA- DR+CD38+/-lineage-, Οξεία αδιαφοροποίητη λευχαιμία, Acute undifferenciated leukemia, AUL) ή εκφράζουν δείκτες περισσοτέρων της μίας σειράς (μυελική+β-λεμφική, μυελική + Τ λεμφική, μυελική +Β + Τ λεμφική, MPAL). Οι MPAL μπορεί να περιέχουν δύο ή περισσότερους διαφορετικούς βλαστικούς πληθυσμούς από διαφορετικές σειρές ή έναν βλαστικό πληθυσμό που εκφράζει δείκτες από διαφορετικές σειρές στο ίδιο κύτταρο. Τα ανοσοφαινοτυπικά κριτήρια για την διάγνωση τους είναι αυστηρά και φαίνονται στον πίνακα 1. Η κυτταρομετρία ροής είναι απαραίτητη επίσης για την διάγνωση του νεοπλάσματος απο βλαστικά πλασματοκυτταροειδή δενδριτικά κύτταρα (blastic plasmatocytoid dendritic cell neoplasm) που παλιότερα ήταν γνωστό σαν CD4+/CD56+ αίματοδερμικό νεόπλασμα αλλά στην κατάταξη WHO 2008 ενσωματώθηκε στα νεοπλάσματα μυελικής προέλευσης. Πρόκειται για ένα σπάνιο και πολύ επιθετικό νόσημα που αρχικά εμφανίζεται με εστίες στο δέρμα και στην συνέχεια διηθεί το περιφερικό αίμα και τον μυελό. Ο βλαστικός πληθυσμός αυτού του νεοπλάσματος δεν εκφράζει ειδικούς δείκτες κάποιας σειράς (lineage - : MPO-, NSE -, cytcd3-, cyt CD22-) και χαρακτηρίζεται από την έκφραση CD4+, CD56+, CD123++, BDCA-2/CD303+ CD43+, HLA-DR++,TCL1+ και CLA+. Συχνά συνεκφράζονται οι δείκτες CD7 και CD33 και στο 30% των περιπτώσεων TdT, ενώ δεν εκφράζονται οι δείκτες αωρότητας CD34 και CD117. Ο ανοσοφαινότυπος είναι απαραίτητος επίσης για την εκτίμηση της έκφρασης δεικτών που αποτελούν στόχους συγκεκριμένης θεραπείας (targeted therapy) όπως π.χ η εκτίμηση της έκφρασης του CD33 στα βλαστικά κύτταρα της ΟΜΛ σε ασθενείς που πρόκειται να χορηγηθεί αντι- CD33 MoAb (gentuzumab ozogamicin).

7 Η μεγάλη ετερογένεια που χαρακτηρίζει την ΟΜΛ αντανακλάται και στην μεγάλη ποικιλία άτυπων προτύπων έκφρασης αντιγόνων που συναντάμε στον ανοσοφαινότυπο των λευχαιμικών κυττάρων. Για την σωστή αναγνώριση των άτυπων ανοσοφαινοτύπων απαραίτητη προϋπόθεση είναι η λεπτομερής γνώση της φυσιολογικής έκφρασης των δεικτών στα διάφορα στάδια ωρίμανσης στον φυσιολογικό μυελό. Οι συχνότερες ατυπίες που περιγράφονται στην ΟΜΛ είναι : 1) ασύγχρονη έκφραση δεικτών δηλαδή ταυτόχρονη έκφραση άωρων και ώριμων δεικτών στο ίδιο κύτταρο.(π.χ συνέκφραση του CD34 και του CD15) 2) έκφραση ενός δείκτη άλλης κυτταρικής σειράς δηλαδή έκφραση δεικτών της λεμφικής σειράς στους βλάστες της μυελικής σειράς (π.χ συνέκφραση CD2, CD5, CD7, CD10, CD19) 3) υπερέκφραση ενός δείκτη, δηλαδή παθολογικά αυξημένη έκφραση ενός αντιγόνου. 4) απουσία έκφρασης ειδικών για την κυτταρική σειρά αντιγόνων (π.χ απουσία του CD13 ή/και του CD33 από τους μυελοβλάστες. 5) μη αναμενόμενα σκεδαστικά χαρακτηριστικά (π.χ έκφραση λεμφικών δεικτών σε κύτταρα με ψηλό FSC/SSC που αντιστοιχούν στα φυσιολογικά κύτταρα της μυελικής σειράς) Η αναγνώριση των άτυπων προτύπων έκφρασης δεικτών που χαρακτηρίζουν τα λευχαιμικά κύτταρα της ΟΜΛ είναι απαραίτητη για τον καθορισμό του σχετιζόμενου με την λευχαιμία ανοσοφαινότυπου (Leukemia Associated Immunophenotype- LAIP) στην διάγνωση (πίνακας 3). Η χρησιμοποίηση της πολυπαραμετρικής ανάλυσης έδειξε ότι σε κάθε ασθενή με ΟΜΛ μπορεί να αναγνωριστούν πάνω από ένας LAIP. Οι LAIP που ανιχνεύονται στην διάγνωση πρέπει να καταγράφονται γιατί αποτελούν το «ανοσολογικό αποτύπωμα» της συγκεκριμένης ΟΜΛ το οποίο χρησιμεύει για την παρακολούθηση του ασθενούς και την ανίχνευση υπολειμματικής νόσου (MRD) όπως θα δούμε παρακάτω. Εκτός από τους δείκτες που χαρακτηρίζουν την σειρά και το στάδιο ωρίμανσης των λευχαιμικών κυττάρων, στο panel διάγνωσης της ΟΜΛ συνιστάται να περιλαμβάνονται και δείκτες άλλων σειρών που η συνεκφράση τους στα βλαστικά κύτταρα της ΟΜΛ έχει συσχετισθεί είτε με την πρόγνωση είτε με κάποια συγκεκριμένη γενετική διαταραχή. Τέτοιοι δείκτες είναι οι : CD2, CD7, CD56, CD19, NG2. Κάποιες ΟΜΛ με ειδικές χρωμοσωμιακές ανωμαλίες (AML with recurrent genetic abnormalities) σχετίζονται με χαρακτηριστικά ανοσοφαινοτυπικά προφίλ (πίνακας 2). Για παράδειγμα, η συχνή έκφραση του CD19 (ή/ και του CD56 και TdT ) στην ΟΜΛ με t(8:21), η έκφραση του CD2 στην ΟΜΛ με inv(16) και στην variant μορφή της ΟΠΛ με t(15;17), η έκφραση του NG2 ομόλογου (που συνδέεται με το 7.1 MoAb) στις περισσότερες περιπτώσεις των 11q23 ΟΜΛ. Τα τελευταία χρόνια γίνεται προσπάθεια συσχέτισης της έκφρασης όχι μόνο δεικτών απο άλλες σειρές αλλά συγκεκριμένων άτυπων ανοσοφαινοτυπικών προφίλ με υποκείμενες χρωμοσωμιακές ανωμαλίες. Για παράδειγμα, η έκφραση CD13+,CD33++,MPO+,CD117-/+,CD34-/dim,HLA-DR-CD15-,CD11b- σε έναν βλαστικό πληθυσμό με ψηλό SSC, είναι χαρακτηριστική της οξείας προμυελοκυτταρικής λευχαιμίας με t(15;17)q(22;q22), η ανεύρεση CD34-, HLA-DR, (και συχνά CD56+,CD123+,CD133-) ανοσοφαινότυπου σε συνδυασμό με συγκεκριμένα μορφολογικά χαρακτηριστικά (cup-shaped nuclear invaginations) και αρνητικό καρυότυπο έχει συσχετισθεί με FLT3-ITD+, ενώ η ανεύρεση CD33++CD34-/dim παρατηρείται συχνά στην NPM1+ ΟΜΛ.

8 Πίνακας 2 Η ταχύτατη αναγνώριση τέτοιων χαρακτηριστικών ανοσοφαινοτυπικών προφίλ με την κυτταρομετρία ροής μπορεί να χρησιμεύσει σαν screening που θα βοηθήσει αφενός μεν στην λήψη γρήγορων θεραπευτικών αποφάσεων όπως στην περίπτωση της οξείας προμυελοκυτταρικής λευχαιμίας που συνήθως εμφανίζεται σαν επείγον περιστατικό, αφετέρου δε στο να κατευθύνει την μοριακή μελέτη για την αναζήτηση συγκεκριμένων μεταλλάξεων που σχετίζονται με την πρόγνωση και την επιλογή της κατάλληλης θεραπείας. Προς το παρόν λόγω της μικρής ειδικότητας και ευαισθησίας που οφείλεται κυρίως στην έλλειψη προτύπωσης της μεθόδου, η κυτταρομετρία δεν είναι το κατάλληλο εργαλείο για την ανίχνευση των γενετικών ανωμαλιών στην ΟΜΛ. Η κυτταρομετρία στην ανίχνευση ελαχίστης υπολειμματικής νόσου (MRD) Οι ασθενείς με ΟΜΛ έχουν περίπου λευχαιμικά κύτταρα στην διάγνωση. Σαν πλήρης μορφολογική ύφεση (CR) χαρακτηρίζεται η ανίχνευση μορφολογικά <5% λευχαιμικών κυττάρων στον μυελό μετά την χημειοθεραπεία. Όμως μπορεί να παραμένουν περίπου λευχαιμικά κύτταρα που η ευαισθησία της μορφολογίας και της κυτταροχημείας δεν μπορεί να ανιχνεύσει. Περίπου 80% των ασθενών με ΟΜΛ εμφανίζουν μορφολογική ύφεση μετά την χημειοθεραπεία, αλλά τουλάχιστον 30% των ασθενών αυτών θα εμφανίσει υποτροπή, που οφείλεται στην παραμονή μικρού υπολειμματικού πληθυσμού λευχαιμικών κυττάρων που δεν ανιχνεύονται με την μορφολογία (Minimal Residual Disease,MRD). Είναι αναγκαίος λοιπόν ο καθορισμός πιο ευαίσθητων κριτηρίων για τον χαρακτηρισμό της ύφεσης και η παρακολούθηση της MRD αποκτά όλο και μεγαλύτερη σημασία για την πρόγνωση και την καθοδήγηση της θεραπείας. Η πιο ευαίσθητη μέθοδος ανίχνευσης MRD είναι η RQ-PCR με ευαισθησία απο 10-4 έως 10-6 (δηλ. ανίχνευση 1 λευχαιμικού κυττάρου σε έως φυσιολογικά κύτταρα). Όμως ευαίσθητοι μοριακοί δείκτες που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για ανίχνευση MRD υπάρχουν περίπου στο 60% των ασθενών με ΟΜΛ. Το μεγάλο πλεονέκτημα της χρησιμοποίησης της πολυπαραμετρικής κυτταρομετρίας ροής στην ανίχνευση MRD είναι ότι μπορεί να εφαρμοστεί σε όλους σχεδόν τους ασθενείς με ΟΜΛ ανεξάρτητα από την συνυπαρξη ή όχι γενετικών διαταραχών. Άτυπη έκφραση αντιγόνων (LAIP) ανιχνεύεται σχεδόν σε όλους τους ασθενείς με ΟΜΛ και αρκετοί μάλιστα από αυτούς έχουν >1 LAIP κατά την διάγνωση (πίνακας 3).

9 Η ανίχνευση της MRD με κυτταρομετρία ροής παρουσιάζει κάποιες δυσκολίες που οφείλονται κυρίως στην ετερογένεια της ΟΜΛ και στο γεγονός ότι μέχρι σήμερα δεν έχει προτυπωθεί πλήρως ούτε ο ποιοτικός ούτε ο ποσοτικός προσδιορισμός της. Απαραίτητη προϋπόθεση για την ανίχνευση της MRD αποτελεί η αναγνώριση τών LAIP για κάθε ασθενή κατά την διάγνωση και η επιλογή του ή των πιό κατάλληλων LAIP για την παρακολούθηση. Πινακας 3 Η ποιότητα ενός LAIP εξαρτάται από τα εξής χαρακτηριστικά : 1) Ειδικότητα: ένας LAIP θεωρείται ειδικός όταν το ποσοστό έκφρασης του στον φυσιολογικό ή στον αναγεννόμενο μετά θεραπεία μυελό είναι <0,1%. 2) Ευαισθησία : ένας LAIP θεωρείται υψηλής ευαισθησίας όταν το ποσοστό έκφρασης του στα λευχαιμικά βλαστικά κύτταρα είναι >50% (μέσης ευαισθησίας : 20-50%, χαμηλής ευαισθησίας:10-20%) 3) Σταθερότητα : οι LAIP μπορεί να υποστούν φαινοτυπική τροποποίηση, δηλαδή κατα την διάρκεια της νόσου η έκφραση (ιδιαίτερα η ασθενής έκφραση) κάποιων δεικτών μπορεί να χαθεί (π.χ η έκφραση του CD19 συχνά εξαφανίζεται). Συγκριτικά με την οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία (ΟΛΛ), οι LAIP στην ΟΜΛ είναι πιο ετερογενείς και συχνά παρατηρούμε την συνύπαρξη αρκετών βλαστικών πληθυσμών με διαφορετικό LAIP στον ίδιο ασθενή. Στην περίπτωση αυτή για την παρακολούθηση της MRD θα πρέπει να επιλέγεται ο LAIP που εμφανίζει την μεγαλύτερη λογαριθμική διαφορά σε σχέση με τον φυσιολογικό μυελό. Επίσης ο λογάριθμος του πηλίκου της % αναλογίας των LAIP+ κυττάρων στην διάγνωση και % αναλογίας των LAIP+ κυττάρων στην επανεκτίμηση (log difference, LD) είναι πιο κατάλληλος δείκτης από την απλή % αναλογία των LAIP+ κυττάρων για την εκτίμηση της ελάττωσης του λευχαιμικού φορτίου μετά την θεραπεία. Για να πετύχουμε ευαισθησία της τάξεως του 1Χ 10-4 θα πρέπει να μετρήσουμε τουλάχιστον κύτταρα (2-5 Χ 10 5 λευκοκύτταρα), ενώ για να αυξηθεί η ευαισθησία κατά 1-log θα πρέπει να μετρηθούν 10 φορές περισσότερα κύτταρα. Η δυνατότητα αυτή παρέχεται μεν από τους νέους ψηφιακούς κυτταρομετρητές μετρώντας διαδοχικά πολλά σωληνάρια με τον ίδιο συνδυασμό μονοκλωνικών και αποθηκεύοντας τα δεδομένα στον ίδιο φάκελο, αλλά αυτή η διαδικασία αυξάνει κατά πολύ το κόστος της εξέτασης και δεν είναι πρακτικά εφαρμόσιμη στα εργαστήρια ρουτίνας. Τα τελευταία χρόνια αρκετές κλινικές μελέτες σε μεγάλες ομάδες ασθενών, διερευνούν την αξία της πολυπαραμετρικής κυτταρομετρίας ροής στην παρακολούθηση της MRD στην ΟΜΛ. Τα αποτελέσματα αυτών δείχνουν την ανεξάρτητη προγνωστική σημασία της ανίχνευσης MRD με κυτταρομετρία ροής

10 κατά την διάρκεια και μετά το τέλος της θεραπείας. Αντικείμενο συζητήσεων παραμένει σε πια χρονική στιγμή κατά την θεραπεία έχει την μεγαλύτερη προγνωστική αξία καθώς και το ποσοστό θετικής MRD που έχει ισχυρότερη συσχέτιση με την κλινική έκβαση. Κάποιες μελέτες αποδεικνύουν ότι η ανίχνευση MRD μετά την θεραπεία εδραίωσης φαίνεται να έχει ισχυρότερη προγνωστική αξία από την ανίχνευση μετά την θεραπεία εφόδου και μπορεί να αναγνωρίσει ασθενείς που θα ωφεληθούν από διαφορετικές θεραπευτικές προσεγγίσεις όπως π.χ αλλογενή μεταμόσχευση. Επίσης σε άλλες μελέτες η ανίχνευση MRD νωρίς της πρώτες οκτώ μέρες της θεραπείας ή στην φάση της απλασίας μετά την πρώτη θεραπεία εφόδου, φάνηκε να χρησιμεύει στην αναγνώριση των ασθενών που έχουν υψηλό κίνδυνο να μην ανταποκριθούν στην θεραπεία. Ταυτόχρονα άλλες κλινικές μελέτες επικεντρώνονται στην αναζήτηση δεικτών που εκφράζονται αποκλειστικά στα πρόδρομα κακοήθη λευχαιμικά κύτταρα (LSC: Leukemia stem cells) και όχι στα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα στον αναγεννόμενο μυελό και που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν στην ανίχνευση MRD με κυτταρομετρία ροής. Τέτοιος δείκτης είναι το μόριο CLL-1 που φαίνεται να εκφράζεται ειδικά στον υποπληθυσμό CD34+CD38- των κακοήθων λευχαιμικών κυττάρων σε όλες τις CD34+ΟΜΛ και που η αναζήτηση του θα μπορούσε να βοηθήσει στην ανίχνευση MRD και ίσως στο μέλλον στην εφαρμογή στοχευμένης θεραπείας με την χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων. Οι μελλοντικές προσπάθειες διεθνώς έχουν στόχο την προτύπωση των panel των μονοκλωνικών που χρησιμοποιούνται για την διάγνωση της ΟΜΛ (ήδη γίνεται μια τέτοια προσπάθεια απο το European LeukemiaNet), την αναγνώριση των πιο κατάλληλων LAIP για την παρακολούθηση της MRD και τον σαφή καθορισμό του κατώτατου ορίου MRD που θα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την επιλογή της κατάλληλης θεραπευτικής στρατηγικής σε κάθε ασθενή καi συγχρόνως την αναζήτηση δεικτών που θα χαρακτηρίζουν τα LSC με σκοπό την ευρύτερη εφαρμογή στοχευμένης θεραπείας. Στην Ελλάδα του σήμερα, που στις ήδη υπάρχουσες οργανωτικές και λειτουργικές δυσκολίες των νοσοκομείων, έρχεται να προστεθεί και η πίεση των διοικήσεων για ελάττωση του κόστους των εξετάσεων θα πρέπει ίσως να επανεξετάσουμε τους τρόπους με τους οποίους θα ήταν δυνατόν αυτό να γίνει εξασφαλίζοντας ταυτόχρονα και την καλύτερη ποιότητα παροχής υπηρεσιών προς τον ασθενή. Σε νοσήματα όπως οι λευχαιμίες που η σωστή και έγκαιρη διάγνωση τους έχει τεράστια σημασία για την ζωή του ασθενούς η μείωση του κόστους δεν θα πρέπει να γίνεται εις βάρος της διαγνωστικής αξίας της εξέτασης. Η χρήση περισσότερων φθοριοχρωμάτων μπορεί να ελαττώνει τον χρόνο της επεξεργασίας των δειγμάτων και να αυξάνει την ακρίβεια τον αποτελεσμάτων αλλα σίγουρα δεν οδηγεί σε μείωση του κόστους. Η χρησιμοποίηση των screening panels αρχικά και στην συνέχεια ευρύτερων πιο στοχευμένων panels και η σωστή συνεργασία κλινικής εργαστηρίου είναι παράγοντες που μπορεί να βοηθήσουν στην ελάττωση του κόστους. Η συνεργασία των εργαστηρίων επίσης για θέματα που αφορούν τον αριθμό και το είδος των δεικτών που πρέπει να περιλαμβάνονται στα panel διάγνωσης καθώς και τις χρονικές στιγμές στην διάρκεια της παρακολούθησης (ανάλογα με το θεραπευτικό πρωτόκολλο) που μπορεί να έχει πραγματική προγνωστική αξία και θεραπευτική σημασία η ανίχνευση MRD με κυτταρομετρία συγκριτικά με άλλες τεχνικές μπορεί να έχει σαν αποτέλεσμα την

11 συνολική ελάττωση των παραγγελόμενων εξετάσεων. Ισως τώρα λοιπών είναι αναγκαία, όσο ποτέ άλλοτε, η προώθηση συνεργασιών μεταξύ μας, η χρησιμοποίηση μιας κοινής γλώσσας και κοινών πρωτοκόλλων και ίσως η διερεύνηση της δυνατότητας δημιουργίας κέντρων αναφοράς ιδιαίτερα για εξετάσεις όπως η ανίχνευση MRD που πρακτικά είναι δύσκολο να εφαρμοστούν στα εργαστήρια ρουτίνας. Βιβλιογραφία 1. Craig E. F, et al: Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood, 2008, 111: Vardiman W. J, et al: The 2008 revision of the World Health Organisation (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important shanges. Blood, 2009, 114: Dohner H, et al: Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet. Blood, 2010, 115: Campana D. et al: Role of Minimal Disease Evaluation in Leukemia Therapy. Current Hematologic Malignancy Reports. 2008, 3: Al-Mawali A., et al: The role of Multiparameter Flow Cytometry for Detection of Minimal Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia. AJCP, 2009, 131: Al-Mawali A., et al: Incidence, Sencitivity and Specificity of Leukemia-Associated Phenotypes in Acute Myeloid Leukemia Using Specific Five-Color Multiparameter Flow Cytometry. AJCP, 2008, 129: Kern W.,et al: The role of multiparameter flow cytometry for disease monitoring in AML. Best Practise & Research Clinical Haematology, 2010, 23: Nomdedeu J., et. al: Immunophenotype of acute leukemia with NPM mutations: Prognostic impact of the leukemic compartment size. Leukemia Research 2011, 35: Munoz L., et. al: Immunophenotypic findings in acute myeloid leukemia with FLT3 internal tandem duplications. Haematologica 2003, 88 (06). 10.Bene MC., et al: Immunophenotyping of acute leukemia and lymphoproliferative disorders: a consensus proposal of the European LeukemiaNet Work Package 10. Leukemia, 2011,25 :

12 Μυελοδυσπλαστικά Σύνδρομα-Κατευθυντήριες οδηγίες Μαρίνα Καρακάντζα, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Εργαστηριακής Αιματολογίας και Αιμοδοσίας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Πατρών 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (ΜΔΣ) αποτελούν κλωνικές διαταραχές του προγονικού αιμοποιητικού κυττάρου, που χαρακτηρίζονται από ποικίλου βαθμού αναστολή ωρίμανσης και διαφοροποίησης, αυξημένο ρυθμό προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου (απόπτωση) σε όλες τις κυτταρικές βαθμίδες με αποτέλεσμα μη αποδοτική αιμοποίηση (1). Τα νοσήματα αυτά μολονότι έχουν αρκετούς κοινούς παθογενετικούς μηχανισμούς, εμφανίζουν σημαντική κλινική και αιματολογική ετερογένεια, η οποία εκδηλώνεται με ποικίλους συνδυασμούς κυτταροπενιών στο αίμα, ποικίλου βαθμού ανάγκες υποστήριξης παραγώγων αίματος και ποικίλο ποσοστό εξέλιξης σε περισσότερο επιθετικό κλινικό σύνδρομο ή οξεία μυελογενή λευχαιμία (ΟΜΛ) (2,3). Η ετερογένεια αυτή πιθανώς είναι αποτέλεσμα του διαφορετικού βαθμού συμμετοχής κάθε παθογενετικού μηχανισμού στην ανάπτυξη του συνδρόμου, του διαφορετικού τρόπου αντίδρασης του ανοσοποιητικού συστήματος στην εμφάνιση και ανάπτυξη ενός νεοπλασματικού νοσήματος και του διαφορετικού λοιπού νοσολογικού υποστρώματος κάθε ασθενούς. Παρά τη συνεχή έρευνα της παθογένειας των νοσημάτων αυτών με σύγχρονες και προηγμένες τεχνολογίες και τη συσσώρευση πλήθους πληροφοριών για τις γενετικές και λειτουργικές βλάβες των κυττάρων τα ισχύοντα συστήματα κατάταξης και πρόγνωση των ΜΔΣ δεν αξιοποιούν τα δεδομένα αυτά. Η διεθνής επιστημονική κοινότητα έχει από καιρό αναγνωρίσει ότι οι υπότυποι των ΜΔΣ όπως αυτοί ορίζονται με μορφολογικά κριτήρια και οριοθετούν τις ομάδες συνδρόμων των εν ισχύει ταξινομήσεων, δεν συσχετίζονται ικανοποιητικά με τα κλινικά χαρακτηριστικά, την ανταπόκριση στην θεραπεία και την πρόγνωση των ασθενών. Γι αυτό γίνονται συνεχείς προσπάθειες αναθεώρησης των κριτηρίων διάγνωσης και κατάταξης των συνδρόμων με σκοπό την ενσωμάτωση και άλλων δεικτών ώστε η αρχική κατάταξη να αντανακλά καλύτερα την παθογένεια των νοσημάτων. Όλο και περισσότερο αναγνωρίζεται η σημασία των κυτταρογενετικών και μοριακών ευρημάτων στη διάγνωση και πρόγνωση των ΜΔΣ. Στην τελευταία ταξινόμηση κατά WHO αναγνωρίζονται υποκατηγορίες ασθενών κατά την διάγνωση βάση κυτταρογενετικών διαταραχών ανεξαρτήτως άλλων κριτηρίων (4). Πρόσφατες δημοσιεύσεις αναδεικνύουν την σημασία της ανίχνευσης μοριακών διαταραχών με νέες τεχνικές όπως SNPs και microarrays στην διάγνωση και παρακολούθηση των ΜΔΣ, διαταραχές που πιθανώς θα ενσωματωθούν σε επόμενες διαγνωστικές και προγνωστικές κατατάξεις. (5,6,7,8)

13 2. ΚΑΤΕΥΘΥΝΤΗΡΙΕΣ ΟΔΗΓΙΕΣ ΓΙΑ ΤΙΣ ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΧΡΗΣΗΣ ΤΗΣ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑΣ ΡΟΗΣ ΣΤΑ ΜΔΣ Ο ρόλος της κυτταρομετρίας ροής στην διάγνωση και πρόγνωση των ΜΔΣ παραμένει αμφισβουτούμενος. Σε ασθενείς με ΜΔΣ τα ευρήματα της κυτταρομετρία ροής αναδεικνύουν διαταραχές στην έκφραση των αντιγόνων σε διάφορα στάδια ωρίμανσης όλων των αιμοποιητικών σειρών και κυρίως της μυελικής σειράς. Οι διαταραχές αυτές αφορούν ασυγχρονίες έκφρασης αντιγόνων για το στάδιο ωρίμανσης κυρίως των κυττάρων της μυελικής και ερυθράς σειράς, άτυπες (aberrant) εκφράσεις αντιγόνων άλλων σειρών και παθολογική υπερέκφραση ή υποέκφραση αντιγόνων. Συγκεντρωτική καταγραφή από το Leukemia EuroNet των παρατηρούμενων διαταραχών στην έκφραση αντιγόνων στα ΜΔΣ δημοσιεύθηκε πρόσφατα φαίνεται στους πίνακες 1,2, και 3 (9). Για να θεωρηθεί ένας αντιγονικός συνδυασμός παθογνωμονικός για τα ΜΔΣ πρέπει να έχει μεγάλη ειδικότητα και ευαισθησία, να εμφανίζεται δηλαδή με μεγάλη συχνότητα σε ασθενείς με ΜΔΣ και με πολύ χαμηλή ή μηδενική συχνότητα σε ασθενείς με άλλα νοσήματα. Από την υπάρχουσα καταγραφή (πίνακας 2) φαίνεται ότι ο πιο ευαίσθητος δείκτης για τα ουδετερόφιλα με συχνότητα εμφάνισης σχεδόν 100% είναι τα παθολογικά σκεδαστικά, ενώ οι ασυγχρονίες των αντιγόνων CD13/CD11b και CD16/CD13 καθώς και οι άτυπες εκφράσεις των αντιγόνων CD2 CD7, CD5, CD19 εμφανίζονται με συχνότητα >70%. Ωστόσο, οι διαταραχές της αντιγονικής έκφρασης δεν έχουν ενσωματωθεί στα διαγνωστικά κριτήρια της WHO επειδή δεν έχουν μελετηθεί επαρκώς σε δευτεροπαθή ΜΔΣ και δεν έχει αποδειχθεί η παθογνωμονική τους σημασία για τη διαφορική διάγνωση πρωτοπαθών και δευτεροπαθών ΜΔΣ από άλλες νοσολογικές οντότητες με ανάλογα κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα (4). Επιπλέον η ανάλυση των αντιγονικών αυτών διαταραχών στα ΜΔΣ είναι πολύπλοκη διότι συχνά αφορά την ανάλυση παθολογικών pattern και όχι απλών αποκλίσεων και απαιτεί εξειδίκευση και ερμηνευτικές τεχνικές πέραν των διαθέσιμων καθιστώντας την ενσωμάτωση τους στα διαγνωστικά κριτήρια προβληματική. Κατά συνέπεια βάση της δημοσιευμένης εμπειρίας δεν είναι δυνατόν να ορισθούν κατευθυντήριες οδηγίες για τις κλινικές ενδείξεις εφαρμογής της κυτταρομετρίας ροής στην διάγνωση και παρακολούθηση των ΜΔΣ για γενικευμένη χρήση. Σε εξειδικευμένα εργαστήρια η δημοσιευμένη εμπειρία δείχνει ότι η κυτταρομετρία ροής συμπληρώνει την μορφολογική και κυτταρογενετική διάγνωση των ΜΔΣ στις υποκατηγορίες των ΜΔΣ χαμηλού κινδύνου. 2.1 Παθογνωμονική σημασία του ανοσοφαινότυπου για τα ΜΔΣ Ανθεκτικές Κυτταροπενίες με δυσπλασία μίας σειράς (Refractory cytopenias unilineage dysplasia, RCUD)) Στην WHO κατάταξη του 2001 αναγνωρίσθηκε η διαφορά επιβίωσης και κινδύνου μετατροπής σε λευχαιμία των ασθενών που εμφανίζουν δυσπλασία μίας σειράς σε σχέση με αυτούς που εμφανίζουν δυσπλασία 2 ή περισσότερων σειρών (10). Η ανίχνευση παθολογικών αντιγονικών συνδυασμών με κυτταρομετρία ροής φαίνεται από μελέτες ότι δεν επιβεβαιώνει απλώς τη διάγνωση που τίθεται από

14 την μορφολογία και τα κυτταρογενετικά ευρήματα αλλά συμπληρώνει την διάγνωση (11, 12) Σε πρόσφατη μελέτη, ασθενείς οι οποίοι με μορφολογικά κριτήρια κατατάχθηκαν ως πάσχοντες από ανθεκτική αναιμία όταν μελετήθηκαν με κυτταρομετρία ροής αποδείχθηκε ότι σε ποσοστό >50% είχαν διαταραχές και της μυελικής σειράς (11). Αυτή η διαφοροποίηση ήταν κλινικά σημαντική και σχετίζονταν με την εξέλιξη και την πρόγνωση των ασθενών Μεμονωμένες κυτταροπενίες αδιευκρίνιστης σημασίας ( Isolated cytopenias of undetermined significance, ICUS) Σύμφωνα με την τελευταία κατάταξη της WHO οι μεμονωμένες κυτταροπενίες αδιευκρίνιστης σημασίας ορίζονται από την κυτταροπενία μίας σειράς χωρίς κυτταρογενετικά ευρήματα ενδεικτικά ΜΔΣ και με δυσπλαστικά χαρακτηριστικά <10%.. Υπάρχουν μελέτες που δείχνουν ότι σε ασθενείς με ICUS ανιχνεύονται διαταραχές στην αντιγονική έκφραση των κυττάρων της μυελικής σειράς ανάλογες με αυτές που παρατηρούνται σε ΜΔΣ διαχωρίζοντας έτσι υποομάδες που εντάσσονται παθογενετικά στο φάσμα των ΜΔΣ και τους διαφοροποιούν από άλλες νοσολογικές οντότητες (13, 14, 15, 16). 3. ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΕΣ ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ 3.1 Πιθανή παθογνωμονική σημασία ανοσοφαινοτύπου για ΜΔΣ Ιδιοπαθής δυσπλασία αδιευκρίνιστης σημασίας Idiopathic dysplasia of undetermined significance, IDUS) Η ιδιοπαθής δυσπλασία αδιευκρίνιστης σημασίας είναι μία οντότητα που ενώ εμφανίζει μορφολογικές διαταραχές χαρκτηριστικές ΜΔΣ δεν εμφανίζει κυτταροπενίες. Θεωρείται πρό ΜΔΣ με άγνωστη κλινική Αταξινόμητα ΜΔΣ (MDS-U) Στην WHO κατάταξη του 2008 χαρακτηρίζονται ως αταξινόμητα ΜΔΣ αυτά που εμφανίζουν δυσπλασία <10% μίας σειράς και κυτταρογενετικά ευρήματα ενδεικτικά ΜΔΣ. Αν και δεν υπάρχουν δεδομένα που να τεκμηριώνουν την σημασία του ανοσοφαινοτύπου στις παραπάνω οντότητες είναι πιθανόν ότι η συμπλήρωση της μορφολογικής και κυτταρογενετικής μελέτης με ανοσοφαινότυπο θα προσθέσει πληροφορίες που θα τις εντάξει σε καλύτερα αναγνωρισμένες οντότητες Μεμονωμένη έλλειψη 5q- (del 5q-) Η μεμονωμένη έλλειψη 5q- αποτελεί ξεχωριστή υποκατηγορία των ΜΔΣ που χαρακτηρίζεται από αναιμία, φυσιολογικό ή αυξημένο αριθμό αιμοπεταλίων και χαμηλή πιθανότητα εκτροπής σε Οξεία Μυελογενή λευχαιμία (ΟΜΛ). Πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι ασθενείς με del 5q- εμφανίζουν περισσότερες διαταραχές στην έκφραση των αντιγόνων από ομάδες ασθενών με άλλες κυτταρογενετικές βλάβες όπως τρισωμία 8, del(20q) και απώλεια χρωμοσώματος Y (17) Η ανοσοφαινοτυπική μελέτη των ασθενών αυτών μπορεί να βοηθήσει στην διάκριση υποκατηγορίας ασθενών με παθολογική αντιγονική έκφραση και αυξημένο κίνδυνο εκτροπής σε ΟΜΛ.

15 3.2 Σημασία του ανοσοφαινότυπου στην πρόγνωση των ΜΔΣ Το διεθνώς ισχύον προγνωστικό σύστημα IPSS ( International Prognostic Scoring System) για τον καθορισμό ομάδων που θα έχουν δυσμενή κλινική πορεία και θα εξελιχθούν σε οξεία λευχαιμία στηρίζεται σε κριτήρια κατά την διάγνωση που έχουν συμπεριληφθεί στις κατατάξεις της WHO και επιπλέον σε χρωμοσωμικές ανωμαλίες που δε συμπεριλαμβάνονται στα διαγνωστικά κριτήρια. Οι χρωμοσωμικές αυτές ανωμαλίες θεωρούνται δευτεροπαθείς, εμφανιζόμενες κατά την εξέλιξη του κλώνου, και προβλέπουν την εξέλιξη σε ΟΜΛ (18). Μειονέκτημα του IPSS είναι ότι κατατάσσει τους ασθενείς κατά την διάγνωση και δεν συμπεριλαμβάνει παραμέτρους που εμφανίζονται κατά την πορεία της νόσου. Πιο δυναμικό σύστημα είναι το WHO-adjusted prognostic scoring system (WPSS) που περιλαμβάνει την εξάρτηση από μεταγγίσεις κατά την πορεία της νόσου και έτσι εισάγει μία κλινική παράμετρο που αντικαθρεπτίζει την βιολογική εξέλιξη του νοσήματος (19). Και τα δύο συστήματα, IPSS και WPSS, μειονεκτούν διότι δεν συμπεριλαμβάνουν νέες σημαντικές παραμέτρους που φαίνεται ότι σχετίζονται με την εξέλιξη της νόσου όπως συννοσηρότητα, επίπεδα LDH, κατάσταση μεθυλίωσης, ίνωση μυελού των οστών κ.α. Τα συστήματα αυτά είναι συνεχώς σε αναθεώρηση με σκοπό αφενός την ενσωμάτωση νέων βιολογικών παραμέτρων και αφετέρου τον εκσυγχρονισμό τους σε σχέση με νέες θεραπείες. Η ανίχνευση παθολογικών αντιγονικών εκφράσεων σε άωρα και ώριμα κύτταρα με κυτταρομετρία ροής πιθανόν να βελτιώσει την προγνωστική δύναμη των ισχυόντων συστημάτων ιδιαίτερα σε υποκατηγορίες ΜΔΣ χαμηλού κινδύνου. Στις υποκατηγορίες RCUD, ICUS, MDS-U, IDUS, isolated del5q- η μελέτη των αντιγόνων μπορεί να συμπληρώσει τα ευρήματα της μορφολογίας και κυτταρογενετικής και να κατατάξει τους ασθενείς σε υποκατηγορίες μεγαλύτερο κινδύνου. Επιπλέον οι παθολογικές αντιγονικές έκφρασεις σε διάφορα στάδια ωρίμανσης των κυττάρων μπορεί να έχουν ανεξάρτητη προγνωστική σημασία. Μελέτες έδειξαν ότι διαταραχές της αντιγονικής έκφρασης της μυελικής και μονοκυτταρικής σειράς συσχετίζονται με το International Prognostic Scoring System (IPSS), το WHO-adjusted prognostic scoring system (WPSS), την εξάρτηση από μεταγγίσεις, τον χρόνο εξέλιξης σε ΟΜΛ και την έκβαση μεταμόσχευσης αιμοποιητικών κυττάρων (20, 21). Άτυπες εκφράσεις αντιγόνων στα προγονικά κύτταρα της μυελικής σειράς πχ υπερέκφραση ή μειωμένη έκφραση κοινών μυελικών αντιγόνων ή έκφραση αντιγόνων άλλης σειράς μπορεί να έχουν ανεξάρτητη προγνωστική σημασία ακόμα και αν ο αριθμός των βλαστών στον μυελό των οστών είναι < 5%.(20-23). Έχει δειχθεί ότι η άτυπη έκφραση κάποιων δεικτών όπως του CD7 και/ή TdT) στα άωρα κύτταρα της μυελικής σειράς συσχετίζεται με χειρότερη κλινική έκβαση (20, 24, 25) Η ανίχνευση διαταραχών έκφρασης αντιγόνων στα πρόδρομα αιμοποιητικά κύτταρα μπορεί να έχει διαγνωστική και προγνωστική σημασία και στις ομάδες ασθενών με περίσσεια βλαστών. Στην ανθεκτική αναιμία με περίσσεια βλαστών, RAEB-1 και RAEB-2, όπως αυτή ορίζεται με μορφολογικά και κυτταρογενετικά κριτήρια οι διαταραχές έκφρασης αντιγόνων τόσος στα πρόδρομα όσο και στα ώριμα

16 κύτταρα της μυελικής και μονοκυτταρικής σειράς μπορεί να μεταβάλλουν την διάγνωση και να έχουν προγνωστική σημασία για τους ασθενείς αυτούς. 3.3 Σημασία του ανοσοφαινότυπου στην παρακολούθηση ασθενών των ΜΔΣ Κανένα από τα ισχύοντα προγνωστικά συστήματα δεν μπορεί να προβλέψει την ανταπόκριση των ασθενών με ΜΔΣ στην θεραπεία. Σε πρόσφατη μελέτη φάνηκε ότι η ανίχνευση άτυπου φαινοτύπου σε πρόδρομα κύτταρα της μυελικής σειράς ασθενών με χαμηλού και ενδιαμέσου κινδύνου-1 ΜΔΣ προβλέπει την ανταπόκριση σε αυξητικούς παράγοντες. Έτσι ασθενείς με χαμηλά επίπεδα Ερυθροποιητίνης(EPO) και φυσιολογική έκφραση αντιγόνων στα πρόδρομα κύτταρα της μυελικής σειρά ανταποκρίνονται στην χορήγηση EPO και G-CSF (94%)ενώ ασθενείς με υψηλά επίπεδα EPO και παθολογική έκφραση αντιγόνων δεν ανταποκρίνονται στην χορήγηση αυξητικών παραγόντων (11%)(26, 27). Σε άλλη μελέτη φάνηκε ότι ο βαθμός φωσφορυλίωσης της perk όπως αυτή ανιχνεύεται με κυτταρομετρία ροής σχετίζεται με την ανταπόκριση στην EPO και την συνολική επιβίωση ασθενών με χαμηλού και ενδιαμέσου κινδύνου -1 ΜΔΣ. (28) Παρακολούθηση ασθενών με κυτταρομετρία ροής μπορεί να είναι σημαντική αφενός για την αναγνώριση νέων παθολογικών αντιγονικών εκφράσεων κατά την εξέλιξη της νόσου ή την απώλεια των παθολογικών αντιγονικών εκφράσεων μετά από ανταπόκριση σε θεραπεία, ιδιαίτερα για ασθενείς που αντιμετωπίζονται με υπομεθυλιωτικούς παράγοντες όπως 5-αζασυτιδίνη.(29) 4. ΚΑΤΕΥΘΥΝΤΗΡΙΕΣ ΟΔΗΓΙΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΣΗΜΑΝΣΗ ΚΑΙ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΜΔΣ Οι διαταραχές της έκφρασης των αντιγόνων σε ασθενείς με ΜΔΣ εμφανίζουν εντυπωσιακή επαναληψιμότητα και είναι διακριτές για κάθε στάδιο ωρίμανσης της αιμοποίησης. Η σχέση των αντιγονικών αυτών συνδυασμών με άλλες διαγνωστικές παραμέτρους ή με τους παθογενετικούς μηχανισμούς εμφάνισης της νόσου ή εξέλιξης της σε ΟΛ είναι άγνωστη. Τα παθολογικά σκεδαστικά των ουδετερόφιλων πιθανώς αποτελούν δείκτη των μορφολογικών διαταραχών που χαρακτηρίζουν τα ΜΔΣ ενώ οι ατυπίες στην έκφραση αντιγόνων σχετίζονται με την παθολογική ωρίμανση των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων και πιθανώς αποτελούν δείκτες υποκείμενων παθογενετικών μηχανισμών. 4.1 Πρόταση European LeukeniaNet για διαγνωστική προσέγγιση των ΜΔΣ Τον Μάρτιο του 2008, αντιπρόσωποι 18 Ευρωπαϊκών Κέντρων, 3 Κέντρων της Αμερικής και 1 της Ιαπωνίας με μεγάλη εμπειρία στην ανοσοφαινοτύπιση των ΜΑΣ στα πλαίσια των εργασιών του Euronet LeukemiaNet αφού ανέλυσαν ερωτηματολόγια που είχαν συμπληρωθεί από 15 από τα 22 συμμετέχοντα Κέντρα έδωσαν οδηγίες για όλα τα στάδια προετοιμασίας και ανάλυσης των δειγμάτων και έθεσαν τα ερωτήματα τα οποία πρέπει να απαντηθούν ώστε να αξιολογηθεί η διαγνωστική σημασία της κυτταρομετρίας στα νοσήματα αυτά (9). Κατά συνέπεια ενώ κατευθυντήριες οδηγίες για τις κλινικές ενδείξεις χρήσης της κυτταρομετρίας στα ΜΔΣ είναι αμφισβητούμενες οι κατευθυντήριες οδηγίες για τις τεχνικές που πρέπει να ακολουθηθούν είναι λεπτομερείς και γενικά αποδεκτές.

17 4.1.1 Δείγματα Η ανάλυση με κυτταρομετρία ροής πρέπει να γίνεται σε δείγματα μυελού των οστών διότι δεν υπάρχουν επαρκή δεδομένα από ανάλυση περιφερικού αίματος. Τα δείγματα πρέπει να συλλέγονται κατά προτίμηση σε ηπαρίνη με δεύτερη επιλογή το EDTA γιατί το EDTA επηρεάζει την έκφραση των αντιγόνων CD16, CD11b CD64, CD Να αναλύονται κατά προτίμηση σε 24 ώρες. Αν πρέπει να φυλαχθούν συνιστάται αποθήκευση σε θερμοκρασία δωματίου και προσθήκη καλλιεργητικού υλικού (1:1) που να περιέχει γλυκόζη Λύση ερυθρών Συνιστάται λύση των ερυθρών πριν την σήμανση με χλωριούχο αμμώνιο χωρίς μονιμοποιητικό. Η λύση μπορεί να γίνει με ανάμιξη 3ml μυελού των οστών με χλωριούχο αμμώνιο σε τελικό όγκο 50 ml, επώαση 10 min σε θερμοκρασία δωματίου πλύσιμο των κυττάρων με PBS με προσθήκη 0,5% βόειδιο ή ανθρώπινη αλβουμίνη (washing solution) Φυγοκέντρηση σε 300g Επαναιώρηση των κυττάρων στο washing solution. Άλλα εμπορικά λυτικά διαλύματα χωρίς μονιμοποιητικό μπορούν να χρησιμοποιηθούν Σήμανση με αντισώματα Συνιστάται σήμανση κυττάρων /σωληνάριο Τα αντισώματα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε ιδανικές συγκεντρώσεις, μετά από τιτλοποίηση. Εφόσον πρέπει να αραιωθούν αυτό πρέπει να γίνει σε washing solution Επώαση 15 min σε θερμοκρασία σωματίου στο σκοτάδι. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό για tandem φθοροχρώματα που είναι πολύ ευαίσθητα στο φώς. Μετά την επώαση πρέπει τα κύτταρα να πλυθούν τουλάχιστον μία φορά με washing solution. Μετά την επιφανειακή σήμανση και εφόσον δεν ακολουθήσει ενδοκυττάρια χρώση τα κύτταρα πρέπει να μονιμοποιηθούν. Η μονιμοποίηση πρέπει να γίνει με εμπορικά διαθέσιμα αντιδραστήρια, 0,5% παραφορμαλδεύδη (PFA) σε PBS (ph 7.4). Τα κύτταρα δεν πρέπει να αποθηκευθούν αλλά αμέσως να αναλυθούν. Η μονιμοποίηση αυτή δεν μεταβάλλει τα σκεδαστικά των κυττάρων. Εάν ακολουθήσει ενδοκυττάρια χρώση πρέπει να χρησιμοποιηθούν εμπορικά αντιδραστήρια που έχουν αξιολογηθεί επαρκώς για αυτήν την χρήση. Μετά την επώαση ακολουθεί πλύσιμο των κυττάρων. Επειδή πολλά μονιμοποιητικά των αντιδραστηρίων για ενδοκυττάρια χρώση μεταβάλουν τα σκεδαστικά των κυττάρων δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται τα χαρακτηριστικά των κυττάρων μετά από ενδοκυττάρια χρώση για ορισμό των δυσπλαστικών κυττάρων Κυτταρομετρητής Οι κυτταρομετρητές πρέπει να ρυθμίζονται σύμφωνα με τις ισχύουσες οδηγίες Συνδυασμοί μονοκλωνικών αντισωμάτων.

18 Στον πίνακα 4 συνοψίζεται η πρόταση της European LeikemiaNet για τους απαραίτητους συνδυασμούς αντισωμάτων ώστε να προσδιορισθούν οι δυσπλαστικοί πληθυσμοί σε κάθε στάδιο ωρίμανσης. Σε κάθε συνδυασμό προστίθεται και το CD45 βάσει του οποίου θα γίνει η ανάλυση. Στον πίνακα αυτό δεν καθορίζεται ο αριθμός των χρωμάτων που πρέπει να χρησιμοποιηθεί αλλά από τους προτεινόμενου συνδυασμούς και την προσθήκη του CD45 προϋποθέτει την χρήση τουλάχιστον 3 χρωμάτων. Στους πίνακες 5 και 6 φαίνεται η πρόταση για συνδυασμό 4 ή 5 χρωμάτων Ανάλυση Ανάλυση των άωρων κυττάρων της μυελικής και λεμφικής σειράς Ορισμός και καταμέτρηση βλαστών. Η ταυτοποίηση των μυελοβλαστών γίνεται από τον συνδυασμό CD45dim/SSlow (βλαστικό παράθυρο). Η διαφοροποίηση τους από τα αιματογόνια, τους λεμφοβλάστες, τα βασεόφιλα, τα πρόδρομα δενδριτικά κύτταρα και τους μονοβλάστες γίνεται με τους συνδυασμούς CD45/CD34/CD117/HLA-DR και CD45/CD34/CD123/HLA-DR Στην καταμέτρηση των μυελοβλαστών πρέπει να έχουμε υπόψιν μας ότι συχνά το ποσοστό των βλαστών όπως αυτοί καταμετρούνται από τη κυτταρομετρία είναι χαμηλότερο από το ποσοστό των βλαστών που αναγνωρίζονται στα επιχρίσματα μυελού των οστών. Αυτό συμβαίνει διότι τα δείγματα μυελού για κυτταρομετρία περιέχουν λιγότερα κοκκία μυελού από τα επιχρίσματα συνήθως λόγω αραίωσης με περιφερικό αίμα. Επιπλέον ο ορισμό των βλαστών διαφέρει μεταξύ μορφολογίας και κυτταρομετρίας. Στην κυτταρομετρία αποκλείονται από την ανάλυση οι λεμφοβλάστες, μονοβλάστες και τα αιματογόνια ενώ στην μορφολογία οι πληθυσμοί αυτοί συχνά καταμετρούνται μαζί. Σπάνια οι βλάστες στα ΜΔΣ δεν εκφράζουν CD34 με αποτέλεσμα την δυσκολία ταυτοποίησης τους αν δεν χρησιμοποιείται ταυτόχρονα εναλλακτικό αντιγόνο πχ CD117. Για τους παραπάνω λόγους το ποσοστό βλαστών που θεωρείται παθολογικό για την κυτταρομετρία ροής είναι το 3% σε αντίθεση με την μορφολογία που είναι το 5%. Ταυτόχρονα καταμετρούνται τα άωρα κύτταρα της Β λεμφικής σειράς με βάση την έκφραση των CD34/CD19/CD10. Η μείωση των κυττάρων αυτών στα ΜΔΣ δεν έχει αξιολογηθεί κλινικά και δεν είναι γνωστό αν τα χαρακτηρίζει ή αν οφείλεται στην ηλικία των ασθενών Άτυπη έκφραση αντιγόνων στους βλάστες. Μετά την καταμέτρηση τους οι βλάστες αναλύονται για άτυπες εκφράσεις αντιγόνων. Στον πίνακα 1 αναφέρεται η συχνότητα άτυπης ή παράδοξης έκφρασης αντιγόνων στους μυελοβλάστες των ασθενών με ΜΔΣ Ανάλυση έκφρασης αντιγόνων σε κύτταρα ενδιάμεσης και τελικής ωρίμανσης της μυελικής σειράς Τα ώριμα κοκκιοκύτταρα ορίζονται από την έκφραση του CD45 ενδιάμεση και του SS έντονο Στα ΜΔΣ η πιο συνηθισμένη διαταραχή είναι η μείωση της κοκκίωσης των κοκκιοκυττάρων που είναι ένα βασικό διαγνωστικό μορφολογικό κριτήριο και στην κυτταρομετρία εκφράζεται με ελάττωση του SS των ουδετερόφιλων. Στον πληθυσμό αυτών εμφανίζεται άτυπη έκφραση αντιγόνων όπως αυτή φαίνεται στον πίνακα 2.

19 Προσοχή χρειάζεται στην ερμηνεία των ευρημάτων της κυτταρομετρίας ροής σε σχέση με την διάγνωση των ΜΔΣ. Η ελάττωση του SS μπορεί να δυσκολεύει την διάκριση του πληθυσμού των ουδετερόφιλων από αυτόν των μονοπυρήνων. Στην περίπτωση αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί η έκφραση του CD33 για την διάκριση των ουδετερόφιλων από τα μονοπύρηνα (CD33 dim, CD33 bright, αντίστοιχα). Για την ερμηνεία της άτυπης έκφρασης αντιγόνων πρέπει να λαμβάνεται υπόψιν ότι το EDTA μεταβάλλει την έκφραση αντιγόνων των οποίων η έκφραση είναι Ca εξαρτώμενη, όπως του CD11b. Δείγματα που δεν σημαίνονται άμεσα μπορεί να ενεργοποιηθούν και να μεταβληθεί η έκφραση των αντιγόνων CD64 και HLA-DR. Επιπλέον η έκφραση ορισμένων αντιγόνων όπως CD16, CD11b, CD64 και HLA-DR μπορεί να σχετίζεται με την επιλογή των κλώνων των MoAb που χρησιμοποιούνται. Η υπερέκφραση του CD56 δεν είναι απαραίτητα παθολογική; μπορεί να σχετίζεται με τη χρήση G-CSF ή την αναγέννηση του μυελού. Κατά συνέπεια η ειδικότητα των μεταβολών αυτών για τα ΜΔΣ πρέπει να αποδειχθεί Ανάλυση έκφρασης αντιγόνων σε κύτταρα ενδιάμεσης και τελικής ωρίμανσης της μονοκυτταρικής σειράς Τα μονοκύτταρα ορίζονται με βάση την έκφραση του CD45 και SS και επιπλέον τους δείκτες CD14, CD36, CD64, CD55. Το CD14 δεν πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο του καθώς εμφανίζεται όψιμα στην διαφοροποίηση και πιθανώς υποτιμά τον μονοκυτταρικό πληθυσμό ιδιαίτερα παρουσία πρόδρομων μονοκυττάρων. Οι άτυπες εκφράσεις αντιγόνων στον μονοκυτταρικό πληθυσμό φαίνονται στον πίνακα 2. Χρήσιμος επίσης είναι ο συνδυασμός IREM2 και CD14 για την διαφοροποίηση των φυσιολογικών από τα λευχαιμικά μονοκύτταρα. Φυσιολογικά το CD14 εκφράζεται πριν το IREM2 ενώ σε λευχαιμικά μονοκύτταρα η διαδοχή αυτή μπορεί να αναστραφεί Ανάλυση έκφρασης αντιγόνων σε κύτταρα της ερυθράς σειράς. Τα κύτταρα της ερυθράς σειράς ορίζονται από την έλλειψη έκφρασης CD45, το low SS και την έκφραση αντιγόνων CD235a και CD71. Η έκφραση των αντιγόνων C105 σε συνδυασμό με το C117 και CD56 μπορεί να διαφοροποίησει την φυσιολογική από δυσπλαστική αιμοποίηση (πίνακας 3). Η έκφραση της M-φερριτίνης φαίνεται ότι σχετίζεται με την παρουσία δακτυλοειδών ερυθροβλαστών. Συμπερασματικά, δεν υπάρχουν ακόμα σαφείς κλινικές ενδείξεις για την χρήση κυτταρομετρίας στην διάγνωση των ΜΔΣ. Τα υπάρχοντα δημοσιευμένα δεδομένα δείχνουν ότι η χρήση της θα συμπληρώσει τις διαθέσιμες διαγνωστικές τεχνικές της κυτταρομορφολογίας και κυτταρογενετικής για την ακριβέστερη διάγνωση κυρίως των ΜΔΣ χαμηλού κινδύνου και των αδιευκρίνιστων κυτταροπενιών. Η ανίχνευση παθολογικών αντιγονικών συνδυασμών σε άωρα και ώριμα αιμοποιητικά κύτταρα μπορεί να αποτελέσουν δείκτες παρακολούθησης της εξέλιξης της νόσου και ανταπόκρισης στη θεραπεία. Πρέπει να επισημανθεί ότι τα ΜΔΣ αποτελούν μία εξαιρετικά ετερογενή ομάδα νοσημάτων ενώ η ανάλυση των δεδομένων της κυτταρομετρίας με τις σύγχρονες τεχνικές είναι εξαιρετικά πολύπλοκη, απαιτεί εμπειρία στην κυτταρομετρία και εξειδίκευση στα ΜΔΣ. Για να γενικευθεί η χρήση της απαιτείται προτύπωση τεχνικών και ανάλυσης και αξιολόγηση τους βάση κλινικών δεδομένων σε