Χρήστος Βαλαβάνης. Μονάδα Μοριακής Ιστοπαθολογίας Τµήµα Παθολογικής Ανατοµικής Ε.Α.Ν.Π. «ΜΕΤΑΞΑ»

Transcript

1 ΑΠΟΠΤΩΣΗ Μοριακοί Μηχανισµοί Μέθοδοι ανίχνευσης Κλινικές εφαρµογές Χρήστος Βαλαβάνης Μονάδα Μοριακής Ιστοπαθολογίας Τµήµα Παθολογικής Ανατοµικής Ε.Α.Ν.Π. «ΜΕΤΑΞΑ»

2 Προγραµµατισµένος Κυτταρικός Θάνατος (ΠΚΘ) Ορισµός Βιολογική σηµασία Τύποι Μορφολογικά χαρακτηριστικά Βιοχηµικά χαρακτηριστικά Μοριακοί µηχανισµοί Σηµασία στην διαδικασία καρκινογένεσης Σηµασία στην θεραπευτική αντιµετώπιση των νεοπλασιών

3 Ορισµός Βασικό φυσιολογικό φαινόµενο που αφορά στην ελεγχόµενη και προγραµµατισµένη κυτταρική καταστροφή. Αποτελεί συστατικό λειτουργικό στοιχείο της οµοιόστασης των ιστών µαζί µε τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό και την διαφοροποίηση. Απαντάται σε όλους τους πολυκύτταρους οργανισµούς.

4 Βιολογική σηµασία Φυσιολογική Μορφογένεση Οµοιόσταση ιστών Ανοσολογική απόκριση Παθολογική Μειωµένος ΠΚΘ Νεοπλασίες Αυτοάνοσα νοσήµατα Στένωση αρτηριών Αυξηµένος ΠΚΘ Νευροεκφυλιστικά νοσήµατα Ισχαιµικά επεισόδια AIDS Απόρριψη µοσχευµάτων ιαβήτης τύπου Ι Οστεοαρθρίτις Τραύµατα ΚΝΣ

5 Τύποι Απόπτωση (Τύπος Ι προγραµµατισµένου κυτταρικού θανάτου) [ εξαρτώµενος από τη δράση κασπασών] Απόπτωση Ανοίκιση (Anoikis Αυτοφαγία Μιτωτική καταστροφή Παράπτωσις (Τύπος ΙΙ Anoikis) (απόπτωση οφειλόµενη σε απώλεια κυτταρικής πρόσφυσης) Αυτοφαγία (Τύπος ΙΙ προγραµµατισµένου κυτταρικού θανάτου) Κυτταρική γήρανση Τύπος ΙΙI προγραµµατισµένου κυτταρικού θανάτου) Νέκρωση (τυχαία και χαοτική κυτταρική καταστροφή)

6 Αυτοφαγία (Τύπος ΙΙ προγραµµατισµένου κυτταρικού θανάτου) Πέψη ενδοκυττάριων οργανιδίων από τα λυσοσώµατα Beclin 1 και Atg7 Μιτωτική καταστροφή Βλάβες κυτταρικής διαίρεσης (ανευπλοειδία, πολυπλοειδία κ.α.) Παράπτωσις Κενοτοπίωση κυτταροπλάσµατος Οίδηµα µιτοχονδρίων και ενδοπλασµατικού δικτύου Κυτταρική γήρανση Οίδηµα και διόγκωση κυττάρων Αυξηµένη µικροκοκκώδης εµφάνιση κυττάρων Αναστολή της κυτταρικής αύξησης Ιδιαίτερα αργός κυτταρικός θάνατος

7

8 Απόπτωση Μορφολογικά χαρακτηριστικά Πρώιµη φάση Πύκνωση χρωµατίνης Πυρηνική αποδόµηση Συρρίκνωση πυρήνα Μέση φάση Αλλαγές στην κυτταρική µεµβράνη (membrane blebbing) Κυτταρική συρρίκνωση Καταστροφή κυτταροπλάσµατος και πυρήνα (καρυόρηξη) ηµιουργία αποπτωτικών σωµατίων Οψιµη φάση Φαγοκυττάρωση

9 Απόπτωση Βιοχηµικά χαρακτηριστικά Πρώιµη φάση Ενεργοποίηση κασπασών 3, 7 και 9 Αποκοπή CΚ-18, β-ακτίνης και PARP Μέση φάση Αποκάλυψη του αντιγόνου 7Α6 στην µιτοχονδριακή µεµβράνη Μετάθεση της φωσφατιδυλοσερίνης στην εξωτερική επιφάνεια της κυτταρικής µεµβράνης Κατάτµηση του DNA µεταξύ των νουκλεοσωµάτων ( bp DNA ladder)

10 A. Φυσιολογικό κύτταρο Β. Απόπτωση

11

12 Απόπτωση vs. Νέκρωση ΑΤP εξαρτώµενη ιατήρηση της δοµής των µιτοχονδρίων Κυτταρική συρρίκνωση Συµπύκνωση χρωµατίνης Κατάτµηση του DNA ( bp) Καρυόρηξη ηµιουργία αποπτωτικών σωµατίων Φαγοκυττάρωση Μη εξαρτώµενη από ATP Καταστροφή της δοµής των µιτοχονδρίων Κυτταρικό οίδηµα ηµιουργία συσσωµατωµάτων χρωµατίνης Καρυόλυση Τυχαία κατάτµηση του DNA Φλεγµονώδης αντίδραση Φαγοκυττάρωση

13 Απόπτωση Νέκρωση

14 Μοριακοί Μηχανισµοί Απόπτωσης Ρυθµιστικές πρωτείνες Κασπάσες Πρωτείνες της οικογένειας Bcl-2 Πρωτείνες της οικογένειας ΙΑP (Inhibitory Apoptosis Proteins) p53 και σχετιζόµενες µε p53 πρωτείνες Λειτουργικές φάσεις Φάση έναρξης - ενεργοποίησης Φάση εκτέλεσης Βιοχηµικοί οδοί (pathways) Εξωγενής - υποδοχέων Ενδογενής µιτοχονδρίων Ενδογενής ενδοπλασµατικού δικτύου

15 Ρυθµιστικές πρωτείνες Κασπάσες (Caspases) Πρωτείνες της οικογένειας Bcl-2 Πρωτείνες της οικογένειας ΙΑP (Inhibitory Apoptosis Proteins) p53 και σχετιζόµενες µε p53 πρωτείνες

16 Κασπάσες (Caspases) Πρωτεάσες (caspase : cysteine aspartyl-specific protease) οµή και ενεργοποίηση Ταξινόµηση Κασπάσες έναρξης [ Initiator caspases ] (substrate tetrapeptide specificity): Caspase-2 (DEHD); Caspase-8 (LETD/IETD) Caspase-9 (LEHD); Caspase-10 (IEAD); Caspase-12 (? ) Κασπάσες εκτέλεσης [ Effector caspases ] (substrate tetrapeptide specificity): Caspase-3 (DEVD); Caspase-6 (VEID); Caspase-7 (DEVD); Caspase-10 (IEAD)

17 Πρωτείνες της οικογένειας Bcl-2

18 Πρωτεΐνες της οικογένειας ΙΑP (Inhibitory Apoptosis Proteins)

19 p53 και σχετιζόµενες µε p53 πρωτεΐνες p53, p63, p73 Εµπλέκονται στην : - αναστολή του κυτταρικού κύκλου - επιδιόρθωση του DNA - απόπτωση ρουν ως µεταγραφικοί παράγοντες - αυξηµένη µεταγραφή (upregulation) προ-αποπτωτικών πρωτεινών και αναστολέων του κυτταρικού κύκλου - µειωµένη µεταγραφή (downregulation) πρωτεινών επιβίωσης

20

21

22

23 Λειτουργικές φάσεις Φάση έναρξης - ενεργοποίησης - απόκριση σε ερεθίσµατα θανάτου - ενεργοποίηση υποδοχέων / διµερισµός πρωτεινών της οικογένειας Bcl-2 - απελευθέρωση κυτοχρώµατος c - ενεργοποίηση κασπασών έναρξης Φάση εκτέλεσης - ενεργοποίηση κασπασών εκτέλεσης - ενεργοποίηση CAD (caspase dependent DNase) ή endog - κατάτµηση DNA (DNA fragmentation)

24 Βιοχηµικοί οδοί (pathways) µηχανισµών απόπτωσης Εξωγενής Υποδοχέων (TNFRs, Fas, DRs) Εξωγενής Granzyme/Perforin Ενδογενής Μιτοχονδρίων Ενδογενής Ενδοπλασµατικού δικτύου (ER)

25

26

27

28 ER-mediated apoptosis

29 Μέθοδοι ανίχνευσης Ανοσοϊστοχηµεία (IHC) TUNEL (terminal deoxyribonucleotidyl transferase mediated dutp nick end labelling) ISEL (in situ end labelling) ISLG-LDF (in situ ligation of labeled DNA fragments) Ratio mitotic index / apoptotic index (MI / AI)

30 Detection Method Apoptotic Events during Time Very Early Early Intermediate Late Very Late IHC IHC IHC IHC IHC IHC IHC, biotin-annexin V IHC, mab APO 2.7 TUNEL ISEL ISLG-LDF Microscopy (Propidium iodide for cell cultures) Caspase-9 activation Caspase-3 activation Caspase-7 activation Cytokeratin-18 cleavage Fractin generation PARP cleavage Phosphatidylserine (PS) externalization Mitochondrial membrane 7A6 antigen exposure DNA fragmentation Morphological changes Plasma membrane leakage

31 Σηµασία απόπτωσης στην διαδικασία της καρκινογένεσης Χηµικά καρκινογόνα, Ακτινοβολίες κ.α. DNA σύµπλοκα Μεταλλάξεις νεοπλασµατική εξαλλαγή καρκινογένεση Αδυναµία επιδιόρθωσης ενεργοποίηση της απόπτωσης p53: κύριος ρυθµιστικός παράγοντας ενεργοποίησης της απόπτωσης σε περίπτωση DNA βλαβών Απορρύθµιση των µηχανισµών απόπτωσης οδηγεί στην αδυναµία εξάλειψης των µεταλλαγµένων νεοπλασµατικών κυττάρων Υψηλά επίπεδα αντι-αποπτωτικών πρωτεινών Χαµηλά επίπεδα προ-αποπτωτικών πρωτεινών

32 M.Parton et al. BMJ 2001;322:

33 Σηµασία απόπτωσης στην θεραπευτική αντιµετώπιση των νεοπλασιών Προγνωστικοί παράγοντες Προβλεπτικοί παράγοντες ανταπόκρισης στις διάφορες µορφές θεραπευτικής αντιµετώπισης (χηµειοευαισθησία- χηµειοανθεκτικότητα) Θεραπεία στόχευσης

34 Apoptotic index Higher levels in large tumors No relation with distant metastasis High levels correlated with positive axillary lymph nodes Higher levels in invasive ductal and medullary carcinomas compared to other types (lobular, papillary, mucinous) Low levels in highly differentiated tumors Not consistent findings in in situ carcinomas High levels in ER-negative tumors High levels of apoptosis worse survival

35 Προγνωστικοί παράγοντες p53 gene status Modulates the chemosensitivity p53 level Predictor for the response to chemo- or radiotherapy Mutant p Overall shortened survival Bax Low levels poor response to chemotherapy Bcl-2 High levels good prognosis Ratio of Bcl-2/Bax more accurate prognostic factor BAG-1 High levels improved survival in early stage Caspases 3,6 and 8 high levels higher levels of apoptosis and higher grade Fas-positive tumors longer disease free survival FasL/Fas ratio mrnas > shorter disease free survival

36 Μελλοντικές κατευθύνσεις Apoptosis detection : PET and MRI SNPs Targeted therapy : RNAi to Bcl-2 and Bclx L