Η Σημασία της Μοριακής Βιολογίας. Αιμιλία Στ. Χατζηγιάννη

Transcript

1 Η Σημασία της Μοριακής Βιολογίας στη Διάγνωση των Λοιμώξεων Αιμιλία Στ. Χατζηγιάννη

2 Σημασία Διάγνωσης Λοιμώξεων Στοχευμένη, έγκαιρη θεραπεία Περιορισμός μετάδοσης Μείωση κατάχρησης αντιβιοτικών Μείωση ανάπτυξης στελεχών με αντοχή Μείωση χρόνου νοσηλείας Επιδημιολογία

3 Συνήθεις Εξετάσεις Κλινικής Μικροβιολογίας Σκοπός: να γίνει ο παθογόνος οργανισμός ορατός και μετρήσιμος Καλλιέργεια Μικροσκόπηση Αντιγόνα Φαινότυπος Αντισώματα Ανοσολογική αντίδραση

4 Καλλιέργεια -Μειονεκτήματα Χρονοβόραδιαδικασία( μύκητες, μυκοβακτηρίδια) Ειδικά θρεπτικά υλικά Δεν αφορά όλα τα παθογόνα Κυτταροκαλλιέργειες για ιούς «Εκλεκτικά» -fastidious μικρόβια ( HACEK) (Haemophilus, Aggregatibacter(previously Actinobacillus), Cardiobacterium, Eikenella corrodens, Kingella) Σωστή λήψη δείγματος Μεταφορά Βιώσιμα παθογόνα

5 Μοριακή Βιολογία Η επιστήμη της Μοριακή Βιολογίας έχει αναπτύξει μεθόδους μεγάλης ευαισθησίας και ειδικότητας με τις οποίες μπορεί να ανιχνευτεί (ποιοτικά)να χαρακτηριστεί (γονοτυπικά) και να μετρηθεί η ποσότητα οποιασδήποτε γνωστής (ή και άγνωστης) αλληλουχίας πυρηνικών οξέων Μοναδικότητα γονιδιώματος κάθε οργανισμού

6 Μοριακή Διάγνωση στις Λοιμώξεις Ταχεία ανίχνευση παθογόνων μικροοργανισμών Από καλλιέργεια Σε κλινικά δείγματα Και μετά από έναρξη αγωγής Όλα τα παθογόνα DNA και RNA

7 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης-1985 Μόριο DNA Αποδιάταξη DNA (90 ο ) Σύνδεση ειδικών ολιγονουκλεοτιδίων Εκκινητές(primers) (50 ο ) Σύνθεση καινούργιου συμπληρωματικού DNA Θερμοάντοχη DNA πολυμεράση (72 o )

8

9 ΑλυσιδωτήΑντίδρασηΠολυμεράσης(PCR) ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΟΥ ΧΡΟΝΟΥ (REAL TIME) REAL-TIME

10 Υβριδισμός

11 Sequensing-Αλληλούχηση

12 Casey Schlenker et al Brittany Goldberg et al. mbio 2015

13 Brittany Goldberg et al. mbio 2015

14 Πολυπλ λοκότητα Palavecino E. Molecular Testing in Infectious Diseases

15 Εφαρμογές Μοριακών Εξετάσεις στις Λοιμώξεις Ανεύρεση νέων παθογόνων Ανίχνευση συγκεκριμένου παθογόνου (μόνο ή πολυπλεκτικά) Ποιοτική εξέταση(+/-): διάγνωση Ανίχνευση γονιδίων που οδηγούν σε αντοχή κατάλληλη θεραπεία Ποσοτικός προσδιορισμός ενεργότητα, ανταπόκριση και παρακολούθηση θεραπείας Τυποποίηση: Πολυμορφισμοί, μεταλλαγές, γονότυποι

16 Κλινική Σημασία Σε λοιμογόνους οργανισμούς που είναι: Σε εξαιρετικά μικρή ποσότητα Δεν καλλιεργούνται ή καλλιεργούνται δύσκολα σε ειδικές συνθήκες Επικίνδυνη καλλιέργεια Σε περιπτώσεις που είναι σημαντική: Η ταχύτητα Ευαισθησία Ειδικότητα

17 Πεδίο Ιολογία Διάγνωση Παραδείγματα Εφαρμογών Παραδείγματα Herpes simplex virus, cytomegalovirus, Epstein-Barr virus, varicellazoster virus, human herpes virus type 6, 7, 8. Ιοίαναπνευστικού(influenza virus, respiratory syncytialvirus, parainfluenzavirus, adenovirus, rhinovirus),sars-cov, avian influenza virus. HIV, hepatitis B, hepatitis C, human papilloma virus, enterovirus,orfvirus, rotavirus, norovirus, enteric adenoviruses Βακτηριολογία C. trachomatis, N. gonorrhoeae, B. pertussis, M. tuberculosis, nontuberculousmycobacteria, T. whipplei, B. henselae, genital mycoplasmata, C. burnettii M. pneumoniae, C. pneumoniae, Legionella spp., N. meningitidis, S. pneumoniae Παρασιτολογία Μυκολογία- Μυκοβακτήρια Plasmodium spp., T. gondii P. jiroveci, Aspergillus spp., ΜΤΒ

18 Ειδικές Εφαρμογές Εξέταση ΙικόΦορτίο ΙικόςΓονότυπος Ιική Αντοχή Λοίμωξη Cytomegalovirus, Epstein-Barr virus hepatitis B, hepatitis C, HIV HIV, hepatitis B, hepatitis C, human papillomavirus ΒακτηριακήΑντοχή MRSA, VRE, ESBL E. coli, K. pneumoniae, M. tuberculosis Βακτηριακός γονότυπος M. tuberculosis, N. meningitidis Ευρέως φάσματος PCR Ενδοκαρδίτιδα, Μηνιγγίτιδα

19 Πλεονέκτημα - Ταχύτητα Απάντηση σε σύντομο χρονικό διάστημα από τη λήψη του δείγματος Δεν «χάνεται» ο ασθενής Έγκαιρη κατάλληλη θεραπεία ασθενούς Εντόπιση θεραπεία άλλων ασθενών ή φορέων (π.χ. συντρόφων) Περιορισμός μετάδοσης

20 Παράδειγμα -Κοινές Λοιμώξεις Rapid antigen detection sensitivity 64.6% and specificity 96.79% Gurol Y et al Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 2010

21 Κλασσική Διάγνωση Χρονοβόρα Παράδειγμα -Μυκοβακτηρίδια Μεγάλη επώαση καλλιεργειών (3-4 εβδομάδες) Φαινοτυπική ποικιλομορφία Δύσκολη απομόνωση από βιολογικά υγρά όπως ΕΝΥ, πλευριτικό και περικαρδιακό Σημαντικός αριθμός παθογόνων μυκοβακτηριδίων εκτός ΤΒ (HIV και άλλου τύπου ανοσοκαταστολή)

22 Μικροσκοπική εξέταση παρασκευασμάτων Ευαισθησία: 10 4 / mlπτυέλου Ειδικότητα: δεν αναγνωρίζεται το είδος

23 Καλλιέργεια Καλλιέργεια 3-6 εβδομάδες Βιοχημική ταυτοποίηση 3-6 εβδομάδες Θρ. Υλικά Middlebrook'smedium(άγαρ) Lowenstein-Jensen medium(αυγό) περιέχουν ανασταλτές για περιορισμό επιμολύνσεων

24 ΦΥΜΑΤΙΩΣΗ (TB) Ταχεία και αξιόπιστη διάγνωση άμεση θεραπεία (Π.Ο.Υ. συνιστά συνδυασμό 3 ή 4 φαρμάκων για τουλάχιστον 6 μήνες: ισονιαζίδη, ριφαμπικίνη, πυραζιναμίδη, ριφαπεντίνη, αιθαμβουτόλη) απομόνωση του ασθενούς (Δημόσια Υγεία) έλεγχος περιβάλλοντος του ασθενούς (προφυλακτική αγωγή) Ελεγχος αντοχής 1985: παγκόσμια της συχνότητας πολυανθεκτικάστελέχη (MDR) -INH και RIF 2006: XDR [ extensivelydrugresistant]

25 Αντοχή

26 Μοριακή Διάγνωση Φυματίωσης Στόχος 16S rrna M. tuberculosis Ευαισθησία μεγαλύτερη σε θετικά (99%) από αρνητικά για οξεάντοχα βακτηρίδια δείγματα(46%) ΟΧΙ για αποκλεισμό νόσου Η ειδικότητα υψηλή για πνευμονική και εξωπνευμονικήφυματίωση >98% Επιβεβαίωση κλινικής υποψίας Κατάλληλος τρόπος ανίχνευσης αντοχής στη φαρμακευτική αγωγή - ισονιαζίδη, ριφαμπικίνη (katg, inha, ahpc rpob)

27 ΝΑΤ για Φυματίωση Ευαισθησία: 10 4 / ml AFB (+) : Θετική προγνωστική αξία μεγαλύτερη (>95%) σε συνθήκες όπου είναι συχνά τα NTM(non tuberculous mycobacteria) Σε αρνητική NAT, προσοχή ανασταλτές- επανάληψη AFB ( ) : Ταχεία επιβεβαίωση M.tbσε 50-80% AFB smear-negative/culture-positive Σε αρνητική NAΤ και καλλιέργεια ελάχιστη πιθανότητα TB

28 Πλεονέκτημα Ανίχνευση μη Βιώσιμων Μικροοργανισμών Γυναίκα 55 ετών με γενικευμένη λεμφαδενοπάθεια (λέμφωμα??) υπόκειται σε βιοψία λεμφαδένα: κυτταρομετρία ροής και ιστολογική εξέταση (μονιμοποίηση ). Δεν έγινε καλλιέργεια CD4:CD8 =0.1,HIV+ Ιστολογικά: κοκκίωμα με οξεάντοχα βακτήρια M avium/ intracellularecomplex (MAI)-αντιβίωση clarithromycin- ethambutol- rifampin PCR στο μπλοκ παραφίνης: Mycobacterium tuberculosis complex University of Washington Molecular Diagnosis Microbiology Section

29 Πλεονέκτημα-Ευαισθησία Ενδοκυττάριοι οργανισμοί (Ιοί, Μυκόπλασμα, Χλαμύδια) Χαμηλή ευαισθησία καλλιέργειας (Neisseria) Δύσκολη ή αδύνατη καλλιέργεια Bartonellaspp., Coxiellaburmetti, Brucellaspp., Legionella spp., Tropheryma whipplei

30 Ιολογία Η μεγαλύτερη συμβολή της Μοριακής Διάγνωσης Κυτταροκαλλιέργειες τεχνικά δύσκολες- χρονοβόρεςχαμηλής ευαισθησίας PCR -Ανίχνευση σε όλα τα βιολογικά υλικά Ποσοτικά (ιικό φορτίο)/γονοτύπωση(πρόγνωσηαντοχή) Μέθοδος αναφοράς: Ερπητική(HSV), από εντεροϊούς (EV) μηνιγγοεγκεφαλίτιδα, Ηπατίτιδα C, Λοίμωξη από HPV «Νέοι» ιοί

31 ENY - Λοιμώξεις Κεντρικού Νευρικού Συστήματος Σημαντική συμβολή της μοριακής διάγνωσης κυρίως στη γρήγορη ανίχνευση ιών αλλά και μικροβιακών παθογόνων στο ΕΝΥ ENY φυσιολογικά στείρο μικροβίων Τυπικά λοιμώξεις μονομικροβιακές Ανασταλτές σε μικρές συγκεντρώσεις Λιγότερα ψευδώς αρνητικά και ψευδώς θετικά Παραμένει ευαίσθητη και μετά την έναρξη αγωγής ΕΝΥ ΕΡΥΘΡΑ ΙΣΤΟΙ - ΕΠΙΜΟΛΥΝΣΗ

32 Etiology Common pathogens (eg, Strep pneumo, Haemophilus) When inclusion of NAT is indicated Gram stain +, culture -/ prior tx Preferred testing method(s) Gram stain and culture Fastidious organisms When clinically suspected Serology, NAT +/ culture Mycobacterium tuberculosis When clinically suspected AFB stain, culture, and NAT Arboviruses When clinically suspected Serology and NAT Cytomegalovirus (CMV) When clinically suspected NAT, preferably quantitative Epstein Barr Virus (EBV) When clinically suspected Serology and NAT quantitative Enteroviruses When clinically suspected NAT Human herpesvirus6 (HHV-6) Herpes simplex virus (HSV) Parechoviruses When clinically suspected NAT, preferably quantitative When clinically suspected Primarily in young children (<5 y) NAT NAT Varicella-zoster virus When clinically suspected NAT

33 ΕΝΥ Μοριακές Εξετάσεις για Παθογόνα Real Time PCR για συγκεκριμένα παθογόνα (μέθοδος αναφοράς για ερπητοιούς, εντεροιούς ) Πολυπλεκτική PCR ανίχνευση και ταυτοποίηση πάνελ από βακτήρια, ιοί και μύκητες Streptococcus pneumoniae, Neisseriameningitidis, Haemophilusinfluenzae, Streptococcus agalactiae(ie, group B Streptococcus), Escherichia coli, Listeria monocytogenes, enterovirus, herpes simplex virus 1 (HSV-1), herpes simplex virus 2 (HSV-2), varicella-zoster virus (VZV), cytomegalovirus (CMV), human herpesvirus 6 (HHV- 6), human parechovirus, Cryptococcus neoformans/gattii

34 Μοριακή εξέταση και αξιολόγηση αποτελεσμάτων με την προ της εξέτασης πιθανότητα λοίμωξης ΕΝΥ Αύξηση λευκοκυττάρων Πρωτεΐνη Tang YW et al. Clin Infect Dis. 1999, Simko JP et al. Clin Infect Dis. 2002, Davies NW et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry, CSF PCR 13 HSV+: όλα WBC/Pr WBC/Pr -: όλα PCR

35 Κλινική Σημασία Το αρνητικό αποτέλεσματης PCR σε υψηλή κλινική υποψία πρέπει να χρησιμοποιείται με μεγάλη προσοχή Συχνά επιμόλυνση από αίμα μπορεί να οδηγήσει σε ψευδώς αρνητικά ή και θετικά αποτελέσματα Σε υψηλή κλινική υποψία όταν η PCRείναι θετική η προγνωστική της αξία φτάνει το 99% ενώ αν είναι αρνητική η πιθανότητα αυτής της διάγνωσης είναι περίπου 6% (Αναστολείς - αίμα, βακτηρίδια) Ελαττώνεται ο χρόνος νοσηλείας των ασθενών κατά 1,2-2,8 ημέρες

36 CMV -Ανοσολογική ανεπάρκεια- Μεταμόσχευση Tο συχνότερο μετά από μεταμόσχευση παθογόνο Ποσοτικός προσδιορισμός για έγκαιρη διάγνωση της νόσου Η συχνότητα του μοριακού ελέγχου σχετίζεται με τον κίνδυνο του κάθε ασθενή για την λοίμωξη (ορολογικό προφίλ δότη και λήπτη) Δείκτης για τερματισμό της θεραπείας ή έναρξης προφυλακτικής αγωγής

37 CMV ΙικόΦορτίο(CMV DNΑ) Η αξιολόγηση πολύπλοκη: παράγοντες που αφορούν ιό -ασθενή - μέθοδο Οι μετρήσεις δεν είναι συγκρίσιμες μεταξύ διαφορετικών τεχνικών Στον ίδιο ασθενή: ίδια μέθοδος -ίδιος τύπος δείγματος (ολικό αίμα ή πλάσμα) Σημαντική συνήθως θεωρείται η αύξηση x 3-5 Μετά από μεταμόσχευση η τάση αύξησης ιαιμίας είναι πιο σημαντικός δείκτης από την τιμή εκτός αν αυτή είναι πολύ υψηλή Σε έναρξη θεραπείας έλεγχος ιαιμίας εκείνη την μέρα(σε ενεργό νόσο οι τιμές αλλάζουν γρήγορα).επανέλεγχος σε μεσοδιαστήματα 5 έως 7 ημερών. Σταθερές τιμές ή αύξηση - γονοτυπική αντοχή?

38 Χαμηλές τιμές ιαιμίας Συχνές και πολλές φορές άνευ κλινικής σημασίας <1000 copies/ml ΣεCMV αμφιβληστροειδίτιδαή σε συμμετοχή του γαστρεντερικού, το ιικόφορτίο έχει χαμηλή προγνωστική αξία

39 Αντοχή σε αντιικά φάρμακα Οργανισμός Αντοχή Γονίδιο HSV Acyclovir Thymidine kinase CMV Ganciclovir Φωσφοτρανσφ/ση, DNA πολυμεράση HIV RT inh, protease inh RT, πρωτεάση HBV Nucleot/side analogues πολυμεράση

40 Λοιμώξεις Αναπνευστικού Viruses Adenovirus Coronavirus 229E Coronavirus HKU1 Coronavirus OC43 Coronavirus NL63 Human Metapneumovirus Human Rhinovirus/Enterovi rus Influenza A Influenza A/H1 Influenza A/H Influenza A/H3 Influenza B Parainfluenza 1 Parainfluenza 2 Parainfluenza 3 Parainfluenza 4 RSV Bacteria Bordetella pertussis Chlamydophila pneumoniae Mycoplasma pneumoniae FilmArray Respiratory Panel

41 Η αξία της μοριακής εξέτασης δειγμάτων του αναπνευστικού για ιούς εκτός από τον ιό της γρίπης και ίσως για RSV έχει αμφισβητηθεί Η μείωση της χρήσης αντιβιοτικών μετά από μοριακή εξέταση είναι μικρή και υπάρχει το ερώτημα ειδικά όταν σε μεγάλα πάνελ βρεθούν θετικά δείγματα αν πρόκειται για παθογόνα ή αποικιστές (colonizers) ή αποτελούν μέρος του αναπνευστικού virome

42 Ζητήματα που πρέπει να εξετάζονται πριν την απόφαση χρήσης συνδρομικήςμοριακής εξέτασης για το αναπνευστικό Είναι ο ασθενής σε ανοσοκαταστολή, βαρέως πάσχων ή ήταν προηγουμένως υγιής; Θα αλλάξει η κλινική αντιμετώπιση με το αποτέλεσμα της εξέτασης; Μερικές φορές οι περισσότερη πληροφορία δεν ισοδυναμεί με βελτίωση της κλινικής φροντίδας. Παράδειγμα: ένα θετικό αποτέλεσμα για rhinovirusπως θα ερμηνευθεί και αντιμετωπιστεί σε έναν ανοσοκατεσταλμένο ασθενή; Είναι η PCRγια ένα παθογόνο πιο κατάλληλη (π.χ. για γρίπη);

43 PCR γρίπη Ποιος εξετάζεται με μοριακές μεθόδους?

44 Όταν δεν υπάρχουν κρούσματα στην κοινότητα δε σημαίνει απαραίτητα ότι ο ασθενής είναι μολυσματικός Σε περιόδους επίπτωσης Σε νοσηλευόμενους, με νόσο κατωτέρου αναπνευστικού, όταν δεν έχει βρεθεί άλλη αιτία, και υπάρχει υποψία γρίπης, πρέπει να γίνεται επανέλεγχος σε νέο δείγμα και αντιική θεραπεία να ξεκινά ή να συνεχίζεται Ψευδώς Αρνητικά Συλλογή χειρισµός δείγµατος. Χρόνος από έναρξη συµπτωµάτων

45 Σήψη Καλλιέργειες αίματος - ανεπαρκής μέθοδος αναφοράς Χρόνος 1-5 μέρες Χαμηλή ευαισθησία στην κλινική σήψη Φαγοκυττάρωση Παρουσία παθογόνων μόνο στην εστία λοίμωξης Πολύ μικρός αριθμός κυκλοφορούντων μικροβίων Δύσκολα αναπτυσσόμενοι (Haemophilus, Actinobacillus, Cardiobacterium)ή μη καλλιεργούμενοι μικροοργανισμοί (Bartonella, Coxiella burnetii, Tropheryma whipplei) Έναρξη αντιβιοτικής αγωγής πριν την λήψη του αίματος Ψευδώς θετικά 5-50% ανάλογα τρόπου συλλογής δείγματος Εμπειρική αντιμικροβιακή αγωγή δύσκολη διαχείριση (step down)

46 Fred C. Tenover Expert Review of Precision Medicine and Drug Development 2018

47

48 Συμφωνία μεταξύ multiplex PCRκαι καλλιέργειας αίματος κυμαίνεται από 55-85% Η κλινική σημασία των θετικών μόνο με PCR δειγμάτων, με αρνητικές καλλιέργειες για τον ίδιο μικροοργανισμό και από άλλα σημεία δύσκολο να εκτιμηθεί Οι μοριακές εξετάσεις δεν αντικαθιστούν κ/α Συμπληρωματική αξία

49 ΜΔ -ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ Πλεονεκτήματα σε σχέση με κλασσικές μεθόδους (όταν υπάρχουν) Ταχύτητα Ευαισθησία Ειδικότητα Ποσοτικός προσδιορισμός Οικονομικές σε μεγάλο όγκο δειγμάτων και μεγάλη οικονομία εκεί που το αποτέλεσμα μειώνει τη νοσηλεία, βοηθά στη διάγνωση και στην κατάλληλη θεραπεία

50 PCR στο Κλινικό Δείγμα Ειδική παθογόνου Πολυπλεκτικέςreal-time PCR Ευρέως φάσματος (rrna) Κλινική υποψία (ιστορικό -κλινική εικόνα εργαστηριακά ευρήματα) Διαθεσιμότητα Όταν δεν υπάρχει κλινική υποψία για συγκεκριμένο παθογόνο εφαρμόζεται πολυπλεκτική PCR (ανάλογα με κλινικό σύνδρομο) ή PCRευρέως φάσματος με εκκινητέςπου στοχεύουν τα γονίδια 16S rrna, 23S rrna, (universal)

51 Pitfalls Δειγματοληψία Μεταφορά Φύλαξη Ψευδώς θετικά Ψευδώς αρνητικά

52 Ευαισθησία PCR

53 Επίπτωση στη Δημόσια Υγεία

54