«Έρευνα στη Γυναικεία Αναπαραγωγή»

Transcript

1 Μεταπτυχιακό πρόγραμμα σπουδών Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Αθήνας «Έρευνα στη Γυναικεία Αναπαραγωγή» Δέσποινα Τζανακάκη Βιολόγος Κλινική Εμβρυολόγος Τμήμα Εξωσωματικής Γονιμοποίησης - Β Μαιευτική & Γυναικολογική Κλινική Πανεπιστήμιο Αθήνας - Αρεταίειο Νοσοκομείο

2

3 Πρόκληση ωοθυλακιορρηξίας Φαρμακευτικές ουσίες Κιτρική κλομιφαίνη. Γοναδοτροπίνες (FSH, LH). Ανάλογα υποθαλαμικής ορμόνης (αγωνιστές, ανταγωνιστές). Χοριακή γοναδοτροπίνη. ιάφορα πρωτόκολλα ελεγχόμενης διέγερσης ωοθηκών (μακρύ, βραχύ, πρωτόκολλο ανταγωνιστή κλπ.).

4 ΩΟΛΗΨΙΑ

5 ΙΑΛΟΓΗ ΩΑΡΙΩΝ Συλλογή ωοθυλακικού υγρού σε δοκιμαστικούς σωλήνες κατά την ωοληψία. Μεταφορά του υγρού σε τρυβλία και αναζήτηση ωαρίων κάτω από στερεοσκόπιο. Εντοπισμός και «ξέπλυμα» ωαρίων. Μεταφορά ωαρίων σε μικροσταγόνες καλλιεργητικού μέσου. Παραμονή για ~ 3 ώρες σε επωαστή (37 C, 5 ή 6% CO 2 ).

6 Ωοληψία

7 OOCYTE CUMULUS COMPLEX Ωάριο μέσα σε σύμπλεγμα θυλακιακών κυττάρων, μετά την ωοληψία.

8

9

10 ΣΤΑ ΙΑ ΩΡΙΜΑΝΣΗΣ ΩΑΡΙΩΝ Ανώριμο ωάριο Ωάρια σταδίου GV (Germinal vesicle) Στάδιο ωχρού σωματίου Στάδιο μετάφασης ΙΙ

11 (A) Cumulus enclosed oocyte at the preantral stage. (B) Cumulus free oocyte at the preantral stage. (C) Metaphase II cumulus enclosed oocyte. (D) Metaphase II cumulus free oocyte.

12 ΩΑΡΙΟ ΠΡΟΦΑΣΗΣ Ι Απουσία πολικού σωματίου Παρουσία 2 GV Συνήθως μεγάλο μέγεθος

13 Φυσιολογικό ωάριο ΜΙΙ Ωάριο σταδίου GV Υπερμεγέθες ωάριο 2 GV

14 ΠΟΙΟΤΗΤΑ ΩΑΡΙΩΝ

15 Παράγοντες που επηρεάζουν την ποιότητα των ωαρίων Ηλικία γυναίκας Πρωτόκολλο διέγερσης

16 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΕΣ ΑΝΩΜΑΛΙΕΣ ΩΑΡΙΩΝ Κοκκιώδες PVS Μεγάλο PVS Θραυσματωμένο ΡΒ Πεπαχυσμένη και σκουρόχρωμη διάφανη ζώνη Κυτταροπλασματικές μορφολογικές ανωμαλίες

17 Ανώμαλα ωάρια Πολικό σωμάτιο με θραύσματα Θραύσματα Vacuoles «Γιγάντιο» ωάριο Degenerative eggs

18 IVF ή ICSI (Μικρογονιμοποίηση) ;

19 IVF ή ICSI (Μικρογονιμοποίηση) ;

20 IVF ή ICSI (Μικρογονιμοποίηση) ; Ενδείξεις για ICSI : «Φτωχό» σπέρμα : < 5 x 10 6 σπ/ρια /ml < 30% προωθητικά κινούμενα σπ/ρια. < 4% φυσιολογικές μορφές (αυστηρά κριτήρια). Αποτυχημένες/ μικρά ποσοστά γονιμοποίησης σε προηγούμενες IVF. Υψηλές συγκεντρώσεις αντισπερμικών αντισωμάτων. Απουσία σπ/ρίων στο σπέρμα (MESA/PESA,TESA/TESE). PGD(προεμφυτευτική διάγνωση).

21 IVF (περίληψη) Μεταφορά ωαρίων σε μικροσταγόνες καλλιεργητικού υλικού. Σπερματέγχυση ωαρίων (~ σπερματοζωάρια/ ml). Παραμονή σε επωαστή για 1 ώρα (ή όλη νύχτα). «Ξέπλυμα» ωαρίων - καθάρισμα μηχανικά από θυλακιακά κύτταρα. Έλεγχος γονιμοποίησης ωαρίων υπό ανεστραμμένο μικροσκόπιο. -2 προπυρήνες (PN) φυσιολογική γονιμοποίηση - 3 PN ανώμαλη γονιμοποίηση -1 PN ανώμαλη γονιμοποίηση Τοποθέτηση γονιμοποιημένων ωαρίων σε χωριστές μικροσταγόνες (φρέσκο καλλιεργητικό υλικό).

22 IVF Εντοπισμός και μεταφορά COCs (Cumulus Oocyte Complexes) σε καλλιεργητικό υλικό.

23 IVF Ενεργοποίηση σπέρματος και σπερματέγχυση ωαρίων (~ σπερματοζωάρια/ ml).

24 IVF Παραμονή σε επωαστή για 1 ώρα (ή όλη νύχτα), (37 C, 5 ή 6% CO 2 ).

25 ΗΜΕΡΑ 1η (Έλεγχος γονιμοποίησης) 2 PN συνέχιση καλλιέργειας 2 PN 3 PN 1 PN

26 Φυσιολογικά γονιμοποιημένο ωάριο (ζυγωτό) 2 προπυρήνες Σαφώς καθορισμένα νουκλεόλια στο σημείο σύζευξης των προπυρήνων

27 ΗΜΕΡΑ 1η (σύντηξη προπυρήνων)

28 Μη φυσιολογικά γονιμοποιημένα ωάρια 3 PN 1 PN

29 ΗΜΕΡΑ 1η (Έλεγχος γονιμοποίησης)

30 ΗΜΕΡΑ 2η Αξιολόγηση εμβρύων - Αριθμός βλαστομεριδίων - Μορφολογία (σχήμα, μέγεθος βλαστομεριδίων, θραύσματα) Επιλογή καλύτερων εμβρύων για εμβρυομεταφορά * Εναλλακτικά : Περαιτέρω καλλιέργεια εμβρύων ως το στάδιο της βλαστοκύστης και ΕΤ την 5η ημέρα.

31 2ηημέρα 4ηημέρα(μορίδιο) 4ηημέρα(μορίδιο) compaction 5ηημέρα(βλαστοκύστη)

32 Αξιολόγηση εμβρύων 2ης-3ης ημέρας Grade Εμφάνιση βλαστομεριδίων και ποσοστό θραυσμάτων Ομοιόμορφο σχήμα, ισομεγέθη βλαστομερίδια, μικρό PVS, ομοιόμορφο κυττ/σμα και θραύσματα <5% Μικρές παραμορφώσεις ή ελαφρώς ανισομεγέθη βλαστομερίδια με θραύσματα <5% ή ισομεγέθη βλαστομερίδια με θραύσματα 5-20% Ανισομεγέθη ή παραμορφωμένα βλαστομερίδια και θραύσματα 5-20% ή ομοιόμορφα βλαστομερίδια και θραύσματα 20-50% 4 Θραύσματα >50%

33 Έμβρυο 2 κυττάρων (42 h p.i.) PB

34 Έμβρυα 4 κυττάρων (2η ημέρα) Grade 1 Grade 4

35 Έμβρυα 8 κυττάρων (3η ημέρα) Grade 1 Grade 3 Grade 4

36 Αξιολόγηση βλαστοκύστης

37 Βλαστοκύστες (6η ημέρα ανάπτυξης) Α: Εκκολαπτόμενη βλαστοκύστη με καλή μορφολογία Β: Βλαστοκύστη με κακή μορφολογία

38 5η ημέρα(βλαστοκύστη) - hatching

39 Μορφολογικά κριτήρια επιλογής εμβρύων για εμβρυομεταφορά Αριθμός βλαστομεριδίων Μέγεθος και σχήμα βλαστομεριδίων Ποσοστό θραυσμάτων

40 Αριθμός εμβρύων που μεταφέρονται στη μήτρα ΝΟΜΟΣ ΥΠ' ΑΡΙΘ (ΦΕΚ Α 327/ ) Γυναίκες ηλικίας έως 40 ετών: μέχρι 3 έμβρυα. Γυναίκες ηλικίας άνω των 40 ετών: μέχρι 4 έμβρυα.

41 Εμβρυομεταφορά

42 Καθετήρας εμβρυομεταφοράς Εμβρυομεταφορά

43 Εμβρυομεταφορά

44 Εμβρυομεταφορά Cervix = C Bladder = B Lining = L Vagina = V

45 ICSI (περίληψη) Απομάκρυνση θυλακιακών κυττάρων και κυττάρων ακτινωτής στεφάνου με τη βοήθεια υαλουρονιδάσης και μηχανικής τριβής. Εντοπισμός ώριμων ωαρίων (Μ ΙΙ), εντοπισμός πολικού σωματίου. Τοποθέτησή τους σε μικροσταγόνες τρυβλίου μικρογονιμοποίησης. Ακινητοποίηση σπερματοζωαρίων (PVP). Ένεση ενός σπ/ρίου στο κυτταρόπλασμα ενός ωαρίου. Τοποθέτηση ωαρίων σε φρέσκο καλλιεργητικό (37 C, 5 ή 6% CO 2 ).

46 ICSI Ωάριο πριν και μετά από την απομάκρυνση των θυλακιακών κυττάρων (stripping) κατά την προετοιμασία για ICSI.

47 ICSI Απομάκρυνση θυλακιακών κυττάρων και κυττάρων ακτινωτής στεφάνου με τη βοήθεια υαλουρονιδάσης και μηχανικής τριβής. Υαλουρονιδάση Βελόνες μικροχειρισμών ωαρίων-εμβρύων

48 ICSI Εντοπισμός ώριμων ωαρίων (Μ ΙΙ), εντοπισμός πολικού σωματίου. Τοποθέτησή τους σε μικροσταγόνες τρυβλίου μικρογονιμοποίησης. Ενεργοποιημένο σπέρμα + PVP Λάδι Ωάριο ICSI dish

49 ΑΝΕΣΤΡΑΜΜΕΝΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ ΜΕ ΜΙΚΡΟΧΕΙΡΙΣΤΗΡΙΑ ΓΙΑ ICSI

50 Ακινητοποίηση σπερματοζωαρίου

51 Ακινητοποίηση σπερματοζωαρίου

52 Μικρογονιμοποίηση (ICSI)

53 ICSI

54 Μικρογονιμοποίηση (ICSI) μετά από TESE ή FNA. Εφαρμογή TESE ή FNA: Αζωοσπερμία (αποφρακτικού τύπου). Αποτυχία προκλητής εκσπερμάτισης με ηλεκτροδιέγερση.

55 TESE

56 Τι είναι ; ΥΠΟΒΟΗΘΟΥΜΕΝΗ ΕΚΚΟΛΑΨΗ Μικρήεκτομήτηςδιάφανηςζώνηςμεμηχανικό, χημικό τρόπο ή με laser, συνήθως την 3η ημέραμετάτη γονιμοποίηση. Ενδείξεις: πάχος διάφανης ζώνης ηλικία γυναίκας (>38 ετών) επαναλαμβανόμενες αποτυχίες εμφύτευσης κρυοσυντηρημένα έμβρυα in vitro ωρίμανση ιαδικασίες που σκληραίνουν τη διάφανη ζώνη «διάσωση» εμβρύων με καθυστερημένη ανάπτυξη ή «παγιδευμένων» βλαστοκύστεων

57 ΥΠΟΒΟΗΘΟΥΜΕΝΗ ΕΚΚΟΛΑΨΗ (ενζυματική υποβοήθηση με acid Tyrod s)

58 ΥΠΟΒΟΗΘΟΥΜΕΝΗ ΕΚΚΟΛΑΨΗ (με τη βοήθεια laser)

59 ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΣΗ Ορισμός Η διατήρηση κυττάρων (π.χ. γαμετών), ιστών (π.χ. εμβρύων τεμαχίων όρχεως ή ωοθήκης) ή ακατέργαστου βιολογικού υλικού (π.χ. σπέρματος) σε πολύ χαμηλή θερμοκρασία, με σκοπό τη χρήση τους σε μεταγενέστερη χρονική στιγμή. Μέσο κρυοσυντήρησης Υγρό άζωτο - θερμοκρασία -196 C.

60 Τι κρυοσυντηρούμε και γιατί; ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΣΗ (περίληψη) Σπέρμα (προσωρινή απουσία συζύγου, συγκέντρωση πολλών ολιγοζωοσπερμικών δειγμάτων, δότες, διατήρηση γονιμότητας πριν από επικείμενη χημειοθεραπεία ή χειρουργική επέμβαση). Έμβρυα (χρησιμοποίηση υπεράριθμων εμβρύων σε επόμενη προσπάθεια, δωρεά, περισσότερος χρόνος για PGD, καθυστέρηση εμβρυομεταφοράς λόγω υπερδιέγερσης ωοθηκών). Ωάρια (δωρεά, διατήρηση γονιμότητας σε επικείμενη απώλεια ωοθηκικής λειτουργίας ή σε γυναίκες που επιθυμούν να αποκτήσουν παιδιά σε μεγαλύτερη ηλικία, χρησιμοποίηση υπεράριθμων ωαρίων σε επόμενους κύκλους). Ωοθηκικό ιστό Ορχικό ιστό

61 ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΣΠΕΡΜΑΤΟΣ

62 ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΣΠΕΡΜΑΤΟΣ Χρησιμότητα: Απουσία συζύγου την ημέρα ωοληψίας/ σπερματέγχυσης. Συγκέντρωση πολλών ολιγοζωοσπερμικών δειγμάτων. ότες. Κίνδυνος απώλειας αναπαραγωγικής ικανότητας του άνδρα πριν από προγραμματιζόμενη αφαίρεση όρχεων για θεραπευτικούς σκοπούς, χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία. υσκολία σπερμοληψίας για ψυχολογικούς λόγους. Προοδευτική πτώση παραμέτρων σπέρματος. Σε χειρουργική λήψη σπέρματος, ώστε να αποφευχθεί νέα βιοψία σε πιθανή επόμενη προσπάθεια.

63 ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΣΠΕΡΜΑΤΟΣ Σχετικά αφυδατωμένα Αποφυγή δημιουργίας ενδοκυτταρικών κρυστάλλων Ανθεκτικότητα σε μεγάλους ρυθμούς μείωσης θερμοκρασίας Προσθήκη κρυοπροστατευτικού μέσου (π.χ. γλυκερόλη) Ο βαθμός επιβίωσης εξαρτάται από την ποιότητα του αρχικού δείγματος σπέρματος (συνήθως >50% των κινητών σπ/ρίων). ιατομή «παγιέτας» (straw) με γλυκερόλη ως κρυοπροστατευτικό

64 ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΣΠΕΡΜΑΤΟΣ - Πώς Ανάμειξη σπέρματος με κρυοπροστατευτικό υλικό (συνήθως γλυκερόλη ~ 5 10 % v/v). Τοποθέτηση μείγματος σε vials ή straws. ιατήρηση των vials ή straws σε «ατμούς» υγρού αζώτου για ~ 15 min. Εμβάπτισμα σε υγρό άζωτο (-196 C) και διατήρηση. Cryo-vials Straws

65 Χρησιμότητα: ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΕΜΒΡΥΩΝ Πλεονάζοντα έμβρυα καλή ποιότητας μετά από IVF. Αναβολή εμβρυομεταφοράς λόγω OHSS ή ανεπαρκούς ανάπτυξης ενδομητρίου. ιαφύλαξη αναπαραγωγικού δυναμικού γυναίκας που θα υποβληθεί σε χημ/πεία, ακτ/πεία, αφαίρεση ωοθηκών (προϋπόθεση η ύπαρξη συντρόφου). Πότε; 1η ημέρα μετά την ωοληψία (στάδιο προπυρήνων). 2η ή 3η ημέρα μετά την ωοληψία (4-8 κύτταρα). 5η ή 6η ημέρα(στάδιο βλαστοκύστης).

66 ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΕΜΒΡΥΩΝ Πώς; i. Slow freezing (προγραμματιζόμενη σταδιακή κατάψυξη). ii. Vitrification (υαλοποίηση).

67 ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΕΜΒΡΥΩΝ i) Slow freezing Έκθεση εμβρύων σε κρυοπροστατευτικό μέσο (π.χ. PROH/σουκρόζη/DMSO/γλυκερόλη) αυξανόμενης συγκέντρωσης (σταδιακή αφυδάτωση κυττάρου, για αποφυγή ωσμωτικού στρες κατά την απόψυξη). Τοποθέτηση εμβρύων σε straws & παραμονή σε θ δωματίου. Προγραμματιζόμενη σταδιακή κατάψυξη (-2 C/min έως -7 C). 5 min αναμονή Seeding* 5 min αναμονή. Συνέχιση σταδιακής κατάψυξης (-0,3 C/min έως -30 C). ιατήρηση - φύλαξη εμβρύων σε υγρό άζωτο (-196 C). * Πρόκληση δημιουργίας πολλών, μικρών εξωκυττάριων κρυστάλλων.

68 Thawing Αναθέρμανση straws σε υδατόλουτρο 30 C (30-90 sec) θ δωματίου (5 min). Πέρασμα εμβρύων από σειρά κρυοπροστατευτικού μέσου μειούμενης συγκέντρωσης. «Ξέπλυμα» εμβρύων από κρυοπροστατευτικό μέσο. Μεταφορά σε καλλιεργητικό υλικό και παραμονή σε επωαστή. Εμβρυομεταφορά.

69 ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΣΗ Cryo-vials Straws Goblets

70 ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΖΟΜΕΝΗΣ ΣΤΑ ΙΑΚΗΣ ΚΑΤΑΨΥΞΗΣ

71 ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΜΕΝΩΝ ΕΜΒΡΥΩΝ Canister Tank

72 ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΖΟΜΕΝΗ ΣΤΑ ΙΑΚΗ ΚΑΤΑΨΥΞΗ ΕΜΒΡΥΩΝ

73 ΕΠΙΒΙΩΣΗ ΕΜΒΡΥΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΣΗ Όλα τα έμβρυα δεν έχουν ίδια ικανότητα επιβίωσης. Έως % κυττάρων καταστρέφονται. Ορισμένα έμβρυα δεν επιβιώνουν ή μπορεί να απολέσουν κάποιο/α βλαστομερίδιο/α. Απώλεια 1-2 βλαστομεριδίων δεν εμποδίζει την επιτυχή εμφύτευση (ολοδύναμα κύτταρα). Έμβρυο μετά από κρυοσυντήρηση και απόψυξη

74 ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΕΜΒΡΥΩΝ ii) Vitrification Πολύ μεγάλος ρυθμός μείωσης θερμοκρασίας ( ως C / min), ώστε δεν προλαβαίνει να σχηματιστεί κρύσταλλος και το κρυοπροστατευτικό υλικό με το έμβρυο σχηματίζουν μια υαλώδη γέλη. Υψηλή συγκέντρωση κρυοπροστατευτικού υλικού (τοξικό, αλλά μικρή διάρκεια έκθεσης).

75 ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΩΑΡΙΩΝ

76 ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΣΗΣ ΩΑΡΙΩΝ ιατήρηση παράταση γονιμότητας της γυναίκας. Ασθένειες που θέτουν σε κίνδυνο τη γονιμότητα ωοθηκική λειτουργία (κορίτσια μικρής ηλικίας, μη ύπαρξη συντρόφου, ανεπάρκεια χρόνου για IVF, επικείμενη πρόωρη εμμηνόπαυση). Ανάγκη για άμεση έναρξη χημειοθεραπείας / ακτινοβολίας. Παράκαμψη ηθικών / θρησκευτικών προβλημάτων κρυοσυντήρησης εμβρύων (εναλλακτική πρόταση για χώρες που υπάρχει και νομικός περιορισμός, π.χ. Ιταλία). Αποφυγή προβλημάτων κυριότητας κρυοσυντηρημένων εμβρύων, σε ζευγάρια που παίρνουν διαζύγιο μετά από IVF. Ανάγκη προγραμμάτων με δότριες ωαρίων.

77 ΥΣΚΟΛΙΕΣ ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΣΗΣ ΩΑΡΙΩΝ Μεγάλη περιεκτικότητα ωαρίων σε νερό δημιουργία κρυστάλλων κατά την κατάψυξη αποδιοργάνωση και καταστροφή εσωτερικών / μεμβρανικών δομών ωαρίων. ιπολυμερισμός μικροσωληνίσκων μειωτικής ατράκτου από τη δημιουργία κρυστάλλων ή από τα κρυοπροστατευτικά υλικά επηρεάζεται ο φυσιολογικός διαχωρισμός των χρωματίδων κατά τη γονιμοποίηση ανευπλοειδία δημιουργούμενου εμβρύου. Σκλήρυνση της διάφανης ζώνης ανάγκη για ICSI μετά την απόψυξη ( και ίσως assisted hatching στα δημιουργούμενα έμβρυα).

78 Πιθανές επιπτώσεις στη δομή του ωαρίου από την κρυοσυντήρηση Ωάριο MII, με φυσιολογική μειωτική άτρακτο ιάσπαση μειωτικής ατράκτου ωαρίου MII Μερική διάσπαση διάφανης ζώνης ωαρίου MII

79 Ωάριο ΜΙΙ μετά από απόψυξη Γονιμοποιημένο ωάριο μετά από απόψυξη και ICSI

80 Βασικά στάδια κρυοσυντήρησης ωαρίων i. Έκθεση ωαρίων σε κρυοπροστατευτικό υλικό Τα κρυοπροστατευτικά υλικά (γλυκερόλη, PROH, DMSO, σουκρόζη) αντικαθιστούντονερόκαι εμποδίζουν τη δημιουργία κρυστάλλων μέσα στο ωάριο. ii. Ψύξη ωαρίων σε θ < 0 C iii. Φύλαξη ωαρίων σε υγρό άζωτο (- 196 C) iv. Αναθέρμανση (απόψυξη) ωαρίων v. Απομάκρυνση κρυοπροστατευτικού υλικού, μεταφορά ωαρίων σε καλλιεργητικό υλικό με κατάλληλο μικροπεριβάλλον

81 ΒΑΣΙΚΕΣ ΜΕΘΟ ΟΙ ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΣΗΣ ΩΑΡΙΩΝ Α. Slow freezing (σταδιακή προγραμματιζόμενη κατάψυξη). Σταδιακή μείωση θερμοκρασίας με ρυθμό 1 ως -2 C / min Πρώτο παιδί από κατεψυγμένο ωάριο το 1986 (Chen C, Lancet 1986), με slow freezing.

82 Β. Vitrification («υαλοποίηση») Πολύ μεγάλος ρυθμός μείωσης θερμοκρασίας ( ως C / min), ώστε δεν προλαβαίνει να σχηματιστεί κρύσταλλος και το κρυοπροστατευτικό υλικό με το ωάριο σχηματίζουν μια υαλώδη γέλη. Πρώτο παιδί από κατεψυγμένο ωάριο μετά από vitrification, το 1999 (Kuleshova et al., Hum Reprod 1999).

83 Πλεονεκτήματα vitrification Πιο απλή και πιο σύντομη διαδικασία Μικρότερο κόστος Τελευταίες μελέτες παρουσιάζουν καλύτερα αποτελέσματα (επιβίωσης ωαρίων, γονιμοποίησης, ανάπτυξης εμβρύων, εμφύτευσης και εγκυμοσύνης). (Lornage et al. 2007, Huang et al. 2007, Ko et al. 2007, Kuleshova et al. 2002, Vajtu et al. 2006, Ambrosini et al. 2006, Porcu et al. 2006). Προβληματισμός Μεγάλη συγκέντρωση κρυοπροστατευτικού υλικού τοξικότητα?

84 ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΩΟΘΗΚΙΚΟΥ ΙΣΤΟΥ Χρησιμότητα: Κίνδυνος επικείμενης απώλειας γονιμότητας (χημ/πείες, ακτ/πείες, χειρουργική αφαίρεση ωοθηκών).

85 ΣΤΑ ΙΑ ΩΟΘΥΛΑΚΙΩΝ

86 ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΩΟΘΗΚΙΚΟΥ ΙΣΤΟΥ

87 ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΩΟΘΗΚΙΚΟΥ ΙΣΤΟΥ

88 Χρησιμότητα: ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΟΡΧΙΚΟΥ ΙΣΤΟΥ Κίνδυνος επικείμενης απώλειας γονιμότητας (χημ/πείες, ακτ/πείες, χειρουργική αφαίρεση όρχεων). Αζωοσπερμία, αλλά εντοπισμός σπ/ρίων μετά από TESE.

89 ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΣΗ Για πόσο ; ΝΟΜΟΣ ΥΠ' ΑΡΙΘ (ΦΕΚ Α 327/ ) α. Σπέρμα και ορχικός ιστός:, μέχρι δέκα (10) έτη (από τρίτο δότη), ενώ μέχρι πέντε (5) έτη (για μελλοντική προσωπική χρήση στο πλαίσιο εφαρμογής μεθόδων Ι.Υ.Α.). β. Ωάρια και ωοθηκικός ιστός: πέντε (5) έτη. [Στις παραπάνω περιπτώσεις α και β η διάρκεια κρυοσυντήρησης μπορεί να παραταθεί με έγγραφη αίτηση των δικαιουμένων προς την Τράπεζα Κρυοσυντήρησης]. γ. Ζυγώτες και γονιμοποιημένα ωάρια: πέντε (5) έτη (δυνατότητα παράτασης μόνο για άλλα 5). Μετά την πάροδο των παραπάνω προθεσμιών κρυοσυντηρημένο υλικό που δεν έχει χρησιμοποιηθεί είτε διατίθενται για ερευνητικούς και θεραπευτικούς σκοπούς είτε καταστρέφονται.

90 ΠΡΟΕΜΦΥΤΕΥΤΙΚΟ ΓΕΝΕΤΙΚΟ ΤΕΣΤ Ο έλεγχος του πυρήνα βλαστομεριδίου (-ων) για γονιδιακές μεταλλάξεις ή ανευπλοειδίες, που πραγματοποιείται όσο τα έμβρυα αναπτύσσονται σε συνθήκες καλλιέργειας στο εργαστήριο, πριν την εμβρυομεταφορά ή ο έλεγχος πολικού σωματίου ωαρίου. PGD Preimplantation Genetic Diagnosis PGS Preimplantation Genetic Screening

91 ΒΙΟΨΙΑ ΕΜΒΡΥΟΥ ΓΙΑ ΠΡΟΕΜΦΥΤΕΥΤΙΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ

92 ΠΡΟΕΜΦΥΤΕΥΤΙΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ (PGD) Όταν ο ένας ή και οι δύο γονείς είναι φορείς μιας γονιδιακής μετάλλαξης ή μιας χρωμοσωμικής ανωμαλίας και ο έλεγχος πραγματοποιείται για να επιβεβαιώσει αν η μετάλλαξη ή ανωμαλία έχει μεταφερθεί στο ωάριο ή στο έμβρυο.

93 ΠΡΟΕΜΦΥΤΕΥΤΙΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ (PGD) Ενδείξεις: Επικρατές αυτοσωμικό γονίδιο (κίνδυνος 50%). Υπολειπόμενο αυτοσωμικό γονίδιο (κίνδυνος 25%). Φυλοσύνδετα νοσήματα (25% - οι μισοί των αρσενικών απογόνων). Φορείς μεταλλάξεων. HLA (Human Leucocyte antigen) συμβατότητα. Φορείς δομικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών (μετατοπίσεις, αναστροφές κλπ).

94 PGS (Preimplantation Genetic Screening) Όταν τα έμβρυα γονέων που θεωρούνται χρωμοσωμικά φυσιολογικοί, ελέγχονται για ανευπλοειδίες. Ενδείξεις: Γυναίκες προχωρημένης ηλικίας. Ιστορικό καθ έξιν αποβολών. Επαναλαμβανόμενες αποτυχίες IVF. Ανδρική υπογονιμότητα σοβαρού βαθμού. Επιλογή φύλου.

95 PGD/PGS Πώς γίνονται ; Βιοψία πολικού σωματίου Βιοψία βλαστομεριδίου Βιοψία τροφοεξωδέρματος

96 ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΒΙΟΨΙΑΣ ΠΟΛΙΚΟΥ ΣΩΜΑΤΙΟΥ Το πολικό σωμάτιο βρίσκεται έξω από το έμβρυο αποφυγή τραυματισμού του εμβρύου. Σε αρκετές χώρες, κοινωνικοί και ηθικοί λόγοι απαγορεύουν τη βιοψία εμβρύων. Ο έλεγχος βλαστομεριδίου για ανευπλοειδίες έχει σημαντικό μειονέκτημα, λόγω της αυξημένης πιθανότητας μωσαϊκισμού, σε αυτά τα στάδια διαίρεσης.

97 ΕΝ ΕΙΞΕΙΣ ΓΙΑ ΒΙΟΨΙΑ ΠΟΛΙΚΟΥ ΣΩΜΑΤΙΟΥ Μονογονιδιακές ανωμαλίες κληρονομούμενες από τη μητέρα 1) Συγκεκριμένες διαγνώσεις φυλοσύνδετων νοσημάτων. 2) PGD για γονείς που φέρουν διαφορετικές μεταλλάξεις του ελεγχόμενου γονιδίου. 3) PGD για ζευγάρια όπου η μητέρα φέρει ομοζυγωτία ή διπλή-ετεροζυγωτία. 4) PGD συνδυασμένη με HLA-typing. 5) PGD συνδυασμένη με έλεγχο ανευπλοειδίας, για τον εντοπισμό εμβρύων που δε φέρουν τη μετάλλαξη της μητέρας, που ελέγχεται περαιτέρω με FISH.

98 ΕΝ ΕΙΞΕΙΣ ΓΙΑ ΒΙΟΨΙΑ ΠΟΛΙΚΟΥ ΣΩΜΑΤΙΟΥ Για χρωμοσωμικές ανωμαλίες. 53% των ωαρίων γυναικών προχωρημένης ηλικίας που υποβάλλονται σε IVF, παρουσιάζουν ανευπλοειδίες.

99 ΜΕΘΟ ΟΙ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ PCR (Polymerase Chain Reaction), γιαναπολλαπλασιασθείτοτμήμα του γονιδιώματος που περιέχει το συγκεκριμένο γονίδιο. FISH (Fluorescence In Situ Hybridization), DNA probes σημαίνονται με διαφορετικές χρωστικές φθορισμού, που συνδέονται με συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA, μοναδικές για κάθε χρωμόσωμα. Η FISH χρησιμοποιείται για να εντοπίσει ελλείψεις ή προσθήκες χρωμοσωμικού υλικού σε ωάρια, έμβρυα ή ασθενείς που φέρουν χρωμοσωμική μετατόπιση ή άλλη δομική ανωμαλία. Array-CGH (Comparative Genomic Hybridization). Το σημασμένο με φθορίζουσα χρωστική DNA υβριδοποιείται πάνω σε ολιγονουκλεοτίδια ακινητοποιημένα πάνω σε ειδική αντικειμενοφόρο πλάκα. Kάθε ολιγονουκλεοτίδιο έχει καθορισμένη θέση πάνω στην πλάκα και είναι συμπληρωματικό για μια συγκεκριμένη περιοχή στο γονιδίωμα. Μεταγενέστερη τεχνική, αναλύει όλα τα χρωμοσώματα.

100

101 PCR

102 PCR Verification of the PCR product on gel. The ladder is a mixture of fragments with known size to compare with the PCR fragments. Notice that the distance between the different fragments of the ladder is logarithmic. Lane 1 : PCR fragment is approximately 1850 bases long. Lane 2 and 4 : the fragments are approximately 800 bases long. Lane 3 : no product is formed, so the PCR failed. Lane 5 : multiple bands are formed because one of the primers fits on different places.

103 PCR Οπτικοποίηση DNA, μετά από ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης.

104 FISH

105 FISH Fluorescent in situ hybridization images of a single blastomere nucleus from a human embryo with the DNA counterstained in aqua: (a) there are two signals for each of chromosomes 13, 16, 18, 21 and 22 shown as red, aqua, blue, green and yellow spots respectively, (b) after washing off the first round of signals the nucleus has been re-probed for chromosomes X, Y and 4 labelled with green, red and aqua fluorochromes respectively. There is one green X signal, one red Y signal and two aqua chromosome 4 signals, so this is a normal male nucleus for all chromosomes tested.

106 FISH PGD of X-linked Disorders Using FISH Two nuclei that have been hybridized with probes that are complementary to sequences on chromosomes X (green), Y (red), and 18 (blue). A nucleus from the blastomere of a normal female embryo has two green and two blue signals (top). Whereas, a nucleus from a normal male has one red, one green, and two blue signals (bottom). Normal FISH result (left): Two signals for 13, 16, 18, 21 & 22. Red=13, Aqua=16, Blue=18, Green=21, Gold= 22 Trisomy 21 (right): Three signals for green (21)

107 Array CGH: The Complete Process

108

109

110 ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΥΣΚΟΛΙΕΣ PGD Σχετικάμικρόςδιαθέσιμοςχρόνοςγιαανάλυση. Μόνο 1-2 κύτταρα μπορούν να αναλυθούν. Στην PCR Λανθασμένη διάγνωση λόγω: Κύτταρο χωρίς πυρήνα. Αποτυχία πολλαπλασιασμού του τμήματος DNA στόχου. Εξωτερική μόλυνση. ADO (Allele Drop Out), το ένα αλληλόμορφο του γονιδίου-στόχου αποτυγχάνει να πολλαπλασιαστεί. Μερικός πολλαπλασιασμός.

111 ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΥΣΚΟΛΙΕΣ PGD Υπολογιζόμενο ρίσκο μεταφοράς εμβρύου από ψευδώς αρνητικό αποτέλεσμα: 2% για υπολειπόμενα γονίδια. 11% για επικρατή γονίδια.

112 ΗΒΙΟΨΙΑΕΠΗΡΕΑΖΕΙΤΟΕΜΒΡΥΟ; Θεωρητικά η αφαίρεση 1-2 βλαστομεριδίων δεν μειώνει την πιθανότητα εγκυμοσύνης. Όμως, παγκοσμίως, οι πιθανότητες εγκυμοσύνης μειώνονται μετά από βιοψία, συγκριτικά με τις πιθανότητες μετά από απλή IVF. Πιθανή αιτία: μειωμένη δυνατότητα εμφύτευσης εμβρύων που έχουν υποστεί βιοψία.

113 Η ΛΟΓΙΚΗ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ PGS Ανευπλοειδία, η πιο συχνή αιτία αυτόματης διακοπής κύησης σε πρώιμο στάδιο. Η παρουσία ωαρίων/εμβρύων με ανευπλοειδίες αυξάνεται με: - Ηλικία μητέρας. - Καθ έξιν αποβολές σε ζευγάρια με φυσιολογικά χρωμοσώματα. - Επαναλαμβανόμενες αποτυχημένες IVF, παρά την καλή (μορφολογικά) ποιότητα μεταφερόμενων εμβρύων.

114 ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΥΣΚΟΛΙΕΣ PGS Η FISH επιτρέπει τον έλεγχο σε λιγότερο από τα μισά ζεύγη (23) χρωμοσωμάτων σε ένα κύτταρο (Χ, Υ, 1, 13, 16, 17, 18, 21). Σύμφωνα με μελέτες, 25% τωνανευπλοειδικώνεμβρύων χαρακτηρίζονται από τη FISH ως φυσιολογικά, επειδή τα ανώμαλα ζεύγη χρωμοσωμάτων δεν περιλαμβανόντουσαν στην ανάλυση.

115 ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΥΣΚΟΛΙΕΣ PGS ~ 10% των κυττάρων που αφαιρούνται από τα έμβρυα για έλεγχο, αποτυγχάνουν να δώσουν αποτέλεσμα. Πιθανώς λανθασμένα αποτελέσματα, όταν ο προσανατολισμός ή η αλληλοεπικάλυψη χρ/των παράγει κατακερματισμένα ή διασκορπισμένα σήματα, που παρερμηνεύονται.

116 ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΥΣΚΟΛΙΕΣ PGS Η ανευπλεοειδία μπορεί να προκύψει με διάφορους τρόπους. Μη αποχωρισμός κατά τη μείωση ανευπλοειδία κατά κανόνα σε όλα τα κύτταρα του εμβρύου. Αντίθετα, μιτωτικός μη αποχωρισμός 2 ή περισσότερες διακριτές κυτταρικές σειρές έμβρυο που περιέχει φυσιολογικά και ανώμαλα κύτταρα. Εντοπισμός μωσαϊκού εμβρύου μόνο όταν αναλυθούν 2 κύτταρα. Αναλογία φυσιολογικών/ανώμαλων κυττάρων προσδιορίζεται μόνο με ανάλυση όλων των κυττάρων καταστροφή εμβρύου.

117 ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΥΣΚΟΛΙΕΣ PGS Όταν ανάλυση 2 κυττάρων ενός εμβρύου παράγει αντικρουόμενα αποτελέσματα, αποδεικνύεται ότι 50% αυτών των εμβρύων θα είναι φυσιολογικά όταν αναλυθούν όλα τα κύτταρα. Έως 50% εμβρύων που χαρακτηρίζονται ανευπλοειδικά (στάδιο ως 8 κυττάρων), όταν επιβιώσουν μέχρι το στάδιο της βλαστοκύστης, αποδεικνύεται ότι «διορθώνονται» αυτόματα. Συμπερασματικά: Μη φυσιολογικό αποτέλεσμα από ανάλυση FISH ενός βλαστομεριδίου σε έμβρυο 3ης ημέρας, δεν αποδεικνύει απαραίτητα ότι το έμβρυο είναι ανώμαλο ή με παθολογική εξέλιξη.

118 ΤΟ PGS ΒΕΛΤΙΩΝΕΙ ΤΑ ΠΟΣΟΣΤΑ ΕΓΚΥΜΟΣΥΝΗΣ ΣΕ ΓΥΝΑΙΚΕΣ ΠΡΟΧΩΡΗΜΕΝΗΣ ΗΛΙΚΙΑΣ ; Οι μέχρι τώρα μελέτες δεν υποστηρίζουν τη χρήση PGS για αύξηση του live birth rate, σε γυναίκες προχωρημένης ηλικίας. Gianaroli L, Magli MC, Ferraretti AP, Munné S. Preimplantation diagnosis for aneuploidies in patients undergoing in vitro fertilization with a poor prognosis: identification of the categories for which it should be proposed. Fertil Steril Nov;72(5): Staessen C, Platteau P, Van Assche E, Michiels A, Tournaye H, Camus M, Devroey P, Liebaers I, Van Steirteghem A. Comparison of blastocyst transfer with or without preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening in couples with advanced maternal age: a prospective randomized controlled trial. Hum Reprod Dec;19(12): Epub 2004 Oct 7. Mastenbroek S, Twisk M, van Echten-Arends J, Sikkema-Raddatz B, Korevaar JC, Verhoeve HR, Vogel NE, Arts EG, de Vries JW, Bossuyt PM, Buys CH, Heineman MJ, Repping S, van der Veen F. In vitro fertilization with preimplantation genetic screening. N Engl J Med Jul 5;357(1):9-17.

119 ΤΟ PGS ΒΕΛΤΙΩΝΕΙ ΤΑ ΠΟΣΟΣΤΑ ΕΓΚΥΜΟΣΥΝΗΣ ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΕΙΣ ΚΑΘ ΕΞΙΝ ΑΠΟΒΟΛΩΝ ; Όχι, σύμφωνα με τις μέχρι τώρα μελέτες (δεν βελτιώνονται τα ongoing pregnancy rate, live birth rate & δεν μειώνονται τα ποσοστά αποβολών). Όμως, όταν οι καθ έξιν αποβολές αποδίδονται σε ισορροπημένες μετατοπίσεις, το ζευγάρι μπορεί να επωφεληθεί από συγκεκριμένη PGD, για να εντοπιστεί στα έμβρυα έλλειμμα ή προσθήκη γενετικού υλικού. Rubio C, Simón C, Vidal F, Rodrigo L, Pehlivan T, Remohí J, Pellicer A. Chromosomal abnormalities and embryo development in recurrent miscarriage couples. Hum Reprod Jan;18(1): Platteau P, Staessen C, Michiels A, Van Steirteghem A, Liebaers I, Devroey P. Preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening in patients with unexplained recurrent miscarriages. Fertil Steril Feb;83(2): Ferraretti AP, Magli MC, Kopcow L, Gianaroli L. Prognostic role of preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy in assisted reproductive technology outcome. Hum Reprod Mar;19(3):694-9.

120 Το PGS βελτιώνει τα ποσοστά εγκυμοσύνης σε περιπτώσεις επαναλαμβανόμενων αποτυχιών εμφύτευσης ; Όχι, σύμφωνα με τις μέχρι τώρα μελέτες. Pehlivan T, Rubio C, Rodrigo L, Romero J, Remohi J, Simón C, Pellicer A. Impact of preimplantation genetic diagnosis on IVF outcome in implantation failure patients. Reprod Biomed Online Mar;6(2): Munné S, Sandalinas M, Escudero T, Velilla E, Walmsley R, Sadowy S, Cohen J, Sable D. Improved implantation after preimplantation genetic diagnosis of aneuploidy. Reprod Biomed Online Jul-Aug;7(1):91-7. Gianaroli L, Magli MC, Ferraretti AP, Munné S. Preimplantation diagnosis for aneuploidies in patients undergoing in vitro fertilization with a poor prognosis: identification of the categories for which it should be proposed. Fertil Steril Nov;72(5):

121 Το PGS βελτιώνει τα ποσοστά εγκυμοσύνης σε περιπτώσεις ανδρικής υπογονιμότητας; Όχι, σύμφωνα με τις μέχρι τώρα μελέτες. Male Infertility Best Practice Policy Committee of the American Urological Association; Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Report on optimal evaluation of the infertile male. Fertil Steril Sep;82 Suppl 1:S Calogero AE, De Palma A, Grazioso C, Barone N, Romeo R, Rappazzo G, D'Agata R. Aneuploidy rate in spermatozoa of selected men with abnormal semen parameters. Hum Reprod Jun;16(6):

122 PGS για επιλογή φύλου ;? Επιτρέπεται μόνο για ιατρικούς λόγους (π.χ. νόσος με φυλοσύνδετη κληρονομικότητα).

123 ΠΡΟΕΜΦΥΤΕΥΤΙΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ (PGD) Κατάλληλη για: Μονογονιδιακές παθήσεις Χρωμοσωμικές ανωμαλίες Επιλογή φύλου (π.χ. περιπτώσεις με φυλοσύνδετα γονίδια) Κυστική ίνωση Σύνδρομο εύθραυστου Χ Σύνδρομο Lesch-Nyhan Νόσος Charcot-Marie- Tooth Σύνδρομο Down Νόσος Tay-Sachs Εντοπίζει: Μυϊκή δυστροφία Duchenne Αιμορροφιλία Σύνδρομο Turner Β-θαλασσαιμία ρεπανοκυτταρική αναιμία Retinitis pigmentosa

124 PGD - Συμβουλές Γενετική συμβουλευτική απαραίτητη πριν από PGD (ρίσκο απόκτησης παιδιού με νόσο, επιπτώσεις νόσου στο παιδί, περιορισμοί της υπάρχουσας τεχνογνωσίας σχετικά με την αποφυγή γέννησης παιδιού με νόσο). PGD μπορεί να μειώσει το ρίσκο γέννησης παιδιού με γενετικές ανωμαλίες, που φέρουν ο ένας ή και οι δύο γονείς, αν αυτή η ανωμαλία μπορεί να εντοπιστεί από τεστ που πραγματοποιούνται σε ένα κύτταρο. Συνιστάται προγεννητικός έλεγχος, γιαναεπιβεβαιωθούν τα αποτελέσματα από PGD, καθώς τεχνικοί περιορισμοί αφήνουν περιθώρια για ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα.

125 PGS - Συμβουλές Πλήρης ενημέρωση γονέων και συμβουλευτική πριν από PGS (περιορισμοί διαθέσιμων τεχνικών, πιθανότητα σφάλματος, έλλειψη αποδείξεων ότι βελτιώνει το live birth rate). εν έχει αποδειχθεί ότι PGS βελτιώνει το live birth rate σε γυναίκες προχωρημένης ηλικίας / με προηγούμενες αποτυχημένες εμφυτεύσεις / με καθ έξιν αποβολές. εν έχει αποδειχθεί ότι PGS μειώνει τα ποσοστά αποβολών σε γυναίκες με ιστορικό καθ έξιν αποβολών σχετικών με ανευπλοειδίες.

126