Αξιολόγηση μεθόδων ποσοτικού και ποιοτικού προσδιορισμού φυτοπροστατευτικών προϊόντων σε βιομίγματα και εκχυλίσματα τους

Transcript

1 Αξιολόγηση μεθόδων ποσοτικού και ποιοτικού προσδιορισμού φυτοπροστατευτικών προϊόντων σε βιομίγματα και εκχυλίσματα τους Δρ Άγγελος Ντάντος Cp Foodlab ltd

2 Ερευνητική Ομάδα cp FOODLAB LTD Χαρά Παπαστεφάνου Δρ Άγγελος Ντάντος Έλενα Αλεξάνδρου Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών Δρ Παναγιώτης Ντάλιας Δρ Μιχάλης Ομήρου Χρυσταλλένη Κώστα Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας Δρ Καρπούζας Δημήτρης Δρ Παπαδοπούλου Καλλιόπη Δρ Τσιρόπουλος Δημήτρης Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών Δρ Κων/νος Οιχαλιώτης Δρ Ιωάννης Μάσσας

3 Προσδιορισμός φυτοπροστατευτικών ενώσεων σε περιβαλλοντικά δείγματα Τα τελευταία χρόνια η χρήση φυτοπροστατευτικών ενώσεων έχει αυξηθεί κατακόρυφα. Πολλαπλές και χημικά διαφορετικές ομάδες φυτοφαρμάκων έχουν εγκριθεί για χρήση στην γεωργική πρακτική (Οδηγία 91/414/EE). Υπολείμματα φυτοπροστατευτικών ενώσεων ανιχνεύονται σε γεωργικά προϊόντα αλλά και σε εδάφη και νερά αποτελώντας μια απειλή για τη δημόσια υγεία. Αναγκαία η ανάπτυξη μεθόδων για τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό φυτοπροστατευτικών ενώσεων σε γεωργικά προιόντα και περιβαλλοντικά δείγματα.

4 Κατηγορίες φυτοφαρμάκων Αριθμός δραστικών ουσιών Οργανοφωσφορικά 69 Οργανοχλωριομένα 13 Τριαζόλες 23 Τριαζίνες 14 Αντιβιοτικά 4 Δινιτροανιλίνες 8 Αμίδια 10 Βενζιμιδαζολικά 5 Καρβαμιδικά 48 βενζουλουρίες 10 σουλφονυλουρίες 27 διθειοκαρβαμιδικά 11 στρομπιλουρίνες 7 Νεονικοτεινοειδή 4 Ανοργανες ενώσεις 9 Φαινυλουριες 19 Αρυλοξυαλκανοικά οξέα 10 Πυρεθρινοειδή 40 Διάφορα 28

5 Προσδιορισμός φυτοπροστατευτικών ενώσεων Πολύπλοκη διαδικασία Πλήθος ενώσεων Διαφορετικές χημικές ιδιότητες Επίδραση υποστρώματος

6 Μέθοδοι ανάλυσης φυτοπροστατευτικών ενώσεων σε περιβαλλοντικά δείγματα Η ανάγκη προσδιορισμού του είδους και της ποσότητας των φυτοπροστατευτικών ενώσεων στο περιβάλλον οδήγησε στην ανάπτυξη μεθόδων ανάλυσης οι οποίες στηρίζονται κυρίως σε χρωματογραφικές τεχνικές

7 Χρωματογραφία Χρησιμοποιείται ευρέως για την ανάλυση περιβαλλοντικών δειγμάτων που περιέχουν μίγματα ρυπαντών. Στηρίζεται στην διαφορετική κατανομή μιας ουσίας ανάμεσα σε μια σταθερή και μια κινητή φάση. Επιτυγχάνεται διαχωρισμός του μίγματος των ρυπαντών στις επιμέρους ενώσεις και στη συνέχεια ανίχνευση τους με κατάλληλους ανιχνευτές. Ανάλογα με το είδος της κινητής φάσης η χρωματογραφία διαχωρίζεται σε υγρή (κινητή φάση υγρή) και αέρια (κινητή φάση αέρια) Και στα δύο είδη χρωματογραφίας η στατική φάση είναι είτε στερεή είτε υγρό υμένιο προσροφημένο σε αδρανές υλικό.

8 Αέρια Χρωματογραφία Οι προς διαχωρισμό ουσίες πρέπει να είναι πτητικές ή να μπορούν να μετατραπούν σε πτητικά παράγωγα Οι προς διαχωρισμό ουσίες δεν πρέπει να είναι θερμοευαίσθητες για να μην διασπώνται με αύξηση της θερμοκρασίας Το εύρος εφαρμογών της σε σχέση με την υγρή χρωματογραφία περιορίζεται σε ουσίες με μικρότερες σχετικές μοριακές μάζες και μικρότερη πολικότητα

9 Υγρή Χρωματογραφία Πλεονεκτεί σε σχέση με την αέρια στον προσδιορισμό πολικών μη πτητικών και θερμοευαίσθητων ενώσεων Μειονεκτεί στη διακριτική ικανότητα

10 Ανιχνευτές αέριου χρωματογράφου GC NPD Αποτελεί μια παραλλαγή του ευρέως χρησιμοποιούμενου ανιχνευτή FID με μεγάλη όμως ευαισθησία σε αζωτούχες και φωσφορούχες ενώσεις. Οι ενώσεις που εξέρχονται της στήλης εισέρχονται στον ανιχνευτή, καίγονται σε μια φλόγα Η2 αέρα και σχηματίζονται ιόντα τα οποία αυξάνουν την ένταση του ρεύματος που καταγράφεται. ECD Χρησιμοποείται για τον προσδιορισμό ενώσεων που περιλαμβάνουν ηλεκτραρνητικά άτομα στο μόριο τους, κυρίως αλογόνα. Παράγονται e από μια ραδιενεργή πηγή 63Ni και το φέρον αέριο εξασφαλίζει τη σταθερή παροχή τους. Όταν στον ανιχνευτή εισέλθει ηλεκτραρνητική ουσία τότε αυτή δεσμεύει ηλεκτρόνια και η διαταραχή στο ρεύμα καταγράφεται. Είναι ιδιαίτερα ευαίσθητος ανιχνευτής. MS Γενικός ανιχνευτής. Οι αναλύτες βομβαρδίζονται με e και τα θραύσματα διαχωρίζονται ανάλογα με το λόγο μάζα προς φορτίο (m/z). Παράγεται φάσμα μαζών για κάθε ένωση το οποίο είναι χαρακτηριστικό της και μπορεί να χρησιμοποιείθεί για την ταυτοποίηση της. Με την τεχνική της παρακολούθησης επιλεγμένων ιόντων ο ανιχνευτής MS μετατρέπεται σε ιδιαίτερα εκλεκτικό και ευαίσθητο.

11 Ανιχνευτές υγρής χρωματογραφίας DAD (Ανιχνευτής φωτοδιόδων) Πολυχρωματική ακτινοβολία διέρχεται από την κυψελίδα διαθλάται και προσπίπτει σε σειρά φωτοδιόδων. Κάθε φωτοδίοδος δέχεται μια δέσμη με μικρό εύρος μήκους κύματος. Όλη η σειρά των διόδων σαρώνεται πολλές φορές το δευτερόλεπτο και προκύπτει το συνολικό φάσμα. Η ανίχνευση μπορεί να γίνει σε ένα ή περισσότερα μήκη κύματος ταυτόχρονα. Σε περίπτωση που χρησιμοποιούμε μόνο ένα μήκος κύματος τότε ο ανιχνευτής συμπεριφέρεται σαν ένας απλός ανιχνευτής UV-Vis.Στηρίζεται στην ικανότητα που έχουν οι περισσότερες ενώσεις να απορροφούν ακτινοβολία UV ή ορατού φωτός. Fluorescence Φθορισμός είναι η ιδιότητα ορισμένων ουσιών να απορροφούν ακτινοβολία UV και στη συνέχεια να εκπέμπουν ακτινοβολία μεγαλύτερου μήκους κύματος. Οι ανιχνευτές φθορισμού χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση ενώσεων που φθορίζουν (PAH) ή μπορούν να μετατραπούν σε κάποιο φθορίζων παράγωγο (αφλατοξίνες). Είναι ιδιαίτερα ευαίσθητοι και εκλεκτικοί ανιχνευτές. Διαθέτουν λυχνία ξένου και φίλτρα μονοχρωμάτορες με τα οποία γίνεται η επιλογή του μήκους κύματος διέγερσης και εκπομπής.

12 Ανάπτυξη μεθόδου ανάλυσης Δειγματοληψία Επιλογή μεθόδου προσδιορισμού - έλεγχος καταλληλότητας Επιλογή και βελτιστοποίηση μεθόδου εκχύλισης Καθαρισμός εκχυλίσματος Ποιοτικός ποσοτικός προσδιορισμός Επαλήθευση μεθόδου

13 Δειγματοληψία Υγρά δείγματα Στερεά δείγματα Είναι απαραίτητος ο σχεδιασμός της δειγματοληψίας με τέτοιο τρόπο ώστε το υποδείγμα που τελικά αναλύεται να είναι αντιπροσωπευτικό.

14 Επιλογή μεθόδου προσδιορισμού - έλεγχος καταλληλότητας Αέρια χρωματογραφία Υγρή χρωματογραφία Είδος ανιχνευτών

15 Ποιοτικός Ποσοτικός προσδιορισμός Ποιοτικός προσδιορισμός Χρωματογραφικές μέθοδοι Ταυτοποίηση βάση του χρόνου κατακράτησης Ανιχνευτής MS Χρήση φάσματος μάζας χρόνου κατακράτησης Ποσοτικός προσδιορισμός Χρήση εξωτερικού προτύπου Χρήση εσωτερικού προτύπου

16 Έλεγχος γραμμικότητας Η γραμμικότητα προσδιορίζεται με την ανάλυση τεσσάρων έως έξι προτύπων (standards) διαφορετικής συγκέντρωσης κατά μήκος της αναμενόμενης περιοχής μέτρησης και τον σχεδιασμό της καμπύλης βαθμονόμησης στην οποία απεικονίζεται η απόκριση του οργάνου (εμβαδόν κορυφής) ως συνάρτηση της συγκέντρωσης του προτύπου. Η σχέση απόκριση / συγκέντρωση προτύπου θεωρείται γραμμική όταν η καμπύλη είναι ευθεία, με συντελεστή συσχετισμού r 2 > 0.99

17 Εκχύλιση Επιλογή διαδικασίας εκχύλισης Επιλογή διαλυτών εκχύλισης Σύγκριση ανάκτησης με διαφορετικά συστήματα διαλυτών Έλεγχος ανάγκης καθαρισμού του εκχυλίσματος

18 Μέθοδοι εκχύλισης Υγρά δείγματα Α) Υγρή υγρή εκχύλιση Β) Εκχύλιση στερεής φάσης Γ) Purge and trap Δ) Μικροεκχύλιση στερεής φάσης (υπερκείμενου όγκου ή με εμβάπτιση στο δείγμα) Ε) Μικροεκχύλιση υγρής φάσης

19 Μέθοδοι εκχύλισης Στερεά δείγματα Α) Εκχύλιση με οργανικό διαλύτη Soxhlet Μηχανική ανάδευση Χρήση υπερήχων Β) Χρήση υπερκρίσιμων ρευστών Γ) Accelerated solvent

20 Καθαρισμός εκχυλίσματος Χρωματογραφία διαχωρισμού πηκτής (GPC) Εκχύλιση στερεής φάσης

21 Επαλήθευση μεθόδου Ακρίβεια (precision) Η ακρίβεια υπολογίζεται με πειράματα επαναληψιμότητας και αναπαραγωγιμότητας, τα οποία περιλαμβάνουν τουλάχιστον 6 επαναληπτικές αναλύσεις σε τουλάχιστον 3 δείγματα που καλύπτουν την περιοχή ανάλυσης. Στη συνέχεια γίνονται 2 επαναλήψεις για έναν αντιπροσωπευτικό αριθμό 3 δειγμάτων, με αλλαγή κάθε φορά είτε του αναλυτή, είτε της ημέρας ανάλυσης, είτε του οργάνου. Από τα αποτελέσματα της διαδικασίας αυτής προκύπτουν η μέση τιμή (mean) και η τυπική απόκλιση (SD) της συγκέντρωσης για κάθε δείγμα. Η ακρίβεια εκφράζεται ως Σχετική Τυπική Απόκλιση (RSD) με βάση τον τύπο υπολογισμού RSD = SD / mean X 100 Η ακρίβεια της μεθόδου θεωρείται ικανοποιητική όταν RSD<20%.

22 Επαλήθευση μεθόδου Έλεγχος ορθότητας Η εκτίμηση της ορθότητας της μεθόδου (δηλαδή της εγγύτητας του αποτελέσματος της δοκιμής με την πραγματική τιμή) γίνεται ως εξής: Πειράματα ανάκτησης εμβολιασμένων δειγμάτων Χρήση πιστοποιημένων και εσωτερικών υλικών αναφοράς Σύγκριση των αποτελεσμάτων με άλλες μεθόδους ανάλυσης Δοκιμές ικανότητας με άλλα εργαστήρια

23 BIOBEDS Δραστικές ενώσεις 3 εντομοκτόνα 3 μυκητοκτόνα Chlorpyrifos Cypermethrin Deltamethrin OPP TBZ Imazalil

24 Μυκητοκτόνα

25 Εντομοκτόνα

26 Όνομα Κατηγορία Διαλυτότητα στο νερό Τάση ατμών MRL 1 SOPP Διάφορα 534g/l mPa 5 2 Chlorpyriphos Οργανοφωσφορικά 2 mg/l 2.5 mpa Cypermethrin Πυρεθρινοειδή insoluble 0.023mPa 2 4 Deltamethrin Πυρεθρινοειδή Insoluble 0.013mPa Thiabendazole Βενζιμιδαζολικά <0.05g/l Negligible 5 6 Imazalil Διάφορα 180mg/l 0.158mPa 5

27 Ανάπτυξη μεθόδου ανάλυσης Δειγματοληψία Επιλογή μεθόδου προσδιορισμού -έλεγχος καταλληλότητας Επιλογή και βελτιστοποίηση μεθόδου εκχύλισης Καθαρισμός εκχυλίσματος Ποιοτικός ποσοτικός προσδιορισμός Επαλήθευση μεθόδου

28 Στερεά δείγματα Δειγματοληψία Ανάμιξη για 5min με σπάτουλα και λήψη του υποδείγματος Υγρά δείγματα Χρήση όλου του δείγματος

29 Επιλογή μεθόδου προσδιορισμού Χρήση αέριας χρωματογραφίας με ανιχνευτές MS ECD NPD Υγρή χρωματογραφία με ανιχνευτές DAD - Fluorescence

30 Έλεγχος γραμμικότητας Για την κατασκευή των καμπύλων αναφοράς χρησιμοποιήθηκαν πρότυπα διαλύματα των φυτοπροστατευτικών ενώσεων σε 4 6 επίπεδα ( μg/ml). Για κάθε σημείο της καμπύλης αναφοράς έγιναν 3 διαφορετικές εγχύσεις

31 Αεριοχρωματογράφος- Φασματογράφος Μάζας (GC-MS)

32 Χαρακτηριστικά λειτουργίας Σύστημα έγχυσης Splitless Injection volume 1 μl Αέριο : He Θερμοκρασία: 250 C GC - MS Θερμοκρασιακό πρόγραμμα φούρνου 80 C για 2 λεπτά. Αύξηση της θερμοκρασίας με ρυθμό 20 C /min μέχρι τους 200 C. Παραμονή στους 200 C για 8 min. Αύξηση της θερμοκρασίας με ρυθμό 10 C /min μέχρι τους 295 C. Παραμονή στους 295 C για 14 min. Συνολικός χρόνος 39.5 min. Ανιχνευτής MS MS Source C MS Quad C

33 Χρωματογράφημα MS

34

35

36

37 SOPP

38 Chlorpyrifos

39 TBZ

40 Imazalil

41 Cypermethrin

42 Deltamethrin

43 Ταυτοποίηση στο GC/MS Ένωση Ιόν Α Ιόν Β Ιόν Γ OPP 170 (100%) TBZ 201 (100%) Chlorpyriphos 197 (100%) Cypermethrin 163 (100%) Deltamethrin 181 (100%) Imazalil 215 (100%) 141 (37%) 174 (89%) 314 (81%) 181 (95%) 253 (92%) 173 (82%) 115 (28%) 129 (8%) 258 (49%) 127 (26%) 172 (26%) 159 (28%)

44 Καμπύλες αναφοράς φυτοφαρμάκων OPP MS Chlorpyrifos MS y = 1E+06x R 2 = y = x R 2 = TBZ MS Imazalil MS y = 20415x R 2 = y = 81784x R 2 =

45 Καμπύλες αναφοράς φυτοφαρμάκων Cypermethrin MS Deltamethrin MS y = 42244x R 2 = y = x R 2 =

46 Αέριος χρωματογράφος με ανιχνευτές ECD - NPD

47 Χαρακτηριστικά λειτουργίας GC ECD - NPD Agilent 6890N Τριχοειδή στήλη Supelco equity ,0 m X 0,32 mm X 0,25 μm ανιχνευτή NPD Restec RTX m X 0,32 mm X 1.00 μm ανιχνευτή ECD Φέρων αέριο N 2 Σύστημα έγχυσης Injection volume 2 μl Splitless Gas : N 2 Heater C Ανιχνευτής NPD Heater C H ml/min Αέρας 60.0 ml/min N ml/min Ανιχνευτής ECD Θερμοκρασία 350 0C N 2 (Μake up) flow 60.0 ml/min Θερμοκρασιακό πρόγραμμα φούρνου 80 0 C για 2 λεπτά. Αύξηση της θερμοκρασίας με ρυθμό 20 0 C /min μέχρι τους C. Παραμονή στους C για 8 λεπτά. Αύξηση της θερμοκρασίας με ρυθμό 10 0 C /min μέχρι τους C. Παραμονή στους C για 14 λεπτά. Συνολικός χρόνος 39.5 λεπτά.

48 Χρωματογραφήματα ECD-NPD

49 Καμπύλες αναφοράς φυτοφαρμάκων Chlorpyrifos ECD Imazalil ECD y = x R 2 = y = x R 2 = Cypermethrin ECD Deltamethrin ECD y = x R 2 = y = x R 2 = 0,

50 Υγρή χρωματογραφία με ανιχνευτές DAD - fluorescence

51 Στήλη Χαρακτηριστικά λειτουργίας HPLC - DAD - fluorescence C18 25cm x 5mm x 5μm Κινητή φάση Ροή DAD Νερό / ακετονιτρίλιο 70/30 ph=9 1ml/min 254nm Fluorescence Διέγερση 300nm Εκπομπή 350nm

52

53 Καμπύλες αναφοράς φυτοφαρμάκων

54 Βελτιστοποίηση εκχύλισης Eκχύλιση δραστικών ουσιών Στερεά δείγματα Για τον προσδιορισμό των ουσιών οι κομπόστες αναμίχθηκαν με έδαφος και άχυρο σε αναλογία (25, 25 και 50% αντίστοιχα) και σε αυτά τα υλικά πραγματοποιήθηκαν οι ανακτήσεις. Επιπρόσθετα δοκιμές πραγματοποιήθηκαν και σε έδαφος. Διαδικασία Εκχύλισης Ζυγίστηκαν 25g υποστρώματος σε κωνική φιάλη στο οποίο προστέθηκε 50ml διαλυτών τα οποία αναφέρονται πιο πάνω. Ακολούθως το μείγμα αναδεύτηκε σε οριζόντιο αναδευτήρα για μια ώρα στις 200 στροφές ανά λεπτό. Μετά την ανάδευση το μείγμα διηθήθηκε υπό κενό σε ηθμό Whatman 42 και η ίδια διαδικασία επαναλήφθηκε ακόμα 2 φορές. Τα διηθήματα συνενώθηκαν και στην περίπτωση του συστήματος Μεθανόλης/Η2Ο ακολούθησε εκχύλιση υγρής-υγρής φάσης. Ακολούθως τα δείγματα συμπυκνώθηκαν μέχρι ξηρού σε περιστροφικό εξατμιστήρα και το υπόλειμμα επαναδιαλύθηκε σε 5ml ακετόνης Για την εκχύλιση των ενώσεων χρησιμοποιήθηκαν τα πιο κάτω συστήματα διαλυτών: Μεθανόλη/Η 2 Ο (80:20) Οξικός αιθυλεστέρας/ακετόνη (70:30) Οξικός αιθυλεστέρας Κυκλοεξάνιο/οξικός αιθυλεστέρας/ακετόνη (30:40:30)

55 Βελτιστοποίηση εκχύλισης Deltamethrin Cypermethrin Chlorpyrifos Διαλύτες Ανάκτηση RSD Ανάκτηση RSD Ανάκτηση RSD *Σχετική Τυπική Απόκλιση 1.Μεθανόλη / Νερό (80:20) 2.Οξικός αιθυλεστέρας / ακετόνη (70:30) 3.Οξικός αιθυλεστέρας 4.Κυκλοεξάνιο / οξικός αιθυλεστέρας / ακετόνη (30:40:30)

56 Βελτιστοποίηση εκχύλισης Imazalil SOPP TBZ Διαλύτες Ανάκτηση RSD* Ανάκτηση RSD Ανάκτηση RSD *Σχετική Τυπική Απόκλιση 1 Μεθανόλη / Νερό (80:20) 2 Οξικός αιθυλεστέρας / ακετόνη (70:30) 3 Οξικός αιθυλεστέρας 1.Κυκλοεξάνιο / οξικός αιθυλεστέρας / ακετόνη (30:40:30)

57 Βελτιστοποίηση εκχύλισης Η εκχύλιση του TBZ από το βιομίγμα έγινε με την εκχύλιση 20g με 100ml διαλύματος 0.06Ν HCl/MeOH (80:20) σε οριζόντιο αναδευτήρα για 15 λεπτά. Ακολούθως το δείγμα φυγοκεντρήθηκε στις 7500 στροφές για 5 λεπτά και φιλτραρίστηκε σε ειδικά οξοανθεκτικά φίλτρα (glass fibre filters). Αμέσως μετά το ph του διαλύματος διορθώθηκε με την προσθήκη NaOH (0.1N) σε τιμή 7.5 και το διάλυμα εκχυλίστηκε με : α) εξάνιο / οξικός αιθυλεστέρα (50:50) β) εξάνιο γ) οξικό αιθυλεστέρα δ) διχλωρομεθάνιο Η οργανική φάση συλλέχθηκε και το διάλυμα εξατμίστηκε μέχρι ξηρού και το υπόλειμμα επαναδιαλύθηκε σε ακετονιτρίολιο (5ml). Το τελικό εκχύλισμα φιλτραρίστηκε σε φίλτρο 0.45μm και 20μl εγχύθηκαν στον υγρό χρωματογράφο. Από τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στον Πίνακα 5 του Π9 το διχλωρομεθάνιο παρουσίασε τη καλύτερη συμπεριφορά με ανάκτηση του ΤΒΖ >90% ενώ οι υπόλοιποι διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν παρουσίασαν ανακτήσεις σημαντικά μικρότερες.

58 Βελτιστοποίηση εκχύλισης Διαλύτε ς Ανάκτηση (%) εξανίο/οξικού αιθυλεστέρα (50:50) 2. εξάνιο 3. οξικό αιθυλεστέρα 4. διχλωρομεθάνιο

59 Βελτιστοποίηση εκχύλισης Υγρά δείγματα Επίπεδα ανακτήσεων σε εκχυλίσματα Για την ανάπτυξη της μεθόδου ανάλυσης των ΦΠ σε υδατικά εκχυλίσματα των υποστρωμάτων ακολουθήθηκε η παρακάτω διαδικασία. Ζυγίστηκε 1kg υποστρώματος και σε αυτό προστέθηκαν 2L απιονισμένου νερού. Το μείγμα αναδεύτηκε σε οριζόντιο αναδευτήρα για 30 λεπτά και διηθήθηκε υπό κενό με ηθμό Whatman 42 εις διπλούν. Σε 250 ml εκχυλίσματος προστέθηκαν γνωστές συγκεντρώσεις των υπό εξέταση μορίων και μεταφέρθηκε σε διαχωριστική χοάνη. Προστέθηκαν 100ml διαλυτών εκχύλισης και το δείγμα εκχυλίστηκε εις τριπλούν. Οι οργανικές φάσεις συμπυκνώθηκαν μέχρι ξηρού και επαναδιαλύθηκαν σε 5ml ακετόνης.

60 Βελτιστοποίηση εκχύλισης Υγρά δείγματα Η διαδικασία εκχύλισης και παραλαβής του TBZ από υγρά υποστρώματα έγινε με τροποποίηση της μεθόδου που αναπτύχθηκε για τα βιομίγματα. Σε 100ml διαλύματος προστέθηκαν 50ml διαλύματος 0.06Ν HCl/MeOH (20:80). Ακολούθως ρυθμίστηκε το ph του διαλύματος με ΝαΟΗ (0.1) σε τιμή ίση με 7.5 και έγινε εκχύλιση του διαλύματος με 50ml διχλωρομεθάνιο (3 φορές). Τα εκχυλίσματα συνενώθηκαν και ο διαλύτης εξατμίστηκε μέχρι ξηρού. Το υπόλειμμα επαναδιαλύθηκε σε 5ml ακετονιτρίλιο μέρος του οποίου χρησιμοποιήθηκε για ποσοτικό προσδιορισμό της ουσίας σε HPLC-fuoresence και DAD

61 Βελτιστοποίηση εκχύλισης Υγρά δείγματα Deltamethrin Cypermethrin Chlorpyrifos Διαλύτες Ανάκτηση RSD Ανάκτηση RSD Ανάκτηση RSD *Σχετική Τυπική Απόκλιση 1. εξανίο/οξικού αιθυλεστέρα (50:50) 2. εξάνιο 3. οξικό αιθυλεστέρα 4. διχλωρομεθάνιο

62 Βελτιστοποίηση εκχύλισης Υγρά δείγματα Imazalil SOPP TBZ Διαλύτες Ανάκτηση RSD* Ανάκτηση RSD Ανάκτηση RSD *Σχετική Τυπική Απόκλιση 1. εξανίο/οξικού αιθυλεστέρα (50:50) 2. εξάνιο 3. οξικό αιθυλεστέρα 4. διχλωρομεθάνιο

63 Επαλήθευση μεθόδου Προστέθηκε γνωστή συγκέντρωση της προς μελέτη ουσίας σε διαφορετικά επίπεδα συγκεντρώσεων (0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1 και 2μg/g υποστρώματος) και ακολουθήθηκε η διαδικασία εκχύλισης με τον διαλύτη που επιλέχθηκε. Υπολογίστηκαν η ανάκτηση της μεθόδου σε κάθε επίπεδο και η σχετική τυπική απόκλιση ώστε να γίνει έλεγχος της ακρίβειας και ορθότητας της μεθόδου

64 Επαλήθευση μεθόδου Στερεά δείγματα Deltamethrin Cypermethrin Chlorpyrifos Επίπεδο εξωτερικού προτύπου (μg/g) Ανάκτηση (%) RSD Ανάκτηση (%) RSD Ανάκτηση (%) RSD *Σχετική Τυπική Απόκλιση

65 Επαλήθευση μεθόδου στερεά δείγματα Imazalil SOPP Thiabendazole Επίπεδο εξωτερικού προτύπου (μg/g) Ανάκτηση (%) RSD Ανάκτηση (%) RSD Ανάκτηση (%) RSD *Σχετική Τυπική Απόκλιση

66 Επαλήθευση μεθόδου Υγρά δείγματα Imazalil SOPP Thiabendazole Επίπεδο εξωτερικού προτύπου (μg/g) Ανάκτηση RSD Ανάκτηση RSD Ανάκτηση RSD *Σχετική Τυπική Απόκλιση

67 Επαλήθευση μεθόδου Υγρά δείγματα Deltamethrin Cypermethrin Chlorpyrifos Επίπεδο εξωτερικού προτύπου (μg/g) Ανάκτηση (%) RSD Ανάκτηση (%) RSD Ανάκτηση (%) RSD *Σχετική Τυπική Απόκλιση

68 Η μέθοδος που αναπτύχθηκε ικανοποιεί όλες τις συνθήκες για όλες τις προσδιοριζόμενες ενώσεις Γραμμικότητα r 2 > 0.99 Επαναληψιμότητα RSD < 20% Ορθότητα (Ανάκτηση > 70%) Είναι συνεπώς κατάλληλη για τον προσδιορισμό τους στα βιομίγματα και τα εκχυλίσματα τους που αναλύθηκαν κατά τη διάρκεια του προγράμματος BIOBEDS

69