Επίδραση διεργασιών οινοποίησης στα φαινολικά συστατικά του οίνου ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΑΝΔΡΕΑΣ ΜΠΙΜΠΙΛΑΣ ΕΘΝΙΚΟ ΜΕΤΣΟΒΙΟ ΠΟΛΥΤΕΧΝΕΙΟ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΜΕΤΣΟΒΙΟ ΠΟΛΥΤΕΧΝΕΙΟ ΣΧΟΛΗ ΧΗΜΙΚΩΝ -ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΧΗΜΕΙΑΣ & ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Επίδραση διεργασιών οινοποίησης στα φαινολικά συστατικά του οίνου ΑΝΔΡΕΑΣ ΜΠΙΜΠΙΛΑΣ Αθήνα,

2 «Η έγκριση της διδακτορικής διατριβής από την Ανωτάτη Σχολή Χημικών Μηχανικών του Ε.Μ.Πολυτεχνείου δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα. (Ν. 5343/1932, Άρθρο 202)». 1

3 Περίληψη Το αντικείμενο της παρούσας διατριβής είναι η μελέτη των μεταβολών φαινολικών συστατικών κατά την βιομηχανική οινοποίηση και την αποθήκευση υπό συνθήκες τροποποιημένης ατμόσφαιρας ελληνικών κρασιών. Για την ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση των κύριων φαινολικών συστατικών χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης συζευγμένης με συστοιχία φωτοδιόδων και φασματογράφο μάζας (HPLC-DAD-ESI-MS/MS). Η μελέτη του φαινολικού προφίλ επέτρεψε την ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση περισσοτέρων από 30 φαινολικών μορίων. Τα φαινολικά αυτά μόρια ανήκουν στις ομάδες των φαινολικών οξέων (κουταρικό & καφταρικό οξύ), φλαβονολών (κερκετίνη, μυρισετίνη, κ.ά.), φλαβαν-3-ολών (κατεχίνη) και ανθοκυανών (μαλβιδίνη, κ.ά.), ενώ κάποια από αυτά τα μόρια (λαρικιτρίνη, συρινγκετίνη, ισοραμνετίνη) ανιχνεύτηκαν για πρώτη φορά σε ελληνικά κρασιά. Βασικός στόχος ήταν η εξέταση της μεταφοράς των φαινολικών συστατικών από το σταφύλι στο ζυμούμενο γλεύκος, και η εξέλιξή τους κατά τις διαφορετικές, συνήθεις πρακτικές που ακολουθούνται στην οινοποίηση. Για το λόγο αυτό επιλέχθηκαν Ελληνικές κυρίως ποικιλίες που δεν έχουν ή έχουν ελάχιστα μελετηθεί, καθώς και διεθνείς ποικιλίες που καλλιεργούνται ευρύτατα και στην Ελλάδα. Επίσης όλα τα πειράματα έγιναν σε συνεργασία με οινοποιεία, ώστε να εξετασθούν οι μεταβολές στις πραγματικές βιομηχανικές συνθήκες οινοποίησης. Για τη διερεύνηση της μεταφοράς φαινολικών συστατικών από το σταφύλι (φλοιοί, σάρκα, γίγαρτα) στο κρασί, επιλέχθηκε ένας κλώνος της ποικιλίας της Μανδηλαριάς, η Μαυροκουντούρα Κύμης, η οποία δεν έχει εξετασθεί καθόλου, αν και αποτελεί μοναδική Ελληνική ποικιλία. Στη συνέχεια για τη μελέτη της εξέλιξης των υποομάδων των φαινολικών συστατικών κατά την οινοποίηση, επιλέχθηκαν ποικιλίες που χρησιμοποιούνται σε ερυθρές και λευκές οινοποιήσεις, με διαφορετικές επεξεργασίες (απλή οινοποίηση, χρήση πηκτινολυτικών ενζύμων, κρυοεκχύλιση πριν τη ζύμωση) καθώς και διαφορετικούς χρόνους παραμονής των στεμφύλων με το ζυμούμενο γλεύκος (εκχύλισης φαινολικών συστατικών). Συγκεκριμένα μελετήθηκαν οι ποικιλίες: Αγιωργίτικο, Μοσχοφίλερο, Ασύρτικο, Merlot, Syrah, και Cabernet. Οι 2

4 δειγματοληψίες γινόταν σε όλη τη διάρκεια της οινοποίησης, ώστε να προσδιορισθεί η επίδραση όλων των σταδίων στις μεταβολές των φαινολικών συστατικών και να εξαχθούν ασφαλή συμπεράσματα για την επίδραση αυτών, ανάλογα με τα απαιτούμενα ποιοτικά χαρακτηριστικά του τελικού προϊόντος (χρώμα, οίνος παλαίωσης κλπ.). Τα φαινολικά συστατικά μεταφέρονται από τους φλοιούς και τα γίγαρτα στο ζυμούμενο γλεύκος κατά την διάρκεια παραμονής των στεμφύλων, στα αρχικά στάδια της ζύμωσης. Τα πιο πολικά συστατικά όπως είναι οι ανθοκυάνες, εκχυλίζονται ευκολότερα, ενώ οι φλαβαν-3-όλες ακολουθούν με πιο αργό ρυθμό και έπειτα από μια φάση υστέρησης. Σε όλες τις οινοποιήσεις το ολικό φαινολικό φορτίο έφτασε στην μέγιστη περιεκτικότητα μεταξύ 2-8 ημερών. Τόσο η διεργασία της κρυοεκχύλισης όσο και η προσθήκη των πηκτινολητικών ενζύμων ενίσχυσαν την ποσοτική εκχύλιση όλων των πολυφαινολών του σταφυλιού κατά την οινοποίηση. Επιπλέον, κατά την κρυοεκχύλιση, οπότε η αλκοολική ζύμωση είναι πολύ περιορισμένη λόγω χαμηλής θερμοκρασίας, αυξημένο ρυθμό διάλυσης παρουσίασαν τα πιο πολικά και υδατοδιαλυτά φαινολικά συστατικά, ενώ η εκχύλιση των φλαβαν- 3-ολών σχεδόν αναστέλλεται. Επιπλέον στα Merlot και Syrah, που αποτελούν ευρύτατα οινοποιήσιμες ποικιλίες διεθνώς, εξετάσθηκε η μεταβολή της περιεκτικότητας μεταλλικών ιχνοστοιχείων σε συνάρτηση με τη μεταβολή φαινολικών συστατικών κατά την οινοποίηση. Παρατηρήθηκε μια αντίστροφη τάση μεταξύ της ποσοτικής μεταβολής πολυφαινολών και ιχνοστοιχείων. Πιο συγκεκριμένα παρατηρήθηκε μείωση του Cu ταυτόχρονα με την εκχύλιση των ανθοκυανών και των φλαβονολών, η οποία και αποδόθηκε στη δημιουργία χηλικών συμπλόκων μεταξύ φλαβονοειδών και μετάλλων. Αντίστοιχη συμπεριφορά θα αναμενόταν και για τον Fe και το Mn όμως κάτι τέτοιο δεν παρατηρήθηκε ενώ η συγκέντρωση των συγκεκριμένων στοιχείων εμφάνισε αυξητική τάση, γεγονός που αποδόθηκε στη ύπαρξη οξειδίων τους σε σκευάσματα που προστέθηκαν κατά την οινοποίηση (ζύμες, πηκτινολητικά ένζυμα) και στη χρήση ανοξείδωτων δεξαμενών. Στα φρέσκα κρασιά έγινε προσπάθεια «χαρακτηρισμού» τους με βάση το φαινολικό προφίλ, μία τάση που αναπτύσσεται διεθνώς πρόσφατα για τη διάκριση μεταξύ των ποικιλιών και ως προς την εντοπιότητα των κρασιών. Ενδιαφέρον εμφάνισε ο υπολογισμός των λόγων των περιεκτικοτήτων κάποιων χαρακτηριστικών συνόλων 3

5 υποκατεστημένων ανθοκυανών (π.χ. Σγλυκοζυλιωμένων/Σακετυλιωμένων), οι οποίοι επέτρεψαν ως ένα βαθμό τη διάκριση μεταξύ των ποικιλιών. Ο επόμενος βασικός στόχος της διατριβής ήταν η εξέταση των φαινολικών συστατικών κατά την αποθήκευση του κρασιού. Κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης το ολικό φαινολικό φορτίο παρέμεινε πρακτικά σταθερό. Aκόμα και τα δείγματα που αποθηκεύτηκαν σε λεπτό στρώμα ατμοσφαιρικού αέρα, διατήρησαν σε χρονικό διάστημα ενός έτους, περισσότερο από το 80% της αρχικής συγκέντρωσης των φαινολικών συστατικών τους. Αντίθετα οι ελεύθερες ανθοκυάνες συμμετείχαν σε αντιδράσεις πολυμερισμού με τις φλαβαν-3-όλες και η συγκέντρωσή τους υποδεκαπλασιάστηκε σε διάστημα λίγων μηνών, ακολουθώντας κινητική πρώτης τάξης. Επίσης παρατηρήθηκε το φαινόμενο της ενζυμικής υδρόλυσης άλλων φαινολικών συστατικών, όπως είναι οι γλυκοζίτες των φλαβονολών και οι τρυγικοί εστέρες του κρασιού, οδηγώντας στην αύξηση των συγκεντρώσεων των αντιστοίχων αγλυκονών και των κινναμικών οξέων. Συνήθως για την αποθήκευση του κρασιού χρησιμοποιείται αδρανής ατμόσφαιρα, κυρίως με χρήση αζώτου, για περιορισμό των μικροβιακών αλλοιώσεων. Η επίδρασή της στα φαινολικά συστατικά του κρασιού, τα οποία είναι ευαίσθητα στην παρουσία οξυγόνου δεν έχει μελετηθεί. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε, εκτός του καθαρού αζώτου, διοξείδιο του άνθρακα ή μίγμα του με άζωτο, επειδή το διοξείδιο του άνθρακα είναι ένα φθηνό αέριο που παράγεται κατά την αλκοολική ζύμωση και τα φρέσκα κρασιά είναι σχεδόν κορεσμένα σε διοξείδιο του άνθρακα. Η αποθήκευση σε συνθήκες τροποποιημένης ατμόσφαιρας, εμφάνισε σημαντική επίδραση στην εξέλιξη των μονομερών ανθοκυανών, με τις σταθερές της κινητικής των δειγμάτων που αποθηκεύτηκαν σε τροποποιημένες ατμόσφαιρες να είναι έως και υποπενταπλάσιες σε σχέση με τα αντίστοιχα που αποθηκεύτηκαν παρουσία λεπτής στιβάδας ατμοσφαιρικού αέρα ( mon -1 έναντι mon -1 ). Εκτός των μεταβολών των φαινολικών, μελετήθηκαν οι μεταβολές του χρώματος κατά την αποθήκευση και συσχετίσθηκαν με τα φαινολικά συστατικά, ώστε να ερμηνευθούν χρωματικές μεταβολές του κρασιού μέχρι την κατανάλωση. Όσον αφορά στις χρωματικές μεταβολές κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης, το ολικό χρώμα (CI) και η λαμπρότητα (da%) εμφάνισαν πτωτική τάση, ενώ αντίθετα η 4

6 παράμετρος της απόχρωσης (Τ) αυξήθηκε κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης των κόκκινων κρασιών. Το λαμπερό κόκκινο χρώμα είναι επιθυμητό στους φρέσκους ερυθρούς οίνους, γι αυτό το λόγο επιδιώχθηκε η ενίσχυση του χρώματος με προσθήκη φυσικών συμπαραγόντων. Το φαινόμενο του σχηματισμού έγχρωμων συμπλόκων των ανθοκυανών, ευθύνεται για περισσότερο από 30% του χρώματος των φρέσκων κόκκινων κρασιών, ενώ κατά την αποθήκευση επικρατεί το χρώμα των πολυμερών που σχηματίζονται από τις αντιδράσεις των ανθοκυανών με τις φλαβαν-3-όλες. Ροσμαρινικό οξύ και φυσικά εκχυλίσματα πλούσια σε υδροξυκινναμικά οξέα, προερχόμενα από αρωματικά φυτά της οικογένειας Lamiaceae (Origanum vulgare και Satureja thymbra) εξετάστηκαν για την ικανότητά τους να ενισχύσουν το χρώμα του φρέσκου κρασιού μέσω δημιουργίας έγχρωμων συμπλόκων με τις ανθοκυάνες. Η αύξηση του κόκκινου χρώματος, ήταν υψηλότερη με την προσθήκη των εκχυλισμάτων των φυτών σε σχέση με την προσθήκη πρότυπου ροσμαρινικού οξέος, γεγονός που αποδόθηκε στα φλαβονοειδή που περιέχονταν στα εκχυλίσματα, πέραν των κινναμικών οξέων. Παρατηρήθηκε η αύξηση του ολικού χρώματος του φρέσκου κρασιού κατά 15-50%, ενώ τα δείγματα στα οποία προστέθηκαν οι συμπαράγοντες από τα αρωματικά φυτά, διατήρησαν υψηλότερο φορτίο συμπλοκοποιημένων ανθοκυανών και υψηλότερη χρωματική ένταση για χρονικό διάστημα 3 μηνών. Κατά την αποθήκευση του κρασιού, παρατηρήθηκε μείωση των μονομερών και συμπλοκοποιημένων ανθοκυανών, με ταυτόχρονη αύξηση των πολυμερισμένων. Παρόλα αυτά η μεταβολή στην ισορροπία μεταξύ μονομερών και συμπλοκοποιημένων ανθοκυανών που επήλθε λόγο της προσθήκης των συμπαραγόντων από τα αρωματικά φυτά, δεν επηρέασε τον ρυθμό των αντιδράσεων πολυμερισμού κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης 6 μηνών. 5

7 Abstract Changes in the principal phenolic compounds during the vinification process and storage under modified atmosphere of Greek wines have been investigated. HPLC- DAD-ESI-MS/MS was used for the identification and quantification of more than 30 principal phenolic compounds, namely anthocyanins (malvidin, etc.), flavonols (quercetin, myricetin, etc.,), flavan-3-ols (catechin) and hydroxycinnamates (caftaric and coutaric acid). The existence of some of these molecules (laricitrin, syringetin and isoramnetin), was confirmed for the first time in Greek wines. During maceration, the most polar molecules, like anthocyanins, were extracted imminently, while the flavan-3-ols followed at a lower rate after a lag phase. In all varieties, the total phenol content reached a maximum within 2-8 days. The effect of vinification processes, like cold maceration and addition of pectolytic enzymes, has been studied. Both processes enhanced the extraction of grape polyphenols during the vinification. Moreover, during cold maceration, due to the low ethanol content and the obstruction of the fermentation, the more polar and water soluble constituents presented increased extraction rates, whereas the extraction of flavan-3-ols was suspended. On the other hand, the use of pectolytic enzymes did not appear to affect the extraction rates of phenolic compounds. Comparing the variation of metals at maceration process, with the variation of monomeric anthocyanins and flavonols, an inverse relationship was noticed that can be attributed to complexing reactions of polyphenols with particular trace elements. During one year storage, the concentration of total phenols remained practically constant and even samples stored under a thin atmospheric air layer, retained up to 80% of their initial phenolic content. On the contrary, free anthocyanins, participated in polymerization reactions with flavan-3-ols and their concentration declined almost tenfold during a few months, following 1st order kinetics. Also, enzymatic hydrolysis of other phenolic compounds like flavonol glycosides and tartaric esters that lead to the respective aglycones and hydroxycinnamic acids was observed. The modified atmosphere had little effect on the observed changes of phenolic constituents, except for the decrease of monomeric anthocyanins. The rate constants of the reactions presented a significant difference (p<0.05) between the MAP stored samples and the blind samples that were packaged with atmospheric air. 6

8 Considering the evolution of color during storage, the indexes of color intensity (CI) and brilliance (da%) declined, while the hue index (T) followed an increasing trend during storage of red wines. The statistical evaluation of the results did not detect significant differences on color parameters due to storage under different modified atmosphere. Copigmentation of anthocyanins accounts for over 30% of the fresh red wine color, while during storage, the color of polymeric pigments formed between anthocyanins and proanthocyanidins predominates. Rosmarinic acid and natural extracts rich in hydroxycinnamic acids, obtained from aromatic plants (Origanum vulgare and Satureja thymbra), were examined as cofactors to fresh Merlot wine and the effect on anthocyanin copigmentation and wine color was studied during storage for 6 months. An increase of the copigmented anthocyanins that enhanced color intensity by 15 50% was observed, confirming the ability of complex hydroxycinnamates to form copigments. The samples with added cofactors retained higher percentages of copigmented anthocyanins and higher color intensity, compared to the control wine, up to 3 months. However, the change in the equilibrium between monomeric and copigmented anthocyanins that was induced by added cofactors, did not affect the rate of polymerization reactions during storage. 7

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Περίληψη... 1 Εισαγωγή Θεωρητικό Μέρος Το σταφύλι Σύσταση του σταφυλιού Ωρίμανση του σταφυλιού Χαρακτηριστικές καλλιεργήσιμες ποικιλίες Οινοποίηση Προζυμωτικές διεργασίες Διαλογή των σταφυλιών Αποβοστρύχωση Έκθλιψη («σπάσιμο ή εκραγισμός») Λευκή οινοποίηση Στράγγιση ή διαχωρισμός «Συμπίεση» Θείωση Απολάσπωση Προζυμωτική κρυοεκχύλιση Ζύμωση Ερυθρή οινοποίηση Προζυμωτική κρυοεκχύλιση Κλασική μέθοδος ερυθρής οινοποίησης Θερμοοινοποίηση Ανθρακική αναεροβίωση Μεταζυμωτικές διεργασίες Διαύγαση Κολλάρισμα Διαύγαση με Διήθηση (Φιλτράρισμα) Σταθεροποίηση Η χημεία του κρασιού Αλκοολική ζύμωση

10 3.2 Μηλογαλακτική ζύμωση Η χημική σύσταση του κρασιού Αλκοόλες Σάκχαρα Οργανικά Οξέα Άλλες κατηγορίες ενώσεων Φαινολικά συστατικά του σταφυλιού και του κρασιού Γενικά στοιχεία Μη φλαβονοειδή Φλαβονοειδή Φλαβονόλες Ανθοκυανιδίνες και Ανθοκυάνες Φλαβαν-3-όλες (κατεχίνες) και προκυανιδίνες Ταννίνες Μεταβολές φαινολικών συστατικών και η επίδρασή τους στο χρώμα και στα άλλα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του κρασιού Παραλαβή φαινολικών συστατικών κατά την οινοποίηση Εκχύλιση των φαινολικών συστατικών από το σταφύλι Παράγοντες που επηρεάζουν την εκχύλιση των φαινολικών Αντιδράσεις φαινολικών συστατικών Δραστικότητα φαινολικών συστατικών Ενζυμικές δράσεις Χημικές αντιδράσεις Ανθοκυάνες: μορφή, αντιδράσεις και επίδραση στο χρώμα των κόκκινων κρασιών Γενικά Οι ανθοκυάνες και η υποκατάστασή τους Αντιδράσεις διάσπασης των ανθοκυανών Η αυτοσυνένωση των ανθοκυανών και το φαινόμενο του σχηματισμού έγχρωμων συμπλόκων με άλλα συστατικά του κρασιού Πολυμερισμός ανθοκυανών - φλαβανολών Πυρανοανθοκυάνες Προϊόντα ξανθυλίου Εξέλιξη του χρώματος των κόκκινων κρασιών

11 5.5 Μεταβολές φαινολικών συστατικών και χρώματος στα λευκά κρασιά Αποθήκευση-συσκευασία Διαλυμένο οξυγόνο στο κρασί Συσκευασία Χρήση αδρανών αερίων κατά την αποθήκευση Στόχος-Πειραματικός Σχεδιασμός Πειραματική Διαδικασία Πρώτες ύλες αναλύσεων και ταυτοποίησης φαινολικών συστατικών Πρώτες ύλες και πειραματική διαδικασία οινοποίησης Αποθήκευση του κρασιού σε τροποποιημένες ατμόσφαιρες Προσθήκη φυσικών εκχυλισμάτων για την ενίσχυση του χρώματος μέσω σχηματισμού εγχρώμων συμπλόκων (copigmentation) με τις ανθοκυάνες Αναλυτικές Μέθοδοι Μέτρηση ολικού φαινολικού φορτίου (TP) Μέθοδος Folin Ciocalteu Προσδιορισμός φλαβαν-3-ολών Μέθοδος DMACA Προσδιορισμός συμπλοκοποιημένων ανθοκυανών Προσδιορισμός χρωματικών παραμέτρων Ανάλυση φαινολικών ενώσεων με HPLC Ανάλυση δειγμάτων κρασιού και μούρων SPE (Solid phase extraction) για την ποιοτική ανάλυση των μη ανθοκυανικών ενώσεων Ανάλυση αρωματικών φυτών Ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση μετάλλων με ICP Αποτελέσματα - Συζήτηση Ανάλυση του φαινολικού προφίλ διαφόρων ποικιλιών ελληνικών κρασιών με LC-MS Ταυτοποίηση ανθοκυανών Ταυτοποίηση μη ανθοκυανικών φαινολικών συστατικών Εξέλιξη πολυφαινολών και ιχνοστοιχείων κατά την οινοποίηση Εκχύλιση πολυφαινολών κατά τη βιομηχανική οινοποίηση ερυθρών και λευκών ποικιλιών σταφυλιού Εκχύλιση φαινολικών συστατικών από τα μέρη του σταφυλιού στο κρασί

12 1.3.2 Επίδραση του χρόνου επαφής με τα στέμφυλα στην εκχύλιση φαινολικών συστατικών Εφαρμογή κρυοεκχύλισης και πηκτινολυτικών ενζύμων Σύγκριση των ερυθρών οινοποιήσεων Επίδραση προζυμωτικής κρυοεκχύλισης στην ανάκτηση φαινολικών συστατικών σε λευκό γλεύκος (Μοσχοφίλερο) Σύγκριση της οινοποίησης Μοσχοφίλερου με και χωρίς προζυμωτική κρυοεκχύλιση Μεταβολή της συγκέντρωσης μετάλλων και επίδραση στη συγκέντρωση των πολυφαινολών κατά την οινοποίηση των ερυθρών ποικιλιών (Merlot και Syrah) Μεταβολή φαινολικών συστατικών και χρωματικών παραμέτρων κατά την αποθήκευση του κρασιού Εξέλιξη του ολικού φαινολικού φορτίου κατά την αποθήκευση Ανθοκυάνες Φλαβονόλες Κινναμικά παράγωγα Φλαβαν-3-όλες Εξέλιξη χρώματος Σύγκριση εξέλιξης φαινολικών κατά την αποθήκευση κρασιού υπό διαφορετικές τροποποιημένες ατμόσφαιρες Ολικό φαινολικό φορτίο Ανθοκυάνες Φλαβονόλες Φαινολικά οξέα Χρώμα Μελέτη του φαινομένου της συνέργειας χρώματος μέσω σχηματισμού εγρώμων συμπλόκων (copigmentation) μεταξύ ανθοκυανών και άλλων φαινολικών συστατικών Επίδραση της προσθήκης των συμπαραγόντων (cofactors) σε φρέσκο κρασί Το φαινολικό προφίλ του φρέσκου κρασιού Το φαινολικό προφίλ των εκχυλισμάτων των αρωματικών φυτών και του εμπλουτισμένου κρασιού Η επίδραση της προσθήκης των συμπαραγόντων στο φρέσκο κρασί και ο σχηματισμός των εγχρώμων συμπλόκων με τις ανθοκυάνες

13 3.1.4 Η επίδραση στο χρώμα του φρέσκου κρασιού Επίδραση της προσθήκης των συμπαραγόντων κατά την αποθήκευση του κρασιού Μεταβολές στις ανθοκυάνες του κρασιού κατά την αποθήκευση Επίδραση στο χρώμα του κρασιού Συμπεράσματα Βιβλιογραφία Παράρτημα 1: Φαινολικά συστατικά μούρων - Ποιοτικά και ποσοτικά χαρακτηριστικά Παράρτημα 2: Αποθήκευση κρασιού σε τροποποιημένες ατμόσφαιρες

14 Εισαγωγή Το σταφύλι αποτελεί τον καρπό του φυτού της αμπέλου, ενός αναρριχητικού φυτού, η μεγάλη προσαρμοστικότητα του οποίου σε ένα ευρύ φάσμα κλιματικών συνθηκών, είχε ως αποτέλεσμα την καθιέρωσή του, από την αρχαιότητα κιόλας, ως ένα από τα βασικά καλλιεργήσιμα γεωργικά αγαθά. Το σταφύλι μπορεί να καταναλωθεί ωμό, ενώ ο χυμός του (γλεύκος) χρησιμοποιείται ως πρώτη ύλη για την παραγωγή κρασιού, η οποία πραγματοποιείται με τη μετατροπή των σακχάρων σε αιθυλική αλκοόλη (αιθανόλη) μέσω του μεταβολισμού των ζυμομυκήτων, μια διαδικασία που ονομάζεται αλκοολική ζύμωση. Εκτός από το ότι αποτέλεσε ένα από τα πρώτα καταγεγραμμένα μεταποιητικά και εμπορικά προϊόντα της ιστορίας, η παραγωγή του οποίου χρονολογείται από το 5000 π.χ. στη Μέση Ανατολή, το κρασί θεωρείται διαχρονικά ως ένα κατεξοχήν πολιτισμικό αγαθό, αναπόσπαστο κομμάτι των κοινωνικών συναθροίσεων και μάρτυρας ευημερίας και ανάπτυξης του εκάστοτε, και δη του ελληνικού πολιτισμού. Η ύπαρξη χιλιάδων διαφορετικών καλλιεργήσιμων ποικιλιών σταφυλιού σε συνδυασμό με το διαφορετικό χαρακτήρα που προσδίδουν στο κρασί οι κλιματικές συνθήκες, η σύσταση του εδάφους και οι τεχνικές οινοποίησης δίνουν έναν εξαιρετικά μεγάλο αριθμό διαφορετικών ειδών παραγόμενων κρασιών, το καθένα από τα οποία έχει ξεχωριστό γευστικό και αρωματικό χαρακτήρα. Τα στοιχεία αυτά έχουν καθιερώσει, σήμερα, την οινική βιομηχανία σε βασικό πυλώνα του κλάδου των αλκοολούχων ποτών. Σήμερα, καλλιεργούνται παγκοσμίως περίπου τετραγωνικά χιλιόμετρα εκτάσεων αμπέλου, για την παραγωγή σταφυλιών, το 71% των οποίων προορίζεται για την παραγωγή κρασιού. Στην Ελλάδα έχει σημειωθεί ιδιαίτερη ανάπτυξη του κλάδου τα τελευταία 50 χρόνια, ενώ η πληθώρα των μοναδικών ελληνικών ποικιλιών, η ιδιαιτερότητα των εδαφών (όπως το ηφαιστιογενές έδαφος της Σαντορίνης) και το ιδανικό γεωγραφικό πλάτος στο οποίο βρίσκεται η χώρα, αποτελούν παράγοντες που ευνοούν την παραγωγή ακόμα ποιοτικότερων κρασιών. Επιπλέον, εκτεταμένες έρευνες έχουν αναδείξει τα τελευταία χρόνια τα θετικά οφέλη που μπορεί να έχει η ελεγχόμενη κατανάλωση κρασιού στην υγεία του ατόμου. 13

15 Μεταξύ άλλων, η με μέτρο κατανάλωση κρασιού μπορεί να μειώσει τον κίνδυνο εμφάνισης στεφανιαίων και καρδιοαγγειακών παθήσεων καθώς και διάφορων μορφών καρκίνου, να βελτιώσει τη κυκλοφορία του αίματος, να μειώσει το άγχος και να έχει αντιοξειδωτική δράση περιορίζοντας τον κίνδυνο καρδιακών επεισοδίων και εγκεφαλικών. Μπορεί ακόμα να βελτιώσει το μεταβολισμό, καταπολεμώντας την παχυσαρκία, ενώ έχει αντιφλεγμονώδη και αντιγηραντική δράση, εμποδίζοντας ή καθυστερώντας την εμφάνιση εκφυλιστικών ασθενειών του εγκεφάλου. Οι περισσότερες από τις ευεργετικές δράσεις του κρασιού οφείλονται σε μια κατηγορία οργανικών ενώσεων που περιέχονται στο κρασί, τα φαινολικά συστατικά. Τα φαινολικά συστατικά εκτός από τις αντιοξειδωτικές τους ιδιότητες και τα γενικότερα οφέλη τους στην υγεία, συμβάλλουν στη δομή και την πολυπλοκότητα του κρασιού και καθορίζουν σε μεγάλο βαθμό τον οργανονοληπτικό του χαρακτήρα και το χρώμα του. Η σύσταση του κάθε κρασιού σε φαινολικά είναι μοναδική. Δεν εξαρτάται μόνο από την ποικιλία του σταφυλιού από το οποίο προέρχονται, αλλά και από ένα σύνολο άλλων παραμέτρων που αφορούν στην οινοποίηση, μεταξύ των οποίων είναι ο χρόνος επαφής των στεμφύλων με το γλεύκος (χρόνος εκχύλισης), οι προζυμωτικές και μεταζυμωτικές διεργασίες που υφίσταται το γλεύκος και το κρασί αντίστοιχα, η χρήση πηκτινολυτικών ενζύμων, η παλαίωση σε δρύινα βαρέλια και η ατμόσφαιρα αποθήκευσης του κρασιού. Η παρούσα διατριβή έχει ως στόχο να μελετήσει τη φαινολική σύσταση διαφορετικών λευκών και ερυθρών κρασιών από ελληνικές και διεθνείς ποικιλίες που καλλιεργούνται στην Ελλάδα, και να εξετάσει τις μεταβολές που παρατηρούνται στο ολικό φαινολικό φορτίο και στις επιμέρους υποομάδες του κατά την οινοποίηση και αποθήκευση του κρασιού υπό διαφορετικές συνθήκες. Η συστηματική μελέτη της εξέλιξης των φαινολικών ομάδων (ανθοκυανών, φλαβονολών, φαινολικών οξέων και κατεχινών) κατά την οινοποίηση είναι μάλλον περιορισμένη στη διεθνή βιβλιογραφία. Ιδιαίτερα δε για τις ελληνικές ποικιλίες δεν υπάρχουν καθόλου δημοσιευμένα δεδομένα. Ενώ η ποικιλία του σταφυλιού επηρεάζει σε μεγάλο βαθμό τη φαινολική σύσταση του μετέπειτα κρασιού στο σύνολο των περιπτώσεων, η εκχύλιση κατά την οινοποίηση αποτελεί το στάδιο που 14

16 δίνει την ευκαιρία στον οινοπαραγωγό να επέμβει και να διαφοροποιήσει τη σύσταση αυτή για να δημιουργήσει το επιθυμητό για αυτόν τελικό προϊόν γι αυτό και κρίθηκε σκόπιμο να μελετηθεί η εξέλιξη της εκχύλισης των φαινολικών συστατικών κατά την οινοποίηση σε βιομηχανική κλίμακα, με εφαρμογή διαφορετικών τεχνικών οινοποίησης (χρήση πηκτινολυτικών ενζύμων, κρυοεκχύλιση πριν τη ζύμωση, διαφορετικός χρόνος παραμονής στεμφύλων σε επαφή με το ζυμούμενο γλεύκος). Επιπλέον, η ανάλυση της φαινολικής σύστασης ελληνικών ποικιλιών έχει μεγάλο ενδιαφέρον αφού τα τελευταία χρόνια γίνεται μια προσπάθεια «χαρακτηρισμού» ( profiling ) όλων των καλλιεργήσιμων ποικιλιών παγκοσμίως, ενώ παρόμοιο ενδιαφέρον έχει και η μελέτη της προσαρμογής της φαινολικής σύστασης των διεθνών ποικιλιών στις κλιματικές συνθήκες και τα εδάφη της ελληνικής επικράτειας. Η σωστή διατήρηση ενός κρασιού τόσο αμέσως μετά την οινοποίηση όσο και την αποθήκευση-παλαίωση στη συσκευασία έχει μεγάλη σημασία. Αν και η χρήση τροποποιημένων ατμοσφαιρών για την προστασία του κρασιού από αλλοιώσεις είναι ευρέως διαδεδομένη, εντούτοις υπάρχουν ελάχιστα δημοσιευμένα ερευνητικά αποτελέσματα για το πώς η σύσταση της ατμόσφαιρας επηρεάζει την εξέλιξη του κρασιού. Συνήθως η επιλογή της τροποποιημένης ατμόσφαιρας στη βιομηχανία γίνεται εμπειρικά και με βάση τα εμπορικώς διαθέσιμα αέρια. Για το λόγο αυτό, μελετήθηκε η επίδραση διαφορετικής σύστασης τροποποιημένων ατμοσφαιρών στην εξέλιξη της φαινολικής σύστασης κρασιών κατά την αποθήκευση τους. Επιπλέον, η ενζυμική υδρόλυση μορίων όπως οι φλαβονόλες και οι τρυγικοί εστέρες, μεταβάλλουν το φαινολικό προφίλ του κρασιού κατά την αποθήκευση, και πιθανώς τα οργανοληπτικά του χαρακτηριστικά, και διερευνήθηκε στην παρούσα εργασία. Τέλος, ένα μεγάλο μέρος της παρούσας διατριβής ασχολείται διεξοδικά με το χρώμα των κόκκινων κρασιών και πιο συγκεκριμένα με τα μόρια των ανθοκυανών και την αλληλεπίδρασή τους με τα άλλα συστατικά του κρασιού. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός, προκειμένου να καταλάβουμε την πολυπλοκότητα του κόκκινου χρώματος του κρασιού, ότι στο ph ενός συνηθισμένου κρασιού, η κύρια χρωστική του (3- γλυκοζίτης της μαλβιδίνης) απαντάται σε ποσοστό 75% ως άχρωμη ημιακετάλη. Από αυτό και μόνο το γεγονός γίνεται εύκολα κατανοητό, ότι το έντονο κόκκινο χρώμα 15

17 του κρασιού και η διατήρηση-εξέλιξή του συμβαίνουν μέσω διαφόρων σταθεροποιητικών μηχανισμών. Ο σχηματισμός έγχρωμων συμπλόκων ευθύνεται σε ποσοστό 30-50% για το χρώμα των νέων κόκκινων κρασιών. Ως συμπαράγοντες στη δημιουργία έγχρωμων συμπλόκων με τις ανθοκυάνες, μπορούν να είναι ένα πλήθος οργανικών ενώσεων, μεταξύ άλλων φαινολικά οξέα, φλαβονοειδή (πιο συγκεκριμένα φλαβονόλες και φλαβόνες), αμινοξέα ακόμα και οι ίδιες οι ανθοκυάνες (αυτό συμπλοκοποίηση self-association). Επίσης, σταθεροποίηση του χρώματος, προκαλεί ο πολυμερισμός των ανθοκυανών με φλαβαν-3-όλες και προκυανιδίνες, καθώς και ο σχηματισμός νέων έγχρωμων ενώσεων, όπως οι πυρανοανθοκυάνες. Το χρώμα των κόκκινων κρασιών δεν εξαρτάται λοιπόν, μόνο από το πλήθος των ανθοκυανών που θα εκχυλιστούν από τους φλοιούς, αλλά και από την εκχύλιση των υπόλοιπων φαινολικών ομάδων, καθώς και από τις μεταβολές τους υπό τις διάφορες συνθήκες αποθήκευσης και εμφιάλωσης. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν αυτές οι μεταβολές και η συνεπαγόμενη μεταβολή του χρώματος των κόκκινων κρασιών. Επίσης, μελετήθηκε η δυνατότητα αύξησης του χρώματος μέσω δημιουργίας έγχρωμων συμπλόκων μεταξύ κινναμικών οξέων που βρίσκονται σε φυσικά εκχυλίσματα και ανθοκυανών του κόκκινου κρασιού καθώς και η επίδραση αυτών στο χρώμα του κατά την αποθήκευσή του. Για τις ανάγκες της μελέτης χρησιμοποιήθηκε ροσμαρινικό οξύ, καθώς και εκχυλίσματα αρωματικών φυτών, πλουσίων σε ροσμαρινικό και άλλα σύνθετα κινναμικά οξέα, της οικογένειας Lamiaceae. 16

18 Θεωρητικό Μέρος 1 Το σταφύλι 1.1 Σύσταση του σταφυλιού Το σταφύλι αποτελεί τον καρπό του ξυλώδους φυτού της αμπέλου, του βοτανικού γένους Vitis. Πιο συγκεκριμένα, το σταφύλι κυρίως από το είδος Vitis Vinifera, που περιλαμβάνει διαφορετικές ποικιλίες, αποτελεί την πρώτη ύλη για την παραγωγή του οίνου σε παγκόσμια κλίμακα. Ως πρώτη ύλη ασκεί σπουδαία επίδραση στη σύσταση, στον τύπο και στην ποιότητα του οίνου. Κάθε βότρυς (ή τσαμπί) του σταφυλιού απαρτίζεται από δύο κύρια μέρη: Το ξυλώδες μέρος που ονομάζεται βόστρυχας ή κοτσάνι και Τις ράγες (ή ρόγες), οι οποίες αποτελούν το εδώδιμο και οινοποιήσιμο τμήμα του σταφυλιού. Η αναλογία των δύο αυτών μερών του σταφυλιού δεν είναι σταθερή αλλά εξαρτάται από έναν αριθμό παραγόντων όπως η ποικιλία, οι κλιματολογικές συνθήκες, το έδαφος, η ηλικία των πρέμνων, ο χρόνος του τρυγητού κ.α. Στις οινοποιήσιμες ποικιλίες σταφυλιών η διακύμανση του μεγέθους των βοτρύων είναι ακόμα μεγαλύτερη σε σχέση με τα επιτραπέζια σταφύλια. Κατά μέσο όρο πάντως, η σύνθεση του σταφυλιού κυμαίνεται στις παρακάτω αναλογίες: Βόστρυχοι 3-7 % κ.β. και 30 % κ.ο. Ράγες % κ.β. και 70 % κ.ο. Οι βόστρυχοι αποτελούνται κυρίως από νερό σε ποσοστό ακόμα και 90% κ.β. αρχικά ενώ στη συνέχεια κατά την ξυλοποίηση το ποσοστό αυτό μειώνεται σε % και παράλληλα αυξάνεται το ποσοστό ξηρής ουσίας που φτάνει στο 20-30%. Το μεγαλύτερο μέρος της ξηράς ουσία αποτελείται από τις ξυλώδεις ουσίες (μέχρι 15%) ενώ το υπόλοιπο από τις ουσίες που εμφανίζονται στον Πίν. 1: 17

19 Πίν. 1: Περιεκτικότητα συστατικών στους βόστρυχους εκτός των ξυλώδων ιστών Συστατικά περιεκτικότητα (% κ.β.) ταννίνες 2-4 ρητίνες 1 αζωτούχες ουσίες 1-2 ανόργανα συστατικά 2-3 οργανικά οξέα 1 2 ζάχαρα 1 (Σουφλερός, 2000) Η σύσταση και συγκεκριμένα η περιεκτικότητα των ραγών σε νερό, ταννίνες και ανόργανα άλατα επηρεάζουν το παραγόμενο κρασί, ιδιαίτερα κατά την ερυθρή οινοποίηση, όπου η ζύμωση του γλεύκους γίνεται παρουσία των στεμφύλων. Η ρόγα αποτελείται από τα παρακάτω τρία μέρη: Τον φλοιό σε ποσοστό % κ.β. Τη σάρκα σε ποσοστό % κ.β. Τα γίγαρτα σε ποσοστό 3-6 % κ.β. (τα οποία όμως σε ορισμένες περιπτώσεις απουσιάζουν εντελώς) Ο φλοιός με τη σειρά του αποτελείται από τρία στρώματα: την εφυμενίδα, την επιδερμίδα και το υπόδερμα το οποίο περιέχει ανθοκυάνες. Επιπλέον, ο φλοιός περιέχει ελάχιστη ποσότητα σακχάρων και είναι πλούσιους σε αδιάλυτες πηκτίνες, σε κυτταρίνη και σε πρωτεΐνες. Το μηλικό και τρυγικό οξύ βρίσκονται σε μικρές συγκεντρώσεις ενώ το κιτρικό οξύ υπερέχει ποσοτικά σε σχέση με τα άλλα οξέα. Η σύσταση του φλοιού φαίνεται στον Πίν. 2: Η σάρκα αποτελεί το τμήμα εκείνο της ρόγας που περιέχει σχεδόν αποκλειστικά τον χυμό του σταφυλιού, ο οποίος αφού παραληφθεί με κατάλληλη επεξεργασία θα αποτελέσει το προς οινοποίηση γλεύκος. Για το λόγο αυτό, η χημική σύσταση της σάρκας είναι σε μεγάλο ποσοστό ίδια με τη σύσταση του γλεύκους. Τα κυριότερα συστατικά της σάρκας φαίνονται στον Πίν. 3: 18

20 Πίν. 2: Περιεκτικότητα συστατικών των φλοιών της ρόγας των σταφυλιών Συστατικά περιεκτικότητα (% κ.β.) νερό ταννίνες 1-2 όξινες ενώσεις ανόργανες ενώσεις αζωτούχες ενώσεις λοιπές ουσίες (Σουφλερός, 2000) Πίν. 3: Περιεκτικότητα συστατικών της σάρκας των σταφυλιών Συστατικά περιεκτικότητα (% κ.β.) νερό σάκχαρα λοιπά συστατικά: 1. Οργανικά οξέα 2. Ανόργανες ενώσεις 3. Αζωτούχες ενώσεις 4. Πηκτινικές ύλες 5. Αρωματικές ουσίες 6. Χρωστικές (μόνο σε βαφικές ποικιλίες) 7. Ταννίνες κλπ. 5-6 (Σουφλερός, 2000) Τα γίγαρτα βρίσκονται στο ενδοκάρπιο, το οποίο δε διακρίνεται με σαφή τρόπο από τη σάρκα. Ο ιστός του γίγαρτος είναι πλούσιος σε εφεδρικές ελαιώδεις και γλυκεροφοσφωρικές ουσίες. Τα γίγαρτα αποτελούν πλούσια πηγή ταννινών και φαινολικών ενώσεων αλλά περιέχουν και ελαιώδεις ουσίες οι οποίες αποτελούν τη 19

21 βάση για την εκδήλωση βουτυρικής ζύμωσης, η οποία προκαλεί αρνητική χαρακτηριστική οσμή. Η σύσταση των γιγάρτων δίνεται στον Πίν. 4: Πίν. 4: Περιεκτικότητα συστατικών στα γίγαρτα της ρόγας του σταφυλιού Συστατικά περιεκτικότητα (% κ.β.) νερό υδρογονάνθρακες ελαιώδης ουσίες ταννίνες 4-6 αζωτούχες ενώσεις ανόργανες ουσίες 2-4 λιπαρά οξέα 1 (Σουφλερός, 1997) 1.2 Ωρίμανση του σταφυλιού Κατά τη διάρκεια της πρώτης περιόδου που είναι γνωστή και ως στάδιο του πράσινου σταφυλιού ή της άγουρης ρόγας αρχίζει ο σχηματισμός του καρπού (ρόγα), ο οποίος λειτουργεί σαν όργανο που επεξεργάζεται και αφομοιώνει άμυλο. Σε όλο το πρώτο στάδιο έχουμε αύξηση του βάρους και του όγκου του καρπού. Τα οξέα που περιέχονται αυξάνονται φτάνοντας σε περιεκτικότητα τα 20 g/kg σταφυλιού ενώ τα σάκχαρα παραμένουν σταθερά και στο ίδιο περίπου ποσοστό με τα οξέα (20-25 g/kg σταφυλιού). Η δεύτερη περίοδος που αποτελεί το στάδιο του περκασμού (veraison), κατά το οποίο η ρόγα αλλάζει χρώμα, φουσκώνει και γίνεται ελαστική. Οι ερυθρές χρωστικές εμφανίζονται στις ρόγες των ερυθρών ποικιλιών και οι αντίστοιχες χρωστικές στις λευκές ποικιλίες. Το φαινόμενο της αλλαγής χρώματος είναι απότομο, έτσι ώστε μία ρόγα να αλλάζει χρώμα σε μία μέρα ενώ για το σύνολο των ρογών του σταφυλιού μιας περιοχής χρειάζονται περίπου 15 μέρες. Ξεκινά η αύξηση και η συσσώρευση των σακχάρων που με τη σειρά της προκαλεί οσμωτική έλξη του νερού και άρα διόγκωση της ρόγας. Τα οξέα μειώνονται τόσο λόγω της αραίωσης όσο και της εξουδετέρωσης τους από τα ανόργανα άλατα που περιέχει το νερό. 20

22 Το στάδιο της ωρίμανσης (maturation) που ακολουθεί εκτείνεται από την ολοκλήρωση του περκασμού ως την πλήρη ωρίμανση η οποία δεν έχει ακριβή ορισμό αλλά μπορεί να οριστεί με διαφορετικούς τρόπους: Με βάση την οξύτητα, την περιεκτικότητα σε σάκχαρα, την περιεκτικότητα σε φαινολικά ή και τον όγκο παραγωγής. Δύο συνήθεις δείκτες που χρησιμοποιούνται στην πράξη είναι η σχέση των σακχάρων προς τα οξέα (ένδειξη ωρίμανσης) και το πηλίκο της συγκέντρωσης του τρυγικού οξέος προς το άθροισμα των συγκεντρώσεων του τρυγικού και του μηλικού οξέος. Η περίοδος της ωρίμανσης διαρκεί 40 με 50 μέρες. Η υπερωρίμανση είναι η περίοδος που ακολουθεί την πλήρη ωρίμανση, κατά την οποία έχουμε απώλεια νερού και συμπύκνωση του χυμού. Έχει μεγάλη σημασία στην οινοποίηση κυρίως γλυκών οίνων και περιλαμβάνει ορισμένες φορές την προσβολή του αμπελώνα από το μύκητα Botrytis cinerea μια διαδικασία που είναι γνωστή και ως «ευγενής σήψη» (Τσακίρης, 1998). Οι παράγοντες που επηρεάζουν την ωρίμανση των σταφυλιών και κατ επέκταση την ποιότητα του οίνου μπορούν να διακριθούν σε σταθερούς των οποίων η επίδραση δεν μεταβάλλεται από σοδειά σε σοδειά και σε μεταβλητούς οι οποίοι είναι υπεύθυνοι για τη ποιότητα μιας συγκεκριμένης σοδειάς. Στους σταθερούς παράγοντες περιλαμβάνονται η ποικιλία της αμπέλου, το υποκείμενο δηλαδή το ένριζο τμήμα του φυτού πάνω στο οποίο εμβολιάζεται η ποικιλία, το κλίμα και η σύσταση του εδάφους. Στους μεταβλητούς περιλαμβάνονται οι καιρικές συνθήκες, οι αποστάσεις φύτευσης, οι καλλιεργητικές τεχνικές καθώς και τυχόν ασθένειες που είναι πιθανόν να προσβάλλουν το αμπέλι. Όσον αφορά τα φαινολικά συστατικά του σταφυλιού, οι ανθοκυάνες είναι οι χρωστικές των κόκκινων ποικιλιών και ανήκουν στα φλαβονοειδή (Κεφ. 4). Οι ανθοκυάνες αρχίζουν να εμφανίζονται στο στάδιο του περκασμού στη ρόγα. Σχηματίζονται κατά κύριο λόγο στο υπόδερμα του φλοιού, όπως προαναφέρθηκε, και συσσωρεύονται στα χυμοτόπια ενώ σε ελάχιστες περιπτώσεις εμφανίζονται και στη σάρκα. Οι αντίστοιχες χρωστικές στα λευκά ανήκουν στις φλαβονόλες (επίσης φλαβονοειδείς φαινολικές ενώσεις κίτρινου χρώματος). Για τον σχηματισμό των ανθοκυανών απαιτείται ένα ορισμένο ποσό ηλιακής ακτινοβολίας. Για το λόγο αυτό 21

23 το μέρος των σταφυλιών που βρίσκεται στη σκιά είναι λιγότερο χρωματισμένο σε σχέση με εκείνο που είναι εκτεθειμένο στον ήλιο. Επιπροσθέτως, οι ερυθρές ποικιλίες για να χρωματιστούν κατάλληλα απαιτούν και ικανοποιητικές θερμοκρασίες. Έτσι, το όριο καλλιέργειας ερυθρών ποικιλιών περιορίζεται σε μικρότερο γεωγραφικό πλάτος σε σχέση με τις λευκές ποικιλίες. Εντούτοις, οι πολύ υψηλές θερμοκρασίες δεν ευνοούν το σχηματισμό ανθοκυανών. Σε θερμοκρασίες από 35 C και άνω έχει παρατηρηθεί ότι προκαλείται αναστολή της παραγωγής χρωστικών ουσιών. Για ημερήσιες θερμοκρασίες 25 C σε συνδυασμό με χαμηλές νυκτερινές θερμοκρασίες, ο χρωματισμός είναι ικανοποιητικός. Είναι αξιοσημείωτο, πως με μεγαλύτερο ημερήσιο εύρος θερμοκρασιών παρατηρείται αυξημένη παραγωγή χρωστικών. Κατά το στάδιο της ωρίμανσης παράγονται και οι προκυανιδίνες, πρόδρομες φλαβονοειδείς ενώσεις των συμπυκνωμένων ταννινών του κρασιού, το μεγαλύτερο ποσοστό των οποίων βρίσκεται στα γίγαρτα (65%), μια σημαντική ποσότητα στους βόστρυχες (22%), στον φλοιό (12%) ενώ η σάρκα περιέχει μόνο το 1 % περίπου των προκυανιδινών. Η περιεκτικότητα του φλοιού σε ταννίνες είναι σταθερή κατά τη περίοδο του περκασμού και της ωρίμανσης με όσες αυξομοιώσεις παρατηρούνται να οφείλονται στις μεταβολές της θερμοκρασία και την ηλιοφάνειας. Οι ταννίνες των γιγάρτων περνούν από ένα μέγιστο στα μισά της περιόδου του περκασμού και κατόπιν ελαττώνονται γρήγορα, ενώ είναι σε σταθερή περιεκτικότητα κατά το στάδιο της ωρίμανσης. Άλλοι παράγοντες που επηρεάζουν την παραγωγή ανθοκυανών και γενικότερα των χρωστικών είναι η χρήση λιπασμάτων και η αύξηση στρεμματικών αποδόσεων. Και στις δύο περιπτώσεις έχει παρατηρηθεί μείωση τόσο των χρωστικών όσο και των ταννινών (Τσακίρης 1998, Σουφλερός 1998). 1.3 Χαρακτηριστικές καλλιεργήσιμες ποικιλίες Υπάρχουν 60 διαφορετικά είδη αμπέλου ανά τον κόσμο αλλά ελάχιστα είναι αυτά που χρησιμοποιούνται στη μοντέρνα αμπελουργία. Τα πιο σημαντικά είναι: 22

24 Vitis Vinifera: Αποτελεί το κύριο ευρασιατικό είδος. Παράγει σχεδόν όλα τα σταφύλια που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή κρασιού, εδώ και πολλές χιλιάδες χρόνια. Όπως προαναφέρθηκε υπολογίζεται ότι υπάρχουν μεταξύ ποικιλίες V. Vinifera. Vitis riparia, Vitis rupestris, Vitis berlandieri: Τα τρία αυτά είδη είναι ενδημικά της Βορείου Αμερικής και σπάνια καλιεργούνται για την παραγωγή κρασιού. Παρόλα αυτά, σε αντίθεση με το V. Vinifera είναι ανθεκτικά στο παράσιτο της φυλλοξήρας που προσβάλει τις ρίζες της αμπέλου και έτσι χρησιμοποιούνται για να παρέχουν τα συστήματα ρίζας πάνω στα οποία μπολιάζονται οι άμπελοι V. Vinifera. Ένας πληθυσμός αμπελιών ανήκει στην ίδια ποικιλία αν η καταγωγή κάθε φυτού ακολουθεί μια σειρά μοσχευμάτων που έχουν ληφθεί μέσω του ίδιου, μοναδικού αρχικού φυτού. Δύο άμπελοι προέρχονται από διαφορετικές ποικιλίες όταν ανιχνευθούν σε αυτές δυο διαφορετικές φύτρες. Οι διαφορετικές ποικιλίες V. Vinifera που υπάρχουν σήμερα, διαφέρουν μεταξύ τους στο χρώμα τη γεύση και τη σύνθεση των σταφυλιών τους. Οι ποικιλίες σταφυλιού διαφέρουν, ακόμα, στο πόσο καλά ωριμάζουν σε διαφορετικό περιβάλλον, στην ανθεκτικότητα τους σε παράσιτα και ασθένειες, στην παραγωγή τους καθώς και σε άλλους παράγοντες που μπορεί να έχουν σημασία για έναν αμπελουργό. Παρά το ότι υπάρχουν χιλιάδες διαφορετικές ποικιλίες σταφυλιού, οι περισσότερες αφορούν συγκεκριμένες περιοχές. Ως διεθνείς ποικιλίες χαρακτηρίζονται οι ποικιλίες που αναπτύχθηκαν επιτυχώς σε περιοχές πέραν τις αρχικής τους. Οι βασικότερες από τις οποίες είναι οι ακόλουθες: Το Chardonnay, το Riesling και το Sauvignon Blanc από λευκές ποικιλίες και το Cabernet Sauvignon, το Merlot, το Syrah και το Pinot Noir από τις ερυθρές ποικιλίες. Άλλες παγκοσμίως γνωστές ποικιλίες που ευδοκιμούν όμως, κυρίως σε μια συγκεκριμένη περιοχή αποτελούν: το Tempranillo και η Grenache στην Ισπανία, το Sangiovese στην Ιταλία, το Malbec στην Αργεντινή, το Pinotage στη Νότια Αφρική και το Gewurztraminer στη Γερμανία και την Αυστρία. Στην Ελλάδα υπάρχουν περισσότερες από 200 γηγενείς ποικιλίες, ελάχιστες από τις οποίες καλλιεργούνται αλλού. Κάποιες από τις πιο σημαντικές και διεθνώς αναγνωρισμένες ελληνικές ποικιλίες αποτελούν το Μοσχοφίλερο (μια ερυθρωπή 23

25 ποικιλία που παράγει όμως λευκό κρασί), το Ασύρτικο, επίσης λευκή ποικιλία καθώς και το Ξινόμαυρο και το Αγιωργίτικο που ανήκουν στις ερυθρές ποικιλίες. Ελληνικές ποικιλίες Αγιωργίτικο: Είναι μία από τις ευγενέστερες Ελληνικές ερυθρές ποικιλίες. Καλλιεργείται αποκλειστικά στην περιοχή της Νεμέας, λόγω της άριστης προσαρμογής της. Είναι πολυδύναμη ερυθρή ποικιλία, δηλαδή μπορεί να δώσει πάνω από ένα τύπο κρασιού. Σε περιοχές με μικρό υψόμετρο δίνει υψηλόβαθμα κρασιά καλής οξύτητας, με βαθύ ρουμπινί χρώμα, αρκετές ταννίνες και έντονα χαρακτηριστικά. Είναι μία ενδιαφέρουσα ελληνική ποικιλία. Την ονομασία προέλευσης «Νεμέα» ανώτερης ποιότητας, δικαιούνται τα κόκκινα ξηρά και γλυκά κρασιά, που προέρχονται από σταφύλια της ποικιλίας Αγιωργίτικο, όταν αυτά καλλιεργούνται στον αμπελώνα της Νεμέας. Ο αμπελώνας αυτός εκτείνεται σε 15 κοινότητες του νομού Κορινθίας και 2 του νομού Αργολίδας και υποβάλλεται στον περιορισμό της στρεμματικής απόδοσης, η οποία δεν πρέπει να ξεπερνά τα 800 kg σταφυλιών. Το σταφύλι είναι μέτριου μεγέθους, κυλινδροκωνικό και πυκνό. Η ρόγα είναι μέτρια, σφαιρική, καλυμμένη με άφθονη άχνη, χρώματος βαθύ μπλε. Η φυσική περιεκτικότητα του γλεύκους σε σάκχαρα πρέπει να ανέρχεται τουλάχιστον σε 188 g/l για το ξηρό κρασί και 221 g/l για το γλυκό. Για την απόκτηση λεπτών οργανοληπτικών χαρακτηριστικών επιβάλλεται η παλαίωση του κρασιού σε δρύινα βαρέλια τουλάχιστον για ένα χρόνο. Το γεγονός ότι διακρίνονται δύο τύποι κρασιού, Εικ. 1: Αγιωργίτικο ξηρό και γλυκό, οφείλεται στο διαφορετικό υψόμετρο των αμπελώνων, που κυμαίνεται από τα 250 μέχρι τα 800 m. Τα σταφύλια που καλλιεργούνται σε υψόμετρο 250 m περίπου, δίνουν γλυκά κρασιά με αλκοολικό βαθμό γύρω στο 15%, ενώ αυτά στα 650 m περίπου, δίνουν κόκκινα ξηρά κρασιά με έντονο χρώμα και εξαιρετικά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Τα χαρακτηριστικά 24

26 των κρασιών που προέρχονται από αμπελώνες, που βρίσκονται σε υψόμετρο μεταξύ 700 και 800 m, δείχνουν ότι θα μπορούσε να παρασκευαστεί ένα από τα πιο εκλεκτά ροζέ ημιαφρώδη κρασιά της χώρας μας, που θα αποτελούσε έναν τρίτο τύπο κρασιού με το τοπωνύμιο Νεμέα (Σουφλερός 2000, Τσέτουρας 2008). Αηδάνι: Αιγαιοπελαγίτικη ποικιλία η οποία καλλιεργείται στις Κυκλάδες, ιδιαίτερα στη Νάξο, τη Σαντορίνη και την Πάρο. Υπάρχει λευκό και μαύρο αηδάνι. Είναι πολύ παλιά ποικιλία. Αναμειγνύεται με άλλες ποικιλίες για να τις εμπλουτίσει σε άρωμα, όπως το ασύρτικο. Το αηδάνι δίνει αρωματικό κρασί με μέτριο αλκοολικό βαθμό και μέτρια οξύτητα. Αθήρι: Αιγαιοπελαγίτικη λευκή ποικιλία που καλλιεργείται στις Κυκλάδες, στα Δωδεκάνησα και στην Κρήτη. Το κρασί της έχει μέτριο αλκοολικό βαθμό, μικρή οξύτητα και ελαφρά αρώματα. Χρησιμοποιείται μόνη της ή μαζί με άλλες λευκές ποικιλίες, κυρίως με το ασύρτικο της Σαντορίνης. Ασύρτικο: Αποτελεί ποικιλία του Αιγαίου. Καλλιεργείται σε μεγάλη έκταση στη Σαντορίνη αλλά και σε άλλες περιοχές της Ελλάδας διάσπαρτα (Χαλκιδική, Στερεά Ελλάδα) καθώς έχει τη δυνατότητα να προσαρμόζεται εύκολα σε διαφορετικές κλιματικές συνθήκες αλλά και σε εδάφη διαφορετικής σύστασης. Το ηφαιστειογενές έδαφος της Σαντορίνης, προσδίδει στην ποικιλία ιδιαίτερα χαρακτηριστικά, που μεταδίδονται στο κρασί. Κρασιά που παράγονται από Ασύρτικο (μπορούν να συμμετέχουν και οι ποικιλίες Αθήρι και Αηδάνι) στη Σαντορίνη φέρουν την ένδειξη Ο.Π.Α.Π. (Ονομασία Προέλευση Ανωτέρας Ποιότητας)/Π.Ο.Π.. Στη Σαντορίνη αλλά και σε άλλες περιοχές, οι ισχυροί άνεμοι μπορούν να προκαλέσουν αναστολή της φωτοσύνθεσης, με αποτέλεσμα η διαδικασία της ωρίμανσης να επιβραδύνεται και τα επίπεδα της οξύτητας να παραμένουν υψηλά. Ταυτόχρονα, τα σταφύλια παραμένοντας αφυδατωμένα στο αμπέλι, συσσωρεύουν σάκχαρα. Για την παραγωγή γλυκού κρασιού (γνωστό και ως Vinsanto) τα σταφύλια συλλέγονται όψιμα και «λιάζονται» ως και 14 μέρες. Τα κρασιά αυτά παλαιώνονται σε βαρέλια παλαιάς δρυός (τουλάχιστον για 2 χρόνια τα γλυκά κρασιά) και οι στρεμματικές αποδόσεις δεν πρέπει να ξεπερνάνε τα 700 kg. Το Ασύρτικο αποδίδει ξηρά και γλυκά λευκά 25

27 κρασιά, έντονα συμπυκνωμένα και αρωματικά, υψηλής οξύτητας και υψηλής περιεκτικότητας σε αλκοόλ. Βηλάνα: Σπουδαία λευκή ποικιλία της Κρήτης. Δίνει κρασιά της ονομασίας προέλευσης της περιοχής Πεζών με αρωματική ένταση, όγκο και οξύτητα. Όταν το φορτίο ανά πρέμνο είναι μικρό, δίνει μέτριο έως υψηλό αλκοολικό βαθμό και οξύτητα. Κοτσιφάλι: Ερυθρή ποικιλία της Κρήτης. Καλλιεργείται στις Αρχάνες, τα Πεζά και το Ηράκλειο. Δίνει κρασιά με υψηλό αλκοολικό βαθμό, χαμηλή οξύτητα, ευχάριστη γεύση και άρωμα, αλλά μειονεκτεί στο χρώμα. Συνδυάζεται κατά την οινοποίηση με τη Μανδηλαριά για καλύτερο χρώμα. Μαλαγουζιά: Λευκή ποικιλία με ιδιαίτερα χαρακτηριστικά. Καλλιεργείται στη Μακεδονία, στη Στερεά Ελλάδα και στην Πελοπόννησο. Δίνει κρασιά με υψηλό αλκοολικό βαθμό, μέτρια οξύτητα και πλούσιο άρωμα. Μανδηλαριά: Αιγαιοπελαγίτικη πολυδύναμη ερυθρή ποικιλία. Καλλιεργείται στις Κυκλάδες, στην Κρήτη και στα Δωδεκάνησα. Η καλλιέργειά της επεκτάθηκε στη Μακεδονία, στη Θεσσαλία και στην Πελοπόννησο. Είναι μία από τις πιο πλούσιες ποικιλίες σε χρώμα, γι αυτό χρησιμοποιείται κατά την οινοποίηση σε συνδυασμό με άλλες ποικιλίες. Δίνει κρασιά μέτριου αλκοολικού βαθμού, μέτριας οξύτητας και πλούσια σε χρώμα. Μαυρούδι Θράκης: Καλλιεργείται στη Θράκη. Είναι ερυθρή ποικιλία με ρόγα σφαιρική. Έχει γενετική συγγένεια με την ποικιλία χονδρομαυρούδι της Αχαΐας και το λιανομαυρούδι των Καλαβρύτων. Παράγει κρασί ερυθρομελανού χρώματος, με έντονα χαρακτηριστικά και πολλά οξέα. Χαρακτηρίζεται από τις πλούσιες γευστικές εντυπώσεις που αφήνει. Πρόκειται για ξεχασμένη ποικιλία, επειδή οινοποιείται μαζί με άλλες τοπικές ποικιλίες. Έχει μεγάλη αντοχή στον περονόσπορο. Μαυροδάφνη: Πελοποννησιακή ερυθρή ποικιλία που καλλιεργείται πολύ στο νομό Αχαΐας. Διακρίνεται για το ξεχωριστό της άρωμα. Προσφέρει ένα τύπο κρασιού που με το πέρασμα του χρόνου εμφανίζει τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά του. Δίνει κρασιά με υψηλό αλκοολικό βαθμό, μέτρια οξύτητα και χαρακτηριστικό άρωμα. 26

28 Ξυνόμαυρο: Ερυθρή πολυδύναμη μακεδονική ποικιλία. Πρόκειται για την ευγενέστερη ερυθρή ποικιλία της Βόρειας Ελλάδας, που δίνει κρασιά με υψηλό αλκοολικό βαθμό, πλούσια σε άρωμα, με έντονο χρώμα και υψηλή οξύτητα. Ροδίτης: Ποικιλία με πολλές παραλλαγές και με χρώμα από λευκό μέχρι ρόδινο. Είναι πολύ παλιά γηγενής ποικιλία, διαδεδομένη σε ολόκληρη την Ελλάδα. Δίνει ισορροπημένα κρασιά σε αλκοόλη και οξύτητα και ξεχωριστό άρωμα. Ρομπόλα: Λευκή εκλεκτή ποικιλία των Ιόνιων Νησιών. Καλλιεργείται κυρίως στην Κεφαλλονιά. Δίνει κρασιά με υψηλό αλκοολικό βαθμό, καλή οξύτητα και χαρακτηριστικό άρωμα. Σαββατιανό: Η μεγαλύτερη σε καλλιέργεια ελληνική λευκή ποικιλία. Καλλιεργείται στην Αττική, την Εύβοια και τη Βοιωτία. Δίνει κρασιά ισορροπημένα σε αλκοόλη και οξύτητα. Χρησιμοποιείται σε μεγάλο βαθμό για την παραγωγή ρετσίνας. Φιλέρι: Πολυδύναμη ποικιλία της Πελοποννήσου. Παρουσιάζεται σε μαύρα, άσπρα και ερυθρωπά σταφύλια και ονομάζεται Μαυροφίλερο, Ξανθοφίλερο και Μοσχοφίλερο αντίστοιχα. Δίνει κρασιά με υψηλό αλκοολικό τίτλο, καλή οξύτητα και χαρακτηριστικό άρωμα. Η ευγενής ερυθρωπή και ημιαρωματική ποικιλία Μοσχοφίλερο, Εικ. 2: Μοσχοφίλερο καλλιεργείται στην καρδιά της Πελοποννήσου και σε υψόμετρο 650 m, όπου εκτείνεται το οροπέδιο της Τρίπολης, και παράγει το λευκό ξηρό κρασί ονομασίας προέλευσης «Μαντινεία» ανώτερης ποιότητας. Το κρασί αυτό χαρακτηρίζεται για τη φρεσκάδα του, το ελαφρύ άρωμά του και είναι ισορροπημένο, αποτελώντας ταυτόχρονα ένα εξαιρετικό κρασί βάσης για την παρασκευή αφρώδους κρασιού. Η υψηλή περιεκτικότητα σε οξέα (κυρίως το χαμηλό ph) και τ άλλα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά κάνουν το κρασί της ποικιλίας αυτής να μοιάζει με τους λευκούς ξηρούς οίνους της Αλσατίας (Γαλλία) και της Γερμανίας, που προέρχονται από την 27

29 ποικιλία Riesling. Για την παραγωγή αυτών των κρασιών, η στρεμματική απόδοση των αμπελώνων δεν πρέπει να ξεπερνά τα 900 kg σταφυλιών, η δε περιεκτικότητα του γλεύκους σε σάκχαρα να μην είναι κατώτερη από 188 g/l (Σουφλερός 2000, Τσέτουρας 2008). Φωκιανό: Ερυθρή ποικιλία με προέλευση τη Μικρά Ασία. Καλλιεργείται σε όλες της περιοχές της ηπειρωτικής και Νησιώτικης Ελλάδας. Δίνει κρασιά με μέτριο αλκοολικό βαθμό, μέτρια οξύτητα, φτωχά σε χρώμα (Τσέτουρας 2008). Ξένες ποικιλίες Grenache: Ερυθρή μεσογειακή ποικιλία, ισπανικής καταγωγής. Καλλιεργείται σε ξηροθερμικές περιοχές. Είναι μία από τις καλύτερες ποικιλίες για κόκκινα κρασιά. Με μικρή στρεμματική απόδοση και στο κατάλληλο γι αυτήν έδαφος, δίνει κρασί με φρουτώδη αρώματα, υψηλού αλκοολικού βαθμού και εξαιρετικής ποιότητας. Cabernet sauvignon: Το Cabernet Sauvignon είναι ίσως η πιο γνωστή ερυθρή ποικιλία παγκοσμίως και αποτελεί διασταύρωση των ποικιλιών Cabernet Franc και Sauvignon Blanc. Προέρχεται από το Bordeaux αλλά καλλιεργείται ευρέως σε όλον το Νέο Κόσμο και στις περισσότερες αμπελουργικές περιοχές. Ανθίζει αργά, μειώνοντας την πιθανότητα ζημιάς από τους παγετούς της άνοιξης. Τα τσαμπιά έχουν ανάριο σχηματισμό και τα σταφύλια παχύ φλοιό, με υψηλή αναλογία φλοιού/σάρκας ενώ είναι και ανθεκτικά στη σήψη και τα έντομα. Η υπερωρίμανση επηρεάζει αρνητικά την οξύτητα του και τα αρωματικά χαρακτηριστικά του. Ωριμάζει κυρίως σε θερμά κλίματα αλλά έχει καλή προσαρμογή και σε ψυχρότερα κλίματα με στρεμματικές αποδόσεις σχετικά μικρές. Προσφέρει παραγωγή έντονα τανικών ερυθρών κρασιών, συμπυκνωμένων, με υψηλή οξύτητα, που αντιδρούν καλά στην ωρίμανση σε δρύινα βαρέλια και αναπτύσσουν πολυπλοκότητα στη φιάλη. Merlot: Ερυθρή ποικιλία με επιτυχία σε πολλές αμπελουργικές περιοχές του κόσμου. Είναι μία από τις Εικ. 3: Merlot 28

30 πιο σημαντικές ποικιλίες, η οποία παράγει κρασί με υψηλό αλκοολικό βαθμό, με καλή οξύτητα, σώμα και έντονο άρωμα. Είναι κατάλληλο για παλαίωση. Ως βελτιωτική ποικιλία σε ανάμειξη με άλλα κρασιά, βελτιώνει το χρώμα τους, το άρωμά τους και επιταχύνει το χρόνο παλαίωσης. Είναι έγχρωμη γαλλική ποικιλία. Στην Ελλάδα συνιστάται για τις αμπελουργικές ζώνες καλλιέργειας των Νομών Κοζάνης, Φλώρινας, Γρεβενών, Λευκάδας, Αχαΐας, Μεσσηνίας και Αρκαδίας. Το σταφύλι είναι μέτριο και κυλινδροκωνικό. Η ρόγα είναι σφαιρική, μικρή, με παχύ φλοιό χρώματος κυανού-μαύρου. Πρόκειται για ποικιλία ζωηρή, παραγωγική, σχετικά πρώιμη. Είναι ευαίσθητη στον περονόσπορο, την ανθόρροια και στον παγετό της άνοιξης. Από το γλεύκος της ποικιλίας αυτής παρασκευάζονται κόκκινα κρασιά (τύπου Bordeaux, στην περιφέρεια του οποίου άλλωστε καλλιεργείται) με χαρακτηριστικά γνωρίσματα το άρωμα και την απλότητά τους (Συμεού 2010, Τσέτουρας 2008). Pinot noir: Πολυδύναμη πρώιμη ερυθρή ποικιλία που μπορεί να καλλιεργηθεί παντού με επιτυχία, δίνοντας κρασί πιο όξινο από το Cabernet, αλλά λιγότερο ταννικό. Το παραγόμενο κρασί μετά την παλαίωσή του έχει αρμονική σύνθεση, ευχάριστη γεύση και πλούσιο άρωμα. Chardonnay: Πολυδύναμη πρώιμη λευκή ποικιλία. Είναι η εκλεκτότερη και η γνωστότερη ποικιλία στον κόσμο για την παραγωγή λευκών ξηρών κρασιών. Το παραγόμενο λευκό κρασί είναι το πιο κατάλληλο για να ωριμάσει σε δρύινα βαρέλια. Παρουσιάζει ισορροπία μεταξύ της αλκοόλης και της οξύτητας, είναι πλούσιο σε σώμα, λιπαρό και ο αρωματικός του πλούτος είναι αντιστρόφως ανάλογος με τη στρεμματική του απόδοση. Sinsaut (Σενζώ): Ερυθρή μεσογειακή ποικιλία, καλλιεργείται κυρίως στη Μακεδονία και τη Θράκη. Ποικιλία με μεγάλη αντοχή στη ξηρασία, κατάλληλη για οινοποίηση και παρασκευή κρασιών εξαιρετικής ποιότητας. Η ποιότητα του κρασιού είναι καλή σε μικρές στρεμματικές αποδόσεις. Είναι πλούσια σε σάκχαρα, έχει μέτρια οξύτητα, καλό χρώμα, σώμα και ταννίνες. 29

31 Syrah: Ερυθρή ποικιλία εκλεκτής ποιότητας, αρκεί να είναι μικρή η παραγωγή σταφυλιών. Δίνει κρασί με υψηλό βαθμό, ταννικό, με πλούσιο άρωμα. Όταν χρησιμοποιείται μόνη της μπορεί να δώσει σπουδαία κρασιά, επιδεχόμενα παλαίωση. Sauvignon blanc: Θεωρείται ότι είναι μία από τις πιο εκλεκτές λευκές ποικιλίες. Το παραγόμενο κρασί είναι αρωματικό, με λεπτή γεύση. Έχει χαμηλή οξύτητα και δεν συνδυάζεται στην οινοποίηση με ποικιλίες που έχουν λίγα οξέα. Δίνει ξηρά κρασιά που δέχονται αργή ωρίμανση. Traminer: Λευκορόδινη ποικιλία ιταλικής προέλευσης. Στην Ελλάδα καλλιεργείται σε μικρή έκταση. Δίνει κρασιά με υψηλό αλκοολικό βαθμό, μέτρια οξύτητα και έντονο άρωμα, όταν είναι μικρή η απόδοση και σωστός ο βαθμός ωριμότητας (Τσέτουρας 2008). 30

32 2 Οινοποίηση 2.1 Προζυμωτικές διεργασίες Αφού πραγματοποιηθεί ο τρυγητός, πρέπει να γίνει σωστή μεταφορά των σταφυλιών στο οινοποιείο ώστε η πρώτη ύλη να καταπονηθεί όσον το δυνατόν λιγότερο. Η οινοποίηση ξεκινά ουσιαστικά από τη στιγμή που τα σταφύλια φτάνουν στο οινοποιείο. Τα πρώτα στάδια της διεργασίας της οινοποίησης περιλαμβάνουν τη διαλογή των σταφυλιών, την αποβοστρύχωση, την έκθλιψη και την πίεση των σταφυλιών. Επί πλέον μπορεί να γίνει χρήση ενζύμων, η οποία διευκολύνει την εκχύλιση των συστατικών από τα στερεά μέρη του σταφυλιού στο γλεύκος (αποδίδεται ευρέως με τον όρο maceration ). Η υλοποίηση των διεργασιών αυτών, η αλληλουχία με την οποία συμβαίνουν αλλά και ο εξοπλισμός που χρησιμοποιείται, διαφοροποιούνται σημαντικά ανάλογα με το αν πρόκειται για λευκή ή ερυθρή οινοποίηση και ανάλογα με τις οινοποιητικές τεχνικές που επιλέγει ο εκάστοτε οινοπαραγωγός για την παραγωγή του επιθυμητού γι αυτόν τελικoύ προϊόντος. Παρά ταύτα, αποτελούν τις βασικές προζυμωτικές διεργασίες της οινοποίησης και θα αναλυθούν συνοπτικά παρακάτω. 2.2 Διαλογή των σταφυλιών Η διαλογή των σταφυλιών μπορεί να γίνει μόνο σε άθικτα σταφύλια και είναι δύσκολη όταν έχει προηγηθεί μηχανικός τρύγος. Στη περίπτωση αυτή, η μόνη διαλογή που μπορεί να γίνει είναι χειρωνακτικά να αφαιρεθούν από το αμπέλι τα χαλασμένα και κατεστραμμένα σταφύλια πριν τον τρύγο. Όταν έχει προηγηθεί κλασικός χειρωνακτικός τρύγος η διαλογή μπορεί να γίνει σε ειδικά τραπέζια διαλογής από το εργατικό προσωπικό. Συνήθως, τα τραπέζια (ή ταινίες) διαλογής αποτελούν μια ανεξάρτητη, κινητή μονάδα που εγκαθίσταται ανάμεσα στο χώρο παραλαβής και το πρώτο κομμάτι του οινοποιητικού εξοπλισμού και αποτελείται από έναν πλαστικό ιμάντα σε ένα μεταλλικό σκελετό που κινείται με τη βοήθεια ενός ηλεκτροκινητήρα (Ribérau-Gayon et al., 2006). 31

33 Τα τελευταία χρόνια έχουν κυκλοφορήσει στο εμπόριο και αυτόματοι διαλογείς. Αυτοί μπορούν να διαφοροποιούνται και να απομακρύνουν τα ανεπιθύμητα σταφύλια με βάση το χρώμα ή/και το μέγεθος των ραγών (Falconer & Hart, 2005). Επιπλέον, ρυθμίζοντας τα κριτήρια αυτά μπορούν να απομακρύνονται και βόστρυχοι που περνάνε στην ταινία διαλογής. Αν και υψηλού κόστους, η αυτόματη διαλογή επεξεργάζεται γρηγορότερα μεγάλους όγκους σταφυλιών (Jackson, 2008). 2.3 Αποβοστρύχωση Η αποβοστρύχωση έχει επικρατήσει τα τελευταία χρόνια να γίνεται ξεχωριστά από την έκθλιψη. Περιλαμβάνει την απομάκρυνση, εκτός των βοστρύχων, και άλλων φυτικών μερών όπως φύλλα και μίσχους της αμπέλου. Το βασικό πλεονέκτημα αυτής της διαδικασίας είναι η ελαχιστοποίηση της πρόσληψης φαινολικών και λιπιδίων από τα μέρη της αμπέλου που είναι ανεπιθύμητα οργανοληπτικά σε σχέση με τα φαινολικά της ρόγας του σταφυλιού. Συνήθως χρησιμοποιείται κοινός εξοπλισμός αποβοστρυχωτήρα-σπαστήρα (εκθλιπτήρα) σε σειρά. Ο αποβοστρυχωτήρας συνήθως περιέχει έναν εξωτερικό διάτρητο κύλινδρο, που επιτρέπει στις ράγες να τον διαπεράσουν αλλά δεν επιτρέπει το πέρασμα των βοστρύχων και των φύλλων. Συχνά, υπάρχει μια σειρά σπειροειδώς τοποθετημένων βραχιόνων, που διαθέτουν εύκαμπτα πτερύγια, οι οποίοι είναι τοποθετημένοι σε μία κεντρική άτρακτο. Ελαφρά περιστροφή προκαλεί την είσοδο των τσαμπιών στον αποβοστρυχωτήρα, αναγκάζοντας τις ράγες να διαπεράσουν τις οπές του κυλίνδρου και αποβάλλοντας τους βόστρυχους και τα φύλλα στην έξοδο. Όταν το σύστημα αποβοστρυχωτήρα-σπαστήρα δουλεύει βέλτιστα, το φρούτο διαχωρίζεται με τη μικρότερη δυνατή καταπόνηση από τους βόστρυχους και τα φύλλα που αποβάλλονται σε όσον το δυνατόν πιο ξηρή μορφή γίνεται. Όταν συμβαίνει αυτό, ελαχιστοποιούνται οι απώλειες σε γλεύκος και επιτρέπεται η ευκολότερη απομάκρυνση των στερεών (Jackson, 2008). Η αποβοστρύχωση έχει ιδιαίτερη σημασία στην ερυθρή οινοποίηση αφού επιδιώκεται η παραμονή του γλεύκους με τα στέμφυλα. Αντίθετα, στη λευκή οινοποίηση που η παραμονή του γλεύκους με τα υπόλοιπα μέρη του σταφυλιού ελαχιστοποιείται, ο αποχωρισμός των βοστρύχων είναι στις περισσότερες περιπτώσεις περιττός (Tσέτουρας, 2008). 32

34 2.4 Έκθλιψη («σπάσιμο ή εκραγισμός») Η έκθλιψη των σταφυλιών ξεκινά κατά την αποβοστρύχωση (όταν η τελευταία λαμβάνει χώρα) όπου ένα ποσοστό των ραγών αναπόφευκτα σπάει με αποτέλεσμα το γλεύκος που απελευθερώνεται να είναι ευάλωτο σε οξειδωτικό μαύρισμα και μικροβιακή μόλυνση. Έτσι, όταν η έκθλιψη πραγματοποιείται χωρίς καθυστέρηση, επιτρέπει στην αλκοολική ζύμωση να ξεκινήσει άμεσα περιορίζοντας τη μικροβιακή αλλοίωση και προσφέροντας καλύτερο έλεγχο των οξειδωτικών φαινομένων κατά την οινοποίηση. Δύο βασικές διαδικασίες που ακολουθούνται για τον εκραγισμό των σταφυλιών είναι η πίεση τους διαμέσου ενός διάτρητου τοιχώματος ή το πέρασμά τους από ένα ζεύγος κυλίνδρων που περιστρέφονται σε διαφορετικές κατευθύνσεις. Η ταχύτητα και η μεταξύ τους απόσταση ρυθμίζονται ανάλογα µε την ποικιλία των σταφυλιών και το βαθμό ωριμότητάς τους έτσι ώστε ενώ σπάζουν οι φλοιοί να αποφεύγεται η έκθλιψη των γιγάρτων. Η έκθλιψη μπορεί ακόμα να πραγματοποιηθεί και με φυγοκέντριση. Επειδή κατά την τεχνική αυτή το γλεύκος πολτοποιείται δυσκολεύοντας την απολάσπωση και παράλληλα υπάρχει ο κίνδυνος της έκθλιψης των γιγάρτων, συνήθως η τεχνική αυτή αποφεύγεται (Jackson, 2008). 2.5 Λευκή οινοποίηση Η παραγωγή των λευκών κρασιών γίνεται συνήθως από τη ζύμωση του γλεύκους χωρίς την παρουσία των στεμφύλων. Για το λόγο αυτό, η παραλαβή και ο διαχωρισμός του γλεύκους από τα στερεά μέρη («στράγγιση» και «πίεση») αλλά και η «απολάσπωση», δηλαδή η απομάκρυνση των στερεών ( clarification ), προηγούνται της αλκοολικής ζύμωσης. Έτσι, οι προζυμωτικές διεργασίες είναι αυτές που καθορίζουν το περιεχόμενο του γλεύκους σε ουσίες που επηρεάζουν τα οργανοληπτικά και ποιοτικά χαρακτηριστικά του λευκού κρασιού (Ribérau-Gayon et al., 2006). Σε ορισμένες ποικιλίες (π.χ. Chardonnay) χρησιμοποιούνται νέες τεχνικές οινοποίησης που επιτρέπουν για κάποιες ώρες την επαφή του γλεύκους με τον φλοιό 33

35 με σκοπό τον εμπλουτισμό σε αρωματικά, φαινολικά και άλλα συστατικά μια διαδικασία που ονομάζεται προζυμωτική εκχύλιση. Όπως προαναφέρθηκε, στη λευκή οινοποίηση συνήθως παραλείπεται η αποβοστρύχωση καθώς το γλεύκος αποχωρίζεται άμεσα από τα στέμφυλα. Έτσι, το πρώτο στάδιο της λευκής οινοποίησης είναι ο εκραγισμός των σταφυλιών που ακολουθείται από το στράγγισμα. Σε λίγες περιπτώσεις λευκής οινοποίησης είναι πιθανό να παραλείπεται και το στάδιο της έκθλιψης των σταφυλιών (παραγωγή σαμπάνιας) Στράγγιση ή διαχωρισμός Η στράγγιση ή διαχωρισμός έχει ως σκοπό την παραλαβή του γλεύκους που έχει απελευθερωθεί κατά την έκθλιψη των σταφυλιών. Οι αποστραγγιστές ή διαχωριστές μπορεί να λειτουργούν είτε στατικά υπό την επίδραση μόνο της βαρύτητας (παραλαβή 50% του Εικ. 4: Ασυνεχές πνευματικό πιεστήριο γλεύκους), είτε δυναμικά με περιστροφή ενός διάτρητου κυλίνδρου (παραλαβή γλεύκους 70-80%). Και στις δύο περιπτώσεις το δοχείο στο οποίο οδηγείται η σταφυλομάζα για το διαχωρισμό μπορεί να είναι ο κάδος ενός πιεστηρίου. Η διαδικασία αυτή μπορεί να επιταχυνθεί με την αύξηση της πίεσης του δοχείου στραγγίσματος μέσω διοχέτευσης διοξειδίου του άνθρακα. Το γλεύκος ρέει από το κάτω μέρος του κάδου προς μία δεξαμενή ενώ η σταφυλομάζα που απομένει οδηγείται στο πιεστήριο. Κατά το στατικό διαχωρισμό το γλεύκος υφίσταται ένα είδος διήθησης από τα στέμφυλα, όμως εμφανίζονται φαινόμενα οξείδωσης τόσο στο γλεύκος όσο και στη σταφυλομάζα. Αντίθετα, οι δυναμικοί διαχωριστήρες περιορίζουν τα οξειδωτικά φαινόμενα λόγω της υψηλότερης ταχύτητας τους, όμως εμφανίζουν υψηλότερα ποσοστά οινολασπών (Σουφλερος, 1997, Jackson, 2008). 34

36 2.5.2 «Συμπίεση» Η συμπίεση έχει στόχο την απόσπαση του υπόλοιπου γλεύκους από τη σταφυλομάζα που έχει ήδη υποστεί έκθλιψη και στράγγιση. Για την παραλαβή γλεύκους με επιθυμητά χαρακτηριστικά (χαμηλή εκχύλιση συστατικών από τον φλοιό, χαμηλή συγκέντρωση αιωρούμενων στερεών, περιορισμός οξειδωτικών φαινομένων) πρέπει να ικανοποιούνται ορισμένες συνθήκες κατά τη συμπίεση των σταφυλιών αλλά και κατά τη διαδικασία του στραγγίσματος. Πιο συγκεκριμένα: Χαμηλές πιέσεις Περιορισμένη μηχανική καταπόνηση των φλοιών του σταφυλιού Μικρή και προοδευτική αύξηση της πίεσης Παραλαβή μεγάλων όγκων σε χαμηλή πίεση Θερμοκρασία που δεν ξεπερνά τους 20 ο C και στις δύο διεργασίες Ελάχιστη επαφή με τον ατμοσφαιρικό αέρα Για την υλοποίηση της διεργασίας αυτής είναι διαθέσιμο ένα μεγάλο πλήθος πιεστηρίων που διαφέρουν τόσο ως προς τη μορφολογία τους όσο και ως προς τον τρόπο λειτουργίας τους (Ribérau-Gayon et al., 2006) Θείωση Η προσθήκη θειώδη ανιδρύτη στο γλεύκος ακολουθεί αμέσως μετά την έξοδο του από το πιεστήριο. Η θείωση στη λευκή οινοποίηση είναι μείζονος σημασίας καθώς λόγω του χαμηλού φαινολικού περιεχομένου τους, τα λευκά κρασιά είναι πιο ευοξείδωτα και ευάλωτα σε μικροβιακές και βακτηριακές μολύνσεις. Επιπλέον, τα οξειδωτικά φαινόμενα στο λευκό κρασί επιδρούν άμεσα στο χρώμα και στα υπόλοιπα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του (Σουφλερος, 1997) Απολάσπωση Το φρεσκοπαραγόμενο γλεύκος είναι πάντα σε ένα βαθμό θολό. Η θολότητα αυτή οφείλεται σε ένα πλήθος αιωρούμενων στερεών που περιλαμβάνουν κομμάτια από τους φλοιούς και τους βόστρυχους, χώμα, κυτταρικά υπολείμματα από τη σάρκα του 35

37 σταφυλιού καθώς και αδιάλυτα υπολείμματα από γεωργικά προϊόντα. Επιπλέον, διαλυμένα μακρομόρια που τείνουν να ιζηματοποιηθούν, μεταξύ των οποίων οι πηκτινικές ενώσεις, συνεισφέρουν στη θολότητα (Ribérau-Gayon et al., 2006). Για τον περιορισμό των ενζυμικά καταλυόμενων οξειδωτικών δράσεων, στις οποίες συμμετέχουν τα συστατικά αυτά και παράγουν ανεπιθύμητα για το κρασί προϊόντα, είναι απαραίτητη, σε ένα ποσοστό, η απομάκρυνσή τους με τη διαδικασία της απολάσπωσης. Η απομάκρυνση ακόμα μεγαλύτερου ποσοστού αιωρούμενων στερεών μπορεί να επιβραδύνει την αλκοολική ζύμωση. Η απολάσπωση μπορεί να γίνει στατικά, αφήνοντας το γλεύκος να ηρεμίσει για κάποιες ώρες (12-24 ώρες), έχοντας αναστείλει την έναρξη της ζύμωσης με προσθήκη θειώδη ανιδρύτη. Ένα ποσοστό οινολασπών καθιζάνει στον πυθμένα και το υπερκείμενο γλεύκος μεταγγίζεται σε άλλη δεξαμενή για την αλκοολική ζύμωση. Παράλληλα, με τη στατική απολάσπωση, μπορεί να γίνει προσθήκη μπετονίτη, μιας κολλοειδούς αργίλου, η οποία κατά την προσρόφηση των πρωτεϊνών και την ιζηματοποιήση τους, συμπαρασύρει και άλλα αιωρούμενα στερεά και διευκολύνει την καθίζησή τους (Jackson, 2008). Μια άλλη τεχνική απολάσπωσης που μπορεί να αντικαθιστά ή να συμπληρώνει τη στατική απολάσπωση, είναι η απολάσπωση με φυγοκέντριση. Η φυγοκέντριση απομακρύνει μόνο αιωρούμενα στερεά του γλεύκους επηρεάζοντας στο μικρότερο βαθμό τη σύσταση του σε σχέση με της υπόλοιπες μεθόδους. Παρά το υψηλό κόστος του εξοπλισμού, η ταχύτητα και η ελαχιστοποίηση των απωλειών σε γλεύκος που προσφέρει, έχουν καταστίσει τη χρήση της μεθόδου αυτής ευρέως διαδεδομένη στη βιομηχανία. Μια εναλλακτική τεχνική που χρησιμοποιείται είναι το φιλτράρισμα υπό κενό. Η τεχνική αυτή απομακρύνει τα αιωρούμενα στερεά σε πολύ μεγάλο ποσοστό, με αποτέλεσμα να αυξάνει τους χρόνους ζύμωσης και την πτητική οξύτητα (Ferrando et al., 1998). Μία ακόμα τεχνική που χρησιμοποιείται είναι η διαύγαση με επίπλευση ( flotation ). Η αρχή της μεθόδου βασίζεται στη διοχέτευση μικροφυσαλίδων αερίου (ατμοσφαιρικού αέρα, αζώτου ή οξυγόνου) στο κάτω μέρος του γλεύκους. Κατά την ανύψωση των φυσαλίδων προσκολλούνται στην επιφάνεια τους αιωρούμενα στερεά, 36

38 τα οποία όταν φτάσουν στην επιφάνεια του γλεύκους επιπλέουν και απομακρύνονται. Το βασικό πλεονέκτημα της τεχνικής αυτής είναι ότι μπορεί να ελέγχεται ο βαθμός απολάσπωσης που επιτυγχάνεται (Ferrarini et al., 1995, Jackson, 2008) Προζυμωτική κρυοεκχύλιση Η προζυμωτική (κρυο)εκχύλιση ( cold maceration ) είναι μία τεχνική που περιλαμβάνει εκχύλιση στην υδατική φάση αφού οι χαμηλές θερμοκρασίες που χρησιμοποιούνται (κάτω από 15 C) έχουν ως αποτέλεσμα την καθυστέρηση της έναρξης της αλκοολικής ζύμωσης. Συνήθως γίνεται σε ατμόσφαιρα διοξειδίου του άνθρακα για την αναστολή των μεταβολικών δράσεων των ζυμών. Έτσι κατά την προζυμωτική κρυοεκχύλιση ευνοείται η εκχύλιση υδατοδιαλυτών συστατικών από τα στερεά μέρη του σταφυλιού όπως χρωστικές, πρόδρομες αρωματικές ουσίες, πολυσακχαρίτες και γλυκοζυλιωμένα φαινολικά συστατικά (Delteil, 2004). Οι βασικοί παράγοντες που επιδρούν στο αποτέλεσμα της προζυμωτικής κρυοεκχύλισης είναι η ποικιλία, η σοδειά και ο βαθμός ωριμότητας του σταφυλιού (Mihnea et al., 2015). Η προζυμωτική κρυοεκχύλιση μπορεί να ενισχύσει τον αρωματικό χαρακτήρα των λευκών κρασιών και παράλληλα, με την εκχύλιση ορισμένων φαινολικών συστατικών, να βελτιώσει τη δυνατότητα παλαίωσης τους. Από την άλλη πλευρά, εκχυλίζονται και μη επιθυμητά φυτικά αρωματικά συστατικά καθώς και συστατικά που ενισχύουν τη στυπτικότητα του κρασιού. Για το λόγο αυτό, θα πρέπει να πραγματοποιείται μια ισορροπημένη εκχύλιση με βασικές παραμέτρους το χρόνο, τη θερμοκρασία, τη χρήση θειώδη ανιδρύτη και πηκτινολυτικών ενζύμων (Sokolowsky et al., 2015). Κάποιες κλασσικές ποικιλίες που ευνοούνται από τη χρήση της τεχνικής αυτής είναι το Riesling, το Gewutraminer, το Chardonnay και το Sauvignon Βlanc. Συνήθως στη λευκή οινοποίηση η κρυοεκχύλιση γίνεται στο εύρος θερμοκρασιών 4-15 C, ενώ η διάρκεια της μπορεί να είναι από λίγες ώρες μέχρι ένα 24ώρο. Ο θειώδης ανυδρίτης, εκτός από την αντιμικροβιακή του δράση κατά την προζυμωτική κρυοεκχύλιση, ευνοεί την εκχύλιση φαινολικών καθώς ενώνεται μαζί τους και καταστρέφει τα κυτταρικά τοιχώματα. Επειδή μπορεί να ενισχύσει σημαντικά την εκχύλιση των φαινολικών, σε ορισμένες περιπτώσεις δεν πραγματοποιείται θείωση και η προστασία 37

39 από οξειδωτικές δράσεις γίνεται μόνο με χρησιμοποίηση ατμόσφαιρας διοξειδίου του άνθρακα (Parley, 1997). Σε χαμηλότερες θερμοκρασίες κρυοεκχύλισης παρατηρήθηκε μικρότερο ολικό φαινολικό περιεχόμενο, μικρότερη χρωματική ένταση αλλά και υψηλότερη συγκέντρωση εστέρων, οι οποίοι επιδρούν αρωματικά στο κρασί, σε σχέση με τις υψηλότερες θερμοκρασίες κρυοεκχύλισης (Salinas et al., 2005). Αναφορικά με την εκχύλιση των φαινολικών, η προζυμωτική κρυοεκχύλιση αυξάνει τη συγκέντρωση των φλαβονοειδών στο γλεύκος, και πιο συγκεκριμένα της κατεχίνης και της επικατεχίνης ενώ δεν επηρεάζει σημαντικά τη συγκέντρωση των μη φλαβονοειδών όπως το καφταρικό οξύ. Παράλληλα με τα φαινολικά εκχυλίζεται και κάλιο στο γλεύκος. Το κάλιο αντιδρά με το τρυγικό οξύ προς παραγωγή όξινου τρυγικού καλίου, το οποίο ιζηματοποιείται. Έτσι, η συγκέντρωση του τρυγικού οξέος και η οξύτητα του γλεύκους μειώνεται ενώ το ph αυξάνεται (Sokolowsky et al., 2015) Ζύμωση Το γλεύκος μεταγγίζεται μετά την απολάσπωση, στη δεξαμενή που πραγματοποιείται η ζύμωση. Πριν την έναρξη της ζύμωσης συχνά πραγματοποιείται η ανάμιξη γλεύκους διαφορετικών πιέσεων. Κατά το γέμισμα της δεξαμενής αφήνεται κενό περίπου το 10% του υπερκείμενου όγκου για να αποτραπεί υπερχύλιση του αφρού που παράγεται κατά τη ζύμωση. Στη συνέχεια ακολουθεί ο εμβολιασμός των ξηρών ζυμών. Σημαντική επίδραση στα αρωματικά χαρακτηριστικά του λευκού κρασιού ασκεί η θερμοκρασία στην οποία συμβαίνει η ζύμωση, με Εικ. 5: Δεξαμενές με μανδύα ψύξης για τη ρύθμιση της θερμοκρασίας της αλκοολικής ζύμωσης 38

40 θερμοκρασίες πάνω από τους 20 C να έχουν αρνητική επίδραση στον αρωματικό χαρακτήρα του. Οι σύγχρονες δεξαμενές που χρησιμοποιούνται έχουν σύστημα αυτόματου ελέγχου της θερμοκρασίας ενώ δεν έχει εκλείψει και η χρήση βαρελιών ως δοχεία για τη πραγματοποίηση της ζύμωσης (Ribérau-Gayon et al., 2006). Στη λευκή οινοποίηση η μηλογαλακτική ζύμωση δεν είναι πάντα επιθυμητή ανάλογα με τη ποικιλία σταφυλιού που χρησιμοποιείται. Όταν δεν είναι επιθυμητή, εφαρμόζεται μετάγγιση του κρασιού με την ολοκλήρωση της αλκοολικής ζύμωσης για νέα απομάκρυνση οινολασπών πλούσιων σε γαλακτικά βακτήρια ενώ στην αντίθετη περίπτωση, η μετάγγιση καθυστερείται και η θερμοκρασία ρυθμίζεται στο εύρος C όπου διευκολύνεται η δράση των βακτηρίων αυτών. Μετά τη μετάγγιση ξαναγίνεται θείωση, με προσοχή ώστε το ελεύθερο διοξείδιο του θείου να μην ξεπερνά τα mg/l. Ύστερα από μέρες μπορεί να γίνει νέα μετάγγιση με συμπλήρωση διοξειδίου του θείου (Σουφλερός, 1997, Ribérau-Gayon et al., 2006). 2.6 Ερυθρή οινοποίηση Η ερυθρή οινοποίηση προϋποθέτει απαραίτητα την παραμονή του γλεύκους με τα στέμφυλα για ένα χρονικό διάστημα ώστε να εκχυλιστούν χρωστικές και άλλα συστατικά στο γλεύκος. Απαιτούμενη προζυμωτική διαδικασία στην ερυθρή οινοποίηση αποτελεί η αποβοστρύχωση. Τέλος, σε αντίθεση με τη λευκή οινοποίηση, η μηλογαλακτική ζύμωση αποτελεί βασική διεργασία των περισσότερων ερυθρών οινοποιήσεων. Πέρα από την «κλασική μέθοδο ερυθρής οινοποίησης» που θα αναλυθεί παρακάτω τα τελευταία χρόνια χρησιμοποιούνται και εναλλακτικές μέθοδοι που διαφοροποιούν σημαντικά το τελικό προϊόν με πιο σημαντικές τη θερμοοινοποίηση και την ανθρακική αναεροβίωση. (Κουράκου, 1998, Ribérau-Gayon et al., 2006). Εικ. 6: Θλιπτήριο - αποβοστρυχωτής σταφυλιών 39

41 2.6.1 Προζυμωτική κρυοεκχύλιση Η προζυμωτική κρυοεκχύλιση αν και ξεκίνησε ως μια τεχνική που χρησιμοποιούνταν μόνο στη λευκή οινοποίηση, τα τελευταιά χρόνια χρησιμοποιείται στην παραγωγή ροζέ και ερυθρών κρασιών με σκοπό να βελτιώσει τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά τους και την «πολυπλοκότητά» τους (De Santis & Frangipane, 2010). Στην ερυθρή οινοποίηση η προζυμωτική κρυοεκχύλιση γίνεται στο ίδιο θερμοκρασιακό εύρος με τη λευκή (4-15 C) αλλά μπορεί να διαρκέσει περισσότερο, δεδομένου ότι τα ερυθρά κρασιά είναι πολύ πιο πλούσια σε φαινολικό περιεχόμενο από τα λευκά και ο οργανοληπτικός χαρακτήρας του κρασιού δεν επηρεάζεται αρνητικά από την περαιτέρω εκχύλιση φαινολικών. Συνήθως, η κρυοεκχύλιση στα ερυθρά κρασιά διαρκεί 2 με 7 μέρες αν και σε ορισμένες περιπτώσεις έχουν παρατηρηθεί χρόνοι κρυοεκχύλισης 10 ημερών. Τόσο το ανθοκυανικό περιεχόμενο όσο και το ολικό φαινολικό περιεχόμενο δε μεταβάλλεται σημαντικά μετά την 4 η -5 η μέρα της προζυμωτικής κρυοεκχύλισης (Canals et al.,2005, Alvarez et al., 2006) Κλασική μέθοδος ερυθρής οινοποίησης Ως κλασσική μέθοδος ερυθρής οινοποίησης ονομάζεται η τεχνική κατά την οποία διεξάγονται ταυτόχρονα: Η αλκοολική ζύμωση των σακχάρων του γλεύκους παρουσία των στερεών μερών του σταφυλιού (φλοιοί και γίγαρτα). Η εκχύλιση των συστατικών των στερεών μερών του σταφυλιού από το υδροαλκοολικό διάλυμα που σχηματίζεται κατά την αλκοολική ζύμωση. Αν και μπορούν να υπάρξουν διαφοροποιήσεις κατά τη διαδικασία της οινοποίησης τα βασικά στάδια της κλασικής μεθόδου συνοψίζονται παρακάτω 1. Μεταφορά της γλεύκους με τα στέμφυλα (σταφυλόμαζα) στα δοχεία οινοποίησης (δεξαμενές, βαρέλια) με ταυτόχρονη θείωση 2. Αλκοολική ζύμωση παρουσία των στερεών μερών με ταυτόχρονη εκχύλιση των συστατικών των μερών αυτών 40

42 3. Διαχωρισμός του ημιζυμωμένου ή αποζυμωμένου γλεύκους από τα στέμφυλα 4. Απομάκρυνση των στεμφύλων από τα δοχεία οινοποίησης και μεταφορά τους στο πιεστήριο 5. Πίεση των στεμφύλων προς παραγωγή του «κρασιού πίεσης» 6. Συμπληρωματικές ζυμώσεις των σακχάρων που έχουν απομείνει με αλκοολική και μηλογαλακτική ζύμωση (Κουράκου, 1997, Ribérau-Gayon et al., 2006). Η σταφυλόμαζα που παραλαμβάνεται, από την αποβοστρύχωση και έκθλιψη, μεταφέρεται στις δεξαμενές οινοποίησης (οινοποιητές) με τη βοήθεια ειδικής αντλίας και ταυτόχρονα γίνεται θείωση με τη βοήθεια θειοδομετρητών. Όταν ο θειώδης ανυδρίτης προστίθεται πριν τη ζύμωση δεσμεύεται με τα σάκχαρα και έτσι κατά τη διάρκεια της αλκοολικής ζύμωσης απελευθερώνεται προοδευτικά και προσφέρει προστασία καθ όλη τη διάρκειά της (Τσέτουρας, 2008). Στη συνέχεια, ξεκινά η αλκοολική ζύμωση με παράλληλη την εκχύλιση (κυρίως) των φαινολικών συστατικών. Η διάρκεια παραμονής των στεμφύλων με το γλεύκος μπορεί να ποικίλει σημαντικά από λίγα 24ωρα ως και μερικές βδομάδες ανάλογα με την ποικιλία του σταφυλιού και το οργανοληπτικό αποτέλεσμα που θέλει να πετύχει ο οινολόγος. Η θερμοκρασία αποτελεί ακόμα έναν καθοριστικό παράγοντα της διεργασίας. Ενώ έχει παρατηρηθεί ότι βέλτιστοι ρυθμοί εκχύλισης παρατηρούνται σε θερμοκρασίες C, πρέπει παράλληλα να μην επιβραδύνεται η δράση των σακχαρομυκήτων ώστε να μη μειώνεται η αρωματική ένταση. Συνήθως, επιλέγεται μια θερμοκρασία στο εύρος C (Σουφλερος, 1997, Κουράκου 1998). Πηκτινολυτικά Ένζυμα Αν και το σταφύλι είναι πλούσιο σε πηκτινολυτικά ένζυμα, η δράση τους πολλές φορές περιορίζεται από την ανομοιογένεια του μίγματος των στεμφύλων με το γλεύκος καθώς και από το ph του. Για το λόγο αυτό, υπάρχουν διάφορα εμπορικά ενζυμικά σκευάσματα με μεγάλη προσαρμοστικότητα, από συγκεκριμένα είδη μυκήτων (Aspergillus, Rhizopus και Trichoderma), τα οποία ενεργούν στο χαμηλό ph που επικρατεί κατά την αλκοολική ζύμωση και η αποτελεσματικότητά τους εξαρτάται 41

43 από τη φύση των σταφυλιών (Συμεού, 2010). Η δράση τους σχετίζεται με την καταστροφή των κυτταρικών δομών και ιστών που διευκολύνει την εκχύλιση των συστατικών στο γλεύκος. Με την προσθήκη τους επιτυγχάνεται βελτίωση της απόδοσης του γλεύκους μέχρι και 15%, μέσα σε 4-10 ώρες. Επιπλέον, βελτιώνεται η σταθερότητα του χρώματος, μέσω του σχηματισμού πολυμερών χρωστικών ενώ αυξάνεται και η συγκέντρωση των προκυανιδινών, κατά τη διάρκεια της ζύμωσης, όχι μόνο αυτών που προέρχονται από τους φλοιούς, αλλά και αυτών από τα γίγαρτα (Busse-Valverde et al., 2011). Η προσθήκη των ενζύμων αυτών πραγματοποιείται σε μικρό χρονικό διάστημα μετά την έκθλιψη των σταφυλιών ώστε να διασφαλιστεί η αύξηση της απόδοσης σε γλεύκος και παράλληλα να ενισχυθεί η διαδικασία της διαύγασης του κρασιού, ειδικά σε ποικιλίες που είναι πλούσιες σε πηκτινικές ουσίες. Οινοποιητές Όταν ξεκινήσει η αλκοολική ζύμωση το διοξείδιο του άνθρακα που εκλύεται από τη διάσπαση των σακχάρων ωθεί με μεγάλη δύναμη τα στέμφυλα προς το επάνω μέρος του δοχείου δημιουργώντας έτσι μια ιδιαίτερα συμπαγή στερεή φάση (γνωστή ως «καπέλο»), διαχωρισμένη από τον μεγάλο όγκο της υγρής φάσης με αποτέλεσμα η εκχύλιση να είναι ατελής. Εκτός αυτού, τα στέμφυλα που επιπλέουν στην επιφάνεια του γλεύκους βρίσκονται εκτεθειμένα στον υπερκείμενο αέρα με αποτέλεσμα την ανάπτυξη οξικών βακτηριών που αυξάνουν την πτητική οξύτητα του κρασιού. Έτσι, είναι αναγκαία μία μέθοδος συνεχούς επαφής των δύο φάσεων. Διάφορες τεχνικές χρησιμοποιήθηκαν κατά καιρούς όπως η εμβάπτιση των στεμφύλων στην υγρή φάση. Τελικά, επικράτησε η μέθοδος της διαβροχής της στερεής φάσης από την υγρή (ανακύκλωση του γλεύκους) με χρήση αντλιών. Τα τελευταία χρόνια είναι διαθέσιμες στο εμπόριο δεξαμενές από ανοξείδωτο χάλυβα με εσωτερικούς ψυκτήρες για αυτόματη ρύθμιση της θερμοκρασίας και αυτόματη ανακύκλωση του γλεύκους οι οποίες και χαρακτηρίζονται ως οινοποιητές. Οι δεξαμενές αυτές περιλαμβάνουν ακόμα και έναν παράπλευρο μετρητή στάθμης και ένα σωλήνα εξόδου για δειγματοληψίες. 42

44 Μια δεξαμενή αυτής της κατηγορίας χωρίζεται σε δύο άνισα τμήματα από ένα διάτρητο φύλλο ανοξείδωτου χάλυβα το οποίο κρατάει τα στέμφυλα βυθισμένα μέσα στο γλεύκος. Στον κεντρικό άξονα της δεξαμενής υπάρχει ένας διάτρητος σωλήνας του οποίου Εικ. 7: Δεξαμενή ερυθρής οινοποίησης με ενσωματωμένο το πάνω άκρο απολήγει πάνω σύστημα ανακύκλωσης του γλεύκους από το διάτρητο φύλλο και κλείνεται με σκέπασμα. Η δεξαμενή έχει επίσης έναν πλευρικό σωλήνα που χρησιμοποιείται για την ανακύκλωση του γλεύκους με τη βοήθεια αντλίας. Όλος αυτός ο εσωτερικός εξοπλισμός είναι κινητός και μπορεί να αφαιρείται ώστε μετά το πέρας της οινοποίησης ο οινοποιητής να χρησιμοποιείται ως δεξαμενή επεξεργασίας και αποθήκευσης του κρασιού. Ένα εναλλακτικό μοντέλο οινοποιητή περιλαμβάνει και ένα πλευρικό σωλήνα, στο άνω άκρο του οποίου είναι προσαρμοσμένο ένα ελευθέρα περιστρεφόμενο σύστημα διαμερισμού του ανακυκλούμενου γλεύκους, προς έκπλυση των σταφυλιών. Στο σύστημα αυτό δεν υπάρχει πλέγμα και τα στέμφυλα σχηματίζουν «καπέλο» στην επιφάνεια του ζυμώμενου γλεύκος ενώ διαβρέχονται απ ευθείας από το ανακυκλούμενο γλεύκος. Μια άλλη βασική διαφορά είναι στον εσωτερικό πυθμένα της δεξαμενής, εκεί που βρίσκεται η θυρίδα εκκένωσης των στεμφύλων, όπου είναι προσαρμοσμένο ένα διπλό πτερύγιο με άνοιγμα περίπου ίσο με τη διάμετρο του πυθμένα. Όταν το υγρό απομακρύνεται από τη δεξαμενή και τα στέμφυλα συγκεντρωθούν στον πυθμένα, το πτερύγιο τα ωθεί αυτόματα προς τη θυρίδα και στη συνέχεια μεταφέρονται στο πιεστήριο. Πέρα από αυτούς τους δύο τύπους, υπάρχουν και άλλοι που η αρχή της λειτουργίας τους μπορεί να διαφέρει σημαντικά. Οι δύο τρόποι με τους οποίους γίνεται η ανακύκλωση του γλεύκους ο «φυσικός» και ο «ενισχυμένος» είναι κοινοί και για τους δύο τύπους οινοποιητών. 43

45 Ο φυσικός τρόπος προϋποθέτει ανοικτό το σκέπασμα του κεντρικού σωλήνα και βασίζεται στην πίεση που ασκεί το εκλυόμενο διοξείδιο του άνθρακα. Η πίεση αυτή ωθεί το γλεύκος στο εσωτερικού του κεντρικού διάτρητου σωλήνα. Στη συνέχεια αυτό ανέρχεται μέσω του κεντρικού σωλήνα πάνω από την επιφάνεια της δεξαμενής και τη διαβρέχει. Ο ενισχυμένος τρόπος προϋποθέτει κλειστό το σκέπασμα του κεντρικού σωλήνα και σε λειτουργία το σύστημα ανακύκλωσης μέσω αντλίας. Το γλεύκος αντλείται από το εσωτερικό του διάτρητου σωλήνα, απαλλαγμένο από στέμφυλα, επομένως δεν υπάρχει κίνδυνος φραξίματος του συστήματος ανακύκλωσης. Ο αριθμός ανακυκλώσεων ανά ώρα και η διάρκεια της εκάστοτε ανακύκλωσης ρυθμίζονται από έναν χρονοδιακόπτη (Κουράκου, 1998, Ribérau-Gayon et al., 2006). Σημαντική παράμετρο των ανακυκλώσεων αποτελεί το γεγονός ότι κατά τη πραγματοποίηση τους μπορεί να γίνει και ο απαραίτητος αερισμός του γλεύκους. Ο αερισμός είναι απαραίτητος για το μεταβολισμό των ζυμών και τη λήψη του απαραίτητου οξυγόνου κυρίως κατά το πρώτο 48ωρο της αλκοολικής ζύμωσης. Θα πρέπει να λαμβάνονται υπ όψιν και οι θερμοκρασιακές μεταβολές που συμβαίνουν λόγω του αερισμού σε συνδυασμό με τη παραγόμενη από τη ζύμωση θερμότητα. Μετά την αλκοολική ζύμωση, και υπό τις κατάλληλες συνθήκες (μικρές ποσότητες θείωσης, κατάλληλη θερμοκρασία κ.α.) πραγματοποιείται η μηλογαλακτική ζύμωση από τα γαλακτικά βακτήρια. Η μηλογαλακτική ζύμωση στην ερυθρή οινοποίηση αποτελεί μια ευρέως διαδεδομένη διεργασία και σπάνια παραλείπεται. Μειώνει την οξύτητα του κρασιού, μετατρέποντας το μηλικό οξύ σε γαλακτικό επηρεάζοντας και τα γευστικά και αρωματικά χαρακτηριστικά του παραγόμενου κρασιού. Μετά το τέλος της, το κρασί μεταγγίζεται άμεσα και γίνεται νέα προσθήκη θειώδη ανυδρίτη, για την αναστολή της δράσης των γαλακτικών βακτηρίων (Σουφλερος, 1997). Διαχωρισμός κρασιού και στεμφύλων Ο διαχωρισμός γίνεται σε δύο φάσεις. Στη πρώτη φάση γίνεται η απομάκρυνση της ελεύθερης υγρής φάσης που αποτελεί περίπου το 85% του ολικού όγκου του κρασιού. Η απομάκρυνση του κρασιού γίνεται συνήθως από τον πυθμένα της δεξαμενής όπως 44

46 παρουσιάστηκε στους οινοποιητές. Συχνά, χρησιμοποιείται συσκευή απομάκρυνσης των γιγάρτων. Ο οίνος εκροής, όπως ονομάζεται, απομακρύνεται και διοχετεύεται σε νέα δεξαμενή επεξεργασίας με τη βοήθεια σωληνώσεων και αντλιών ή όταν υπάρχει η κατάλληλη διαμόρφωση χώρου μέσω της βαρύτητας. Το υπόλοιπο 15% του οίνου κατακρατείται από τα στέμφυλα και παραλαμβάνεται με την πίεση αυτών. Υπάρχει ένα πλήθος διαφορετικών τύπων πιεστηρίων που παράγουν διαφορετικής ποιότητας προϊόν. Γενικά, το παραγόμενο προϊόν, που ονομάζεται οίνος πίεσης, θεωρείται κατώτερο ποιοτικά από τον οίνο εκροής. Παρά ταύτα, ο οίνος πίεσης είναι πλουσιότερος σε όλα τα συστατικά του από τον οίνο εκροής, με εξαίρεση την περιεκτικότητά του σε αλκοόλη, και χρησιμοποιείται, κατά κόρον, κυρίως αυτός που προκύπτει από την πρώτη πίεση, για τις διάφορες αναμείξεις. Στη συνέχεια ακολουθούν κάποιες μεταζυμωτικές διεργασίες με πιο βασικές τη διαύγαση και τη σταθεροποίηση όπως θα παρουσιαστούν παρακάτω (Κουράκου, 1997, Σουφλερός 1998) Θερμοοινοποίηση Κατά την εφαρμογή της κλασικής μεθόδου ερυθρής οινοποίησης, παρόλο που οι υψηλές θερμοκρασίες ευνοούν την εκχύλιση των χρωστικών και άλλων φαινολικών, η οινοποίηση πρέπει να περιορίζεται σε θερμοκρασίες μέχρι 35 C, καθώς σε υψηλότερες θερμοκρασίες εμφανίζονται προβλήματα στην αντοχή των σακχαρομυκήτων. Έτσι, ακόμα και υπό τις καλύτερες συνθήκες της κλασικής μεθόδου δεν εκχυλίζεται ποσοστό μεγαλύτερο του 30% του συνολικού ανθοκυανικού περιεχομένου των ραγών. Από την άλλη, η διεξαγωγή της ζύμωσης σε ψηλές θερμοκρασίες με σκοπό την καλύτερη δυνατή εκχύλιση προκαλεί απώλειες σε πτητικές αρωματικές ενώσεις που σχηματίζονται. Με τη θερμοοινοποίηση ( thermovinification ) η διεξαγωγή της αλκοολικής ζύμωσης και τις εκχύλισης γίνεται σε δύο διαφορετικά στάδια. Αρχικά, τα σταφύλια ακέραια ή αφού έχουν υποστεί έκθλιψη θερμαίνονται με συνέπεια την ταχεία διάχυση των φαινολικών συστατικών των φλοιών και των γιγάρτων στο γλεύκος της ρόγας. Στη 45

47 συνέχεια ξεκινά η αλκοολική ζύμωση αφού όμως έχει προηγηθεί ο διαχωρισμός των στεμφύλων από το γλεύκος (Κουράκου, 1997). Η θερμοοινοποίηση χρησιμοποιείται κυρίως σε σταφύλια που προέρχονται από καλλιέργειες με χαμηλό ανθοκυανικό περιεχόμενο ή σε σταφύλια που έχουν μολυνθεί από λακάση. Η διεργασία περιλαμβάνει τη θέρμανση των ακέραιων ή σπασμένων σταφυλιών σε θερμοκρασίες C. Σε ορισμένες περιπτώσεις γίνεται μικρής διάρκειας (περίπου ένα λεπτό) θέρμανση με χρήση ατμού ή βραστού νερού, η οποία θερμαίνει μόνο το φλοιό των ραγών σε θερμοκρασίες περίπου 80 ο C. Έτσι, επιτυγχάνεται καταστροφή των κυτταρικών μεμβρανών και άμεση εκχύλιση των φαινολικών συστατικών, ιδιαίτερα των ανθοκυανών, στο γλεύκος. Σε άλλες τεχνικές τα σταφύλια θερμαίνονται σε θερμοκρασίες C με χρήση σωληνωτών εναλλακτών θερμότητας ενώ όταν η ποικιλία που χρησιμοποιείται έχει λεπτά αρωματικά χαρακτηριστικά που μπορεί να εξασθενίσουν από τη διεργασία, η θέρμανση γίνεται σε ακόμα χαμηλότερες θερμοκρασίες μέχρι 50 C. Σε θερμοκρασίες πάνω από 60 C απενεργοποιούνται οι λακκάσες, γι αυτό και η χρήση της μεθόδου αυτής είναι ιδιαίτερα χρήσιμη σε κόκκινα σταφύλια που έχουν μολυνθεί από βοτρύτη. Ενώ η θερμοοινοποίηση βελτιώνει δραστικά την εκχύλιση των ανθοκυανών, το ίδιο δεν μπορεί να ειπωθεί και για την εκχύλιση των ταννινών. Για το λόγο αυτό, τα ερυθρά κρασιά που παράγονται με τη μέθοδο αυτή προορίζονται για άμεση κατανάλωση και δεν ενδείκνυνται για μακροχρόνια παλαίωση. Τα κρασιά αυτά έχουν έντονο ερυθρό χρώμα, όχι ιδιαίτερα υψηλή οξύτητα και διαφοροποιημένα αρωματικά και γευστικά χαρακτηριστικά σε σχέση με τα αντίστοιχα που προκύπτουν από την κλασσική μέθοδο (Jackson, 2008). Αφού διαχωριστεί το γλεύκος εκροής από τα στέμφυλα, τα τελευταία οδηγούνται στο πιεστήριο όπου λαμβάνεται το γλεύκος πίεσης. Τα δύο αυτά γλεύκη, που στη συνέχεια οινοποιούνται συνήθως ξεχωριστά, έχουν ερυθρό χρώμα. Η θερμοοινοποίηση βελτιώνει τη διαδικασία τόσο της αλκοολικής όσο και της μηλογαλακτικής ζύμωσης που πλέον πραγματοποιούνται σε μία φάση, δίχως ανάγκη για ανακύκλωση του γλεύκους και στο επιθυμητό θερμοκρασιακό εύρος. Η χρήση 46

48 των οινοποιητών γίνεται, επίσης, πιο αποτελεσματική, αφού εκμεταλλεύεται το σύνολο της χωρητικότητας τους. Στα αρνητικά της μεθόδου, πρέπει να αναφερθεί η δημιουργία κάποιων ανεπιθύμητων οργανοληπτικών χαρακτηριστικών αλλά και προβλήματα στα μετέπειτα στάδια της διαύγασης και του φιλτραρίσματος λόγω της καταστροφής των πηκτινών του σταφυλιού τα οποία μπορούν να διορθωθούν με προσθήκη πηκτινάσης. Τέλος, ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δίνεται στο θερμοκρασιακό έλεγχο αφού τόσο η θέρμανση όσο και η αλκοολική ζύμωση πραγματοποιούνται σε υψηλότερες από το συνηθισμένο θερμοκρασίες (Κουρακου 1998, Jackson, 2008) Ανθρακική αναεροβίωση Ανθρακική αναεροβίωση ( vinification par macération carbonique ) ονομάζεται η τεχνική οινοποίησης που αξιοποιεί τα φαινόμενα του αναερόβιου μεταβολισμού, τα οποία εκδηλώνονται αυθόρμητα μέσα στις ανέπαφες ράγες σταφυλιών, όταν αυτές βρεθούν σε περιβάλλον κορεσμένο με διοξείδιο του άνθρακα και απουσία οξυγόνου. Επειδή τα φαινόμενα αυτά πραγματοποιούνται υπό την επίδραση μόνο των ενζύμων της ρόγας ο αναερόβιος μεταβολισμός λέγεται και ενδοκυτταρική ζύμωση. Η χρήση της μεθόδου αυτής δίνει χαρακτηριστικό άρωμα στο παραγόμενο κρασί. Τα σταφύλια ακέραια, χωρίς να έχει προηγηθεί έκθλιψη ή αποβοστρύχωση μεταφέρονται στους οινοποιητές όπου έχει απομακρυνθεί ο αέρας με διοχέτευση διοξειδίου του άνθρακα. Μετά το γέμισμα οι δεξαμενές κλείνονται αεροστεγώς. Κατά το γέμισμα των δεξαμενών και υπό το βάρος των υπερκείμενων σταφυλιών μέρος των ραγών συνθλίβεται. Έτσι, μέσα στη δεξαμενή και υπό ατμόσφαιρα διοξειδίου του άνθρακα συνυπάρχουν: Γλεύκος στο κάτω μέρος της δεξαμενής (υγρή φάση) Σταφύλια ολόκληρα με ανέπαφες ράγες μη εμβαπτισμένα στο γλεύκος Σταφύλια ολόκληρα με ανέπαφες ράγες εμβαπτισμένα στο γλεύκος Σταφύλια με σπασμένες ράγες μη εμβαπτισμένα στο γλεύκος Σταφύλια με σπασμένες ράγες εμβαπτισμένα στο γλεύκος 47

49 Όλα τα παραπάνω αποτελούν υποστρώματα ενός πλήθους διαφορετικών αντιδράσεων που διαφέρουν ως προς τη φύση και την ένταση τους. Στις σπασμένες ράγες και στο γλεύκος τα σταφύλια ζυμώνονται υπό την επίδραση των ενζύμων των σακχαρομυκήτων παρουσία των στεμφύλων, πραγματοποιείται δηλαδή μια κλασική ερυθρή οινοποίηση όπου η ατμόσφαιρα εμπλουτίζεται σε ατμούς αιθυλικής αλκοόλης και άλλων πτητικών ουσιών. Στα σταφύλια που οι ράγες τους έχουν παραμείνει ανέπαφες εκδηλώνεται αναερόβιος μεταβολισμός τόσο στην αέρια όσο και στην υγρή φάση με μειωμένη πάντως ένταση. Κατά τον αναερόβιο μεταβολισμό πραγματοποιείται μια ενδοκυτταρική ζύμωση των σακχάρων και του μηλικού οξέος με ταυτόχρονα φαινόμενα διάχυσης των φαινολικών συστατικών από τους φλοιούς προς τη σάρκα των ραγών. Επιπλέον, οι κατεχίνες και οι προκυανιδίνες των γιγάρτων δεν συμμετέχουν στη διάχυση με αποτέλεσμα το παραγόμενο κρασί να έχει έντονο χρώμα αλλά να απουσιάζει η τραχύτητα λόγω των ταννινών που εμφανίζουν τα φρέσκα ερυθρά κρασιά της κλασικής οινοποίησης (Kουράκου, 1998). Η διάρκεια παραμονής των σταφυλιών στο αναερόβιο περιβάλλον εξαρτάται κυρίως από τη θερμοκρασία. Σε θερμοκρασία C για τα επιθυμητά αποτελέσματα της εκχύλισης απαιτούνται 8 μέρες παραμονής στον οινοποιητή ενώ όταν η θερμοκρασία μειώνεται στους 20 C, το αντίστοιχο διάστημα είναι 15 μέρες (Σουφλερός, 1997). Μετά το πέρας του αναερόβιου μεταβολισμού, το γλεύκος που έχει συγκεντρωθεί στο κάτω μέρος της δεξαμενής και έχει σχεδόν αποζυμωθεί εκρέει και μεταγγίζεται σε νέα δεξαμενή προς ολοκλήρωση της ζύμωσης ή προς περαιτέρω επεξεργασία. Το γλεύκος αυτό αποτελεί το 40-60% του συνολικά παραλαμβανόμενου γλεύκους. Τα σταφύλια που παρέμειναν υπό αναερόβιες συνθήκες οδηγούνται στο πιεστήριο και πιέζονται. Στη συνέχεια επειδή το γλεύκος που παραλαμβάνεται από το πιεστήριο είναι πλούσιο σε αζύμωτα σάκχαρα μεταγγίζεται σε νέο οινοποιητή όπου πραγματοποιείται μικροβιακή αλκοολική ζύμωση (ζύμωση από σακχαρομύκητες). Η ανάπτυξη των ζυμών σε μια τέτοια ατμόσφαιρα διοξειδίου του άνθρακα είναι 48

50 εξαιρετική και η μικροβιακή ζύμωση που περιλαμβάνει και την αλκοολική και τη μηλογαλακτική ζύμωση ολοκληρώνεται σύντομα. Το κρασί ανώτερης ποιότητας με τα ιδιαίτερα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά σε αντίθεση με την κλασική μέθοδο είναι αυτό που προκύπτει από το γλεύκος πίεσης και όχι από το γλεύκος εκροής. Ο οίνος εκροής συνήθως αναμιγνύεται σε μικρές αναλογίες με τον οίνο πίεσης για τη δημιουργία του επιθυμητού χαρμανιού (Σουφλερος, 1997, Κουράκου 1998). 2.7 Μεταζυμωτικές διεργασίες Αφού ολοκληρωθεί η αλκοολική ζύμωση το κρασί μεταγγίζεται σε νέες δεξαμενές ώστε να γίνει η απολάσπωση από ένα στερεό στρώμα που αποτελείται από αιωρούμενα στερεά και έχει κατακαθίσει στον πυθμένα του οινοποιητή. Το ίζημα αυτό αποτελείται από ένα πλήθος ουσιών που περιλαμβάνουν νεκρούς ζυμομύκητες, πρωτεΐνες, πηκτινικές ουσίες, χρωστικές, υπολείμματα στερεών μερών του σταφυλιού, κρυστάλλους αλάτων και άλλες ουσίες που μπορεί να επηρεάσουν τόσο τον οργανοληπτικό χαρακτήρα του κρασιού όσο και τη διαύγεια του. Οι μεταγγίσεις αυτές συνήθως επαναλαμβάνονται μετά τη σταθεροποίηση και πριν τη συσκευασία για τα λευκά κρασιά ενώ στα ερυθρά που παλαιώνουν για μεγάλη χρονική διάρκεια απολασπώσεις πραγματοποιούνται κάθε 6 μήνες. Στη συνέχεια και στις νέες δεξαμενές επεξεργασίας που μεταγγίζεται το κρασί μπορεί να γίνουν και οι διάφορες αναμίξεις μεταξύ κρασιών εκροής και πίεσης, διαφορετικών ποικιλιών, διαφορετικής ωρίμανσης και διαφορετικής οινοποίησης. Πριν ολοκληρωθεί η οινοποίηση και το κρασί οδηγηθεί προς συσκευασία ή παλαίωση σε βαρέλι πραγματοποιούνται δύο βασικές διεργασίες, η διαύγαση και η σταθεροποίηση του κρασιού, για να εξασφαλιστεί η διαύγεια, η αποφυγή θολώματος στο μέλλον και λοιπές οργανοληπτικές αστοχίες (Eisenman, 1998). 49

51 2.7.1 Διαύγαση Ακόμα και μετά την απολάσπωση στο κρασί παραμένουν αιωρούμενα στερεά που προκαλούν θολότητα και ανεπιθύμητα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Τα κυριότερα από αυτά είναι ζυμομύκητες, βακτήρια, πρωτεϊνικές ενώσεις, πολυσακχαρίτες, τανικές ενώσεις και πολυμερή του τρυγικού οξέος. Η ανάγκη για διαύγαση και σταθεροποίηση είναι συνήθως πιο έντονη στη λευκή οινοποίηση και πρέπει να γίνει σε μικρό χρονικό διάστημα μετά το πέρας της οινοποίησης σε αντίθεση με τα ερυθρά κρασιά, στα οποία, λόγω της παλαίωσης τους σε βαρέλια, μεγάλο ποσοστό των αιωρημάτων κατακάθεται υπό την επίδραση της βαρύτητας. Οι δύο βασικές μέθοδοι διαύγασης του οίνου είναι το Εικ. 8: Φίλτρο γης διατόμων για «κολλάρισμα» ( fining ) και η διήθηση χονδροειδή διήθηση («φιλτράρισμα») (Eisenman, 1998, Jackson, 2008) Κολλάρισμα Κολλάρισμα ονομάζεται η προσθήκη στο κρασί ενός προϊόντος, φυσικού ή συνθετικού που προκαλεί την καθίζηση των αιωρούμενων στερεών και τη διαύγαση του κρασιού. Τα προϊόντα αυτά, που είναι στην πλειοψηφία τους ουσίες πρωτεϊνικής φύσης, έχουν την ιδιότητα να συσσωματώνονται και να καθιζάνουν, συμπαρασύροντας κατά την πτώση τους τα αιωρούμενα στερεά. Είναι προτιμότερο το κολλάρισμα να πραγματοποιείται άμεσα μετά το τέλος της αλκοολικής ζύμωσης ώστε να μη χάνονται τα χρωστικά πολυμερή, που σχηματίζονται κατά την παλαίωση του κρασιού, λόγω της συμπλοκοποίησης τους με τις πρωτεΐνες που οδηγεί στην κατακρίμνισή τους (Harbertson, 2008). Ο χρόνος που απαιτείται για τη δράση των πρωτεϊνούχων κολλών είναι πολύ μικρός από 15 λεπτά ως μία ώρα, ενώ ο χρόνος που απαιτείται για την κατακάθιση των σωματιδίων είναι περίπου 2 με 3 μέρες και εξαρτάται από την πυκνότητα του κρασιού, τον όγκο, τη θερμοκρασία και το ποσότητα κολλών που προστίθενται (Boulton et al., 1996). 50

52 Τα κυριότερα φυσικά διαυγαστικά μέσα περιλαμβάνουν τον μπεντονίτη, τον άνθρακα, τη ζελατίνη, την ιχθυόκολλα, την καζεΐνη, την αλβουμίνη που προέρχεται από τα ασπράδια των αυγών καθώς και βοηθητικά μέσα όπως οινολογικές ταννίνες και εμπορικά ένζυμα για την απομάκρυνση πολυσακχαριτών. Πολύ κοινά εμπορικά σκευάσματα που χρησιμοποιούνται ευρέως στη βιομηχανία για το κολλάρισμα είναι τα Kieselsol, Sparkolloid και η πολυβυνιλοπολυπυρολιδόνη (PVPP) (Eisenman, 1998, Harbertson, 2008) Διαύγαση με Διήθηση (Φιλτράρισμα) Μετά την ολοκλήρωση του κολλαρίσματος πάντα παραμένει στο κρασί ένα ποσοστό αιωρούμενων σωματιδίων καθώς και υπολείμματα των πρωτεϊνούχων κολλών που χρησιμοποιήθηκαν. Για την απομάκρυνση των στερεών αυτών αλλά και την παστερίωση του κρασιού, αφού ολοκληρωθεί η απολάσπωση μετά το κολλάρισμα, ακολουθεί η διήθηση του κρασιού. Όταν η διήθηση πραγματοποιηθεί σωστά η χρωματική και οργανοληπτική υποβάθμιση του κρασιού είναι ελάχιστη. Αν και υπάρχουν διάφοροι τύποι φίλτρων όπως φίλτρα γης διατόμων και φίλτρα με μεμβράνες αυτά που χρησιμοποιούνται σε συντριπτική πλειοψηφία στη βιομηχανία είναι τα φίλτρα με πλάκες. Τα φίλτρα πλακών αποτελούνται από έναν αριθμό πλαστικών ή μεταλλικών πλαισίων τα οποία συγκρατούνται μεταξύ τους από έναν ισχυρό σκελετό. Κάθε πλαίσιο διαχωρίζεται από το επόμενο με το διηθητικό μέσο. Η διήθηση γίνεται με δύο μηχανισμούς. Είτε με φαινόμενα προσρόφησης στο «φίλτρο βάθους» ( depth filters ) είτε μέσω κοσκινίσματος στα φίλτρα μεμβρανών. Τα φίλτρα βάθους κατασκευάζονται συνήθως από ειδικά επεξεργασμένη κυτταρίνη σε ένα μεγάλο εύρος διαστάσεων και διαφορετικού πορώδους. Χρησιμοποιούνται για την απομάκρυνση υπολειμμάτων του σταφυλιού, κρυστάλλων του τρυγικού Εικ. 9: Φίλτρο πλακών με φιλτρόχαρτα 51

53 οξέος, κυττάρων των ζυμών και σκόνης. Τα φίλτρα μεμβρανών είναι υψηλού κόστους και κατασκευάζονται από διάφορα πολυμερή όπως από σελοφάν, πολυεστέρα και προπυλένιο και χρησιμοποιούνται για την παστερίωση του κρασιού (Σουφλερος, 1997, Eisenman, 1998) Σταθεροποίηση Ακόμα και με την ολοκλήρωση της διαύγασης ο οινοπαραγωγός πρέπει να εξασφαλίσει ότι το κρασί δε θα παρουσιάσει θολώματα ή ιζήματα μετά την παλαίωση ή/και τη συσκευασία του προϊόντος. Οι σημαντικότεροι παράγοντες που μπορεί να αποσταθεροποιήσουν το κρασί είναι τα υπολειπόμενα σάκχαρα, υπολείμματα πρωτεϊνών και τρυγικού οξέος καθώς και το υπολειπόμενο μηλικό οξύ σε ερυθρά κρασιά. Τα υπολειπόμενα σάκχαρα μπορεί να επανεκκινήσουν την αλκοολική ζύμωση όπως και το μηλικό οξύ και τα γαλακτικά βακτήρια τη μηλογαλακτική ζύμωση στη συσκευασία. Και τα Εικ. 10: Δεξαμενή σταθεροποίησης δύο αυτά φαινόμενα είναι ανεπιθύμητα και πρέπει με διπλό τοίχωμα και ενδιάμεση να ανασταλεί η δράση τους. μόνωση Υπάρχουν διαφορετικές μέθοδοι σταθεροποίησης του κρασιού. Στις φυσικές μεθόδους περιλαμβάνονται η θέρμανση και η ψύξη του οίνου καθώς και μια τεχνική που συνδυάζει και τις δύο μεθόδους. Στις χημικές μεθόδους μπορεί να αναφερθεί η αφαίρεση του σιδήρου (Fe) και του χαλκού (Cu) ενώ στις φυσικοχημικές μεθόδους η προσθήκη μπεντονίτη, αραβικού κόμμεος ή άλλων παρόμοιων ουσιών. Από το πλήθος των διαφορετικών μεθόδων σταθεροποίησης συνήθως επιλέγεται ένας συνδυασμός τους που καταπολεμάει όλες τις πιθανές αιτίες αλλοίωσης του κρασιού και το σταθεροποιεί σε βάθος χρόνου δίχως όμως να είναι πάντα δυνατή η αποφυγή εμφάνισης θολωμάτων ή ιζημάτων σε κρασιά που έχουν παλαιωθεί για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα (περισσότερο από 5-10 χρόνια). (Σουφλερός, 1997, Eisenman, 1998). 52

54 Σταθεροποίηση με ψύξη Με την ψύξη του κρασιού διατηρείται η διαύγειά του. Η ακριβής θερμοκρασία στην οποία γίνεται η σταθεροποίηση με ψύξη είναι ίση με την αρνητική τιμή που προκύπτει από τη σχέση (αλκοολικός βαθμός - 1)/2. Ύστερα από μία βδομάδα ψύξης ακολουθεί το φιλτράρισμα του κρασιού στην ίδια θερμοκρασία. Με την ψύξη επιτυγχάνεται η καθίζηση των κρυστάλλων του όξινου τρυγικού καλίου και του τρυγικού ασβεστίου, των κολλοειδών, όπως είναι οι χρωστικές, οι πρωτεΐνες, και οι ενώσεις σιδήρου, και η επιβράδυνση της ανάπτυξης των μικροοργανισμών. Επίσης, το κρασί που προκύπτει έχει βελτιωμένα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Με την ψύξη, όταν η θερμοκρασία πέσει στους -8 C, επιτυγχάνεται η αύξηση του αλκοολικού βαθμού, η οποία δεν επιτρέπεται να ξεπερνά τους 2 βαθμούς. Ένα μέρος του νερού παγώνει και μετά την αφαίρεση των κρυστάλλων, το κρασί συμπυκνώνεται. Μετά τη ψύξη είναι δυνατή η εμφιάλωση ακόμα και σε νέα κρασιά, χωρίς τον κίνδυνο εμφάνισης ιζήματος στις φιάλες. Η ψύξη, εκτός από τη σταθεροποίηση του κρασιού, συντελεί στη βελτίωση της γεύσης στα φρέσκα κρασιά και στην επιτάχυνση της παλαίωσης (Τσέτουρας 2008, Σουφλερός 2000). Σταθεροποίηση με θέρμανση Με τη θέρμανση επιτυγχάνεται βιολογική και ενζυμική σταθεροποίηση, αντιμετώπιση του πρωτεϊνικού θολώματος και του θολώματος χαλκού, σχηματισμός προστατευτικών κολλοειδών, επιτάχυνση της παλαίωσης και διάλυση των πυρήνων κρυστάλλωσης. Η βιολογική σταθεροποίηση επιτυγχάνεται με θέρμανση απουσία αέρα, και έχει ως αποτέλεσμα την καταστροφή των μικροοργανισμών που βρίσκονται στο κρασί (παστερίωση). Η καταστροφή εξαρτάται από τη θερμοκρασία και τη διάρκεια της θέρμανσης. Μεγάλος αλκοολικός βαθμός, χαμηλό ph, μεγάλη ποσότητα θειώδη ανυδρίτη και μικρότερη περιεκτικότητα σε σάκχαρα βοηθούν στην αποτελεσματικότητα της θέρμανσης. Μία επιτυχημένη μέθοδος βιολογικής σταθεροποίησης είναι η θέρμανση του κρασιού στους C για τα ξηρά κρασιά και στους C για τα κρασιά που έχουν αναγωγικά σάκχαρα. Το κρασί εμφιαλώνεται εν θερμώ και η φιάλη ξαναπαίρνει φυσιολογικά τη θερμοκρασία του 53

55 περιβάλλοντος. Η ενζυμική σταθεροποίηση αφορά περισσότερο τα οξειδωτικά ένζυμα λακκάση και τυροσινάση. Η λακκάση καταστρέφεται σε θερμοκρασία μεγαλύτερη των 60 C και η τυροσινάση πάνω από τους 75 C. Η αντιμετώπιση του πρωτεϊνικού θολώματος γίνεται με θέρμανση του κρασιού στους 80 C για 10 min ή στους 60 C για 30 min. Ακολουθεί η διαύγασή του 24 ώρες μετά τη ψύξη του. Η διαύγεια παραμένει, αρκεί το κρασί να έχει εμφιαλωθεί. Με τη θέρμανση, επιτυγχάνεται επίσης ο σχηματισμός των προστατευτικών κολλοειδών. Τα κολλοειδή σωματίδια που βρίσκονται στο κρασί διογκώνονται με τη θέρμανση στους 80 C και μετατρέπονται σε προστατευτικά κολλοειδή. Έτσι, δεν καθιζάνουν τα σωματίδια και προστατεύεται η διαύγεια του κρασιού. Όταν η περιεκτικότητα του χαλκού είναι μεγαλύτερη από 0.5 mg/l εμφανίζεται θόλωμα, ενώ πάνω από 2-3 mg/l εμφανίζεται καστανέρυθρο ίζημα. Η απομάκρυνση της περίσσειας χαλκού γίνεται με κολλάρισμα μετά τη θέρμανση του κρασιού. Επίσης, με τη θέρμανση διαλύονται οι κρυσταλλικοί πυρήνες και έτσι εμποδίζεται ο σχηματισμών των τρυγικών ιζημάτων. Η επιτάχυνση της παλαίωσης επιτυγχάνεται με την παρατεταμένη θέρμανση του κρασιού σε αναγωγικό περιβάλλον (απουσία οξυγόνου) (Τσέτουρας 2008). Σταθεροποίηση με άλλα μέσα Η σταθεροποίηση του κρασιού μπορεί να γίνει και με άλλα μέσα όπως με τον μπεντονίτη, το αραβικό κόμμι, το μετατρυγικό οξύ και με ιοντοεναλλαγή. Ο μπεντονίτης, λόγω των χαρακτηριστικών ιδιοτήτων του, εκτός από διαυγαστικό, είναι πολύ αποτελεσματικός στη σταθεροποίηση των κρασιών. Χρησιμοποιείται ενάντια στα θολώματα χαλκού και τα πρωτεϊνικά θολώματα. Το αραβικό κόμμι εμποδίζει αποτελεσματικά το θόλωμα χαλκού, σιδήρου και το θόλωμα των χρωστικών στα κόκκινα κρασιά. Το μετατρυγικό οξύ χρησιμοποιείται για την προφύλαξη από την καταβύθιση τρυγικών αλάτων. Το μειονέκτημά του είναι ότι παρέχει προστασία μόνο για μικρό χρονικό διάστημα. Στους 0 C η δράση του διαρκεί για χρόνια, στους 20 C όμως μόνο για δύο μήνες. Οι εναλλάκτες ιόντων είμαι μέθοδος οικονομικότερη από την ψύξη και δεν απαιτεί χρόνο. Χρησιμοποιούνται ρητίνες ιοντοεναλλαγής για την αφαίρεση της περίσσειας καλίου και ασβεστίου, με σκοπό την αποφυγή σχηματισμού τρυγικών αλάτων, την αφαίρεση του σιδήρου και του χαλκού, που προκαλούν 54

56 θολώματα, και την αύξηση ή μείωση της οξύτητας του γλεύκους και του κρασιού (Τσέτουρας 2008). 55

57 3 Η χημεία του κρασιού 3.1 Αλκοολική ζύμωση Η αλκοολική ζύμωση είναι η αναερόβια εξώθερμη αντίδραση μετασχηματισμού των σακχάρων, κυρίως της γλυκόζης και της φρουκτόζης, σε αιθανόλη και διοξείδιο του άνθρακα. Η διεργασία αυτή που πραγματοποιείται από ζύμες αλλά και από ορισμένα βακτήρια όπως o Zymomonas mobilis μπορεί να περιγραφεί από το γενικό τύπο αντίδρασης: CC 66 HH 1111 OO CCHH 33 CCHH 22 OOOO + 22 CCOO 22 Παρόλα αυτά, η αλκοολική ζύμωση στο κρασί είναι μια πολύ πιο περίπλοκη διεργασία. Ενώ η παραπάνω γενική αντίδραση λαμβάνει χώρα, ένα πλήθος άλλων βιοχημικών, χημικών και φυσιοχημικών διεργασιών πραγματοποιούνται παράλληλα ώστε το γλεύκος να μετατραπεί τελικά σε κρασί. Εκτός της αιθανόλης, πολλές άλλες ενώσεις παράγονται κατά την αλκοολική ζύμωση όπως ανώτερες αλκοόλες, εστέρες, γλυκερόλη, ηλεκτρικό οξύ, διακετύλιο, ακετοΐνη και 2,3-βουτανεδιόλη. Ταυτόχρονα, και ορισμένα άλλα συστατικά του γλεύκους, εκτός των σακχάρων, μετασχηματίζονται από το μεταβολισμό των ζυμών. Χωρίς την παρουσία αυτών των παραπροϊόντων, το κρασί θα είχε πολύ περιορισμένο οργανοληπτικό ενδιαφέρον (Zamora, 2009). Η μεταβολική διαδικασία της αλκοολικής ζύμωσης όπως και η διαδικασία της αναπνοής των ζυμών αρχίζουν με τον ίδιο τρόπο αποικοδόμησης της γλυκόζης προς πυροσταφυλικό οξύ. Ως δευτερεύον προιόν της ζύμωσης παράγεται επίσης και γλυκερόλη μέσω της μεταβολικής διαδικασίας της πυροσταφυλικής ζύμωσης. Το κρασί περιέχει περίπου 8 g γλυκερόλης ανά 100 g αιθανόλης. Το μεγαλύτερο ποσοστό της γλυκερόλης παράγεται κατά το πρώτο στάδιο της ζύμωσης και στη συνέχεια ο ρυθμός της μειώνεται δραστικά, χωρίς ποτέ να μηδενιστεί. (Ribérau- Gayon et al., 2006) Στην αρχή της οινοποίησης ένα πλήθος διαφορετικών ειδών ζυμών μπορεί να είναι παρόν στο γλεύκος. Αυτή η βιοποικιλότητα εξαρτάται από πολλούς παράγοντες όπως 56

58 την ποικιλία του σταφυλιού, το στάδιο ωρίμανσης κατά τον τρυγητό, τις αντιμυκητιακές δράσεις κατά την καλλιέργεια, τις κλιματικές συνθήκες της σοδειάς, τις μολύνσεις από μύκητες και γενικά τις αμπελουργικές μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν κατά την καλλιέργεια (Sapis-Domercq, 1980, Pretorius et al., 1999). Επιπλέον παράγοντες που επηρεάζουν την τελική σύσταση των ζυμών πριν την αλκοολική ζύμωση, είναι όλες οι επαφές του σταφυλιού, κατά τον τρυγητό, τις μεταφορές του σταφυλιού καθώς και τις προζυμωτικές διεργασίες στο οινοποιείο (Constantí et al., 1997, Mortimer & Polsinelli, 1999). Διαφορετικές ζύμες συμμετέχουν στην αυθόρμητη αλκοολική ζύμωση ακόμα και υπό την παρουσία διοξειδίου του θείου (θειώδης ανυδρίτης) (Beltran et al., 2002). Συνήθως τα είδη Kloeckera, Hanseniaspora και Candida κυριαρχούν στα πρώτα στάδια της ζύμωσης ενώ κατά τα ενδιάμεσα στάδια επικρατούν τα είδη Pichia και Metschnikowia. Στα τελευταία στάδια, επικρατεί κυρίως ο Saccharomyces cerevisiae λόγω της αντοχής του σε υψηλές συγκεντρώσεις αιθανόλης. Κάποιες άλλες ζύμες που μπορεί να είναι παρούσες κατά την αλκοολική ζύμωση αλλά και στο τελικό προϊόν μπορεί να έχουν αρνητική οργανοληπτική επίδραση στο κρασί. Για να αποτραπεί το φαινόμενο αυτό, προστίθεται θειώδης ανιδύτρης και εμβολιάζεται το γλεύκος με ορισμένα στελέχη ξηρών ζυμών (Saccharomyces cerevisiae). Η δραστική επιλεκτική δράση του θειώδη ανιδρύτη στην ανάπτυξη των ζυμών σε συνδυασμό με την υψηλή αντοχή του S. cerevisiae ευνοεί την ανάπτυξη του και την αύξηση του πληθυσμού του. Τα τελευταία χρόνια τα περισσότερα οινοποιεία επιλέγουν τον εμβολιασμό με ξηρές ζύμες ώστε να εξασφαλίσουν ότι η αλκοολική ζύμωση θα πραγματοποιηθεί με μεγαλύτερο έλεγχο. Αντίθετα, κάποια οινοποιεία, κατά κύριο λόγω παραδοσιακά κελάρια (wine-cellars) συνεχίζουν να πραγματοποιούν μόνο την αυθόρμητη αλκοολική ζύμωση καθώς θεωρούν ότι ενισχύει την πολυπλοκότητα των κρασιών τους (Ribérau-Gayon et al., 2006, Zamora, 2009). 3.2 Μηλογαλακτική ζύμωση Η μηλογαλακτική ζύμωση στο κρασί είναι η ενζυμική μετατροπή του L-μηλικού οξέος σε L-γαλακτικό οξύ, μια δευτερεύουσα δράση που συνήθως ακολουθεί την 57

59 αλκοολική ζύμωση ενώ σε κάποιες περιπτώσεις μπορεί να συμβαίνουν και παράλληλα. Η μετατροπή του μηλικού οξέος σε γαλακτικό οξύ δεν είναι πραγματική ζύμωση αλλά μια ενζυμική αντίδραση που πραγματοποιείται από τα βακτήρια του γαλακτικού οξέος, όταν έχει ολοκληρωθεί η εκθετική φάση ανάπτυξής τους (Constantini et al., 2009). Η μηλογαλακτική ζύμωση πραγματοποιείται κυρίως από το βακτήριο Oenococcus oeni, ένα είδος το οποίο μπορεί να αντέξει στο χαμηλό ph (<3,5), στην υψηλή αλκοόλη (>10 vol. %) καθώς και στα υψηλά επίπεδα διοξειδίου του θείου (50 mg/l), που υπάρχουν στο κρασί. Πιο ανθεκτικά στελέχη του Lactobacillus, του Leuconostoc και του Pediococcus μπορούν, επίσης, να αναπτυχθούν στο κρασί και να συνεισφέρουν στη μηλογαλακτική ζύμωση, ειδικά αν το ph του κρασιού υπερβαίνει την τιμή του 3,5 (Davis et al., 1986, Wibowo et al., 1985). Τα πιο σημαντικά οφέλη της μηλογαλακτικής ζύμωσης είναι η μείωση της οξύτητας σε κρασιά πολύ υψηλής οξύτητας ψυχρών κλιμάτων ενώ ακόμα το γαλακτικό οξύ και τα βακτήρια του γαλακτικού οξέος συνεισφέρουν στα γευστικά και αρωματικά χαρακτηριστικά, και στην πολυπλοκότητα του κρασιού. Επιπλέον, η μηλογαλακτική ζύμωση βελτιώνει τη μικροβιακή σταθερότητα του κρασιού (Lonvaud-Funel 1999, Moreno-Arribas & Polo 2005). Από την άλλη πλευρά, η μη ελεγχόμενη μηλογαλακτική ζύμωση παρουσιάζει το ρίσκο αλλοίωσης του κρασιού λόγω παραγωγής ουσιών ανεπιθύμητων οργανοληπτικών χαρακτηριστικών (αρωματικών και γευστικών) όπως το οξικό οξύ και ορισμένα πτητικά φαινολικά. Μπορεί, επίσης, να παράγει και ουσίες που αποτελούν κίνδυνο για την ανθρώπινη υγεία όπως τον καρβαμιδικό αιθυλεστέρα και βιογενείς αμίνες (Constantini et al., 2009). Στα ελληνικά γλεύκη η ποσότητα του μηλικού οξέος που περιέχεται είναι πολύ μικρή και πολλές φορές ελάχιστη, λόγω της καλής ωρίμανσης των σταφυλιών όμως η μηλογαλακτική ζύμωση σχεδόν πάντα αναπτύσσεται. Μετά τη διάσπαση του μηλικού, ακολουθεί η προσβολή του κιτρικού οξέος του κρασιού με παραγωγή οξικού οξέος που αυξάνει την πτητική οξύτητα (Τσέτουρας, 1998). 58

60 3.3 Η χημική σύσταση του κρασιού Το κρασί είναι ένα πολυσύνθετο υδρο-αλκοολικό διάλυμα που περιέχει ένα σύνολο χημικών ενώσεων. Τα δύο κύρια συστατικά από τα οποία αποτελείται το κρασί είναι το νερό και η αιθανόλη. Εντούτοις, τα βασικά αρωματικά και γευστικά χαρακτηριστικά του κρασιού εξαρτώνται από ένα πλήθος τουλάχιστον 20 επιπλέον ενώσεων, ενώ οι ελαφριές οργανοληπτικές διαφορές ανάμεσα σε κρασιά από διαφορετικές ποικιλίες, οφείλονται σε έναν ακόμα μεγαλύτερο αριθμό συστατικών που περιέχονται στο κρασί. Κυρίαρχο ρόλο στα φυσιολογικά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του κρασιού παίζουν τα φαινολικά συστατικά. Καθώς αποτελούν βασικό αντικείμενο μελέτης της παρούσας διατριβής θα αναλυθούν ξεχωριστά σε επόμενο κεφάλαιο. Ορισμένες από τις βασικότερες κατηγορίες ενώσεων που εμφανίζονται στο κρασί αναλύονται παρακάτω: Αλκοόλες Η αιθανόλη, όπως προαναφέρθηκε, αποτελεί το κύριο προϊόν της αλκοολικής ζύμωσης και είναι η πιο σημαντική αλκοόλη του οίνου. Σε συνήθεις συνθήκες οινοποίησης η περιεκτικότητα σε αιθανόλη ανέρχεται έως και 14-15% vol, ενώ υψηλότερες συγκεντρώσεις μπορούν να επιτευχθούν με τη προσθήκης σακχάρων ή συμπυκνωμένου γλεύκος, μια διαδικασία που ονομάζεται ενίσχυση του κρασιού. Οι βασικοί παράγοντες που ελέγχουν την παραγωγή αιθανόλης είναι το περιεχόμενο σε σάκχαρα, η θερμοκρασία της οινοποίησης και το γένος των ζυμών που χρησιμοποιούνται. Η μεγάλη αντοχή του S. Cerevisiae στην αιθανόλη δικαιολογεί την ευρεία επικράτησή του στη βιομηχανία. Η παρουσία της αιθανόλης είναι πρωτεύουσας σημασίας για τη σταθεροποίηση του κρασιού, για την παλαίωση του, καθώς και για τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του. Η ιδιότητα της να σχηματίζει δεσμούς υδρογόνου την καθιστά ως έναν αφυδατικό παράγοντα που επιδρά κατά την κροκίδωση υδρόφιλων κολλοειδών, πρωτεϊνών και πολυσακχαριτών. Παράλληλα, της προσδίδει απολυμαντικό 59

61 χαρακτήρα, ο οποίος σε συνδυασμό με την οξύτητα επιτρέπει στο κρασί να διατηρηθεί σε βάθος χρόνου. Κατά την παλαίωση αντιδρά, με αργό ρυθμό, με οργανικά οξέα για την παραγωγή εστέρων ενώ επηρεάζει και τη σταθερότητα αυτών. Τέλος, αντιδρά αργά με αλδεΰδες για την παραγωγή ακεταλών. Επιπλέον, μέσω της επίδρασης που έχει στη μεταβολική δραστηριότητα των ζυμών καθορίζει το είδος και την ποσότητα των αρωματικών ενώσεων που παράγονται και παράλληλα αποτελεί αντιδρόν για το σχηματισμό ορισμένων σημαντικών πτητικών ουσιών. Η αιθανόλη αποτελεί βασικό συνδιαλύτη μαζί με το νερό για την εκχύλιση συστατικών από τα σταφύλια (με πιο βασικά τα φαινολικά συστατικά) και πιο συγκεκριμένα για τη διάλυση μη πολικών αρωματικών ενώσεων. Υποβοηθά ακόμα, τη διάλυση πτητικών ενώσεων που παράγονται κατά τη ζύμωση καθώς και κατά την παλαίωση σε ξύλινα βαρέλια ενώ εμποδίζει και την απομάκρυνση αρωματικών ενώσεων με το διοξείδιο του άνθρακα κατά τη ζύμωση. Η μεθανόλη είναι παρούσα στον οίνο σε πολύ μικρές περιεκτικότητες (30-35 mg/l) και δεν ανιχνεύεται οργανοληπτικά. Μεταβολίζεται σε φορμαλδεΰδη και φορμικό οξύ τα οποία έχουν τοξική δράση και γι αυτό η παρουσία της στο κρασί είναι πάντα σε συγκεντρώσεις πολύ μικρότερες του επιτρεπτού ορίου. Παράγεται κυρίως από την απομεθυλίωση των πηκτινών. Ανώτερες αλκοόλες βρίσκονται συνήθως σε μικρές συγκεντρώσεις με μόνη εξαίρεση της εξανόλες. Αποτελούν συνήθως παραπροϊόντα της ζύμωσης και μπορούν να συνεισφέρουν μέχρι και το 50% των αρωματικών συστατικών του οίνου. Επιπρόσθετα, στον οίνο περιέχονται κάποιες διόλες και πολυόλες (ή πολυ-αλκοόλες), με σημαντικότερη πολυόλη, τη γλυκερόλη. Η γλυκερόλη είναι συνήθως η ουσία με τη μεγαλύτερη συγκέντρωση μετά το νερό και την αιθανόλη, επιδρά στο ιξώδες του κρασιού και προσδίδει μια γλυκιά γεύση στα ξηρά κρασιά, όταν η συγκέντρωση της ξεπερνά το όριο ανίχνευσης Σάκχαρα Τα βασικά σάκχαρα που περιέχονται στο σταφύλι είναι η γλυκόζη και η φρουκτόζη, με τα υπόλοιπα σάκχαρα να βρίσκονται σε ίχνη. Συνήθως εμφανίζονται σε ίση 60

62 ποσότητα με τον λόγο γλυκόζη/φρουκτόζη περίπου ίσο με 0,95 στο γλεύκος. Η βασική οινική ζύμη Saccharromyces cerevisiae αντλεί το μεγαλύτερο μέρος της μεταβολικής ενέργειας από τη γλυκόζη και τη φρουκτόζη και επειδή η ικανότητα της να ζυμώνει άλλες ουσίες είναι περιορισμένη, είναι σημαντικό η μεγαλύτερη ποσότητα των θρεπτικών συστατικών στο γλεύκος να είναι σε μορφή γλυκόζης και φρουκτόζης. Τα ζυμώσιμα σάκχαρα εκτός της παραγωγής αιθανόλης ως βασικού προϊόντος της αλκοολικής ζύμωσης μπορούν να δώσουν ως παραπροϊόντα ανώτερες αλκοόλες, εστέρες λιπαρών οξέων καθώς και αλδεΰδες. Όσα σάκχαρα δεν ζυμωθούν αναφέρονται ως υπολειπόμενα σάκχαρα. Στα ξηρά κρασιά τα υπολειπόμενα σάκχαρα αποτελούνται κυρίως από πεντόζες, όπως αραβινόζη και ξυλόζη καθώς και από μικρά ποσοστά αζύμωτης γλυκόζης και φρουκτόζης. Η περιεκτικότητα των υπολειπόμενων σακχάρων στα ξηρά κρασιά είναι συνήθως χαμηλότερη από 1.5 g/l, και μπορεί να αυξηθεί ελαφρά κατά την παλαίωση σε δρύινα βαρέλια λόγω της διάλυσης γλυκοζιδίων από το ξύλο και της διάσπασής τους Οργανικά Οξέα Τα οργανικά οξέα έχουν σημαντική συνεισφορά στη σύσταση, στη σταθερότητα και στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των κρασιών, και ιδιαίτερα των λευκών κρασιών ενώ παράλληλα βελτιώνουν τη μικροβιολογική και φυσικοχημική σταθερότητα του κρασιού. Λευκά νεαρά κρασιά με υψηλή οξύτητα εμφανίζουν μεγαλύτερες δυνατότητες παλαίωσης. Τα κόκκινα κρασιά μπορούν να σταθεροποιηθούν σε χαμηλότερη οξύτητα λόγω της παρουσίας των φαινολών, οι οποίες ενισχύουν την οξύτητα και βοηθούν στη διατήρηση της σταθερότητας του οίνου κατά την παλαίωση. Το τρυγικό οξύ αποτελεί ένα από τα κυρίαρχα οξέα τόσο στα ανώριμα σταφύλια όσο και στο γλεύκος. Δεν είναι ιδιαίτερα διαδεδομένο στη φύση αλλά συγκεκριμένα στο σταφύλι για αυτό και είναι γνωστό ως οξύ του κρασιού ( wine acid ). Πριν την ωρίμανση η συγκέντρωση του σταφυλιού σε τρυγικό οξύ μπορεί να φτάσει έως και τα 15 g/l. Σε γλεύκος αμπελώνων βόρειων περιοχών η συγκέντρωσή του συνήθως ξεπερνάει τα 6 g/l, ενώ σε νότιους αμπελώνες ανέρχεται σε 2-3 g/l. Οι εστέρες και 61

63 τα άλατα του τρυγικού οξέος που προέρχονται από τις οινοβιομηχανίες είναι η κύρια πηγή τρυγικού οξέος που τροφοδοτεί ολόκληρο τον κλάδο της βιομηχανίας τροφίμων και ποτών (αναψυκτικά, σοκολάτες κονσέρβες κ.α.) (Ribereau-Gayon et al., 2006). Λόγω του ότι μεταβολίζεται από μικρό αριθμό μικροοργανισμών, συνήθως προτιμάται ως προσθήκη για την αύξηση της οξύτητας σε κρασιά υψηλού ph. Κατά την παλαίωση, τα διαλυτοποιημένα παράγωγα του τρυγικού οξέος τείνουν να κρυσταλλοποιούνται με αποτέλεσμα να καθιζάνουν και να ιζηματοποιούνται. Επειδή η ψύξη επιταχύνει αυτή τη διαδικασία, κατά το τέλος της οινοποίησης το κρασί ψύχεται ώστε να πραγματοποιηθεί πρώιμος σχηματισμός ιζήματος, το οποίο απομακρύνεται, και να αποφευχθεί η κρυσταλλοποίηση στη φιάλη (Jackson, 1998). Το μηλικό οξύ αποτελεί το άλλο βασικό οξύ του σταφυλιού. Η συγκέντρωση του στα ανώριμα σταφύλια είναι πολύ υψηλή και μπορεί να φτάσει ως και τα 25 g/l. Στη συνέχεια όμως, και κατά τις 2 βδομάδες του περκασμού, η συγκέντρωσή του πέφτει στο ήμισυ. Όταν έχει ωριμάσει το σταφύλι η συγκέντρωση ποικίλει από g/l σε βόρειες περιοχές και μειώνεται αισθητά στο νότο σε συγκεντρώσεις 1-2 g/l. Συνεισφέρει περίπου κατά 50% στην ολική οξύτητα και του σταφυλιού και του κρασιού προσδίδοντας ξινή γεύση. Το περιεχόμενο σε μηλικό οξύ αποτελεί ένα βασικό δείκτη για τον καθορισμό της αρχής του τρύγου. Επιπλέον το σταφύλι περιέχει σε μικρότερες συγκεντρώσεις κιτρικό οξύ (0.5-1 g/l) και ασκορβικό οξύ, το οποίο όμως καταναλώνεται από τις ζύμες και δεν υπάρχει στο τελικό προϊόν. Το γλεύκος περιέχει και ουρoνικά οξέα (γαλακτουρονικό οξύ και γλυκουρονικό οξύ) καθώς και φαινολικά οξέα της κινναμικής ομάδας (κουμαρικό και καφεϊκό οξύ) τα οποία εστεροποιούνται παρουσία του τρυγικού οξέος, σε κουταρικό και καφταρικό οξύ αντίστοιχα. Τα περισσότερα οργανικά οξέα του γλεύκους και του κρασιού είναι πολυ-λειτουργικά μόρια, πολλά από τα οποία είναι υδροξυ-οξέα. Οι δύο αυτές λειτουργικές ομάδες προσδίδουν στα οξέα πολικά και υδρόφιλα χαρακτηριστικά. Σαν αποτέλεσμα, είναι διαλυτά τόσο στο νερό όσο και σε αραιά αλκοολικά διαλύματα όπως είναι το κρασί. Αυτός ακριβώς ο πολυ-λειτουργικός χαρακτήρας είναι υπεύθυνος για τη χημική 62

64 ενεργότητά τους που τους επιτρέπει να εξελίσσονται κατά την παλαίωση. (Jackson, 1998, Σουφλερός, 1998) Άλλες κατηγορίες ενώσεων Το κρασί περιέχει επίσης, σε μικρότερες συγκεντρώσεις, εστέρες, κετόνες, αζωτούχες ενώσεις, πηκτινικές ουσίες, τερπένια, ένζυμα, βιταμίνες, και ανόργανα άλατα. Η παραγωγή εστέρων στο κρασί έχει διπλή προέλευση: Σχηματίζονται είτε μέσω ενζυμικής εστεροποίησης κατά τη διάρκεια της αλκοολικής ζύμωσης, είτε μέσω χημικής εστεροποίησης κατά τη μακράς διάρκειας παλαίωση. Για το λόγο αυτό, η περιεκτικότητα σε εστέρες αυξάνεται σημαντικά κατά την παλαίωση με αποτέλεσμα παλαιωμένα κρασιά να περιέχουν 2-3 φορές περισσότερους εστέρες σε σχέση με τα νεαρά κρασιά. Η σημασία των εστέρων έγκειται στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά τους. Ενώ ο οξικός αιθυλεστέρας, ο οποίος αντιπροσωπεύει το 80% των πτητικών εστέρων, προσδίδει δυσάρεστη οσμή στο κρασί, οι οξικοί εστέρες του 2- μεθυλοπροπυλίου, του 3-μεθυλοβουτυλίου,του 2-φαινυλο αιθυλίου καθώς και οι αιθυλεστέρες των λιπαρών οξέων με ζυγό αριθμό ατόμων άνθρακα αποτελούν βασικά συστατικά του αρώματος του οίνου. Οι παράγοντες που επιδρούν στον σχηματισμό ανώτερων εστέρων κατά την αλκοολική ζύμωση είναι το γένος και το είδος των ζυμών, η θερμοκρασία της ζύμωσης, το ph, ο αερισμός του γλεύκους και η τεχνική της οινοποίησης (Ribereau-Gayon et al., 2006, Σουφλερός, 1997). Στο σταφύλι υπάρχει ένας μικρός αριθμός κετονών, οι περισσότερες από τις οποίες όμως διατηρούνται και μετά την αλκοολική ζύμωση. Τα έντονα αρώματα εξωτικών λουλουδιών ή τριαντάφυλλου της β-δαμασκηνόνηs (β-damascenone) καθώς και το χαμηλό όριο ανίχνευσής της οργανοληπτικά, υποδεικνύουν το σημαντικό της ρόλο στο άρωμα πολλών λευκών, κυρίως, ποικιλιών, συμπεριλαμβανομένου του Chardonnay (Simpson & Miller, 1984) και του Riesling (Strauss et al., 1987). Επιπλέον, στις ερυθρές ποικιλίες η β-ιονίνη (β-ionone) προσδίδει χαρακτηριστικά αρώματα βιολέτας και σμέουρου ( raspberry ) (Ferreira et al., 1993). Αν και πλήθος κετονών παράγεται κατά την αλκοολική ζύμωση, ελάχιστες από αυτές έχουν σημαντική οργανοληπτική σημασία (Jackson, 1998). 63

65 Οι αζωτούχες ενώσεις στο κρασί είναι κατά κύριο λόγο οργανικές ενώσεις (95%). Οι κύριες οργανικές αζωτούχες ενώσεις που εμφανίζονται στο κρασί είναι οι πρωτεΐνες, τα πεπτίδια, τα αμινοξέα και τα αμίδια. Ο κολλοειδής χαρακτήρας των πρωτεϊνών προκαλεί θόλωμα στο κρασί και στη συνέχεια υπό την επίδραση της θερμότητας και την παρουσία ταννινών σχηματίζει ίζημα. Σήμερα η απομάκρυνση των πρωτεϊνών γίνεται αποτελεσματικά με την προσθήκη μπεντονίτη ή τη χρήση πρωτεολυτικών ενζύμων (Σουφλερός, 1997). Τα αμινοξέα λειτουργούν ως θρεπτικά συστατικά των ζυμών τόσο στην αλκοολική όσο και στη μηλογαλακτική ζύμωση. Η συγκέντρωση και η σύσταση των αμινοξέων στο κρασί μπορεί να έχει σημαντική επίδραση και στην αρωματική πολυπλοκότητα του (Moreno-Arribas et al., 2003). Το κρασί περιέχει, ακόμα, ένα πλήθος πηκτινικών ουσιών, όπως τις πηκτίνες και τις οζάνες στις οποίες ανήκουν και τα κόμμεα. Αποτελούν συνήθως πολυμερή σακχαρωδών οξέων, διακλαδισμένων αλυσίδων (πολυσακχαρίτες) και δρουν ως προστατευτικά κολλοειδή που εμποδίζουν τη διαύγαση. Για το λόγο αυτό γίνεται χρήση πηκτινολυτικών ενζύμων για την αποικοδόμηση τους (Τσακίρης, 1998). Επιπρόσθετα, μια άλλη κατηγορία ενώσεων που περιέχει το κρασί είναι οι τερπενικές ενώσεις. Αποτελούν οργανικές ενώσεις 10 ατόμων άνθρακα και είναι αρωματικές ενώσεις υπεύθυνες για τα πρωτεύοντα αρώματα κάποιων έντονα αρωματικών ποικιλιών όπως το Μοσχάτο και το Riesling. Χαρακτηριστικές τερπενικές ενώσεις είναι η λιναλόλη, η (cis) γερανιόλη, η (trans) νερόλη και η α-τερπινεόλη. Τέλος, στο κρασί υπάρχει ένα πλήθος βιταμινών, ενζύμων και ανόργανων ενώσεων που περιλαμβάνουν ανιόντα και κατιόντα ανόοργανων αλάτων (Σουφλερός 1998). 64

66 4 Φαινολικά συστατικά του σταφυλιού και του κρασιού 4.1 Γενικά στοιχεία Τα φαινολικά συστατικά περιλαμβάνουν ένα ευρύ πλήθος χημικών ενώσεων, διαφορετικών δομών και λειτουργιών και αποτελούν μια από τις βασικές κατηγορίες των δευτερογενών μεταβολιτών. Απλές φαινόλες ονομάζονται οι χημικές ενώσεις που περιλαμβάνουν έναν αρωματικό δακτύλιο με ένα ή περισσότερα υδροξύλια ως υποκαταστάτες ενώ πολυφαινόλες ονομάζονται οι ενώσεις που περιλαμβάνουν πολλαπλούς φαινολικούς δακτυλίους στη δομή τους (Waterhouse, 2002). Εντούτοις, ο ορισμός αυτός δεν είναι εντελώς ικανοποιητικός καθώς περιλαμβάνει και ενώσεις όπως η οιστρόνη, μια γυναικεία ορμόνη, που προέρχεται από τα τερπένια. Παράλληλα, δεν περιλαμβάνει ενώσεις που δεν έχουν υδροξύλια ως υποκαταστάτες στον αρωματικό δακτύλιο (και άρα αυστηρά δε μπορούν να χαρακτηριστούν ως φαινολικά), όπως το κινναμικό οξύ, αλλά έχει επικρατήσει στην οινική βιβλιογραφία να εξετάζονται από κοινού με τα φαινολικά συστατικά (Jackson, 1998). Για το λόγο αυτό, προτιμάται συνήθως ένας ορισμός με βάση τη μεταβολική προέλευση τους. Έτσι ως φυτικά φαινολικά συστατικά χαρακτηρίζονται οι ενώσεις που παράγονται από το σικιμικό μεταβολικό μονοπάτι και τον φαινυλοπροπανοειδή μεταβολισμό (Robards et al., 2002). Λόγω της πολυπλοκότητας και του μεγάλου εύρους δομών που περιλαμβάνουν, τα φαινολικά συστατικά επιτελούν ένα πλήθος σημαντικών και διαφορετικών λειτουργιών στο κρασί και επηρεάζουν σημαντικά την ποιότητα του. Συμβάλλουν στη διαμόρφωση των οργανοληπτικών του χαρακτηριστικών, όπως είναι το χρώμα, η πικράδα, η στυφότητα και η αίσθηση στο στόμα (mouthfeel) (Boulton, 2001, Vidal et al., 2004), ενώ επιπλέον, σύμφωνα με διάφορες in vitro και in vivo μελέτες, τα συστατικά αυτά, μειώνουν τον κίνδυνο ανάπτυξης καρδιοαγγειακών και νευρολογικών παθήσεων, διαβήτη, οστεοπόρωσης κλπ. λόγω της αντιοξειδωτικής τους δράσης (Scalbert et al., 2005, Stoclet et al., 2004). Λειτουργούν ως φυσικά συντηρητικά του κρασιού λόγω της αντιοξειδωτικής και αντιμικροβιακής τους δράσης και παίζουν σημαντικό ρόλο κατά την παλαίωση του κρασιού. Ευθύνονται, όμως, για τον σχηματισμό ιζημάτων και θολότητας, καθώς και για άλλα τεχνικά 65

67 προβλήματα (συσσώρευση στην επιφάνεια των φίλτρων και ρόφηση στην επιφάνεια της δεξαμενής) (Cheynier, 2006, Jackson, 1998). Τα φαινολικά συστατικά του κρασιού προέρχονται κατά κύριο λόγο από το σταφύλι και πιο συγκεκριμένα από τα στερεά του μέρη, τον φλοιό και τα γίγαρτα. Έτσι βρίσκονται σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις στα ερυθρά κρασιά, στα οποία εκχυλίζεται το μεγαλύτερο μέρος, ύστερα από την επαφή με τα στέμφυλα. Μικρότερες ποσότητες προσλαμβάνονται από το ξύλο των βαρελιών, ενώ σε πολύ μικρές ποσότητες φαινολικά παράγονται από τον μεταβολισμό των ζυμών και μπορούν να εκχυλιστούν από τον φελλό της φιάλης αν έρθει σε επαφή με το κρασί (Conde et al., 1998, Jackson, 1998). Τα κύρια φαινολικά του κρασιού μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο βασικές κατηγορίες. Στα διφαινυλοπροπανοειδή γνωστά και ως φλαβονοειδή που περιλαμβάνουν τις φλαβονόλες, τις φλαβαν-3-όλες και τις ανθοκυάνες, και στα φαινυλοπροπανοειδή ή μη φλαβονοειδή που περιλαμβάνουν υδροξυ-βενζοϊκά και υδροξυ-κινναμικα οξέα (φαινολικά οξέα) (Minussi et al., 2003). Η δομή των φλαβονοειδών (διφαινυλοπροπανοειδών) περιλαμβάνει δύο φαινολικούς δακτυλίους (Α και Β) συνδεδεμένους με έναν κεντρικό δακτύλιο πυρανίου (C). Η δομή των μη φλαβονοειδών είναι πιο απλή σε σχέση με τα φλαβονοειδή καθώς αποτελούνται από μία C3-C6 κεντρική αλυσίδα συνδεδεμένη στο φαινολικό δακτύλιο. Στην Εικ. 11 παρουσιάζονται οι κυριότερες φαινόλες του κρασιού και η προέλευσή τους.. 66

68 Εικ. 11: Οι φλαβονοειδείς και οι μη φλαβονοειδείς φαινόλες και η προέλευσή τους 67

69 4.2 Μη φλαβονοειδή Στα μη φλαβονοειδή του κρασιού που δεν έχει παλαιωθεί περιλαμβάνονται κυρίως τα φαινολικά οξέα και τα παραγωγά τους - και πιο συγκεκριμένα τα υδροξυ-κινναμικά και υδροξυ-βενζοϊκά οξέα - καθώς και οι πτητικές φαινόλες και τα στιλβένια. Βρίσκονται κυρίως στα χυμοτόπια των κυττάρων του φλοιού και της σάρκας και εκχυλίζονται εύκολα κατά τη θραύση των σταφυλιών. Βρίσκονται σε συγκεντρώσεις mg/l στα ερυθρά κρασιά και mg/l στα λευκά. Με τον όρο φαινολικά οξέα του κρασιού, αναφερόμαστε τόσο σε βενζοικά (π.χ. γαλλικό οξύ) όσο και σε (υδρόξυ)κινναμικά οξέα αλλά και στους τρυγικούς εστέρες αυτών που απαντώνται σε υψηλές συγκεντρώσεις στο κρασί. Τα φαινολικά οξέα είναι άχρωμα σε καθαρό αλκοολικό διάλυμα αλλά μπορεί να αποκτήσουν κίτρινη απόχρωση αν οξειδωθούν. Από οργανοληπτικής πλευράς, δεν έχουν συγκεκριμένα γευστικά η αρωματικά χαρακτηριστικά αλλά ορισμένα από τα παράγωγα τους κατά το μεταβολισμό των ζυμών αποτελούν πτητικά φαινολικά συστατικά που επηρεάζουν τον αρωματικό χαρακτήρα του κρασιού. (Jackson, 1998, Rentzch et al., 2009) Σε μεγαλύτερη αναλογία ποσοτικά υπάρχουν τα υδροξυ-κινναμικά οξέα και τα παράγωγά τους. Τα κυριότερα κινναμικά οξέα του σταφυλιού και του κρασιού είναι το p-κουμαρικό (4-υδρόξυ υποκατάσταση του φαινολικού δακτυλίου), το καφεϊκό (3, 4-διυδρόξυ υποκατάσταση ή κατεχολική υποκατάσταση) και το φερουλικό οξύ (3-μεθόξυ, 4-υδρόξυ υποκατάσταση ή γουαϊακολική υποκατάσταση) (Πίν. 5). Σημειώνεται ότι στον χυμό σταφυλιού και στο λευκό κρασί, τα κινναμικά παράγωγα αποτελούν την κυριότερη ομάδα πολυφαινολικών συστατικών. Επίσης, είναι τα πιο ευοξείδωτα συστατικά και ευθύνονται για το καφέτιασμα των λευκών κρασιών. Εικ. 12: Οι τρυγικοί εστέρες του κρασιού 68

70 Στα σταφύλια τα κινναμικά οξέα δεν συναντώνται σε ελεύθερη μορφή, παρά εστεροποιημένα με το τρυγικό οξύ. Τα ονόματα που έχουν υιοθετηθεί για τους τρυγικούς εστέρες του καφεϊκού, του p-κουμαρικού και του φερουλικού οξέος είναι αντίστοιχα: καφταρικό, κουταρικό και φερταρικό οξύ (Εικ. 12). Ενδεικτικά για τα σταφύλια του γένους Vitis vinifera η μέση περιεκτικότητα σε κουταρικό, καφταρικό και φερταρικό οξύ είναι 20, 170 και 5 mg/kg αντίστοιχα, ενώ οι σχετικές αναλογίες διατηρούνται και μετά την οινοποίηση (Ribérau-Gayon et al., 2006, Rentzch et al., 2009). Το πιο κοινό μη φλαβονοειδές των σταφυλιών, το καφταρικό οξύ, λόγω της o- διφαινολικής του δομής οξειδώνεται εύκολα και για το λόγο αυτό παίζει σημαντικό ρόλο στο οξειδωτικό μαύρισμα του γλεύκους. Τα οξειδωμένα παράγωγα του καφταρικού και κουταρικού οξέος συνεισφέρουν στην κιτρινωπή-χρυσή απόχρωση των λευκών κρασιών. Στα κόκκινα κρασιά, αντίθετα, η αφθονία των ανθοκυανών και των προκυανιδίνων καλύπτει την παρουσία των οξειδωμένων μη φλαβονειδών του σταφυλιού. Οι εστέρες αυτοί αποσυντίθενται στα μονομερή τους υπό την παρουσία της πηκτίνομεθυλεστεράσης ενώ ακόμα υδρολύονται αργά κατά την αλκοολική ζύμωση. Όταν τα κινναμικά οξέα ενώνονται με ανθοκυανικούς μονοσακχαρίτες σχηματίζουν ακυλιωμένες ανθοκυάνες μέσω εστεροποίησης του καφεϊκού και του p-κουμαρικού με τη γλυκόζη του γλυκοζίτη (υποκεφάλαιο 4.3.2). Από τα βενζοϊκά οξέα, 7 έχουν ταυτοποιηθεί στο κρασί (Πίν. 5). Η μεταξύ τους διαφοροποίηση αφορά τους υποκαταστάτες του βενζολικού τους δακτυλίου. Στα σταφύλια εμφανίζονται κυρίως ως εστέρες με σάκχαρα, από τους οποίους απελευθερώνονται με υδρόλυση παρουσία οξέος, αλλά και ως εστέρες των ανθοκυανών, από τις οποίες απελευθερώνονται με αλκαλική υδρόλυση. Σε ελεύθερη μορφή εμφανίζονται κυρίως σε ερυθρά κρασιά λόγω της υδρόλυσης των γλυκοζιτών αλλά και σε αντιδράσεις θερμικής αποσύνθεσης πιο πολύπλοκων ενώσεων, ειδικά των ανθοκυανών. (Ribérau-Gayon et al., 2006, Κοτσερίδης, 2006). 69

71 Πίν. 5: Τα βενζοϊκά και κινναμικά οξέα του κρασιού Βενζοϊκά οξέα R 2 R 3 R 4 R 5 Κινναμικά οξέα p-υδροξυβενζοϊκό οξύ Η H ΟΗ H p-κουμαρικό οξύ πρωτοκατεχικό οξύ Η OH ΟΗ H καφεϊκό οξύ βανιλλικό οξύ Η OCH 3 ΟΗ H φερουλικό οξύ γαλλικό οξύ Η OH ΟΗ OH συριγγικό οξύ H OCH 3 ΟΗ OCH 3 σιναπικό οξύ σαλικυλικό οξύ ΟΗ H Η H γεντισικό οξύ OH H Η OH Τα βενζοϊκά οξέα του κρασιού προέρχονται συχνά από τις υδρολύσιμες ταννίνες. Αυτές ανήκουν στα μη φλαβονοειδή και αποτελούνται από ένα μόριο σακχάρου (γλυκόζη ή πολυσακχαρίτης), του οποίου πολλά υδροξύλια είναι εστεροποιημένα με διάφορα φαινολικά οξέα, κυρίως με το γαλλικό (γαλλοταννίνες) ή με το διμερές του γαλλικού οξέος, το ελλαγικό οξύ (ελλαγιταννίνες). Δεν περιέχονται στα σταφύλια, αλλά είναι δυνατόν να βρεθούν σε κρασιά, αφού αποτελούν τις κύριες εμπορικές ταννίνες, που χρησιμοποιούνται στις διάφορες κατεργασίες του κρασιού. Τα κρασιά που έχουν παλαιωθεί σε δρύινα βαρέλια εμφανίζουν αυξημένα επίπεδα υδροξυβενζοϊκού οξέος και των παραγώγων του, ειδικά του ελλαγικού οξέος. Το ελλαγικό οξύ παράγεται από την υδρολυτική διάσπαση των ελλαγι-ταννινών που είναι πολυμερή του εξα-υδροδι-φενικού οξέος εστεροποιημένα με γλυκόζη. Οι γαλλοταννίνες αποτελούν μόνο το 5% των ολικών υδρολίσιμων ταννινών του ξύλου του βαρελιού. Περισσότερα για τις υδρολύσιμες ταννίνες, των οποίων αποτελούν παράγωγα οι ενώσεις αυτές, θα αναφερθούν σε επόμενο υποκεφάλαιο. Οι εστέρες του ελλαγικού οξέος μπορούν να ενισχύουν το κόκκινο χρώμα του κρασιού 70

72 σχηματίζοντας έγχρωμα σύμπλοκα ( copigments ) με τις ανθοκυάνες. Η δυνατότητα τους να οξειδώνονται εύκολα τους καθιστά ενεργούς στην κατανάλωση οξυγόνου σε κρασιά που παλαιώνουν σε δρύινα βαρέλια. Η εκχύλιση μη φαινολικών συστατικών σε κρασιά που παλαιώνουν σε ξύλο καστανιάς είναι ελαφρώς διαφορετική με αντίστοιχες ενώσεις να εκχυλίζονται στην περίπτωση αυτή. (Jackson 1998, Ribérau- Gayon et al., 2006) Η υποβάθμιση των λιγνινών της δρυός αποδεσμεύει, ακόμα, διάφορα πτητικά κινναμο-αλδεϋδικά και βενζο-αλδεϋδικά παράγωγα με κύρια τη βανιλίνη, σιναπαλδεΰδη, κονιφεραλδεΰδη και συρινγκαλδεΰδη ενώ εκχυλίζονται και μικρές ποσότητες άλλων φαινολικών όπως η εσκουλίνη και η σκοπολίνη, οι οποίες ανήκουν στις κουμαρίνες. Οι κουμαρίνες αποτελούν παράγωγα του κινναμικού οξέος και σχηματίζονται από την ενδομοριακή εστεροποίηση ενός φαινολικού υδροξυλίοιυ. Η αργή μετατροπή της εσκουλίνης στη λιγότερο πικρή εσκουλετίνη θεωρείται ότι είναι υπεύθυνη κατά ένα μέρος για τη μείωση της πίκρας σε κρασιά που παλαιώνουν σε δρύινα βαρέλια. (Ribérau-Gayon et al., 2006) Ο μεταβολισμός των ζυμών μπορεί να αποδώσει κάποια μη φλαβονοειδή φαινολικά με επικρατέστερη την τυροσόλη και σε μικρότερες ποσότητες την τρυπτοφόλη. Μία επιπλέον κατηγορία πολυφαινολών που υπάρχουν στο κρασί είναι τα στιλβένια. Έχουν δύο βενζολικούς δακτυλίους, συνδεδεμένους με ένα αιθάνιο, ή μπορεί και αιθυλένιο. Μεταξύ αυτών των trans ισομερών συγκαταλέγεται και η ρεσβερατρόλη ή αλλιώς το 3,5,4 -τριυδροξυστιλβένιο, ενώ απαντάται και το παράγωγό της με γλυκόζη. Παράγεται σε περιπτώσεις στρες, όπως μετά από προσβολή από μύκητες. Βρίσκεται στους φλοιούς, όχι στα γίγαρτα, και η περιεκτικότητα των φλοιών διαφέρει από ποικιλία σε ποικιλία. Εκχυλίζεται κυρίως κατά την αλκοολική ζύμωση των ερυθρών οίνων. Η συγκέντρωσή της κυμαίνεται από 1-3 mg/l και έχει διαπιστωθεί πως είναι ευεργετική για την υγεία (Κοτσερίδης, 2006, Ribéreau-Gayon et al., 2006, Dell Agli et al., 2004, Nikfardjam et al., 2006, Schieber et al., Εικ. 13: Το μόριο της ρεσβερατρόλης 71

73 2002). Τα μη φλαβονοειδή του σταφυλιού προέρχονται κυρίως από τη φαινυλανανίνη (Hrazdina et al., 1984) ενώ αυτά που προέρχονται από της ζύμες είναι παράγωγα αιθανικού οξέος (Packter, 1980). 4.3 Φλαβονοειδή Τα φλαβονοειδή είναι μία μεγάλη ομάδα φυσικών μεταβολικών προϊόντων, πολύ διαδεδομένα στα ανώτερα φυτά αλλά και στα βρύα. Επιτελούν ένα πλήθος βιολογικών λειτουργιών στα φυτά όπως προστασία από τη UV ακτινοβολία, ενζυμική διαμόρφωση και προστασία από μολυσματικούς παράγοντες ενώ ως μέρος της ανθρώπινης διατροφής Εικ. 14: Η δομή και η αρίθμηση της συνεισφέρουν θετικά στην υγεία κυρίως λόγω ανθρακικής αλυσίδας του μορίου της αντιοξειδωτικής δράσης και της δέσμευσης των φλαβονοειδών ελευθέρων ριζών. Δομικά, αποτελούνται από έναν C6-C3-C6 σκελετό αποτελούμενο από δύο φαινολικούς δακτυλίους (Α και Β) που ενώνονται με έναν οξυγονωμένο ετεροκυκλικό δακτύλιο (δακτύλιος πυρανίου) (Εικ. 14). Ανάλογα με το αν ο ετερόκυκλος είναι κορεσμένος ή όχι τα φλαβονοειδή μπορούν να ταξινομηθούν σε φλαβανόνες και φλαβάνες, όταν είναι κορεσμένος, και σε ανθοκυάνες, φλαβόνες και φλαβονόλες, όταν είναι ακόρεστος. (Buckingham et al., 2015). Σε κάθε επιμέρους κατηγορία φλαβονοειδών υπάρχει μεγάλη πολυμορφία ενώσεων που οφείλεται στις διάφορες τροποποιήσεις που μπορεί να υποστεί ο κεντρικός σκελετός και μεταξύ αυτών περιλαμβάνονται: Η υδροξυλίωση Η μεθυλίωση ορισμένων φαινολικών υδροξυλίων Η γλυκοζυλίωση με διάφορα σάκχαρα Η ακυλίωση των αλκοολικών υδροξυλο-ομάδων 72

74 Ο πολυμερισμός, ιδιαίτερα στην κατηγορία των φλαβανολών Τα φλαβονοειδή στη φύση εμφανίζονται ως μονομερή, διμερή, ολιγομερή και πολυμερή μόρια. Τα περισσότερα δι-φλαβονοειδή ενώνονται με ένα δεσμό άνθρακαάνθρακα δύο όμοιων μονομερών, αλλά έχουν βρεθεί και διμερή διαφορετικών ενώσεων (φλαβονολο-φλαβανόνες). Τα υψηλότερου μοριακού βάρους φλαβονοειδή αποτελούν τα ολιγομερή και πολυμερή των προανθοκυανιδινών, οι οποίες πρέρχονται από τις φλαβαν-3-όλες. Συνήθως, τα περισσότερα φλαβονοειδή εμφανίζονται ενωμένα με σάκχαρα σε εστερική μορφή ως μονογλυκοζίτες, διγλυκοζίτες κλπ., ενώ ακετυλιωμένοι Ο-γλυκοζίτες προκύπτουν από την ένωση φλαβονοειδών με φαινολικά οξέα. Τα φλαβονοειδή του σταφυλιού εμφανίζουν υδροξύλια (-ΟΗ) στους άνθρακες C5 και C7 του Α-δακτύλιου και στη θέση 4 του Β-δακτύλιου. Μπορούν ακόμα να έχουν υδροξύλια (-ΟΗ) στις θέσεις 3 ή 3 και 5 και υποκατεστημένο το υδροξύλιο της θέσης 3 από κάποιον γλυκοζίτη ή μια ακυλομάδα. Στο κρασί, τα πιο κοινά φλαβονοειδή αποτελούν οι φλαβονόλες, οι φλαβαν-3-όλες και οι ανθοκυάνες, ενώ σε μικρότερες ποσότητες υπάρχουν φλαβαν-3,4-διόλες (λευκοανθοκυάνες) (Cheynier, 2006, Terrier et al., 2009) Φλαβονόλες Οι φλαβόνες είναι μια υπο-κατηγορία των πολυ-υδροξυ-φλαβονοειδών που βασίζονται στη δομή της 2-φαινυλο-χρωμόνης (2-3 διπλός δεσμός). Οι φλαβονόλες είναι φλαβόνες με έναν 3-υδροξυ-υποκαταστάτη. 73

75 Εικ. 15: Οι φλαβονόλες του κρασιού Αποτελούν κίτρινες χρωστικές, οι οποίες στο σταφύλι εντοπίζονται στο φλοιό είτε ως 3-γλυκοζίτες και 3-γλυκουρονίδια των μορίων της κερκετίνης, της καιμπφερόλης, και της μυρισετίνης, είτε και υδρολυμένα στις αντίστοιχες αγλυκόνες (Εικ. 15). Και οι 3 παραπάνω φλαβονόλες έχουν εντοπιστεί στα ερυθρά κρασιά ενώ στα λευκά έχουν ανιχνευτεί μόνο η κερκετίνη και η καιμπφερόλη. Επιπλέον τα τελευταία χρόνια σε κόκκινα κρασιά έχουν ανιχνευτεί 3 επιπλέον φλαβονόλες: η ισοραμνετίνη (5 μεθόξυ), η λαρικιτρίνη (3 υδροξυ, 5 μεθόξυ) και η συριγκετίνη (3, 5 διμεθόξυ). Στο κρασί οι φλαβονόλες παίρνουν μέρος στη δημιουργία έγχρωμων συμπλόκων ( copigments ) με τις ανθοκυάνες. Η βασική λειτουργία τους είναι να προστατεύουν τη σάρκα από τη UV ακτινοβολία όπως έχει προαναφερθεί. (Cheynier 2006, Ribérau- Gayon et al., 2006). Μεταξύ των φλαβονοειδών του κρασιού, οι φλαβονόλες βρίσκονται στη μικρότερη συγκέντρωση, σε ποσοστό που ποικίλει από 1-10% του συνολικού φαινολικού περιεχομένου και εξαρτάται από τις συνθήκες καλλιέργειας. Οι αντίστοιχες συγκεντρώσεις τους είναι της τάξης των 100 mg/l στα ερυθρά και 1-3 mg/l στα λευκά απουσία εκχύλισης (Jackson, 1998) Ανθοκυανιδίνες και Ανθοκυάνες Ο όρος ανθοκυάνες ή ανθοκυανίνες αναφέρεται σε γλυκοζυλιωμένες ανθοκυανιδίνες, οι οποίες είναι οι κόκκινες χρωστικές του κρασιού και απαντώνται σχεδόν πάντα στο 74

76 κρασί γλυκοζυλιωμένες. Οι ανθοκυανιδίνες έχουν τη βασική δομή του φλαβυλίου, με σκελετό C6-C3-C6. Το μόριο τους αποτελείται από δύο βενζολικούς δακτύλιους (Α και Β) και ενδιάμεσα παρεμβάλεται ένας πυρυλικός δακτύλιος. Ο δακτύλιος Α φέρει πάντα δύο φαινολικά υδροξύλια στις θέσεις -5 και -7 και ο δακτύλιος Β ένα φαινολικό υδροξύλιο στη θέση -4 (Εικ. 16). Οι ανθοκυάνες είναι ετεροζίτες των ανθοκυανιδινών με αλδόζες, κυρίως γλυκόζη. Τα μόρια είναι πιο σταθερά στη γλυκοζυλιωμένη μορφή των ανθοκυανών σε σχέση με την αγλυκονική μορφή των ανθοκυανιδινών, γι αυτό και απαντώνται κυρίως ως ανθοκυάνες στη φύση. Οι ανθοκυάνες αποτελούν μία από τις πιο βασικές ομάδες φλαβονοειδών υπεύθυνες, στο μεγαλύτερο ποσοστό, για το ερυθρό χρώμα των κρασιών. Εντοπίζονται κυρίως στον φλοιό των σταφυλιών και σε περιορισμένες περιπτώσεις, κυρίως σε κάποιες ερυθρές ποικιλίες και στη σάρκα τους γι αυτό και η μελέτη τους επικεντρώνεται στα ερυθρά κρασιά στα οποία εκχυλίζονται από τα στέμφυλα. Εικ. 16: Δομή του μορίου των ανθοκυανιδινών Σε σταφύλια V. Vinifera έχουν ταυτοποιηθεί μόνο μονογλυκοζυλιωμένες και ακυλιωμένες μορφές των ανθοκυανών. Στις τελευταίες, η ακυλίωση λαμβάνει χώρα με p-κουμαρικό, καφεϊκό ή οξικό οξύ. Η κατάταξη των ανθοκυανών γίνεται με βάση τη θέση των υδροξυλίων και των μεθυλίων στο Β δακτύλιο των ανθοκυανιδινών. Από τις εννέα (9) ανθοκυανιδίνες που είναι γνωστές, οι πέντε (5) που παρουσιάζονται στην Εικ. 16 αποτελούν δομικά στοιχεία των ανθοκυανών που βρίσκονται στο σταφύλι και το κρασί (Κουράκου, 1998, Ribérau-Gayon et al., 2006). 75

77 Από τις ανθοκυανιδίνες των σταφυλιών η κυανιδίνη είναι αυτή που βρίσκεται σε μεγαλύτερη αναλογία μετά τον περκασμό των σταφυλιών, με τη συγκέντρωσή της να αυξάνεται για περίπου δύο βδομάδες κατά την ωρίμανση. Επειδή όμως σε συνδυασμό με τη δελφινιδίνη αποτελούν τις πιο ασταθείς από τις προκυανιδίνες στη συνέχεια μετασχηματίζονται και τελικά επικρατεί σε συντριπτικό ποσοστό η μαλβιδίνη, η οποία αποτελεί τη βασική ανθοκυανιδίνη σχεδόν όλων των σταφυλιών και κρασιών. Σε ορισμένες Εικ. 17 Η γλυκοζυλιωμένη (a) και η ακυλιωμένη (b) δομή του μορίου μιας ανθοκυανιδίνης ποικιλίες φτάνει να αντιπροσωπεύει το 90% των περιεχόμενων ανθοκυανών, όπως για παράδειγμα στην ποικιλία Grenache (Cheynier, 2006). Στις ελληνικές ερυθρές ποικιλίες συνήθως απαντάται ο μονογλυκοζίτης-3 της μαλβιδίνης, ελεύθερος και ακυλιωμένος είτε με οξικό είτε με p-κουμαρικό οξύ (Κουράκου, 1998). Στην ποικιλία Αγιωργίτικο συγκεκριμένα έχουν ταυτοποιηθεί και οι δύο ακυλιωμένες μορφές της μαλβιδίνης (Kallithraka, 2006). Η σύσταση και η συγκέντρωση σε ανθοκυανιδίνες ποικίλει ανάλογα με την ποικιλία, την ωρίμανση των σταφυλιών, τις κλιματικές συνθήκες, την εντοπιότητα, τη στρεμματική απόδοση και τις συνθήκες καλλιέργειας. Παράλληλα εξαρτώνται και από τις συνθήκες εκχύλισης και οινοποίησης. Κατά την επαφή των στεμφύλων με το γλεύκος, πραγματοποιείται η εκχύλιση των ανθοκυανών και των λοιπών φαινολικών. Η εκχύλιση αυτή μπορεί να λάβει χώρα προζυμωτικά ή κατά την αλκοολική ζύμωση είτε με θρυμματισμένα σταφύλια (κλασσική οινοποίηση) είτε με ολόκληρα σταφύλια (carbonic maceration). Αφού φτάσει σε ένα μέγιστο, η συγκέντρωση των ανθοκυανών αρχίζει να μειώνεται σαν αποτέλεσμα της ρόφησης τους στα κυτταρικά τοιχώματα των ζυμών, της ιζηματοποίησης τους σε μορφή κολλοειδών μαζί με τρυγικά άλατα 76

78 καθώς και της διαδικασίας σταθεροποίησης και φιλτραρίσματος. Επιπλέον, αντιδράσεις υδρόλυσης καθώς και αντιδράσεις συμπύκνωσης με άλλα φαινολικά συστατικά κατά την οινοποίηση διαφοροποιούν την ανθοκυανική σύσταση όπως θα αναφερθεί αναλυτικά σε επόμενο υποκεφάλαιο. Το ανθοκυανικό προφίλ του σταφυλιού, σε αντίθεση με το ολικό φαινολικό περιεχόμενο, μπορεί να αποτελέσει κριτήριο για τη χημειο-ταξινόμηση των ποικιλιών. Σχέσεις μεταξύ μεμονομένων ή και ολικής συγκέντρωσης των επιμέρους ανθοκυανιδινών έχουν προταθεί για τον χαρακτηρισμό της ποικιλίας σταφυλιού από την οποία προέρχεται το κρασί. Οι σχέσεις αυτές έχουν να κάνουν με την ενζυμική δραστικότητα των φλαβονοειδο-3-υδροξυλασών και Ο-δι-υδροξυφαινυλο-Ομεθυλοτρανσφερασών. Ένας άλλος τρόπος ταξινόμησης βασίζεται στην παρουσία και σχετική ποσοτικοποίηση ακυλυωμένων ανθοκυανών με οξικό και p-κουμαρικό οξύ, που σχετίζονται με τη δραστικότητα των αιθυλο- και κινναμικών τρανσφερασών. Η παραγωγή των παραπάνω ενζύμων καθορίζεται αυστηρά από την ποικιλία του σταφυλιού, αφού αποτελούν άμεση έκφραση του γονιδιώματος. Παρά τις μεταβολές στο ανθοκυανικό προφίλ κατά την οινοποίηση των κρασιών, το ανθοκυανικό προφίλ του κρασιού χρησιμοποιείται επίσης ως χημειο-ταξινομικό κριτήριο για τη διάκριση διαφορών μεταξύ ποικιλιών, εντοπιότητας, απόδοσης, χρονολογίας και οινοποιητικών τεχνικών (Monagas & Bartolomé, 2009) Φλαβαν-3-όλες (κατεχίνες) και προκυανιδίνες Ο όρος φλαβανόλες και ο όρος φλαβαν-3-όλες είναι ταυτόσημος (στην οινική βιβλιογραφία) και εμπεριέχει όλα τα μονομερή, ολιγομερή και πολυμερή φλαβονοειδή του κρασιού που εμπεριέχουν τουλάχιστον ένα μόριο φλαβανόλης (π.χ. κατεχίνης) στο μόριό τους. (Buckingham et al., 2015). Οι προανθοκυανιδίνες είναι υποσύνολο των φλαβανολών και αποτελούνται από ολιγομερή αυτών, που περιέχονται στους φλοιούς και στα κουκούτσια των σταφυλιών και εκχυλίζονται στο κρασί κατά τη διεργασία της οινοποίησης. 77

79 Οι προανθοκυανιδίνες χωρίζονται σε προκυανιδίνες ή προδελφινιδίνες, με βάση την ανθοκυάνη που προκύπτει κατά τη διάσπασή τους υπό όξινες συνθήκες. Η πιο ευρέως διαδεδομένη φλαβαν-3-όλη είναι η κατεχίνη, από το όνομα τις οποίας έχει επικρατήσει να χαρακτηρίζονται και όλες οι φλαβαν- 3-όλες ως κατεχίνες. Στο κρασί εμφανίζονται ως μονομερή, ολιγομερή και πολυμερή (Terrier et al., 2009). Στο σταφύλι εντοπίζονται κυρίως Εικ. 18: Τα μόρια των φλαβαν-3-ολών στα στους φλοιούς και στα γίγαρτα, ενώ σε σταφύλια ίχνη έχουν εντοπιστεί και στη σάρκα. Τα βασικά μονομερή των φλαβαν-3-ολών αποτελούν η (+)-κατεχίνη, η (-)- επικατεχίνη και ο (-)-3-γαλλικός εστέρας της επικατεχίνης (Εικ. 18). Επιπλέον, έχει ανιχνευτεί γαλλο-κατεχίνη σε σταφύλια V. Vinifera καθώς και άλλα μονομερή σε σταφύλια που δεν προέρχονται από το γένος Vinifera (Cheynier, 2006). Οι προανθοκυανιδίνες είναι μια ομάδα ολιγομερών φλαβαν-3-ολών που προέρχονται από τον πολυμερισμό των έντονα ευοξείδωτων κατεχινών. Η ονομασία τους οφείλεται στο ότι κατά τη θέρμανση τους και υπό την παρουσία ανόργανων οξέων, αποσυντίθενται παράγοντας έγχρωμες ανθοκυανιδίνες. Επιπλέον, έχουν την ιδιότητα να προσδένονται στις πρωτεΐνες. Η πιο γνωστή ομάδα προανθοκυανιδινών είναι οι προκυανιδίνες, που αποτελούνται από μονομερή κατεχίνης και επικατεχίνης και με τη σειρά τους διασπώνται παράγοντας κυανιδίνη κατά τη θέρμανση τους υπό την παρουσία ανόργανων οξέων. Αντίστοιχα, οι προδελφινιδίνες υπό τις ίδιες συνθήκες παράγουν δελφινιδίνη (Buckingham et al., 2015). Στο σταφύλι έχουν ανιχνευτεί μέχρι τετραμερείς προκυανιδίνες ενώ στο κρασί συνήθως εμφανίζονται διμερή. Οι προανθοκυανιδίνες που περιέχονται στο κρασί είναι, κατά κύριο λόγο, διμερή που ενώνονται συνήθως με έναν ομοιοπολικό δεσμό άνθρακα-άνθρακα στη θέση 8 του ενός μονομερούς με τον άνθρακα της θέσης 4 ενός 78

80 γειτονικού μονομερούς και ονομάζονται τύπου Β (Εικ. 19). Εκτός αυτών, έχουν ταυτοποιηθεί και τριμερή καθώς και διμερή που προέρχονται τόσο από προκυανιδινικά όσο και από προδελφινιδικά μονομερή (Cheynier, 2006, Terrier et al., 2009). Κατά την αποθήκευση και παλαίωση των κρασιών οι προκυανιδίνες ενώνονται μεταξύ τους και σχηματίζουν πολυμερή που αποτελούνται από 3-10 μονομερή φλαβανολών, μοριακού βάρους που είναι γνωστά και ως συμπυκνωμένες ταννίνες. Οι συμπυκνωμένες ταννίνες δεν θα πρέπει να συγχέονται με τις υδρολύσιμες ταννίνες που αναφέρθηκαν προηγουμένως και ανήκουν στα μη φλαβονοείδη. Οι ταννίνες παίζουν καθοριστικό ρόλο στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του κρασιού και θα αναλυθούν περαιτέρω σε παρακάτω υποκεφάλαιο. 79

81 Εικ. 19: Τα A και B τύπου, διμερή και τριμερή των φλαβαν-3-ολών του σταφυλιού και του κρασιού 80

82 4.3.4 Ταννίνες Οι ταννίνες αποτελούν μια κατηγορία φυσικών φαινολικών συστατικών υψηλού μοριακού βάρους, για τις οποίες δεν υπάρχει ένας αυστηρός ορισμός, και που αποτελούνται τόσο από φλαβονοειδή όσο και από μη φλαβονοειδή μονομερή. Οι ταννίνες χωρίζονται σε συμπυκνωμένες και σε υδρολύσιμες, ομαδοποίηση που αφορά στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά που προσδίδουν, αλλά σε καμία περίπτωση στη χημική δομή, προέλευση, εξέλιξη, κλπ. Μία επί πλέον ομάδα είναι οι μικτές ή πολύπλοκες ταννίνες που προέρχονται από συνέννωση μορίων των δύο παραπάνω ομάδων. Η κοινή ιδιότητα των ταννινών είναι η ικανότητα τους να ενώνονται με πρωτεΐνες και άλλα πολυμερή όπως οι πολυσακχαρίτες. Η ένωση αυτή πραγματοποιείται είτε με υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις είτε μέσω δεσμών υδρογόνου. Σε ορισμένες περιπτώσεις δημιουργούνται και ιοντικοί ή ομοιοπολικοί δεσμοί (Κουράκου, 1998). Με τον όρο συμπυκνωμένες ταννίνες εννοείται το σύνολο των μακρομορίων που προκύπτουν κατά την παλαίωση του οίνου μέσω της συνένωσης των προανθοκυανιδινών μεταξύ τους, καθώς και με άλλα μόρια, προς σχηματισμό πολυμερών με μήκος από 8 έως 14 μονομερή και μοριακό βάρος 2000 έως Από την άλλη οι υδρολύσιμες ταννίνες ανήκουν στα μη φλαβονοειδή και αποτελούνται από ένα μόριο σακχάρου (γλυκόζη ή πολυσακχαρίτης), του οποίου πολλά υδροξύλια είναι εστεροποιημένα με διάφορα φαινολικά οξέα, κυρίως με το γαλλικό (γαλλοταννίνες) ή με το διμερές του γαλλικού οξέος, το ελλαγικό οξύ (ελλαγιταννίνες). Δεν περιέχονται στα σταφύλια, αλλά είναι δυνατόν να βρεθούν σε κρασιά, αφού αποτελούν τις κύριες εμπορικές ταννίνες, που χρησιμοποιούνται στις διάφορες κατεργασίες του κρασιού. Η δομή και ο όγκος των ταννινών επηρεάζει σε σημαντικό βαθμό τη δραστικότητα τους με τις πρωτεΐνες. Πρέπει, από τη μία, να είναι αρκετά ογκώδεις ώστε να σχηματίζουν σταθερές ενώσεις με τις πρωτεΐνες ενώ, από την άλλη, ο όγκος τους δεν θα πρέπει να τις αποτρέπει από το να πλησιάζουν στα σημεία σύνδεσης με τις πρωτεΐνες. Τα μοριακά βάρη των ενεργών ταννινών εκτείνονται περίπου στο εύρος (Jackson, 1998). 81

83 Συμπυκνωμένες ταννίνες Οι συμπυκνωμένες ταννίνες, γενικά, αποτελούν πολυμερή των κατεχινών. Στο σταφύλι υπάρχουν διαφορετικά είδη ταννινών στους βόστρυχους, τα γίγαρτα και τους φλοιούς. Οι ταννίνες των φλοιών, με τη σειρά τους, μπορούν να χωριστούν σε τρεις υπό-κατηγορίες: Τις ταννίνες που βρίσκονται στα χυμοτόπια, οι οποίες σχηματίζουν πυκνά συμπλέγματα στα κύτταρα που βρίσκονται κοντά στην επιδερμίδα. Η συγκέντρωση σε ταννίνες αυξάνεται ακτινικά προς τα εξωτερικά στρώματα του φλοιού. Τις ταννίνες που είναι ισχυρά ενωμένες με την πρωτεϊνο-φωσφολιπιδική μεμβράνη (τονοπλάστης) και είναι ευαίσθητες στους υπερήχους. Τις ταννίνες που είναι ενωμένες με το κυτταρικό τοίχωμα κυτταρίνης πηκτίνης (Ribérau-Gayon et al., 2006). Οι ταννίνες του σταφυλιού διαφέρουν μεταξύ τους ως προς τον βαθμό πολυμερισμού. Οι ταννίνες των γιγάρτων είναι προκυανιδίνες με σχετικά μικρό βαθμό πολυμερισμού ενώ οι ταννίνες των φλοιών έχουν πιο πολύπλοκες δομές και δεν παρουσιάζουν ιδιαίτερη διαφοροποίηση ως προς το βαθμό πολυμερισμού τους. Ο φλοιός του σταφυλιού είναι πλούσιος σε επιγαλλοκατεχίνες σε αντίθεση με τα γίγαρτα τα οποία έχουν μεγαλύτερες συγκεντρώσεις γαλλικού εστέρα της επικατεχίνης (Cheynier, 2006). Στο κρασί οι προκυανιδίνες οξειδώνονται παράγοντας ολιγομερή σχετικά μικρού μοριακού βάρους που μπορούν να χαρακτηριστούν ως ταννίνες. Όταν υπόκεινται όμως σε μη οξειδωτική συμπύκνωση σχηματίζονται συμπυκνωμένες ταννίνες που έχουν βαθμό συμπύκνωσης περίπου 10 και μοριακό βάρος , μέγεθος που αντιστοιχεί στο μέγιστο τανικό χαρακτήρα. Οι συμπυκνωμένες αυτές ταννίνες αντιπροσωπεύουν το 30-60% των ολικών φαινολικών παραγώγων και το ποσοστό τους αυξάνεται με την ηλικία του κρασιού (Κουράκου, 1998). Κατά την παλαίωση, οι προκυανιδίνες πολυμερίζονται περαιτέρω προς ταννίνες μοριακού 82

84 βάρους από ως πάνω από 5.000, πάνω στις οποίες συνδέονται και άλλα μόρια με αποτέλεσμα να χάνουν σταδιακά τη δραστικότητα τους επί των πρωτεϊνών. Η ανάλυση όλων των διαφορετικών μορίων συμπυκνωμένων ταννινών είναι ιδιαίτερα δύσκολη λόγω του μεγάλου εύρους δομών τους που οφείλεται στο πλήθος των υποκατεστημένων υδροξυλίων, τη θέση τους στο δακτύλιο, τη στερεοχημεία των ασύμμετρων ανθράκων στον δακτύλιο του πυρανίου καθώς και στον αριθμό και είδος των δεσμών των βασικών ομάδων. Η ποικιλομορφία αυτή μπορεί να εξηγήσει την ύπαρξη ταννινών με διαφορετικά χαρακτηριστικά και ειδικά όσον αφορά στα οργανοληπτικά τους χαρακτηριστικά (Ribérau-Gayon et al., 2006). Υδρολύσιμες ταννίνες Οι υδρολύσιμες ταννίνες προέρχονται από τα μη φλαβονοειδή. Αποτελούνται από ένα μόριο σακχάρου, κυρίως γλυκόζης ή ένα μόριο πολυσακχαρίτη του οποίου πολλά υδροξύλια είναι εστεροποιημένα με διάφορα φαινολικά οξέα, όπως το γαλλικό (γαλλοταννίνες), το διγαλλικό και το ελαγγικό (ελλαγιταννίνες) (Κουράκου, 1998). Παίζουν σημαντικό ρόλο κατά την παλαίωση λευκών και κόκκινων κρασιών λόγω της ικανότητάς τους να οξειδώνονται (Vivas & Glories, 1996) και λόγω των γευστικών χαρακτηριστικών τους (Pocock t al., 1994). Οι ταννίνες αυτές δεν βρίσκονται στο σταφύλι αλλά απαντώνται στο ξύλο ορισμένων δέντρων όπως της δρυός. Για το λόγο αυτό στα κρασιά απαντώνται μόνο τα υδρολυμένα παραγωγά τους, κυρίως το ελλαγικό και γαλλικό οξύ. Οι υδρολυόμενες ταννίνες, όμως αποτελούν τις βασικές εμπορικές ταννίνες που επιτρέπονται ως πρόσθετα του οίνου και μπορούν να υπάρχουν σε μικρές συγκεντρώσεις στο κρασί, αν το τελευταίο έχει υποστεί κολλάρισμα με προσθήκη οινολογική ταννίνης. Τα δύο κύρια ισομερή της ελλαγιταννίνης της δρυός είναι η βεσκαλαγίνη και η κασταλαγίνη με μοριακό βάρος 934, ενώ δευτερεύουσας σημασίας είναι η γρανδανίνη και η ρομπουρίνη. Η μερική υδρόλυση της κασταλαγίνης και της βεσκαλαγίνης με απώλεια εξα-υδροξυ-διφενικού οξέος παράγει βεσκαλίνη και κασταλίνη. Τα διάφορα αυτά μόρια είναι υδατοδιαλυτά αλλά διαλύονται επίσης γρήγορα και σε αραιά αλκοολικά διαλύματα όπως είναι το κρασί. Η σύσταση των 83

85 ελλαγιτανικών εκχυλισμάτων εξαρτάται από το είδος της δρυός. Τέσσερα μονομερή και τέσσερα διμερή ελλαγιταννινών περιέχονται στα ευρωπαϊκά είδη, ενώ τα αμερικανικά είδη δρυός δεν περιλαμβάνουν διμερή ελλαγιταννινών (Jackson 1998, Ribérau-Gayon et al., 2006). Οι μη φλαβονοειδείς υδρολύσιμες ταννίνες διασπώνται εύκολα στα μονομερή τους υπό όξινες συνθήκες. Το χαμηλό ph αποδυναμώνει το δεσμό ανάμεσα στα άτομα υδρογόνου και οξυγόνου του μακρομορίου. Αντίθετα, οι συμπυκνωμένες ταννίνες, που προέρχονται από τα φλαβονοειδή, είναι πιο σταθερές σε όξινες συνθήκες αφού σε αυτές συμμετέχουν ομοιοπολικοί δεσμοί. Μικτές ταννίνες Ο όρος μικτές η πολύπλοκες ταννίνες χρησιμοποιείται για να περιγράψει την κατηγορία των πολυφαινολών στις οποίες ένα μονομερές κατεχίνης, δομικό συστατικό των συμπυκνωμένων ταννινών συνδέεται με μια υδρολυόμενη γαλλο- ή ελλαγιταννίνη μέσω ενός δεσμού άνθρακα-άνθρακα. Ένας σημαντικός αριθμός των ουσιών αυτών έχει αναφερθεί ύστερα από την πρώτη τους εμφάνιση (Ferreira et al., 2006). Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η Α ακουτισιμίνη (Acutissimin A) που απομονώθηκε από το ξυλώδες μέρος του φυτού Castanea sativa και είναι ένα ομοιοπολικό σύμπλοκο της κατεχίνης με την κασταλαγίνη ή τη βεσκαλαγίνη. Τέτοιου είδους ενώσεις σε συνδυασμό με σύμπλοκα κασταλαγίνης-μαλβιδίνης είναι παρόντα σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις σε κρασιά που έχουν παλαιώσει σε ξύλινα βαρέλια. Οι οργανοληπτικές τους ιδιότητες δεν έχουν αναλυθεί ακόμα (Ribérau-Gayon et al., 2006). 84

86 5 Μεταβολές φαινολικών συστατικών και η επίδρασή τους στο χρώμα και στα άλλα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του κρασιού 5.1 Παραλαβή φαινολικών συστατικών κατά την οινοποίηση Εκχύλιση των φαινολικών συστατικών από το σταφύλι Παρόλο που το ίδιο το γλεύκος περιέχει φαινολικά συστατικά, η ποσότητά τους αυξάνεται σημαντικά στο κρασί λόγω της αυξημένης διαλυτότητας τους σε αιθανολικά διαλύματα σε σχέση με τα καθαρά υδατικά διαλύματα. Η σύσταση σε φαινολικά συστατικά επιδρά σημαντικά στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά (χρώμα, γεύση, στυφότητα) του κρασιού και στις δυνατότητες παλαίωσής του. Για το λόγο αυτό οι οινοποιητικές τεχνικές που χρησιμοποιούνται και οι παράμετροι τους επιλέγονται με κύριο σκοπό να αποδώσουν μια επιθυμητή φαινολική σύσταση στο τελικό προϊόν (Kennedy & Peyrot des Gachons, 2003). Καθώς η μεγάλη πλειοψηφία των φαινολικών συστατικών (με εξαίρεση τα μη φλαβονοειδή) συγκεντρώνεται στα στερεά μέρη του σταφυλιού, η εκχύλιση τους στο γλεύκος εξαρτάται αρχικά από το διάρκεια παραμονής των στεμφύλων με το γλεύκος. Ενώ στη λευκή οινοποίηση η διαδικασία αυτή μπορεί να μην πραγματοποιείται, για την ερυθρή οινοποίηση είναι απαραίτητη η εκχύλιση των ανθοκυανών από τους φλοιούς των ραγών για την πρόσδοση κόκκινου χρώματος. Στην ερυθρή οινοποίηση, η διάχυση των φαινολικών ξεκινά κατά την έκθλιψη των σταφυλιών και συνεχίζεται μέχρι το διαχωρισμό των στεμφύλων από το γλεύκος. Επομένως, ο ρυθμός διάχυσης κάθε επιμέρους ομάδας φαινολικών συστατικών εξαρτάται τόσο από τη διαλυτότητά τους όσο και από τη θέση τους στο σταφύλι. Εκτός από τους δύο αυτούς βασικούς παράγοντες, η εκχύλιση των φαινολικών εξαρτάται από ένα σύνολο επιπλέον παραμέτρων, που περιλαμβάνουν τη συγκέντρωση σε αλκοόλη και θειώδη ανυδρίτη της υγρής φάσης, τη θερμοκρασία, το βαθμό ομογενοποίησης του γλεύκους καθώς και άλλους παράγοντες που θα αναλυθούν στη συνέχεια (Cheynier, 2006). Η γενική κατανομή των φαινολικών στο σταφύλι εκτιμάται ότι είναι η ακόλουθη: 85

87 Πίν. 6: Κατανομή φαινολικών στα μέρη του σταφυλιού Μέρος του σταφυλιού ποσοστό των ολικών φαινολικών (%) Σάρκα και χυμός 6 Φλοιός της ρόγας 51 Γίγαρτα 40 (Singleton & Esau, 1969) Τα φαινολικά οξέα και τα παράγωγά τους, που είναι τα μόνα φαινολικά συστατικά που βρίσκονται σε σημαντικές συγκεντρώσεις στη σάρκα του σταφυλιού, είναι τα πρώτα που εκχυλίζονται. Το ίδιο γρήγορα αρχίζουν να εκχυλίζονται και οι ανθοκυάνες. Ο ρυθμός εκχύλισης τους είναι μεγάλος τις πρώτες μέρες της εκχύλισης και στη συνέχεια μειώνεται. Σε εκτεταμένη εκχύλιση έχει παρατηρηθεί ότι, είτε το ανθοκυανικό περιεχόμενο δεν αυξάνεται σημαντικά μετά από κάποιες μέρες εκχύλισης, είτε ότι μειώνεται λόγω αντιδράσεων των ανθοκυανών, ανάλογα με τις παραμέτρους οινοποίησης. Η συγκέντρωση των ανθοκυανών στο γλεύκος αυξάνεται γρήγορα λόγω της διάχυσης των γλυκοζιτών της μαλβιδίνης και των μη ακυλιωμένων γλυκοζιτών των υπόλοιπων ανθοκυανών που διαχέονται γρηγορότερα από τους αντίστοιχους ακετυλιωμένους και κουμαριλιωμένους γλυκοζίτες. Στη συνέχεια, τα σχετικά ποσοστά των μη ακυλιωμένων μορφών μειώνονται κατά τη διάρκεια των πρώτων ημερών της εκχύλισης, και αυτά των ακετυλιωμένων και των κουμαριλιωμένων γλυκοζιτών αυξάνονται (González-Neves et al., 2007, Puértolas et al., 2011). Η ανάλυση με σύστημα HPLC μετά από θειόλυση, έχει δείξει ότι οι προανθοκυανιδίνες των φλοιών εκχυλίζονται γρηγορότερα από τις αντίστοιχες των γιγάρτων, εξαιτίας τόσο της θέσης τους στη στερεή φάση όσο και της υψηλότερης διαλυτότητας σε υδατική φάση των προδελφινιδών σε σχέση με τις εστεροποιημένες προκυανιδίνες. Η εκχύλιση των προκυανιδινών από τα γίγαρτα ξεκινά μετά από μια λανθάνουσα φάση, όταν αρχίσει να αυξάνεται και η περιεκτικότητα σε αλκοόλη. Τα πολυμερή μεγάλου μοριακού βάρους διαχέονται με μικρότερο ρυθμό από τα αντίστοιχα χαμηλότερου μοριακού βάρους με αποτέλεσμα το μέσο μήκος αλυσίδας 86

88 να αυξάνεται συναρτήσει του χρόνου εκχύλισης. Τέλος, και οι φλαβονόλες εκχυλίζονται σχετικά αργά, και για το λόγο αυτό βρίσκονται σε σημαντικές συγκεντρώσεις μόνο στα γλεύκη που έχουν παραμείνει για εκτεταμένο χρονικό διάστημα διάστημα σε επαφή με τα στέμφυλα (Κουράκου, 1998, Cheynier, 2006, Jackson, 2008) Παράγοντες που επηρεάζουν την εκχύλιση των φαινολικών Χρόνος παραμονής των στεμφύλων με το γλεύκος Κατά την παραμονή του γλεύκους με τα στέμφυλα, οι ανθοκυάνες των φλοιών διαχέονται ταχύτατα στο γλεύκος ήδη από τις πρώτες μέρες της αλκοολική ζύμωσης και στη συνέχεια ο ρυθμός εκχύλισης τους μειώνεται ενώ τα ολικά φαινολικά συνεχίζουν να διαχέονται στο γλεύκος καθ όλη τη διάρκεια της παραμονής του με τα στέμφυλα. Η διαφορά αυτή στην εκχύλιση οφείλεται στο ότι οι ανθοκυάνες που είναι ευδιάλυτες και σε υδατικά διαλύματα βρίσκονται αποκλειστικά στα χυμοτόπια των κυττάρων των φλοιών, στις 3-4 εξωτερικές σειρές κυττάρων από όπου διαχέονται εύκολα στο γλεύκος μόλις τα κύτταρα υποστούν πλασμόλυση (Κουράκου, 1998). Έχει αποδειχθεί ότι παραμονή των στεμφύλων με το γλεύκος 10 ημερών έναντι 5 ημερών αυξάνει τη συγκέντρωση των κρασιών τόσο σε ανθοκυάνες όσο και σε ταννίνες, ενώ τα κρασιά στα οποία πραγματοποιήθηκε η μεγαλύτερου χρόνου παραμονή εμφάνισαν περισσότερα χρωστικά πολυμερή μετά από ένα χρόνο αποθήκευσης σε φιάλη. Η μεγαλύτερη αύξηση σε ανθοκυάνες πραγματοποιήθηκε μεταξύ 4 ης και 5 ης μέρας εκχύλισης, με μικρή επί πλέον αύξηση μετά από τις 10 ημέρες (Gomez-Plaza et al., 2001). Έρευνα σε μικρής κλίμακας οινοποιητή έδειξε μεγαλύτερη ποσότητα ανθοκυανών σε φρέσκο κρασί στο οποίο είχε γίνει παρατεταμένη εκχύλιση και μεγαλύτερο φορτίο ολικών φαινολικών καθ όλη την αποθήκευση του κρασιού σε σχέση με το ίδιο κρασί στο οποίο είχε γίνει εκχύλιση μικρότερου χρόνου (Scudamore-Smith et al., 1990). Η μελέτη εκχύλισης σε Cabernet Sauvignon για 7, 13 και 21 ημέρες έδειξε ότι τα ολικά φαινολικά, το γαλλικό οξύ και οι φλαβανόλες αυξήθηκαν όλα με μεγαλύτερο χρόνο παραμονής με τα στέμφυλα ενώ η αύξηση σε ολικά φαινολικά και φλαβανόλες ήταν 87

89 μεγαλύτερη ανάμεσα στις 13 και 21 μέρες έναντι της διαφοράς μεταξύ 7 και 13 ημερών (Auw et al., 1996). Σε έρευνα της ποικιλίας Merlot η αύξηση ολικών φαινολικών συνεχίστηκε για 36 ημέρες ενώ οι χρωστικές ουσίες εμφάνισαν μέγιστο την 4 η μέρα και στη συνέχεια υπήρξε αργή σταδιακή μείωση τους (Yokotsuka et al., 2000). Ο βέλτιστος χρόνος παραμονής των στεμφύλων εξαρτάται από την ποικιλία του σταφυλιού, το βαθμό ωρίμανσης και από τα επιδιωκόμενα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του οίνου. Υπάρχουν ελάχιστα δημοσιευμένα αποτελέσματα για τις Ελληνικές ποικιλίες, ενώ επιπλέον ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η μέτρηση των φαινολικών κατηγοριών με διαφορετικές μεθόδους (π.χ. χρωματογραφία έναντι απλής φασματοφωτομέτρησης), μιας και πολλές φορές οι διαφορετικοί τρόποι μέτρησης των φαινολικών οδηγούν σε εν μέρει αντικρουόμενα αποτελέσματα στη βιβλιογραφία. Για τους παραπάνω λόγους η εκχύλιση των διαφορετικών κατηγοριών φαινολικών μελετήθηκε συστηματικά στην παρούσα διατριβή. Θερμοκρασία αλκοολικής ζύμωσης Γενικά με αύξηση της θερμοκρασίας αυξάνεται το ολικό φαινολικό περιεχόμενο που εκχυλίζεται στο κρασί. Κρασιά που παράχθηκαν από Cabernet Sauvignon και Pinot Noir είχαν μεγαλύτερη ένταση χρώματος με αύξηση της θερμοκρασίας ζύμωσης (Sacchi et al., 2005). Αν και το ανθοκυανικό περιεχόμενο δεν παρουσιάζει σημαντικές διαφορές, το ολικό φαινολικό περιεχόμενο αυξάνεται με αύξηση της θερμοκρασίας στο εύρος C (Girard et al., 1997 & 2001). Επιπλέον, διάφορες έρευνες έδειξαν ότι με αύξηση της θερμοκρασίας οινοποίησης, παρατηρείται αύξηση των ταννινών και των πολυμερών χρωστικών μικρού και μεγάλου μοριακού βάρους, με παράλληλη μείωση των ελεύθερων ανθοκυανών (Bakker et al., 1998, Harbertson et al., 2002, Zimman et al., 2002). Τα δεδομένα δεν συμφωνούν πάντα μεταξύ τους, καθώς σπάνια οι υπόλοιπες παράμετροι που επηρεάζουν την εκχύλιση παραμένουν σταθερές, με αποτέλεσμα η σύγκριση αποτελεσμάτων διαφορετικών ερευνών να είναι τις περισσότερες φορές δύσκολη (Zimman et al., 2002). Η αυξημένη εκχύλιση φαινολικών σε υψηλότερη θερμοκρασία οφείλεται στην αυξημένη διαπερατότητα των υποδερμικών κυττάρων, με αποτέλεσμα τη μεγαλύτερη 88

90 διάχυση ανθοκυανών, καθώς και στην αυξημένη διαλυτότητα των άλλων φαινολικών ομάδων στην υγρή φάση. Η αύξηση των πολυμερών χρωστικών φαίνεται να οφείλεται περισσότερο στην αυξημένη εκχύλιση ταννινών παρά ανθοκυανών αφού οι ανθοκυάνες φτάνουν σε μια μέγιστη συγκέντρωση σχετικά νωρίς κατά την αλκοολική ζύμωση. Αν δεν υπάρχει επαρκής συγκέντρωση ταννινών για να «παγιδεύσει» τις ελεύθερες ανθοκυάνες τότε η ποσότητα των πολυμερών χρωστικών στο κρασί θα είναι μειωμένη (Sacchi, 2005). Παρ όλα αυτά η θερμοκρασία της αλκοολικής ζύμωσης στην ερυθρή οινοποίηση κυμαίνεται συνήθως στους C, και καθορίζεται από άλλους παράγοντες, κυρίως τη διατήρηση αρωματικών συστατικών. Το συγκεκριμένο θερμοκρασιακό εύρος πάντως είναι κατάλληλο για την επαρκή εκχύλιση φαινολικών συστατικών Επίδραση προζυμωτικής κρυοεκχύλισης Η προζυμωτική κρυοεκχύλιση στην ερυθρή οινοποίηση χρηισιμοποιείται για να διευκολύνει την εκχύλιση των πιο υδρόφιλων φαινολικών συστατικών, καθώς πραγματοποιείται σε υδατικό και όχι αλκοολικό περιβάλλον, για να βελτιώσει τον αρωματικό χαρακτήρα του παραγόμενου κρασιού και γιατί ευνοεί την εκχύλιση των προανθοκυανιδινών και ταννινών του φλοιού έναντι των αντίστοιχων από τα γίγαρτα. Έρευνες για την επίδραση της κρυοεκχύλισης στη φαινολική σύσταση του κρασιού έχουν δώσει διάφορα αποτελέσματα που οφείλονται κατά κύριο λόγο στην ποικιλία του σταφυλιού, τη διαφορετική διάρκεια και θερμοκρασία της κρυοεκχύλισης καθώς και στη μετέπειτα τεχνική οινοποίησης. Κρυοεκχύλιση σταφυλιών από την ποικιλία Merlot στους 8 C για τέσσερις (4) μέρες έδωσαν κρασί με υψηλότερη συγκέντρωση σε ανθοκυάνες και πτητικά συστατικά σε σχέση με κρασιά που παράχθηκαν με την κλασσική μέθοδο οινοποίησης (De Santis & Frangipane, 2010). Η κρυοεκχύλιση στους 10 C για 10 ημέρες στις ποικιλίες Monastrell και Cabernet Sauvignon έδειξε αύξηση των προανθοκυανιδινών των γιγάρτων ενώ δεν είχε καμία επίδραση στην ποικιλία Syrah. Παρά τη βελτίωση της εκχύλισης των ανθοκυανών, οι διαφορές δεν ήταν σημαντικές στο τέλος της οινοποίησης (Busse-Valverde et al., 2010). Η εκχύλιση ανθοκυανών σε κρασί από την ποικιλία Syrah βελτιώθηκε με την κρυοεκχύλιση όταν συνδυάστηκε με 89

91 αλκοολική ζύμωση σε χαμηλές θερμοκρασίες (15 C με 20 C) σε σχέση με οινοποίηση σε υψηλές θερμοκρασίες (30 C), σύμφωνα με τα ερευνητικά αποτελέσματα των Reynolds et al. (2001). Αντίθετα, η κρυοεκχύλιση σε Pinotage στους 10 C δεν προκάλεσε διαφορές στη φαινολική του σύσταση, αλλά μείωσε τη συγκέτρωση σε οξικούς εστέρες και αιθυλεστέρες για 2 με 4 μέρες κρυοεκχύλισης στους 15 C (Marais, 2003). Τέλος, έρευνα σε Cabernet Sauvignon, η κρυοεκχύλιση του οποίου μελετάται και στην παρούσα διατριβή, έδειξε ότι η κρυοεκχύλιση 4-10 ημερών στους 10 C, βελτίωσε την εκχύλιση σε γαλλικό οξύ, σε μονομερείς και πολυμερείς φλαβανόλες (κατεχίνη, επικατεχίνη, ταννίνες). Αντίθετα, τα υδροξυ-κινναμικά οξέα και οι φλαβονόλες δεν παρουσίασαν διαφορές. Αν και βελτιώθηκε, επίσης, η εκχύλιση ανθοκυανών καθώς και η ένταση του χρώματος οι διαφορές αυτές δεν ήταν σημαντικές μετά την ολοκλήρωση της αλκοολικής ζύμωσης (Panprivech et al., 2015). Λοιποί παράγοντες Η παρουσία της αλκοόλης, όπως είναι λογικό διαδραματίζει κύριο ρόλο στην εκχύλιση των φαινολικών συστατικών. Μετά τις πρώτες 2-3 μέρες της αλκοολική ζύμωσης παρουσιάζεται μια μείωση στο ρυθμό εκχύλισης των ανθοκυανών, οι οποίες είναι υδατοδιαλυτές και το μεγαλύτερο μέρος τους έχει ήδη εκχυλισθεί. Αντίθετα, η αύξηση της περιεκτικότητας της αιθανόλης κατά την εξέλιξη της αλκοολικής ζύμωσης συντελεί στην καλύτερη εκχύλιση των προκυανιδινών (Cheynier, 2006). Ο θειώδης ανυδρίτης, εκτός των άλλων δράσεων του κατά την οινοποίηση, διευκολύνει και την εκχύλιση φαινολικών συστατικών από τα στερεά μέρη του σταφυλιού στο γλεύκος. Στην ερυθρή οινοποίηση η προσθήκη θειώδη ανιδρύτη πριν η κατά την εκχύλιση ευνοεί τη διάχυση των ανόργανων συστατικών και των φαινολικών συστατικών των φλοιών. Η δράση αυτή του θειώδη ανυδρίτη οφείλεται στην καταστροφή των κυτταρικών δομών των φλοιών του σταφυλιού (Κουράκου, 1998). Οι τεχνικές οινοποίησης καθορίζουν σε μεγάλο βαθμό την εκχύλιση των επιμέρους φαινολικών ομάδων κατά την ερυθρή οινοποίηση. Η θερμοοινοποίηση καταστρέφει τις κυτταρικές μεμβράνες, επιτρέποντας την καλύτερη διάχυση των ανθοκυανών αλλά λόγω της απουσίας αλκοόλης δε μεταβάλλει το περιεχόμενο σε 90

92 ταννίνες. Σε σύγκριση με την κλασσική μέθοδο ερυθρής οινοποίησης, έδωσε καλύτερο αποτέλεσμα χρώματος αλλά χαμηλότερο φαινολικό φορτίο. Το πάγωμα της σταφυλομάζας πριν την εκχύλιση έχει το ίδιο αποτέλεσμα της διάρρηξης των κυταρρικών μεμβρανών, αυξάνει το περιεχόμενο σε ταννίνες ενώ έχει και το επιπλέον πλεονέκτημα ότι προστατεύει από οξειδωτικά φαινόμενα πριν την αλκοολική ζύμωση. Η ανθρακική αναεροβίωση παρουσιάζει αντικρουόμενα αποτελέσματα που εξαρτώνται κυρίως από τη χρησιμοποιούμενη ποικιλία, κάτι που συμβαίνει και με τον τρόπο και χρόνο διαβροχής του γλεύκους. Η αφαίμαξη αποτελεί άλλη μία μέθοδο βελτίωσης της εκχύλισης των φαινολικών κατά την οινοποίηση, στην οποία μία ποσότητα γλεύκους απομακρύνεται ώστε να αυξηθεί ο λόγος της στερεής προς την υγρή φάση του γλεύκους. Τα πηκτινολητικά ένζυμα μπορούν να αυξήσουν το χρώμα και το ολικό φαινολικό φορτίο στο τέλος της ζύμωσης. Στις περισσότερες περιπτώσεις οι πηκτινάσες δεν φαίνεται να αυξάνουν τις ανθοκυάνες σε αντίθεση με τις ταννίνες και τα χρωστικά πολυμερή. Αυτό, μάλλον, οφείλεται στο ότι οι ελεύθερες ανθοκυάνες που διαχέονται στο γλεύκος δεσμεύονται άμεσα από άλλες ουσίες (άλλες ανθοκυάνες, φλαβανόλες και πολυμερείς χρωστικές ουσίες). Πρέπει να εξασφαλίζεται η καθαρότητα των ενζύμων αυτών καθώς τυχόν παρουσία β-γλυκοζιδάσης μπορεί να προκαλέσει υδρόλυση ανθοκυανών με αποτέλεσμα να χάνεται χρωματική ένταση (Sacchi et al., 2005). 5.2 Αντιδράσεις φαινολικών συστατικών Δραστικότητα φαινολικών συστατικών Οι δράσεις στις οποίες συμμετέχουν τα φαινολικά συστατικά είναι τόσο ενζυμικές όσο και χημικής φύσεως. Οι ενζυμικές δράσεις περιορίζονται στα πρώιμα στάδια της οινοποίησης, ενώ οι χημικές δράσεις επικρατούν καθώς τα ένζυμα απενεργοποιούνται, και συνεχίζουν κατά την παλαίωση του κρασιού. Ανεξάρτητα από το είδος τους, οι δράσεις αυτές (βιοχημικές ή χημικές) εξαρτώνται από τη δραστικότητα των φαινολικών συστατικών και την παρουσία ή μη άλλων υποκαταστατών. 91

93 Η δραστικότητα των πολυφαινολικών συστατικών, οφείλεται κυρίως στα φαινολικά υδροξύλια αλλά και στα φαινόμενα συντονισμού του ελεύθερου ζεύγους ηλεκτρονίων μεταξύ του φαινολικού οξυγόνου και του βενζολικού δακτυλίου, που προσδίδει μερικό αρνητικό φορτίο στον υποκαταστάτη που βρίσκεται κοντά στο υδροξύλιο, με αποτέλεσμα να αποκτά πυρηνόφιλο χαρακτήρα. Ο Α δακτύλιος που υπάρχει σε όλα τα φλαβονοειδή περιλαμβάνει δύο πυρηνόφιλες θέσεις στους άνθρακες -6 και -8. Οι φλαβανόλες δρουν τόσο ως πυρηνόφιλα, διαμέσου του Α-δακτύλιου τους, όσο και ως ηλεκτρονιόφιλα αντιδραστήρια, διαμέσου των καρβοκατιόντων που σχηματίζονται από την όξινα καταλυόμενη διάσπαση των μεταξύ τους δεσμών. Η τελευταία αυτή αντίδραση, που περιορίζεται στα ολιγομερή και τα πολυμερή των φλαβονολών, έχει διαπιστωθεί πως συμβαίνει αυθόρμητα στις τιμές ph των κρασιών. Οι βασικές μορφές των φαινολών (φαινολικών ανιόντων) οξειδώνονται εύκολα προς ρίζες ημικιννόνης μέσω μεταφοράς ηλεκτρονίων. Οι ρίζες αυτές μπορούν στη συνέχεια να αντιδράσουν με μια νέα ρίζα σχηματίζοντας ένα προϊόν προσθήκης μέσω της σύζευξης ριζών ή στην περίπτωση των ο-διφαινολών να υφίστανται ένα δεύτερο στάδιο οξείδωσης αποδίδοντας ο-κιννόνες που είναι τόσο ηλεκτρονιόφιλα όσο και οξειδωτικά μέσα. Οι αντιδράσεις οξείδωσης στο κρασί είναι πολύ αργές, λόγω της χαμηλής αναλογίας των φαινολικών ανιόντων στις τιμές ph του κρασιού, αλλά συμβαίνουν εξαιρετικά γρήγορα όταν υπάρχουν ενεργά οξειδωτικά ένζυμα (Cheynier, 2006) Ενζυμικές δράσεις Τα κύρια ένζυμα που καταλύουν τις αντιδράσεις των φαινολικών συστατικών (φλαβονοειδών) είναι οξειδωτικά ένζυμα (όπως οι πολυφαινολοξειδάσες και οι περοξειδάσες) που προέρχονται από το σταφύλι αλλά και από μύκητες που το μολύνουν. Επίσης βρίσκονται στο κρασί διάφορα υδρολυτικά ένζυμα (γλυκοζιδάσες, εστεράσες) που αποβάλλονται από τις ζύμες και τους μύκητες ή υπάρχουν σε παρασκευάσματα που προστίθενται στο κρασί για τεχνολογικούς σκοπούς (όπως οι πηκτινάσες). 92

94 Υδρολυτικά ένζυμα Οι πηκτινάσες και οι β-γλυκανάσες είναι τα μόνα ένζυμα που επιτρέπονται στην οινοποίηση σύμφωνα με την Ευρωπαϊκή νομοθεσία. Χρησιμοποιούνται κατά τη διαύγαση και σταθεροποίηση του κρασιού αλλά και για να απελευθερώσουν σε αυτό αρωματικές ουσίες οι οποίες βρίσκονται στο σταφύλι ως μη πτητικές γλυκοζιδικές πρόδρομες ουσίες. Τα πηκτινολυτικά ένζυμα βελτιώνουν, ακόμα, την εκχύλιση των φαινολικών συστατικών και ενισχύουν το χρώμα του κρασιού. Τέτοια, σχετικά ακατέργαστα εμπορικά σκευάσματα συχνά περιέχουν και άλλες ουσίες όπως κινναμο-εστεράσες, ταννίνο-ακυλο-υδρολάσες (ταννάσες) και γλυκοζιδάσες. Η υδρόλυση των γλυκοζιτών των φλαβονολών που καταλύεται από τη β-γλυκοζιδάση, έχει διαπιστωθεί ότι προκαλεί θολώματα λόγω της καθίζησης αδιάλυτων άγλυκων φλαβονολών. Η απόσπαση του γλυκοζίτη στις ανθοκυάνες έχει σαν αποτέλεσμα τον αποχρωματισμό τους, λόγω της αστάθειας των προανθοκυανιδινών που προκύπτουν. Το φαινόμενο αυτό ενισχύεται περισσότερο από την παρουσία των κινναμοεστερασών που υδρολύουν τον δεσμό μεταξύ του p- κουμαρικού οξέος και της γλυκόζης στις p-κουμαριλιωμένες ανθοκυάνες. Παρόλα αυτά, οι β-γλυκοζιδάσες από το μύκητα Aspergillus niger παρουσιάζουν διαφορετικά μοτίβα συγγένειας υποστρώματος, έτσι ώστε οι δράσεις που αφορούν στην υδρόλυση των πρόδρομων αρωματικών ενώσεων και των πολυσακχαριτών των φυτικών κυτταρικών τοιχωμάτων να διαχωρίζονται από ανεπιθύμητες διασπάσεις των ανθοκυανών. Η δράση της ταννάσης έχει αναφερθεί σε διάφορους μύκητες, συμπεριλαμβανομένων και των Aspergillus niger και Botrytis cinereα. Καταλύει τη διάσπαση του εστερικού δεσμού σε εστεροποιημένες φλαβανόλες. Η δράση της στο κρασί είναι σχετικά αδύναμη λόγω της απενεργοποίησης της από το υψηλό φαινολικό του φορτίο. Επιπλέον, ορισμένες γαλλο-ομάδες στα προκυανιδικά πολυμερή είναι ανθεκτικές στην υδρόλυση από την ταννάση, λόγω στερεοχημικής παρεμπόδισης ή άλλων μοριακών αλληλεπιδράσεων (Cheynier, 2006). 93

95 Ενζυμικές οξειδώσεις Το κύριο ένζυμο που είναι υπεύθυνο για την οξείδωση των πολυφαινολών κατά την οινοποίηση είναι η πολυφαινολοξειδάση (PPO) η οποία έχει διπλή δράση: Αρχικά, υδροξυλιώνει τις μονοφαινόλες σε ο-διφαινόλες, και στη συνέχεια οξειδώνει τις ο- διφαινόλες σε ο-κιννόνες χρησιμοποιώντας το μοριακό οξυγόνο σαν συν-υπόστρωμα. Η λακκάση, που προέρχεται από μυκητιακή μόλυνση του σταφυλιού από το B. cinerea, επίσης καταλύει τη μετατροπή των ο-διφαινολών σε ο-κιννόνες ενώ παράλληλα μπορεί να χρησιμοποίησει ένα ευρύ φάσμα υποστρωμάτων, που περιλαμβάνει, συγκεκριμένα, γλυκοζυλιωμένα φλαβονοειδή όπως ανθοκυάνες και π- διφαινόλες. Η περοξειδάση (POD) καταλύει την οξείδωση ενός μεγάλου αριθμού ο-διφαινολικών υποστρωμάτων προς ο-κιννόνες, χρησιμοποιώντας το υπεροξείδιο του υδρογόνου σαν συν-υπόστρωμα. Η δράση αυτή, που συμβαίνει στο σταφύλι δεν έχει διαπιστωθεί στο γλεύκος όπου η πολυφαινολοξειδάση είναι εξαιρετικά ενεργή ενώ και η διαθεσιμότητα του υπεροξειδίου του υδρογόνου είναι περιορισμένη. Η περοξειδάση μπορεί ακόμα να συμμετέχει στην αποδόμηση των ανθοκυανών που συμβαίνει κατά αποθήκευση των σταφυλιών μετά τον τρύγο. Η απενεργοποίηση της δράσης της καταλάσης, η οποία καταλύει τη μετατροπή του υπεροξειδίου του υδρογόνου σε νερό, σε συνδιασμό με την αποδόμηση των ανθοκυανών και την επαγωγή της δράσης της πολυφαινολοξειδάσης έχει παρατηρηθεί κατά την ανθρακική αναεροβίωση. Τα φλαβονοειδή, συνήθως δεν εμπλέκονται άμεσα στην ενζυμική οξείδωση, δεδομένου ότι δεν αποτελούν ιδανικό υπόστρωμα για την πολυφαινολοξειδάση του σταφυλιού σε σχέση με τα καφεïλιωμένα τρυγικά οξέα, τα οποία βρίσκονται σε αφθονία στο γλεύκος. Ορθο-διφαινολικές φλαβονοειδείς αγλυκόνες, και συγκεκριμένα, μονομερή φλαβανολών μπορεί να οξειδωθούν από την πολυφαινολοξειδάση. Τα γλυκοζιλιωμένα φλαβονοειδή (γλυκοζίτες των ανθοκυανών και των φλαβονολών) και οι προανθοκυανιδίνες είναι φτωχά υποστρώματα για την πολυφαινολοξειδάση μπορούν όμως να οξειδωθούν από τη λακκάση και την περοξειδάση. Επιπλέον, μπορούν να συμμετέχουν σε αντιδράσεις οξείδωσης μέσω συζευγμένης οξείδωσης και αντιδράσεων πυρηνόφιλης προσθήκης με ενζυμικά 94

96 παραχθείσες κιννόνες. Συγκεκριμένα μελέτες της χημικής κινητικής των δράσεων αυτών έδειξαν ότι οι κιννόνες που προκύπτουν από την ενζυμική οξείδωση των καφεïλιωμένων τρυγικών οξέων, είναι ισχυρά οξειδωτικά μέσα ικανά να οξειδώσουν τις περισσότερες φλαβονοειδείς ο-διφαινόλες, συμπεριλαμβανομένου των κατεχινών, των εστέρων της επικατεχίνης, των προκυανιδινών και του 3-γλυκοζίτη της κυανιδίνης προς τις αντίστοιχες δευτερογενείς ο-κιννόνες. Τέλος, oι ηλεκτρονιόφιλες κιννόνες υφίστανται προσθήκη πυρηνόφιλων, που περιλαμβάνουν και τα φλαβονοειδή. Έτσι, η πυρηνόφιλη προσθήκη κατεχίνης στην ενζυμικά παραχθείσα κιννόνη, απέδωσε ένα διμερές κατεχίνης στο οποίο τα δύο μονομερή συνδέονται με έναν C6-C8 διφαίνυλο δεσμό. Αυτή η Β τύπου διμερής κατεχίνη που προκύπτει με απομάκρυνση ενός μορίου νερού οξειδώνεται περαιτέρω προς κίτρινες χρωστικές. Όμοιες ουσίες προκύπτουν από τη σύζευξη ριζών ημικιννονών κατεχίνης, ειδικά σε διαλύματα χαμηλού ph (Cheynier, 2006) Χημικές αντιδράσεις Οι χρωματικές και γευστικές μεταβολές που συμβαίνουν κατά την αποθήκευσηπαλαίωση του κρασιού έχουν αποδοθεί στη μετατροπή των ανθοκυανών του σταφυλιού σε πολυμερείς χρωστικές ουσίες μέσα από αντιδράσεις προσθήκης με τις φλαβανόλες. Λόγω της σημασίας τους, και της ιδιαίτερης ενασχόλησης με αυτές στην παρούσα διατριβή, οι χημικές δράσεις μεταξύ ανθοκυανών και προκυανιδινών και η επίδρασή τους στο χρώμα των κόκκινων κρασιών σχολιάζονται αναλυτικά στο υποκεφάλαιο Ανθοκυάνες: μορφή, αντιδράσεις και επίδραση στο χρώμα των κόκκινων κρασιών Γενικά Το χρώμα είναι ένα από τα σημαντικότερα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του κόκκινου κρασιού, αποτελώντας μια παράμετρο που επηρεάζει τη συνολική ποιότητα 95

97 του προϊόντος. Κύριοι υπεύθυνοι του κόκκινου χρώματος του κρασιού είναι οι ανθοκυάνες στη μορφή του φλαβυλίου (Hermosín Gutiérrez et al., 2005). Οι ανθοκυάνες δεν είναι σταθερά μόρια, οπότε η συγκέντρωσή τους στα κρασιά μειώνεται κατά τους πρώτους μήνες της παραμονής στο βαρέλι. Μετά από μερικά χρόνια εξαφανίζονται εντελώς, παρά το γεγονός ότι το κρασί παραμένει κόκκινο. Αυτή η μείωση οφείλεται σε αντιδράσεις που συμβαίνουν με άλλα συστατικά του κρασιού, σε αντιδράσεις διάσπασης, αλλά και σε τροποποίηση της δομής τους (Ribèreau - Gayon et al., 2006). Η σταθερότητα των ανθοκυανών εξαρτάται από πολλούς παράγοντες όπως ο τύπος των μορίων, η συγκέντρωση των διάφορων συστατικών του κρασιού, το ph, η θερμοκρασία, η οξείδωση και το φως. Η μείωση της συγκέντρωση των ελεύθερων ανθοκυανών, που καταλήγει στην εξαφάνισή τους μετά από μερικά χρόνια, οφείλεται σε αντιδράσεις διάσπασης και σε αντιδράσεις σταθεροποίησης. Η σταθερότητα αναπτύσσεται μέσω μίας περίπλοκης σειράς μηχανισμών, όπως είναι το φαινόμενο σχηματισμού έγχρωμων συμπλόκων (copigmentation), ο πολυμερισμός των ανθοκυανών με φλαβαν-3-όλες, η συμπύκνωση των τελευταίων με ταννίνες καθώς και η οξείδωση και ο πολυμερισμός των φλαβονοειδών που προέρχονται από το σταφύλι και το δρύινο βαρέλι (Jackson 2008, Ribèreau - Gayon et al., 2006) Οι ανθοκυάνες και η υποκατάστασή τους Οι ανθοκυανιδίνες βρίσκονται στα σταφύλια υπό τη μορφή γλυκοζιτών (ανθοκυάνες). Ο γλυκοζιδικός δεσμός αυξάνει τη χημική σταθερότητα καθώς και τη διαλυτότητα της ανθοκυάνης. Στα φρέσκα κρασιά, οι ανθοκυάνες βρίσκονται σε μία δυναμική ισορροπία μεταξύ 5 μοριακών μορφών, όπως φαίνεται στην Εικ. 20: μίας δεσμευμένης με το διοξείδιο του θείου (A) και τεσσάρων ελεύθερων: της μορφής του φλαβυλίου (flavylium cation) (C), μίας άχρωμης ψευδοβάσης υπό τη μορφή καρβινόλης ή αλλιώς ημικεταλική μορφή (carbinol pseudobase) (E), μίας άνυδρης βάσης υπό τη μορφή κιννόνης (quinoidal base) (B), και της χαλκόνης (chalcone) (D). Το κατιόν του φλαβυλίου βρίσκεται στο κέντρο της ισορροπίας και συμμετέχει σε αντιδράσεις οξέος-βάσης και ενυδάτωσης. Η μετατροπή της μορφής του φλαβυλίου στη μορφή της άνυδρης βάσης της κιννόνης γίνεται γρήγορα, με τη μεταφορά ενός πρωτονίου, καθώς και η μετατροπή στην ημικεταλική μορφή (ψευδοβάση υπό τη 96

98 μορφή καρβινόλης) γίνεται γρήγορα με την ενυδάτωση και την επακόλουθη μεταφορά ενός πρωτονίου. Το άνοιγμα του ετεροδακτυλίου και η αναδόμηση του μορίου της ημικεταλικής μορφής για τον σχηματισμό χαλκόνης γίνεται αργά, και η ισορροπία μεταξύ cis- και trans-χαλκόνης απέρχεται αργά και είναι δύσκολο να μεταβληθεί (Jackson, 2008, He et al., 2012). Το κόκκινο χρώμα προέρχεται αρχικά από το μικρό ποσοστό των ανθοκυανών που βρίσκονται στη μορφή του φλαβυλίου, αφού στο ph του κρασιού η ισορροπία είναι μετατοπισμένη προς την ημικεταλική μορφή, που είναι άχρωμη. Το ποσοστό αυτό εξαρτάται από το ph και τη συγκέντρωση του ελεύθερου θειώδη ανυδρίτη στο κρασί. Χαμηλά ph αυξάνουν τη συγκέντρωση της μορφής του φλαβυλίου, ενισχύοντας το κόκκινο χρώμα. Το χαμηλό ph, επίσης, καθυστερεί την υδρόλυση των μορίων των ανθοκυανών σε αγλυκόνη και σάκχαρο. Καθώς το ph αυξάνεται, μειώνεται δραματικά η πυκνότητα του χρώματος και το ποσοστό των ανθοκυανών που βρίσκονται υπό τη μορφή φλαβυλίου. Για παράδειγμα, το 20-25% των ανθοκυανών σε ph βρίσκεται στην ιονισμένη μορφή του φλαβυλίου, ενώ σε ph 4 μόνο το 10%. Παρόλα αυτά, ο σημαντικότερος παράγοντας που επηρεάζει την πυκνότητα του χρώματος στα φρέσκα κόκκινα κρασιά δεν είναι το ph, αλλά η συγκέντρωση του θειώδη ανυδρίτη, που είναι ένας αποτελεσματικός, αν και αναστρέψιμος, παράγοντας αποχρωματισμού των ανθοκυανών. Οι ελεύθερες ανθοκυάνες δεσμεύουν τον θειώδη ανυδρίτη σύμφωνα με την αντίδραση (C) + HSO3 - (A), όπως είναι φανερό και στην Εικ. 20 (Jackson, 2008, Κουράκου Δραγώνα, 1998, He et al., 2012). Η απόχρωση και η σταθερότητα του χρώματος επηρεάζονται από την έκταση και το είδος της υποκατάστασης του Β δακτυλίου της ανθοκυάνης. Το μπλε χρώμα αυξάνεται με το βαθμό υποκατάστασης με υδροξυλομάδες, ενώ το κόκκινο με τις μεθυλομάδες. Η κυρίαρχη ανθοκυάνη στα περισσότερα κόκκινα κρασιά είναι η μαλβιδίνη, η πιο κόκκινη ανθοκυάνη, και άρα είναι αυτή που δίνει το χρώμα. 97

99 Εικ. 20: Ισορροπία μεταξύ των διαφόρων μορφών των ανθοκυανών στο κρασί 98

100 Η ευαισθησία στην οξείδωση των ανθοκυανών επηρεάζεται από την παρουσία ορθουδροξυλίων στον Β δακτύλιο. Οι συγκεκριμένες ομάδες είναι ευαίσθητες στην ενζυμική και μη ενζυμική οξείδωση. Εκτός από τη λακκάση, οι περισσότερες πολυφαινολικές οξειδάσες επιδρούν μόνο στις ορθο-διφαινολικές θέσεις. Αφού ούτε η μαλβιδίνη ούτε η πεονιδίνη έχουν υδροξυλομάδες σε ορθο- θέση, είναι συγκριτικά ανθεκτικότερες στην οξείδωση. Η ανθεκτικότητα στην οξείδωση επηρεάζεται, επίσης, και από τη σύζευξη με σάκχαρα και άλλα συστατικά. Οι ενυδατωμένες μορφές των ανθοκυανών (ημικετάλη ή καρβινόλη) αντιδρούν με ορθο-δικιννόνες, οι οποίες παρήχθησαν από την οξείδωση. Το προϊόν την αντίδρασης είναι άχρωμο και χημικά ασταθές. Επιπλέον, οι ανθοκυάνες τείνουν να υδρολύονται σε ανθοκυανιδίνες, χάνοντας το ακυλιωμένο τους μέρος (οξικό, καφεϊκό ή p-κουμαρικό οξύ), μαζί με το γλυκοζυλιωμένο (γλυκόζη). Οι διαστασιοποιημένες ανθοκυάνες είναι πιο ευαίσθητες στη μη αναστρέψιμη απώλεια χρώματος, καθώς και στην αναστρέψιμη μετατροπή της έγχρωμης μορφής του φλαβυλίου σε άχρωμες ημικετάλες (Jackson 2008) Αντιδράσεις διάσπασης των ανθοκυανών Οι αντιδράσεις διάσπασης καταλήγουν στο σχηματισμό διάφορων ενώσεων όπως χαλκόνες (σε αλκαλικό μέσο), μαλβόνες (υπό την επίδραση υπεροξειδίων), φαινολικά οξέα και κουμαρίνες (σε υδατικά διαλύματα με ph από 3 έως 7) και διυδροφλαβονόλες (παρουσία αλκοόλης). Οι αντιδράσεις διάσπασης εντάσσονται σε τρείς κατηγορίες, στη θερμική υποβάθμιση των ανθοκυανών, στην οξειδωτική υποβάθμιση και στην υποβάθμιση από κετόνες. Η θέρμανση των ανθοκυανών στους 100 C προκαλεί μείωση της έντασης του χρώματος, που γίνεται εντονότερη με την πάροδο του χρόνου. Αυτό εξηγείται από τη μετατόπιση της ισορροπίας προς τη χαλκόνη και τις άχρωμες μορφές. Εάν θερμανθούν οι ανθοκυάνες δεν επανέρχονται ποτέ στην αρχική τους κατάσταση, όποιες και αν είναι οι μετέπειτα συνθήκες. Κατά τη θέρμανση, σπάει η ανθρακική αλυσίδα της trans χαλκόνης και σχηματίζεται βενζοϊκό οξύ. Επίσης, γίνεται γλυκοζιδική υδρόλυση και σχηματίζεται διυδροφλαβονόλη, από την οποία μπορεί να 99

101 παραχθεί ένα κινναμικό οξύ. Η μαλβιδίνη έχει αποδειχθεί πολύ πιο ευαίσθητη στη θερμική υποβάθμιση σε σχέση με την κυανιδίνη. Κατά την οξειδωτική υποβάθμιση, οι ανθοκυάνες σε όξινο περιβάλλον χάνουν το χρώμα τους μετά από μερικές μέρες έκθεσης στο φως. Η αντίδραση αυτή επηρεάζεται από τη συγκέντρωση της αλκοόλης. Το οξυγόνο και το φως δρουν ως καταλύτες. Η μαλβιδίνη έχει αποδειχθεί ότι είναι περισσότερο ανθεκτική από την κυανιδίνη στην ελεγχόμενη οξείδωση που συμβαίνει κατά την παλαίωση, λόγω της υποκατάστασης του Β δακτυλίου της. Οι o-διφαινόλες οξειδώνονται, όπως έχει ήδη αναφερθεί, και μπορούν να δράσουν ως υποστρώματα για τα ένζυμα οξείδωσης, όπως η πολυφαινολοξειδάση, και σε μικρότερο βαθμό η υπεροξειδάση. Οι ορθο-κινόνες που παράγονται με αυτόν τον τρόπο είναι ισχυρά οξειδωτικά με έντονη δραστικότητα. Οι ανθοκυάνες μπορούν να οξειδωθούν από τις κινόνες προς παραγωγή ιδιαίτερα ασταθών συμπλόκων ανθοκυανών-κινονών. Διαφορετικά, η βάση της καρβινόλης, με αρνητικά φορτία στις θέσεις 6 και 8, μπορεί να προσελκύσει τις ηλεκτρονιόφιλες κινόνες, δίνοντας άχρωμα προϊόντα προσθήκης, τα οποία αφυδατώνονται και σχηματίζουν ερυθρά κατιόντα φλαβυλίου. Τελευταία κατηγορία αντιδράσεων αποτελεί η υποβάθμιση από κετόνες. Σε όξινα υδατικά διαλύματα που περιέχουν ακετόνη, οι ανθοκυάνες παράγουν προϊόντα χρώματος πορτοκαλί. Έχουν προταθεί διάφοροι μηχανισμοί πραγματοποίησης της αντίδρασης αυτής: υδρόλυση των ανθοκυανών και μετατροπή των ανθοκυανιδινών σε διυδροφλαβονόλες, διάσπαση του ετεροκυκλικού δακτυλίου με σχηματισμό βενζοϊκών οξέων, ή αντίδραση μεταξύ της ακετόνης και της ανθοκυάνης, μέσω πολικών διπλών δεσμών. Η παρουσία του 2- και του 5- οξογλυκονικού οξέος στα κόκκινα κρασιά, ορισμένες φορές σε ιδιαίτερα υψηλές συγκεντρώσεις, όταν το κρασί έχει παραχθεί από σταφύλια προσβεβλημένα, έχει σαν αποτέλεσμα τη δημιουργία χρωμάτων που γρήγορα αποκτούν πορτοκαλί τόνους. Αυτό πιθανώς οφείλεται σε αντίδραση μεταξύ αυτών των οξέων και των ανθοκυανών, με σταθεροποίηση του πολικού διπλού δεσμού στον C4 (Ribèreau - Gayon et al., 2006). 100

102 5.3.4 Η αυτοσυνένωση των ανθοκυανών και το φαινόμενο του σχηματισμού έγχρωμων συμπλόκων με άλλα συστατικά του κρασιού Η αυτοσυνένωση των ανθοκυανών (self-association), το φαινόμενο του σχηματισμού έγχρωμων συμπλόκων (copigmentation) και τα διάφορα προϊόντα της συμπύκνωσης, εμπλέκονται στην αρχική εξέλιξη του χρώματος των κόκκινων κρασιών, κατά τη διάρκεια και αμέσως μετά την αλκοολική ζύμωση. Οι ανθοκυάνες στα κόκκινα κρασιά συσσωρεύονται και συγκρατούνται μεταξύ τους μέσω της αυτοσυνένωσης (self-association) και με άλλα συστατικά μέσω του φαινομένου του σχηματισμού έγχρωμων συμπλόκων (copigmentation). Έτσι, δημιουργούνται μοριακά συσσωματώματα που συγκρατούνται από υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις, μεταξύ ανθοκυανών μόνο (αυτοσυνένωση), ή μεταξύ ανθοκυανών και άλλων άχρωμων οργανικών συστατικών ή μεταλλικών ιόντων που παρευρίσκονται στο διάλυμα και αναφέρονται ως συμπαράγοντες (cofactors) (φαινόμενο έγχρωμων συμπλόκων) (Gómez-Míguez et al., 2006, Figueiredo- González et al., 2013). Και οι δύο τύποι συμπλόκων αυξάνουν σημαντικά την ένταση του χρώματος, και μπορούν να επηρεάσουν και την απόχρωση, όπως έχει αποδειχθεί πάνω σε πρότυπα συστήματα αρχικά, αλλά και στο κρασί (Boulton 2001). Η αυτοσυνένωση φαίνεται να είναι ιδιαίτερα σημαντική στον χρωματισμό του σταφυλιού, ενώ το φαινόμενο του σχηματισμού έγχρωμων συμπλόκων είναι περισσότερο σημαντικό στον ιώδη χρωματισμό των φρέσκων κόκκινων κρασιών. Η συσσωμάτωση των ανθοκυανικών μορίων σε αυτά τα σύμπλοκα, εμποδίζει την πρόσβαση του νερού στο ιόν του κόκκινου φλαβυλίου και της μπλε βάσης υπό μορφή κιννόνης, και άρα η ισορροπία δεν μετατοπίζεται προς την άχρωμη μορφή της ψευδοβάσης της καρβινόλης. Το φλαβύλιο και η βάση κιννόνης είναι σχεδόν επίπεδες, καθιστώντας την αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών και άλλων ανθοκυανών ή άλλων συστατικών (cofactors) ευκολότερη και πιο πιθανή μια και δεν υπάρχει στερεοχημική παρεμπόδιση (Jackson 2008). Στο χαμηλό ph του κρασιού, στο φαινόμενο των έγχρωμων συμπλόκων συμμετέχουν κυρίως ανθοκυάνες υπό τη μορφή φλαβυλίου. Αυτό, με τη σειρά του, μετατοπίζει την ισορροπία των ελεύθερων ανθοκυανών προς την έγχρωμη μορφή του φλαβυλίου, 101

103 γεγονός το οποίο ενισχύει ακόμη περισσότερο το χρώμα και τείνει να μεταβάλλει την απόχρωση προς το ιώδες. Αυτά τα έγχρωμα σύμπλοκα εκτιμάται ότι συμβάλλουν περίπου 30 με 50% στο χρώμα των φρέσκων κόκκινων κρασιών (Βoulton 2001, Jackson 2008). Τα συστατικά (cofactors) που συμμετέχουν στο φαινόμενο των έγχρωμων συμπλόκων είναι πλούσια σε π-ηλεκτρόνια και είναι ικανά να ενωθούν με τα ιόντα του φλαβυλίου, τα οποία είναι φτωχά σε ηλεκτρόνια. Αυτή η ένωση παρέχει προστασία από την πυρηνόφιλη προσβολή του νερού στη θέση 2 του ιόντος του φλαβυλίου, και από άλλες ενώσεις όπως τα υπεροξείδια και τον θειώδη ανυδρίτη στη θέση 4. Τα συστατικά που συνδέονται μέσω του φαινομένου αυτού με τις ανθοκυάνες, μπορούν να είναι φλαβονοειδή, αλκαλοειδή, αμινοξέα, οργανικά οξέα, νουκλεοτίδια, πολυσακχαρίτες, ή μέταλλα (Rustioni et al., 2012). Η Εικ. 21 δείχνει τους πέντε διαφορετικούς τρόπους με τους οποίους μπορεί να εκδηλωθεί το φαινόμενο της ενίσχυσης του χρώματος. Αρχικά, μόνο με ανθοκυάνες, μέσω της αυτοσυνένωσης (Εικ. 21(Α)) και του σχηματισμού ενδομοριακού συμπλόκου (intramolecular copigmentation: Εικ. 21(Β)). Αν το συστατικό που ενώνεται με την ανθοκυάνη είναι ένα μέταλλο, τότε δημιουργείται ένα σύμπλοκο με μέταλλο (Εικ. 21(C)). Στην περίπτωση ενός συστατικού με ελεύθερο ζεύγος ηλεκτρονίων, σχηματίζεται ένα διαμοριακό έγχρωμο σύμπλοκο (intermolecular copigmentation: Εικ. 21(D)). Τέλος, στην πιο πολύπλοκη περίπτωση, το φαινόμενο των έγχρωμων συμπλόκων μπορεί να πραγματοποιηθεί από μία αγλυκόνη, ένα σάκχαρο, ένα άλλο συστατικό (cofactor) και πρωτόνια, όλα μαζί ταυτόχρονα. Όταν το συστατικό είναι ένα φαινολικό συστατικό, η αλληλεπίδραση είναι παροδική, λόγω της έλλειψης χημικών δεσμών. Αυτή η συμπεριφορά είναι το αποτέλεσμα ενός χημικού φαινομένου, γνωστού ως ένωση μεταφοράς φορτίου ή π-π αλληλεπίδραση, το οποίο αναπτύσσεται όταν αλληλοεπιδρούν συστατικά αντίθετου ηλεκτρικού φορτίου. Έτσι, στους δακτυλίους που ενώνονται με ασθενείς δεσμούς, η πυκνότητα των ηλεκτρονίων μεταφέρεται από τον πλούσιο στον φτωχότερο σε ηλεκτρόνια δακτύλιο. Το ιόν του φλαβυλίου στις ανθοκυάνες είναι θετικά φορτισμένο, και άρα είναι κατάλληλο για τον σχηματισμό συμπλόκων μέσω της μεταφοράς φορτίου, με 102

104 υποστρώματα που είναι πλούσια σε ηλεκτρόνια (Castaneda - Ovando et al., 2009, He et al., 2012). Εικ. 21: Οι αλληλεπιδράσεις των ανθοκυανών: (Α) αυτοσυνένωση ανθοκυανών, (Β) ενδομοριακός σχηματισμός έγχρωμου συμπλόκου ανθοκυάνης, (C) σύμπλοκο με μέταλλα, (D) διαμοριακός σχηματισμός έγχρωμων συμπλόκων με ένα συστατικό με ελεύθερο ζεύγος ηλεκτρονίων Το φαινομένου του σχηματισμού έγχρωμων συμπλόκων έχει δύο επιπτώσεις. Πρώτον, τον σχηματισμό των π-π ενώσεων που προκαλούν μεταβολή στις φασματικές ιδιότητες των μορίων στο ιόν του φλαβυλίου, αυξάνοντας την ένταση της απορρόφησης (αυξοχρωμική επίδραση), και μεταβάλλοντας το μήκος κύματος της μέγιστης απορρόφησης, κατά 5 έως 20 nm υψηλότερα, δίνοντας μία μπλε-ιώδη απόχρωση, στο κατά τ άλλα κόκκινο διάλυμα (βαθοχρωμική μετατόπιση). Δεύτερον, τη σταθεροποίηση της μορφής του φλαβυλίου από την π ένωση, που μετατοπίζει την 103

105 ισορροπία με τέτοιο τρόπο ώστε να αυξάνεται το κόκκινο χρώμα (Εικ. 22). Γι αυτό, το μέγεθος της επίδρασης του φαινομένου σχηματισμού των έγχρωμων ενώσεων είναι στενά συνδεδεμένο με το ph, αφού σε χαμηλά ph όλες οι ανθοκυάνες είναι υπό τη μορφή φλαβυλίου, ενώ σε υψηλά είναι υπό τη μορφή της άχρωμης ψευδοβάσης της καρβινόλης. Το φαινόμενο σχηματισμού έγχρωμων συμπλόκων είναι εμφανές υπό ασθενείς όξινες συνθήκες όπως π.χ. στο κρασί, όπου οι ανθοκυάνες βρίσκονται σε μεγάλο ποσοστό στις άχρωμες μορφές τους (Castaneda - Ovando et al., 2009, Boulton, 2001). Εικ. 22: Παράδειγμα της σταθεροποίησης των ανθοκυανών μέσω σχηματισμού ενώσεων από μεταφορά φορτίου (αλληλεπίδραση ανθοκυανών με φαινολικά συστατικά) Πολλά συστατικά μπορούν να ενωθούν με τις ανθοκυάνες, μέσω του φαινομένου των έγχρωμων συμπλόκων, αλλά τα κύρια είναι η επικατεχίνη, οι προκυανιδίνες, οι φλαβονόλες, τα κινναμικά οξέα και οι υδροκινναμικοί εστέρες. Οι ποικιλία των ποσοστών αυτών των ουσιών από κρασί σε κρασί, μπορεί εν μέρει να εξηγήσει τα διαφορετικά χρώματα σε κρασιά της ίδια ποικιλίας. Για παράδειγμα, παρόλο που οι 104

106 επικατεχίνες συμπλοκοποιούνται με τις ανθοκυάνες αμέσως, οι κατεχίνες δίνουν πιο έντονα σε χρώμα σύμπλοκα. Τα παράγωγα των κινναμικών οξέων, όπως το καφεϊκό και το p-κουμαρικό οξύ, συμπλοκοποιούνται και αυτά αμέσως (He et al., 2012). Αυτό εξηγεί το γιατί παραδοσιακά μερικές περιοχές προσθέτουν γλεύκος λευκών ποικιλιών σταφυλιού (συνήθως πλούσιο σε αυτά τα μη φλαβονοειδή στο γλεύκος των ερυθρών ποικιλιών, πριν την έναρξη της αλκοολικής ζύμωσης (Jackson 2008). Συγκεκριμένα, έχει αποδειχθεί ότι κατά την ανάμειξη ερυθρών ποικιλιών πριν τη ζύμωση, το ποσοστό της κάθε ποικιλίας, καθώς και οι συνθήκες καλλιέργειάς της, μπορoύν να επηρεάσουν την έκταση του φαινομένου του σχηματισμού έγχρωμων συμπλόκων (Lorenzo et al., 2005). Έχουν διεξαχθεί έρευνες γύρω από το φαινόμενο του σχηματισμού έγχρωμων συμπλόκων μεταξύ ανθοκυανών και άλλων συστατικών, με στόχο την ενίσχυση του χρώματος του προϊόντος. Οι Gómez-Míguez et al. (2006) διερεύνησαν την αποτελεσματικότητα 7 φαινολικών συστατικών (κατεχίνη, επικατεχίνη, προκυανιδίνη Β2, καφεϊκό οξύ, p-κουμαρικό οξύ, μυρισετίνη και κερκετίνη) στη δράση τους ως συμπαράγοντες του 3-γλυκοζίτη της μαλβιδίνης, σε μοριακή αναλογία συμπαράγοντας/χρωμοφόρο 1:1, σε διαλύματα που προσομοίαζαν κρασί. Παρά τη σχετικά χαμηλή περιεκτικότητα και οι 7 ενώσεις οδήγησαν σε μια υπερχρωμική μετατόπιση του φάσματος απορρόφησης της ανθοκυάνης η οποία είναι χαρακτηριστική του φαινομένου σχηματισμού εγχρώμων συμπλόκων. Επιπλέον οι Álvarez et al. (2009) αναφέρουν ότι η προζυμωτική προσθήκη συμπαραγόντων (καφεϊκό οξύ, ρουτίνη, κατεχίνη, καθώς και φλαβονολών που απομονώθηκαν από τον φλοιό και τη σάρκα λευκών σταθυλιών) αύξησαν τις συμπλοκοποιημένες ανθοκυάνες και οδήγησαν σε νέους οίνους με πιο έντονο χρώμα, υψηλότερη συγκέντρωση ανθοκυανών, μεγαλύτερη συνεισφορά στο χρώμα του κρασιού από τις συμπλοκοποιημένες ανθοκυάνες και λιγότερη στυφότητα. Οι φλαβανόλες του φλοιού και της σάρκας των σταφυλιών θα μπορούσαν να αποτελέσουν έναν πολύ αξιόλογο και βιομηχανικά αξιοποιήσιμο συμπαράγοντα, μια και μπορούν να απομονωθούν από παραπροϊόντα της λευκής και κόκκινης οινοποίησης. Παρόλα αυτά, οι Darias-Martín et al. (2001), αναφέρουν ότι η προζυμωτική προσθήκη κατεχίνης ενίσχυσε το χρώμα του κρασιού μόνο κατά 10%, ενώ η προσθήκη καφεϊκού οξέος κατά 60%. Τα 105

107 κινναμικά οξέα, όπως είναι το καφεϊκό και το p-κουμαρικό, αναφέρονται επίσης από τους Bloomfield, Heatherbell και Pour Nikfardjam (2003) ως συμπαράγοντες που ενισχύουν το χρώμα του Cabernet Sauvignon και του Pinot Noir. Επίσης το ροσμαρινικό οξύ έχει μελετηθεί σαν συμπαράγοντας των ανθοκυανών σε κράνο, φράουλα, βατόμουρο και μύρτιλλο από τους Rein και Heinonen (2004), οι οποίοι και σημειώνουν την αυξημένη ικανότητα σχηματισμού έγχρωμων συμπλόκων του συγκεκριμένου μορίου σε σχέση με άλλα κινναμικά οξέα όπως είναι το φερουλικό και το σιναπικό. Φαινόμενα σχηματισμού έγχρωμων συμπλόκων δεν παρατηρούνται στα ροζέ κρασιά, και προφανώς ούτε στα λευκά. Τα περισσότερα ροζέ κρασιά περιέχουν ανθοκυάνες της τάξης των 20 με 50 mg/l, όπου δεν παρατηρούνται τέτοια φαινόμενα. Η ελάχιστη συγκέντρωση των ανθοκυανών για να αναπτυχθούν φαινόμενα αυτοσυννένωσης είναι 1 mmol/l (González-Manzano et al., 2008). Διάφοροι παράγοντες μπορούν να προκαλέσουν διάσπαση αυτών των ενώσεων των ανθοκυανών. Με τη θέρμανση των σταφυλιών ή του γλεύκους με σκοπό τη βελτίωση της εκχύλισης του χρώματος (θερμοοινοποίηση), αποτρέπεται η αυτοσυνένωση των ανθοκυανών. Αυτό μπορεί να οδηγήσει σε μία σημαντική απώλεια του χρώματος κατά την ωρίμανση του κρασιού, αν δεν έχουν εκχυλιστεί αρκετές ταννίνες από τα στέμφυλα, αφού οι ταννίνες τείνουν να σχηματίζουν με τις ανθοκυάνες έγχρωμα πολυμερή ανθοκυανών - ταννινών. Επίσης, η παρουσία της αιθανόλης αποσταθεροποιεί του δεσμούς ανάμεσα στα συσσωματώματα των ανθοκυανών (González-Manzano et al., 2008, Hermosín-Gutiérrez, 2003). Συνεπώς, το γλεύκος που έχει παραμείνει σε επαφή με τα στέμφυλα για λίγες μόνο μέρες, μπορεί να παρουσιάσει μία απώλεια χρώματος καθώς προχωρά η αλκοολική ζύμωση, παρόλο που το ανθοκυανικό φορτίο παραμένει σχετικά σταθερό. Η ελάττωση της πυκνότητας του χρώματος εξαρτάται από το φαινολικό φορτίο, το ph και την περιεκτικότητα της αιθανόλης (Jackson 2008). Έχει αναφερθεί ότι όσο μεγαλύτερη είναι η υποκατάσταση από μεθυλομάδες στον Β δακτύλιο του μορίου της ανθοκυάνης, τόσο υψηλότερη αυτοσυνένωση ανθοκυανών παρουσιάζεται (González-Manzano et al., 2008). Επιπλέον, υποστηρίζεται ότι το 106

108 μόριο του 3-γλυκοζίτη της μαλβιδίνης προτιμά να συμμετέχει στην αυτοσυνένωση των ανθοκυανών, παρά να λάβει μέρος στο φαινόμενο σχηματισμού έγχρωμων συμπλόκων με άλλα συστατικά, όσα και αν δοκιμάστηκαν. Παρόλα αυτά, ο p- κουμαριλιωμένος γλυκοζίτης της μαλβιδίνης (malvidin-3-o-(6 -O-p-coumarοyl)- glucoside) δεν έδειξε καμία ενίσχυση στο χρώμα, και γι αυτό θεωρείται ότι η p- κουμαρική ομάδα αποτρέπει την αυτοσυνένωση των ανθοκυανών (Lambert et al., 2011). Η αποθήκευση του κρασιού σε χαμηλές θερμοκρασίες ευνοεί την ανάπτυξη του φαινομένου των έγχρωμων συμπλόκων και καθυστερεί τη διάσπασή τους. Επειδή η μοριακή συσσωμάτωση συμβαίνει σε μία δυναμική ισορροπία μεταξύ των ελεύθερων ανθοκυανών, στα κόκκινα κρασιά με λίγες χρωστικές και χαμηλό φαινολικό φορτίο παρουσιάζεται αυξημένη διάσταση των συσσωματωμάτων και μεγαλύτερη απώλεια χρώματος από αυτά που θα αναμενόταν με βάση το ανθοκυανικό τους φορτίο (Jackson 2008). Η ενίσχυση του χρώματος των κόκκινων κρασιών, όπως φάνηκε παραπάνω έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Γι αυτό στην παρούσα διατριβή εξετάσθηκαν ως δυνητικοί συμπαράγοντες εκχυλίσματα αρωματικών φυτών που απαντούν ευρύτατα στην Ελλάδα και είναι πλούσια σε ροσμαρινικό και άλλα σύνθετα κινναμικά οξέα. Επιπλέον της ενίσχυσης του χρώματος, μετρήθηκε η ποσοστιαία συνεισφορά στο χρώμα του κρασιού, των μονομερών, συμπλοκοποιημένων και πολυμερισμένων ανθοκυανών κατά τη διάρκεια της αποθήκευσής του. Οι μεταβολές αυτές, ιδιαίτερα παρουσία συμπαραγόντων, έχουν ελάχιστα μελετηθεί στη διεθνή βιβλιογραφία, αν και είναι ιδιαίτερα σημαντικές, καθώς το κρασί καταναλώνεται αρκετούς μήνες μετά την οινοποίηση. Συμπλοκοποίηση μετάλλων - πολυφαινολών Η παρουσία μετάλλων όπως Fe, Cu, Mn και Zn στο κρασί έχει εξετασθεί από διάφορους ερευνητές (Sebecic et al., 1998 & Soto Vázquez et al., 2013). Είναι γνωστό ότι δρουν ως καταλύτες οξειδωτικών και ενζυμικών δράσεων. Επιπλέον παίζουν σημαντικό ρόλο στη σταθεροποίηση του χρώματος, τη διαύγαση του κρασιού αλλά και στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του. 107

109 Οι φυσικές πολυφαινόλες εμφανίζουν πολύ μεγάλη ικανότητα δημιουργίας συμπλόκων με τα μέταλλα. Οι Bai et al. (2004) αναφέρουν ότι όλα τα μέταλλα που ανήκουν στα στοιχεία μετάπτωσης μπορούν να σχηματίσουν σύμπλοκα με τη ρουτίνη. Οι Esparza et al. (2005) μελέτησαν τη συμπεριφορά του Zn και του Cu με τρία φλαβονοειδή (κατεχίνη, κερκετίνη και ρουτίνη), ενώ οι Smyk, Pliszka, και Drabent (2008) μελέτησαν τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ του 3-γλυκοζίτη της κυανιδίνης και ιόντων Cu. Παρόλα αυτά οι μελέτες που συσχετίζουν το φαινολικό προφίλ του κρασιού με τα ιχνοστοιχεία κατά τη διάρκεια της οινοποίησης και αποθήκευσής του, είναι πάρα πολύ περιορισμένες και με αντικρουόμενα αποτελέσματα (Esparza et al., 2004, Soto Vázquez et al., 2013, Zúñiga et al., 2014), γι αυτό το λόγο και οι συγκεκριμένες αλληλεπιδράσεις αποτέλεσαν ένα από τα αντικείμενα μελέτης της παρούσας διατριβής Πολυμερισμός ανθοκυανών - φλαβανολών Μετά τη ζύμωση, περίπου το 25% των ανθοκυανών πολυμερίζονται με φλαβονοειδή ή μη φλαβονοειδή φαινολικά. Το ποσοστό αυτό μπορεί να φτάσει και πάνω από το 40% μέσα στον πρώτο χρόνο. Κατά την αποθήκευση παλαίωση του κρασιού, παρατηρείται μείωση του ποσοστού των συμπλοκοποιημένων ανθοκυανών, με ταυτόχρονη αύξηση των πολυμερισμένων (Dobrei et al., 2010, Hermosín Gutiérrez et al., 2005), μέσω των αντιδράσεων συμπύκνωσης με τις φλαβονόλες που έχουν αναφερθεί ήδη. Η μεταβολή αυτή προφανώς επιφέρει και μεταβολές στη χρωματική έκφραση των ανθοκυανών. O πολυμερισμός συνεχίζεται με πιο αργό ρυθμό, μέχρι να φτάσει το 100% μετά από μερικά χρόνια. Αυτές οι πολυμερείς χρωστικές ουσίες μπορούν να δώσουν διάφορα χρώματα όπως, κίτρινο, ερυθροκίτρινο, καστανοκίτρινο, κόκκινο, και ιώδες, ανάλογα με τη χημική τους φύση. Επειδή τα περισσότερα πολυμερή έχουν μία κιτρινωπή, πορτοκαλί και καστανή απόχρωση, το κρασί σταδιακά παίρνει ένα κεραμιδί χρώμα. Οι διαφορές των ποικιλιών στο περιεχόμενο των φλαβονοειδών, έχουν προταθεί ως μία από τις αιτίες της διαφοράς της σταθερότητας του χρώματος στα κόκκινα κρασιά. Ο δείκτης του ολικού χρώματος επίσης μειώνεται με το χρόνο. Αυτό μπορεί να προκαλείται από την υποβάθμιση των ανθοκυανών, την επιπρόσθετη αναδόμηση των πολυμερών ανθοκυανών-ταννινών που τροποποιεί την απόχρωσή τους, και τον σχηματισμό και 108

110 την καθίζηση των έγχρωμων πολυμερών. Επειδή οι ανθοκυάνες συνδέονται κυρίως μέσω C4-C8 δεσμών με τις τερματικές φλαβονοειδείς ομάδες των ταννινών, τα πολυμερή ανθοκυανών-ταννινών γενικά δεν μεγαλώνουν όσο αυτά των ταννινών. Έτσι, η καθίζηση των έγχρωμων πολυμερών συνήθως απαιτεί την ένωσή τους με τα υπολείμματα των διαλυτών πρωτεϊνών του κρασιού (Jackson 2008). Τα συστατικά που εκχυλίζονται από τα στέμφυλα, μαζί με τις ανθοκυάνες, συνεισφέρουν, άμεσα ή έμμεσα, στον χρωματισμό του κρασιού. Αυτά τα συστατικά, κυρίως οι κατεχίνες και οι προκυανιδίνες (ολιγομερή κατεχινών), ξεκινούν να πολυμερίζονται με τις ανθοκυάνες και τις ανθοκυανιδίνες, παράγοντας προϊόντα προσθήκης τύπου Τ-Α ή Α-Τ (Τ: ταννίνες, Α: ανθοκυάνες). Οι κατεχίνες και οι προκυανιδίνες μπορούν επίσης να ενωθούν μεταξύ τους. Αυτό οδηγεί στον σχηματισμό μεγάλων σε μέγεθος συμπυκνωμένων ταννινών, πολύ πιο πολύπλοκων από αυτές που εκχυλίζονται από τα σταφύλια. Αυτά τα μεγάλα πολυμερή είναι λιγότερο επιρρεπή στο να συμπυκνωθούν με ανθοκυάνες, σε σχέση με τις μικρότερες προκυανιδίνες ή κατεχίνες. Λόγω της ευαισθησίας των ελεύθερων ανθοκυανών στη μη αντιστρεπτή υποβάθμιση, είναι επιθυμητός ο πολυμερισμός τους με τις κατεχίνες και προκυανιδίνες να συμβαίνει γρήγορα κατά την ωρίμανση του κρασιού, αφού προστατεύει τα μόρια των ανθοκυανών από την οξείδωση. Οι παράγοντες που καθυστερούν τον πολυμερισμό ανθοκυανών - φλαβονοειδών, αυξάνουν την πιθανότητα της μη αναστρέψιμης οξείδωσης των ανθοκυανών (και το καφέτισμα). Ένας τέτοιος παράγοντας είναι η προσθήκη θειώδη ανυδρίτη που οδηγεί στον σχηματισμό ενώσεων με τις ανθοκυάνες. Σε αυτή τη περίπτωση, ο πολυμερισμός εμποδίζεται, καθώς αυτή η προσθήκη γίνεται στον ίδιο άνθρακα που συνδέει τις ανθοκυάνες με τα φλαβονοειδή. Ο πολυμερισμός απωθεί το νερό, προστατεύοντας έτσι τις ανθοκυάνες από μία πυρηνόφιλη προσβολή. Τα σύμπλοκα που σχηματίζονται από τον πολυμερισμό ανθοκυανών - ταννινών είναι σταθερά και διατηρούν το κόκκινο χρώμα των ανθοκυανών. Ένα μεγαλύτερο ποσοστό των ανθοκυανών είναι σε έγχρωμη μορφή (μορφή φλαβυλίου και κατάσταση άνυδρης βάσης υπό τη μορφή κιννόνης) όταν συνδέονται με ταννίνες, 109

111 παρά όταν είναι ελεύθερες. Για παράδειγμα, το 60% των πολυμερισμένων ανθοκυανών είναι έγχρωμο σε ph 3.4, ενώ μόνο το 20% του αντίστοιχου ποσού των ελεύθερων ανθοκυανών είναι έγχρωμο στο ίδιο ph. Αυτό φανερώνει τον σημαντικό ρόλο που παίζουν το ph και ο πολυμερισμός στο ζωηρό χρώμα των κόκκινων κρασιών. Ο πολυμερισμός είναι, επίσης, σημαντικός και στη γεύση των κόκκινων κρασιών, αφού αυξάνει τη διαλυτότητα των φλαβονοειδών πολυμερών (ταννίνες). Επίσης, είναι σημαντικός στη ελάττωση της καθίζησης των ταννινών. Οι μη φλαβονοειδείς ταννίνες που εκχυλίζονται από τα δρύινα βαρέλια δεν συμμετέχουν σημαντικά στις αντιδράσεις πολυμερισμού με ανθοκυάνες. Παρ όλα αυτά, ευνοούν τη σταθερότητα του χρώματος έμμεσα, προστατεύοντας τις ανθοκυάνες και τις φλαβονόλες από την οξείδωση (Jackson 2008, Κουράκου 1998). Oι πιο άφθονες, αλλά άχρωμες, πυρηνόφιλες ανθοκυάνες σε ημικεταλική μορφή παράγουν προϊόντα προσθήκης Τ-Α. Αυτά σχηματίζονται καθώς ο C8 (ή ο C6) ενός μορίου ανθοκυάνης, ενώνεται με τον ηλεκτρονιόφιλο C4 μίας τερματικής φλαβονοειδούς μονάδας μίας προκυανιδίνης ή μίας μικρής συμπυκνωμένης ταννίνης (Εικ. 23). Μέσω της αφυδάτωσης, παράγουν έγχρωμες ενώσεις φλαβυλίου, οι οποίες ενισχύουν το χρώμα. Τέτοια πολυμερή μπορούν να έχουν πάνω από οκτώ φλαβονοειδείς υπομονάδες. Αντίθετα, η αλληλεπίδραση των ηλεκτρονίων μεταξύ του C4 μίας ηλεκτρονιόφιλης ανθοκυάνης υπό τη μορφή φλαβυλίου και του C8 (ή C6) μίας πυρηνόφυλης φλαβαν-3-όλης, μίας προκυανιδίνης, ή ενός μορίου κατεχίνης ή επικατεχίνης, σχηματίζει προϊόντα προσθήκης Α-Τ. Η ένωση αυτή αρχικά παράγει άχρωμα σύμπλοκα (ημικετάλες). Η επακόλουθη οξείδωση θεωρείται ότι καταλήγει στην αποκατάσταση της έγχρωμης μορφής του φλαβυλίου. Περαιτέρω δομική αναδιάταξη μπορεί να παράγει κιτρινοπορτοκαλί μορφές ξανθυλίου. Η δομή του ξανθυλίου σχηματίζεται από την αντίδραση της αφυδάτωσης μεταξύ του C5 μιας ανθοκυάνης και του C8 ενός φλαβονοειδούς. Έτσι, σχηματίζεται ένας δακτύλιος πυρανίου μεταξύ των δύο αυτών μορίων (Jackson 2008). Ο πολυμερισμός μαζί με την οξείδωση μεταβάλλουν το χρώμα των ανθοκυανών, και το κρασί αποκτά ένα κεραμιδί χρώμα. Η οξείδωση των ελεύθερων ανθοκυανών διευκολύνει το σχηματισμό ενώσεων με τις προκυανιδίνες και τις ολιγομερείς ταννίνες, με συνέπεια τη δημιουργία έγχρωμων ενώσεων Τ-Α, που έχουν διαφορετικά 110

112 χρώματα από τις ελεύθερες ανθοκυάνες και είναι αρκετά σταθερές στις μεταβολές του ph και στο χρόνο, γεγονός που επιτρέπει στα κόκκινα κρασιά να διατηρήσουν το χρώμα τους κατά την αποθήκευση και την παλαίωση. Ο σχηματισμός των ενώσεων Τ-Α εξαρτάται από τη φύση και την ποσότητα των ανθοκυανών και των ταννινών που θα εκχυλιστούν κατά την οινοποίηση. Το χρώμα των φρέσκων κόκκινων κρασιών είναι, επομένως, στενά εξαρτώμενο από τον πλούτο του φλοιού των ραγών σε ανθοκυάνες, την ωριμότητα των γιγάρτων που εμπλουτίζουν το ζυμούμενο γλεύκος σε προκυανιδίνες, και τη μέθοδο της οινοποίησης που καθορίζει τις συνθήκες εκχύλισης (Κουράκου 1998). Εικ. 23: Πιθανός μηχανισμός σχηματισμού προϊόντων προσθήκης Τ-Α και T-Τ Κατά τη διάρκεια της προζυμωτικής εκχύλισης οι άμεσες αντιδράσεις του σχηματισμού του συμπλόκου Α-Τ, παράγουν άχρωμες ενώσεις, που αντιδρούν όταν γίνεται η αποστράγγιση του κρασιού, μετά την αλκοολική ζύμωση. Αντίθετα μέσα στις δεξαμενές οινοποίησης δεν ευνοείται ο σχηματισμός ενώσεων Τ-Α λόγω του έντονα αναγωγικού περιβάλλοντος. Ο σχηματισμός του συμπλόκου Τ-Α παρεμποδίζεται από τον θειώδη ανυδρίτη, ο οποίος ενώνεται με τις ελεύθερες 111

113 ανθοκυάνες και από το φως, το οποίο τις καταστρέφει. Αντίθετα, το οξυγόνο, λόγω των οξειδώσεων που προκαλεί, ευνοεί των σχηματισμό των ενώσεων Τ-Α, και είναι αυτό που καθιστά αναγκαία την παλαίωση των κόκκινων κρασιών σε βαρέλια. Όταν τα κρασιά παραμένουν προς ωρίμανση και παλαίωση σε βαρέλια, με μικρή περιεκτικότητα σε θειώδη ανυδρίτη, επέρχονται πολυμερισμοί σε ακόμη μεγαλύτερο βαθμό, οπότε οι ιδιότητες των ενώσεων Τ-Α μεταβάλλονται και πλησιάζουν αυτές των συμπυκνωμένων ταννινών. Οι απλές ενώσεις Τ-Α ονομάζονται συμπυκνωμένες ανθοκυάνες, ενώ οι ενώσεις μεγαλύτερου βαθμού πολυμερισμού, πολυμερισμένες ανθοκυάνες (Κουράκου 1998). Πολυμερισμός ανθοκυανών - ταννινών μέσω ακεταλδεΰδης Παρόλο που οι ανθοκυάνες πολυμερίζονται με φλαβονοειδή, η αντίδραση γίνεται με αργό ρυθμό στο κρασί. Η ένωση αυτή ενισχύεται από την παρουσία της ακεταλδεΰδης. Σε χαμηλά ph, η ακεταλδεΰδη βρίσκεται υπό τη δραστική μορφή του ιόντος καρβονίου (Εικ. 25). Σε αυτή την κατάσταση, η ακεταλδεΰδη μπορεί να αντιδράσει με τον πυρηνόφιλο (αρνητικά φορτισμένο) C8 μίας τερματικής μονάδας μίας προκυανιδίνης. Κατά την αφυδάτωση, η ομάδα της ακεταλδεΰδης μπορεί να συνδεθεί με τον C8 μίας ανθοκυάνης στην ημικεταλική κατάσταση. Περαιτέρω αφυδάτωση, μετατρέπει την άχρωμη ημικεταλική μορφή σε έγχρωμη μορφή του φλαβυλίου ή της άνυδρης βάσης κιννόνης, ενισχύοντας έτσι το χρώμα. Παρόμοιες συνδέσεις του μορίου ακεταλδεΰδης-προκυανιδίνης οδηγούν στον πολυμερισμό της ομάδας της φλαβαν-3-όλης, δημιουργώντας ενώσεις Τ-Τ, είτε μέσω του πυρηνόφιλου C8 τους, είτε μεταξύ του C8 του ενός φλαβανοειδούς με τον C6 του άλλου. Οι αντιδράσεις αυτές παρουσιάζονται στην Εικ. 25. Παρόλο που οι χαμηλές θερμοκρασίες των κελαριών καθυστερούν τον σχηματισμό των ενώσεων Τ-Τ και Τ-Α, είναι επιθυμητές γιατί περιορίζουν τον σχηματισμό υπερβολικά μεγάλων έγχρωμων πολυμερών, τα οποία καθιζάνουν και οδηγούν σε απώλεια του χρώματος (Jackson 2008). Η ακεταλδεΰδη που παράγεται από τις ζύμες κατά την αλκοολική ζύμωση, είναι σημαντική, αφού σχηματίζονται άμεσα αυτά τα έγχρωμα πολυμερή. Η παρουσία της αιθανόλης και της ακεταλδεΰδης μειώνουν τον φαινόμενο του σχηματισμού των 112

114 έγχρωμων συμπλόκων (copigmentation), ενώ ευνοούν τον παραπάνω πολυμερισμό που περιλαμβάνει ακεταλδεΰδη. Εικ. 25: Μηχανισμός αντιδράσεων σχηματισμού προϊόντων Τ-Α και Τ-Τ υπό την παρουσία ακεταλδεΰδης Εικ. 24: Αυτοοξείδωση ο-διφαινολών για την παραγωγή πολυμερών ο-διφαινολών και υπεροξειδίου του υδρογόνου 113

115 Η πιο δραστική ανθοκυάνη στον σχηματισμό αυτών των πολυμερών είναι η μαλβιδίνη, η πιο συνηθισμένη ανθοκυάνη των σταφυλιών. Ο πολυμερισμός γίνεται σχετικά γρήγορα, αλλά απαιτεί την αυτοοξείδωση των φαινολικών του κρασιού, παρουσία οξυγόνου. Αυτό εξηγεί την ενίσχυση και τη σταθεροποίηση του χρώματος των κόκκινων κρασιών, όταν αυτά εκτίθενται σε μικρά ποσά οξυγόνου (περίπου 40 mg O2/έτος). Κατά τη διάρκεια της αυτοοξείδωσης των ορθο-διφαινολών, που καταλύεται από ιόντα χαλκού ή σιδήρου, παράγεται υπεροξείδιο του υδρογόνου και μία ορθο-δικιννόνη. Η ορθο-δικινόνη που παράγεται μπορεί να αντιδράσει με μία ορθο-διφαινόλη, ώσπου τελικά να παραχθεί ένα διμερές ορθο-διφαινόλης (Εικ. 24). Το υπεροξείδιο του υδρογόνου που παράγεται ενεργοποιεί την οξείδωση της αιθανόλης σε ακεταλδεΰδη, υπό την παρουσία ιόντων χαλκού και σιδήρου. Στη συνέχεια, η ακεταλδεΰδη ενεργοποιεί τις αντιδράσεις πολυμερισμού ανθοκυανώνταννινών. Η έκταση αυτών των αντιδράσεων, εξαρτάται από την πρόσληψη του οξυγόνου, την παρουσία του θειώδη ανυδρίτη, και την ποσότητα καθώς και τον τύπο των κατεχινών και των πολυμερών τους, των προκυανιδινών (Jackson 2008) Πυρανοανθοκυάνες Άλλοι μηχανισμοί της αρχικής σταθεροποίησης του χρώματος περιλαμβάνουν την άμεση αντίδραση μεταξύ της μαλβιδίνης και των παραπροϊόντων των ζυμών, όπως η ακεταλδεΰδη και οι βινυλοφαινόλες (π.χ. παράγωγα των κινναμικών οξέων). Οι ενώσεις που προκύπτουν ονομάζονται πυρανοανθοκυάνες (Εικ. 26). Σχηματίζεται ένας επιπλέον δακτύλιος πυρανίου μεταξύ του C4 και μιας υδροξυλομάδας του C5 της ανθοκυάνης. Οι ενώσεις αυτές είναι Εικ. 26: Δομή των τριών κατηγοριών πυροανθοκυανών (πορτισίνες, βιτισίνες, πινοτίνες) που έχουν βρεθεί στο κρασί 114

116 πολύ σταθερές και ανθεκτικές στον αποχρωματισμό του θειώδη ανυδρίτη και συντελούν στη σταθεροποίηση του χρώματος. Εκτός από μερικές πορτισίνες, που είναι μπλε, οι περισσότερες πυρανοανθοκυάνες έχουν κιτρινοπορτοκαλί χρώματα. Πιθανώς, συντελούν στο καστανόξανθο χρώμα που σχετίζεται με την παλαίωση. Οι κύριες μονομερείς ανθοκυάνες που παραμένουν στα παλαιωμένα κρασιά είναι οι βιτισίνες, τα προϊόντα της αντίδρασης μεταξύ της μαλβιδίνης και του πυροσταφυλικού οξέος (βιτισίνες Α), ή της ακεταλδεΰδης (βιτισίνες Β). Και αυτές μπορούν να ακυλιωθούν, όπως οι ανθοκυάνες. Σχηματίζονται κατά τα αρχικά στάδια της ζύμωσης. Επίσης, μπορούν να σχηματίσουν πολυμερή με τις ταννίνες. Οι πινοτίνες σχηματίζονται μεταξύ των ανθοκυανών και των παραγώγων του κινναμικού οξέoς, όπως το καφεϊκό οξύ. Έχουν την τάση να συσσωρεύονται μετά τη ζύμωση. Οι πορτισίνες προέρχονται από τα προϊόντα προσθήκης ανθοκυανών-πυροσταφυλικού οξέος και τις φλαβονόλες, υπό την παρουσία ακεταλδεΰδης. Σχηματίζονται καθώς τα αρχικά προϊόντα της αντίδρασης υφίστανται κυκλοποίηση και οξείδωση. Άλλες κιτρινωπές χρωστικές που έχουν απομονωθεί, προέρχονται από τις ανθοκυάνες με ακετοξικό οξύ (Jackson 2008) Προϊόντα ξανθυλίου Οι ανθοκυάνες και οι φλαβαν-3-όλες μπορούν, επίσης, να ενωθούν με γλυοξυλικό οξύ, παράγοντας πορτοκαλοκίτρινα προϊόντα ξανθυλίου. Το γλυοξυλικό οξύ είναι προϊόν της οξείδωσης του τρυγικού οξέος, καταλυόμενης από ιόντα μετάλλων. Τα προϊόντα ξανθυλίου ενώνονται με φλαβανόλες και σχηματίζουν περίπλοκες δομές ταννινών. Τέλος, το γλυοξυλικό οξύ μπορεί να συμπυκνωθεί με προϊόντα υποβάθμισης των ανθοκυανών (π.χ. φλωρογλυκινόλες) και κατεχίνες, σχηματίζοντας επιπλέον κιτρινωπές Εικ. 27: Δομή μορίου ξανθυλίου χρωστικές (Jackson 2008). 115

117 5.4 Εξέλιξη του χρώματος των κόκκινων κρασιών Ενώ τα φρέσκα κόκκινα κρασιά παίρνουν το χρώμα τους από τις ελεύθερες ανθοκυάνες, τα παλαιωμένα κρασιά δεν περιέχουν καθόλου ελεύθερες, αλλά πολυμερισμένες. Ένα μέρος τους αποδομήθηκε και ένα άλλο ενώθηκε με ταννίνες. Αν και η ένωση των ανθοκυανών είτε με ανθοκυάνες, είτε με ταννίνες, είτε με άλλες ενώσεις συμβαίνει στα πρώτα στάδια της εξέλιξης του χρώματος, κατά τη διάρκεια της αλκοολικής ζύμωσης και μετά την ολοκλήρωσή της, η μακροχρόνια σταθερότητα του χρώματος οφείλεται στον επακόλουθο σχηματισμό πολυμερών μεταξύ ανθοκυανών και ταννινών. Το ποσοστό του πολυμερισμού των ανθοκυανών με τις ταννίνες θεωρείται δείκτης της χημικής ηλικίας του κρασιού. Σε μερικά κρασιά εμφανίζεται υψηλό ποσοστό πολυμερισμού, χωρίς να έχει το κρασί τους οργανοληπτικούς χαρακτήρες του ώριμου και παλαιού κρασιού. Σε τέτοια περίπτωση, το ποσοστό πολυμερισμού υποδηλώνει το πρόωρο γέρασμα, δηλαδή μεγάλη χημική ηλικία που δεν είναι συμβατή με την πραγματική ηλικία του κρασιού. Έτσι, για ένα φρέσκο κρασί με έντονο χρώμα, που θα εξελιχθεί αργά κατά την αποθήκευση, χρειάζεται όχι μόνο να εκχυλιστούν κατά την οινοποίηση πολλές ανθοκυάνες και ταννίνες, αλλά και να αποθηκευτεί το κρασί σε συνθήκες που ευνοούν την ένωση ανθοκυανών και ταννινών, αλλά όχι τον έντονο και γρήγορο πολυμερισμό τους. Για αυτό επιβάλλεται παλαίωση σε δρύινα βαρέλια, απουσία ηλιακού φωτός και σε χαμηλές θερμοκρασίες. Εάν το φρέσκο κρασί δεν έχει επάρκεια ανθοκυανών ενωμένων με ταννίνες, το χρώμα του θα έχει την τάση να αποκτήσει γρήγορα καστανοκίτρινες αποχρώσεις, λόγω πολυάριθμων διασπάσεων των ελεύθερων ανθοκυανών. Η προστασία που παρέχουν στις ανθοκυάνες οι ταννίνες, είναι συνάρτηση της ποσότητάς τους. Στην έλλειψη ταννινών οφείλεται το ευοξείδωτο του χρώματος των ροζέ κρασιών, και των κόκκινων κρασιών πρώιμης κατανάλωσης όταν έχουν παρασκευαστεί με τη μέθοδο της ανθρακικής αναεροβίωσης. Όταν τα κρασιά παραμένουν προς ωρίμανση και παλαίωση σε βαρέλια, είναι καθοριστικές οι αλλαγές που γίνονται στο χρώμα των κρασιών. Οι αντιδράσεις με την ακεταλδεΰδη διευκολύνονται, αφού το βαρέλι επιτρέπει τη διείσδυση του οξυγόνου 116

118 και έτσι το κρασί οξειδώνεται, ενώ παράλληλα απελευθερώνονται ελλαγιταννίνες που δρουν σαν συμπαράγοντες οξείδωσης. Οι άμεσες αντιδράσεις σχηματισμού συμπλόκων Τ-Α συμβαίνουν, επίσης, όταν η παλαίωση γίνεται σε αεριζόμενες δεξαμενές, και διασφαλίζεται ο ήπιος αερισμός που οδηγεί σε περιορισμένη οξυγόνωση. Τότε οι αντιδράσεις αυτές είναι πολύ αργές, εκτός και αν η θερμοκρασία είναι σχετικά υψηλή (>20 C). Το χρώμα αυξάνεται λίγο και είναι πιθανή η δημιουργία κίτρινης χροιάς κατά τη διάρκεια του καλοκαιριού. Το κρασί μπορεί επίσης να πάρει κίτρινες αποχρώσεις και στο βαρέλι, όταν η θερμοκρασία υπερβαίνει τους 20 C. Όταν η οξείδωση γίνει με μεγάλη ταχύτητα είναι πιθανό να συμβούν αντιδράσεις διάσπασης των ανθοκυανών, με συνέπεια την απώλεια χρώματος, που πιθανώς να ακολουθείται από το σχηματισμό γλυοξυλικού οξέος και κίτρινων ξανθυλίων. Το τελικό αποτέλεσμα εξαρτάται από τις σχετικές ποσότητες των ανθοκυανών και των ταννινών του οίνου. Κατά τη διάρκεια της παλαίωσης σε φιάλη, η οποία χαρακτηρίζεται από πλήρη έλλειψη οξυγόνου, το χρώμα εξελίσσεται πολύ γρήγορα σε κεραμιδί και πορτοκαλί. Αυτή η τροπή εξαρτάται κυρίως από την περιεκτικότητα σε φαινολικά συστατικά. Μια μακρά περίοδος παλαίωσης σε φιάλη περιλαμβάνει διάφορες αντιδράσεις οι οποίες συνεχίζονται μέχρι την ολοκλήρωση της εξέλιξης του οίνου. Οι αντιδράσεις αυτές προκαλούν πολυμερισμό των ταννινών και των ανθοκυανών. Είναι επίσης πιθανό να σχηματιστούν μικκύλια τα οποία γίνονται υδρόφοβα και καθιζάνουν, ακόμα και αν οι πολυμερισμένες ταννίνες έχουν μέγεθος μικρότερο από 100 Å. Αυτά τα ασταθή κολλοειδή παρατίθενται σε στοιβάδες, οι οποίες περιβάλλουν τα πλευρικά τοιχώματα των φιαλών. Εκτός από τις ταννίνες και τις ανθοκυάνες, κάλιο και σίδηρος είναι παρόντα, όπως και νιτρικά, και σε ορισμένες περιπτώσεις μικρές ποσότητες πολυσακχαριτών. Εάν ένα φρέσκο κρασί τοποθετηθεί στο ψυγείο αμέσως μετά την ολοκλήρωση της μηλογαλακτικής ζύμωσης, γρήγορα θα αποκτήσει θολερότητα και θα σχηματιστεί ίζημα. Η εμφάνιση αυτού του ιζήματος είναι τελείως διαφορετική από αυτό που προκύπτει σε φιάλες παλαιωμένου κρασιού. Πρόκειται για ίζημα ζελατινώδες και έντονα λαμπερό κόκκινο με χαρακτηριστική στιλπνότητα. Είναι παρόμοιο με τα υπολείμματα που παραμένουν στα βαρέλια και τις δεξαμενές. Η σύνθεση αυτού του 117

119 ιζήματος είναι σχετικά σταθερή: τρυγικά, ανθοκυάνες, ταννίνες και πολυσακχαρίτες. Η κατακρήμνιση του όξινου τρυγικού καλίου είναι γνωστό φαινόμενο. Η φυσικοχημική μεταβολή που συμβαίνει στο κρασί κατά την παλαίωση σε βαρέλι και σε φιάλη έγκειται στο σχηματισμό αυτής της κολλοειδούς χρωστικής ουσίας, κυρίως κατά τη διάρκεια του καλοκαιριού και στην κατακρήμνισή της κατά τη διάρκεια του χειμώνα. Το χαρακτηριστικό αυτό το έχουν όλα τα κρασιά, ορισμένα από αυτά σε μεγαλύτερο βαθμό, ειδικά όταν οι οινοποιητικές μέθοδοι προάγουν την έντονη εκχύλιση. Τα κρασιά έχουν επίσης περισσότερες κολλοειδείς χρωστικές εάν τα σταφύλια από τα οποία προέρχονται έχουν προσβληθεί από σήψη, έχουν υπερθερμανθεί κατά τη διάρκεια ζύμωσης σε υψηλές θερμοκρασίες, ή έχουν υποστεί μηχανική κατεργασία (έντονο σπάσιμο, άντληση, ανακάτεμα κλπ.). Όλα αυτά οδηγούν σε αναγκαστική εκχύλιση είτε μη υδρολυόμενων πολυσακχαριτών από τους φλοιούς των σταφυλιών, είτε εξωκυτταρικών πολυσακχαριτών από τους μύκητες. Αυτά τα κολλοειδή είναι σχετικά ασταθή, ανάλογα με το μέγεθος του μορίου τους. Σχηματίζουν μια κολλοειδή βάση για τις χρωστικές ουσίες και χρωματίζονται από τα φαινολικά συστατικά κατά την κατακρήμνιση. Ο βαθμός κατακρήμνισης επίσης εξαρτάται από την περιεκτικότητα του κρασιού σε αιθανόλη και τη θερμοκρασία αποθήκευσης (Συμεού 2010). 5.5 Μεταβολές φαινολικών συστατικών και χρώματος στα λευκά κρασιά Στα ξηρά λευκά κρασιά η συνολική περιεκτικότητα σε φαινολικά συστατικά κυμαίνεται από 50 μέχρι 250 mg/l, δηλαδή λιγότερο από το 10% της αντίστοιχης τιμής των κόκκινων κρασιών. Οι τιμές αυτές είναι ακόμα μικρότερες όταν πρόκειται για γλυκά λευκά κρασιά που έχουν παραχθεί από ευγενή σήψη, ενώ στην περίπτωση των γλυκών λευκών κρασιών από σταφύλια που συμπυκνώθηκαν με ξήρανση, το ποσό των φαινολικών συστατικών πλησιάζει αυτό των κόκκινων κρασιών. Όπως έχει αναφερθεί, τα λευκά γλεύκη και τα κρασιά περιέχουν βενζοϊκά και κινναμικά οξέα, κατεχίνες, προκυανιδίνες, και φλαβονόλες. Έχουν, επίσης, βρεθεί και σύμπλοκα πρωτεϊνών - ταννινών, τα οποία συνεισφέρουν στο ολικό φαινολικό φορτίο των λευκών κρασιών. Από το χαμηλό ποσοστό των φαινολικών συστατικών που βρίσκονται στα λευκά κρασιά, το μεγαλύτερο το κατέχουν τα άμεσα διαλυτά μη 118

120 φλαβονοειδή (υδροξυκινναμικά), όπως το καφταρικό οξύ και τα παράγωγά του, κουταρικό οξύ και φερουλικό οξύ (Jackson, 2008, Ribèreau - Gayon et al., 2006). Σε αντίθεση με τα κόκκινα κρασιά, σχετικά λίγα είναι γνωστά για την ανάπτυξη και τη χημική φύση του χρώματος των λευκών κρασιών. Το ιδιαίτερα έντονο κίτρινο χρώμα των γλυκών λευκών κρασιών είναι διαφορετικό από αυτό των ξηρών, ακόμα και όταν είναι οξειδωμένα. Η χρήση πηκτινολυτικών ενζύμων, κατά την οινοποίηση, ενισχύει την υδρόλυση του καφταρικού οξέος στα συστατικά του, καφεϊκό και τρυγικό οξύ. Μετά την έκθλιψη των σταφυλιών, το καφταρικό οξύ και οι σχετικές ο-διφαινόλες οξειδώνονται άμεσα υπό τη παρουσία της πολυφαινολοξειδάσης των σταφυλιών και του οξυγόνου. Αυτά τα συστατικά, καθώς και τα οξειδωμένα τους προϊόντα, μπορούν να αντιδράσουν με το τριπεπτίδιο της γλουταθειόνης για να σχηματίσουν άχρωμα S-γλουταθειονυλικά σύμπλοκα. Αυτά τα σύμπλοκα, ενώνονται με άλλα συστατικά και καθιζάνουν. Παρά την περεταίρω οξείδωσή τους, π.χ. από τη λακκάση που προέρχεται από τα σταφύλια που έχουν υποστεί σήψη, τα άχρωμα σύμπλοκα γλουταθειόνης-υδροξυκινναμικού οξέος συνήθως δεν πολυμερίζονται και δεν σχηματίζουν καστανές έγχρωμες ενώσεις. Συνεπώς, η προστασία του γλεύκους από το οξυγόνο κατά την έκθλιψη, ή η προσθήκη θειώδη ανυδρίτη για την αδρανοποίηση των πολυφαινολοξειδασών, εμποδίζουν το σχηματισμό συμπλόκων γλουταθειόνης-υδροξυκινναμικού οξέος, και συμβάλλουν στο επακόλουθο καφέτισμα του κρασιού. Το περιεχόμενο σε γλουταθειόνη των σταφυλιών αυξάνεται σημαντικά κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης. Ποικιλίες με υψηλή περιεκτικότητα σε υδροξυκινναμικά οξέα, αλλά χαμηλή σε γλουταθειόνη, παρουσιάζουν αυξημένες πιθανότητες για καφέτισμα του κρασιού τους (Jackson 2008). Η τυροσόλη (p-υδροξυφαινυλαιθυλαλκοόλη) είναι η κύρια φαινολική ουσία που απαντάται σε διάφορα είδη λευκών κρασιών. Παράγεται από την τυροσίνη, με τη δράση των ζυμών και απαντάται σε συγκεντρώσεις από 6 έως 25 mg/l. Σε περίπτωση προσβολής από τον Botrytis cinerea, τα περισσότερα φαινολικά συστατικά με προέλευση τους φλοιούς, εκτός από την τυροσόλη, καταστρέφονται, όχι όμως και αυτά που προέρχονται από τα γίγαρτα (Ribèreau - Gayon et al., 2006). Επειδή οι φλαβονόλες και οι άλλες φλαβονοειδείς φαινόλες εκχυλίζονται σχετικά αργά, βρίσκονται σε σημαντικές συγκεντρώσεις μόνο στα γλεύκη που έχουν 119

121 παραμείνει κάποιο διάστημα σε επαφή με τα στέμφυλα. Θεωρείται ότι το μεγαλύτερο μέρος του κιτρινωπού χρωματισμού των φρέσκων λευκών κρασιών, προέρχεται από την περιορισμένη εκχύλιση και την οξείδωση των φλαβονολών, όπως η κερκετίνη και η καιμπφερόλη (Jackson 2008). Οι φλαβανόλες που περιέχονται στα λευκά κρασιά είναι κυρίως κατεχίνες και πολυμερή γαλλοκατεχινών. Ένας μέρος του καφετιάσματος μπορεί να οφείλεται στον σχηματισμό έγχρωμων ξανθυλιοκατιόντων, από κατεχίνες και γλυοξυλικό οξύ (μέσω της οξείδωσης του τρυγικού οξέος). Οι ταννίνες από τον πολυμερισμό των προκυανιδινών είναι, επίσης, κίτρινες και το χρώμα τους ποικίλει ανάλογα με το επίπεδο της οξείδωσης. Η οξείδωση των ξηρών λευκών κρασιών οδηγεί στο καφέτισμα, εξαιτίας των τροποποιήσεων των ταννινών και των ιδιαίτερα ευοξείδωτων παραγώγων του καφταρικού οξέος, καθώς και του ίδιου. Τα υπόλοιπα συστατικά είναι σχετικά ανεπηρέαστα από την οξείδωση. Μέσα σε ένα χρόνο, η μείωση στη συγκέντρωση των κατεχινών των λευκών κρασιών μπορεί να φτάσει το 35 με 50% (Jackson, 2008, Ribèreau - Gayon et al., 2006). Τα μη φλαβονοειδή και οι λιγνίνες που εκχυλίζονται από τα δρύινα βαρέλια κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης του κρασιού, συνεισφέρουν στο χρώμα των λευκών κρασιών. Για παράδειγμα, κατά την οξείδωση, το καφεϊκό οξύ μπορεί να πολυμεριστεί, σχηματίζοντας διμερή και τριμερή. Το χρυσοκίτρινο χρώμα των παλαιών λευκών κρασιών, ίσως προέρχεται από την οξείδωση τέτοιων φαινολικών και πιθανώς γαλακτουρονικού οξέος. Αυτές οι ουσίες είναι γνωστό ότι ενισχύουν την απορρόφηση στο ορατό φάσμα ( nm). Οι χρυσωπές χροιές των γλυκών λευκών κρασιών οφείλονται στο σχηματισμό μελανοειδών συστατικών από τις αντιδράσεις Maillard, ή την καραμελοποίηση των σακχάρων. Αυτές οι δύο σειρές αντιδράσεων συμβάλλουν, επίσης, στον καστανωπό χρωματισμό των κρασιών που έχουν εκτεθεί σε θέρμανση, όπως είναι η Μαδέρα και το Vin santo (Jackson 2008). 120

122 6 Αποθήκευση-συσκευασία 6.1 Διαλυμένο οξυγόνο στο κρασί Η σημαντικότερη παράμετρος για τη διατήρηση της ποιότητας κατά την αποθήκευση του κρασιού είναι ο περιορισμός του ελεύθερου οξυγόνου στον υπερκείμενο χώρο της συσκευασίας αλλά και της ποσότητας διαλυμένου οξυγόνου που περιέχεται στο κρασί. Οι κύριες ανεπιθύμητες δράσεις του οξυγόνου είναι η ανάπτυξη αλλοιογόνων αερόβιων μικροοργανισμών και οι οξειδώσεις συστατικών του κρασιού. Η απομάκρυνση του οξυγόνου του αέρα στον υπερκείμενο χώρο γίνεται με τη διαβίβαση κάποιου αδρανούς αερίου. Όλες οι δράσεις του οξυγόνου στο κρασί δεν είναι αρνητικές. Σε ορισμένες περιπτώσεις κατά την ωρίμανση, ειδικά ερυθρών κρασιών σε βαρέλια, παρέχεται στο κρασί μια μικρή, ελεγχόμενη δόση οξυγόνου που αναπτύσσει περεταίρω τον οργανοληπτικό του χαρακτήρα (μικροοξυγόνωση). Η ποσότητα του οξυγόνου που απαιτείται για τη βέλτιστη εξέλιξη ποικίλει από κρασί σε κρασί. Η έλλειψη επαρκούς οξυγόνου μπορεί να προκαλέσει αναγωγικά φαινόμενα στο συσκευασμένο κρασί (Vidal & Aagaard, 2008). Από την άλλη περίσσεια οξυγόνου μπορεί να αλλοιώσει τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του κρασιού (κυρίως μέσω της δράσης του με τα φαινολικά συστατικά που αναπτύχθηκε σε προηγούμενο κεφάλαιο). Τα λευκά κρασιά λόγω του χαμηλού φαινολικού περιεχομένου τους είναι πιο ευάλωτα σε οξειδωτικά φαινόμενα. Οι οινοπαραγωγοί στοχεύουν σε τιμές διαλυμένου οξυγόνου μέχρι 0,2-0,4 mg/l στο κρασί πριν την εμφιάλωση, ενώ σε κρασιά με μεγάλες συγκεντρώσεις φαινολικών είναι αποδεκτές τιμές μέχρι 1 mg/l. Βασικές παράμετροι που επηρεάζουν την ποσότητα διαλυμένου οξυγόνου που περιέχεται στο κρασί είναι ο τύπος της συσκευασίας, ο τρόπος και το υλικό της εμφιάλωσης όταν γίνεται χρήση φιαλών, η ύπαρξη και η σύσταση τροποποιημένης ατμόσφαιρας αδρανούς αερίου καθώς και ο τρόπος και η ταχύτητα παροχής του αδρανούς αερίου (Robertson, 2009). Όταν γίνεται «ξέπλυμα» με ποσότητες αδρανών αερίων περίπου διπλάσιες του όγκου της φιάλης είναι δυνατό να μειωθεί το διαλυμένο οξυγόνο σε συγκεντρώσεις 1-3 mg/l Η 121

123 θερμοκρασία και οι ανακίνηση του κρασιού κατά τη συσκευασία μπορούν επίσης να μεταβάλλουν την τιμή του διαλυμένου οξυγόνου (Boulton et al., 1999). Η μεταβολή του διαλυμένου οξυγόνου αφού συσκευαστεί το κρασί εξαρτάται από τη συγκέντρωσή του κατά την ολοκλήρωση της συσκευασίας, τον όγκο του υπερκείμενου χώρου, την παρουσία οξυγόνου στον υπερκείμενο χώρο και το ρυθμό εισροής του στη συσκευασία, που με τη σειρά του, εξαρτάται από τον τρόπο πωματισμού και το υλικό συσκευασίας (Robertson, 2009). 6.2 Συσκευασία Το κρασί συσκευάζεται είτε σε φιάλες, κυρίως γυάλινες αλλά και πλαστικές, είτε σε «ασκούς» ( Bag in Box ). Οι βασικές παράμετροι που καθορίζουν την επιλογή του υλικού συσκευασίες είναι η διατήρηση της ποιότητας του κρασιού, οι προσδοκίες των καταναλωτών, η αντίσταση στη διάβρωση του κρασιού, το κόστος του υλικού και το περιβαλλοντικό αντίκτυπο. Αν και η χρήση γυάλινων φιαλών έχει επικρατήσει στο μεγαλύτερο μέρος της βιομηχανίας, παράλληλα υπάρχει αυξανόμενη ζήτηση για εναλλακτικούς, φτηνούς, περιβαλλοντικά φιλικούς τρόπους συσκευασίας. Η επιλογή του εκάστοτε υλικού συσκευασίας μπορεί να έχει σημαντική επίδραση στη διατήρηση του κρασιού. Σημαντικότερη παράμετρο για τη διατήρηση του κρασιού κατά την αποθήκευση αποτελεί η διάχυση αερίων διαμέσου της συσκευασίας. Πιο συγκεκριμένα, ο έλεγχος των επιπέδων οξυγόνου που διαχέεται στο κρασί καθορίζει σε σημαντικό βαθμό τη διατήρηση της ποιότητας του προϊόντος καθώς τα οξειδωτικά φαινόμενα που λαμβάνουν χώρα λόγω της παρουσίας του οξυγόνου μπορούν να αλλοιώσουν το χρώμα και το γευστικό χαρακτήρα του κρασιού (Barbe et al., 2010). Επιπλέον, τα οξειδωτικά αυτά φαινόμενα συνεισφέρουν στην απώλεια αρωματικής φρεσκάδας, στη σύνθεση πτητικών αρωματικών ουσιών, σε αντιδράσεις ανθοκυανών, ταννινών και πτητικών θειολών καθώς και στη δημιουργία ιζήματος (Moutounet et al., 2004). Για παράδειγμα, οι πτητικές θειόλες αποτελούν σημαντικό παράγοντα κατά την αποθήκευση κυρίως λευκών κρασιών αφού είναι υπεύθυνες για χαρακτηριστικά αρώματα φρούτων. Η έρευνα των Thibon et al. (2008) έδειξε ότι η συγκέντρωση των πτητικών θειολών μειώνεται τόσο κατά την ωρίμανση σε βαρέλι όσο και μετά τη συσκευασία, παρουσία οξυγόνου. Παράλληλα, η συγκέντρωση μιας 122

124 άλλης ένωσης, της σοτολόνης (sotolon), που ανήκει στις λακτόνες και είναι υπεύθυνη για χαρακτηριστικά αρώματα που διαφοροποιούνται ανάλογα με τη συγκέντρωση της, αυξάνεται σημαντικά κατά την οξείδωση του κρασιού (Ghidossi et al., 2012). Η γυάλινη φιάλη αποτελεί το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο υλικό συσκευασίας του κρασιού. Το γυαλί αποτελεί ένα ανόργανο, στερεό, διαφανές, εύθραυστο, χωρίς κρυσταλλική δομή, αδιάλυτο στο νερό, θερμοπλαστικό και ρευστοποιήσιμο σε υψηλές θερμοκρασίες υλικό, το οποίο παρασκευάζεται με τήξη διάφορων οξειδίων το σημαντικότερο από τα οποία είναι η πυριτία (SiΟ2). Επιπλέον, περιέχει νάτριο, ασβέστιο, αλουμίνιο, μαγνήσιο ενώ οι φιάλες χρωματίζονται με διάφορα οξείδια που προστίθενται κατά την κατασκευή τους. Από χημικής άποψης δεν είναι απόλυτα ουδέτερο. Είναι αλκαλικό και αντιδρά με τα όξινα υγρά που προσβάλλουν την επιφάνεια του νέου γυαλιού. Ουσιαστικά πραγματοποιούνται αντιδράσεις ιοντοεναλλαγής μεταξύ κατιόντων νατρίου (Na + ) από την επιφάνεια του γυαλιού και κατιόντων (H + ). Τα άλλα συστατικά του γυαλιού εκχυλίζονται επίσης αλλά σε μικρότερο ποσοστό σε σχέση με το νάτριο και βρίσκονται σε ίχνη. Τα τελευταία χρόνια χρησιμοποιείται ένα εναλλακτικό πλαστικό υλικό για την παραγωγή φιαλών το τερεφθαλικό πολυαιθυλένιο ( PET ). Η χρήση του PET είναι ιδιαίτερα διαδεδομένη στη συσκευασία άλλων ποτών όπως αναψυκτικά, χυμοί και νερό. Το PET αποτελεί προϊόν πολυμερισμού των μονομερών της αιθανοδιόλης και του τερεφθαλικού διμεθυλεστέρα. Η χρήση του έχει πολλά πλεονεκτήματα όπως ευελιξία διαμόρφωσης αφού μπορεί να δώσει περιέκτες σχεδόν οποιασδήποτε μορφής, χρώματος και διαμέτρου. Επιπλέον, η συσκευασία αυτή προσφέρει πλήρη διαφάνεια, μικρό βάρος, υψηλή μηχανική εντολή και χαμηλό κόστος ενώ είναι και πλήρως ανακυκλώσιμο (Shirakura al., 2006). Για να εμποδιστεί παραπέρα η διαφυγή αερίου εκτός από μονοστρωματικές φιάλες είναι διαθέσιμες και πολυστρωματικές όπου μεταξύ των στρωμάτων του PET παρεμβάλλονται στρώματα ρητίνης. Χαρακτηριστικά παραδείγματα αυτών των ρητινών φραγμού αερίων περιλαμβάνουν ένα συμπολυμερές αιθυλενίου-βυνιλικής αλκοόλης (EVOH) καθώς και το MXD6 νάιλον. 123

125 Αρκετά διαδεδομένη είναι και η χρήση «ασκών» ( Bag in a Box ) για τη συσκευασία κρασιών. Συνήθως χρησιμοποιούνται για τη συσκευασία μεγαλύτερων όγκων κρασιών 2-20 L τα οποία δεν ενδείκνυνται για μακρά παλαίωση. Ο ασκός αποτελείται από έναν ανθεκτικό πλαστικό περιέκτη που όπως και με τη συσκευασία PET κατασκευάζεται από διαφορετικά στρώματα κυρίως πλαστικών πολυμερών ρητινών. Για την αύξηση της μηχανικής αντοχής του περιβάλλεται από ένα ανθεκτικό χάρτινο κουτί. Ο πλαστικός περιέκτης είναι συμπιέσιμος ώστε να εξωθεί το προϊόν από ένα επιστόμιο που είναι ενσωματωμένο στον περιέκτη. Διάφορες έρευνες έχουν δείξει ότι για τα κόκκινα κρασιά οι διαφορετικοί τύποι συσκευασίας δε διαφέρουν σημαντικά, ως προς τη διατήρηση του κρασιού και τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του, για ένα χρονικό διάστημα τουλάχιστον επτά (7) μηνών αφού αναστέλλουν τις περισσότερες δράσεις αλλοίωσης που συμβαίνουν τουλάχιστον κατά την περίοδο αυτή (Mentana et al., 2009). Τα λευκά κρασιά, αντίθετα, εμφανίζουν σημαντικές διαφορές ανάλογα με τη συσκευασία για διάρκεια αποθήκευσης 12 μηνών. Σε έρευνα των Ghidossi et al. (2012) οι γυάλινες φιάλες αποτέλεσαν τη μοναδική συσκευασία που διατήρησε επαρκώς το προϊόν τόσο οργανοληπτικά όσο και σε σχέση με τα επίπεδα του διαλυμένου οξυγόνου ενώ τη χειρότερη εξέλιξη παρουσίασαν τα κρασιά που συσκευάστηκαν σε φιάλες από PET. Όσον αφορά στον τρόπο πωματισμού των κρασιών που συσκευάζονται σε φιάλες, οι κυλινδρικοί φελλοί αποτελούν τον κλασσικό τρόπο εμφιάλωσης. Η στεγανότητα που προσφέρουν έναντι υγρών και αερίων καθώς και η μεγάλη συμπιεστότητα και ελαστικότητα τους, τους καθιστούν ιδανικούς για τον πωματισμό των φιαλών (Silva et al., 2005). Εντούτοις, ορισμένα προβλήματα που εμφανίζονται όπως η «αστοχία του φελλού» που οφείλεται κυρίως στη 2,4,6,-τριχλωροανισόλη (TCA), με αποτέλεσμα η εκάστοτε φιάλη να μη μπορεί να καταναλωθεί λόγω της οργανοληπτικής αλλοίωσης, καθώς και η μεταβλητότητα που παρουσιάζουν στη διαπερατότητα και διάχυση αερίων, που μπορεί να προκαλέσει οξειδώσεις μετά την εμφιάλωση, έχουν ως αποτέλεσμα την εμφάνιση και εναλλακτικών τρόπων πωματισμού με χαρακτηριστικότερο παράδειγμα το βιδωτό μεταλλικό πώμα, η χρήση του οποίου γίνεται ευρέως στην Αυστραλία και τη Νέα Ζηλανδία (Boulton, 2005). 124

126 Εκτός από τα βιδωτά μεταλλικά πώματα, χρησιμοποιούνται πώματα από θερμοπλαστικά πολυμερή που κατασκευάζονται με έγχυση σε καλούπια (injection molded) ή με εκβολή (extruded closures). (Liberati, 2005). 6.3 Χρήση αδρανών αερίων κατά την αποθήκευση Η χρήση των αδρανών αερίων είναι πλέον πολύ διαδεδομένη τόσο στην αποθήκευση του κρασιού, όσο και κατά την οινοποίηση, ειδικά με τις καινούριες τεχνικές οινοποίησης υπό αναερόβιες συνθήκες που χρησιμοποιούνται ευρέως σε μεγάλες βιομηχανικές μονάδες. Ο βασικός σκοπός της χρήσης αδρανών αερίων είναι να αντικαταστήσει το οξυγόνο στον υπερκείμενο χώρο ενός δοχείου κρασιού (είτε σε δεξαμενές, είτε σε συσκευασίες) ώστε να αποτρέψει μικροβιακές αλλοιώσεις, οξειδώσεις και άλλες χημικές δράσεις ενώ ταυτόχρονα ελαττώνει και τη συγκέντρωση διαλυμένου οξυγόνου στο κρασί. Για να αποτρέπεται η ανάπτυξη μικροοργανισμών στην επιφάνεια του κρασιού, το ποσοστό του οξυγόνου στον υπερκείμενο χώρο δε θα πρέπει να ξεπερνά το 0.5%. Η πλήρωση του υπερκείμενου χώρου γίνεται με ένα από τα αδρανή αέρια άζωτο (Ν2), διοξείδιο του άνθρακα (CO2) και αργό (Ar), ή κάποιο μίγμα τους (Rankine, 1996). Στοn Πίν. 7 παρουσιάζονται κάποιες βασικές ιδιότητες των αδρανών αυτών αερίων. Πίν. 7: Ιδιότητες αδρανών αερίων Ιδιότητα N2 CO2 Ar Μοριακό Βάρος (M r) Πυκνότητα [kg/m 3 ] (25 C, 1 atm) Διαλυτότητα σε υδατικό διάλυμα [g/l] (25 C, 1 atm) Το άζωτο είναι αδρανές, άοσμο και έχει μικρή διαλυτότητα στο νερό και το κρασί χωρίς συγκεκριμένη αντιβακτηριδιακή ή αντιμυκητιακή δράση. Επειδή είναι πιο ελαφρύ από τον ατμοσφαιρικό αέρα δεν είναι δυνατό να δημιουργήσει ένα στρώμα πάνω από την επιφάνεια του κρασιού ( blanketing ). Για το λόγο αυτό, η χρήση μόνο αζώτου ως αδρανούς αερίου προϋποθέτει ικανή ποσότητα του αερίου ώστε να εκτοπιστεί όλος ο ατμοσφαιρικός αέρας από τον υπερκείμενο χώρο ( flushing ). Απαιτείται, στη πραγματικότητα, ένας όγκος αερίου 3-7 φορές μεγαλύτερος από 125

127 αυτόν που αντιστοιχεί στον υπερκείμενο χώρο λόγω φαινομένων διασποράς και διάχυσης που συμβαίνουν κατά τη μεταβίβαση του αερίου στη δεξαμενή ή στη συσκευασία. Ο όγκος αυτός μπορεί να μειωθεί μόνο ελαττώνοντας την ταχύτητα διαβίβασης του αερίου. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί με χρήση διασκορπιστήρα αερίων ( sparger ) (Allen, 1991). Το διοξείδιο του άνθρακα χρησιμοποιείται ευρέως στη βιομηχανία ενώ αποτελεί και προϊόν της αλκοολικής ζύμωσης. Λόγω της μεγάλης διαλυτότητάς του υπάρχει πάντα σε ένα ποσοστό διαλυμένο στο κρασί και επηρεάζει τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του. Σε αντίθεση με το άζωτο έχει τόσο αντιβακτηριακή όσο και αντιμυκητιακή δράση επιβραδύνοντας και μειώνοντας των πολλαπλασιασμό των αερόβιων βακτηρίων και μυκήτων, απουσία οξυγόνου. Είναι βαρύτερο από τον αέρα, οπότε θεωρείται ότι δημιουργεί ένα στρώμα που καλύπτει την ελεύθερη επιφάνεια του κρασιού ( blanketing ). Λόγω φαινομένων μοριακής διάχυσης όμως και το διοξείδιο του άνθρακα μετά από σύντομο χρονικό διάστημα κατανέμεται ισόποσα σε όλον τον υπερκείμενο χώρο. Όταν χρησιμοποιείται σε μίγματα θεωρείται αποτελεσματικό σε συγκεντρώσεις πάνω από 20% στην τροποποιημένη ατμόσφαιρα (Allen, 1991). Το αργό υπάρχει στον ατμοσφαιρικό αέρα σε ποσοστό περίπου 1%. Η μικρή αυτή διαθεσιμότητα του εξηγεί και το υψηλό του κόστος. Είναι ένα χημικά αδρανές, άοσμο και άγευστο αέριο. Η πυκνότητά του είναι παραπλήσια του διοξειδίου του άνθρακα αλλά η διαλυτότητα του ανέρχεται στο 38% της αντίστοιχης του διοξειδίου του άνθρακα. Η τεχνική του διασκορπισμού ( sparging ) χρησιμοποιείται για να αφαιρέσει αποτελεσματικά το διαλυμένο οξυγόνο (ή διοξείδιο του άνθρακα) από το κρασί. Η διεργασία βασίζεται στο νόμο του Henry σύμφωνα με τον οποία η διαλυτότητα ενός αερίου σε μια υγρή φάση είναι ανάλογη της μερικής πίεσης του εν λόγω αερίου στην αέρια φάση που είναι σε επαφή με την υγρή. Κατά τη διάρκεια του διασκορπισμού το αδρανές αέριο διοχετεύεται στο κρασί με τη μορφή πολύ λεπτών φυσαλίδων. Καθώς οι φυσαλίδες διασπείρονται, το διαλυμένο αέριο (O2) μεταφέρεται στην αέρια 126

128 φάση έως ότου αποκατασταθεί ισσοποπία μεταξύ της διαλυτότητάς του και της μερική πίεσης στην αέρια φάση. Η αποτελεσματικότητα της διεργασίας εξαρτάται από πλήθος παραγόντων όπως το μέγεθος των φυσαλίδων, το χρόνο επαφής μεταξύ αδρανούς αερίου και κρασιού, τη θερμοκρασία του κρασιού και την παροχή του αερίου. Όσο μικρότερο είναι το μέγεθος των φυσαλίδων τόσο μεγαλύτερη είναι η διεπιφάνεια επαφής άρα και πιο αποτελεσματική η απομάκρυνση του οξυγόνου. Συνήθως η τεχνική πραγματοποιείται στους 15 C με 20 C σε πιέσεις 1-2 atm. Ο όρος purging χρησιμοποιείται για να περιγράψει τη διαδικασία μετατόπισης του αέρα από τον υπερκείμενο χώρο ενός δοχείου ή οποιοδήποτε άλλου περιέκτη με ταυτόχρονη αντικατάστασή του από ένα αδρανές αέριο. Κατά τη μεταφορά του κρασιού σε νέους περιέκτες (δεξαμενές, βαρέλια) το κρασί επίσης προστατεύεται με τη χρήση ενός αδρανούς αερίου. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί με την απομάκρυνση του ατμοσφαιρικού αέρα τόσο από το αρχικό όσο και από το τελικό δοχείο μεταφοράς. Η απομάκρυνση του αέρα, όπως προαναφέρθηκε απαιτεί όγκους αδρανούς αερίου 3-7 φορές μεγαλύτερους από τον όγκο του υπερκείμενου χώρου. Είναι, ακόμα επιθυμητή η διοχέτευση αδρανούς αερίου στις σωληνώσεις μεταφοράς και στην αντλία. Η διεργασία του sparging μπορεί να πραγματοποιηθεί κατά την άντληση του κρασιού απομακρύνοντας έτσι το ήδη διαλυμένο οξυγόνο στο κρασί. Σε κάθε περίπτωση με την ολοκλήρωση της άντλησης, η συγκέντρωση του οξυγόνου στο κρασί θα πρέπει να ελέγχεται. Το κρασί είναι ιδιαίτερα ευάλωτο σε οξειδώσεις κατά την εμφιάλωση. Η ανακίνηση του κρασιού με την ταυτόχρονη ύπαρξη οξυγόνου κατά τη διάρκεια της πλήρωσης της φιάλης ευνοεί την οξείδωση του κρασιού. Για το λόγο αυτό η φιάλη «ξεπλένεται» με αδρανές αέριο πριν την πλήρωση. Επιπλέον, τα σύγχρονα μηχανήματα εμφιάλωσης διοχετεύουν αδρανές αέριο στις απαιτούμενες ποσότητες και μετά το γέμισμα της φιάλης, ώστε ο υπερκείμενος χώρος να μην περιέχει οξυγόνο. Παρ ότι η ατμόσφαιρα αδρανούς αερίου χρησιμοποιείται ευρύτατα στην αποθήκευση του κρασιού, δεν υπάρχουν στη βιβλιογραφία μελέτες για την επίδρασή 127

129 της στα φαινολικά συστατικά του κρασιού. Για το λόγο αυτό αποτέλεσε ένα από τα αντικείμενα μελέτης της παρούσας διατριβής. 128

130 Στόχος-Πειραματικός Σχεδιασμός Το αντικείμενο της παρούσας διατριβής είναι η μελέτη των μεταβολών φαινολικών συστατικών κατά την οινοποίηση και την αποθήκευση του κρασιού. Πρώτος στόχος επομένως, ήταν η κατάρτιση κατάλληλης μεθόδου χρωματογραφικής ανάλυσης, για την ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση των φαινολικών συστατικών δειγμάτων κρασιού. Τα αρχικά πειράματα στο LC-MS έγιναν σε δείγματα χυμών μούρων, λόγο του ότι αποτελούν αντίστοιχες πρώτες ύλες με το κόκκινο κρασί από τη σκοπιά του φαινολικού τους φορτίου. Ταυτόχρονα είναι πιο απλές πρώτες ύλες, μιας και δεν μεταβάλλεται τόσο πολύ το φαινολικό τους προφίλ κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης, ενώ το γεγονός ότι εμφανίζουν υποκαταστάσεις των φλαβονοειδών όχι μόνο με γλυκόζη αλλά και με άλλα σάκχαρα, ήταν πολύ χρήσιμο στην κατανόηση και αριστοποίηση των παραμέτρων ανάλυσης. Βασικός στόχος ήταν η εξέταση της μεταφοράς των φαινολικών συστατικών από το σταφύλι στο ζυμούμενο γλεύκος, και η εξέλιξή τους κατά τις διαφορετικές, συνήθεις πρακτικές που ακολουθούνται στην οινοποίηση. Για το λόγο αυτό επιλέχθηκαν Ελληνικές κυρίως ποικιλίες που δεν έχουν ή έχουν ελάχιστα μελετηθεί, καθώς και διεθνείς ποικιλίες που καλλιεργούνται ευρύτατα και στην Ελλάδα. Επίσης όλα τα πειράματα έγιναν σε συνεργασία με οινοποιεία, ώστε να εξετασθούν οι μεταβολές στις πραγματικές βιομηχανικές συνθήκες οινοποίησης. Για τη διερεύνηση της μεταφοράς φαινολικών συστατικών από το σταφύλι (φλοιοί, σάρκα, γίγαρτα) στο κρασί, επιλέχθηκε μία ποικιλία της Μανδηλαριάς, η Μαυροκουντούρα Κύμης, η οποία δεν έχει εξετασθεί καθόλου, αν και αποτελεί μοναδική Ελληνική ποικιλία. Στη συνέχεια για τη μελέτη της εξέλιξης των υποομάδων των φαινολικών συστατικών κατά την οινοποίηση, επιλέχθηκαν ποικιλίες που χρησιμοποιούνται σε ερυθρές και λευκές οινοποιήσεις, με διαφορετικές επεξεργασίες (απλή οινοποίηση, χρήση πηκτινολυτικών ενζύμων, κρυοεκχύλιση πριν τη ζύμωση) καθώς και διαφορετικούς χρόνους παραμονής των στεμφύλων με το ζυμούμενο γλεύκος (εκχύλισης φαινολικών συστατικών). Περιοριστικός παράγοντας βέβαια ήταν η διαθεσιμότητα δειγμάτων από τα οινοποιεία. Συγκεκριμένα μελετήθηκαν τά: Αγιωργίτικο από δύο περιοχές, Μοσχοφίλερο, Ασύρτικο, Merlot από 3 περιοχές, Syrah, και Cabernet. Οι 129

131 δειγματοληψίες γινόταν σε όλη τη διάρκεια της οινοποίησης, ώστε να προσδιορισθεί η επίδραση όλων των σταδίων στις μεταβολές των φαινολικών συστατικών και να εξαχθούν ασφαλή συμπεράσματα για την επίδραση αυτών, ανάλογα με τα απαιτούμενα ποιοτικά χαρακτηριστικά του τελικού προϊόντος (χρώμα, οίνος παλαίωσης κλπ.). Επιπλέον στα Merlot και Syrah, που αποτελούν ευρύτατα οινοποιήσιμες ποικιλίες διεθνώς, εξετάσθηκε η μεταβολή της περιεκτικότητας μεταλλικών ιχνοστοιχείων σε συνάρτηση με τη μεταβολή φαινολικών συστατικών κατά την οινοποίηση. Στα φρέσκα κρασιά έγινε προσπάθεια «χαρακτηρισμού» τους με βάση το φαινολικό προφίλ, μία τάση που αναπτύσσεται διεθνώς πρόσφατα για τη διάκριση μεταξύ των ποικιλιών και ως προς την εντοπιότητα των κρασιών. Ο επόμενος βασικός στόχος της διατριβής ήταν η εξέταση των φαινολικών συστατικών κατά την αποθήκευση του κρασιού. Συνήθως χρησιμοποιείται αδρανής ατμόσφαιρα, κυρίως με χρήση αζώτου, για περιορισμό των μικροβιακών αλλοιώσεων. Η επίδρασή της στα φαινολικά συστατικά του κρασιού, τα οποία είναι ευαίσθητα στην παρουσία οξυγόνου δεν έχει μελετηθεί. Στην παρούσα διαρτιβή μελετήθηκε, εκτός του καθαρού αζώτου, διοξείδιο του άνθρακα ή μίγμα του με άζωτο, επειδή το διοξείδιο του άνθρακα είναι ένα φθηνό αέριο που παράγεται κατά την αλκοολική ζύμωση. Τα φρέσκα κρασιά είναι σχεδόν κορεσμένα σε διοξείδιο του άνθρακα. Εκτός των μεταβολών των φαινολικών, μελετήθηκαν οι μεταβολές του χρώματος κατά την αποθήκευση και συσχετίσθηκαν με τα φαινολικά συστατικά, ώστε να ερμηνευθούν χρωματικές μεταβολές του κρασιού μέχρι την κατανάλωση. Το λαμπερό κόκκινο χρώμα είναι επιθυμητό στους φρέσκους ερυθρούς οίνους, γι αυτό το λόγο επιδιώχθηκε η ενίσχυση του χρώματος με προσθήκη φυσικών συμπαραγόντων. Επιλέχθηκαν εκχυλίσματα αρωματικών φυτών (ρίγανη, θρούμπι), τα οποία έχουν προσελκύσει μεγάλο ενδιαφέρον τα τελευταία χρόνια, λόγω του πλούτου τους σε φαινολικά συστατικά και των ευεργετικών τους ιδιοτήτων. Τα εκχυλίσματα αποχρωματίσθηκαν, ενώ απομακρύνθηκαν και τα αιθέρια έλαια, ώστε να μην επηρεάσουν τη γεύση και το χρώμα του κρασιού. Παράλληλα μελετήθηκε ως συμπαράγοντας ενίσχυσης χρώματος, το ροσμαρινικό οξύ, που αποτελεί το κύριο φαινολικό συστατικό των εκχυλισμάτων. Η επίδραση των συμπαραγόντων μελετήθηκε στο χρώμα του φρέσκου κρασιού και στην εξέλιξή του κατά την αποθήκευση. 130

132 131

133 Πειραματική Διαδικασία 1 Πρώτες ύλες αναλύσεων και ταυτοποίησης φαινολικών συστατικών Για την τυποποίηση των κατάλληλων μεθόδων ανάλυσης των φαινολικών συστατικών χρησιμοποιήθηκαν χυμοί από βατόμουρο, κράνο (Cornus mas), μύρτιλλο (Vaccinium myrtillus) και ρόδι (Punica granatum). Οι χυμοί παραλήφθηκαν από φρούτα Ελληνικής προέλευσης και από βιολογικές και συστηματικές καλλιέργειες στη Β. Ελλάδα και Πελ/νησο. Παράλληλα η μελέτη επεκτάθηκε και στην ανάλυση χυμού από κούμαρα (Myrica rubra) που παραλήφθησαν από την Κίνα στα πλαίσια προγράμματος διακρατικής συνεργασίας Ελλάδας-Κίνας. 2 Πρώτες ύλες και πειραματική διαδικασία οινοποίησης Όλες οι οινοποιήσεις πραγματοποιήθηκαν σε βιομηχανικό ή ημιβιομηχανικό επίπεδο. Στον Πίν. 8 παρουσιάζονται οι ποικιλίες ελληνικών σταφυλιών που οινοποιήθηκαν, ο τόπος προέλευσης και το οινοποιείο παραγωγής του κάθε κρασιού, ενώ στον Πίν. 9 οι συνθήκες οινοποίησης. Σε όλες τις περιπτώσεις ερυθρής οινοποίησης μετά τον εκραγισμό το γλεύκος διοχετεύτηκε στον οινοποιητή σε επαφή με τα στέμφυλα, όπου πραγματοποιήθηκε προσθήκη θειώση ανυδρίτη (5-9 g/hl). Στην περίπτωση προσθήκης πηκτινολυτικών ενζύμων, αυτή έγινε επίσης στην είσοδο στον οινοποιητή. Η ανακύκλωση του γλεύκους για συνεχή διαβροχή των στεμφύλων κατά την εκχύλιση γινόταν ανά τακτά χρονικά διαστήματα (δύο ή περισσότερες φορές την ημέρα ανάλογα με το οινοποιείο). Με το πέρας της αλκοολικής ζύμωσης, έγινε προσθήκη μηλογαλακτικών βακτηρίων, ώστε να πραγματοποιηθεί η μηλογαλακτική ζύμωση στους οίνους Αγιωργίτικο (Νεμέα και Τρίπολη), και Cabernet Sauvignon. Η εκχύλιση των πολυφαινολών μελετήθηκε κατά την οινοποίηση πέντε ερυθρών ποικιλιών σταφυλιού: Αγιωργίτικο (Τρίπολη), Merlot Α (Μαντινεία), Merlot Β (Μαρκόπουλο), Syrah (Μαρκόπουλο), και Cabernet (Τρίπολη). 132

134 Πίν. 8: Οι ποικιλίες ελληνικών σταφυλιών που μελετήθηκαν, ο τόπος προέλευσης, το οινοποιείο παραγωγής και η μέθοδος οινοποίησης που χρησιμοποιήθηκε Ποικιλία Τόπος προέλευσης Οινοποιείο παραγωγής Μέθοδος οινοποίησης Αγιωργίτικο Νεμέα Τμήμα Οινολογίας και Κρυοεκχύλιση/ Τεχνολογίας Ποτών Α.Τ.Ε.Ι. Πηκτινολητικά ένζυμα Αθηνών Αγιωργίτικο Τρίπολη Τσέλεπος Οινοποιητική Α.Ε. Πηκτινολητικά Ένζυμα Merlot Μαρκόπουλο Οινοποιεία Αλλαγιάννη Πηκτινολητικά Ένζυμα Merlot Μαντινεία Οινοποιεία Παναγοπούλου Κλασική οινοποίηση Merlot Τρίπολη Τσέλεπος Οινοποιητική Α.Ε. Κρυοεκχύλιση/ Πηκτινολητικά ένζυμα Syrah Μαρκόπουλο Οινοποιεία Αλλαγιάννη Πηκτινολητικά Ένζυμα Cabernet Τρίπολη Τσέλεπος Οινοποιητική Α.Ε. Κρυοεκχύλιση/ Πηκτινολητικά ένζυμα Μαυροκουντούρα Χαλκίδα Κτήμα Avantis Κρυοεκχύλιση σε τροποποιημένη ατμόσφαιρα Ασύρτικο Νεμέα Τμήμα Οινολογίας και Κλασική οινοποίηση Τεχνολογίας Ποτών Α.Τ.Ε.Ι. Αθηνών Μοσχοφίλερο Μαντινεία Οινοποιεία Παναγοπούλου 1) Κλασική οινοποίηση 2) Πηκτινολητικά ένζυμα Κατά τη διάρκεια της παραμονής των στεμφύλων στη δεξαμενή λαμβάνονταν δείγματα, τα οποία αποτελούνταν μόνο από γλεύκος, χωρίς την παρουσία των στεμφύλων. Όλες οι δειγματοληψίες κατά τη διάρκεια της εκχύλισης γίνονταν μετά την ανάδευση του σταφυλοπολτού. Δείγματα ελήφθησαν σε τακτά χρονικά 133

135 διαστήματα μέχρι το τέλος της αλκοολικής ζύμωσης. Όλες οι δειγματοληψίες ήταν διπλές. Πίν. 9: Οι συνθήκες οινοποίησης των ποικιλιών που μελετήθηκαν Ποικιλία Κρυοεκχύλιση Ενζυμα Ζύμωση Διάρκεια (ημέρες) Θερμοκρασ ία Διάρκεια (ημέρες)* Θερμοκρασία ( ο C) ( ο C) Αγιωργίτικο/ Νεμέα 2 10 Ex-V 12(12) 25 Αγιωργίτικο/ - - Ex-V 12(6) 25 Τρίπολη Merlot/ - - Uvazym 12(7) 22 Μαρκόπουλο couleur Merlot/ Μαντινεία (5) 18 Merlot/ Τρίπολη 4 12 Ex-V 12(12) 25 Syrah/ Μαρκόπουλο - - Uvazym couleur 12(7) 22 Cabernet/ Τρίπολη 5 12 Ex-V 15(15) 25 Μαυροκουντούρα/ 3 8-7(7) 22 Χαλκίδα Ασύρτικο/ Νεμέα (0) 18 Μοσχοφίλερο/ 6ώρες 10-16(0) 17 Μαντινεία * σε παρένθεση ο χρόνος παραμονής των στεμφύλων σε επαφή με το γλεύκος Η λευκή οινοποίηση έγινε με γλεύκος που παραλήφθηκε από αποβοστρυχωτήριο θλιπτήριο. Στην περίπτωση κρυοεκχύλισης ο σταφυλοπολτός παρέμεινε στον οινοποιητή για 6 ώρες στους 10 C, όπου και αναδευόταν ανά τακτά χρονικά διαστήματα. Στις 6 ώρες εκχύλισης παρατηρήθηκε μία ελαφρά ερυθρωπή χροιά στο γλεύκος, γεγονός που υποδηλώνει την έναρξη εκχύλισης ανθοκυανών από τους 134

136 φλοιούς της ρόγας του Μοσχοφίλερου. Για το λόγο αυτό, η εκχύλιση σταμάτησε και ο σταφυλοπολτός μεταφέρθηκε στο πιεστήριο, απ όπου και λήφθηκε μόνο γλεύκος εκροής. Θειώδης ανυδρίτης προστέθηκε στην αρχή της ζύμωσης, ενώ στο τέλος έγινε κολλάρισμα, απομάκρυνση της οινολάσπης και νέα θείωση. Οι μεταβολές φαινολικών συστατικών μελετήθηκαν στην ποικιλία Μοσχοφίλερο (Μαντινεία), με και χωρίς κρυοεκχύλιση. Διπλές δειγματοληψίες λαμβάνονταν ανά 1 h στη διάρκεια της κρυοεκχύλισης και ανά τακτά διαστήματα στη διάρκεια της ζύμωσης. Τα νέα κρασιά με το πέρας της οινοποίησης τοποθετήθηκαν σε πλαστικά βαρέλια ή δεξαμενές για σταθεροποίηση στους 4 C και για χρονικό διάστημα ημερών, και ακολούθησε δειγματοληψία. Οι μετρήσεις τόσο των λευκών όσο και των ερυθρών οίνων περιελάμβαναν ολικά φαινολικά με τη μέθοδο Folin, ολικές φλαβαν-3-όλες με τη μέθοδο DMACA και χρωματογραφική ανάλυση των δειγμάτων για την ποσοτικοποίηση των επιμέρους φαινολικών ομάδων (ανθοκυάνες, φλαβονόλες, κινναμικά οξέα). Επιπλέον στις ποικιλίες Merlot και Syrah (Μαρκόπουλο) ταυτοποιήθηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν τα ιχνοστοιχεία με χρήση ICP όπως περιγράφεται στις Μεθόδους στο υποκεφάλαιο 6. Εκχύλιση φαινολικών συστατικών από τα μέρη του καρπού της Μαυροκουντούρας Συγκεκριμένα στην ποικιλία της Μαυροκουντούρας, μετρήθηκε η περιεκτικότητα φαινολικών συστατικών στα μέρη του καρπού της (φλοιοί, σάρκα, γίγαρτα) και έγινε μελέτη της εκχύλισης των φαινολικών από τον καρπό στο κρασί. Για το λόγο αυτό εκτός των δειγματοληψιών που έγιναν κατά τη διάρκεια της οινοποίησης, την ημέρα έναρξης της διεργασίας παρελήφθη και δείγμα σταφυλιού πριν τον εκραγισμό. Xρησιμοποιήθηκαν 500 g τυχαία επιλεγμένων ρογών. Η μέση διάμετρος και το μέσο βάρος του καρπού προσδιορίστηκε από δείγμα 100 ρογών ενώ στη συνέχεια χωρίστηκαν φλοιοί και γίγαρτα από τη σάρκα. Τα μέρη του καρπού λιοφυλιώθηκαν ξεχωριστά (freeze drier, Martin Christ, Alpha 1-4 LD plus, Osterode, Germany). Τα ξηρά δείγματα ζυγίστηκαν και κονιορτοποιήθηκαν σε εργαστηριακό μπλέντερ (Waring Products Inc., Torrington, Connecticut, USA) ενώ στη συνέχεια αποθηκεύτηκαν σε ερμητικά κλειστές συσκευασίες στους -18 C. 135

137 Για την εκχύλιση των πολυφαινολών χρησιμοποιήθηκε μεθανόλη οξινισμένη με φορμικό οξύ (1% (v/v)) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα των Lafka et al. (2007) & Mercken et al. (2001). Η εκχύλιση έγινε σε λουτρό υπερήχων (S 30 H, Elmasonic, Elma, Singen, Germany). Ποσότητα 4 g δείγματος τοποθετήθηκε σε δοκιμαστικό σωλήνα φυγοκέντρου με πώμα και προστέθηκαν 40 ml οξινισμένης μεθανόλης. Το μίγμα αναδεύεται έντονα για 5 min και στη συνέχεια τοποθετήτε στο λουτρό υπερήχων για 10 min. Το εκχύλισμα παραλαμβάνεται με απόχυση έπειτα από φυγοκέντριση (10g / 10 min). Η διαδικασία επαναλαμβάνεται, ο συνολικός όγκος εκχυλίσματος συμπυκνώνεται σε περιστροφικό εξατμιστήρα (Büchi RE 111, Büchi Laboratoriums Technik AG, Flawil, Switzerland) και ανακτάται σε όγκο 100 ml σε ογκομετρική φιάλη. 3 Αποθήκευση του κρασιού σε τροποποιημένες ατμόσφαιρες Η μελέτη των μεταβολών φαινολικών συστατικών και χρώματος κατά την αποθήκευση περιελάμβανε δείγματα κρασιών από τις κόκκινες ποικιλίες Αγιωργίτικο (Νεμέα), Merlot (Μαρκόπουλο), Syrah (Μαρκόπουλο), καθώς και λευκό κρασί της ποικιλίας Ασύρτικο (Νεμέα). Τα φρέσκα κρασιά μεταφέρονταν στο εργαστήριο συσκευασμένα σε ασκούς υπό κενό και αποθηκεύονταν για σύντομο χρονικό διάστημα (λιγότερο από μήνα) σε θερμοκρασία 5-8 C μέχρι τη συσκευασία των δειγμάτων. Η συσκευασία των δειγμάτων προς αποθήκευση έγινε με χρήση της συσκευής MAP, σε συσκευασίες πολυστρωματικού υλικού (OPP 20 μm/ink/adhesive/pet MET 12 μm/adhesive//pe 75 μm STC) σε τροποποιημένες ατμόσφαιρες αζώτου (Ν2), διοξειδίου του άνθρακα (CO2) και μίγματος αεριών σε CO2-N2 σε αναλογία 1:1. Μετά τη συσκευασία πραγματοποιήθηκε δειγματοληψία στον υπερκείμενο χώρο των συσκευασιών με αναλυτή αερίων για να επιβεβαιωθεί η σύσταση τους. Η ποσότητα δείγματος κρασιού σε κάθε συσκευασία ήταν 25 ml. Μια σειρά δειγμάτων συσκευάστηκε σε ατμόσφαιρα λεπτού στρώματος ατμοσφαιρικού αέρα με απλή θερμοκόλληση της συσκευασίας. Στη συνέχεια όλα τα δείγματα αποθηκεύτηκαν σε θερμοκρασία δωματίου, απουσία ηλιακής ακτινοβολίας. 136

138 Τα διπλά δείγματα που ανοίγονταν κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης αναλύονταν αυθημερόν. Οι αναλύσεις περιελάμβαναν: ολικό φαινολικό φορτίο, μέτρηση χρωματικών παραμέτρων και χρωματογραφική ανάλυση για την ποσοτικοποίηση των επιμέρους φαινολικών ομάδων (φαινολικά οξέα, φλαβονόλες, ανθοκυάνες). 4 Προσθήκη φυσικών εκχυλισμάτων για την ενίσχυση του χρώματος μέσω σχηματισμού εγχρώμων συμπλόκων (copigmentation) με τις ανθοκυάνες Για τις ανάγκες των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκε φρέσκο κρασί από μονοποικιλιακά σταφύλια της ποικιλίας Merlot (Vitis vinifera). Ο τρύγος έγινε τον Σεπτέμβριο του 2014 από την οινοποιεία Παναγοπούλου στη Μαντινεία (Αρκαδία). Ο φρέσκος οίνος παραλήφθηκε ένα μήνα μετά το πέρας της αλκοολικής ζύμωσης και είχε αλκοολικό τίτλο 12.8, ολική οξύτητα 5.3 g/l (ισοδυνάμων τρυγικού οξέος) και ph 3.6. Ως συμπαράγοντες σχηματισμού έγχρωμων συμπλόκων χρησιμοποιήθηκαν εκχυλίσματα αρωματικών φυτών (ρίγανη, θρούμπι), πλούσια σε φαινολικά συστατικά, και ροσμαρινικό οξύ, που είναι το βασικό συστατικό αυτών των εκχυλισμάτων. Προετοιμασία αιθανολικών εκχυλισμάτων αρωματικών φυτών Ξερά φύλλα ρίγανης (O. vulgare ssp. hirtum, χημειότυπου καρβακρόλης) και θρούμπι (S. thymbra) παρελήφθησαν από τον ΕΛΓΟ-Δήμητρα και υπεβλήθησαν σε υδροατμοαπόσταξη σε εργαστηριακό αποστακτήρα 17 L προκειμένου να απομακρυνθεί το αιθέριο έλαιο. Η διαδικασία της απόσταξης είχε επιπλέον ως στόχο την ολική απόσμηση των φυτών. Τα αποσμημένα φυτά ξηράνθηκαν σε αεριζόμενο φούρνο στους 38 C και κονιορτοποιήθηκαν σε εργαστηριακό μύλο με κόσκινο ανοίγματος 0.5 mm (Retch ZM 1, Haan, Germany). Η κονιορτοποιημένη φυτόμαζα (70 g) εκχυλίστηκε σε συσκευή Soxhlet για 6 ώρες, με οξικό αιθυλεστέρα (350 ml) προκειμένου να απομακρυνθούν οι αγλυκόνες των φλαβονοειδών (Kouri et al., 2007) που θα εμφάνιζαν προβλήματα διαλυτότητας στον οίνο και στη συνέχεια με αιθανόλη (350 ml) ώστε να ανακτηθούν τα φαινολικά οξέα και οι γλυκοζίτες των φλαβονειδών. 137

139 Τα αιθανολικά εκχυλίσματα μεταφέρθησαν σε ογκομετρική φιάλη των 500 ml έπειτα από φιλτράρισμα και πληρώθηκαν μέχρι τη χαραγή. Οι πράσινες χρωστικές των αρωματικών φυτών πού είναι κατά κύριο λόγο χλωροφύλλες απομακρύνθηκαν με κατάλληλες στήλες SPE που περιείχαν ενεργό άνθρακα (Bond Elut Carbon, 250 mg, 5 ml, Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA). Τα τελικά εκχυλίσματα είχαν υποκίτρινο χρώμα και ξηράνθηκαν σε περιστροφικό εξατμιστήρα υπό κενό (Büchi RE, Büchi Laboratoriums Technik AG, Flawil, Switzerland). Τα ξηρά εκχυλίσματα διατηρήθηκαν σε ερμητικά κλεισμένα γυάλινα φιαλίδια έως ότου αναλυθούν και προστεθούν στο κρασί. Προσθήκη εκχυλισμάτων στο κρασί Κατάλληλη ποσότητα του κάθε εκχυλίσματος προστέθηκε στο φρέσκο κρασί έτσι ώστε τα προστιθέμενα φαινολικά συστατικά να είναι 650 mg/l ισοδυνάμων γαλλικού οξέος. Επίσης πρότυπο ροσμαρινικό οξύ προστέθηκε σε περιεκτικότητα 650 mg/l σε μία τρίτη σειρά δειγμάτων. Συνολικά συσκευάστηκαν 4 διπλές σειρές δειγμάτων: ο μάρτυρας (CW), κρασί στο οποίο προστέθηκαν 650 mg/l ροσμαρινικό οξύ (RosW), κρασί με εκχύλισμα ρίγανης (EocW) και κρασί με εκχύλισμα από θρούμπι (EsW). Ο όγκος του κάθε δείγματος ήταν 20 ml και η συσκευασία έγινε σε πολυστρωματικό υλικό συσκευασίας (OPP 20 l m/ink/adhesive/pet MET 12 l m/adhesive//pe 75 l m STC), πρακτικά αδιαπέραστο από τον αέρα, και σε συνθήκες τροποποιημένης ατμόσφαιρας (50% N2 50% CO2) με χρησιμοποίηση κατάλληλης συσκευής συσκευασίας (Boss NT42N MAP unit Bad Homburg, Germany). Διπλά δείγματα όλων των σειρών δειγμάτων ανοίγονταν σε τακτά χρονικά διαστήματα κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης και στα οποία έγιναν οι παρακάτω μετρήσεις: ολικά φαινολικά (Folin Ciocalteu), ολικές φλαβαν-3-όλες (DMACA), μονομερείς, πολυμερισμένες και συμπλοκοποιημένες (copigmented) ανθοκυάνες (Boulton, 2001), ολικό χρώμα (CI) και απόχρωση (hue). Επιπλέον όλα τα δείγματα αναλύθηκαν χρωματογραφικά με χρήση HPLC-DAD-MS. Χρωματογραφική ανάλυση έγινε και στα εκχυλίσματα των αρωματικών φυτών προκειμένου να είναι γνωστό το φαινολικό τους προφίλ. 138

140 Αναλυτικές Μέθοδοι 1 Μέτρηση ολικού φαινολικού φορτίου (TP) Μέθοδος Folin Ciocalteu Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην οξείδωση των φαινολών σε αλκαλικό περιβάλλον, με μίγμα φωσφοροβολφραμικού και φωσφορομολυβδαινικού οξέος (αντιδραστήριο Folin Ciocalteu). Η οξείδωση προκαλεί μία αλλαγή χρώματος από κίτρινο σε μπλε, που μπορεί να ανιχνευθεί εύκολα από ένα φασματοφωτόμετρο. Την ίδια αντίδραση δίνουν και άλλα συστατικά, όπως τα ανάγοντα σάκχαρα και τα νουκλεϊνικά οξέα. Κατά την εφαρμογή της σε ξηρούς οίνους δεν δημιουργείται πρόβλημα, αφού η περιεκτικότητα σε ανάγοντα σάκχαρα είναι της τάξης των 20 mg/l, οπότε η συνεισφορά τους στην τιμή της μέτρησης μπορεί να θεωρηθεί αμελητέα (Waterhouse 2005). Σύμφωνα με τη μέθοδο, προστίθενται σε δοκιμαστικό σωλήνα 100 μl δείγμα κατάλληλα αραιωμένο (ή πρότυπο), 7.9 ml απιονισμένο νερό, και 500 μl αντιδραστήριο Folin Ciocalteu και ακολουθεί ανάδευση σε vortex. Το διάλυμα αφήνεται σε ηρεμία 30 s - 8 min και εν συνεχεία προστίθενται 1.5 ml κορεσμένου διαλύματος Na2CO3. Ακολουθεί ανάδευση και πάλι σε vortex και το δείγμα αφήνεται σε ηρεμία είτε για 2 h στους 20 C, είτε για 30 min σε υδατόλουτρο στους 40 C. Ακολουθεί φωτομέτρηση του δείγματος σε γυάλινη κυψελίδα πάχους 1 cm, σε φασματοφωτόμετρο διπλής δέσμης στα 765 nm με τυφλό, αντιστοίχως παρασκευασμένο δείγμα όπου στη θέση των 100 μl δείγματος, προσθέτουμε 100 μl απιονισμένο νερό. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ισοδύναμα mg/l γαλλικού οξέος (GAE), που προκύπτουν από αντίστοιχη καμπύλη αναφοράς που παρασκευάσθηκε με συγκεντρώσεις mg γαλλικού οξέος/l σε απιονισμένο νερό. Για την παρασκευή του κορεσμένου διαλυματος Na2CO3 αναμιγνύονται 200 g άνυδρου Na2CO3 με 800 ml απιονισμένο νερό σε ποτήρι ζέσεως. Το διάλυμα θερμαίνεται μέχρι βρασμού υπό ανάδευση και εν συνεχεία αφήνεται να ψυχθεί. Προστίθενται μερικοί κρύσταλλοι ένυδρου Na2CO3 και το διάλυμα αφήνεται σε ηρεμία για 24 h. Ακολουθεί διήθηση με ταυτόχρονη μεταφορά του διαλύματος σε 139

141 ογκομετρική φιάλη 1 L η οποία συμπληρώνεται με απιονισμένο νερό μέχρι τη χαραγή ABS 765 nm y = x R² = mg/l γαλλικού οξέος Εικ. 28: Καμπύλη αναφοράς γαλλικου οξέος για τη μέθοδο Folin Ciocalteu 2 Προσδιορισμός φλαβαν-3-ολών Μέθοδος DMACA Oι ολικές φλαβαν-3-όλες προσδιορίσθηκαν με τη μέθοδο της p- διμεθυλαμινοκινναμαλδεΰδης (DMACA). Η συγκεκριμένη μέθοδος έχει το σημαντικό πλεονέκτημα ότι δεν έχει παρεμβολές από τις ανθοκυάνες. Επιπλέον, παρέχει υψηλή ευαισθησία και εκλεκτικότητα. Η αντίδραση γίνεται στον Α δακτύλιο των κατεχινών όπως φαίνεται στην Εικ. 29 (Arnous 2002). Εικ. 29: Αντίδραση συμπύκνωσης του αντιδραστηρίου DMACA (a) με (+)-κατεχίνη (b) και προϊόν την έγχρωμη ένωση (c) 140

142 Σύμφωνα με τη μέθοδο, σε 600 μl κατάλληλα αραιωμένου κρασιού/γλεύκους προστίθενται 3 ml διαλύματος 0.1% DMACA σε 1 Ν HCl σε μεθανόλη. Το δείγμα ανακινείται και αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου για να πραγματοποιηθεί η αντίδραση, για 10 min. Ως τυφλό δείγμα λαμβάνεται αιθανολικό διάλυμα 12.5%. Ακολουθεί φωτομέτρηση στα 640 nm. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ισοδύναμα mg/l κατεχίνης (catechin), που προκύπτουν από την καμπύλη αναφοράς, η χάραξη της οποίας γίνεται με διαλύματα κατεχίνης γνωστών συγκεντρώσεων (1-16 mg/l) ABS 640 nm y = x R² = mg/l κατεχίνης Εικ. 30: Καμπύλη αναφοράς κατεχίνης για τη μέθοδο DMACA 3 Προσδιορισμός συμπλοκοποιημένων ανθοκυανών Χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος που προτάθηκε από τον Boulton (2001), η οποία προσδιορίζει το ποσοστό του χρώματος που οφείλεται στα έγχρωμα σύμπλοκα, στις πολυμερισμένες και στις ελεύθερες ανθοκυάνες. Σύμφωνα με τη μέθοδο, ετοιμάζονται 3 δείγματα. Το πρώτο δείγμα είναι κρασί αραιωμένο με ρυθμιστικό, το δεύτερο περιέχει κρασί με περίσσεια SO2, και το τρίτο περίσσεια ακεταλδεΰδης. Όταν αραιώνεται το κρασί με κάποιο πρότυπο ρυθμιστικό, τα φαινόμενα συμπλοκοποίησης παύουν να υφίστανται, και τα συστατικά του συμπλόκου επανέρχονται στην ελεύθερη μορφή τους. Επομένως, με την απορρόφηση του αραιωμένου κρασιού (Awine) 141

143 μετριέται το χρώμα που οφείλεται στις μονομερείς και πολυμερισμένες ανθοκυάνες, χωρίς να υπάρχουν έγχρωμα σύμπλοκα. Ο θειώδης ανυδρίτης αποχρωματίζει και τις μονομερείς ανθοκυάνες και τις συμπλοκοποιημένες. Μόνο οι πολυμερισμένες μπορούν να αντισταθούν σε αυτή την αλλαγή χρώματος. Επομένως, με την απορρόφηση του κρασιού με περίσσεια θειώδη ανυδρίτη (ΑSO2) μετριέται το χρώμα που οφείλεται μόνο στις πολυμερισμένες ανθοκυάνες. Κατά την προσθήκη ακεταλδεΰδης στο κρασί, η ακεταλδεΰδη δεσμεύει το διοξείδιο του θείου, και έτσι αποδεσμεύονται όλες οι ανθοκυάνες, και οι μονομερείς και οι συμπλοκοποιημένες. Άρα, με αυτή την απορρόφηση (Αacet) μετριέται το ολικό χρώμα του κρασιού, που οφείλεται στις μονομερείς, συμπλοκοποιημένες και πολυμερισμένες ανθοκυάνες. Το μέρος του χρώματος που οφείλεται στα έγχρωμα σύμπλοκα είναι (Αacet-Awine)/ Αacet. Δηλαδή, με αυτόν τον τρόπο υπολογίζεται η ενίσχυση του χρώματος που προκαλεί το σύμπλοκο σε σχέση με τις ίδιες ανθοκυάνες αν ήταν μονομερείς. Το χρώμα που οφείλεται στις μονομερείς ανθοκυάνες, είναι (Αwine-ASO2)/ Αacet, και αυτό που οφείλεται στις πολυμερισμένες είναι ASO2/ Αacet. Η μέθοδος αυτή απαιτεί τη ρύθμιση του ph στο 3.6. Αρχικά το κρασί διηθείται με φίλτρο μεγέθους πόρων 0.45 μm. Η πειραματική διαδικασία περιείχε την παρασκευή τριών δειγμάτων. Στο πρώτο δείγμα περιέχονται 100 μl κρασιού και 1900 μl ρυθμιστικού διαλύματος (0.25% όξινο τρυγικό κάλιο σε 12.5% αιθανολικό διάλυμα και ph 3.6 ) ακολουθεί φωτομέτρηση στα 520 nm και στα 365 nm σε κυψελίδα πάχους 1 cm. Στο δεύτερο δείγμα περιέχονται 160 μl διαλύματος 5% SO2 και 2 ml κρασιού. H φωτομέτρηση γίνεται στα 520 nm σε κυψελίδα 1 cm ή 1 mm, ανάλογα με την απορρόφηση. Στο τρίτο δείγμα περιέχονται 20 μl διαλύματος 10% ακεταλδεΰδης και 2 ml κρασιού. Το δείγμα αφήνεται σε ηρεμία για 45 min και στη συνέχεια μετριέται η απορρόφηση στα 520 και 365 nm με κυψελίδα πάχους 1mm. Ως τυφλό δείγμα, χρησιμοποιείται αιθανολικό διάλυμα 12.5%. 4 Προσδιορισμός χρωματικών παραμέτρων Σύμφωνα με τη μέθοδο Glories (1984) μετριέται η απορρόφηση του κρασιού στα 420 (Α420), 520 (Α520) και 620 nm (Α620). Τα δείγματα κρασιού δεν αραιώνονται, αλλά η 142

144 φωτομέτρηση γίνεται σε κυψελίδα του 1 mm. Ως τυφλό χρησιμοποιείται αιθανολικό διάλυμα 12.5% (Glories, 1984, Ribèreau - Gayon et al., 2006). Από τις τρεις αυτές απορροφήσεις προκύπτουν οι παρακάτω χρωματικοί δείκτες: Ολικό χρώμα ή χρωματική ένταση (CI), η οποία αντιπροσωπεύει το ποσό του χρώματος και ισούται με το άθροισμα των τριών απορροφήσεων CCCC = ΑΑ ΑΑ ΑΑ 620 Απόχρωση (Τ ή Hue), που δείχνει την πορεία του χρώματος προς το πορτοκαλί TT = ΑΑ 420 ΑΑ 520 Σύνθεση χρώματος, που είναι τα ποσοστά των τριών χρωμάτων στο κρασί (σε άθροισμα 100%) Λαμπρότητα (da%), που σχετίζεται με το σχήμα του φάσματος. Όταν το κρασί είναι φωτεινό κόκκινο, το μέγιστο στα 520 nm είναι στενό και καθαρά ορισμένο. Όσο υψηλότερη είναι αυτή η τιμή, τόσο κυριαρχεί περισσότερο το κόκκινο χρώμα. Η τιμή του δείκτη αυτού δίνεται από τον τύπο: da% = 1 ΑΑ ΑΑ ΑΑ % Τέλος η εκατοστιαία απόκλιση των παραπάνω μεγεθών και συγκεκριμένα των Α520, CI και T έναντι του μάρτυρα, όπως χρησιμοποιούνται στο Κεφάλαιο 4 των αποτελεσμάτων, υπολογίστηκαν σύμφωνα με τις παρακάτω εξισώσεις: %ΔΔΔΔ 520 = AA 520 ΔΔΔΔΔΔΔΔΔΔΔΔ AA 520 ΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜ AA 520 ΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΡΡΡΡ % %ΔΔCCCC = CCCCΔΔΔΔΔΔΔΔΔΔΔΔ CCCC ΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜ CCCC ΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜ % %ΔΔTT = TTΔΔΔΔΔΔΔΔΔΔΔΔ TT ΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜ TT ΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜ % 143

145 5 Ανάλυση φαινολικών ενώσεων με HPLC 5.1 Ανάλυση δειγμάτων κρασιού και μούρων Ο χαρακτηρισμός του φαινολικού προφίλ των κόκκινων κρασιών και των μούρων έγινε με τη μέθοδο υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης HPLC (HP 1100, Agilent Technologies, Santa Clara, California) σε σύνδεση με συστοιχία φωτοδιόδων (DAD) και φασματόμετρο μάζας (ESI-MS/MS). Η στήλη χρωματογραφίας που επιλέχθηκε ήταν η Hypersil C18 (ODS 5 μm, 250x4.6 mm, MZ Analysentechnik, Mainz, Germany). Τα δείγματα κρασιού εκχύονταν έπειτα από φιλτράρισμα με φίλτρο χρωματογραφίας (0.2 μm, PVDF syringe filters, Teknokroma, Barcelona, Spain). Ο όγκος του εγχυόμενου δείγματος ήταν 20 μl. Το σύστημα των διαλυτών έκλουσης ήταν νερό/ακετονιτρίλιο/φορμικό οξύ (87/3/10 (v/v/v) διαλύτης Α, 40/50/10 (v/v/v) διαλύτης Β) και η ροή ρυθμίστηκε σε 0.4 ml/min. Το προφίλ της βαθμωτής έκλουσης του διαλύτη Β είχε ως εξής: 6% στα 0 min, 30% στα 21.5 min, 50% στα 42 min, 60% στα 50 min. Η ταυτοποίηση των ανθοκυανών έγινε ρυθμίζοντας τις ακόλουθες παραμέτρους στo φασματόμετρο μάζας: θετικός ιονισμός, φέρον αέριο άζωτο, θερμοκρασία 350 C, διαφορά δυναμικού 2.5 kv, εύρος σάρωσης m/z. Για την ταυτοποίηση των φλαβονολών και τα φαινολικών οξέων, χρησιμοποιήθηκε αρνητικός ιονισμός. Όσον αφορά την ποσοτικοποίηση στον ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων έγινε για τις ανθοκυάνες στα 520 nm σε ισοδύναμα 3-γλυκοζίτη της μαλβιδίνης (ή 3-γλυκοζίτη της κυανιδίνης για τα μούρα), για τις φλαβονόλες στα 360 nm σε ισοδύμανα κερκετίνης, και για τα κινναμικά οξέα στα 320 nm σε ισοδύναμα καφεϊκού οξέος. 144

146 12000 Area 520 nm y = x R² = mg/l Mv-3-glc Εικ. 31: Καμπύλη αναφοράς Mv-3-glc στα 520 nm με αυτόματο δειγματολήπτη Area 520 nm y = x R² = mg/l cyanidin-3-glc Εικ. 32: Καμπύλη αναφοράς Cn-3-glc στα 520 nm 145

147 Area 360 nm y = x R² = mg/l κερκετίνης Εικ. 33: Καμπύλη αναφοράς κερκετίνης στα 360 nm Area 320 nm y = x R² = mg/l καφεϊκού οξέος Εικ. 34: Καμπύλη αναφοράς καφεϊκού οξέος στα 320 nm 5.2 SPE (Solid phase extraction) για την ποιοτική ανάλυση των μη ανθοκυανικών ενώσεων Οι ανθοκυάνες λόγο της φύσης του φλαβυλίου εμφανίζουν πολύ εντονότερο σήμα κατά την ανίχνευσή τους με τον φασματογράφο μάζας συγκριτικά με τις υπόλοιπες 146

148 φαινολικές ενώσεις των κόκκινων κρασιών, επισκιάζοντας με αυτό τον τρόπο ουσιαστικά την ανίχνευσή και ταυτοποίησή των τελευταίων. Για αυτό τον λόγο οι κόκκινες χρωστικές απομακρύνθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο των Nixdorf και Hermosín-Gutiérrez (2010) με χρήση SPE. Οι στήλες ιοντοανταλλαγής που χρησιμοποιήθηακν ήταν οι Oasis MCX cartridges (Waters, Milford, Massachusetts, 6 cm 3 ). Κόκκινο κρασί (3 ml) αραιώνεται σε 3 ml HCl (0.1M) και προστίθεται στη στήλη. Σε όξινες συνθήκες οι ανθοκυάνες εμφανίζονται στη μορφή του ερυθρού φορτισμένου φλαβυλίου και κατακρατούνται στη στήλη ιοντοανταλλαγής, από την οποία έχει προηγουμένως περάσει κατάλληλο σύστημα διαλυμάτων: 5 ml MeOH, 5 ml H2O, 5 ml HCl (0.1 M), 5 ml of H2O. Το απαλαγμένο από τις ανθοκυάνες κλάσμα συλλέγεται με έκπλυση της στήλης με 3 5 ml MeOH και στη συνέχεια συμπυκνώνεται μέχρι ξηρού σε περιστροφικό εξατμιστήρα στους 40 C και ανακτάται σε τελικό όγκο 3 ml και διαλύτη μεθανόλη. Αύτο το κλάσμα χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση των υπολοίπων φαινολικών συστατικών πλήν των ανθοκυανών. 5.3 Ανάλυση αρωματικών φυτών Για την ανάλυση των αρωματικών φυτών χρησιμοποιήθηκε το παρακάτω σύστημα διαλυτών: 1% (v/v) οξικό οξύ [Διαλύτης Α] και μίγμα μεθανόλη 60%/ακετονιτρίλιο 40% οξινισμένο επίσης με 1% οξιξό οξύ [Διαλύτης Β]. Η ροή ρυθμίστηκε στα 0.4 ml/min. Το προφίλ της βαθμωτής έκλουσης του διαλύτη Β είχε ως εξής: 10% στα 0 min, 29% στα 35 min, 100% στα 70 min. Η ταυτοποίηση των φαινολικών συστατικών έγινε ρυθμίζοντας τις ακόλουθες παραμέτρους στo φασματόμετρο μάζας: αρνητικός ιονισμός, φέρον αέριο άζωτο, θερμοκρασία 350 C, διαφορά δυναμικού 3.5 kv, εύρος σάρωσης m/z. 6 Ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση μετάλλων με ICP Για την ταυτοποίηση των μετάλλων χρησιμοποιήθηκαν οι τεχνικές της φασματομετρίας εκπομπής επαγωγικά συζευγμένου πλάσματος (ICP-OES) και της 147

149 φασματομετρίας μάζας επαγωγικά συζευγμένου πλάσματος (ICP-MS), αφού προηγήθηκε υγρή χώνευση του δείγματος. Δείγμα 25 ml δείγματος κρασιού εξατμίσθηκε έως τα 2/3 του όγκου του προκειμένου να απομακρυνθεί η αλκοόλη (80 C). Στη συνέχεια το δείγμα κατεργάστηκε με 5 ml υπερκάθαρου HNO3 65% (w/w) και αραιώθηκε στα 25 ml. Τα διαλύματα που προέκυψαν μετρήθηκαν με το Agilent 7700 ICP-MS (Agilent Technologies, Santa Clara, California) και το Perkin Elmer Optima 7000 DV, ICP-OES (Perkin Elmer, Waltham, Massachusetts), αναλόγως των συγκεντρώσεων των στοιχείων. Οι συνθήκες λειτουργίας των οργάνων αναφέρονται στη βιβλιογραφία (Gonzálvez et al., 2009, Moreno et al., 2008, Nicolini et al., 2004). Για τη βαθμονόμηση των οργάνων χρησιμοποιήθηκαν πρότυπα πολυστοιχειακά διαλύματα της εταιρείας Scharlau (Barcelona, Spain) καθώς επίσης και πρότυπο πολυστοιχειακό διάλυμα ελέγχου CertiPUR της εταιρείας Merck (Darmstadt, Germany). 148

150 Αποτελέσματα - Συζήτηση 1 Ανάλυση του φαινολικού προφίλ διαφόρων ποικιλιών ελληνικών κρασιών με LC-MS Η μέθοδος της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης συζευγμένης με φασματογράφο μάζας (HPLC-MS), αποτελεί μία από τις πιο σημαντικές τεχνικές ενόργανης ανάλυσης της τελευταίας εικοσαετίας. Ο συνδυασμός προσφέρει τη δυνατότητα της εκμετάλλευσης του χρωματογράφου ως τεχνική διαχωρισμού και του φασματογράφου σαν εργαλείο ταυτοποίησης. Το τεράστιο εύρος εφαρμογών της εν λόγου τεχνικής και η συνεχής μείωση του κόστους (αλλά και του όγκου) των συγκεκριμένων οργάνων, οδήγησε την τεχνική του HPLC-MS σε άνθιση. Η φασματογραφία μάζας είναι τεχνική με πολύ χαμηλά όρια ανίχνευσης και υψηλή εκλεκτικότητα. Τα πρόβλημα της μεθόδου, όταν πρόκειται να συνδυασθεί με HPLC, είναι ότι οι ιδανικές συνθήκες λειτουργίας του φασματογράφου (υψηλό κενό, υψηλή θερμοκρασία, ανάλυση στην αέρια φάση και χαμηλές ροές), είναι εκ διαμέτρου αντίθετες με τις συνήθεις συνθήκες λειτουργίας ενός συστήματος HPLC, δηλαδή ανάλυση στην υγρή φάση, υψηλές πιέσεις, υψηλές ροές και σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες. Τα φαινολικά συστατικά που ταυτοποιήθηκαν ανήκουν στις κατηγορίες των ανθοκυανών, φλαβονολών και κινναμικών οξέων, ενώ επιπλέον ταυτοποιήθηκε η κατεχίνη από τις φλαβανόλες και το γαλλικό οξύ από τα βενζοϊκά οξέα του κρασιού. Η ποσοτικοποίηση ακετυλιωμένων και κουμαριλιωμένων παραγώγων είναι σημαντική, λόγο της συσχέτισής τους με τη δράση ενζύμων του κύκλου της βιοσύνθεσης των ανθοκυανών, ενώ προτείνεται και η αξιοποίησή τους σχετικά με την ταυτοποίηση της εντοπιότητας του κρασιού (Fanzone et al., 2012, Ivanova-Petropulos et al., 2015). Επιπλέον, οι Figueiredo-González et al. (2012), ισχυρίζονται ότι η βιοσύνθεση των φλαβονολών είναι άρρηκτα συνδεδεμένη με την αντίστοιχη των ανθοκυανών και ότι το προφίλ του κρασιού στα παραπάνω συστατικά είναι χαρακτηριστικό της κάθε ποικιλίας. 149

151 Η ταυτοποίηση έγινε με βάση τους χρόνους έκλουσης, τα φάσματα UV-VIS, MS και MS/MS καθώς και με χρήση πρότυπων ουσιών όταν αυτές ήταν διαθέσιμες. 1.1 Ταυτοποίηση ανθοκυανών Εφόσον οι ανθοκυάνες στην έγχρωμη μορφή του ιόντος φλαβυλίου είναι τα μοναδικά φαινολικά συστατικά του κρασιού με απορόφηση στα 520 nm η καταγραφή στον DAD του συγκεκριμένου μήκους κύματος επέτρεψε τη διάκριση τους από τα λοιπά φαινολικά μόρια. Το πολύ χαμηλό ph της μεθόδου με χρήση 10% φορμικού οξέος διασφαλίζει την παρουσία των ελευθέρων ανθοκυανών του κρασιού στη μορφή του φλαβυλίου, ενώ οι Cheynier et al. (2006) αναφέρουν ότι ο καλύτερος τρόπος ταυτοποίησης των συγκεκριμένων μορίων είναι με χρήση ESI-MS και σε οξινισμένο διαλύτη έκλουσης με 10% φορμικό οξύ. Η ανίχνευση των κατιόντων φλαβυλίου των ανθοκυανών έγινε σε λειτουργία θετικού ιονισμού του φασματογράφου μάζας. Σε όλα τα δείγματα έγινε ανάλυση των ανθοκυανών και στην Εικ. 35 φαίνεται το χρωματογράφημα στα 520 nm από τον ανιχνευτή DAD για κρασί της ποικιλίας Syrah από το Μαρκόπουλο, Αττικής. Πρώτοι εκλούονται οι απλοί γλυκοζίτες, ενώ η ακυλίωση μιας ανθοκυάνης αυξάνει τον χρόνο έκλουσης (da Costa et al., 2000) όταν γίνεται ανάλυση σε στήλη χρωματογραφίας αντίστροφης φάσης και το γεγονός αυτό είναι πολύ χρήσιμο κατά τη διαδικασία της ταυτοποίησης. Εικ. 35: Χρωματογράφημα από τον DAD στα 520 nm με τις ανθοκυάνες κρασιού της ποικιλίας Syrah από το Μαρκόπουλο, Αττικής. Dp: δελφινιδίνη, Pt: πετουνιδίνη, Pn: πεονιδίνη, Mv: μαλβιδίνη, glc: γλυκοζίτης, acglc: ακετυλιωμένος γλυκοζίτης, coumglc: κουμαριλιωμένος γλυκοζίτης 150

152 Σε όλες τις ποικιλίες οι ανθοκυανιδίνες εμφανίστηκαν γλυκοζιλιωμένες στη μορφή των 3-Ο-γλυκοζιτών, ως απλοί γλυκοζίτες ή ακυλιωμένοι από το οξικό, το p- κουμαρικό και το καφεϊκό οξύ. Στην Εικ. 36 φαίνεται το φάσμα UV-VIS του 3-Ο-γλυκοζίτη της μαλβιδίνης και του 3-Ο-(6 -p-κουμαρυλιωμένος) γλυκοζίτη της μαλβιδίνης (Mv-3-Ο-coumglc) με τα χαρακτηριστικά μέγιστα απορρόφησης κοντά στα 280 και 520 nm, καθώς και τα φάσματα μάζας των δύο ουσιών. Οι ανθοκυάνες λόγω του ότι είναι ήδη φορτισμένες δίνουν πολύ καλή απόκριση στον ανιχνευτή του φασματογράφου μάζας. Το κύριο ιόν (M + ) ισούται με το μοριακό βάρος της ανθοκυάνης ενώ διακρίνεται και το θραύσμα που αντιστοιχεί στην αντίστοιχη ανθοκυανιδίνη ([Μ-C6H10O5] + για τον 3-γλυκοζίτη, και [Μ-C15H16O7] + για την κουμαριλιωμένη μορφή). Έτσι για τον 3-γλυκοζίτη της μαλβιδίνης το κύριο ιόν αντιστοιχεί σε 493 που είναι και το μοριακό της βάρος, ενώ το θραύσμα 331 είναι το μοριακό βάρος της αγλυκόνης και γι αυτό ανιχνεύεται και στην κουμαριλιωμένη μορφή της. Εικ. 36: Τα φάσματα UV-VIS του γλυκοζίτη και του κουμαριλιωμένου γλυκοζίτη της μαλβιδίνης (a 1 και b 1) και τα αντίστοιχα φάσματα μάζας (a 2 και b 2) 151

153 Στην Εικ. 37 φαίνεται το χρωματογράφημα από τον ανιχνευτή MS για φλοιούς σταφυλιού της Μαυροκουντούρας Κύμης. Εικ. 37: Χρωματογράφημα LC- MS όπου διακρίνονται οι ανθοκυάνες των φλοιών του σταφυλιού της ποικιλίας Μαυροκουντούρα Κύμης Για τις ανθοκυάνες που βρίσκονται στα όρια ανίχνευσης του οργάνου, λόγω μικρής περιεκτικότητας, χρησιμοποιήθηκε ο φασματογράφος σε λειτουργία MS/MS. Σε αυτή την περίπτωση γνωρίζοντας από τον DAD ότι πρόκειται για ανθοκυάνη λόγο του χαρακτηριστικού της φάσματος UV-VIS, επιλέγονται όλα τα υποψήφια μοριακά βάρη που φαίνονται στον φασματογράφο μάζας και επαναλαμβάνεται η ανάλυση. Το μοριακό ιόν θα θραυσματωθεί στο μοριακό βάρος μίας από της 5 ανθοκυανιδίνες (m/z 331 εάν είναι μαλβιδίνη, m/z 317 εάν είναι πετουνιδίνη κ.ο.κ.). Εν συνεχεία η διαφορά από το αρχικό ιόν που θραυσματώθηκε υποδεικνύει την υποκατάσταση (- 162 Da εάν είναι γλυκοζίτης, -204 Da εάν είναι ακετυλιωμένος γλυκοζίτης, -324 Da εάν είναι διγλυκοζίτης κ.ο.κ.). Στην Εικ. 38 φαίνoνται τα φάσματα MS/MS του 3- γλυκοζίτη της δελφινιδίνης, του 3-γλυκοζίτη της κυανιδίνης, του 3-αραβινοζίτη της πετουνιδίνης, και του 3-αραβινοζίτη της δελφινιδίνης από δείγμα χυμού μύρτιλλο. Τα αντίστοιχα μοριακά βάρη είναι 465, 449, 449 και 435 αντίστοιχα. Η θραυσμάτωση τους με την τεχνική MS/MS δίνει τα θραύσματα των αγλυκόνων της δελφινιδίνης, της κυανιδίνης και της πετουνιδίνης. Για τη δελφινιδίνη συγκεκριμένα, η διάκριση μεταξύ αραβινοζίτη και γλυκοζίτη προέκυψε ως εξής: α) Ο αραβινοζίτης είναι πιο άπολη ένωση από τον γλυκοζίτη της ίδιας ανθοκυάνης και είναι αναμενόμενο να έχει μεγαλύτερο χρόνο έκλουσης, β) τα μοριακά βάρη των δύο ενώσεων είναι τα 152

154 αναμενόμενα από βιβλιογραφικά δεδομένα, γ) το φάσμα MS/MS και των δύο ανταποκρίνεται στην αγλυκόνη της δελφινιδίνης. Εικ. 38: Τα φάσματα MS/MS των δελφινιδίνη-3-γλυκοζίτης, κυανιδίνη-3-γλυκοζίτης, πετουνιδίνη-3-αραβινοζίτης και δελφινιδίνη-3-αραβινοζίτης από δείγμα χυμού μύρτιλλο Στον Πίν. 10 φαίνονται οι ανθοκυάνες που ταυτοποιήθηκαν σε όλες τις ποικιλίες σταφυλιού που αναλύθηκαν, μαζί με τους χρόνους έκλουσης, τα μέγιστα απορρόφησης του φάσματος UV-VIS καθώς και τα κύρια ιόντα και θραύσματα από τα φάσματα μάζας. 153

155 Πίν. 10: Οι ανθοκυάνες που ταυτοποιήθηκαν σε όλες τις ποικιλίες κρασιού που μελετήθηκαν Φαινολικό συστατικό Χρόνος λ max [nm] M + και έκλουσης [min] θραύσμα (m/z) Δελφινιδίνη-3-γλυκοζίτης , 346, , 303 Κυανιδίνη-3-γλυκοζίτης , , 287 Πετουνιδίνη-3-γλυκοζίτης , 350, , 317 Πεονιδίνη-3-γλυκοζίτης , 362, , 301 Μαλβιδίνη-3-γλυκοζίτης , 350, , 331 Δελφινιδίνη-3-(6 -ακέτυλ)γλυκοζίτης , , 303 Κυανιδίνη-3-(6 -ακέτυλ)γλυκοζίτης , , 287 Πετουνιδίνη-3-(6 -ακέτυλ)γλυκοζίτης , , 317 Πεονιδίνη-3-(6 -ακέτυλ)γλυκοζίτης , 372, , 301 Δελφινιδίνη-3-(6 -κουμάρυλ)γλυκοζίτης , , 303 Μαλβιδίνη-3-(6 -ακέτυλ)γλυκοζίτης , 350, , 331 Μαλβιδίνη-3-(6 -καφέυλ)γλυκοζίτης , , 331 Πετουνιδίνη-3-(6 -κουμάρυλ)γλυκοζίτης , , 317 Μαλβιδίνη-3-(6 -cisκουμάρυλ)γλυκοζίτης , , 331 Πεονιδίνη-3-(6 -κουμάρυλ)γλυκοζίτης , , 301 Μαλβιδίνη-3-(6 -transκουμάρυλ)γλυκοζίτης , , 331 Η ποσοτικοποίηση των ανθοκυανών έγινε σε ισοδύναμα 3-γλυκοζίτη της μαλβιδίνης με χρήση αντίστοιχης καμπύλης αναφοράς που έγινε στα 520 nm στον DAD. Τα αποτελέσματα για όλες της ποικιλίες κρασιού που μελετήθηκαν παρουσιάζονται στον Πίν

156 Πίν. 11: Το ανθοκυανικό περιεχόμενο 8 κόκκινων φρέσκων κρασιών και οι λόγοι που χρησιμοποιήθηκαν για τον χαρακτηρισμό τους. Η ποσοτικοποίηση γίνεται σε mg/l ισοδυνάμων μαλβιδίνης-3-γλυκοζίτη. Τα διαφορετικά γράμματα στην ίδια σειρά, υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές σύμφωνα με τη δοκιμή Duncan (p < 0.05) Ανθοκυάνες Αγιωργίτικο (Νεμέα) Αγιωργίτικο (Τρίπολη) Merlot (Μαρκόπουλο) Merlot (Μαντινεία) Merlot (Τρίπολη) Syrah (Μαρκόπουλο) Cabernet (Τρίπολη) Μαυροκουντού ρα (Χαλκίδα) Dp-3-glc Cn-3-glc Ίχνη Ίχνη Pt-3-glc Pn-3-glc Mv-3-glc Dp-3-acglc - - Ίχνη Cn-3-acglc Ίχνη Ίχνη Pt-3-acglc Pn-3-acglc Mv-3-acglc Dp-3-coumglc Ίχνη Pt-3-coumglc Ίχνη Pn-3-coumglc Mv-3-coumglc Mv-3-cis-coumglc Ίχνη Mv-3-cafglc Ίχνη Ίχνη - - Ίχνη Ολικές ελεύθερες ανθοκυάνες % γλυκοζιλιωμένες % ακετυλιωμένες % κουμαριλιωμένες

157 Αγιωργίτικο (Νεμέα) Αγιωργίτικο (Τρίπολη) Merlot (Μαρκόπουλο) Merlot (Μαντινεία) Merlot (Τρίπολη) Syrah (Μαρκόπουλο) Cabernet (Τρίπολη) Μαυροκουντούρα (Χαλκίδα) γλυκοζυλιωμένων/ 10.9 a a 2.15 b 2.80 b 3.83 b 2.19 b 2.79 b 2.87 b ακετυλιωμένων γλυκοζιλιωμένων/ 4.5 d 5.80 bc 3.72 e 5.65 c 6.30 b 4.38 d 7.21 a 3.47 e κουμαριλιωμένων ακετυλιωμένων/ 0.4 e 0.52 e 1.74 bc 2.02 b 1.65 c 2.00 b 2.58 a 1.21 d κουμαριλιωμένων (Pn-3-glc+pt-3-glc)/(dp-3- glc+cn-3-glc) 2.6 b 2.50 b 2.75 b 2.68 b 1.62 c 3.22 a 1.35 c 3.40 a Ο 3-γλυκοζίτης της μαλβιδίνης ήταν η κύρια μονομερής ανθοκυάνη σε όλες τις περιπτώσεις. Ο ακετυλιωμένος γλυκοζίτης της μαλβιδίνης ήταν σε όλες τις ποικιλίες η 2η κύρια ανθοκυάνη, με μοναδική εξαίρεση την ποικιλία του Αγιωργίτικου όπου ο trans-κουμαριλιωμένος γλυκοζίτης εμφάνισε τη 2η υψηλότερη συγκέντρωση. Συνολικά, ταυτοποιήθηκαν στις ποικιλίες 16 μονομερείς ανθοκυάνες. Πέντε 3-Oγλυκοζίτες (3-glc), πέντε 3-O-(6 -ακετυλιωμένοι)γλυκοζίτες (3-acglc), τέσσερις 3-O- (6 -trans-p-κουμαριλιωμένοι)γλυκοζίτες (3-coumglc), ενώ ο κουμαριλιωμένος γλυκοζίτης της μαλβιδίνης ταυτοποιήθηκε και σαν cis ισομερές (mv-3-cis-coumglc) στο Αγιωργίτικο με προέλευση την Τρίπολη αλλά και στη Μαυροκουντούρα. Τέλος, σε τρεις περιπτώσεις (Merlot από Μαντινεία και Τρίπολη, αλλά και στη Μαυροκουντούρα), ταυτοποιήθηκε η μαλβιδίνη υποκατεστημένη από καφεϊκό οξύ (3-cafglc). H κυανιδίνη ήταν η ανθοκυανιδίνη με τη μικρότερη συγκέντρωση ανεξαρτήτως ποικιλίας και ανιχνεύτηκε σε ίχνη μόνο στην ποικιλία Merlot. Γενικά, στην ποικιλία Merlot ταυτοποιήθηκαν οι περισσότερες διαφορετικές ανθοκυάνες (14), ενώ η μαλβιδίνη εμφανίστηκε (με τη μορφή όλων των γλυκοζιτών της) στα χαμηλότερα ποσοστά (70 ± 5%). Αντίθετα, στο Αγιωργίτικο η μαλβιδίνη αποτελούσε το 82 ± 2% του συνολικού ανθοκυανικού φορτίου, ενώ στην εν λόγω ποικιλία ταυτοποιήθηκαν μόλις 9 διαφορετικοί γλυκοζίτες. 156

158 Τα τελευταία χρόνια, το φαινολικό προφίλ του κρασιού προτείνεται ως τρόπος χαρακτηρισμού του, ανάλογα με τον τόπο προέλευσης των σταφυλιών και την ποικιλία τους (Figueiredo-González et al., 2012, Fanzone et al., 2012), ενώ η ποσοτικοποίηση ακετυλιωμένων και κουμαριλιωμένων παραγώγων είναι σημαντική, λόγο της συσχέτισής τους με τη δράση ενζύμων του κύκλου της βιοσύνθεσης των ανθοκυανών (Fanzone et al., 2012, Ivanova-Petropulos et al., 2015). Προφανώς η συγκέντρωση των επιμέρους χαρακτηριστικών ομάδων δεν θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί, γιατί δεν είναι συνάρτηση μόνο του σταφυλιού από το οποίο προέρχεται η χαρακτηριστική ομάδα, αλλά και πλήθους παραμέτρων της οινοποίησης, όπως είναι ο χρόνος εκχύλισης, η χρήση ή όχι πηκτινολητικών ενζύμων, η διάρκεια της παλαίωσης, η ατμόσφαιρα αποθήκευσης κλπ. Αντ αυτού, χρησιμοποιούνται κάποιες αναλογίες συγκέντρωσης επιμέρους φαινολικών συστατικών (Fanzone et al., 2012, Ivanova-Petropoulos et al., 2015). Το γεγονός ότι απλώς η ποσοτικοποίηση του ανθοκυανικού περιεχομένου δεν μπορεί να χαρακτηρίσει μια ποικιλία κρασιού, φαίνεται από το γεγονός ότι για την ποικιλία Merlot η μέση συγκέντρωση των ολικών μονομερών ανθοκυανών για τους 3 οίνους που εξετάσθηκαν στην παρούσα διατριβή (Πίν. 11) ήταν 539 ± 107 ppm. Η τόσο μεγάλη τυπική απόκλιση είναι αναμενόμενη εάν ληφθεί υπόψη ότι στις τρεις οινοποιήσεις της συγκεκριμένης ποικιλίας δεν ήταν ίδιος ο χρόνος εκχύλισης, ο τρόπος οινοποίησης, αλλά ακόμα και η προέλευση των σταφυλιών. Αντίθετα, αυτό που υπό συνθήκες αναφέρεται στη διεθνή βιβλιογραφία ότι χαρακτηρίζει ανεξάρτητα από τις παραπάνω παραμέτρους μια ποικιλία σταφυλιού, είναι οι αναλογίες μεταξύ συγκεκριμένων γλυκοζιτών. Ως εκ τούτου, για τα 8 κρασιά που μελετήθηκαν, υπολογίστηκαν και παρουσιάζονται στον Πίν. 11 οι λόγοι Σγλυκοζιλιωμένων/Σακετυλιωμένων, Σγλυκοζιλιωμένων/Σκουμαριλιωμένων και Σακετυλιωμένων/Σκουμαριλιωμένων γλυκοζιτών, οι οποίοι προτείνονται στη βιβλιογραφία για τον χαρακτηρισμό των κρασιών ως προς την ποικιλία και εντοπιότητα. Επιπλέον χρησιμοποιήθηκε ο λόγος (Pn-3-glc+pt-3- glc)/(dp-3-glc+cn-3-glc) ο οποίος προτείνεται από τους Figueiredo-González et al. (2012) για τον ίδιο σκοπό και που ουσιαστικά είναι ενδεικτικός για τη δράση του ενζύμου 3 Ο-μέθυλ τρανσφεράση (3 ΟΜΤ), το οποίο μετατρέπει μέσω Ο- μεθυλίωσης στη θέση 3 της ανθοκυανιδίνης, την κυανιδίνη σε πεονιδίνη και τη δελφινιδίνη σε πετουνιδίνη. 157

159 Η στατιστική επεξεργασία (one-way ANOVA, p<0.05), έδειξε ότι οι λόγοι Σγλυκοζιλιωμένων/Σακετυλιωμένων και Σακετυλιωμένων/Σκουμαριλιωμένων γλυκοζιτών διαχώρησαν ως έναν βαθμό τα μελετώμενα κρασιά ως προς την ποικιλία. Οι τιμές του πρώτου λόγου για την ποικιλία του Αγιωργίτικου, είχαν σημαντική διαφορά από τις τιμές των υπολοίπων ποικιλιών. Ακόμα μεγαλύτερο ενδιαφέρον είχαν τα αποτελέσματα του δεύτερου λόγου, μια και εμφάνισαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ποικιλιών Αγιωργίτικο, Cabernet και Μαυροκουντούρας, καθώς και για δύο από τα τρία Merlot. Σε σχέση με την εντοπιότητα, είναι απαραίτητο να μελετηθούν περισσότερα κρασιά ίδιας ποικιλίας και διαφορετικής εντοπιότητας για να προκύψουν σαφή συμπεράσματα. 1.2 Ταυτοποίηση μη ανθοκυανικών φαινολικών συστατικών Η ταυτοποίηση των φαινολικών συστατικών του κρασιού εκτός των ανθοκυανών έγινε χρησιμοποιώντας τον ανιχνευτή MS σε λειτουργία αρνητικού ιονισμού, επειδή τα κινναμικά οξέα και οι φλαβονόλες δίνουν με σχετική ευκολία ιόντα [M-H] -. Επιπλέον, όσον αφορά στα χαρακτηριστικά μήκη κύματος των παραπάνω ενώσεων, για τα κινναμικά οξέα είναι τα 320 nm και για τις φλαβονόλες τα 360 nm. Στην Εικ. 39 παρουσιάζεται το χρωματογράφημα στα 360 nm από τον DAD, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση των μορίων των φλαβονολών. Οι κύριες φλαβονόλες που ανιχνεύτηκαν σε όλες τις ποικιλίες ήταν η κερκετίνη και η μυρισετίνη, ενώ ανιχνεύτηκαν στη μορφή των 3-Ο-γλυκουρονιδίων, 3-Ο-γλυκοζιτών καθώς και ως αγλυκόνες. Επιπλέον σε μικρότερες περιεκτικότητες ταυτοποιήθηκαν τα μόρια του 3-γλυκοζίτη της λαρικιτρίνης, 3-γλυκοζίτη της ισοραμνετίνης, και 3- γλυκοζίτη της συρινγκετίνης. Η ταυτοποίηση των μορίων των φλαβονολών στις 3 διαφορετικές μορφές τους (γλυκουρονίδιο, γλυκοζίτης και αγλυκόνη) έγινε και πάλι με χρήση της τεχνικής του MS/MS. Τα στοχευμένα μοριακά ιόντα που αναμενόταν να αντιστοιχούν σε μόρια φλαβονολών (υπόθεση που προέκυπτε από το φάσμα UV-VIS) θραυσματώνονταν σε m/z που αντιστοιχούσαν στην αγλυκόνη της εκάστοτε φλαβονόλης (π.χ. 301 για την κερκετίνη, 317 για τη μυρισετίνη). Εν συνεχεία εάν το θραύσμα της αγλυκόνης προέκυπτε ως [Μ-176] - τότε το μόριο ήταν γλυκουρονίδιο, ενώ το αντίστοιχο 158

160 θραύσμα αγλυκόνης από τον γλυκοζίτη προέκυπτε ως [Μ-162] -. Επιπλέον ο χρόνος έκλουσης λόγο της διαφοράς πολικότητας ήταν πάντα μεγαλύτερος για την άπολη αγλυκόνη σε σχέση με τα υποκατεστημένα μόρια. Γενικά ο χρόνος έκλουσης όπως φαίνεται και στην Εικ. 39 για τα μόρια των φλαβονολών ακολουθούσε τη σειρά: Γλυκουρονίδιο<γλυκοζίτης<αγλυκόνη Στον Πίν. 12 παρουσιάζονται οι χρόνοι έκλουσης, τα φάσματα απορρόφησης καθώς και τα μοριακά ιόντα και κύρια θραύσματα για τα μόρια των φλαβονολών που ταυτοποιήθηκαν. Εικ. 39: Χρωματογράφημα από τον DAD στα 360 nm με τις φλαβονόλες κρασιού της ποικιλίας Merlot από το Μαρκόπουλο, Αττικής. M: μυρισετίνη, Q: κερκετίνη, L: λαρικιτρίνη, I: ισοραμνετίνη, S: συρινγκετίνη, glcrn: γλυκουρονίδιο, glc: γλυκοζίτης Στον Πίν. 12 παρατίθενται επίσης τα οξέα που ταυτοποιήθηκαν με την τεχνική του LC-DAD-MS, οι χρόνοι έκλουσης και τα στοιχεία των φασμάτων απορρόφησης και μάζας. Το trans-καφταρικό και to trans-κουταρικό οξύ ήταν τα κύρια κινναμικά παράγωγα που ανιχνεύτηκαν, ενώ τα αντίστοιχα υδρολυμένα μόρια (καφεϊκό και p- κουμαρικό οξύ) ανιχνεύτηκαν μόνο σε ίχνη στα φρέσκα κρασιά, με εξαίρεση το Merlot και το Cabernet από την Τρίπολη, στα οποία η συγκέντρωση του καφεϊκού οξέoς ήταν μετρήσημη. Παρατηρούμε ότι η σχάση των τρυγικών εστέρων, έδινε θραύσμα που αντιστοιχεί στο μοριακό βάρος των αντίστοιχων κινναμικών οξέων (καφεϊκό και p-κουμαρικό), αλλά και τη γρηγορότερη έκλουση των εστεροποιημένων δομών. Άλλα φαινολικά συστατικά που ανιχνεύτηκαν με τη βοήθεια της HPLC, είναι το γαλλικό οξύ (φαινολικό οξύ) και τα μονομερή των προκυανιδινών (κατεχίνη και επικατεχίνη). Τα τρία παραπάνω μόρια δεν ποσοτικοποιήθηκαν μιας και το φάσμα 159

161 τους με μέγιστο στα 280 nm, μήκος κύματος που απορροφούν όλα τα φαινολικά συστατικά δεν επέτρεψε τον σαφή διαχωρισμό τους, προκειμένου να είναι αξιόπιστη η ολοκλήρωση του χρωματογραφήματος. Πίν. 12: Τα φαινολικά συστατικά που ταυτοποιήθηκαν στις διάφορες ποικιλίες κρασιού πλην των ανθοκυανών Φλαβονόλες Φαινολικά οξέα Φαινολικό συστατικό Χρόνος λ max [nm] [M-Η] - και έκλουσης [min] θραύσμα (m/z) Μυρισετίνη-3-γλυκουρονίδιο , , 317 Μυρισετίνη-3-γλυκοζίτης , , 317 Κερκετίνη-3-γλυκουρονίδιο , , 301 Κερκετίνη-3-γλυκοζίτης , , 301 Λαρικιτρίνη-3-γλυκοζίτης , , 331 Μυρισετίνη , Ισοραμνετίνη-3-γλυκοζίτης , , 315 Συρινγκετίνη-3-γλυκοζίτης , , 345 Κερκετίνη , Γαλλικό οξύ , 125 trans-καφταρικό οξύ , 179 trans-κουταρικό acid , 163 Καφεϊκό οξύ , 135 p-κουμαρικό οξύ , 119 Φλαβανόλες (+)-Κατεχίνη Στον Πίν. 13 παρουσιάζεται η ποσοτικοποίηση των μορίων των φλαβονολών σε ισοδύναμα κερκετίνης για όλες τις ποικιλίες κρασιού που μελετήθηκαν. Στις λευκές ποικιλίες του Ασύρτικου και του Μοσχοφίλερου οι φλαβονόλες ανιχνεύτηκαν μόνο σε ίχνη, δείγμα του πόσο σημαντική είναι η διεργασία της εκχύλισης για την 160

162 παραλαβή των συγκεκριμένων φαινολικών συστατικών από το σταφύλι. Στις ερυθρές ποικιλίες οι μυρισετίνη και η κερκετίνη στις 3 μορφές που απαντώνται (γλυκουρονίδιο, γλυκοζίτης και αγλυκόνη) ήταν οι κυρίαρχες φλαβονόλες συναποτελώντας το 79-92% του ολικού φορτίου ανάλογα με την ποικιλία (79% στο Αγιωργίτικο που οινοποιήθηκε στη Νεμέα και 92% στο Merlot που οινoποιήθηκε στην Τρίπολη). Οι γλυκοζίτες των λαρικιτρίνη, ισοραμνετίνη και συριγγετίνη απαντήθηκαν σε πολύ μικρότερες περιεκτικότητες (έως και ίχνη) σε όλες τις περιπτώσεις. Το υψηλότερο φορτίο φλαβονολών παρατηρήθηκε στην ποικιλία Syrah από το Μαρκόπουλο Αττικής (191.3 mg/l), ενώ το χαμηλότερο (από τις ερυθρές ποικιλίες) στην ποικιλία Merlot από τη Μαντινεία με μόλις 16.2 mg/l. Αξιοσημείωτη τέλος ήταν η διακύμανση του ποσοστού των αγλυκόνων των φλαβονολών, με το ποσοστό τους να κυμαίνεται (στις ερυθρές ποικιλίες) από 23% στο Αγιωργίτικο από τη Νεμέα, έως 45% στο Cabernet και 72% στο Merlot από την Τρίπολη. Το γεγονός αυτό είναι αξιοσημείωτο μιας και σύμφωνα με τους Castillo-Muñoz et al. (2007) οι φλαβονόλες στα σταφύλια απαντούν μόνο υποκατεστημένες από σάκχαρα, ενώ οι αγλυκόνες προκύπτουν αργότερα σαν αποτέλεσμα όξινης υδρόλυσης κατά την οινοποίηση και παλαίωση. Στον Πίν. 14 παρουσιάζεται η ποσοτικοποίηση των κινναμικών παραγώγων σε ισοδύναμα καφεϊκού οξέoς για όλες τις ποικιλίες κρασιού που μελετήθηκαν. Το trans-καφταρικό οξύ ήταν το κύριο υδροξυκινναμικό παράγωγο σε όλες τις ποικιλίες, εμφανίζοντας την υψηλότερη συγκέντρωση στην ποικιλία του Αγιωργίτικου (48.6 mg/l στον οίνο της Νεμέας και 45 mg/l στον οίνο της Τρίπολης). Η συγκέντρωση του κουταρικού οξέος ήταν για τις ποικιλίες Αγιωργίτικου και Syrah υποδιπλάσια της αντίστοιχης του καφταρικού, ενώ στις υπόλοιπες ποικιλίες από υποτριπλάσια έως και υπο εξαπλάσια. Τα παραπάνω συμφωνούν με τους Makris et al. (2006), Puértolas et al. (2011) και ενισχύουν τον ισχυρισμό τους ότι το καφταρικό και το κουταρικό οξύ μπορούν πιθανόν να χρησιμοποιηθούν για το χαρακτηρισμό και τη διάκριση συγκεκριμένων ποικιλιών. Όσον αφορά τα ολικά κινναμικά παράγωγα, το υψηλότερο φορτίο εμφάνισε η ποικιλία του Αγιωργίτικου (70 mg/l) ενώ ακολούθησε το Syrah (52 mg/l). H μικρότερη περιεκτικότητα παρατηρήθηκε στο Merlot από τη Μαντινεία (15 mg/l), ενώ οι αντίστοιχες περιεκτικότητες για τις λευκές ποικιλίες του Ασύρτικου και του Μοσχοφίλερου ήταν 18 και 33 mg/l αντίστοιχα. 161

163 Πίν. 13: Οι φλαβονόλες που ταυτοποιήθηκαν σε 7 κόκκινα και 2 λευκά φρέσκων ελληνικών κρασιών. Η ποσοτικοποίηση έγινε σε mg/l ισοδυνάμων κερκετίνης Φλαβονόλες Αγιωργίτικο (Νεμέα) Αγιωργίτικο (Τρίπολη) Merlot (Μαρκόπουλο) Merlot (Μαντινεία) Merlot (Τρίπολη) Syrah (Μαρκόπουλο) Cabernet (Τρίπολη) Ασύρτικο (Νεμέα) Μοσχοφίλερο (Μαντινεία) Μ-3-glcrn Ίχνη Q-3-glcrn Ίχνη M-3-glc Ίχνη Q-3-glc Ίχνη L-3-glc I-3-glc Ίχνη 16.5 Ίχνη Ίχνη - S-3-glc M Ίχνη Ίχνη Q Ίχνη Ολικές φλαβονόλες % γλυκουρονιδιωμένες % γλυκοζιλιωμένες % άγλυκες Πίν. 14: Τα φαινολικά οξέα που ταυτοποιήθηκαν σε 7 κόκκινα και 2 λευκά φρέσκων ελληνικών κρασιών. Η ποσοτικοποίηση έγινε σε mg/l ισοδυνάμων καφεϊκού οξέος Φαινολικά Οξέα Αγιωργίτικο (Νεμέα) Αγιωργίτικο (Τρίπολη) Merlot (Μαρκόπουλο) Merlot (Μαντινεία) Merlot (Τρίπολη) Syrah (Μαρκόπουλο) Cabernet (Τρίπολη) Ασύρτικο (Νεμέα) Μοσχοφίλερο (Μαντινεία) trans-καφταρικό οξύ trans-κουταρικό acid Καφεϊκό οξύ Ίχνη Ίχνη Ίχνη Ίχνη 4.2 Ίχνη 3.7 Ίχνη Ίχνη p-κουμαρικό οξύ Ίχνη Ίχνη Ίχνη Ίχνη Ίχνη Ίχνη Ίχνη Ίχνη Ίχνη Ολικά κινναμικά παράγωγα

164 Εξέλιξη πολυφαινολών και ιχνοστοιχείων κατά την οινοποίηση 1.3 Εκχύλιση πολυφαινολών κατά τη βιομηχανική οινοποίηση ερυθρών και λευκών ποικιλιών σταφυλιού Στο παρόν κεφάλαιο θα παρουσιαστούν και θα σχολιασθούν τα αποτελέσματα της εκχύλισης των επιμέρους φαινολικών ομάδων, καθώς και των ολικών φαινολών, από τα στέμφυλα προς το γλεύκος, για διαφορετικές ποικιλίες ελληνικών σταφυλιών. Όλες οι οινοποιήσεις έγιναν σε βιομηχανική κλίμακα. Η διεργασία της εκχύλισης, δηλαδή η παραμονή του γλεύκους σε επαφή με τα στέμφυλα, είναι απαραίτητη κατά την ερυθρή οινοποίηση για την παραλαβή του χρώματος από τους φλοιούς των σταφυλιών, ενώ στη λευκή οινοποίηση είτε γίνεται προζυμωτική εκχύλιση, είτε δεν γίνεται καθόλου. Αν και το φαινολικό προφίλ του κρασιού χαρακτηρίζεται από συνεχείς μεταβολές όχι μόνο κατά τη διάρκεια της οινοποίησης, αλλά και κατά τη διάρκεια της παλαίωσης-αποθήκευσης (αντιδράσεις πολυμερισμού μεταξύ προκυανιδινών και ανθοκυανών, δημιουργία πυρανοανθοκυανών κλπ.), η διεργασία της εκχύλισης δεν παύει να είναι το πιο καθοριστικό στάδιο, αφού το αρχικό φαινολικό φορτίο είναι αυτό που σε μεγάλο βαθμό θα καθορίσει και τη μετέπειτα εξέλιξη. Οι ρυθμοί εκχύλισης των διαφορετικών φαινολικών ομάδων του κρασιού διαφέρουν και είναι συνάρτηση της πολικότητας των μορίων, της θέσης τους στον καρπό του σταφυλιού, του σχήματος της ρόγας, του βαθμού ωρίμανσης κλπ. Η χρήση πηκτινολητικών ενζύμων κατά την εκχύλιση είναι μια συχνά χρησιμοποιούμενη τεχνική προκειμένου να μεγιστοποιηθεί η απόδοση του γλεύκους κατά την οινοποίηση, ενώ λόγο της διάρηξης των ιστών του καρπού ευνοείται και η εκχύλιση των πολυφαινολών. Τέλος, μια εναλλακτική μέθοδο αποτελεί η προζυμωτική κρυοεκχύλιση, η οποία οδηγεί σε μειωμένη εκχύλιση προκυανιδινών από τα γίγαρτα, οι οποίες προσδίδουν πικρή γεύση που δεν είναι επιθυμητή (Álvarez et al., 2009 & Busse-Valverde et al., 2011). Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η εκχύλιση των διαφορετικών φαινολικών ομάδων (ανθοκυάνες, κινναμικά οξέα, φλαβονόλες, φλαβαν-3-όλες) σε πέντε βιομηχανικές οινοποιήσεις, σε λευκά και κόκκινα ελληνικά κρασιά. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η εκχύλιση των πολυφαινολών κατά την οινοποίηση πέντε ερυθρών 163

165 (Αγιωργίτικο, Merlot Α, Merlot Β, Syrah, Cabernet) και μίας λευκής ποικιλίας σταφυλιού (Μοσχοφίλερο). Η διεργασία της εκχύλισης διήρκεσε 5-7 ημέρες για το Αγιωργίτικο, το Merlot A και Β, και το Syrah, και 20 για το Cabernet (5 ημέρες κρυοεκχύλιση στους 12 C) μιας και το συγκεκριμένο κρασί προοριζόταν για παλαίωση μακράς διάρκειας σε δρύινα βαρέλια. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκαν πηκτινολητικά ένζυμα για την οινοποίηση Αγιωργίτικου και Cabernet (EX-V, Montreal, Canada, 12 g/tn) και Merlot B και Syrah (Uvazym couleur, Enartis, San Martino, Italy, 20 g/tn). Τέλος, το Μοσχοφίλερο υποβλήθηκε σε δύο διαφορετικές οινοποιήσεις, στη μία εκ των οποίων προηγήθηκε κρυοεκχύλιση στους 10 C για 6 ώρες Εκχύλιση φαινολικών συστατικών από τα μέρη του σταφυλιού στο κρασί Η συγκεκριμένη μελέτη έγινε σε σταφύλια της Μαυροκουντούρα, η οποία καλλιεργείται στην Εύβοια και είναι κλώνος της ποικιλίας της Μανδηλαριάς. Οι ρόγες της Μαυροκουντούρας είναι σχετικά μικρότερες από τις αντίστοιχες άλλων κλόνων της Μανδηλαριάς. Η μέση διάμετρός τους προσδιορίστηκε στα 13.7±2.0 mm και το μέσο βάρος τους στα 1.9±0.2 g, ενώ οι αντίστοιχες τιμές για τη Μανδηλαριά είναι 16.0 mm και 2.8 g (Stavrakakis, 2010). Οι φλοιοί αντιστοιχούν στο 19.1% της ολικής λιοφυλιωμένης μάζας του καρπού, τα γίγαρτα στο 3.1% και η σάρκα στο 67.1%. Στον Πίν. 15 φαίνονται οι τιμές των ολικών φαινολικών για το κάθε μέρος του καρπού. Το υψηλότερο φαινολικό φορτίο εμφάνισαν τα γίγαρτα (4969 ppm), γεγονός που αποδίδεται στην παρουσία προκυανιδινών στο συγκεκριμένο μέρος του καρπού, ενώ και το φορτίο των φλοιών ήταν υψηλό (1686 ppm). Αντίθετα το φαινολικό φορτίο της σάρκας ήταν αμελητέο. Τα παραπάνω είναι σε συμφωνία με τους Kallithraka et al. (2001) και Kourakou-Dragona (1998). Το ολικό φαινολικό φορτίο του φρέσκου κρασιού μετρήθηκε ίσο με 2165 mg/l ισοδυνάμων γαλλικού οξέος (GAE). Η ανάκτηση της Mv-3-glc υπολογίστηκε σε 33% και ήταν σχεδόν η ίδια με αυτή των ολικών ελεύθερων ανθοκυανών (32%) και των ολικών φαινολών (32%) όπως φαίνεται στον Πίν. 16. Αντίθετα η Mv-3-coumglc είχε 164

166 πολύ χαμηλότερη ανάκτηση (10%), γεγονός που αποδίδεται και στη χαμηλότερη πολικότητα του κουμαριλιωμένου μορίου. Οι García-Beneytez et al. (2002) αναφέρουν ότι οι ακυλιωμένες ανθοκυάνες με p-κουμαρικό οξύ, εκχυλίζοναι δυσκολότερα κατά την ερυθρή οινοποίηση, συγκριτικά με τις μη ακυλιωμένες και τις ακετυλιωμένες. Οι González-Neves et al. (2008) προσδιορίζουν την απόδοση της εκχύλισης των κουμαριλιωμένων ανθοκυανών μεταξύ 5% και 15%. Πίν. 15: Η ποσοτικοποίηση των ολικών φαινολικών της σταφυλής και του κρασιού της Μαυροκουντούρας σε ppm ισοδυνάμων γαλλικού οξέος Μαυροκουντούρα Ολικές Φαινόλες (mg GAE/L) Φλοιοί 1686±129 Γίγαρτα 4969±398 Σάρκα 140±18 Σταφυλή (σύνολο) 6795 Κρασί 2165±69 Πίν. 16: Το ανθοκυανικό περιεχόμενο της σταφυλής και του κρασιού της Μαυροκουντούρας εκφρασμένο σε ppm Μv-3-glc Μαυροκουντούρα Mv-3-glc Mv-3-coumglc Ολικές ανθοκυάνες Σταφυλή 169.2± ± ±4.3 Κρασί 55.5± ± ±8.9 Ποσοστό εκχύλισης ανθοκυανών 33% 10% 32% 165

167 1.3.2 Επίδραση του χρόνου επαφής με τα στέμφυλα στην εκχύλιση φαινολικών συστατικών Η εκχύλιση των επιμέρους φαινολικών ομάδων (ανθοκυάνες, φλαβαν-3-όλες, τρυγικοί εστέρες των κινναμικών οξέων και φλαβονόλες) καθώς και των ολικών φαινολικών κατά την ερυθρή οινοποίηση της ποικιλίας Merlot A παρουσιάζεται στην Εικ. 40 και της ποικιλίας Αγιωργίτικο στην Εικ. 41. Η εκχύλιση διήρκησε 5 ημέρες, σε θερμοκρασία 18 C, χωρίς προσθήκη πηκτινολυτικών ενζύμων, για το Merlot A και 6 μέρες με χρήση πηκτινολητικών ενζύμων για το Αγιωργίτικο. Εικ. 40: Η μεταβολή του ολικού φαινολικού φορτίου TP (ισοδύναμα γαλλικού οξέoς), ανθοκυανών TAntho (ισοδύναμα μαλβιδίνης-3-γλυκοζίτη), φλαβονολών TFlav (ισοδύναμα κερκετίνης), φλαβαν-3-ολών TCat (ισοδύναμα κατεχίνης) και τρυγικών εστέρων TCAcids (ισοδύναμα καφεϊκού οξέος), κατά την εκχύλιση του Merlot Α 166

168 Εικ. 41: Η μεταβολή του ολικού φαινολικού φορτίου TP (ισοδύναμα γαλλικού οξέoς), ανθοκυανών TAntho (ισοδύναμα μαλβιδίνης-3-γλυκοζίτη), φλαβονολών TFlav (ισοδύναμα κερκετίνης), φλαβαν-3-ολών TCat (ισοδύναμα κατεχίνης) και τρυγικών εστέρων TCAcids (ισοδύναμα καφεϊκού οξέος), κατά την εκχύλιση του Αγιωργίτικου Η εκχύλιση των πολυφαινολών κατά την οινοποίηση επηρεάζεται πρωταρχικά από τη χρονική διάρκεια της διεργασίας. Έτσι, η μέγιστη συγκέντρωση των ολικών φαινολικών παρατηρήθηκε την 4η ημέρα, δηλαδή προς το τέλος της εκχύλισης, και ήταν ίση με 1446 ± 97 mg/l για το Merlot και την 6η ημέρα και ήταν ίση με 2654 ± 6 mg/l για το Αγιωργίτικο. Προφανώς, η συγκέντρωση των ολικών φαινολών είναι συνάρτηση της εκχύλισης των επιμέρους φαινολικών ομάδων. Όπως φαίνεται στην Εικ. 40 οι ανθοκυάνες εκχυλίζονται με ταχύ ρυθμό κατά τις πρώτες ημέρες της οινοποίησης μετά την έκθλιψη, αφού είναι υδατοδιαλυτές και βρίσκονται αποκλειστικά στα χυμοτόπια των κυττάρων των φλοιών, στις τρεις με τέσσερις εξωτερικές σειρές κυττάρων, από όπου διαχέονται εύκολα στο γλεύκος, αμέσως μόλις υποστούν πλασμόλυση τα κύτταρα (Κουράκου 1998). Η μέγιστη συγκέντρωσή τους στο Αγιωργίτικο παρατηρήθηκε την 5η ημέρα και ισούταν με 827 ± 80 mg/l. Η απότομη μείωσή τους την 6η ημέρα, ίσως δικαιολογείται από το γεγονός ότι το 167

169 δείγμα αυτής της ημέρας λήφθηκε μετά το διαχωρισμό των στεμφύλων από το γλεύκος, και άρα παρακρατήθηκε ένα ποσοστό των εκχυλισμένων ανθοκυανών από τα στέμφυλα. Ίσως, επίσης, να οφείλεται σε φαινόμενα που συμβαίνουν ταυτόχρονα με την εκχύλιση. Ένα μέρος των ανθοκυανών υποβαθμίζεται λόγω των αντιδράσεων υδρόλυσης και οξείδωσης που λαμβάνουν χώρα, άλλα μόρια σχηματίζουν σύμπλοκα με φαινολικά συστατικά, τα οποία καθιζάνουν και ένα σημαντικό μέρος απορροφάται από τους ζυμομήκυτες (Puértolas et al., 2011). Στο Merlot οι ανθοκυάνες εκχυλίστηκαν ακόμη ταχύτερα, και μάλιστα την 1η κιόλας ημέρα έφτασαν στη μέγιστη συγκέντρωσή τους, στα ± 27.7 mg/l. Το γεγονός ότι σε αυτή την ποικιλία οι ανθοκυάνες εκχυλίζονται τόσο γρήγορα, αποδίδεται στη μορφολογία κυρίως του καρπού και συγκεκριμένα στη μικρής διαμέτρου ρόγα, με λεπτό φλοιό (Ortega - Regules et al., 2007). Μελέτες που έχουν διεξαχθεί έχουν επιβεβαιώσει την ταχύτατη εκχύλιση των ανθοκυανών της ποικιλίας Merlot σε σχέση με άλλες ποικιλίες. Συγκεκριμένα, η συγκέντρωση των ανθοκυανών της ποικιλίας Merlot φτάνει γρηγορότερα σε μέγιστο σε σχέση με την ποικιλία Cabernet Sauvignon (Gonzàlez - Neves et al., 2007). Μετά την 1η ημέρα της εκχύλισης, οι ανθοκυάνες μειώνονται, ενώ στη συνέχεια αυξάνονται πάλι. Αυτό ίσως οφείλεται σε φαινόμενα που συμβαίνουν ταυτόχρονα με την εκχύλιση, όπως ήδη αναφέραμε. Αντίστοιχο προφίλ εκχύλισης με τις ανθοκυάνες, εμφάνισαν τα κινναμικά οξέα και οι τρυγικοί εστέρες τους, με την περιεκτικότητά τους στο γλεύκος να είναι εν γένει μικρότερη από αυτή των ανθοκυανών. Οι τρυγικοί εστέρες εκτός από τα στερεά μέρη του σταφυλιού βρίσκονται και στη σάρκα της ρόγας με αποτέλεσμα όταν ξεκινά η κρυοεκχύλιση ένα σημαντικό ποσοστό τρυγικών εστέρων να βρίσκεται ήδη στο γλεύκος. Η εκχύλισή τους ξεκίνησε από την πρώτη κιόλας ημέρα της οινοποίησης και η μέγιστη περιεκτικότητα παρατηρήθηκε την 5η ημέρα στα ± 15.6 mg/l στο Αγιωργίτικο. Στο Merlot, λόγω της μορφολογίας του καρπού η μέγιστη περιεκτικότητά τους (112.9 ± 5.6 mg/l) παρατηρήθηκε ήδη την 1η ημέρα και στη συνέχεια η συγκέντρωσή τους παρέμεινε πρακτικά σταθερή. Σύμφωνα με τους Puértolas et al. (2011) οι εστέρες των κινναμικών οξέων φτάνουν στη μέγιστη τιμή τους την 3η κιόλας ημέρα της εκχύλισης.. Οι φλαβονόλες βρίσκονται σε ακόμα μικρότερες περιεκτικότητες σε σχέση με τις άλλες φαινολικές ομάδες στο γλεύκος, αλλά εκχυλίζονται και αυτές γρήγορα. 168

170 Συνεισφέρουν στην πικρή γεύση των κόκκινων κρασιών και στη σταθεροποίηση, αλλά και την ενίσχυση του χρώματός τους. Παρόλο που οι φλαβονόλες συντίθενται κυρίως στους φλοιούς, περιέχονται επίσης και στη σάρκα των ραγών (Figueiredo- González et al., 2012). Στη μέγιστη συγκέντρωσή τους έφτασαν την 5η ημέρα στα ± 11.4 mg/l στο Αγιωργίτικο, ενώ η αντίστοιχη τιμή (88.1 ± 7.1 mg/l) παρατηρήθηκε την πρώτη μέρα στο Merlot. Η ποσοτικοποίηση των επιμέρους φλαβονολών, επέδειξε τη γρηγορότερη εκχύλιση των γλυκοζιλιωμένων μορίων. Πιο συγκεκριμένα, ο 3-γλυκοζίτης της κερκετίνης και ο 3-γλυκοζίτης της μυρισετίνης έφτασαν σε αθροιστική περιεκτικότητα 165 mg/l έπειτα από 6 ημέρες. Η εκχύλιση των αγλυκόνων των παραπάνω μορίων (κερκετίνη και μυρισετίνη) ήταν πιο αργή και η μέγιστη περιεκτικότητα παρατηρήθηκε μετά από 13 ημέρες (26 mg/l). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε όλες τις οινοποιήσεις π.χ. στο Merlot B η μέγιστη περιεκτικότητα των γλυκοζυλιωμένων φλαβονολών παρατηρήθηκε έπειτα από 2 ημέρες, ενώ των αγλυκόνων έπειτα από 6 ημέρες. Η διαλυτότητα των φλαβονολών (κυρίως των άγλυκων) είναι μικρότερη από αυτή των ανθοκυανών και η εκχύλισή τους ενισχύεται με την παρουσία αιθανόλης. Τέλος, παρατηρήθηκε μία υστέρηση στην εκχύλιση των φλαβαν-3-ολών και των πολυμερών τους των προκυανιδινών. Οι προκυανιδίνες βρίσκονται κυρίως στα γίγαρτα και όχι στους φλοιούς ή τη σάρκα των ραγών, και ως εκ τούτου η εκχύλισή τους είναι πιο δύσκολη από των άλλων φαινολικών συστατικών του σταφυλιού. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι η αύξηση της περιεκτικότητας της αιθανόλης κατά την εξέλιξη της αλκοολικής ζύμωσης συντελεί στην καλύτερη εκχύλισή τους (Cheynier 2006). Η εκχύλισή τους ξεκίνησε τη 2η ημέρα και στα δύο γλεύκη και στη μέγιστη συγκέντρωσή τους στο γλεύκος έφτασαν προς το τέλος της εκχύλισης (4η ημέρα) στο Merlot και στο τέλος της εκχύλισης (6η ημέρα) στο Αγιωργίτικο. Η χρονική υστέρηση της εκχύλισης των φλαβαν-3-ολών επιβεβαιώνεται αν ληφθεί υπόψη ότι τη 2η ημέρα της εκχύλισης έχει εκχυλιστεί το 48.5% των ανθοκυανών, το 47.8% των κινναμικών οξέων, το 58.5% των φλαβονολών και μόνο το 20% των φλαβαν-3-ολών στο Αγιωργίτικο. Επί πλέον στο Merlot, την 1η ημέρα της εκχύλισης που έχουν παρουσιάσει μέγιστο όλες οι άλλες ομάδες, οι φλαβαν-3-όλες έχουν εκχυλιστεί μόνο κατά 23%. 169

171 1.3.3 Εφαρμογή κρυοεκχύλισης και πηκτινολυτικών ενζύμων Η χρήση πηκτινολυτικών ενζύμων δεν φάνηκε να επηρεάζει το ρυθμό εκχύλισης των φαινολικών συστατικών. Συγκεκριμένα κατά την οινοποίηση του Merlot Β που έγινε παρουσία πηκτινολυτικών ενζύμων, η υψηλότερη περιεκτικότητα σε ελεύθερες ανθοκυάνες παρατηρήθηκε και εδώ την πρώτη ημέρα της εκχύλισης, ενώ στη συνέχεια παρατηρήθηκε μείωση (Εικ. 44). Από την άλλη η υψηλότερη περιεκτικότητα φλαβονολών, όπως και ολικών φαινολών παρατηρήθηκε τη 2η ημέρα της οινοποίησης. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η εκχύλιση των ανθοκυανών είναι ταχύτατη στην ποικιλία Merlot, ανεξάρτητα από τη χρήση ή όχι πηκτινολυτικών ενζύμων. Επί πλέον η εκχύλιση των λοιπών φαινολικών συστατικών προχωρά επίσης γρηγορότερα από ότι στις άλλες ποικιλίες, και πιθανώς ενισχύεται από τα πηκτινολυτικά ένζυμα. Παρ όλα αυτά δεν ήταν δυνατή η σύγκριση οινοποιήσεων με και χωρίς ένζυμα στις ίδιες ποικιλίες και με τις ίδιες συνθήκες ώστε να εξαχθούν σαφή συμπεράσματα. Στην Εικ. 42 παρουσιάζεται η εκχύλιση των επιμέρους κύριων ομαδών των φαινολικών συστατικών καθώς και το ολικό φαινολικό φορτίο κατά την οινοποίηση της ποικιλίας Cabernet Sauvignon. Στον οινοποιητή υπήρχε ελεγχόμενη μεταβλητή θερμοκρασία. Η προζυμωτική κρυοεκχύλιση ολοκληρώθηκε την 5η μέρα με σταδιακή αύξηση της θερμοκρασίας από τους 12 στους 20 C, ενώ το γλεύκος ήταν σε επαφή με τα στέμφυλα μέχρι και την 20η μέρα της οινοποίησης. Η μέγιστη συγκέντρωση ολικών φαινολικών προσδιορίστηκε σε 3581 ± 147 mg/l για το Cabernet και σημειώθηκε την 20η και τελευταία ημέρα της διεργασίας. Όπως έχει αναφερθεί, οι ανθοκυάνες είναι τα συστατικά που εκχυλίζονται άμεσα, κατά τις πρώτες κιόλας ώρες της οινοποίησης μετά την έκθλιψη. Αυτό το γεγονός επιβεβαιώνεται και στην Εικ. 42 όπου φαίνεται ότι στην αρχή της κρυοεκχύλισης έχει ήδη εκχυλιστεί στο γλεύκος μια ποσότητα ανθοκυανών που αντιστοιχεί περίπου στο 29% των ολικών ανθοκυανών στο τέλος της οινοποίησης. Η μέγιστη συγκέντρωση ανθοκυανών παρατηρείται την 20η μέρα κάτι που δείχνει ότι η διεργασία της κρυοκχύλισης σε συνδυασμό με τη χρήση πηκτινολητικών ενζύμων επιτρέπουν την εκχύλιση των ανθοκυανών μέχρι την ολοκλήρωση της οινοποίησης. Την 1η μέρα της κρυοεκχύλισης το γλεύκος περιέχει ήδη το 40% της τελικής συγκέντρωσης τρυγικών εστέρων. Η μέγιστη συγκέντρωση των τρυγικών εστέρων 170

172 παρατηρήθηκε όπως και στις ανθοκυάνες την 20η μέρα της εκχύλισης και ήταν 270 ± 1 mg/l καφεϊκού οξέος. Οι φλαβονόλες βρίσκονται σε πολύ μικρές περιεκτικότητες σε σχέση με τις άλλες φαινολικές ομάδες στο κρασί. Και πάλι η μέγιστη συγκέντρωση παρατηρήθηκε την 20η μέρα της εκχύλισης και ήταν 200 ± 5 mg/l ισοδύναμα κερκετίνης. Εικ. 42: Η μεταβολή του ολικού φαινολικού φορτίου TP (ισοδύναμα γαλλικού οξέoς), ανθοκυανών TAntho (ισοδύναμα μαλβιδίνης-3-γλυκοζίτη), φλαβονολών TFlav (ισοδύναμα κερκετίνης), φλαβαν-3-ολών TCat (ισοδύναμα κατεχίνης) και τρυγικών εστέρων TCAcids (ισοδύναμα καφεϊκού οξέος), κατά την εκχύλιση του Cabernet Sauvignon Τέλος, ιδιαίτερο ενδιαφέρον εμφάνισε και αυτή τη φορά η εκχύλιση των φλαβαν-3- ολών. Παρατηρείται ότι στο τέλος της κρυοεκχύλισης (5η μέρα) το ποσοστό των προκυανιδινών που είχε εκχυλιστεί ήταν μόνο 30% αφού δεν είχε ξεκινήσει η αλκοολική ζύμωση, ενώ η μέγιστη συγκέντρωση προσδιορίστηκε την 20η ημέρα (792 ± 13 mg/l ισοδύναμα κατεχίνης), στο πέρας της ζύμωσης, μαζί με τις υπόλοιπες φαινολικές ομάδες. Όπως αναφέρθηκε και για τις άλλες ποικιλίες, το χαμηλό ποσοστό εκχύλισης μέχρι το πέρας της κρυοεκχύλισης μπορεί να εξηγηθεί από το 171

173 γεγονός ότι οι προκυανιδίνες βρίσκονται κυρίως στα γίγαρτα και όχι στους φλοιούς ή τη σάρκα των ραγών, και ως εκ τούτου η εκχύλισή τους είναι πιο δύσκολη από των άλλων φαινολικών συστατικών του σταφυλιού. Παράλληλα, έχουν χαμηλή διαλυτότητα στο νερό, επομένως η αύξηση της περιεκτικότητας της αιθανόλης κατά την εξέλιξη της αλκοολικής ζύμωσης συντελεί στην καλύτερη εκχύλιση των προκυανιδινών Σύγκριση των ερυθρών οινοποιήσεων Η μέγιστη συγκέντρωση ολικών φαινολικών προσδιορίστηκε πολύ διαφορετική στις πέντε ποικιλίες (1446 ± 97 ppm για το Merlot Α, 2143 ± 45 mg/l για το Merlot B, 1954 ± 21 mg/l για το Syrah, 2654 ± 6 ppm για το Αγιωργίτικο και 3581 ± 147 ppm για το Cabernet) και προφανώς δεν οφείλεται μόνο στο χρόνο παραμονής των στεμφύλων στο γλεύκος, καθώς ήταν παρόμοιος για τις τέσσερεις από τις πέντε οινοποιήσεις που εξετάσθηκαν. Στην οινοποίηση του Merlot η μέγιστη συγκέντρωση των ανθοκυανών επιτυγχάνεται από την πρώτη κιόλας ημέρα της εκχύλισης, ανεξάρτητα από τη χρήση πηκτινολυτικών ενζύμων. Αντίθετα, στις ποικιλίες Αγιωργίτικο και Syrah, όπου χρησιμοποιήθηκαν πηκτινολητικά ένζυμα και Cabernet, όπου χρησιμοποιήθηκαν πηκτινολητικά ένζυμα ταυτόχρονα με κρυοεκχύλιση, παρατηρείται αύξηση της συγκέντρωσης των ανθοκυανών καθόλη τη διάρκεια της επαφής των στεμφύλων με το γλεύκος, Επίπλέον, η χρονική αυτή διαφορά του μέγιστου των ανθοκυανών που παρουσιάζει η ποικιλία, Merlot αποδίδεται, όπως έχει αναφερθεί στη μορφολογία κυρίως του καρπού της, και συγκεκριμένα στη μικρής διαμέτρου ρόγα, με λεπτό φλοιό (Ortega Regules et al., 2008). Αξιοσημείωτο δε είναι, ότι παρόλο που φαίνεται ότι τόσο η κρυοεκχύλιση όσο και τα πηκτινολητικά ένζυμα ενισχύουν την ποσοτική εκχύλιση όλων των πολυφαινολών του σταφυλιού κατά την οινοποίηση, το μεγαλύτερο μέρος των ανθοκυανών εκχυλίζεται και πάλι τις πρώτες ημέρες της οινοποίησης. Έτσι, στο Αγιωργίτικο τη 2η ημέρα έχει εκχυλιστεί το 51% των ανθοκυανών, ενώ αντίστοιχα στο Cabernet με το πέρας της κρυοεκχύλισης (και απουσία αιθανόλης) την 5η ημέρα έχει εκχυλιστεί το 47%. Αντίστοιχο προφίλ εκχύλισης με τις ανθοκυάνες, εμφάνισαν τα κινναμικά οξέα και οι τρυγικοί εστέρες τους, ενώ και η συγκριτική περιεκτικότητά τους στα τρία κρασιά είναι παρόμοια με αυτή των ανθοκυανών. 172

174 Οι φλαβονόλες βρίσκονται σε πολύ μικρές περιεκτικότητες σε σχέση με τις άλλες φαινολικές ομάδες στο κρασί και στο μεγαλύτερο ποσοστό τους σε μορφή γλυκοζιτών ή γλυκουρονιδίων. Και πάλι οι μέγιστες συγκεντρώσεις παρατηρήθηκαν τις ίδιες ημέρες με τις ανθοκυάνες ή λίγο βραδύτερα, ενώ η συγκριτική περιεκτικότητά τους ήταν παρόμοια με αυτή των ανθοκυανών. Τέλος, ιδιαίτερο ενδιαφέρον εμφάνισε η εκχύλιση των φλαβαν-3-ολών που περιλαμβάνουν τις προκυανιδίνες (πρόδρομους των συμπυκνωμένων ταννινών των παλαιωμένων οίνων). Οι προκυανιδίνες βρίσκονται κυρίως στα γίγαρτα και όχι στους φλοιούς ή τη σάρκα των ραγών, και ως εκ τούτου η εκχύλισή τους είναι πιο δύσκολη από των άλλων φαινολικών συστατικών του σταφυλιού. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι η αύξηση της περιεκτικότητας της αιθανόλης κατά την εξέλιξη της αλκοολικής ζύμωσης συντελεί στην καλύτερη εκχύλιση των προκυανιδινών (Cheynier V., 2006). Κατά την οινοποίηση του Merlot, απουσία πηκτινολητικών ενζύμων και κρυεκχύλισης, η μέγιστη περιεκτικότητα των φλαβαν-3-ολών, προσδιορίστηκε την 4η ημέρα της εκχύλισης (309 ± 25 ppm), ενώ την 1η ημέρα που προσδιορίστηκε η μέγιστη περιεκτικότητα για όλες τις άλλες ομάδες, το ποσοστό των προκυανιδινών που είχε εκχυλιστεί ήταν μόλις 29%, γεγονός που επιβεβαιώνει τη χαμηλή διαλυτότητά τους στο νερό. Kατά την οινοποίηση του Αγιωργίτικου, η μέγιστη περιεκτικότητα προσδιορίστηκε την 6η ημέρα (410 ± 3 ppm), δηλαδή στο πέρας της εκχύλισης. Στην οινοποίηση του Cabernet, στο τέλος της κρυοεκχύλισης το ποσοστό των προκυανιδινών που είχε εκχυλιστεί ήταν μόνο 30% αφού δεν είχε ξεκινήσει η αλκοολική ζύμωση, ενώ η μέγιστη συγκέντρωση προσδιορίστηκε την 20η ημέρα (792 ± 13 ppm), στο πέρας της ζύμωσης, μαζί με τις υπόλοιπες φαινολικές ομάδες. Το υψηλό ανθοκυανικό φορτίο στα κόκκινα κρασιά είναι θεμιτό προκειμένου να έχουν έντονο χρώμα. Επιπλέον, οι φλαβονόλες και τα φαινολικά οξέα είναι σημαντικά συστατικά λόγω των αντιοξειδωτικών τους ιδιοτήτων, τόσο γιατί συμβάλουν στην οξειδωτική σταθεροποίηση των οίνων, όσο και για τη διατροφική τους αξία. Από την άλλη μεριά το περιεχόμενο σε φλαβαν-3-όλες εξαρτάται από το είδος του κρασιού που οινοποιείται. Χαμηλή περιεκτικότητα σε φλαβαν-3-όλες είναι ζητούμενη σε κρασιά που προορίζονται για άμεση κατανάλωση, δίχως παλαίωση, έτσι ώστε να αποφευχθεί η στυφότητα που προσδίδουν στη γεύση, ενώ για τα κρασιά παλαίωσης το υψηλό προκυανιδικό περιεχόμενο κρίνεται απαραίτητο. 173

175 Σύμφωνα με τα παραπάνω, η διάρκεια της εκχύλισης πρέπει να αριστοποιείται ανάλογα με το είδος της οινοποίησης αλλά και την ποικιλία του σταφυλιού, έτσι ώστε να ανακτηθεί το μέγιστο δυνατό ανθοκυανικό φορτίο και το κατάλληλο φορτίο σε φλαβαν-3-όλες. Στις περιπτώσεις ερυθρής οινοποίησης όπου το κρασί δεν προορίζεται για παλαίωση, η κρυοεκχύλιση φαίνεται να είναι η πιο κατάλληλη τεχνική οινοποίησης, μιας και με αυτόν τον τρόπο το φορτίο των προκυανιδινών διατηρείται σε χαμηλές συγκεντρώσεις, ενώ έχουμε πολύ υψηλή συγκέντρωση ανθοκυανών. Για την παραγωγή κόκκινων κρασιών κατάλληλων για παλαίωση η χρήση πηκτινολητικών ενζύμων σε συνδυασμό αρχική κρυοεκχύλιση, ενισχύουν την εκχύλιση προκυανιδινών και ανθοκυανών, εφόσον αναστέλεται πρόσκαιρα η αλκοολική ζύμωση επιτρέποντας τη μακρά παραμονή των στεμφύλων σε επαφή με το γλεύκος Επίδραση προζυμωτικής κρυοεκχύλισης στην ανάκτηση φαινολικών συστατικών σε λευκό γλεύκος (Μοσχοφίλερο) Για να εξαχθούν συμπεράσματα για τη συμβολή της κρυοεκχύλισης πριν τη ζύμωση στο φαινολικό φορτίο του τελικού κρασιού εξετάσθηκε μεταβολή των ολικών φαινολικών, αλλά και των επιμέρους ομάδων, των τρυγικών εστέρων των κινναμικών οξέων, των φλαβονολών και των φλαβαν-3-ολών, κατά την οινοποίηση της λευκής ποικιλίας Μοσχοφίλερου με και χωρίς εφαρμογή κρυοεκχύλισης. Η κρυοεκχύλιση στη λευκή ποικιλία Μοσχοφίλερο διήρκησε μόνο 6 ώρες, σε θερμοκρασία 10 C, καθώς το γλεύκος είχε ξεκινήσει να αποκτά μία ερυθρή χροιά, λόγω της εκχύλισης των ανθοκυανών από το φλοιό της ρόγας του Μοσχοφίλερου. Στην Εικ. 43 παρουσιάζεται η εκχύλιση των επιμέρους φαινολικών ομάδων (τρυγικοί εστέρες των κινναμικών οξέων, φλαβονόλες και φλαβαν-3-όλες) καθώς και των ολικών φαινολικών κατά την προζυμωτική κρυοεκχύλιση της ποικιλίας του Μοσχοφίλερου. 174

176 Εικ. 43: Η μεταβολή του ολικού φαινολικού φορτίου TP (ισοδύναμα γαλλικού οξέoς), φλαβονολών TFlav (ισοδύναμα κερκετίνης), φλαβαν-3-ολών TCat (ισοδύναμα κατεχίνης) και τρυγικών εστέρων TCAcids (ισοδύναμα καφεϊκού οξέος), κατά την εκχύλιση του Μοσχοφίλερου Όπως παρατηρείται υπάρχει αύξηση σε όλες τις επιμέρους φαινολικές ομάδες, καθ όλη τη διάρκεια της προζυμωτικής κρυοεκχύλισης. Αυξάνονται τα κινναμικά οξέα και οι φλαβονόλες αφού είναι υδατοδιαλυτά συστατικά και βρίσκονται στους φλοιούς των ραγών. Οι φλαβαν-3-όλες που εκχυλίστηκαν θεωρείται ότι είναι προκυανιδίνες των φλοιών, οι οποίες παραλαμβάνονται σχετικά γρήγορα, λόγω της θέσης τους και λόγω της υψηλότερης διαλυτότητας στο νερό, σε αντίθεση με τις προκυανιδίνες των γιγάρτων, οι οποίες διαχέονται με μικρότερο ρυθμό, ανάλογα με το στάδιο ωριμότητας των γιγάρτων και παρουσιάζουν μία υστέρηση, καθώς η εκχύλισή τους ξεκινά όταν αυξάνεται η περιεκτικότητα της αιθανόλης στο ζυμούμενο γλεύκος (Cheynier 2006). Το ολικό φαινολικό φορτίο, μετά τις 6 ώρες προζυμωτικής εκχύλισης στους 10 C, προέκυψε ίσο με ± 0.6 mg/l, τα κινναμικά οξέα και οι τρυγικοί τους εστέρες 92.8 ± 5.7 mg/l, οι φλαβονόλες 44.1 ± 2.4 mg/l, ενώ οι φλαβαν-3-όλες διατηρήθηκαν σε χαμηλά επίπεδα της τάξης των 13 mg/l, αφού εκχυλίστηκαν μόνο εκείνες των φλοιών, που βρίσκονται σε σημαντικά χαμηλότερη συγκέντρωση από 175

177 αυτές των γιγάρτων. Επομένως, κατά τη διάρκεια της προζυμωτικής εκχύλισης, υπήρξε αύξηση των τρυγικών εστέρων των κινναμικών οξέων κατά 56%, των φλαβονολών κατά 61% και των φλαβαν-3-ολών κατά 87%. Η αύξηση των ολικών φαινολικών ανήλθε στο 34%, η οποία ίσως έχει απόκλιση από την πραγματική τιμή, καθώς η μέθοδος μέτρησής τους έχει παρεμβολές από τα ανάγοντα σάκχαρα, τα οποία βρίσκονται σε μεγάλη συγκέντρωση. Οι αυξήσεις αυτές των επιμέρους φαινολικών ομάδων ενδέχεται να είναι ακόμη μεγαλύτερες αφού το δείγμα στο χρόνο μηδέν λήφθηκε μετά την αποβοστρύχωση και το σπάσιμο όλων των σταφυλιών (περίπου μία ώρα μετά την έναρξη της διεργασίας), που ήδη είχε αρχίσει η εκχύλιση των φαινολικών συστατικών Σύγκριση της οινοποίησης Μοσχοφίλερου με και χωρίς προζυμωτική κρυοεκχύλιση Για τη διεξαγωγή συμπερασμάτων σχετικά με την επίδραση της κρυοεκχύλισης στο φαινολικό περιχόμενο του λευκού κρασιού συγκρίθηκαν τα αποτελέσματα της κλασικής λευκής οινοποίησης, με την οινοποίηση μετά από προζυμωτική κρυοεκχύλιση 6 ωρών, στους 10 C. Οι λοιπές συνθήκες οινοποίησης, καθώς και η πρώτη ύλη, ήταν οι ίδιες. Η αλκοολική ζύμωση ολοκληρώθηκε στο Μοσχοφίλερο χωρίς προζυμωτική εκχύλιση τη 14η και σε αυτό με προζυμωτική εκχύλιση τη 16η ημέρα. Οι δειγματοληψίες συνεχίστηκαν μέχρι τη 18-22η ημέρα, ενώ το φρέσκο κρασί διατηρείτο σε δεξαμενή. Κατά τη διάρκεια της λευκής οινοποίησης χωρίς προζυμωτική εκχύλιση, παρατηρήθηκε ότι η συγκέντρωση των ολικών φαινολικών, καθώς και των επιμέρους φαινολικών ομάδων, παρέμεινε σταθερή καθ όλη τη διάρκεια της ζύμωσης. Το γεγονός αυτό είναι αναμενόμενο αφού δεν υπήρξε επαφή των στεμφύλων με το γλεύκος, και ως εκ τούτου δεν πραγματοποιήθηκε εκχύλιση των φαινολικών συστατικών από τους φλοιούς των ραγών στο γλεύκος. Αντίθετα, στην οινοποίηση με προζυμωτική εκχύλιση, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση της συγκέντρωσης των φαινολικών συστατικών κατά την εκχύλιση, όπως ήδη αναφέρθηκε, και έχει παρατηρηθεί και από άλλους ερευνητές (Hernanz et al., 2007, Gómez-Míguez et al., 2007). Η συγκέντρωση όμως των φαινολικών ενώσεων 176

178 μειώθηκε κατά τη διάρκεια της αλκοολικής ζύμωσης. Συγκεκριμένα, χάθηκε το 7% των ολικών φαινολικών, το 23% των κινναμικών οξέων, το 45% των φλαβονολών και το 18% των φλαβαν-3-ολών, που είχαν εκχυλιστεί. Η μείωση παρατηρείται κυρίως στις φλαβονόλες. Παρόμοιες αναφορές έχουν γίνει στο παρελθόν, όπου αναφέρεται η μείωση του φαινολικού φορτίου κατά τη διάρκεια της μετέπειτα οινοποίησης, η οποία μπορεί να φτάσει και το 26% σε κρασιά μεγάλης διάρκειας εκχύλισης (πάνω από 12 ώρες) και παρατηρείται κυρίως στις φλαβονοειδείς φαινόλες (Gómez-Míguez et al., 2007). Στον Πίν. 17 παρουσιάζεται η συγκέντρωση των φαινολικών συστατικών στο φρέσκο μοσχοφίλερο που οινοποιήθηκε με και χωρίς προζυμωτική κρυοεκχύλιση. Όπως φαίνεται η προζυμωτική κρυοεκχύλιση στη λευκή οινοποίηση προσφέρει ένα αυξημένο φαινολικό φορτίο στο κρασί. Έτσι, το φρέσκο κρασί που προέκυψε μετά τη λευκή οινοποίηση με προζυμωτική κρυοεκχύλιση είχε κατά 41% υψηλότερο φαινολικό φορτίο. Όσον αφορά τις επιμέρους φαινολικές ομάδες, οι τρυγικοί εστέρες των κινναμικών οξέων αυξήθηκαν κατά 42% ενώ οι φλαβονόλες και οι φλαβαν-3- όλες υπερδιπλασιάστηκαν αλλά και πάλι παρέμειναν σε πολύ χαμηλά επίπεδα. Τέλος, η συγκέντρωση των προκυανιδινών στις οινοποιήσεις του Μοσχοφίλερου ήταν ιδιαίτερα χαμηλή ακόμα και στην οινοποίηση με κρυοεκχύλιση (15 ± 2 ppm). Συμπερασματικά, στη λευκή οινοποίηση η κρυοεκχύλιση συμβάλει στην αύξηση της συγκέντρωσης των πολυφαινολών και στην αποφυγή της οινοποίησης «αδύναμων» οργανοληπτικά κρασιών (δίχως σώμα). Πίν. 17: Το φαινολικό φορτίο των φρέσκων κρασιών της ποικιλίας Μοσχοφίλερο, κατά την οινοποίηση με και χωρίς προζυμωτική εκχύλιση. Μοσχοφίλερο Κλασική οινοποίηση Μοσχοφίλερο Προζυμωτική εκχύλιση Ολικά Φαινολικά [mg/l γαλλικού οξέος] ± ± 13.1 Ολικά κινναμικά [mg/l καφεϊκού οξέος] 50.3 ± ± 1.3 Φλαβονόλες [mg/l κερκετίνης] 10.3 ± ± 1.8 Φλαβαν-3-όλες [mg/l κατεχίνης] 6.2 ± ±

179 1.4 Μεταβολή της συγκέντρωσης μετάλλων και επίδραση στη συγκέντρωση των πολυφαινολών κατά την οινοποίηση των ερυθρών ποικιλιών (Merlot και Syrah) Οι φυσικές πολυφαινόλες εμφανίζουν πολύ μεγάλη ικανότητα δημιουργίας συμπλόκων με μέταλλα. Για το λόγο αυτό στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η εξέλιξη των πολυφαινολών (συγκεκριμένα ανθοκυανών και φλαβονολών) και των μετάλλων σε κρασιά των ποικιλιών Merlot και Syrah που οινοποιήθηκαν στην Αττική. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι συγκεντρώσεις των Ni, Pb, Cr, Cd, Ba, Zn και Al παρέμειναν πρακτικά σταθερές. Αντίθετα, η συγκέντρωση των Fe, Cu και Mn (σε μικρότερο βαθμό) έδειξε σημαντική μεταβολή και παρουσιάζεται στην Εικ. 44, σε αντιπαραβολή με τη μεταβολή των φαινολικών συστατικών στις δύο ποικιλίες. Η μεγάλη αρχική συγκέντρωση του Cu και στις δύο ποικιλίες, πιθανότατα οφείλεται στη χρήση χαλκούχων σκευασμάτων για την προστασία της καλλιέργειας από μύκητες. Παρόλα αυτά, στα πρώτα στάδια της οινοποίησης σημειώθηκε μια εντυπωσιακή μείωση της συγκέντρωσης του Cu και στις δύο ποικιλίες, η οποία στη συνέχεια σταθεροποιήθηκε. Συγκρίνοντας τη συγκέντρωση του Cu με τις συγκεντρώσεις των ελευθέρων ανθοκυανών, ολικών φλαβονολών και ολικών φαινολικών, παρατηρείται η αντίστροφη τάση της εξέλιξής τους. Με άλλα λόγια η μείωση του Cu συμβαίνει ταυτόχρονα με την εκχύλιση των φαινολικών συστατικών. Αυτό το φαινόμενο έχει παρατηρηθεί και από τους Esparza et al. (2004). Τα φλαβονοειδή μπορούν να δημιουργήσουν χηλικά σύμπλοκα με μέταλλα όπως Cu και Fe. Αυτή η ικανότητα των φλαβονοειδών σχετίζεται με την παρουσία των όρθο υδροξυλίων στο Β φαινολικό δακτύλιο. Συνεπώς η πετουνιδίνη και η κερκετίνη δύνανται να δημιουργήσουν σύμπλοκα, ενώ η μεθόξυ ομάδα της μαλβιδίνης μειώνει την ικανότητά της να συμποκοποιηθεί με ιόντα μετάλλων (Nicolini et al., 2004). Επιπλέον οι Bai et al. (2004), Esparza et al. (2005) αναφέρουν τη δημιουργία συμπλόκων μέσω αντιδράσεων φλαβονοειδών και μετάλλων σε διάφορες στοιχειομετρικές αναλογίες. 178

180 Εικ. 44: Η μεταβολή των συγκεντρώσεων ελεύθερων ανθοκυανών (ΜΑ, ισοδύναμα μαλβιδίνης-3-γλυκοζίτη), ολικών φλαβονολών (ΤF, ισοδύναμα κερκετίνης), ολικών φαινολικών (TP, ισοδύναμα γαλλικού οξέος) και ιχνοστοιχίων, κατά την οινοποίηση Merlot και Syrah Στις δύο ποικιλίες που μελετήθηκαν (Merlot, Syrah) υπάρχουν άφθονα μόρια που εμφανίζουν όρθο υδροξύλια στον Β δακτύλιο (κερκετίνη, μυρισετίνη, πετουνιδίνη, δελφινιδίνη κ.α.), γλυκοζιλιωμένα ή μη, όπως φαίνεται και στους Πίν. 11 & Πίν. 13. Συνεπώς συμπεραίνουμε ότι η εκχύλιση των συγκεκριμένων φαινολικών συστατικών, οδηγεί σε αντιδράσεις συμπλοκοποίησης και καταβύθιση του Cu. Ανάλογη συμπεριφορά θα αναμενόταν και για τα Fe και Μn, κάτι τέτοιο όμως δεν παρατηρήθηκε, αντίστροφα η συγκέντρωση των Fe και Μn ελαφρώς αυξήθηκε κατά τη διάρκεια της ζύμωσης. Η αύξηση αυτή αποδίδεται στην παρουσία οξειδίων αυτών των μετάλλων στα στελέχη της ζύμωσης και στο σκεύασμα που περιείχε τα πηκτινολητικά ένζυμα, στη χρήση ανοξείδωτων δεξαμενών ενώ αντίστοιχες παρατηρήσεις κάνουν και οι Bai et al., 2004 & Castiñeira et al.,

181 Το περιεχόμενο σε ιχνοστοιχεία για τα φρέσκα κρασιά των δύο ποικιλιών φαίνεται στον Πίν. 18. Στον συγκεκριμένο πίνακα παρουσιάζονται και τα μέγιστα επιτρεπόμενα όρια σύμφωνα με τον OIV (2011), αλλά και οι μέσες απαντώμενες συγκεντρώσεις σε ελληνικά κρασιά. Και στα δύο κρασιά όλες οι συγκεντρώσεις είναι εντός των προβλεπόμενων ορίων. Ο Cu μειώθηκε από 1394 σε 413 μg/l και από 1249 σε 340 μg/l, σε Merlot και Syrah αντίστοιχα. Ο Fe αν και αυξήθηκε κατά τη διάρκεια της οινοποίησης για τους λόγους που προαναφέρθηκαν, ήταν τελικά και πάλι εντός των ορίων. Οι παρατηρούμενες διαφορές στις περιεκτικότητες των ιχνοστοιχείων μεταξύ των δύο ποικιλιών, αποδίδονται στην ποικιλία, την τεχνική της καλλιέργειας, το έδαφος και τα λιπάσματα (Soto Vázquez et al., 2013), ενώ όλες οι τιμές που μετρήθηκαν είναι κοντά στις αντίστοιχες μέσες τιμές που αναφέρονται στη βιβλιογραφία (Galani-Nikolakaki et al., 2002, Tariba, 2011). Πίν. 18: Ποσοτικοποίηση ιχνοστοιχείων στα φρέσκα κρασιά (μg/l) Ιχνοστοιχεία Syrah Merlot Μέγιστα επιτρεπόμενα όρια Όριο ανίχνευσης Μέση συγκέντρωση ελληνικών κρασιών Fe 795 ± ± α Cu 340 ± ± α Mn 649 ± ± 8-10 α ίχνη Zn 652 ± ± α Ni 5 ± ± β ίχνη-2300 Pb 25 ± ± β Cr 20 ± ± β ίχνη-1600 Cd 7 ± ± β ίχνη-6 Ba 278 ± ± β Al 175 ± ± β α ποσοτικοποίηση με ICP-OES β ποσοτικοποίηση με ICP-MS 180

182 2 Μεταβολή φαινολικών συστατικών και χρωματικών παραμέτρων κατά την αποθήκευση του κρασιού Στη παρόν κεφάλαιο παρουσιάζονται οι μεταβολές των ολικών φαινολικών, των επιμέρους υποομάδων τους (φαινολικά οξέα, φλαβονόλες, φλαβαν-3-όλες, ανθοκυάνες) καθώς και οι χρωματικές παράμετροι για κόκκινα κρασιά των ποικιλιών Αγιωργίτικο, Merlot, Syrah καθώς και για ένα λευκό κρασί της ποικιλίας Ασύρτικο. Η αποθήκευση των φρέσκων κρασιών έγινε σε πολυστρωματικές συσκευασίες και σε τροποποιημένη ατμόσφαιρα N2:CO2 (1:1). Οι συσκευασίες με τα δείγματα των κρασιών αποθηκεύτηκαν σε σκιερό μέρος και σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. 2.1 Εξέλιξη του ολικού φαινολικού φορτίου κατά την αποθήκευση Τα ολικά φαινολικά κατά την έναρξη της αποθήκευσης των φρέσκων οίνων, μετρήθηκαν με τη μέθοδο Folin ίσα με 2592 mg/l στο Αγιωργίτικο, 2143 mg/l στο Merlot και 1954 mg/l στο Syrah, ενώ στη λευκή ποικιλία του Ασύρτικου η αντίστοιχη συγκέντρωση ήταν 327 mg/l ισοδυνάμων γαλλικού οξέος. Όπως φαίνεται στις Εικ. 45 & Εικ. 46, η συγκέντρωση των ολικών φαινολικών παρέμεινε πρακτικά σταθερή (Merlot και Syrah), ή εμφάνισε μία μικρή μείωση της τάξης του 20% (Αγιωργίτικο, Ασύρτικο) κατά το χρονικό διάστημα του 1 έτους της αποθήκευσης. Αυτό αποδίδεται στο γεγονός ότι οι αντιδράσεις μεταξύ φαινολικών συστατικών του κρασιού είναι κυρίως αντιδράσεις πολυμερισμού (ανθοκυάνες-προκυανιδίνες), παρά αντιδράσεις οξείδωσης ή υποβάθμισης και συνεπώς η επίδραση στον αριθμό των υδροξυλομάδων που μετρούνται με τη μέθοδο Folin-Ciocalteau είναι ασήμαντη ή μικρή. 181

183 Εικ. 45: Μεταβολή του ολικού φαινολικού φορτίου (ισοδύναμα γαλλικού οξέος) των ποικιλιών Αγιωργίτικο, Merlot και Syrah κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης Εικ. 46: Μεταβολή του ολικού φαινολικού φορτίου (ισοδύναμα γαλλικού οξέος) της λευκής ποικιλίας Ασύρτικο κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης Επιπλέον, όπως ήταν αναμενόμενο οι κόκκινες ποικιλίες εμφανίζουν πολύ μεγαλύτερες συγκεντρώσεις από το Ασύρτικο, σχεδόν μια τάξη μεγέθους μεγαλύτερες, γεγονός που οφείλεται στην εκχύλιση των φαινολικών στο γλεύκος κατά τη περίοδο παραμονής του τελευταίου με τα στέμφυλα στον οινοποιητή. 182

184 2.2 Ανθοκυάνες Σε όλες τις περιπτώσεις, κατά την αποθήκευση των φρέσκων κρασιών, παρατηρήθηκε η μείωση του φορτίου των ανθοκυανών, όπως αυτό μετρήθηκε ως το άθροισμα των μονομερών γλυκοζιτών με χρήση HPLC. Στις Εικ. 47 & Εικ. 48 παρατηρείται ο υποδεκαπλασιασμός της συγκέντρωσης των ελευθέρων ανθοκυανών για τις ποικιλίες Merlot και Syrah σε χρονικό διάστημα αποθήκευσης λιγότερο από ένα έτος, ενώ στο ίδιο χρονικό διάστημα τα ολικά φαινολικά παρέμειναν πρακτικώς σταθερά. Οι μεταβολές σε χρώμα και γεύση του κρασιού κατά την αποθήκευση, έχουν αποδοθεί εν μέρει εδώ και χρόνια στη μετατροπή των ελεύθερων ανθοκυανών σε πολυμερή έγχρωμα σύμπλοκα μέσω αντιδράσεων προσθήκης αυτών και των φλαβανολών, όπως είναι τα ολιγομερή της κατεχίνης. Οι παραπάνω αντιδράσεις είναι ο κύριος λόγος μείωσης των ελεύθερων ανθοκυανών του κρασιού (Cheynier, 2006, Figueiredo-González et al., 2013, Figueiredo-González et al., 2014). Εικ. 47: Η μεταβολή ελεύθερων ανθοκυανών (mg/l ισοδυνάμων μαλβιδίνης-3-γλυκοζίτη) και ολικών φαινολικών (mg/l ισοδυνάμων γαλλικού οξέος) κατά την αποθήκευση κρασιού της ποικιλίας Merlot για χρονικό διάστημα 11 μηνών 183

185 Εικ. 48: Η μεταβολή ελεύθερων ανθοκυανών (mg/l ισοδυνάμων μαλβιδίνης-3-γλυκοζίτη) και ολικών φαινολικών (mg/l ισοδυνάμων γαλλικού οξέος) κατά την αποθήκευση κρασιού της ποικιλίας Syrah για χρονικό διάστημα 11 μηνών Εικ. 49: Υπολογισμός των συντελεστών του ρυθμού μείωσης (k) των ελεύθερων ανθοκυανών, για κινητική αντίδρασης πρώτης τάξης, με ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης. Η προσαρμογή γίνεται για τις κύριες ανθοκυάνες του Αγιωργίτικου Σε όλες τις ποικιλίες που μελετήθηκαν, η μείωση των ελεύθερων ανθοκυανών ακολούθησε ικανοποιητικά κινητική αντίδρασης πρώτης τάξης. Στον Πίν. 19 παρατίθενται οι αντίστοιχοι συντελεστές του ρυθμού μείωσης (k) έπειτα από ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης (Εικ. 49), για τους 3 γλυκοζίτες της μαλβιδίνης 184

186 (Mv-3-glc, Mv-3-acglc, Mv-3-coumglc) που ήταν και οι ανθοκυάνες με τις υψηλότερες αρχικές συγκεντρώσεις σε όλες τις περιπτώσεις. Πίν. 19: Οι σταθερές μείωσης των κυριώτερων ανθοκυανών (k) κατά την αποθήκευση των ποικιλιών Merlot, Syrah, Μαυροκουντούρα και Αγιωργίτικο Mv-3-glc Mv-3-acglc Mv-3-coumglc k±sd R 2 k±sd R 2 k±sd R 2 [mon -1 ] [mon -1 ] [mon -1 ] Merlot a ± a ± a ± Syrah a ± a ± a ± Μαυροκουντούρα a ± a ± a ± Αγιωργίτικο a ± b ± b ± Διαφορετικά γράμματα στην ίδια στήλη δείχνουν σημαντική διαφορά μεταξύ των τιμών (p<0.05) Εύκολα γίνεται αντιληπτή η ομοιότητα των ρυθμών μείωσης παρά τις διαφορετικές ποικιλίες που χρησιμοποιήθηκαν. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων με one-way ANOVA (p<0.05) και τη δοκιμή Dunkan έδειξε σημαντικές διαφορές μόνο για τους ρυθμούς μείωσης της ποικιλίας του Αγιωργίτικου και μόνο για τις ακυλιωμένες μορφές τις μαλβιδίνης. Άρα λοιπόν φαίνεται ότι ο ρυθμός μείωσης των ανθοκυανών κατά την αποθήκευση των δειγμάτων ήταν ανεξάρτητος της ποικιλίας του σταφυλιού που οινοποιήθηκε. 2.3 Φλαβονόλες Οι μεταβολές της συγκέντρωσης των ολικών φλαβονολών συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης για τις ποικιλίες των Merlot, Syrah, Αγιωργίτικο και Ασύρτικο εμφανίζονται στην Εικ. 50. Οι συγκεντρώσεις δίνονται σε ισοδύναμα mg/l κερκετίνης. Οι συγκεντρώσεις των ολικών φλαβονολών που διαχωρίστηκαν και ποσοτικοποίηθηκαν με τη χρωματογραφική μέθοδο στο Ασύρτικο δεν ξεπέρασαν τα 10 mg/l ισοδυνάμων κερκετίνης ενώ οι αντίστοιχες συγκεντρώσεις στο Αγιωργίτικο δεν ξεπέρασαν τα 40 mg/l. Αντίθετα οι συγκεντρώσεις που μετρήθηκαν στις ποικιλίες Merlot και Syrah ήταν σημαντικά μεγαλύτερες. Η αρχική περιεκτικότητα των ολικών φλαβονολών, μετά το πέρας της κρυοσταθεροποίησης, ήταν 161 mg/l για το Merlot και 193 mg/l για το Syrah. Οι ολικές φλαβονόλες εμφάνισαν φθίνουσα 185

187 τάση κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης όπως φαίνεται και στην Εικ. 50. Η μείωση των φλαβονολών αποδίδεται μερικώς σε φαινόμενα οξείδωσης, ενώ μέρος αυτών σχηματίζει ολιγομερή μόρια μαζί με τα άλλα φλαβονοειδή του κρασιού (Figueiredo- González et al., 2014, Cheynier, 2006). Εικ. 50: Εξέλιξη συγκέντρωσης ολικών φλαβονολών σε ισοδύναμα κερκετίνης κατά την αποθήκευση κρασιού από τις ποικιλίες Merlot, Syrah, Αγιωργίτικο και Ασύρτικο Παρά τη μικρή μείωση που παρατηρήθηκε στο φορτίο των ολικών φλαβονολών κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης, η ποσοτικοποίηση των μεμονωμένων μορίων με HPLC έδειξε ότι οι αγλυκόνες της κερκετίνης και της μυρισετίνης αυξήθηκαν κατά το ίδιο χρονικό διάστημα. Στην Εικ. 51 φαίνεται η εκατοστιαία μεταβολή των γλυκοζιλιωμένων φλαβονολών έναντι των αγλυκόνων τους. Η συνεχής μείωση των γλυκοζιλιωμένων μορίων με ταυτόχρονη αύξηση των αγλυκόνων είναι εμφανής και αποδίδεται στην υδρόλυση των πρώτων η οποία καταλύεται από ένζυμα όπως είναι η β-γλυκοζιδάση. Επί πλέον, οι Mateo & Di Stefano (1997) απέδειξαν την υδρόλυση των γλυκοζιτών του σταφυλιού από συγκεκριμένα στελέχη του S. Cerevisiae ενώ οι συγκεκριμένες δράσεις συσχετίστηκαν με την παρουσία του ενζύμου major exo-bglucanase (Gil et al., 2005). 186

188 Merlot Syrah Εικ. 51: Εκατοστιαία μεταβολή γλυκοζιλιωμένων φλαβονολών και αγλυκόνων κατά την αποθήκευση 2.4 Κινναμικά παράγωγα Merlot και Syrah Η μελέτη της εξέλιξης των φαινολικών οξέων επικεντρώθηκε στα κινναμικά οξέα και τους τρυγικούς εστέρες αυτών. Στην Εικ. 52 παρουσιάζεται η συγκέντρωση των ολικών κινναμικών (τρυγικών εστέρων και κινναμικών οξέων) συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης για τις ποικιλίες του Αγιωργίτικου και του Ασύρτικου. Οι συγκεντρώσεις των ολικών κινναμικών είναι σημαντικά μεγαλύτερες στο ερυθρό Αγιωργίτικο (4-5 φορές μεγαλύτερες), γεγονός που οφείλεται στην εκχύλιση των φαινολικών οξέων κατά την ερυθρή οινοποίηση. Στις Εικ. 53 και Εικ. 54 παρουσιάζονται οι μεταβολές των συγκεντρώσεων στις δύο βασικές μορφές εμφάνισης των κινναμικών συστατικών στο κρασί, ως τρυγικοί εστέρες (καφταρικό και κουταρικό οξύ) και ως τα αντίστοιχα υδρολυμένα κινναμικά οξέα (καφεϊκό και p-κουμαρικό), συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης μέσω ανάλυσης με τη χρωματογραφική μέθοδο (HPLC-DAD). 187

189 Εικ. 52: Εξέλιξη συγκέντρωσης ολικών κινναμικών σε ισοδύναμα καφεϊκού οξέος κατά την παλαίωση κρασιού από τις ποικιλίες Αγιωργίτικο και Ασύρτικο Εικ. 53: Εξέλιξη συγκέντρωσης ολικών κινναμικών καθώς και των επιμέρους συγκεντρώσεων τρυγικών εστέρων και κινναμικών οξέων κατά την αποθήκευση κρασιού από την ποικιλία Αγιωγίτικο 188

190 Εικ. 54: Εξέλιξη συγκέντρωσης ολικών κινναμικών καθώς και των επιμέρους συγκεντρώσεων τρυγικών εστέρων και κινναμικών οξέων κατά την αποθήκευση κρασιού από την ποικιλία Ασύρτικο Παρατηρώντας τα δύο διαγράμματα, συμπεραίνεται πως με την ολοκλήρωση της οινοποίησης τα κινναμικά συστατικά απαντώνται σχεδόν αποκλειστικά ως τρυγικοί εστέρες των κινναμικών και στο λευκό κρασί (Ασύρτικο) και στο ερυθρό (Αγιωργίτικο). Εντούτοις, ενώ στην αποθήκευση του Ασύρτικου δε φαίνεται να μεταβάλεται η αναλογία εστέρων και οξέων των κινναμικών, στο Αγιωργίτικο φαίνεται να πραγματοποιείται υδρόλυση των τρυγικών εστέρων προς κινναμικά οξέα, με τη συγκέντρωση των τελευταίων να αυξάνεται συνεχώς κατά τους πρώτους 6 μήνες της αποθήκευσης, ενώ στη συνέχεια η αναλογία των συγκεντρώσεων μεταβάλεται συνέχεια γύρω από την τιμή 1:1. Το ίδιο φαινόμενο παρατηρήθηκε και στις ποικιλίες Merlot και Syrah κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης. Η υδρόλυση των τρυγικών εστέρων έχει μελετηθεί από διάφορους ερευνητές τα τελευταία χρόνια με αντικρουόμενα αποτελέσματα όχι μόνο ως προς τον λόγο που αυτή συμβαίνει (θερμοκρασία και χρόνος αποθήκευσης, ποικιλία, πηκτινολητικά ένζυμα), αλλά και ως προς το εύρος και τη χρονική στιγμή που αυτή συμβαίνει (κατά την αλκοολική ζύμωση, κατά τους πρώτους μήνες της παλαίωσης-αποθήκευσης ή και καθόλη τη διάρκεια αυτής με γραμμική εξέλιξη του φαινομένου) (Cejudo-Bastante, 2011, Hernández et al., 2006, Monagas et al., 2005). 189

191 2.5 Φλαβαν-3-όλες Στην Εικ. 55 παρουσιάζεται η μεταβολή της συγκέντρωσης των φλαβαν-3-ολών κατά την αποθήκευση κρασιού της ποικιλίας Merlot, όπως προσδιορίσθηκε με τη μέθοδο της p-διμεθυλάμινοκινναμαλδεΰδης (DMACA). Με την πάροδο 6 μηνών αποθήκευσης, ο δείκτης DMACA ήταν ελαττωμένος κατά 25% (από 290 σε 213 mg/l ισοδυνάμων κατεχίνης). Το γεγονός αυτό οφείλεται σε μικρής έκτασης οξειδωτικά φαινόμενα και κυρίως σε αντιδράσεις πολυμερισμού ανθοκυανών προκυανιδινών. Εικ. 55: Η ποσοτικοποίηση των φλαβαν-3-ολών με DMACA σε ισοδύναμα κατεχίνης κατά την αποθήκευση κρασιού της ποικιλίας Merlot Η συνήθης ένωση των ολιγομερών των φλαβονοειδών προς σχηματισμό μη διακλαδισμένων μεγαλομορίων, γίνεται με δεσμούς μεταξύ του C4 του πυρανίου της μίας φλαβανόλης με τον C8 του πρώτου δακτυλίου της άλλης. Παρόλα αυτά είναι πιθανή και η ένωση των φλαβανολών μεταξύ C4 και C6, δεσμός που επιτρέπει τη διακλάδωση του μορίου (Jackson, 2008, Ribéreau-Gayon et al., 2006). Θεωρητικά η DMACA μετράει μόνο τις φλαβανόλες που δεν είναι υποκατεστημένες στον C8 του 190

192 Α δακτυλίου και συνεπώς στην περίπτωση των ολιγομερών ή πολυμερών των φλαβανολών, μόνο ένα μόριο από την κάθε αλυσίδα, δύναται να αντιδράσει με την κινναμαλδεΰδη, ανεξαρτήτως μεγέθους της ανθρακικής αλυσίδας, εκτός και εάν υπάρχει διακλάδωση (Ivanova et al., 2012). Με βάση τα παραπάνω η μείωση του δείκτη DMACA κατά τη διάρκεια της παλαίωσης οφείλετε εν μέρει και στις λιγότερες ελεύθερες θέσεις C8 των φλαβαν-3- ολών, λόγο των αντιδράσεων πολυμερισμού. 2.6 Εξέλιξη χρώματος Στα λευκά κρασιά χρησιμοποιείται μόνο η απορρόφηση στα 420 nm (κίτρινη απόχρωση) για το χαρακτηρισμό του χρώματος, σε αντίθεση με τα κόκκινα όπου προσδιορίζονται διάφορες χρωματικές παράμετροι. Στην Εικ. 56 παρουσιάζεται η απορρόφηση στα 420 nm συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης για το Ασύρτικο, ενώ στην Εικ. 57 παρουσιάζεται η εξέλιξη των χρωματικών παραμέτρων της κόκκινης ποικιλίας του Αγιωργίτικου. Η χρωματική ένταση (CI), η απόχρωση (HUE) και η λαμπρότητα (da%) δίνονται για το κρασί από την ποικιλία Αγιωργίτικο συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης. Εικ. 56: Απορρόφηση στα 420 nm κατά τη διάρκεια αποθήκευσης για το κρασί από την ποικιλία 191

193 Εικ. 57: Εξέλιξη χρωματικών παραμέτρων CI, HUE και da % κατά την αποθήκευση κρασιού από την ποικιλία Αγιωργίτικο Για το χρώμα στο Ασύρτικο παρατηρείται ότι οι απορροφήσεις στα 420 nm εμφανίζουν αυξητική τάση μετά τους πρώτους 6 μήνες αποθήκευσης. Η αύξηση της απορρόφησης που ήταν ορατή και οπτικά κατά το άνοιγμα των δείγματων (πιο έντονο κίτρινο χρώμα ή ελαφρύ «καφέτιασμα») συμφωνεί με τα βιβλιογραφικά δεδομένα για την αποθήκευση λευκών κρασιών και μπορεί να αποδοθεί σε χημικές οξειδωτικές δράσεις που συμβαίνουν στο λευκό κρασί. Στο χρώμα του ερυθρού κρασιού, προφανώς, όσο μεγαλύτερη είναι η τιμή της χρωματικής έντασης (CI) τόσο πιο έντονο χρώμα έχει το κρασί. Παρατηρείται ότι μετά από μία απότομη αύξηση του δείκτη CI κατά την πρώτη δειγματοληψία, η χρωματική ένταση στη συνέχεια παραμένει πρακτικά σταθερή ενώ αρχίζει να μειώνεται μετά από τους 6 πρώτους μήνες αποθήκευσης. Η μείωση αυτή συμφωνεί με τα βιβλιογραφικά δεδομένα και μπορεί να αποδοθεί σε ένα βαθμό στη μείωση των ελεύθερων ανθοκυανών λόγω συμπλοκοποίησης ή πολυμερισμού τους (Dobrei et al., 2010). Αντίθετα, η αρχική αύξηση μπορεί να αποδοθεί σε απελευθέρωση μονομερών ανθοκυανών από το θειώδη ανυδρίτη. Όσων αφορά στη χρωματική παράμετρο της απόχρωσης (hue), αντιπροσωπεύει την εξέλιξη του χρώματος προς το πορτοκαλί. Όσο υψηλότερη είναι η τιμή της, τόσο το χρώμα μεταβάλλεται από το κόκκινο προς το πορτοκαλί. Παρατηρείται μία σταθερή 192

194 αύξηση της τιμής της από την αρχή κιόλας της αποθήκευσης, που φτάνει περίπου το 40%, στο πέρας της αποθήκευσης σε σχέση με την αρχική τιμή. Η αύξηση αυτή συμφωνεί και πάλι με τα βιβλιογραφικά δεδομένα (Dobrei et al., 2010), και αποτελεί κριτήριο «παλαίωσης» ενός ερυθρού κρασιού ενώ μπορεί να συσχετιστεί και με τη μείωση των ελεύθερων ανθοκυανών που δίνουν το κόκκινο χρώμα. Τέλος, ο χρωματικός δείκτης da%, σχετίζεται με το σχήμα του φάσματος και όσο υψηλότερη είναι η τιμή του, τόσο περισσότερο κυριαρχεί το κόκκινο χρώμα. Παρατηρείται μια σταθερή μείωση της τιμής da% αντίθετα με την απόχρωση ίση περίπου με 30%. 2.7 Σύγκριση εξέλιξης φαινολικών κατά την αποθήκευση κρασιού υπό διαφορετικές τροποποιημένες ατμόσφαιρες Τα αποτελέσματα που παρουσιάστηκαν μέχρι τώρα αφορούσαν στην εξέλιξη των ολικών και επιμέρους φαινολικών καθώς και των χρωματικών παραμέτρων συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης σε δείγματα που είχαν συσκευαστεί υπό τροποποιημένη ατμόσφαιρα Ν2-CO2 (1:1). Στη συνέχεια, γίνεται μια προσπάθεια εκτίμησης της επίδρασης που μπορεί να έχει η σύσταση της τροποποιημένης ατμόσφαιρα στην εξέλιξη των φαινολικών συστατικών κατά τη διάρκεια αποθήκευσης τους Ολικό φαινολικό φορτίο Το ολικό φαινολικό φορτίο για τη λευκή ποικιλία του Ασύρτικου συναρτήσει του χρόνου για τις τέσσερις (4) διαφορετικές ατμόσφαιρες αποθήκευσης (λεπτό στρώμα αέρα, άζωτο, διοξείδιο του άνθρακα, και ισομοριακό μίγμα των δύο τελευταίων) παρουσιάζεται στην Εικ. 58. Παρατηρείται μια τάση για μείωση της συγκέντρωσης των ολικών φαινολικών συναρτήσει του χρόνου σε όλες τις ατμόσφαιρες αποθήκευσης. Ενώ οι τρεις τροποποιημένες ατμόσφαιρες (Ν2, CO2 και μίγμα) εμφανίζουν κάποιες διαφορές στο ρυθμό μείωσης του ολικού φαινολικού φορτίου ιδιαίτερα πριν τις 100 πρώτες μέρες, όσο αυξανόταν ο χρόνος αποθήκευσης οι διαφορές αυτές αμβλύνονταν. Η αρχική συγκέντρωση του φρέσκου Ασύρτικου ακριβώς πριν τη συσκευασία ίση με 327 ± 17 mg/l GAE μετά από σχεδόν ένα χρόνο 193

195 παλαίωσης μειώθηκε σε 234 ± 4, 239 ± 5 και 242 ± 3 mg/l GAE για τις ατμόσφαιρες αζώτου, διοξειδίου του άνθρακα και μίγματος, αντίστοιχα. Οι τιμές αυτές δεν διαφέρουν σημαντικά και αντιστοιχούν σε ποσοστιαία μείωση 27 ± 1%. Αντίθετα, η ατμόσφαιρα με το λεπτό στρώμα ατμοσφαιρικού αέρα παρουσίασε ελαφρώς μεγαλύτερη μείωση του ολικού φαινολικού φορτίου στα 212 ± 1 mg/l GAE που αντιστοιχεί σε 35% μείωση από την αρχική συγκέντρωση. Η διαφορά αυτή υποδηλώνει την εκδήλωση πιο έντονων οξειδωτικών φαινομένων στο λευκό κρασί χωρίς τη χρήση ατμόσφαιρας αδρανούς αερίου, κάτι που είναι λογικό λόγω της μεγαλύτερης περιεκτικότητας του οξυγόνου τόσο στην υπερκείμενη αέρια φάση όσο και στο διάλυμα του κρασιού. Εικ. 58: Εξέλιξη συγκέντρωσης ολικών φαινολικών συστατικών σε ισοδύναμα γαλλικού οξέος [GAE] κατά την αποθήκευση κρασιού από την ποικιλία Ασύρτικο υπό διαφορετικές ατμόσφαιρες Όσον αφορά τις κόκκινες ποικιλίες, η μείωση των ολικών φαινολικών ήταν ακόμη μικρότερη μιας και το μεγαλύτερο αρχικό φαινολικό φορτίο λόγο της ερυθρής οινοποίησης προστατεύει από τα φαινόμενα χημικής οξείδωσης. Ενδεικτικά αναφέρεται ότι σε χρονικό διάστημα αποθήκευσης ενός έτους, κρασιά από τις ποικιλίες Merlot και Syrah (Παράρτημα) δεν εμφάνισαν μείωση του ολικού 194

196 φαινολικού τους φορτίου σε καμία ατμόσφαιρα αποθήκευσης πλην του στρώματος αέρα (3 και 6.5% για Merlot και Syrah αντίστοιχα). Πίν. 20: % μείωση των ολικών φαινολικών των κόκκινων ποικιλιών Merlot και Syrah, μετά από την αποθήκευση 17 μηνών σε συνθήκες τροποποιημένης ατμόσφαιρας Αέρας Ν 2 CO 2 Μίγμα Merlot Syrah Στη συνέχεια και κατά την αποθήκευση έως χρονικού διαστήματος 17 μηνών, η μείωση των ολικών φαινολικών και για τις δύο ποικιλίες κυμάνθηκε από 10% (Ν2 Μerlot) μέχρι 25% (CO2 Syrah) (Πίν. 20). Αν και η μείωση σε ατμόσφαιρα CO2 είναι μεγαλύτερη, δεν φαίνεται να υπάρχει σαφής συσχέτιση της ατμόσφαιρας αποθήκευσης με την εξέλιξη του ολικού φαινολικού φορτίου. Αντίστοιχα αποτελέσματα εμφάνισαν και τα πειράματα με την ποικιλία του Αγιωργίτικου. Σε αυτό το σημείο αξίζει να σημειωθεί, ότι ένα μέρος της μείωσης που φαίνεται για το ολικό φαινολικό φορτίο, δεν αντικατοπτρίζει φαινόμενα οξείδωσης παρά μπορεί να αποδωθεί σε σφάλμα της αναλυτικής μεθόδου. Ο πολυμερισμός των φαινολικών συστατικών με αντιδράσεις συμπύκνωσης, έχει σαν αποτέλεσμα τη μείωση των ελεύθερων υδροξυλομάδων με τις οποίες σχηματίζει σύμπλοκα το αντιδραστήριο Folin κατά τη διαδικασία των μετρήσεων, επομένως πρακτικά ακόμα και εάν δεν οξειδώνονταν καθόλου οι πολυφαινόλες του κρασιού και πάλι ο δείκτης Folin θα εμφάνιζε μια μικρή ελάττωση κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης Ανθοκυάνες Οι ελεύθερες ανθοκυάνες εμφανίζουν τον μεγαλύτερο ρυθμό μείωσης από τις φαινολικές ομάδες που εξετάστηκαν με αποτέλεσμα η συμπεριφορά τους υπό τις διαφορετικές ατμόσφαιρες αποθήκευσης να αποκτά ιδιαίτερο ενδαιφέρον. Στην Εικ. 59 παρουσιάζεται η μεταβολή της συγκέντρωσης ελεύθερων (μονομερών) ανθοκυανών συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης για τις τέσσερις (4) διαφορετικές ατμόσφαιρες αποθήκευσης στο Αγιωργίτικο. 195

197 Εικ. 59: Εξέλιξη συγκέντρωσης μονομερών ανθοκυανών σε ισοδύναμα μαλβιδίνης-3- γλυκοζίτη κατά την αποθήκευση κρασιού από την ποικιλία Αγιωργίτικο υπό διαφορετικές ατμόσφαιρες Παρατηρώντας το διάγραμμα φαίνεται ότι στην ατμόσφαιρα αποθήκευσης με το στρώμα αέρα η εξάντληση των ελεύθερων ανθοκυανών ολοκληρώνεται ήδη μετά από 2 μήνες αποθήκευσης. Αντίθετα, ο ρυθμός μείωσης των ελευθερων ανθοκυανών στις τρεις (3) τροποποιημένες ατμόσφαιρες ακολουθεί παρόμοια συμπεριφορά με σταδιακή μείωση μέχρι 10 μήνες. Η μείωση αυτή των ελεύθερων ανθοκυανών σε όλες τις ατμόσφαιρες αποθήκευσης οφείλεται σε αντιδράσεις πολυμερισμού και σε συμπλοκοποιήσεις των ελεύθερων ανθοκυανών και μόνο σε ένα πολύ μικρό ποσοστό σε οξειδωτικά φαινόμενα αφού δεν παρατηρήθηκε ανάλογη μείωση στη συγκέντρωση των ολικών φαινολικών. Για να μελετηθεί αναλυτικότερα η δέσμευση των μονομερών ανθοκυανών υπολογίστηκαν οι ρυθμοί μείωσης των τριών κύριων ανθοκυανών (Mv-3-glc, Mv-3- acglc, Mv-3-coumglc) στις τέσσερις (4) ατμόσφαιρες αποθήκευσης και για τις ποικιλίες Αγιωργίτικο, Merlot και Syrah και παρουσιάζονται στον Πίν. 21: 196

198 Πίν. 21: Ρυθμοί μείωσης και συντελεστές συσχέτισης των τριών κυριώτερων ανθοκυανών υπό τις διαφορετικές ατμόσφαιρες αποθήκευσης για κρασί της ποικιλίας του Αγιωργίτικου. Οι διαφορετικοί δείκτες υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές ανά στήλη (p<0.05). Mv-3-glc Mv-3-acglc Mv-3-coumglc k±sd k±sd k±sd R 2 R 2 [mon -1 ] [mon -1 ] [mon -1 ] R 2 Αέρας a a a N b b b CO b b b Μίγμα b b b Από τη σύγκριση των σταθερών k προκύπτει ότι ο μεγαλύτερος ρυθμός μείωσης των ελεύθερων ανθοκυανών εντοπίζεται στην ατμόσφαιρα του λεπτού στρώματος ατμοσφαιρικού αέρα, με τους ρυθμούς μείωσης να είναι σχεδόν 5πλάσιοι σε σχέση με τις λοιπές ατμόσφαιρες. Οι ατμόσφαιρες αζώτου, διοξειδίου του άνθρακα και μίγματος αερίου δεν φαίνεται να εμφανίζουν σημαντικές διαφορές μεταξύ τους. Ο μεγάλος ρυθμός μείωσης των ανθοκυανών στην περίπτωση της αποθήκευσης σε λεπτό στρώμα αέρα δεν μπορεί να αποδοθεί (τουλάχιστον όχι αποκλειστικά) σε φαινόμενα οξείδωσης μέχρις εξαντλήσεως του περιεχόμενου οξυγόνου στη συσκευασία γιατί κάτι τέτοιο θα οδηγούσε σε στατιστικά σημαντικές διαφορές των ολικών φαινολικών (δείκτης Folin), πράγμα που δεν παρατηρήθηκε ούτε στο Αγιωργίτικο αλλά ούτε και στις ποικιλίες Merlot και Syrah. Αντίθετα ο αυξημένος ρυθμός μείωσης θα μπορούσε να είναι ουσιαστικά αυξημένος ρυθμός δέσμευσης μέσω αντιδράσεων πολυμερισμού. Η μικρή ποσότητα οξυγόνου της συσκευασίας ενισχύει τον πολυμερισμό παρουσία ακεταλδεΰδης μέσω γεφυρών αιθυλίου (Κεφ. 5.3 Θεωρητικό) και προσομοιάζει ενός είδους παλαίωση με μικροοξυγόνωση. Φυσικά κάτι τέτοιο εμπεριέχει το ρίσκο της ταχείας οξείδωσης μικροβιακής φύσης εφόσον η οξυγόνωση δεν γίνεται σε ελεγχόμενες συνθήκες Φλαβονόλες Η μεταβολή της συγκέντρωσης των ολικών φλαβονολών συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης για τις τέσσερις διαφορετικές ατμόσφαιρες αποθήκευσης δεν παρουσίασε σημαντική διαφορά (Παράρτημα). 197

199 Οι επιμέρους συγκεντρώσεις των γλυκοζυλιωμένων φλαβονολών καθώς και των υδρολυμένων άγλυκων μορφών τους συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης για το Αγιωργίτικο παρουσιάζονται στην Εικ. 60, για κάθε ατμόσφαιρα αποθήκευσης ξεχωριστά. Εικ. 60 Εξέλιξη συγκέντρωσης επιμέρους υποομάδων φλαβονολών (γλυκοζυλιωμένων και άγλυκων) σε ισοδύναμα κερκετίνης κατά την αποθήκευση κρασιού από την ποικιλία Αγιωργίτικο σε διαφορετικές ατμόσφαιρες Οι επιμέρους συγκεντρώσεις γλυκοζυλιωμένων και άγλυκων φλαβονολών παρουσιάζουν παρόμοια συμπεριφορά και στις τέσσερις ατμόσφαιρες αποθήκευσης. Οι γλυκοζυλιωμένες φλαβονόλες που αρχικά εμφανίζονται σε υπερδιπλάσια συγκέντρωση από τις αντίστοιχες άγλυκες μορφές υδρολύονται σταδιακά μέχρι οι συγκεντρώσεις τους να μειωθούν και να γίνουν περίπου ίσες με τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις των άγλυκων φλαβονολών σε όλες τις ατμόσφαιρες αποθήκευσης. 198

200 2.7.4 Φαινολικά οξέα Στην Εικ. 61 παρουσιάζεται η μεταβολή των συγκεντρώσεων ολικών κινναμικών (τρυγικών εστέρων και κινναμικών οξέων) συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης των δειγμάτων κρασιού από την ποικιλία Ασύρτικο για τις τέσσερις (4) ατμόσφαιρες αποθήκευσης. Εικ. 61: Εξέλιξη συγκέντρωσης ολικών κινναμικών σε ισοδύναμα καφεϊκού οξέος [CAE] κατά την αποθήκευση κρασιού από την ποικιλία Ασύρτικο υπό διαφορετικές ατμόσφαιρες Παρατηρώντας την εικόνα, είναι φανερό πως οι τρεις (3) τροποποιημένες ατμόσφαιρες παρουσιάζουν όμοια συμπεριφορά κατά την αποθήκευση του Ασύρτικου. Συγκεκριμένα, εμφανίζεται μια μικρή τάση μείωσης των ολικών κινναμικών συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης για τις τρεις (3) τροποποιημένες ατμόσφαιρες αζώτου, διοξειδίου του άνθρακα και του μίγματος αερίων. Η ατμόσφαιρα λεπτού στρώματος ατμοσφαιρικού αέρα, μετά 3 πρώτους μήνες φαίνεται να διαφοροποιείται εμφανίζοντας μεγαλύτερο ρυθμό μείωσης. Στο Παράρτημα παρουσιάζονται οι μεταβολές των συγκεντρώσεων ολικών κινναμικών συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης για τις τέσσερις διαφορετικές ατμόσφαιρες αποθήκευσης του κρασιού από την ποικιλία Αγιωργίτικο. 199

201 Στην αποθήκευση του Αγιωργίτικου δεν παρατηρούνται διαφορές ούτε στη συμπεριφορά των συγκεντρώσεων συναρτήσει του χρόνου μεταξύ των διαφορετικών ατμοσφαιρών αποθήκευσης αλλά ούτε και σημαντική μείωση των ολικών κινναμικών κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης (Παράρτημα). Το υψηλό φαινολικό φορτίο του ερυθρού κρασιού φαίνεται ότι προστατεύει ακόμα και την ατμόσφαιρα του αέρα. Στη συνέχεια, στην Εικ. 62 παρουσιάζεται η εξέλιξη των επιμέρους συγκεντρώσεων των τρυγικών εστέρων και των κινναμικών οξέων συναρτήσει του χρόνου αποθήκευσης για την κάθε μια διαφορετική ατμόσφαιρα αποθήκευσης ξεχωριστά. Εικ. 62: Εξέλιξη επιμέρους συγκεντρώσεων τρυγικών εστέρων και κιναμωμικών οξέων κατά την αποθήκευση κρασιού από την ποικιλία Αγιωργίτικο στις τέσσερις (4) διαφορετικές ατμόσφαιρες Παρατηρώντας τα διαγράμματα προκύπτει ότι κατά την αποθήκευση των δειγμάτων του Αγιωργίτικου, σε όλες τις ατμόσφαιρες αποθήκευσης, μετά τους δύο πρώτους μήνες αποθήκευσης η ισορροπία μετατοπίζεται προς την υδρόλυση των τρυγικών εστέρων σε κινναμικά οξέα. Σε όλες τις περιπτώσεις η αναλογία των συγκεντρώσεων εστέρων-οξέων φαίνεται να κυμαίνεται γύρω από μια σταθερή τιμή σχετικά κοντά 200

202 στο 1:1, ενώ εξαίρεση αποτέλεσε η αποθήκευση στην ατμόσφαιρα του διοξειδίου του άνθρακα όπου φαίνεται ότι η ισορροπία είναι περισσότερο μετατοπισμένη προς τον σχηματισμό των οξέων με τη σχετική αναλογία των δύο συγκεντρώσεων να παραμένει μικρότερη από Χρώμα Οι χρωματικές παράμετροι: χρωματική ένταση (CI), απόχρωση (hue) και λαμπρότητα (da%) κατά την αποθήκευση σε διαφορετική σύσταση ατμόσφαιρας εξετάσθηκαν σε διάστημα 12 μηνών (Παράρτημα). Παρατηρήθηκε ότι όλες οι ατμόσφαιρες αποθήκευσης παρουσιάζουν παρόμοια συμπεριφορά συναρτήσει του χρόνου. Σε όλες τις περιπτώσεις η χρωματική ένταση (CI) και η λαμπρότητα (da%) μειώνονται με αύξηση της διάρκειας αποθήκευσης ενώ η απόχρωση (hue) αυξάνεται σταδιακά. Η ατμόσφαιρα διοξειδίου του άνθρακα φαίνεται να διατηρεί καλύτερα τη χρωματική ένταση (CI) του ερυθρού κρασιού για διάρκεια αποθήκευσης ενός χρόνου σε σχέση με τις άλλες ατμόσφαιρες αποθήκευσης ενώ η ατμόσφαιρα του αέρα παρουσιάζει το μικρότερο ρυθμό αύξησης της παραμέτρου της απόχρωσης, παρόλα αυτά οι παραπάνω διαφορές δεν ήταν σημαντικές (p<0.05). Στις Εικ. 63, Εικ. 64 & Εικ. 65 διακρίνονται οι τιμές των χρωματικών παραμέτρων που μετρήθηκαν στις τρεις μελετώμενες ποικιλίες κόκκινου κρασιού, έπειτα από χρονικό διάστημα αποθήκευσης ενός έτους. 201

203 Εικ. 63: Η χρωματική ένταση (CI) δειγμάτων των ποικιλιών Merlot, Syrah και Αγιωργίτικο, αποθηκευμένων για χρονικό διάστημα ενός έτους υπό διαφορετικές ατμόσφαιρες Εικ. 64: Η απόχρωση (hue) δειγμάτων των ποικιλιών Merlot, Syrah και Αγιωργίτικο, αποθηκευμένων για χρονικό διάστημα ενός έτους υπό διαφορετικές ατμόσφαιρες 202

204 Εικ. 65: Η λαμπρότητα (da%) δειγμάτων των ποικιλιών Merlot, Syrah και Αγιωργίτικο, αποθηκευμένων για χρονικό διάστημα ενός έτους υπό διαφορετικές ατμόσφαιρες 203

205 3 Μελέτη του φαινομένου της συνέργειας χρώματος μέσω σχηματισμού εγρώμων συμπλόκων (copigmentation) μεταξύ ανθοκυανών και άλλων φαινολικών συστατικών 3.1 Επίδραση της προσθήκης των συμπαραγόντων (cofactors) σε φρέσκο κρασί Το φαινολικό προφίλ του φρέσκου κρασιού Το ολικό φαινολικό φορτίο στο φρέσκο Merlot, όπως αυτό προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Folin-Ciocalteu, ανερχόταν σε 1600 ± 35 mg/l GAE, ενώ οι ολικές φλαβαν- 3-όλες σε 290 ± 16 mg/l ισοδυνάμων κατεχίνης (Πίν. 22). Το Merlot εμφανίζει ένα ιδιαίτερα πλούσιο και πολύπλοκο ανθοκυανικό προφίλ. Συνολικά ανιχνεύτηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν 14 ανθοκυάνες. Στο φρέσκο Merlot η μαλβιδίνη ανιχνεύτηκε στη μορφή του 3-Ο-γλυκοζίτη καθώς και ακυλιωμένη από το οξικό, το κουμαρικό και το καφεϊκό οξύ, ενώ ποσοτικά τα τέσσερα παραπάνω μόρια έφτασαν το 70% του φορτίου των ολικών ανθοκυανών. Η πεονιδίνη και η πετουνιδίνη ανιχνεύτηκαν στη μορφή του 3-Ο-γλυκοζίτη, 3-Ο-6 ακετυλιωμένου γλυκοζίτη και 3-Ο-6 p-κουμαριλιωμένου γλυκοζίτη, ενώ η δελφινιδίνη και η κυανιδίνη ανιχνεύτηκαν μόνο στις δύο πρώτες μορφές. Οι ολικές μονομερείς ανθοκυάνες του κρασιού, ποσοτικοποιημένες ως το άθροισμα των μεμονωμένων μορίων που ανιχνεύτηκαν με HPLC, υπολογίστηκαν σε ± 4.6 mg/l. Σε αυτό το σημείο σημειώνεται ότι οι ανθοκυάνες που ποσοτικοποιούνται με HPLC στα 520 nm σε έντονα όξινο ph, στην πραγματικότητα δεν είναι μόνο οι μονομερείς ανθοκυάνες του κρασιού παρά και ένα ποσοστό συμπλοκοποιημένων ανθοκυανών οι οποίες μετρούνται ως μονομερείς. Τα έγχρωμα σύμπλοκα των ανθοκυανών είναι μοριακές κατανομές στο χώρο που συγκρατούνται από ασθενείς υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μορίων. Η αραίωση του κρασιού κατά τη χρωματογραφική ανάλυση σε μεγάλο βαθμό αποδομεί αυτά τα σύμπλοκα και στη συνέχεια οι εν λόγο ανθοκυάνες μετρούνται ως μονομερείς δομές. 204

206 Πίν. 22: Η χημική ανάλυση του φρέσκου Merlot πριν την προσθήκη των συμπαραγόντων και η ποσοτικοποίηση ανθοκυανών, φλαβαν-3-ολών, φλαβονολών και κινναμικών οξέων, σε ισοδύναμα μαλβιδίνης-3-γλυκοζίτη, κατεχίνης, κερκετίνης και καφεϊκού οξέος αντίστοιχα Παράμετρος Περιεκτικότητα στο κρασί [mg/l] Ολικές φαινόλες 1600 ± 35 Ολικές φλαβαν-3-όλες 290 ± 16 Δελφινιδίνη-3-γλυκοζίτης 19.0 ± 1.0 Κυανιδίνη-3-γλυκοζίτης Ίχνη Πετουνιδίνη-3-γλυκοζίτης 28.7 ± 0.9 Πεονιδίνη-3-γλυκοζίτης 22.2 ± 1.5 Μαλβιδίνη-3-γλυκοζίτης ± 2.8 Δελφινιδίνη-3-ακετυλιωμένος γλυκοζίτης 8.4 ± 0.7 Κυανιδίνη-3-ακετυλιωμένος γλυκοζίτης Ίχνη Πετουνιδίνη-3-ακετυλιωμένος γλυκοζίτης 11.0 ± 0.9 Πεονιδίνη-3-ακετυλιωμένος γλυκοζίτης 16.6 ± 1.1 Μαλβιδίνη-3-ακετυλιωμένος γλυκοζίτης 61.5 ± 1.9 Πετουνιδίνη-3-κουμαριλιωμένος γλυκοζίτης 9.2 ± 0.4 Πεονιδίνη-3-κουμαριλιωμένος γλυκοζίτης 11.8 ± 0.8 Μαλβιδίνη-3-κουμαριλιωμένος γλυκοζίτης 27.3 ± 1.4 Μαλβιδίνη-3-καφεϊλιωμένος γλυκοζίτης Ίχνη Ολικές ελεύθερες ανθοκυάνες ± 4.6 Καφταρικό οξύ 11.1 ± 0.7 Κουταρικό οξύ 3.6 ± 0.6 Καφεϊκό οξύ Ίχνη p-κουμαρικό οξύ Ίχνη Ολικά κινναμικά οξέα 14.7 ± 0.9 Μυρισετίνη-3-γλυκουρονίδιο Ίχνη Μυρισετίνη-3-γλυκοζίτης 2.6 ± 0.1 Κερκετίνη-3-γλυκουρονίδιο 1.6 ± 0.1 Κερκετίνη-3-γλυκοζίτης 3.1 ± 0.3 Λαρικιτρίνη-3-γλυκοζίτης 1.8 ±

207 Μυρισετίνη 2.8 ± 0.5 Συρινγκετίνη-3-γλυκοζίτης 1.7 ± 0.1 Κερκετίνη 1.9 ± 0.6 Ολικές φλαβονόλες 16.3 ± 0.9 Ο Boulton (2001) ανέφερε ότι η παρουσία των εγχρώμων συμπλόκων των ανθοκυανών καθιστά μη συγκρίσιμα τα αποτελέσματα της μέτρησης του ολικού ανθοκυανικού φορτίου του κρασιού χρωματογραφικά σε σχέση με τις διάφορες φασματοφωτομετρικές μεθόδους. Για αυτούς τους λόγους θα χρησιμοποιούμε τον όρο «ελεύθερες» για να χαρακτηρίσουμε τις ανθοκυάνες που μετρούνται χρωματογραφικά, ενώ ως μονομερείς θα χαρακτηρίζονται οι ανθοκυάνες που μετρούνται φωτομετρικά με τη μέθοδο του Boulton. Οι κύριες φλαβονόλες που ανιχνεύτηκαν στο φρέσκο Merlot ήταν η κερκετίνη και η μυρισετίνη, γλυκοζιλιωμένες, γλυκουρονιδιωμένες, αλλά και στις άγλυκες μορφές τους. Επιπλέον βρέθηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν οι γλυκοζίτες της λαρικιτρίνης και της συρινγκετίνης. Το καφταρικό και το κουταρικό οξύ ήταν τα κύρια φαινολικά συστατικά από την ομάδα των κινναμικών οξέων, ενώ οι υδρολυμένες τους μορφές, δηλαδή το καφεϊκό και το p-κουμαρικό οξύ βρέθηκαν μόνο σε ίχνη Το φαινολικό προφίλ των εκχυλισμάτων των αρωματικών φυτών και του εμπλουτισμένου κρασιού Τα αρωματικά φυτά της οικογένειας Lamiaceae, όπως η ρίγανη και το θρούμπι, εμφανίζουν υψηλή περιεκτικότητα σε φαινολικά συστατικά, το μεγαλύτερο ποσοστό των οποίων ανήκει σε πολύπλοκα κινναμικά οξέα που έχουν σαν βάση τους το καφεϊκό οξύ, όπως είναι το ροσμαρινικό οξύ (Janicsák et al., 1999, Petersen & Simmonds, 2003). Το ολικό φαινολικό φορτίο των εκχυλισμάτων, εκφρασμένο σε ισοδύναμα γαλλικού οξέος, μετρήθηκε ίσο με 274 ± 5 g/kg (ξηρή βάση) στη ρίγανη και 289 ± 6 g/kg (ξηρή βάση) στο θρούμπι. Το κύριο φαινολικό συστατικό και στα δύο εκχυλίσματα ήταν το ροσμαρινικό οξύ, ενώ σε σημαντικές περιεκτικότητες απαντήθηκαν άλλα πιο πολύπλοκα κινναμικά οξέα όπως είναι το σαλβιανολικό οξύ Α και το λιθοσπερμικό οξύ. Η δράση των δύο τελευταίων συστατικών δεν έχει μελετηθεί όσον αφορά την ικανότητά τους να δρουν ως συμπαράγοντες 206

208 συμπλοκοποίησης των ανθοκυανών και αυτός ήταν και ένας από τους στόχους αυτής της μελέτης. Εκτός από τα κινναμικά οξέα, στα δύο εκχυλίσματα απαντήθηκαν σε μικρή περιεκτικότητα φαινολικές ενώσεις της χαρακτηριστικής ομάδας των φλαβονών, με τον γλυκοζίτη 6,8-δι-C της απιγενίνης να είναι ποσοτικά η σημαντικότερη από αυτές. Άλλες ενώσεις που ανιχνεύτηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν είναι το 7-Οδιγλυκουρονίδιο της απιγενίνης, γλυκοζίτες της λουτεολίνης και της κερκετίνης, καθώς τα αντίστοιχα άγλυκα μόρια να οποία όμως ευρέθηκαν σε ίχνη. Πίν. 23: Ποσοτικοποίηση των συμπαραγόντων στα δείγματα του κρασιού με προσθήκη ροσμαρινικού οξέος (RosW), εκχυλίσματος ρίγανης (EocW), και εκχυλίσματος από θρούμπι Παράμετρος (EsW) RosW (mg/l) EocW (mg/l) EsW (mg/l) Ροσμαρινικό οξύ ± ± 2.9 Λιθοσπερμικό οξύ α ± ± 2.6 Σαλβιανολικό οξύ Α α ± ± 7.6 Μη ταυτοποιημένα κινναμικά οξέα α ± ± 2.2 Ολικά προστεθειμένα κινναμικά οξέα α ± ± 9.1 Απιγενίνη 6,8-δι-C γλυκοζίτης β ± ± 0.9 Λουτεολίνη 7,4 -δι-ο γλυκουρονίδιο β ± ± 0.1 Απιγενίνη 7-Ο διγλυκουρονίδιο β ± Λουτεολίνη β - Ίχνη 2.8 ± 0.6 Απιγενίνη β - Ίχνη 2.4 ± 0.2 Κερκετίνη - Ίχνη 2.1 ± 0.5 Ρουτίνη β - Ίχνη Ίχνη Ολικές προστεθειμένες ± ± 1.4 φλαβόνες/φλαβονόλες β α εκφρασμένα σε ισοδύναμα ροσμαρινικού οξέος β εκφρασμένα σε ισοδύναμα κερκετίνης Όλα τα δείγματα κρασιού αναλύθηκαν χρωματογραφικώς αμέσως μετά την προσθήκη των συμπαραγόντων και η αντίστοιχη ποσοτικοποίηση φαίνεται στον Πίν. 207

209 23. Όπως φαίνεται τα κινναμικά οξέα είναι τα μόρια που απαντώνται στις μεγαλύτερες συγκεντρώσεις στις σειρές δειγμάτων όπου έχουν προστεθεί τα εκχυλίσματα των αρωματικών φυτών, ενώ στα δείγματα όπου έχει προστεθεί το εκχύλισμα της ρίγανης (EocW) οι συγκεντρώσεις είναι μεγαλύτερες σε σχέση με τα αντίστοιχα δείγματα όπου έχει προστεθεί το θρούμπι (EsW) Η επίδραση της προσθήκης των συμπαραγόντων στο φρέσκο κρασί και ο σχηματισμός των εγχρώμων συμπλόκων με τις ανθοκυάνες Στην Εικ. 66 φαίνεται το ποσοστό των μονομερών, συμπλοκοποιημένων και πολυμερισμένων ανθοκυανών στο φρέσκο Merlot (μάρτυρας) και οι αντίστοιχες μεταβολές κατά την προσθήκη των συμπαραγόντων. Η φασματοφωτομετρική ανάλυση του μάρτυρα στο χρόνο 0 (σχεδόν 1 μήνα μετά το πέρας της αλκοολικής ζύμωσης) έδειξε ότι 45% των ανθοκυανών ήταν μονομερείς, 28% είχαν ήδη συμπλοκοποιηθεί με συμπαράγοντες προερχόμενους από το ίδιο το κρασί, ενώ 29% ήταν ήδη πολυμερισμένες, γεγονός ενδεικτικό του πόσο γρήγορα εξελίσσονται οι αντιδράσεις πολυμερισμού μεταξύ ανθοκυανών και φλαβαν-3-ολών στο κρασί. Εικ. 66: Η επίδραση της προσθήκης των συμπαραγόντων στις ανθοκυάνες του κρασιού. CW: μάρτυρας, RosW, EsW, EocW: δείγματα με προσθήκη ροσμαρινικού οξέος, εκχυλίσματος από θρούμπι, και εκχυλίσαμτος από ρίγανη, αντίστοιχα. 208

210 Η αυτο-συμπλοκοποίηση των ανθοκυανών και ιδιαιτέρως του 3-γλυκοζίτη της μαλβιδίνης (που εμφανίζει και την υψηλότερη συγκέντρωση από πλευράς ανθοκυανών, mg/l), θα μπορούσε να ευθύνεται εν μέρει για τις συμπλοκοποιημένες ανθοκυάνες στο μάρτυρα. Η ανθοκυανική σύσταση του κρασιού (ποσοτικά ασφαλώς αλλά και ποιοτικά) παίζει ρόλο στο φαινόμενο του σχηματισμού εγχρώμων συμπλόκων, μιας και αναφέρεται ότι η ικανότητα μεταξύ των διαφορετικών ανθοκυανών να σχηματίζουν έγχρωμα σύμπλοκα, ως ένα βαθμό ποικίλει (González-Manzano et al., 2009, González-Manzano et al., 2008, Vaadia, 1997). Οι He et al. (2012) αναφέρουν ότι όσο μεγαλύτερο το ποσοστό της μεθοξυλίωσης του Β δακτυλίου της ανθοκυάνης, τόσο πιο αυξημένη εμφανίζεται η ικανότητα αυτο-συμπλοκοποίησης του μορίου. Επιπλέον αναφέρεται ότι η αυτοσυμπλοκοποίηση του 3-γλυκοζίτη της μαλβιδίνης ευνοείται θερμοδυναμικώς σε σχέση με τη δημιουργία συμπλόκων όπου το ρόλο του συμπαράγοντα παίζει κάποιο διαφορετικό μόριο, ενώ η εστεροποίηση του γλυκοζίτη με το κουμαρικό οξύ καθιστά την ικανότητα αυτο-συμπλοκοποίησης του 3-κουμαριλιωμένου γλυκοζίτη της μαλβιδίνης μηδαμινή. Παρόλα αυτά, αναφέρεται ότι για να λάβει μέρος η αυτοσυμπλοκοποίηση των ανθοκυανών, αυτές πρέπει να βρίσκονται εν διαλύσει σε περιεκτικότητες μεγαλύτερες από 1 mmol/l (González-Manzano et al., 2008, He et al., 2012). Επομένως η επίδραση της αυτο-συμπλοκοποίησης στις παρατηρούμενες μεταβολές είναι αμφισβητήσιμη. Από την άλλη μεριά, φλαβονόλες, φλαβαν-3-όλες, κινναμικά οξέα και παράγωγα αυτών, θεωρούνται οι κύριοι συμπαράγοντες στο φρέσκο κόκκινο κρασί (Favre et al., 2014, He et al., 2012). Οι φλαβαν-3-όλες έχουν θεωρητικά τη μικρότερη ικανότητα σχηματισμού εγχρώμων συμπλόκων σε σχέση με τα υπόλοιπα φλαβονοειδή (φλαβονόλες, φλαβόνες) και ακόμα περισσότερο σε σχέση με τα κινναμικά οξέα. Η σχετικά μικρή ικανότητα των φλαβαν-3-ολών, οφείλεται στη μη επίπεδη δομή τους, η οποία παρεμποδίζει στερεοχημικά την υδρόφοβη διάταξη του συμπλόκου στο χώρο (González-Manzano et al., 2009, Liao, Cai, & Haslam, 1992). Αντίθετα, τα επίπεδα μόρια φλαβονολών και κινναμικών οξέων αναφέρονται ως οι καλύτεροι συμπαράγοντες του κρασιού (Darias-Martin et al., 2001, Gómez-Míguez et al., 2006). Παρ όλα αυτά, επειδή η συγκέντρωση των ολικών φλαβαν-3-ολών (290 ± 16 mg/l κατεχίνης) ήταν υπερπολλαπλάσια της συγκέντρωσης ολικών φλαβονολών και 209

211 κινναμικών παραγώγων στο φρέσκο κρασί (16.3 ± 0.9 mg/l ισοδυνάμων κερκετίνης και 14.7 ± 0.9 mg/l ισοδυνάμων καφεϊκού οξέος, αντίστοιχα) είναι πιθανόν οι πρώτες να αποτελούν τους κύριους συμπαράγοντες στο κρασί. Η προσθήκη των συμπαραγόντων σε όλες τις περιπτώσεις δεν επηρέασε σημαντικά τις πολυμερισμένες ανθοκυάνες, ενώ παρατηρήθηκε μία αύξηση των συμπλοκοποιημένων σε βάρος των μονομερών ανθοκυανών (Εικ. 66). Πιο συγκεκριμένα, οι μονομερείς ανθοκυάνες μετρήθηκαν ίσες με 39% στο RosW, 37% στο EsW και 36% στο EocW. Τα αντίστοιχα ποσοστά για τις συμπλοκοποιημένες ήταν 34% για το RosW, 35% για το EsW και 36% για το EocW. Οι μεταβολές αυτές ήταν σημαντικές σε σύγκριση με το μάρτυρα, ενώ δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ RosW, EsW και EocW. Οι προστιθέμενοι συμπαράγοντες και στις τρεις περιπτώσεις ήταν σε αντίστοιχες συγκεντρώσεις αλλά η συγκέντρωση του ροσμαρινικού οξέος στα δείγματα με εκχύλισμα από ρίγανη ή θρούμπι ήταν πολύ μικρότερη από το δείγμα με καθαρό ροσμαρινικό οξύ. Επομένως, η υπόθεση ότι τα σύνθετα φαινολικά οξέα, λιθοσπερμικό και σαλβιανολικό εμφανίζουν δράση συμπαραγόντων, αντίστοιχη με αυτή του ροσμαρινικού φαίνεται να ευσταθεί. Επί πλέον, η συμπλοκοποίηση που παρατηρήθηκε δεν μπορεί να αποδοθεί εξ ολοκλήρου στα κινναμικά οξέα των εκχυλισμάτων, παρά εν μέρει και στο φορτίο των φλαβονών και φλαβονολών, που έχουν αναφερθεί ως ισχυροί συμπαράγοντες (Rustioni et al., 2012 & Boulton, 2001). Η συγκέντρωσή τους ήταν σίγουρα σημαντικά μικρότερη από ότι των φαινολικών οξέων και η συνεισφορά τους στο φαινόμενο του σχηματισμού των εγχρώμων συμπλόκων αναμένεται να είναι αντίστοιχα μικρή Η επίδραση στο χρώμα του φρέσκου κρασιού Η δημιουργία εγχρώμων συμπλόκων των ανθοκυανών οδηγεί σε μεταβολή του χρώματος των φρέσκων κόκκινων κρασιών. Η μεταβολή αυτή προκαλείται μέσω της αύξησης του μέγιστου απορρόφησης του κρασιού κατά 5-20 nm (βαθυχρωμικό φαινόμενο), ενώ ταυτόχρονα αυξάνεται και κατά απόλυτη τιμή η απορρόφηση στο νέο λmax (αυξοχρωμικό φαινόμενο). Η στερεοχημική διάταξη των ανθοκυανών στο χώρο κατά τη δημιουργία των συμπλόκων τους, θυμίζει «σάντουιτς», δυσχεραίνοντας την πρόσβαση του νερού και προφυλάσσοντας τη χρωμοφόρο ομάδα του φλαβυλίου, 210

212 με σκοπό να περιοριστεί ο σχηματισμός των υδρογονωμένων άχρωμων μορφών του μορίου (χαλκόνη ή ψευδοβάση). Με αυτό τον τρόπο το φαινόμενου του σχηματισμού των έγχρωμων συμπλόκων, ενισχύει το ολικό χρώμα στα διαλύματα αυτών των μορίων και οι μετρήσεις αποκλίνουν από τις θεωρητικές προβλέψεις με βάση τη συγκέντρωση και το ph (González-Manzano et al., 2009, He et al., 2012, Jackson, 2008). Δεδομένου ότι όλοι οι προστιθέμενοι συμπαράγοντες στα RosW, EsW και EocW, δεν απορροφούν στα 520 nm, ο μόνος λόγος να παρατηρηθούν αποκλίσεις από το μάρτυρα στο συγκεκριμένο μήκος κύματος, είναι το φαινόμενο του σχηματισμού των έγχρωμων συμπλόκων. Πράγματι οι μετρήσεις στα δείγματα του χρόνου μηδέν, έδειξαν σημαντικές αποκλίσεις των Α520 μεταξύ RosW, EsW, EocW και του μάρτυρα (Εικ. 67). Η απορρόφηση για το μάρτυρα ήταν μονάδες, ενώ οι αντίστοιχες απορροφήσεις για τα δείγματα όπου είχαν προστεθεί συμπαράγοντες ήταν για το RosW και για τα EsW και EocW. Αντίστοιχη τάση εμφάνισαν και οι δείκτες ολικού χρώματος (CI). Το CI για το μάρτυρα μετρήθηκε ίσο με μονάδες απορρόφησης, ενώ για το RosW ήταν 0.608, για το EsW και για το EocW Η επεξεργασία των μετρήσεων με το τεστ πολλαπλής κατεύθυνσης του Duncan (p<0.05) επέδειξε σημαντικές διαφορές όχι μόνο μεταξύ μάρτυρα και δειγμάτων με προστεθειμένους συμπαράγοντες, αλλά και του RosW σε σχέση με τα EocW και EsW. Το γεγονός ότι το αυξοχρωμικό φαινόμενο εκδηλώνεται σε μεγαλύτερο βαθμό (ειδικά στα 520 nm) στα δείγματα όπου έχουν προστεθεί τα εκχυλίσματα των αρωματικών φυτών, πρέπει να αποδοθεί στα φύση των διαφορετικών συμπαραγόντων μεταξύ των δειγμάτων. Οι Gómez-Míguez et al. (2006) αναφέρουν ότι το φαινόμενο του σχηματισμού των έγχρωμων συμπλόκων εξαρτάται από τη φύση του συμπαράγοντα και ότι οι φλαβονόλες είναι οι καλύτεροι συμπαράγοντες του κόκκινου κρασιού, λόγο της επίπεδης δομής του μορίου τους, που του επιτρέπει να διατάσσεται σε πολύ κοντινή απόσταση με τις ανθοκυάνες, συντελώντας στην αύξηση της απορρόφησης από 45 55% σε ισομοριακά μείγματα φλαβονολών και 3-γλυκοζίτη της μαλβιδίνης. Σύμφωνα με τα παραπάνω, όσο μικρή και αν είναι η περιεκτικότητα φλαβονών/φλαβονολών στα EsW και EocW, η συνεισφορά τους στη μεταβολή του χρώματος μπορεί να είναι σημαντική. 211

213 Εικ. 67: Η επίδραση της προσθήκης των συμπαραγόντων στις χρωματικές παραμέτρους του φρέσκου κρασιού. CW: μάρτυρας, RosW, EsW, EocW: δείγματα με προσθήκη ροσμαρινικού οξέος, εκχυλίσματος από θρούμπι, και εκχυλίσαμτος από ρίγανη, αντίστοιχα. Ο προσδιορισμός της χρωματικής παραμέτρου της απόχρωσης στα δείγματα με τους προστεθειμένους συμπαράγοντες, αλλά και η αντίστοιχη εκατοστιαία απόκλιση από τον μάρτυρα (%ΔΤ) ήταν ενδεικτική της διαφοροποίησης αυτής, EsW και EocW από το RosW. Η %ΔΤ για τα δύο πρώτα ήταν 5.0% και 18.8% αντίστοιχα, ενώ για το RosW η τιμή της ήταν αρνητική (-7.8%). Αυτό συνέβη διότι στο RosW το A520 αυξήθηκε ενώ ταυτόχρονα το A420 παρέμεινε σταθερό, γεγονός χαρακτηριστικό για το φαινόμενο σχηματισμού των έγχρωμων συμπλόκων. Από την άλλη μεριά, στα δείγματα όπου έγινε η προσθήκη των εκχυλισμάτων των αρωματικών φυτών, η απορρόφηση φλαβονών και φλαβονολών, οι οποίες έχουν μέγιστο κοντά στα 360 nm, φαίνεται να έχει σημαντική επίδραση στο A420 και αυτός είναι ο λόγος της αύξησης της παραμέτρου της απόχρωσης. Με άλλα λόγια, η θετική μεταβολή της %ΔΤ αποδίδεται στο κίτρινο χρώμα των φλαβονοειδών και είναι άσχετη με το φαινόμενο σχηματισμού των συμπλόκων. Συνεπακόλουθα, η υψηλότερη αύξηση της παραμέτρου του ολικού χρώματος (CI) στα αντίστοιχα δείγματα αποδίδεται στον ίδιο ακριβώς λόγο. 212

214 3.2 Επίδραση της προσθήκης των συμπαραγόντων κατά την αποθήκευση του κρασιού Μεταβολές στις ανθοκυάνες του κρασιού κατά την αποθήκευση Η μεταβολή των ανθοκυανών και του χρώματος του κρασιού, μελετήθηκε κατά την αποθήκευση των δειγμάτων για χρονικό διάστημα 6 μηνών. Το διάστημα αυτό επιλέχθηκε με βάση τη φθίνουσα συγκέντρωση των ελεύθερων ανθοκυανών του κρασιού, που οφείλεται όπως περιγράφεται στο αντίστοιχο κεφάλαιο, στον πολυμερισμό τους μέσω αντιδράσεων συμπύκνωσης με τις φλαβαν-3-όλες (Figueiredo-González et al., 2013b). Η ποσοτικοποίηση των ελεύθερων ανθοκυανών χρωματογραφικά, ήταν ενδεικτική αυτού του γεγονότος. Η αρχική περιεκτικότητα αυτών στο μάρτυρα ήταν ± 4.6 mg/l, ενώ με την πάροδο χρονικού διαστήματος 6 μηνών, η περιεκτικότητά τους ανήλθε μόλις σε 21.2 ± 0.3 mg/l. Την ίδια στιγμή, το ολικό φαινολικό φορτίο παρέμενε σταθερό καθόλη τη διάρκεια της αποθήκευσης, μιας και οι αντιδράσεις που ελάμβαναν χώρα ήταν κυρίως οι προαναφερθείσες αντιδράσεις πολυμερισμού, οι οποίες έχουν πολύ μικρή επίδραση στο ολικό αριθμό των υδροξυλομάδων όπως αυτός μετριέται με τη μέθοδο Folin- Ciocalteu. Τυχόν αντιδράσεις οξείδωσης ή υποβάθμισης που συνέβησαν κατά την αποθήκευση, ποσοτικά τουλάχιστον θεωρούνται αμελητέες σε σύγκριση με τις αντιδράσεις πολυμερισμού. Η μέτρηση των ολικών φλαβαν-3-ολών με τη μέθοδο DMACA, ήταν επίσης ενδεικτική του πολυμερισμού ανθοκυανών - φλαβαν-3-ολών, για τους λόγους που αναφέρονται στο Κεφ Με την πάροδο 6 μηνών αποθήκευσης, ο δείκτης DMACA ήταν ελαττωμένος για όλες τις σειρές δειγμάτων (Εικ. 68), γεγονός που μεταφράζεται στις λιγότερες ελεύθερες C8 θέσεις, λόγο των αντιδράσεων πολυμερισμού. Οι αντίστοιχες τιμές ήταν 213 ± 4 ισοδύναμα κατεχίνης για το μάρτυρα, 210 ± 5 για το RosW, 213 ± 3 για το EsW, και 213 ± 7 για το EocW, ενώ οι αντίστοιχες τιμές αμέσως μετά την προσθήκη των συμπαραγόντων, στο χρόνο μηδέν της αποθήκευσης ήταν: 290 ± 16, 286 ± 2, 278 ± 4, 282 ± 2 mg/l. 213

215 Εικ. 68: Η ποσοτικοποίηση των φλαβαν-3-ολών με DMACA σε ισοδύναμα κατεχίνης κατά την αποθήκευση. CW: μάρτυρας, RosW, EsW, EocW: δείγματα με προσθήκη ροσμαρινικού οξέος, εκχυλίσματος από θρούμπι, και εκχυλίσαμτος από ρίγανη, αντίστοιχα. Η μεταβολή των ανθοκυανών κατά την αποθήκευση για όλες τις σειρές δειγμάτων, φαίνεται στην Εικ. 69. Είναι διακριτή η μείωση του ποσοστού (% των ολικών) συμπλοκοποιημένων και μονομερών ανθοκυανών, με ταυτόχρονη αύξηση του ποσοστού των πολυμερισμένων ανθοκυανών σε όλες τις περιπτώσεις. Αντίστοιχες παρατηρήσεις έχουν γίνει από τους Dobrei et al. (2010) και Hermosín Gutiérrez et al. (2005). Οι διαφορές μεταξύ μάρτυρα και δειγμάτων με προστειθέμενους συμπαράγοντες, όσον αφορά σε μονομερείς και συμπλοκοποιημένες ανθοκυάνες, ήταν σημαντικές (p<0.5) για τους πρώτους 3 μήνες της αποθήκευσης. Έπειτα από 6 μήνες αποθήκευσης, τα ποσοστά των συμπλοκοποιημένων ανθοκυανών στα δείγματα δεν διέφεραν σημαντικά (8 ± 2% στο CW, 11 ± 1% στο RosW, 8 ± 2% στο EsW και 7 ± 5% στο EocW). Η μείωση που παρατηρήθηκε είναι σε συμφωνία με τα αποτελέσματα των Hermosín Gutiérrez et al. (2005), που αναφέρουν ότι σε Cabernet Sauvignon, το ποσοστό των συμπλοκοποιημένων ανθοκυανών μειώθηκε κατά 25 43% σε χρονικό διάστημα 3 μηνών αποθήκευσης, ενώ σε Syrah η αντίστοιχη μείωση ήταν 34 44%. Αντίθετα, οι Dobrei et al. (2010), αναφέρουν μείωση μόλις 3% των συμπλοκοποιημένων ανθοκυανών κατά την αποθήκευση Merlot για χρονικό διάστημα αποθήκευσης 4 μηνών (από 35% σε 32%). Τα αντικρουόμενα αυτά 214

216 Εικ. 69: Η εξέλιξη των συμπλοκοποιημένων (Α), μονομερών (Β) και πολυμερισμένων (Γ) ανθοκυανών, κατά την αποθήκευση του κρασιού. CW: μάρτυρας, RosW, EsW, EocW: δείγματα με προσθήκη ροσμαρινικού οξέος, εκχυλίσματος από θρούμπι, και εκχυλίσαμτος από ρίγανη, αντίστοιχα. 215

217 αποτελέσματα δείχνουν το ότι η πορεία των ανθοκυανών επηρεάζεται από παραμέτρους όπως είναι οι συνθήκες της αποθήκευσης/παλαίωσης και η περιεκτικότητα του κρασιού σε προκυανιδίνες που μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένους ή μειωμένους ρυθμούς πολυμερισμού. Οι πολυμερισμένες ανθοκυάνες σε όλα τα δείγματα, μετά από 6 μήνες αποθήκευσης αποτελούσαν περισσότερο από 80% των ολικών ανθοκυανών. Η επεξεργασία των αποτελεσμάτων με ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης επέτρεψε τον υπολογισμό του ρυθμού των αντιδράσεων πολυμερισμού, με προσαρμογή πολύ ικανοποιητική (R 2 > 0.98). Ο ρυθμός για το μάρτυρα προσδιορίστηκε σε 9.7 ± 0.3% αύξηση ανά μήνα, ενώ οι αντίστοιχοι ρυθμοί για τις υπόλοιπες σειρές δειγμάτων ήταν: 9.9 ± 0.6% για το RosW, 9.6 ± 0.5% για το EsW και 8.8 ± 0.7% για το EocW. Σημαντικές διαφορές μεταξύ των σειρών δεν ανιχνεύτηκαν, με άλλα λόγια το αυξημένο ποσοστό των συμπλοκοποιημένων ανθοκυανών, στα δείγματα με τους προστεθειμένους συμπαράγοντες, δεν φάνηκε ικανό να επηρεάσει την εξέλιξη των πολυμερισμένων ανθοκυανών ποσοτικά. Η ερμηνεία του φαινομένου πρέπει να αναζητηθεί στις αντιδράσεις στις οποίες συμμετέχουν οι ανθοκάνες, όπως αναλύεται στη συνέχεια: Κατά την αποθήκευση του κρασιού, μονομερείς και συμπλοκοποιημένες ανθοκυάνες βρίσκονται σε χημική ισορροπία (Rustioni et al., 2012): ΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜίςς ααααααααααααάνννννν + ΣΣΣΣΣΣΣΣΣΣΣΣάγγγγγγγγγγγγ ΣΣΣΣΣΣΣΣΣΣΣΣΣΣΣΣΣΣΣΣΣΣένννννν ααννθθθθθθθθάνννννν Επιπλέον οι μονομερείς ανθοκυάνες αντιδρούν προς σχηματισμό έγχρωμων πολυμερών με τις προκυανιδίνες: ΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜίςς ααααααααααααάνννννν + ΠΠΠΠΠΠΠΠΠΠΠΠΠΠΠΠΠΠΠΠΠΠΠΠΠΠίνννννν Έγγγγγγγγγγγγ ππππππππππππππή Η μείωση της συγκέντρωσης των μονομερών ανθοκυανών λόγο των αντιδράσεων πολυμερισμού, φαίνεται να μετατοπίζει τη χημική ισορροπία μεταξύ μονομερών και συμπλοκοποιημένων ανθοκυανών, εκκινώντας την αποδόμηση των τελευταίων προκειμένου να επανέλθει και πάλι η ισορροπία. Παρόλα αυτά, λόγω του ότι οι αντιδράσεις πολυμερισμού είναι μονόδρομες και εξελίσσονται με πολύ πιο αργούς 216

218 ρυθμούς σε σχέση με τον σχηματισμό/αποδόμηση των εγχρώμων συμπλόκων που γίνεται σχεδόν ακαριαία, η αρχικώς αυξημένη συγκέντρωση των συμπλοκοποιημένων ανθοκυανών, δεν φαίνεται ικανή να αλλάξει τον ρυθμό των αντιδράσεων πολυμερισμού Επίδραση στο χρώμα του κρασιού Ο δείκτης ολικού χρώματος του μάρτυρα αυξήθηκε από σε κατά τη διάρκεια των 6 μηνών αποθήκευσης. Η μεταβολή αυτή του χρώματος αποδίδεται σε απελευθέρωση μονομερών ανθοκυανών από το θειώδη ανυδρίτη, όπως αναφέρεται και στο Κεφ. 3.6, αλλά εν μέρει και στις αντιδράσεις μεταξύ ανθοκυανών και φλαβαν-3-ολών. Οι 3 μηχανισμοί των αντιδράσεων, όπως έχει ήδη αναφερθεί είναι οι εξής: (1) αντιδράσεις ανθοκυανών (Α + ) και φλαβαν-3-ολών (Φ - ), οδηγούν στο σχηματισμό μορίων Α + -Φ -. Τα μόρια αυτά είναι άχρωμα και γίνονται κόκκινα μόνο όταν οξειδώνονται. (2) αντιδράσεις μεταξύ φλαβαν-3-ολών (Φ + ) και ανθοκυανών (Α - ) που σχηματίζουν μόρια Φ + -Α -. Σε αυτή την περίπτωση οι ανθοκυάνες αντιδρούν στη μορφή της ψευδοβάσης (καρβινόλη) και τα σχηματιζόμενα μόρια είναι θεωρητικά άχρωμα, αλλά στην πραγματικότητα αφυδατώνονται ακαριαία στη σταθερότερη έγχρωμη μορφή τους. Η αντίδραση αυτή δεν έχει σχέση με τα οξειδωτικά φαινόμενα. (3) αντιδράσεις οι οποίες γίνονται παρουσία ακεταλδεΰδης και προφανώς για να εκκινήσουν απαιτείται η αργή οξείδωση της αιθανόλης προς ακεταλδεΰδη. Εφόσον τα δείγματα του κρασιού, στη συγκεκριμένη περίπτωση αποθηκεύτηκαν σε τροποποιημένη ατμόσφαιρα, τα φαινόμενα χημικής οξείδωσης αποφεύχθηκαν, και συνεπώς ο σχηματισμός των δομών Φ + -Α - μέσω του δεύτερου μηχανισμού υπερίσχυσε των άλλων δύο. Τα σχηματιζόμενα μόρια μετά την αφυδάτωσή τους δίνουν έγχρωμες δομές φλαβυλίου, οι οποίες ενισχύουν το χρώμα του κρασιού (Hayasaka & Kennedy, 2003, Jackson, 2008, Ribéreau-Gayon et al., 2006). Οι μεταβολές των χρωματικών παραμέτρων (ΔΑ520, ΔCI, ΔT) για τα RosW, EsW και EocW έναντι του μάρτυρα παρουσιάζονται στην Εικ. 70. Τα ΔΑ520 και ΔCI φαίνεται να έχουν την ίδια τάση, γεγονός που αποδίδεται στην υψηλή % συνεισφορά του Α520 στο φρέσκο κρασί. Κατά τους 3 πρώτους μήνες της αποθήκευσης, η θετική απόκλιση για τα RosW, EsW και EocW είναι εμφανής, με τα EsW και EocW να εμφανίζουν τις 217

219 υψηλότερες τιμές, γεγονός που συμφωνεί με τα αποτελέσματα που παρουσιάστηκαν στο 4.1. Τα αποτελέσματα αυτά, αντικατοπτρίζουν τη σημαντική συνεισφορά των συμπλοκοποιημένων ανθοκυανών στα δείγματα όπου έχουν προστεθεί συμπαράγοντες, και για το χρονικό διάστημα όπου οι % πολυμερισμένες ανθοκυάνες συνεισφέρουν σε ποσοστό μικρότερο του 60% στο ολικό χρώμα του δείγματος. Παρόλα αυτά η τάση για τα ΔΑ520 και ΔCI είναι πτωτική και μετά από χρονικό διάστημα 6 μηνών αποθήκευσης, οι αρχική ενίσχυση του χρώματος (θετική απόκλιση) είναι σχεδόν μηδαμινή. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων δεν έδειξε σημαντικές διαφορές μεταξύ μάρτυρα και δειγμάτων με πρόσθετους συμπαράγοντες όσον αφορά στις παραμέτρους του ολικού χρώματος και του Α520, μετά την πάροδο των 3 πρώτων μηνών. Από την άλλη μεριά, η παράμετρος ΔΤ παρέμεινε πρακτικά σταθερή καθόλη τη διάρκεια της αποθήκευσης για τα δείγματα όπου είχαν προστεθεί τα εκχυλίσματα των αρωματικών φυτών. Οι αντίστοιχες τιμές με την πάροδο 6 μηνών ήταν: 4.4% για το EsW και 13.2% για το EocW, ενώ η αρνητική απόκλιση για το RosW ήταν κοντά στο μηδέν (-3.7%). 218

220 Εικ. 70: Η εκατοστιαία απόκλιση των Α 520 (Α), CI (Β) και Τ (Γ) των δειγμάτων όπου έχουν προστεθεί συμπαράγοντες, σε σχέση με το μάρτυρα (CW). RosW, EsW, EocW: δείγματα με προσθήκη ροσμαρινικού οξέος, εκχυλίσματος από θρούμπι, και εκχυλίσαμτος από ρίγανη, αντίστοιχα. 219

221 Συμπεράσματα Η μελέτη του φαινολικού προφίλ ελληνικών κρασιών με χρήση HPLC-DAD-ESI- MS/MS επέτρεψε την ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση περισσοτέρων από 30 φαινολικών μορίων. Τα φαινολικά αυτά μόρια ανήκουν στις ομάδες των φαινολικών οξέων (κουταρικό & καφταρικό οξύ), φλαβονολών (κερκετίνη, μυρισετίνη, κ.ά.), φλαβαν-3-ολών (κατεχίνη) και ανθοκυανών (μαλβιδίνη, κ.ά.). Διαφορές ανιχνεύτηκαν μεταξύ των μελετώμενων ποικιλιών, ενώ κάποια φαινολικά συστατικά (λαρικιτρίνη, συρινγκετίνη, ισοραμνετίνη) ανιχνεύτηκαν για πρώτη φορά σε ελληνικά κρασιά. Επιπλέον για τα μελετώμενα ερυθρά κρασιά, ο υπολογισμός των λόγων των περιεκτικοτήτων κάποιων χαρακτηριστικών συνόλων υποκατεστημένων ανθοκυανών (π.χ. Σγλυκοζυλιωμένων/Σακετυλιωμένων) φάνηκε ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένα βαθμό τη διάκριση των ποικιλιών. Η μελέτη της εκχύλισης των φαινολικών συστατικών του κρασιού κατά τη διάρκεια της οινοποίησης, έδειξε ότι ανθοκυάνες, κινναμικά παράγωγα και γλυκοζίτες των φλαβονολών εκχυλίζονται άμεσα από τις πρώτες κιόλας ημέρες τις οινοποίησης. Αντίθετα η εκχύλιση των φλαβ-3-ολών εμφανίζει μια φάση υστέρησης, η οποία οφείλεται στη μεγαλύτερη διαλυτότητα αυτών των μορίων σε αιθανολικά διαλύματα καθώς και στο ότι ευρίσκονται ως επί το πλείστον στα γίγαρτα από όπου η εκχύλιση είναι σχετικά πιο αργή σε σχέση με τα συστατικά των εξωτερικών στρωμάτων του φλοιού. Κατά τη διάρκεια της διεργασίας της κρυοεκχύλισης, οπότε η αλκοολική ζύμωση είναι πολύ περιορισμένη λόγω χαμηλής θερμοκρασίας, αυξημένο ρυθμό διάλυσης παρουσίασαν τα πιο πολικά και υδατοδιαλυτά φαινολικά συστατικά, ενώ η εκχύλιση των φλαβαν-3-ολών σχεδόν αναστέλλεται. H διάρκεια της εκχύλισης παράλληλα με τη ζύμωση πρέπει κάθε φορά να αριστοποιείται ανάλογα με το κρασί που πρόκειται να παραχθεί. Όσο επιμηκύνεται η διάρκεια παραμονής των στεμφύλων σε επαφή με το γλεύκος, τα σάκχαρα μετατρέπονται σταδιακά σε αιθανόλη, και εκχυλίζονται όλο και περισσότερες φλαβαν-3-όλες. Επομένως, κρυοεκχύλιση ή μικρής διάρκειας εκχύλιση σε συνήθη θερμοκρασία ζύμωσης επιτρέπει την ανάκτηση υψηλού ανθοκυανικού φορτίου και χαμηλή περιεκτικότητα σε προκυανιδίνες, αφού η ζύμωση 220

222 είναι ακόμη στο αρχικό στάδιο και η συγκέντρωση της αιθανόλης δεν είναι υψηλή. Επιπλέον, η χρήση πηκτινολυτικών ενζύμων φαίνεται ότι ενισχύει την ποσοτική εκχύλιση όλων των πολυφαινολών του σταφυλιού κατά την οινοποίηση. Στις λευκές οινοποιήσεις, η προζυμωτική κρυοεκχύλιση μπορεί να ενισχύσει το πολύ φτωχό φαινολικό προφίλ που παρουσιάζουν τα λευκά κρασιά. Η μελέτη της μεταβολής των ιχνοστοιχείων κατά την οινοποίηση σταφυλιών των ποικιλίων Merlot και Syrah, επέδειξε ότι η αύξηση των φαινολικών συστατικών (ανθοκυάνες, φλαβονόλες) κατά τη διεργασία της εκχύλισης, συνοδεύτηκε από την άμεση μείωση του περιεχόμενου χαλκού. Το γεγονός αυτό αποδόθηκε σε αντιδράσεις συμπλοκοποίησης μεταξύ πολυφαινολών και ιχνοστοιχείων. Κατά την αποθήκευση των κρασιών, για χρονικό διάστημα μεγαλύτερο του ενός έτους, υπό διαφορετικές τροποποιημένες ατμόσφαιρες, το ολικό φαινολικό φορτίο παρέμεινε πρακτικά σταθερό, ενώ οι ποιοτικές μεταβολές του αποδόθηκαν ως επί το πλείστον σε αντιδράσεις πολυμερισμού (ανθοκυανών φλαβαν-3-ολών). Ακόμα και τα δείγματα που αποθηκεύτηκαν σε λεπτό στρώμα ατμοσφαιρικού αέρα, διατήρησαν σε χρονικό διάστημα ενός έτους, περισσότερο από το 80% της αρχικής συγκέντρωσης των φαινολικών συστατικών τους, γεγονός ενδεικτικό του μικρού εύρους των οξειδωτικών δράσεων κατά την αποθήκευση. Η συγκέντρωση των φλαβονολών δεν επέδειξε σημαντικές διαφορές συναρτήσει του χρόνου ή της ατμόσφαιρας αποθήκευσης. Από την άλλη, παρατηρήθηκε μία σταθερή τάση μείωσης των γλυκοζιλιωμένων μορίων με ταυτόχρονη αύξηση των αντίστοιχων αγλυκόνων, η οποία και αποδόθηκε σε ενζυμικές αντιδράσεις υδρόλυσης καταλυόμενες από ένζυμα όπως η β-γλυκοζιδάση, που απαντώνται στα σκευάσματα που χρησιμοποιούνται για την οινοποίηση. Ούτε τα υδροξυκινναμικά παράγωγα εμφάνισαν σημαντικές ποσοτικές μεταβολές κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης, όσον αφορά το ολικό τους φορτίο. Παρόλα αυτά η χρωματογραφική ανάλυση επέδειξε την υδρόλυση των μορίων των τρυγικών εστέρων προς τα αντίστοιχα οξέα (καφεϊκό και p-κουμαρικό). Ο σχηματισμός των οξέων αυτών έφτασε σε ποσοστά άνω του 50% του αρχικού φορτίου των τρυγικών εστέρων και παρατηρήθηκε μόνο κατά την αποθήκευση των ερυθρών ποικιλιών. Η συγκέντρωση των ελεύθερων ανθοκυανών υποδεκαπλασιάστηκε σε χρονικό διάστημα μικρότερο του ενός έτους. Η μείωση αυτή είναι ενδεικτική της μετατροπής 221

223 των μορίων σε πολυμερή έγρωμα σύμπλοκα, μέσω αντιδράσεων προσθήκης με τις φλαβαν-3-όλες (ολιγομερή κατεχίνης, προκυανιδίνες κλπ.). Η μείωση ακολούθησε κινητική πρώτης τάξης με τις σταθερές του ρυθμού (k) να είναι υψηλότερες για τα δείγματα που αποθηκεύτηκαν παρουσία λεπτού στώματος ατμοσφαιρικού αέρα, παρότι τα συγκεκριμένα δείγματα δεν προσαρμόστηκαν εξίσου ικανοποιητικά στο μοντέλο σε σχέση με τα δείγματα που αποθηκεύτηκαν σε τροποποιημένη ατμόσφαιρα (N2, CO2, μίγμα). Όσον αφορά τις χρωματικές μεταβολές κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης, το ολικό χρώμα (CI) και η λαμπρότητα (da%) εμφάνισαν πτωτική τάση, ενώ η τελευταία συσχετίστηκε ικανοποιητικά με τη συγκέντρωση των ελεύθερων ανθοκυανών. Αντίθετα η παράμετρος της απόχρωσης (Τ) αυξήθηκε κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης των κόκκινων κρασιών. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων με ANOVA δεν εντόπισε σημαντικές διαφορές όσον αφορά την εξέλιξη των χρωματικών παραμέτρων κατά την αποθήκευση σε διαφορετικές τροποποιημένες ατμόσφαιρες. Τέλος μελετήθηκε το φαινόμενο της συνέργειας χρώματος και σχηματισμού εγχρώμων συμπλόκων (copigmentation) μέσω προσθήκης φαινολικών συστατικών από αρωματικά φυτά της οικογένειας Lamiaceae σε κόκκινο κρασί. Το ροσμαρινικό οξύ και τα αιθανολικά εκχυλίσματα από τη ρίγανη και το θρούμπι, που ήταν πλούσια σε κινναμικά οξέα, αποδείχτηκαν ικανά να προάγουν το φαινόμενο σχηματισμού εγχρώμων συμπλόκων με τις ανθοκυάνες και να ενισχύσουν το χρώμα του φρέσκου Merlot. Η αύξηση του κόκκινου χρώματος, ήταν υψηλότερη με την προσθήκη των εκχυλισμάτων των φυτών σε σχέση με την προσθήκη πρότυπου ροσματινικού οξέος, γεγονός που αποδόθηκε στα φλαβονοειδή που περιέχονταν στα εκχυλίσματα, πέραν των κινναμικών οξέων. Στα φλαβονοειδή αποδόθηκε επιπλέον, η αύξηση της παραμέτρου της απόχρωσης, η οποία παρατηρήθηκε όταν προστέθηκαν τα εκχυλίσματα στο κρασί, μιας και είναι κίτρινες ενώσεις με μέγιστα απορρόφησης κοντά στα 420 nm. Κατά την αποθήκευση του κρασιού, παρατηρήθηκε μείωση των μονομερών και συμπλοκοποιημένων ανθοκυανών, με ταυτόχρονη αύξηση των πολυμερισμένων, όπως αναμενόταν. Τα δείγματα όπου είχαν προστεθεί συμπαράγοντες, διατήρησαν τα υψηλότερα ποσοστά συμπλοκοποιημένων ανθοκυανών και τις υψηλότερες τιμές 222

224 ολικού χρώματος για χρονικό διάστημα 3 μηνών, ενώ στη συνέχεια οι διαφορές δεν ήταν στατιστικά σημαντικές. Ο ρυθμός αύξησης των πολυμερισμένων ανθοκυανών, ήταν ο ίδιος για όλες τις σειρές δειγμάτων, γεγονός που δείχνει ότι η αρχικά υψηλότερη συγκέντρωση συμπαραγόντων δεν κατάφερε να τον μεταβάλει για το μελετώμενο χρονικό διάστημα. 223

225 Βιβλιογραφία Álvarez, I., Aleixandre, J. L., García, M. J., & Lizama, V. (2006). Impact of prefermentative maceration on the phenolic and volatile compounds in Monastrell red wines. Analytica Chimica Acta, 563(1), Álvarez, I., Aleixandre, J. L., García, M. J., Lizama, V. & Aleixandre-Tudó, J. L. (2009). Effect of the prefermentative addition of copigments on the polyphenolic composition of Tempranillo wines after malolactic fermentation. European Food Research and Technology, 228, Arnous, A., Makris, D. P., & Kefalas, P. (2001). Effect of principal polyphenolic components in relation to antioxidant characteristics of aged red wines. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, Auw, J. M., Blanco, V., O'keefe, S. F., & Sims, C. A. (1996). Effect of processing on the phenolics and color of Cabernet Sauvignon, Chambourcin, and Noble wines and juices. American Journal of Enology and Viticulture, 47(3), Bai, Y., Song, F., Chen, M., Xing, J., Liu, Z., & Liu, S. (2004). Characterization of the rutin-metal complex by electrospray ionization tandem mass spectrometry. Analytical Sciences, 20, Bakker, J., & Timberlake, C. F. (1997). Isolation, identification, and characterization of new color-stable anthocyanins occurring in some red wines. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45(1), Beltran, G., Novo, M., Rozes, N., Mas, A., & Guillamón, J. M. (2004). Nitrogen catabolite repression in Saccharomyces cerevisiae during wine fermentations. FEMS Yeast Research, 4(6), Bloomfield, D. G., Heatherbell, D. A., & Pour Nikfardjam, M. S. (2003). Effect of p- coumaric acid on the color of red wine. Mitteilungen Klosterneuburg, 53, Fowles, G., & Dickenson, J. (1996). Principles and Practices of Winemaking Roger B. Boulton, Vernon L. Singleton, Linda F. Bisson and Ralph E. Kunkee, 1996 London, Chapman and Hall. Journal of Wine Research, 7(2), Boulton, R. B., Singleton, V. L., Bisson, L. F., & Kunkee, R. E. (1999). Principles and Practices of Winemaking. US: Springer. 224

226 Boulton, R. (2001). The copigmentation of anthocyanins and its role in the color of red wine: a critical review. American Journal of Enology and Viticulture, 52, Buckingham, J., & Munasinghe, V. R. N. (2015). Dictionary of Flavonoids. Boca Raton: CRC Press. Busse-Valverde, N., Gómez-Plaza, E., López-Roca, J. M., Gil-Muñoz, R., & BautistaOrtin, A. B. (2011). The extraction of anthocyanins and proanthocyanidins from grapes to wine during fermentative maceration is affected by the enological technique. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59, Canals, R., Llaudy, M. C., Valls, J., Canals, J. M., & Zamora, F. (2005). Influence of ethanol concentration on the extraction of color and phenolic compounds from the skin and seeds of Tempranillo grapes at different stages of ripening. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53(10), Castaneda-Ovando, A., Pacheco-Hernandez, M., Paez-Hernandez,M., Rodriguez, J. & Galan-Vidal, C. (2009), Chemical studies of anthocyanins: A review, Food Chemistry, 113, Castillo-Muñoz, N., Gómez-Alonso, S., García-Romero, E., & Hermosín-Gutiérrez, I. (2007). Flavonol profiles of Vitis vinifera red grapes and their single-cultivar wines. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55, Castiñeira, M. D. M., Brandt, R., Jakubowski, N., & Andersson, J. T. (2004). Changes of the metal composition in German white wines through the winemaking process. A study of 63 elements by inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, Cejudo-Bastante, M. J., Hermosín-Gutiérrez, I., Castro-Vázquez, L. I., & Pérez- Coello, M. S. (2011). Hyperoxygenation and bottle storage of Chardonnay white wines: Effects on color-related phenolics, volatile composition, and sensory characteristics. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59(8), Cheynier, V. (2006). Flavonoids in wine. In: Flavonoids: Chemistry, Biochemistry and Applications (pp ). Boca Raton: CRC Taylor and Francis Group. Conde, E., Cadahía, E., García-Vallejo, M. C., & Fernández de Simón, B. (1998). Polyphenolic composition of Quercus suber cork from different Spanish provenances. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46(8), Constantí, M., Poblet, M., Arola, L., Mas, A., & Guillamón, J. M. (1997). Analysis of 225

227 yeast populations during alcoholic fermentation in a newly established winery. American Journal of Enology and Viticulture, 48(3), Costantini, A., García-Moruno, E., & Moreno-Arribas, M. V. (2009). Biochemical transformations produced by malolactic fermentation. In: Wine chemistry and biochemistry (pp ). New York: Springer. da Costa, C. T., Horton, D., & Margolis, S. A. (2000). Analysis of anthocyanins in foods by liquid chromatography, liquid chromatography mass spectrometry and capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A, 881(1), Darias-Martín, J., Carrillo, M., Díaz, E. & Boulton, R. B. (2001). Enhancement of red wine colour by pre-fermentation addition of copigments. Food Chemistry, 73, Davis, C. R., Wibowo, D. J., Lee, T. H., & Fleet, G. H. (1986). Growth and metabolism of lactic acid bacteria during and after malolactic fermentation of wines at different ph. Applied and Environmental Microbiology, 51(3), De Santis, D., & Frangipane, M. T. (2010). Effect of prefermentative cold maceration on the aroma and phenolic profiles of a merlot red wine. Italian Journal of Food Science, 22(1), Dell'Agli, M., Buscialà, A., & Bosisio, E. (2004). Vascular effects of wine polyphenols. Cardiovascular Research, 63(4), Delteil, D. (2004). La Macération Préfermentaire à Froid (MPF) des raisins méditerranéens et rhodaniens. Revue des Œnologues, 112, Dobrei, A., Poiana, M. A., Sala, F., Ghita, A., & Gergen, I. (2010). Changes in the chromatic properties of red wines from Vitis vinifera L. cv. Merlot and Pinot Noir during the course of aging in bottle. Journal of Food, Agriculture & Environment, 8, Esparza, I., Salinas, I., Caballero, I., Santamaria, C., Calvo, I., Garcia-Mina, J. M., & Fernandez, J. M. (2004). Evolution of metal and polyphenol content over a 1-year period of vinification: sample fractionation and correlation between metals and anthocyanins. Analytica Chimica Acta, 524, Falconer, R. J., & Hart, A. (2005). MOG removal system makes its mark. The Australian & New Zealand Grapegrower and Winemaker, 501,

228 Fanzone, M., Zamora, F., Jofré, V., Assof, M., Gómez Cordovés, C., & Peña Neira, Á. (2012). Phenolic characterisation of red wines from different grape varieties cultivated in Mendoza province (Argentina). Journal of the Science of Food and Agriculture, 92, Favre, G., Peña-Neira, Á., Baldi, C., Hernández, N., Traverso, S., Gil, G., & González-Neves, G. (2014). Low molecular-weight phenols in Tannat wines made by alternative winemaking procedures. Food Chemistry, 158, Ferrando, M., Guell, C., and Lopez, F. (1998) Industrial wine making: Comparison of must clarifi cation treatments. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46, Ferrarini, R., Celotti, E., Zironi, R., and Buiatti, S. (1995) Recent advances in the progress of fl otation applied to the clarifi cation of grape musts. Journal of Wine Research, 6, Ferreira, V., Peña, C., Escudero, C. L., Fernández, P., and Cacho, J. (1993) Method for the HPLC prefractionation of wine flavour extracts. Part II Sensory aspects. Profiling wine aroma. In: Progress in Food Fermentation (Vol. 2, pp ). Valencia: IATA, CSIC. Ferreira, V., Jarauta, I., & Cacho, J. (2006). Physicochemical model to interpret the kinetics of aroma extraction during wine aging in wood. Model limitations suggest the necessary existence of biochemical processes. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54(8), Figueiredo-González, M., Martínez-Carballo, E., Cancho-Grande, B., Santiago, J. L., Martínez, M. C., & Simal-Gándara, J. (2012). Pattern recognition of three Vitis vinifera L. red grapes varieties based on anthocyanin and flavonol profiles, with correlations between their biosynthesis pathways. Food Chemistry, 130, Figueiredo-González, M., Cancho-Grande, B., & Simal-Gándara, J. (2013). Garnacha Tintorera-based sweet wines: Chromatic properties and global phenolic composition by means of UV Vis spectrophotometry. Food Chemistry, 140, Figueiredo-González, M., Cancho-Grande, B., & Simal-Gándara, J. (2013b). Evolution of colour and phenolic compounds during Garnacha Tintorera grape raisining. Food Chemistry, 141, Figueiredo-González, M., Regueiro, J., Cancho-Grande, B., & Simal-Gándara, J. 227

229 (2014b). Garnacha Tintorera-based sweet wines: Detailed phenolic composition by HPLC/DAD ESI/MS analysis. Food Chemistry, 143, Galani-Nikolakaki, S., Kallithrakas-Kontos, N., & Katsanos, A. A. (2002). Trace element analysis of Cretan wines and wine products. Science of the Total Environment, 285, García-Beneytez, E., Revilla, E., & Cabello, F. (2002). Anthocyanin pattern of several red grape cultivars and wines made from them. European Food Research and Technology, 215(1), Ghidossi, R., Poupot, C., Thibon, C., Pons, A., Darriet, P., Riquier, L.,... & Peuchot, M. M. (2012). The influence of packaging on wine conservation. Food Control, 23(2), Gil, J. V., Manzanares, P., Genovés, S., Vallés, S., & González-Candelas, L. (2005). Over-production of the major exoglucanase of Saccharomyces cerevisiae leads to an increase in the aroma of wine. International Journal of Food Microbiology, 103, Girard, B., Yuksel, D., Cliff, M. A., Delaquis, P., & Reynolds, A. G. (2001). Vinification effects on the sensory, colour and GC profiles of Pinot noir wines from British Columbia. Food Research International, 34(6), Girard, B., Kopp, T. G., Reynolds, A. G., & Cliff, M. (1997). Influence of vinification treatments on aroma constituents and sensory descriptors of Pinot noir wines. American Journal of Enology and Viticulture, 48(2), Glories, Y. (1984). The colour of red wines. Part 2. Measurement, origin and interpretation. Connaissance de la Vigne et du Vin, 18, Gómez-Míguez, J., Gonzalez-Miret, L., Hernanz, D., Fernandez, A., Vicario, I. & Heredia, F. J. (2007). Effects of prefermentative skin contact conditions on colour and phenolic content of white wines. Journal of Food Engineering, 78, Gómez-Míguez, M., González-Manzano, S., Escribano-Bailón, M. T., Heredia, F. J. & Santos-Buelga, C. (2006). Influence of different phenolic copigments on the color of malvidin 3-glucoside. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, Gómez-Plaza, E., Gil-Muñoz, R., López-Roca, J. M., Martínez-Cutillas, A., & Fernández-Fernández, J. I. (2001). Phenolic compounds and color stability of red wines: Effect of skin maceration time. American Journal of Enology and 228

230 Viticulture, 52(3), González-Manzano, S., Dueñas, M., Rivas-Gonzalo, J. C., Escribano-Bailón, M. T., & Santos-Buelga, C. (2009). Studies on the copigmentation between anthocyanins and flavan-3-ols and their influence in the colour expression of red wine. Food Chemistry, 114, González-Manzano, S., Santos-Buelga, C., Dueñas, M., Rivas-Gonzalo, J.C. & Escribano-Bailón, T. (2008). Colour implications of self-association processes of wine anthocyanins. European Food Research and Technology, 226, González-Neves, G., Franco, J., Barreiro, L., Gil, G., Moutounet, M. & Carbonneau, A. (2007). Varietal differentiation of Tannat. Cabernet-Sauvignon and Merlot grapes and wines according to their anthocyanic composition. European Food Research and Technology. 225, Gonzálvez, A., Llorens, A., Cervera, M. L., Armenta, S., & De la Guardia, M. (2009). Elemental fingerprint of wines from the protected designation of origin Valencia. Food Chemistry, 112(1), Harbertson, J. F., Kennedy, J. A., & Adams, D. O. (2002). Tannin in skins and seeds of Cabernet Sauvignon, Syrah, and Pinot noir berries during ripening. American Journal of Enology and Viticulture, 53(1), Harbertson, J. F., Hodgins, R. E., Thurston, L. N., Schaffer, L. J., Reid, M. S., Landon, J. L.,... & Adams, D. O. (2008). Variability of tannin concentration in red wines. American Journal of Enology and Viticulture, 59(2), Hayasaka, Y., & Kennedy, J. A. (2003). Mass spectrometric evidence for the formation of pigmented polymers in red wine. Australian Journal of Grape and Wine Research, 9, He, F., Liang, N. N., Mu, L., Pan, Q. H., Wang, J., Reeves, M. J., & Duan, C. Q. (2012). Anthocyanins and their variation in red wines I. Monomeric anthocyanins and their color expression. Molecules, 17, Hermosín-Gutiérrez, I., Lorenzo E. A. P. & Espinosa A. V. (2005). Phenolic composition and magnitude of copigmentation in young and shortly aged red wines made from the cultivars, Cabernet Sauvignon, Cencibel, and Syrah. Food Chemistry, 92, Hermosín-Gutiérrez, I. (2003). Influence of ethanol content on the extent of 229

231 copigmentation in a Cencibel young red wine. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, Hernández, T., Estrella, I., Carlavilla, D., Martín-Álvarez, P. J., & Moreno-Arribas, M. V. (2006). Phenolic compounds in red wine subjected to industrial malolactic fermentation and ageing on lees. Analytica Chimica Acta, 563(1), Hernanz, D., Recamales, A. F., Gonzalez-Miret, M. L., Gómez-Míguez, M. J., Vicario, I.M. & Heredia, F.J. (2007). Phenolic composition of white wines with a prefermentative maceration at experimental and industrial scale. Journal of Food Engineering, 80, Hrazdina, G., Parsons, G. F., & Mattick, L. R. (1984). Physiological and biochemical events during development and maturation of grape berries. American Journal of Enology and Viticulture, 35(4), Ivanova, V., Vojnoski, B., & Stefova, M. (2012). Effect of winemaking treatment and wine aging on phenolic content in Vranec wines. Journal of Food Science and Technology, 49, Ivanova-Petropulos, V., Ricci, A., Nedelkovski, D., Dimovska, V., Parpinello, G. P., & Versari, A. (2015). Targeted analysis of bioactive phenolic compounds and antioxidant activity of Macedonian red wines. Food Chemistry, 171, Jackson, R. S. (2008). Wine science: principles and applications. San Diego: Academic Press. Janicsák, G., Máthé, I., Miklóssy-Vári, V., & Blunden, G. (1999). Comparative studies of the rosmarinic and caffeic acid contents of Lamiaceae species. Biochemical Systematics and Ecology, 27, Kallithraka, S., Arvanitoyannis, I. S., Kefalas, P., El-Zajouli, A., Soufleros, E., & Psarra, E. (2001). Instrumental and sensory analysis of Greek wines, implementation of principal component analysis (PCA) for classification according to geographical origin. Food Chemistry, 73(4), Kallithraka, S., Tsoutsouras, E., Tzourou, E., & Lanaridis, P. (2006). Principal phenolic compounds in Greek red wines. Food Chemistry, 99, Peyrot des Gachons, C., & Kennedy, J. A. (2003). Direct method for determining seed and skin proanthocyanidin extraction into red wine. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51(20),

232 Kouri, G., Tsimogiannis, D., Bardouki, H., & Oreopoulou, V. (2007). Extraction and analysis of antioxidant components from Origanum dictamnus. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 8, Lafka, T. I., Sinanoglou, V., & Lazos, E. S. (2007). On the extraction and antioxidant activity of phenolic compounds from winery wastes. Food Chemistry, 104(3), Lambert, S.G., Asenstorfer, R.E., Williamson, N.M., Iland, P.G., Jones, G.P. (2011). Copigmentation between malvidin-3-glucoside and some wine constituents and its importance to colour expression in red wine. Food Chemistry, 125, Liao, H., Cai, Y., & Haslam, E. (1992). Polyphenol interactions. Anthocyanins: Co pigmentation and colour changes in red wines. Journal of the Science of Food and Agriculture, 59, Lonvaud-Funel, A. (1999). Lactic acid bacteria in the quality improvement and depreciation of wine. In: Lactic Acid Bacteria: Genetics, Metabolism and Applications (pp ). Netherlands: Springer. Makris, D. P., Kallithraka, S., & Mamalos, A. (2006). Differentiation of young red wines based on cultivar and geographical origin with application of chemometrics of principal polyphenolic constituents. Talanta, 70, Marais, J. (2003). Effect of different wine-making techniques on the composition and quality of Pinotage wine. I. Low-temperature skin contact prior to fermentation. South African Journal for Enology and Viticulture, 24(2), Mateo, J. J., & Di Stefano, R. (1997). Description of the β-glucosidase activity of wine yeasts. Food Microbiology, 14, Mentana, A., Pati, S., La Notte, E., & Del Nobile, M. A. (2009). Chemical changes in Apulia table wines as affected by plastic packages. LWT-Food Science and Technology, 42(8), Merken, H.M., Merken C.D., & Beecher G.R. (2001). Kinetics method for the quantitation of anthocyanidins, flavonols and flavones in foods. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 49, Mihnea, M., González-SanJosé, M. L., Ortega-Heras, M., & Pérez-Magariño, S. (2015). A comparative study of the volatile content of Mencía wines obtained using 231

233 different pre-fermentative maceration techniques. LWT-Food Science and Technology, 64(1), Minussi, R. C., Rossi, M., Bologna, L., Cordi, L., Rotilio, D., Pastore, G. M., & Durán, N. (2003). Phenolic compounds and total antioxidant potential of commercial wines. Food Chemistry, 82(3), Monagas, M., & Bartolomé, B. (2009). Anthocyanins and anthocyanin-derived compounds. In: Wine chemistry and biochemistry (pp ). New York: Springer. Monagas, M., Bartolomé, B., & Gómez-Cordovés, C. (2005). Evolution of polyphenols in red wines from Vitis vinifera L. during aging in the bottle. European Food Research and Technology, 220(3-4), Moreno, I. M., González-Weller, D., Gutierrez, V., Marino, M., Cameán, A. M., González, A. G., & Hardisson, A. (2008). Determination of Al, Ba, Ca, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Na, Sr and Zn in red wine samples by inductively coupled plasma optical emission spectroscopy: Evaluation of preliminary sample treatments. Microchemical Journal, 88, Moreno-Arribas, M. V., & Polo, M. C. (2005). Winemaking biochemistry and microbiology: current knowledge and future trends. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 45(4), Moreno-Arribas, M. V., Polo, M. C., Jorganes, F., & Muñoz, R. (2003). Screening of biogenic amine production by lactic acid bacteria isolated from grape must and wine. International Journal of Food Microbiology, 84(1), Mortimer, R., & Polsinelli, M. (1999). On the origins of wine yeast. Research in Microbiology, 150(3), Moutounet, M., & Vidal, J. C. (2006). Monitoring of oxygen in the gas and liquid phases of bottles of wine at bottling and during storage. Journal International des Sciences de la Vigne, 40. Nicolini, G., Larcher, R., Pangrazzi, P., & Bontempo, L. (2004). Changes in the contents of micro- and trace-elements in wine due to winemaking treatments. Vitis, 43, Nikfardjam, M. P., László, G. Y., & Dietrich, H. (2006). Resveratrol-derivatives and antioxidative capacity in wines made from botrytized grapes. Food Chemistry, 96(1), 232

234 Nixdorf, S. L., & Hermosín-Gutiérrez, I. (2010). Brazilian red wines made from the hybrid grape cultivar Isabel: Phenolic composition and antioxidant capacity. Analytica Chimica Acta, 659, Ong, B. Y., & Nagel, C. W. (1978). Hydroxycinnamic acid-tartaric acid ester content in mature grapes and during the maturation of White Riesling grapes. American Journal of Enology and Viticulture, 29(4), Ortega-Regules, A., Ros-García, J. M., Bautista-Ortín, A. B., López-Roca, J. M., & Gómez-Plaza, E. (2008). Differences in morphology and composition of skin and pulp cell walls from grapes (Vitis vinifera L.): technological implications. European Food Research and Technology, 227(1), 223. Ortega-Regules, A., Ros-García, J. M., Bautista-Ortín, A. B., López-Roca, J. M., & Gómez-Plaza, E. (2008). Differences in morphology and composition of skin and pulp cell walls from grapes (Vitis vinifera L.): technological implications. European Food Research and Technology, 227, Packter, N. M. (1980) Biosynthesis of acetate-derived phenols (polyketides)) In: The Biochemistry of Plants (Vol. 4, pp ). New York: Academic Press. Panprivech, S., Lerno, L. A., Brenneman, C. A., Block, D. E., & Oberholster, A. (2015). Investigating the effect of cold soak duration on phenolic extraction during Cabernet Sauvignon fermentation. Molecules, 20(5), Petersen, M., & Simmonds, M. S. (2003). Rosmarinic acid. Phytochemistry, 62, Pocock, K. F., Sefton, M. A., & Williams, P. J. (1994). Taste thresholds of phenolic extracts of French and American oakwood: the influence of oak phenols on wine flavor. American Journal of Enology and Viticulture, 45(4), Pretorius, I. S., Van der Westhuizen, T. J., & Augustyn, O. P. H. (1999). Yeast biodiversity in vineyards and wineries and its importance to the South African wine industry. A review. South African Journal of Enology and Viticulture, 20(2), Puértolas, E., Álvarez, I., & Raso, J. (2011). Changes in phenolic compounds of Aragón red wines during alcoholic fermentation. Food Science and Technology International, 17,

235 Rein, M. J., & Heinonen, M. (2004). Stability and enhancement of berry juice color. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, Rentzsch, M., Wilkens, A., & Winterhalter, P. (2009). Non-flavonoid phenolic compounds. In: Wine chemistry and biochemistry (pp ). New York: Springer. Reynolds, A., Cliff, M., Girard, B., & Kopp, T. G. (2001). Influence of fermentation temperature on composition and sensory properties of Semillon and Shiraz wines. American Journal of Enology and Viticulture, 52(3), Ribereau-Gayon, P., Glories, Y., Maujean, A., & Dubourdieu, D. (2006). Handbook of Enology. The chemistry of wine stabilization and treatments (Vol. 2) (pp ). West Sussex-UK: John Wiley and Sons Ltd. Robards, K. (2003). Strategies for the determination of bioactive phenols in plants, fruit and vegetables. Journal of chromatography A, 1000(1), Robertson, G. L. (2009). Food packaging and shelf life: a practical guide. Boca Raton: CRC Press. Rustioni, L., Bedgood, D. R., Failla, O., Prenzler, P. D., & Robards, K. (2012). Copigmentation and anti-copigmentation in grape extracts studied by spectrophotometry and post-column-reaction HPLC. Food chemistry, 132, Sacchi, K. L., Bisson, L. F., & Adams, D. O. (2005). A review of the effect of winemaking techniques on phenolic extraction in red wines. American Journal of Enology and Viticulture, 56(3), Salinas, M. R., Garijo, J., Pardo, F., Zalacain, A., & Alonso, G. L. (2005). Influence of prefermentative maceration temperature on the colour and the phenolic and volatile composition of rosé wines. Journal of the Science of Food and Agriculture, 85(9), Sapis-domercq, S. (1980). Etude de l'influence des produits de traitement de la vigne sur la microflore des raisins et des vins. Expérimentation Comparaison avec les résultats de 1975, 1976 et OENO One, 14(3), Scalbert, A., Manach, C., Morand, C., Rémésy, C., & Jiménez, L. (2005). Dietary polyphenols and the prevention of diseases. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 45,

236 Schieber, A., Müller, D., Röhrig, G., & Carle, R. (2002). Effects of grape cultivar and processing on the quality of cold-pressed grape seed oils. Mitteilungen Klosterneuburg, 52, Scudamore-Smith, P. D., Hooper, R. L., & McLaran, E. D. (1990). Color and phenolic changes of Cabernet Sauvignon wine made by simultaneous yeast/bacterial fermentation and extended pomace contact. American Journal of Enology and Viticulture, 41(1), Sebecic, B., Pavisic-Strache, D., & Vedrina-Dragojevic, I. (1998). Trace elements in wine from Croatia. Deutsche Lebensmittel-Rundschau, 94(10), Shirakura, A., Nakaya, M., Koga, Y., Kodama, H., Hasebe, T., & Suzuki, T. (2006). Diamond-like carbon films for PET bottles and medical applications. Thin Solid Films, 494, Silva, L. R., Andrade, P. B., Valentão, P., Seabra, R. M., Trujillo, M. E., & Velázquez, E. (2005). Analysis of non-coloured phenolics in red wine: effect of Dekkera bruxellensis yeast. Food Chemistry, 89(2), Simpson, R. F., & Miller, G. C. (2016). Aroma composition of Chardonnay wine. Vitis-Journal of Grapevine Research, 23(2), 143. Singleton, V. L., & Esau, P. (1969). Advances in food research: Supplement. New York: Academic. Smyk, B., Pliszka, B., & Drabent, R. (2008). Interaction between cyanidin 3- glucoside and Cu (II) ions. Food Chemistry, 107, Sokolowsky, M., Rosenberger, A., & Fischer, U. (2015). Sensory impact of skin contact on white wines characterized by descriptive analysis, time intensity analysis and temporal dominance of sensations analysis. Food Quality and Preference, 39, Soto Vázquez, E., Rio Segade, S., & Fernández Gomez, E. (2013). Incidence of the winemaking technique on metal content and phenolic composition of red wines. International Journal of Food Properties, 16(3), Stoclet, J. C., Chataigneau, T., Ndiaye, M., Oak, M. H., El Bedoui, J., Chataigneau, M., & Schini-Kerth, V. B. (2004). Vascular protection by dietary polyphenols. European Journal of Pharmacology, 500,

237 Strauss, C. R., Wilson, B., Anderson, R., & Williams, P. J. (1987). Development of precursors of C13 nor-isoprenoid flavorants in Riesling grapes. American Journal of Enology and Viticulture, 38(1), Tariba, B. (2011). Metals in Wine Impact on Wine Quality and Health Outcomes. Biological Trace Element Research, 144, Terrier, N., Poncet-Legrand, C., & Cheynier, V. (2009). Flavanols, flavonols and dihydroflavonols. In: Wine chemistry and biochemistry (pp ). New York: Springer. Thibon, C., Marullo, P., Claisse, O., Cullin, C., Dubourdieu, D., & Tominaga, T. (2008). Nitrogen catabolic repression controls the release of volatile thiols by Saccharomyces cerevisiae during wine fermentation. FEMS Yeast Research, 8(7), Vaadia, M., Master of Science Thesis: Copigmentation in varietal wines from Napa Valley. Davis: University of California. Vidal, S., & Aagaard, O. (2008). Oxygen management during vinification and storage of Shiraz wine. The Australian and New Zealand Wine Inudstry Journal, 23, Vidal, S., Francis, L., Noble, A., Kwiatkowski, M., Cheynier, V., & Waters, E. (2004). Taste and mouth-feel properties of different types of tannin-like polyphenolic compounds and anthocyanins in wine. Analytica Chimica Acta, 513, Vivas, N., & Glories, Y. (1996). Role of oak wood ellagitannins in the oxidation process of red wines during aging. American Journal of Enology and Viticulture, 47(1), Waterhouse, A. L. (2005). Determination of total phenolics. In: Handbook of Food Analytical Chemistry (pp ). Hoboken: John Wiley & Sons. Waterhouse, A. L. (2002). Determination of total phenolics. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. Wibowo, D., Eschenbruch, R., Davis, C. R., Fleet, G. H., & Lee, T. H. (1985). Occurrence and growth of lactic acid bacteria in wine: a review. American Journal of Enology and Viticulture, 36(4), Yokotsuka, K., Sato, M., Ueno, N., & Singleton, V. L. (2000). Colour and sensory characteristics of Merlot red wines caused by prolonged pomace contact. Journal of Wine Research, 11(1),

238 Zamora, F. (2009). Biochemistry of alcoholic fermentation. In: Wine chemistry and biochemistry. New York: Springer. Zimman, A., Joslin, W. S., Lyon, M. L., Meier, J., & Waterhouse, A. L. (2002). Maceration variables affecting phenolic composition in commercial-scale Cabernet Sauvignon winemaking trials. American Journal of Enology and Viticulture, 53(2), Zúñiga, M. C., Pérez-Roa, R. E., Olea-Azar, C., Laurie, V. F., & Agosin, E. (2014). Contribution of metals, sulfur-dioxide and phenolic compounds to the antioxidant capacity of Carménère wines. Journal of Food Composition and Analysis, 35, Κοτσερίδης, Γ. (2006}, Σημειώσεις Οινολογίας II, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων, Αθήνα. Κουράκου Δραγώνα, Σ. (1998). Θέματα Οινολογίας. Αθήνα: Τροχαλία. Παναγοπούλου, Μ. (2015). Διπλωματική Εργασία: Μελέτη βελτίωσης ποιοτικών παραμέτρων στο κρασί κατά την οινοποίηση και την μεταζυμωτική περίοδο. Αθήνα: ΕΜΠ. Σουφλερός, Ε. (2000). Οινολογία, Επιστήμη και Τεχνογνωσία, Τομός Ι. Θεσσαλονίκη: Τυπογραφία Παπαγεωργίου. Σουφλερός, Ε. (2000). Οινολογία, Επιστήμη και Τεχνογνωσία, Τομός ΙΙ. Θεσσαλονίκη: Τυπογραφία Παπαγεωργίου. Σταυρακάκης M. N. (2010) Αμπελογραφία (Ampelography). Αθήνα: Εκδόσεις Τροπή Συμεού, Ε. (2010). Διδακτορική Διατριβή: Μελέτη των φαινολικών συστατικών σταφυλιών και οίνου, Χίου και Νεμέας και της επίδρασης των ενζύμων και άλλων παραμέτρων σε αυτά. Αθήνα: Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών. Τσακίρης, Α. Ν. (1998). Οινολογία, από το σταφύλι στο κρασί. Αθήνα: Εκδόσεις Ψυχάλου. Τσέλεπος, Α. (2015). Διπλωματική Εργασία: Μελέτη της εξέλιξης των φαινολικών συστατικών του κρασιού κατά την οινοποίηση και την αποθήκευση σε τροποποιημένη ατμόσφαιρα. Αθήνα: ΕΜΠ. Τσέτουρας, Π. (2008). Οινοτεχνία, Η Επιστήμη του κρασιού στην πράξη, ISO Αθήνα: Εκδόσεις Σταμούλη Α.Ε. 237

239 Παράρτημα 1: Φαινολικά συστατικά μούρων - Ποιοτικά και ποσοτικά χαρακτηριστικά Χρωματογράφημα HPLC-DAD σε δείγμα χυμού μύρτιλλο στα 520 & 360 nm 238

240 Χρωματογράφημα HPLC-DAD σε δείγμα χυμού βατόμουρο στα 520 & 360 nm 239

241 Χρωματογράφημα HPLC-DAD σε δείγμα χυμού κράνου στα 520 & 320 nm Χρωματογράφημα HPLC-DAD σε δείγμα ρόδι στα 520 nm 240

242 Ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση φαινολικών συστατικών σε ελληνικούς χυμούς βατόμουρο, κράνο, μύρτιλλο, ρόδι καθώς και δύο ποικιλιών κούμαρου κινεζικής προέλευσης. Η ποσοτικοποίηση των ανθοκυανών γίνεται σε ισοδύναμα κυανιδίνης-3-γλυκοζίτη (κουρομανίνης), των φαινολικών οξέων σε ισοδύναμα καφεϊκού οξέος και των φλαβονολών σε ισοδύναμα κερκετίνης Φαινολικά συστατικά Δελφινιδίνη-3,5-διγλυκοζίτης Κυανιδίνη-3,5-διγλυκοζίτης Χρόνος έκλουσης [min] [M-H] + και θράυσμα (m/z)* Βατόμουρο [mg/l] Κράνο [mg/l] Μύρτιλλο [mg/l] Ρόδι [mg/l] Κούμαρο [mg/l] Dongkui Biqi , 645, , 449, Δελφινιδίνη-3-γαλακτοζίτης , Δελφινιδίνη-3-γλυκοζίτης , Ανθοκυάνες Κυανιδίνη-3-γαλακτοζίτης , Δελφινιδίνη-3-αραβινοζίτης , Κυανιδίνη-3-γλυκοζίτης , Πετουνιδίνη-3-γαλακτοζίτης , Πετουνιδίνη-3-γλυκοζίτης , Πελαργονιδίνη-3-γλυκοζίτης ,

243 Κυανιδίνη-3- (6 μαλόνυλ)γλυκοζίτης Κυανιδίνη-3-διοξαλύλογλυκοζίτης , , Κυανιδίνη-3-αραβινοζίτης , Πεονιδίνη-3-γαλακτοζίτης , Πετουνιδίνη-3-αραβινοζίτης , Πετουνιδίνη-3-γλυκοζίτης , Μαλβιδίνη-3-γαλακτοζίτης , Μαλβιδίνη-3-γλυκοζίτης , Μαλβιδίνη-3-αραβινοζίτης , Κυανιδίνη-3-(6 - ακέτυλ)γαλακτοζίτης Μαλβιδίνη-3- (μαλόνυλ)γλυκοζίτης Πετουνιδίνη-3-(6 - ακέτυλ)γλυκοζίτης , , , Μαλβιδίνη-3-O-ξυλοζίτης ,

244 Μαλβιδίνη-3-(6 - ακέτυλ)γαλακτοζίτης Πεονιδίνη-3-(6 - ακέτυλ)γλυκοζίτης Μαλβιδίνη-3-(6 - ακέτυλ)γλυκοζίτης , , , Παράγωγο του καφεϊκού οξέος , Φαινολικό οξύ Παράγωγο του καφεϊκού οξέος , Χλωρογενικό οξύ , μ.π Παράγωγο του p-κουμαρικού οξέος Ρουτίνη , Δεσόξυ-εξοζίτης της μυρισετίνης , Φλαβονόλες Κερκετίνη-3-γλυκοζίτης , Κερκετίνη-3-[6 -(3-υδρόξυ-3- μεθύλγλουταρύλ) γαλακτοζίτης , Κερκετίνη-3-αραβινοζίτης , Κερκετίνη-3-ραμνοζίτης ,

245 Δεσόξυ-εξοζίτης της κερκετίνης , Ελλαγικά παράγωγα Εξοζίτης του ελλαγικού οξέος Δεσοξυεξοζίτης του ελλαγικού οξέος , μ.π , μ.π. - - Γλυκοζίτης του ελλαγικού οξέος , 301 μ.π. μ.π * [M-H] - και θραύσματα για φαινολικά οξέα, φλαβονόλες και παράγωγα του ελλαγικού οξέος μ.π. : το μόριο ανιχνεύτηκε αλλά δεν ποσοτικοποιήθηκε 244

246 Παράρτημα 2: Αποθήκευση κρασιού σε τροποποιημένες ατμόσφαιρες Εξέλιξη συγκέντρωσης ολικών φαινολικών συστατικών σε ισοδύναμα γαλλικού οξέος [GAE] κατά την αποθήκευση κρασιού από την ποικιλία Merlot υπό διαφορετικές ατμόσφαιρες Εξέλιξη συγκέντρωσης ολικών φαινολικών συστατικών σε ισοδύναμα γαλλικού οξέος [GAE] κατά την αποθήκευση κρασιού από την ποικιλία Syrah υπό διαφορετικές ατμόσφαιρες 245

247 Εξέλιξη συγκέντρωσης ολικών φλαβονολών σε ισοδύναμα κερκετίνης κατά την αποθήκευση κρασιού από την ποικιλία Ασύρτικο υπό διαφορετικές ατμόσφαιρες Εξέλιξη συγκέντρωσης ολικών φλαβονολών σε ισοδύναμα κερκετίνης κατά την αποθήκευση κρασιού από την ποικιλία Αγιωργίτικο υπό διαφορετικές ατμόσφαιρες 246

248 Εξέλιξη συγκέντρωσης ολικών κινναμικών σε ισοδύναμα καφεϊκού οξέος [CAE] κατά την αποθήκευση κρασιού από την ποικιλία Αγιωργίτικο υπό διαφορετικές ατμόσφαιρες Εξέλιξη χρωματικής έντασης (CI) κατά την αποθήκευση κρασιού από την ποικιλία Αγιωργίτικο υπό διαφορετικές ατμόσφαιρες 247

249 Εξέλιξη της χρωματικής παραμέτρου της απόχρωσης κατά την αποθήκευση κρασιού από την ποικιλία Αγιωργίτικο υπό διαφορετικές ατμόσφαιρες Εξέλιξη της χρωματικής παραμέτρου της λαμπρότητας (da%) κατά την αποθήκευση κρασιού από την ποικιλία Αγιωργίτικο υπό διαφορετικές ατμόσφαιρες 248