ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΛΗΠΤΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Α ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ : Καθηγητής Α.Φ. Αντωνιάδης ΠΑΝΕΠ. ΕTOΣ 20042005 ΑΡΙΘΜ. 1719 ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ ΚΙΑΡΑ Ι. ΝΤΟΥΤΣΟΥ ΙΑΤΡΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2005

Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΑΝΤΩΝΙΑΔΗΣ Φ. ΑΝΤΩΝΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΣΟΥΛΙΟΥΣΥΜΕΩΝΙΔΟΥ ΕΥΦΗΜΙΑ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΜΑΛΙΣΙΟΒΑΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΑΝΤΩΝΙΑΔΗΣ Φ. ΑΝΤΩΝΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΣΟΥΛΙΟΥΣΥΜΕΩΝΙΔΟΥ ΕΥΦΗΜΙΑ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΜΑΛΙΣΙΟΒΑΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΛΕΞΙΟΥΔΑΝΙΗΛ ΣΤΥΛΙΑΝΗ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΚΥΡΙΑΖΟΠΟΥΛΟΥΔΑΛΑΪΝΑ ΒΑΣΙΛΙΚΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΒΑΒΑΤΣΗΧΡΙΣΤΑΚΗ ΝΟΡΜΑ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΚΩΤΣΗΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ «Η έγκριση της Διδακτορικής Διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλοί αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως». ( Νόμος 5343/32, αρθρ. 202 2 και ν. 1268/82, αρθρ. 50 8 )

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΜΠΟΝΤΗΣ

Στους γονείς μου, Ιωάννη και Φωτίκα και την αδελφή μου, Γεωργία Στον σύζυγο μου Ιωάννη και τα παιδιά μου Μαρία και Ιωάννη

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 1 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελ. ΠΡΟΛΟΓΟΣ 5 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 9 1. ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ 11 2. ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ STAPHYLOCOCCUS 13 2.1 Ταξινόμηση 13 2.2 Γενικοί χαρακτήρες 19 2.3 Καλλιεργητικοί χαρακτήρες 19 2.4 Κατασκευή και χημική σύσταση 20 2.5 Τοξίνες και ένζυμα 22 2.5.1 Πηκτάση (κοαγκουλάση) 23 2.5.2 Αιμολυσίνες 23 2.5.3 Ανθεκτική νουκλεάση (Dnαση) 25 2.5.4 Εντεροτοξίνες 26 2.5.5 Τοξίνη του συνδρόμου τοξικής καταπληξίας (TSST) 27 2.5.6 Λευκοκτονίνη 27 2.5.7 Αποφολιδωτική τοξίνη 28 2.5.8 Σταφυλοκινάση 29 2.5.9 Άλλες ουσίες 29 3. ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΛΗΨΗ 30 3.1 Επιδημιολογία του S. aureus 30 3.2 Επιδημιολογία των νοσοκομειακών MRSA στελεχών 30 3.3 Επιδημιολογία των κοαγκουλάση αρνητικών Σταφυλοκόκκων 31 4. ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ 33 4.1 Παθογένεια της λοίμωξης από S. aureus 33 4.2Παθογένεια της λοίμωξης από κοαγκουλάση 35 αρνητικούς Σταφυλοκόκκους 5. ΠΑΘΟΓΟΝΟΣ ΔΡΑΣΗ 37 5.1 Παθογόνος δράση του S. aureus 37

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 2 5.1.1 Λοιμώξεις του δέρματος και των εξαρτημάτων του 37 5.1.1.α Τοπικές πυώδης φλεγμονές 37 5.1.1.β Τοπικές δερματικές φλεγμονές με διάχυτο δερματικό 38 εξάνθημα 5.1.2 Σηψαιμία και ενδοκαρδίτιδα 42 5.1.3 Περικαρδίτιδα 44 5.1.4 Λοιμώξεις αναπνευστικού συστήματος 44 5.1.5 Λοιμώξεις μυοσκελετικού συστήματος 45 5.1.5. α Οστεομυελίτιδα 45 5.1.5.β Πυώδη Αρθρίτιδα 46 5.1.5.γ Πυώδη Υμενίτιδα 47 5.1.5.δ Πυομυοσίτιδα 47 5.1.6 Τροφική Δηλητηρίαση 48 5.2 Παθογόνος δράση των κοαγκουλάση αρνητικών 48 Σταφυλοκόκκων 5.2.1 Μικροβιαιμία 48 5.2.2 Ενδοκαρδίτιδα 49 5.2.3 Μολύνσεις ενδαγγειακών καθετήρων 49 5.2.4 Μολύνσεις τεχνητών διόδων εγκεφαλονωτιαίου υγρού 50 5.2.5 Περιτονίτιδα από μόλυνση καθετήρων περιτοναϊκής διήλισης 50 5.2.6 Λοιμώξεις ουροποιητικού συστήματος 51 5.2.7 Οστεομυελίτιδα 52 5.2.8 Μολύνσεις των προσθετικών αρθρώσεων 52 5.2.9 Άλλες λοιμώξεις 52 6. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ 53 6.1 Μικροσκοπική εξέτασηκαλλιέργεια 53 6.2 Ταυτοποίηση 53 6.2.1 Δοκιμασία της καταλάσης 53 6.2.2 Δοκιμασία της πηκτάσης (κοαγκουλάσης) 54 6.2.3 Δοκιμασία παραγωγής πρωτεΐνης Α 56

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 3 6.2.4 Δοκιμασία παραγωγής θερμοανθεκτικής DNασης 57 6.2.5 Δοκιμασία ζυμώσεως/οξειδώσεως ή F/O δοκιμή 57 6.2.6 Δοκιμασία ευαισθησίας στη λυσοσταφίνη 57 6.2.7 Άλλες δοκιμασίες ταυτοποίσης 57 7. ΜΕΘΟΔΟΙ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗΣ 58 7.1 Φαινοτυπικές μέθοδοι τυποποίησης 58 7.1.1 Φαινότυπος αντοχής στα αντιβιοτικά 58 7.1.2 Λυσιτυπία 59 7.1.3 Οροτυπία Βιοτυπία 59 7.2 Γενετικές μέθοδοι τυποποίησης 59 7.2.1 Ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο (PFGE) 59 7.2.2 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) 63 7.2.3 Πλασμιδιακή ανάλυση 65 8. ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ 67 9. ΑΝΤΟΧΗ ΤΩΝ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ ΣΤΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ 68 9.1 Αντοχή του Σταφυλοκόκκου στα βλακταμικά αντιβιοτικά 68 9.2 Αντοχή του Σταφυλοκόκκου στα αντιβιοτικά που αναστέλλουν την πρωτεϊνική σύνθεση 73 9.2.1 Τετρακυκλίνες 73 9.2.2 Μακρολίδες 75 9.2.3 Αμινογλυκοσίδες 75 9.2.4 Φουσιδικό Οξύ 76 9.3 Αντοχή του Σταφυλοκόκκου στην τριμεθοπρίμη 76 9.4 Αντοχή του Σταφυλοκόκκου στις κινολόνες 76 9.5 Αντοχή του Σταφυλοκόκκου στα γλυκοπεπτίδια 77 10. ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ 81 10.1 Δράση της μουπιροσίνης 82 10.2 Μηχανισμός ανθεκτικότητας 83 10.3 Κλινική χρησιμότητα της μουπιροσίνης 87

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 4 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 89 1. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ 91 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 93 2.1Υλικό 93 2.2 Μέθοδοι 93 1. Απομόνωση σταφυλοκόκκων 94 2. Τυποποίηση σταφυλοκόκκων 94 3. Δοκιμασίες ευαισθησίας των στελεχών στα αντιβιοτικά 94 4. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) 97 5. Μεταφορά με μικροβιακή σύζευξη του φαινότυπου αντοχής 99 στα αντιβιοτικά 6. Πλασμιδιακή ανάλυση 100 7. Ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο 102 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 106 3.1 Αποτελέσματα από την καλλιέργεια και τυποποίηση των Σταφυλοκόκκων 106 3.2 Φαινότυποι αντοχής των σταφυλοκόκκων στα αντιβιοτικά 111 3.3 Αποτελέσματα από τον έλεγχο ευαισθησίας στην οξακιλλίνη με τη μέθοδο ενσωματώσεως της οξακιλλίνης στο άγαρ 113 3.4 Αντοχή των κλινικών στελεχών στη μουπιροσίνη 113 3.5 Μεταβίβαση αντοχής με σύζευξη 119 3.6 Πλασμιδιακή ανάλυση 119 3.7 Δοκιμασία PCR για την ανίχνευση του γονιδίου αντοχής mupa 120 3.8 Ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο πεδίο (PFGE) 122 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 129 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 141 SUMMARY 145 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 147

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η επιστημονική επανάσταση των τελευταίων δεκαετιών με την εισαγωγή των τεχνικών της μοριακής βιολογίας και βιοτεχνολογίας έδωσαν μεγάλη ώθηση στη μελέτη του προβλήματος της ανθεκτικότητας των μικροοργανισμών έναντι των αντιβιοτικών. Η εφαρμογή τεχνικών όπως η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης, η ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτικό πεδίο, η δυνατότητα προσδιορισμού της αλληλουχίας συγκεκριμένων περιοχών του γονιδιώματος βοηθούν πάρα πολύ όχι μόνο στην ελαχιστοποίηση του χρόνου ανίχνευσης και τυποποίησης των μικροοργανισμών, αλλά κατέστησαν δυνατή τη μελέτη των μηχανισμών αντοχής σε μοριακό πλέον επίπεδο. Η μουπιροσίνη είναι ένα αντιβιοτικό με τοπική αντιμικροβιακή δράση που άρχισε να χρησιμοποιείται στην κλινική πράξη στα μέσα της δεκαετίας του 80. Χρησιμοποιείται για τη θεραπεία σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων του δέρματος, ως προφυλακτική αγωγή σε ασθενείς με κεντρικούς φλεβικούς καθετήρες και για την μείωση των ρινικών μικροβιοφορέων από μεθικιλλίνηανθεκτικούς σταφυλοκόκκους (MRSA). Η μελέτη της διασποράς των γονιδίων αντοχής στη μουπιροσίνη σε στελέχη σταφυλοκόκκων που είναι ο σκοπός της παρούσας μελέτης έχει ως στόχο να βοηθήσει στην κατανόηση των μηχανισμών αντοχής και διασποράς των ανθεκτικών στελεχών. Επιπλέον σκοπός της μελέτης είναι να αναδείξει το τυχόν πρόβλημα της ανθεκτικότητας ώστε να βοηθήσει στη λήψη των απαραίτητων μέτρων για την αντιμετώπιση της διασποράς. Για τη βοήθεια τους στην εκπόνηση της διατριβής αυτής ευχαριστώ θερμά:

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 6 Ιδιαίτερα ευχαριστώ τον Καθηγητή Μικροβιολογίας κ. Αντώνιο Αντωνιάδη, ο οποίος ως Διευθυντής του Α Εργαστηρίου Μικροβιολογίας μου εμπιστεύτηκε το θέμα της διατριβής αυτής. Είμαι βαθύτατα ευγνώμων για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε, την ευαισθησία και την ενθάρρυνση του σε όλη τη διάρκεια της εκπόνησης της διδακτορικής μου διατριβής. Οι γνώσεις του και η επιστημονική του εμπειρεία συνέβαλαν τα μέγιστα για την πραγματοποίηση αυτής της διατριβής. Επίσης θα ήθελα να εκφράσω τις θερμότερες ευχαριστίες μου προς τα άλλα δύο μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής. Την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κα. Ευφημία ΣούλιουΣυμεωνίδου για την ουσιαστική βοήθεια της. Οι πολύτιμες συμβουλές της, το ενδιαφέρον της και η σε βάθος διόρθωση της διατριβής αυτής, συνέβαλαν στην αρτιότερη τελική εμφάνιση της διατριβής. Είμαι βαθύτατα ευγνώμων για τον χρόνο που μου διέθεσε και την συμπαράσταση της σε όλη τη διαδικασία. Τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Νικόλαο Μαλισιόβα για την επίβλεψη και το ενδιαφέρον που έδειξε όλο αυτό το διάστημα και τις εύστοχες παρατηρήσεις στη διόρθωση των δοκιμίων της διατριβής αυτής. Θα ήταν μεγάλη παράλειψη μου να μην ευχαριστήσω τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Αθανάσιο Τσακρή, μέλος της τριμελούς επιτροπής τα πρώτα χρόνια της ανάθεσης της διατριβής, για την πολύτιμη βοήθεια του με τις γνώσεις του πάνω στις εφαρμογές των τεχνικών που χρησιμοποιήθηκαν. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τη Διευθύντρια του Μικροβιολογικού Εργαστηρίου του Νοσοκομείου ΑΧΕΠΑ, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κα. Στυλιανή ΑλεξίουΔανιήλ και μέλος της επταμελούς επιτροπής, για την διαρκή και αμέριστη συμπαράσταση της, τις πολύτιμες συμβουλές της και την επιστημονική της βοήθεια καθ όλη τη διάρκεια της εκπόνησης της διατριβής. Θα θυμάμαι πάντα με συγκίνηση το άριστο και ευχάριστο κλίμα συνεργασίας μας και την ευαισθησία και τη βοήθεια που επέδειξε σε δύσκολες στιγμές.

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 7 Τα μέλη της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής Καθηγητές κ. Αλέξανδρο Κώτση, κ. Βασιλική ΚυριαζοπούλουΔαλαϊνα και κ. Νόρμα Βαβάτση Χριστάκη που μου έκαναν την τιμή να είναι μέλη της επιτροπής, για την συμβολή τους και τις εύστοχες παρατηρήσεις τους στη διόρθωση των δοκιμίων της διατριβής αυτής. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την Καθηγήτρια κα. Μαρία Ραπτοπούλου Γιγή για τις καθοριστικές και πολύτιμες παρεμβάσεις και συμβουλές της. Θερμές ευχαριστίες εκφράζω και στην κα. Τάσα Παπαδημητρίου, τεχνολόγο του Α Εργαστηρίου Μικροβιολογίας, για την τεχνική της βοήθεια το μεγάλο ενδιαφέρον και την ηθική συμπαράσταση που επέδειξε από τα αρχικά στάδια της διατριβής αυτής. Θερμές ευχαριστίες οφείλω και στην κα. Αλέκα Βαρνά για τη βοήθεια και την συνεργασία της κατά τη διεκπεραίωση διαδικαστικών θεμάτων. Θα ήθελα επίσης να εκφράσω τις ευχαριστίες μου σε όλα τα μέλη ΔΕΠ και το προσωπικό του Α Εργαστηρίου Μικροβιολογίας για το ευχάριστο κλίμα συνεργασίας που δημιούργησαν. Θερμότατα ευχαριστώ τη συνάδελφο κα Χριστίνα Τρακατέλλη με την οποία συνεργαστήκαμε για την εκπόνηση των διατριβών μας καθώς και για τη μεγάλη συμπαράσταση της αυτό το διάστημα. Δε θα ξεχάσω ποτέ τις χαρές και τις απογοητεύσεις που μοιραστήκαμε μέσα στο εργαστήριο δουλεύοντας μαζί. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω τους γονείς μου, τον Αναπλ. Καθηγητή Μικροβιολογίας κ. Ιωάννη Ντούτσο και την Dr.Φωτίκα Σταμάτογλου Ντούτσου ΙατρόΜικροβιολόγο για την αγάπη που μου ενέπνευσαν για τη Μικροβιολογία και την διδαχή των βασικών αρχών της. Ολοκληρώνοντας τον πρόλογο αυτό θα ήθελα να ζητήσω συγνώμη από την οικογένεια μου για τον χρόνο που με στερήθηκαν και να τους ευχαριστήσω για την αμέριστη συμπαράσταση και κατανόηση τους καθ όλη τη διάρκεια της διατριβής αυτής.

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 8

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 9 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 10

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 11 1. ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ Η πρώτη παρατήρηση των σταφυλοκόκκων έγινε από τον R. Koch το 1878. Το1883 ο Ogston [1] εισήγαγε την ονομασία σταφυλόκοκκος από τη λέξη σταφύλι, λόγω της διάταξης του κατά ομάδες σε σχήμα σταφυλιού μικροσκοπικώς, για μια ομάδα μικροκόκκων που προκαλούσαν φλεγμονή και διαπύηση και έτσι ήταν ο πρώτος, που επισήμανε την σημασία του σταφυλοκόκκου ως αιτία λοιμώξεων. Ο Rosenbach [2] τo 1884 μελέτησε τους σταφυλοκόκκους κάνοντας τον πρώτο διαχωρισμό σύμφωνα με το χρώμα των αποικιών τους, σε σταφυλόκοκκο πυογόνο χρυσίζοντα ( Staphylococcus pyogenes aureus) με αποικίες χρώματος χρυσοκίτρινου ή πορτοκαλόχρουν και σε σταφυλόκοκκο πυογόνο λευκό (Staphylococcus pyogenes albus) με αποικίες χρώματος λευκού. Ένα χρόνο αργότερα προστέθηκε και μια τρίτη ποικιλία ο σταφυλόκοκκος ο πυογόνος ο κιτρόχρους (Staphylococcus pyogenes citrus) με αποικίες χρώματος λεμονιού. Το 1891 προτάθηκε το όνομα Staphylococcus epidermidis albus (σταφυλόκοκκος λευκός της επιδερμίδας). Η ονομασία σταφυλόκοκκος δεν έγινε εύκολα δεκτή και για αυτό οι μικροοργανισμοί αυτοί συμπεριλαμβάνονταν στο γένος των Micrococcus. Από τα 34 συστήματα ταξινόμησης που χρησιμοποιήθηκαν από το 1883 έως το 1923 μόνο τα 9 αναγνώριζαν το Σταφυλόκοκκο ως ξεχωριστό γένος [3]. Το 1900 το γένος Staphylococcus υποδιαιρέθηκε σε δύο υπογένη, τον Aureococcus aureus και τον Albococcus epidermidis. Το 1906 οι Andrews και Gordon πρότειναν μια ταξινόμηση των σταφυλοκόκκων με βάση το χρώμα και την παθογονικότητα τους στον ινδόχοιρο και έτσι προέκυψαν 4 είδη, ο Staphylococcus pyogenes (με πορτοκαλί, ανοικτό κίτρινο ή λευκό χρώμα, πολύ παθογόνος) ο Staphylococcus epidermidis albus (λευκός,ασθενώς παθογόνος) και άλλα δύο είδη λευκά μη παθογόνα [3].

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 12 Ο Loeb [4] το 1903 απέδειξε ότι ο Staphylococcus pyogenes aureus είχε την ικανότητα να πήζει το πλάσμα αίματος χήνας, ενώ ο Much [5] χρησιμοποίησε για την ίδια δοκιμασία αίμα κουνελιού και αλόγου. Στα μέσα της δεκαετίας του 1950 διατυπώθηκαν αρκετές απόψεις για το διαχωρισμό ή μη των σταφυλοκόκκων από τους μικρόκοκκους. Κατά μια άποψη προτεινόταν ο διαχωρισμός τους με βάση την ικανότητα τους να αναπτύσσονται ή όχι αναεροβίως και την παραγωγή ή μη οξέος από τη γλυκόζη. Επιπλέον αναγνωρίστηκαν δύο είδη, ο Staphylococcus aureus και ο Staphylococcus epidermidis, με βάση την αναερόβια διάσπαση της μαννιτόλης και την παραγωγή της πηκτάσης. Ο διαχωρισμός αυτός κατέτασσε όλους τους πηκτάση αρνητικούς σε ένα είδος, τον Staphylococcus epidermidis, ο οποίος όμως αποτελούνταν από ένα μεγάλο αριθμό μικροοργανισμών με σημαντική ετερογένεια. Ένα άλλο μειονέκτημα που παρουσίαζε ήταν ότι αυτός ο διαχωρισμός Staphlococcus Micrococcus με βάση την αναερόβια παραγωγή οξέος από τη γλυκόζη δεν ήταν τυποποιημένος και έτσι μερικά στελέχη μπορούσαν να ταξινομηθούν και στα δύο είδη. Με την αριθμητική ταξινόμηση το 1959 αποδείχθηκε ότι οι πηκτάση θετικοί σταφυλόκοκκοι ήταν μια ομοιογενής ομάδα σε αντίθεση με τους πηκτάση αρνητικούς σταφυλοκόκκους [3]. Το 1964 σε μια μεγάλη μελέτη που αφορούσε τον Staphylococcus epidermidis διαπιστώθηκαν τα εξής: 1) η ικανότητα του να αναπτύσσεται αναεροβίως σε υπόστρωμα με γλυκόζη, 2) η αδυναμία παραγωγής πηκτάσης, 3)η αδυναμία ζύμωσης της γλυκόζης, 4) η απαίτηση για ουρακίλη, 5) η αναγωγή νιτρικών αλάτων σε νιτρώδη, 6) η απαίτηση βιοτίνης για την ανάπτυξη τους [3]. Ο Baird Parker [6] ήταν ο πρώτος που διαχώρισε ειδικούς τύπους ανάμεσα στους πηκτάση αρνητικούς σταφυλοκόκκους. Η υποομάδα I περιλάμβανε τον Staphylococcus aureus και οι υποομάδες II έως VI που περιελάμβαναν τον Staphylococcus epidermidis διαχωρίστηκαν με βάση την παραγωγή φωσφατάσης και ακετοΐνης και την ικανότητα παραγωγής αεροβίως οξέος από την λακτόζη, μαλτόζη και μαννιτόλη.

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 13 Το 1965 η Διεθνής Επιτροπή για τη Συστηματική Βακτηριολογία τυποποίησε τη δοκιμασία της αναερόβιας ζύμωσης της γλυκόζης και έτσι έγινε ο διαχωρισμός μεταξύ του Staphylococcus και Micrococcus [3]. Τελικά στα μέσα της δεκαετίας του 60 έγινε σαφής διαχωρισμός των σταφυλοκόκκων με βάση τη σύνθεση του DNA [7]. Τα είδη του γένους των σταφυλοκόκκων έχουν στο DNA τους περιεκτικότητα σε G+C (γουανίνη+κυτοσίνη) 3039mol%, ενώ τα είδη του γένους των μικροκόκκων παρουσιάζουν μεγαλύτερο ποσοστό σε G+C(6373mol%). 2. ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ ΤΩΝ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 2.1 Ταξινόμηση Οι Σταφυλόκοκκοι είναι Gram (+) κόκκοι και υπάγονται στην οικογένεια των Micrococcocaceae. Η οικογένεια αυτή περιλαμβάνει τα γένη Micrococcus, Planococcus και Stomatococcus και δεν αποτελεί μια φυλογενετικά συναφή ομάδα [14]. Αποτελέσματα από τη μελέτη της σύνθεσης του DNA έδειξαν ότι το γένος των σταφυλοκόκκων και των μικροκόκκων δεν είναι στενά συνδεδεμένα. Το γένος των Σταφυλοκόκκων εμφανίζει μεγαλύτερη συγγένεια με το γένος των Enterococcus, Bacillus, Listeria, Planococcus και Brochothrix, ενώ το γένος των Μικροκόκκων με το γένος Arthrobacter από τα κορυνοβακτηριοειδή [15]. Οι σταφυλόκοκκοι και οι μικρόκοκκοι δίνουν θετική την αντίδραση της καταλάσης, σε αντίθεση με τους στρεπτόκοκκους και τους αερόκοκκους. Η δοκιμασία της καταλάσης στηρίζεται στην διάσπαση του H 2 O 2 με παρουσία Fe 3+ [10]. Ο Evans και συν. το 1955 [16] πρότειναν το διαχωρισμό των σταφυλοκόκκων και μικροκόκκων με βάση τη σχέση τους με το οξυγόνο. Με τον τρόπο αυτό οι προαιρετικά αναερόβιοι κόκκοι τοποθετήθηκαν στο γένος

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 14 των σταφυλοκόκκων, ενώ οι υποχρεωτικά αερόβιοι στο γένος των μικροκόκκων. Σήμερα είναι γνωστό ότι υπάρχουν εξαιρέσεις σε αυτή τη ταξινόμηση. Όπως ήδη αναφέρθηκε, στα μέσα της δεκαετίας του 60 έγινε ένας σαφής διαχωρισμός με βάση τη σύνθεση του DNA. Τα είδη του γένους των σταφυλοκόκκων έχουν περιεκτικότητα σε G+C (γουανίνη+κυτοσίνη) στο DNA τους 3039mol%, ενώ τα είδη του γένους των μικροκόκκων εμφανίζουν μεγαλύτερο ποσοστό σε G+C (6373mol%). Επειδή όμως ο προσδιορισμός της περιεκτικότητας του DNA σε G+C είναι μια εξειδικευμένη διαδικασία, η δοκιμασία ρουτίνας για το διαχωρισμό τους εξακολουθεί να είναι η αναερόβια ζύμωση της γλυκόζης (Hugh & Leifson test) [8]. Μερικοί όμως σταφυλόκοκκοι, όπως ο S. saprophyticus, παρουσιάζουν φτωχή ανάπτυξη κάτω από αναερόβιες συνθήκες, έτσι ώστε μπορεί λανθασμένα να χαρακτηριστούν ως μικρόκοκκοι.(kloos & Schleifer 1975, BairdParker 1979) [17,18]. Η απομόνωση της λυσοσταφίνης το 1964 εισήγαγε μια άλλη μέθοδο διαχωρισμού των σταφυλοκόκκων από τους μικροκόκκους. Η λυσοσταφίνη είναι μία εξωκυττάριος ουσία, που παράγεται από το Staphylococcus staphylolyticus και περιέχει μίγμα διαφόρων πρωτεϊνών, από τις οποίες μια είναι λυτική πεπτιδάση, η οποία διασπά τους δεσμούς γλυκυλγλυκίνης στις πέντα ή εξαπεπτιδικές αλληλογέφυρες της πεπτιδογλυκάνης του κυτταρικού τοιχώματος. Οι πένταπεπτιδικοί δεσμοί των σταφυλοκόκκων και των άλλων Gram (+) κόκκων διαφέρουν στα ποσοστά γλυκίνης και σερίνης και έτσι εξηγείται η διαφορά στην ευαισθησία τους στη λυσοσταφίνη [19]. Με τη μέθοδο αυτή διαπιστώθηκε ότι ο S. aureus λύεται από τη λυσοσταφίνη, ο S. epidermidis είναι λιγότερο ευαίσθητος, ενώ οι μικρόκοκκοι είναι ανθεκτικοί σε αυτήν. Ακόμη βασικές διαφορές ανάμεσα στους σταφυλοκόκκους και τους μικρόκοκκους, παρατηρούνται στη δομή του κυτταρικού τοιχώματος, αφού αυτό των σταφυλοκόκκων περιέχει πεπτιδογλυκάνη και τειχοϊκά οξέα, τα οποία δεν ανευρίσκονται στους μικροκόκκους.

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 15 Επίσης οι αναπνευστικοί άλυσσοι του σταφυλοκόκκου και του μικροκόκκου διαφέρουν στη σύνθεση των κυτοχρωμάτων και της μενακινόνης. Οι περισσότεροι σταφυλόκοκκοι περιέχουν μόνο α και b τύπους κυτοχρώματος, ενώ οι μικρόκοκκοι έχουν και cκαι d τύπους. Εξαίρεση αποτελούν οι S. caseolyticus, S. lentus, S. sciuri και S. vitulus, οι οποίοι περιέχουν συγχρόνως a, b, και c τύπους κυτοχρώματος [9]. Τελικά, περαιτέρω αξιόπιστα στοιχεία για το διαχωρισμό των σταφυλοκόκκων από τους μικρόκοκκους θεωρούνται η ικανότητα τους να αναπτύσσονται και να διασπούν τη γλυκερόλη με παραγωγή οξέος παρουσία 0,4mg/l ερυθρομυκίνης, η ευαισθησία τους σε 200mg/l λυσοσταφίνης και η αντοχή τους σε 25mg/l λυσοενζύμων με τη μέθοδο Schleifer & Kloos (1975)[8], η αντοχή τους στην βακιτρακίνη και η ευαισθησία τους στην φουραζολιδόνη [20]. Το γένος των σταφυλοκόκκων περιλαμβάνει μέχρι στιγμής περισσότερα από 30 είδη (πίνακας 1) και υπάρχουν αναφορές και για καινούρια είδη, όπως ο S. pettenkoferi, ο οποίος είναι πηκτάση αρνητικός σταφυλόκοκκος ευαίσθητος στη νοβοβιοκίνη [13]. Τα σπουδαιότερα είδη τα οποία έχει αποδειχθεί ότι είναι παθογόνα για τον άνθρωπο είναι οι S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. lugdunensis και S. saprophyticus, ενώ οι S. schleiferi, S. intermedius και S. hyicus ενδημούν σε ζώα. Τα κύρια χαρακτηριστικά του διαχωρισμού των σταφυλοκόκκων από τους άλλους Gram(+) κόκκους, αναφέρονται στον πίνακα 2 και τα κύρια χαρακτηριστικά τους με τα οποία διακρίνονται τα διάφορα είδη αυτών φαίνονται στον πίνακα 3 [9].

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 16 Πίνακας 1: Είδη σταφυλοκόκκων που ανήκουν στο γένος Staphylococcus. Staphylococcus aureus Ομάδα Staphylococcus Simulans S. aureus subsp. anaerobius S. simulans S. carnosus Ομάδα Staphylococcus Epidermidis S. epidermidis Ομάδα Staphylococcus Sciuri S. capitis S. sciuri S. capitis subsp. ureolyticus S. lentus S. caprae S. saccharolyticus Ομάδα Απροσδιορίστων S. warneri S. auricularis S. haemolyticus S. intermedius S. hominis S. hyicus S. lugdunensis S. caseolyticus S. schleiferi S. delphini S. chromogenes Ομάδα Staphylococcus Saprophyticus S. muscae S. piscifermentans S. saprophyticus S. felis S. cohnii S. cohnii subsp. ureolyticus S. xylosus S. arlettae S. equorum S. gallinarium S. succinus S. kloossii

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 17 Πίνακας 2. Διαφοροποίηση των σταφυλοκόκκων από άλλους gram (+) κόκκους. Ανάπτυξη σε: Αντοχή σε: Genus and exceptional species Mol%G+C of DNA Υποχρεωτικά αερόβια Προαιρετικά αναερόβια ή μικροαερόφιλα Υποχεωτικά αναερόβια Τετραδικοί κόκκοι Προσκόλληση στο άγαρ Κινητικότητα 5% NaCl άγαρ 6.5% NaCl άγαρ 12% NaCl άγαρ Staphylococcus 3039 d d + + d + + + d + + + + S. aureus subsp. Anaerobius ± ± + + d + + ND + ND S. saccharolyticus ± ± + + + ± ± + + ND + ND S. hominis ± ± + + ± + + + + + + + + S. auricularis + + + + ± + + + + ND + + S. saprophyticus, S. cohnii, S. d d + + ± + + + + + + + xylosus S. kloosii, S. equorum, S. ± ± + + ± d + + + + + + arlettae S. intermedius + + + + + + + + + ± + + S. caseolyticus, S. sciuri, S. lentus, ± ± d + + d d + + + + + + + S. vitulus Enterococcus 3442 + d + + (±) + + d (±) + + + Streptococcus 3446 + d d d + d + d Aerococcus 3540 + + + + + (+) ND ND + ND Planococcus 3952 + d + + + + + + ND ND + ND ND Stomatococcus 5660 + d + ± + + d ND + ND d Micrococcus 6675 + + + + d + + + + + M. kristinae ± ± + + + ± + + + (+) + (±) + + M. agilis + + d + ± + + + d + +, $90% των στελεχών είναι θετικά, ", $90% των στελεχών είναι ασθενώς θετικά,, $90% των στελεχών είναι αρνητικά, d, 1189% των στελεχών είναι θετικά ( ), βραδεία αντίδραση P agar σε 18 ώρες καταλάση Benzidine test Τρ. Δοκιμ. οξειδάσης Αναερόβιο οξύ από γλυκόζη Αναερόβιο οξύ από γλυκερόλη Ανάπτυξη σε Schleifer Kramer agar λυσοσταφίνη 200μg/ml) ερυθρομυκίνη (0.04 μg/ml) Βακιτρακίνη (0.04 U) Furazolidone (100μg)

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 18 Πίνακας 3. Βιοχημικές Ιδιότητες των ειδών του Σταφυλοκόκκου Ιδιότητες S. aureus S. epidermidis S. capitis S. capitis subs. ureolyticus S. caprae S. saccharolyticus S. warneri S. haemolyticus S. hominis S. lugdunensis S. schleiferi S. saprophyticus Κοαγκουλάση + + d + ελεύθερη Κοαγκουλάση + (+) + d συνδεδεμένη Νουκλεάση + + + + θερμοανθεκτική Αιμολυσίνες + (d) (d) (d) (d) (d) (+) (+) (+) (d) (d) (d) (d) (d) (d) d + Αργινίνη + Ορνιθίνη (d) ND + Πυρρολιδόνη (d) d ND + + + (d) d d + + d + Ουρεάση (d) + + + ND + + d + + + + + d + + d + Αλκαλική + + d + + d (+) (+) (+) d (d) + + (+) + + Φωσφατάση Β Γαλακτοσιδάση ND (+) + + + d d d d + + (d) + Ακετοίνη (VP) + + d d + ND + + d + + + d d d d d + Νιτρικά + + d + + + d + d + + d + + + + + + d + + + Εσκουλίνη ND d d + d + + Αντοχή σε 10% + + NaCl Αντοχή στη + + + + + + + + + + νοβοβιοκίνη Αντοχή στην + + + ND ND d + + + πολυμυξίνη Μαννιτόλη + + + d d d d d + + + + + + + + + + (d) Μαννόζη + (+) + + + (+) + + (d) + + + + + d + (d) (+) + + + Τρεχαλόξη + (+) + + d + d + + + + + + + + d d + + (+) + + + Λακτόζη + d + d d d + d + d + + d (d) + d (d) d d + + Καταλάση + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Οξειδάση + + +, $90% των στελεχών είναι θετικά, ", $90% των στελεχών είναι ασθενώς θετικά,, $90% των στελεχών είναι αρνητικά, d, 1189% των στελεχών είναι θετικά ( ), βραδεία αντίδραση S. cohnii S. cohnii subs. ureolyticus S. xylosus S. arlettae S. equorum S. gallinarium S. kloossii S. simulans S. carnosus S. sciuri S. lentus S. auricularis S. intermedius S. hyicus S. delphini

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 19 2. 2 Γενικοί χαρακτήρες Το γένος των Σταφυλοκόκκων περιλαμβάνει Gram (+) κόκκους διαμέτρου 0,81,5 μm, που διατάσσονται σε μικρές ομάδες με σχήμα σταφυλιού ή σε σειρά τεσσάρων το πολύ κόκκων. Δεν έχουν βλεφαρίδες και σπόρους και είναι ακίνητοι. Δεν φέρουν έλυτρο, αλλά ορισμένα στελέχη αναπτύσσουν ένα λεπτό περίβλημα από αμινογλυκουρονικό οξύ, το οποίο προσδίδει στον S.aureus αντοχή στη φαγοκυττάρωση. Δίνουν θετική την αντίδραση της καταλάσης. Τα περισσότερα είδη είναι αερόβια και προαιρετικά αναερόβια. Αντέχουν στη ξηρότητα του ατμοσφαιρικού αέρα και στη θερμοκρασία των 50 C για 30 λεπτά. 2.3 Καλλιεργητικοί χαρακτήρες Αναπτύσσονται στα συνήθη θρεπτικά υλικά, όπως το αιματούχο άγαρ, το BHIA (άγαρ από εκχύλισμα εγκεφάλουκαρδιάς), το θρεπτικό άγαρ, και σε μεγάλο εύρος θερμοκρασιών (1042 C) με ευνοϊκότερη θερμοκρασία τους 35 37 C. Η μεγάλη αντοχή σε υψηλές πυκνότητες NaCl (810%) χρησιμοποιείται για την απομόνωση του από υλικά που περιέχουν και άλλα μικρόβια [8]. Σε υγρά θρεπτικά υλικά προκαλεί ομοιομερή θολερότητα. Σε στερεά θρεπτικά υλικά αναπτύσσονται μέσα σε 24 ώρες με αποικίες στρογγυλές 13mm διάμετρο, λείες, υπερυψωμένες και λάμπουσες, οι οποίες παράγουν διάφορες χρωστικές, από άσπρες έως πορτοκαλί και μπορούν να παρουσιάσουν μερικές φορές ζώνες αιμόλυσης στο αιματούχο άγαρ, λόγω παραγωγής αιμολυσίνης. Η χρωστική του S.aureus, η οποία οφείλεται στην ύπαρξη καροτινοειδών, αναπτύσσεται καλύτερα μετά από παρατεταμένη επώαση, ενώ κατά την αναερόβια ανάπτυξη και κατά την καλλιέργεια σε υγρά θρεπτικά υλικά, οι αποικίες δεν παράγουν χρωστική [9]. Οι S.aureus subsp. anaerobius, S. saccharolyticus, S. auricularis, S.equorum, S.caseolyticus, S. vitulus, S. lentus αναπτύσσονται με πιο αργό ρυθμό και χρειάζονται συνήθως 2436 ώρες για την ανάπτυξη των αποικιών. Οι αποικίες του S.aureus είναι συνήθως μεγάλες (68mm διάμετρο), γυαλιστερές, ελαφρώς υπερυψωμένες και ημιδιαφανείς. Οι αποικίες του S.

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 20 epidermidis είναι σχετικά μικρότερες (2,56 mm διάμετρο), συνήθως χωρίς χρώμα, ενώ του S. haemolyticus είναι συνήθως μεγαλύτερες (59 mm διάμετρο) γυαλιστερές και αδιαφανείς, χωρίς χρώμα ή άσπρες μέχρι κίτρινοπορτοκαλί. Οι αποικίες του S. lugdunensis έχουν συνήθως διάμετρο 47 mm, είναι γυαλιστερές, λείες, χωρίς χρώμα ή άσπρες μέχρι κίτρινοπορτοκαλί. Οι αποικίες του S. saprophyticus είναι μεγάλες 58 mm διάμετρο, λείες, γυαλιστερές, αδιαφανείς και κυρτές. Την ίδια διάμετρο εμφανίζουν και οι αποικίες του S. intermedius και του S. hyicus, ελαφρώς κυρτές, γυαλιστερές και συνήθως άχρωμες. Οι αποικίες του S. intermedius είναι ημιδιαφανείς, ενώ του S. hyicus είναι αδιαφανείς και γίνονται ημιδιαφανείς ύστερα από παρατεταμένη επώαση [9]. Με τη ζύμωση διαφόρων σακχάρων και με την εφαρμογή διαφόρων άλλων βιοχημικών δοκιμασιών (Πίνακας 3) γίνεται η ταυτοποίηση των διαφόρων ειδών των σταφυλοκόκκων. 2.4 Κατασκευή και χημική σύσταση Το κυτταρικό τοίχωμα των σταφυλοκόκκων περιέχει πεπτιδογλυκάνη και τειχοϊκά οξέα, τα οποία δεν ανευρίσκονται στους μικροκόκκους (εικ. 1). Εικόνα 1: Δομή κυτταρικού τοιχώματος σταφυλοκκόκου.

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 21 Η πεπτιδογλυκάνη αποτελεί το μεγαλύτερο μέρος του κυτταρικού τοιχώματος, αφού αποτελεί το 50% του βάρους του. Αποτελείται από τα αμινοσάκχαρα Νακετυλογλυκοζαμίνη και Νακετυλομουραμικό οξύ, που συνδέονται μεταξύ τους με 1,4 βγλυκοσιδικό δεσμό. Με την καρβοξυλική ομάδα του Νακετυλομουραμικού οξέος ενώνονται τετραπεπτιδικές αλυσίδες που αποτελούνται από τα αμινοξέα D γλουταμινικό οξύ, D και L αλανίνη και L λυσίνη. Οι πεπτιδικές αλυσίδες του Νακετυλομουραμικού οξέος ενώνονται μεταξύ τους με πενταπεπτιδική γέφυρα γλυκίνης [10]. Η δομή της πεπτιδογλυκάνης αποικονίζεται στην εικόνα 2 [132]. Εικόνα 2: Δομή πετιδογλυκάνης. Μ: Νακετυλομουραμικό οξύ, ΓΛ: Ν ακετυλογλυκοζαμίνη, ο και Δ τα αμινοξέα: Lαλα (αλανίνη), Dγλου (γλουταμινικό οξύ), Lλυσ (λυσίνη), Dαλα (αλανίνη) και γλυ (γλυκίνη). Οι δύο τετραπεπτιδικές αλυσίδες ενώνονται μεταξύ τους με πενταπεπτιδική γέφυρα γλυκίνης.

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 22 Στη πεπτιδογλυκάνη οφείλεται η στερεότητα του τοιχώματος του σταφυλοκόκκου και καταστρέφεται με την επίδραση της λυσοζύμης ή οξέων. Παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογόνο δράση του σταφυλοκόκκου, προκαλεί την παραγωγή ιντερλευκίνης 1 από τα φαγοκύτταρα και χημειοτακτισμό για τη συγκέντρωση των πολυμορφοπυρήνων στο σημείο της φλεγμονής [11, 12]. Τα τειχοϊκά οξέα αποτελούνται από μια ομάδα φωσφορικών πολυμερών. Κάποια από αυτά βρίσκονται συνδεδεμένα με την πεπτιδογλυκάνη (τειχοϊκά οξέα του κυτταρικού τοιχώματος) αποτελούμενα από μια εναλλασόμενη ακολουθία φωσφορικής ριβιτόλης, ενώ άλλα είναι συνδεδεμένα με λιπίδια της κυτταρικής μεμβράνης (τειχοϊκά οξέα της μεμβράνης) και αποτελούνται από φωσφορική γλυκερόλη σε επαναλαμβανόμενες μονάδες [10]. Στο κυτταρικό τοίχωμα πολλών στελεχών του Staphylococcus aureus ανευρίσκεται η μικρού μοριακού βάρους, πρωτεΐνη Α. Η πρωτεΐνη αυτή συνδέεται με το Fc τμήμα της ανοσοσφαιρίνης IgG. Μ αυτόν τον τρόπο τα δύο τμήματα Fab μένουν ελεύθερα, με τα οποία μπορεί να συνδεθούν αντιγόνα προς τα οποία το μόριο της IgG είναι ομόλογο. Η ιδιότητα αυτή έχει πολλές πρακτικές εφαρμογές στην εργαστηριακή διάγνωση, για την αναζήτηση αντιγόνων μικροβίων, όταν το ειδικό IgG αντίσωμα προσκοληθεί με το Fc τμήμα του με την πρωτεΐνη Α και αναφέρεται ως δοκιμασία επισυγκόλλησης [11]. Άλλες βασικές πρωτεΐνες του κυτταρικού τοιχώματος είναι οι τέσσερεις πενικιλλοδεσμευτικές πρωτεΐνες (Penicillin Binding ProteinsPBPs), οι οποίες είναι διαφορετικές μεταξύ τους και σχετίζονται με την σύνθεση της πεπτιδογλυκάνης και την σύνδεση των β λακταμικών αντιβιοτικών. Ο ρόλος τους αναλύεται στο Κεφάλαιο 9. 2.5 Τοξίνες και ένζυμα Ο S. aureus παράγει περίπου 30 τοξίνες και ένζυμα, από τα οποία των περισσοτέρων η παραγωγή ρυθμίζεται από την ύπαρξη πλασμιδίων. Οι κυριότερες είναι :

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 23 2.5.1 Πηκτάση (κοαγκουλάση) Η ικανότητα πήξης του πλάσματος από ορισμένους σταφυλοκόκκους συνεχίζει να είναι το πιο αξιόπιστο κριτήριο της διάκρισης των κυρίως παθογόνων σταφυλοκόκκων, όπως είναι ο S. aureus στους ανθρώπους και στα ζώα και των S. hyicus και S. intermedius που είναι παθογόνοι μόνο για τα ζώα. Τα σπάνια στελέχη S. aureus που είναι πηκτάση αρνητικά, είναι επίσης παθογόνα. Η πηκτάση είναι εξωκυττάρια ενζυμική πρωτεΐνη, που προκαλεί πήξη του πλάσματος του ανθρώπου και του κουνελιού, του οποίου η πήξη έχει ανασταλεί με κιτρικά ή οξαλικά άλατα, όχι όμως του προβάτου. Η πηκτάση διασπάται από τη θρυψίνη και την πεψίνη. Συναντάται σε δύο μορφές, την ελεύθερη και τη συνδεδεμένη. Η ελεύθερη είναι εξωτοξίνη και εκκρίνεται από το μικρόβιο όταν αναπτύσσεται σε ζωμό. Η πήξη επιτελείται παρουσία ενός παράγοντα που υπάρχει στο πλάσμα του αίματος. Ο παράγοντας αυτός αντιδρά με την πηκτάση, με δράση παρόμοια της ενεργοποίησης της προθρομβίνης σε θρομβίνη και διεγείρει την μετατροπή του ινωδογόνου σε ινώδες. Η πηκτάση έτσι προφυλάσσει τον S. aureus από τη φαγοκυττάρωση και δημιουργεί μια κάψα από ινική γύρω από το σημείο προσβολής του ιστού. Η συνδεδεμένη πηκτάση προκαλεί αδροσυγκόλληση πυκνού εναιωρήματος σταφυλοκόκκου, χωρίς τη μεσολάβηση παράγοντος από το πλάσμα. Η παραγωγή της συνδεδεμένης κοαγκουλάσης είναι ανεξάρτητη από την παραγωγή της ελεύθερης Ο παράγοντας προσκόλλησης (clumping factor) θεωρείται συνώνυμο της συνδεδεμένης κοαγκουλάσης, αν και αναφέρεται στη βιβλιογραφία από ορισμένους συγγραφείς ως ξεχωριστή οντότητα [21]. 2.5.2 Αιμολυσίνες Οι αιμολυσίνες είναι εξωτοξίνες που καταστρέφουν τη μεμβράνη και διαφέρουν μεταξύ τους στην αντιγονική δομή και στη δράση τους στα ερυθρά αιμοσφαίρια διαφορετικών ειδών.

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 24 Σχεδόν όλα τα στελέχη του S. aureus παράγουν μία ή περισσότερες από τις 4 αιμολυσίνες, οι οποίες δρουν καταστροφικά στην μεμβράνη των κυττάρωνστόχων. Α). Η ααιμολυσίνη, είναι πρωτεΐνη Μ.Β. 30000 και είναι η σπουδαιότερη των αιμολυσινών. Ηλεκτροφορητικά είναι μια ετερογενής πρωτεΐνη, η οποία δρα σε μεγάλο εύρος κυτταρικών μεμβρανών, όπως των ερυθροκυττάρων, των αιμοπεταλίων, των λευκοκυττάρων κ.α,αλλά δεν δρα στις κυτταροπλασματικές μεμβράνες των βακτηριδίων [9]. Τα ευαίσθητα κύτταρα διαθέτουν ειδικό υποδοχέα για την ατοξίνη, ο οποίος επιτρέπει χαμηλές συγκεντρώσεις της τοξίνης να συνδεθούν, δημιουργώντας μικρούς πόρους από τους οποίους μπορούν να εξέρχονται μονοσθενή κατιόντα. Σε υψηλές συγκεντρώσεις η τοξίνη δρα μη ειδικά στα λιπίδια της μεμβράνης, δημιουργώντας μεγαλύτερους πόρους, από τους οποίους εξέρχονται πολυσθενή κατιόντα και μικρά μόρια [21]. Η ααιμολυσίνη αιμολύει τα ερυθρά προβάτου και κονίκλου, όχι όμως του ανθρώπου. Αντίθετα, στον άνθρωπο τα μονοπύρηνα και τα αιμοπετάλια είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα στη δράση της, γιατί διαθέτουν θέσεις με μεγάλη χημική συγγένεια προς την τοξίνη, επιτρέποντας έτσι στην τοξίνη να συνδεθεί στις κυτταρικές μεμβράνες. Ακολουθεί μια σειρά από δευτεροπαθείς αντιδράσεις, με αποτέλεσμα την απελευθέρωση κυτταροκινών, οι οποίες κινητοποιούν την παραγωγή φλεγμονωδών παραγόντων (mediators). Η ααιμολυσίνη προκαλεί νέκρωση του δέρματος του κονίκλου, μετά από ενδοδερμική ένεση, ενώ μετά από ενδοφλέβια ένεση, προκαλεί το θάνατο του κονίκλου και του μυός. Β). Η βαιμολυσίνη είναι σφιγγομυελινάση, η οποία καταστρέφει μεμβράνες πλούσιες σε σφιγγομυελίνη. Η δράση της αφορά μια πλειονότητα κυττάρων, όπως τα ανθρώπινα ερυθροκύτταρα, τα λευκά αιμοσφαίρια και τους ινοβλάστες. Αιμολύει τα ερυθρά προβάτου, ενώ έχει διαπιστωθεί ότι στην πλειονότητα των στελεχών του S. aureus, που απομονώνεται από ανθρώπους δεν εκφράζεται η βτοξίνη [21].

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 25 Γ). Η γαιμολυσίνη προκαλεί αιμόλυση των ερυθρών του αλόγου και του ανθρώπου [8] με άγνωστο μηχανισμό, αν και υπάρχουν ενδείξεις ότι δρα μαζί με την λευκοκτονίνη στην καταστροφή των μεμβρανών των κυττάρων. Αναφέρεται ότι εκφράζεται με 3 πρωτεΐνες, από τις οποίες τα τμήματα B και C σχηματίζουν μια λευκοτοξίνη με μικρή αιμολυτική δράση, ενώ τα τμήματα Α και Β εμφανίζουν αιμολυτική και πολύ μικρή λευκοτοξική δράση [21]. Δ). Η δαιμολυσίνη είναι ηλεκτροφορητικά ετερογενής, με ιδιαίτερα χαρακτηριστικά την υδροφοβία και την θερμοαντοχή. Δρα στην επιφάνεια των κυττάρων, καταστρέφοντας τις κυτταρικές μεμβράνες με μια δράση παρόμοια του απορρυπαντικού (detergentlike). Πιθανολογείται ότι παίζει ρόλο στην εμφάνιση της οξείας διάρροιας σε ορισμένες σταφυλοκοκκικές λοιμώξεις, λόγω της αναστολής της απορρόφησης του ύδατος και της ταυτόχρονης ενεργοποίησης της παραγωγής του κυκλικού αδενοσινομονοφωσφορικού οξέος (camp) στον ειλεό κουνελιών και ινδικών χοιριδίων [28]. Στελέχη του S. albus δεν παράγουν αυτές τις αιμολυσίνες, παράγουν όμως άλλες αιμολυσίνες, όπως την ε αιμολυσίνη, που δρα σε ερυθρά κουνελιού και προβάτου. Αν και η ύπαρξη των τοξινών μπορεί να διαπιστώνεται πολύ συχνά με τη ζώνη αιμόλυσης, που σχηματίζεται γύρω από τις αποικίες στο αιματούχο άγαρ, ωστόσο η ειδική αναγνώριση τους, απαιτεί αντιορούς και δεν χρησιμοποιείται ιδιαίτερα στην εργαστηριακή πράξη. 2.5.3 Θερμοανθεκτική νουκλεάση (tdnαση) Πάνω από το 99% των κοαγκουλάση θετικών στελεχών του S. aureus παράγουν θερμοανθεκτική νουκλεάση, η οποία υδρολύει το DNA.Εντούτοις, ορισμένα στελέχη των S. epidermidis, S. simulans, και S. carnosus παρουσιάζουν tdnαση με ασθενή δραστηριότητα [9]. Η DNάση του S. aureus είναι ανθεκτική στην θέρμανση για 15 λεπτά στους 100ºC. Η παραγωγή του ενζύμου αυτού συνδέεται και με την παραγωγή εντεροτοξίνης. Για αυτό το λόγο σε περιπτώσεις τροφικής δηλητηρίασης

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 26 μπορεί να αναζητηθεί η παραγωγή της DNάσης, η οποία είναι ευκολότερη ως δοκιμασία από αυτή της παραγωγής εντεροτοξίνης. 2.5.4. Εντεροτοξίνες Οι εντεροτοξίνες είναι διαλυτές εξωκυττάριες τοξίνες, που παράγονται από το 3050% των στελεχών του S. aureus, ιδιαίτερα αυτών που ανήκουν στην φαγοκυτταρική ομάδα III. Οι κοαγκουλάση αρνητικοί σταφυλόκοκκοι δεν παράγουν εντεροτοξίνες. Το γονίδιο που ευθύνεται για την παραγωγή της εντεροτοξίνης εδρεύει στο χρωμόσωμα του μικροβίου. Έχουν ιδιότητες υπεραντιγόνων, συνδέονται με τα μόρια μείζονος συστήματος ιστοσυμβατότητας (MHC) τάξεως II και προκαλούν ενεργοποίηση των Τλεμφοκυττάρων [50]. Τα διάφορα στελέχη S. aureus παράγουν οκτώ διαφορετικούς αντιγονικούς τύπους εντεροτοξινών (A,B,C,D,E,F,G,I), που διακρίνονται μεταξύ τους με ιζηματινοαντιδράσεις. H εντεροτοξίνη F πιθανολογείται ότι εμπλέκεται και στο σύνδρομο της τοξικής καταπληξίας [10], ενώ κατά άλλους ερευνητές στο σύνδρομο αυτό εμπλέκονται και οι εντεροτοξίνες G και I [71]. Οι εντεροτοξίνες παράγονται από στελέχη S. aureus, που αναπτύσσονται σε τρόφιμα πλούσια σε υδατάνθρακες και πρωτεΐνες, προκαλώντας τροφική δηλητηρίαση. Η δηλητηρίαση αυτή, οφείλεται μόνο στις εντεροτοξίνες και όχι στο σταφυλόκοκκο. Η εμφάνιση των συμπτωμάτων, η οποία χαρακτηρίζεται από εμέτους και διαρροϊκές κενώσεις χωρίς πυρετό, γίνεται μέσα σε λίγες ώρες (18 ώρες) από τη λήψη της μολυσμένης τροφής [11]. Η τοξίνη αυτή, η οποία είναι θερμοανθεκτική, αφού μπορεί να παραμείνει ενεργή μετά από θέρμανση σε 100ºC για 30 λεπτά, δρα στο νευρικό σύστημα και όχι όπως άλλες εντεροτοξίνες, στο εντερικό επιθήλιο. Η πρόκληση του εμέτου, οφείλεται στον ερεθισμού του κέντρου του εμέτου του ΚΝΣ, από τη δράση της τοξίνης σε νευρικούς υποδοχείς του εντέρου [8]. Αναφέρονται διάφοροι μέθοδοι για την ταυτοποίηση των τοξινών αυτών με την χρήση αντιορών (Bergdoll,1970)[31] ή με τη μέθοδο των Casman &

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 27 Bennett, τροποποιημένη από τους Gilbert και συν. (1972) [32], η οποία ανιχνεύει μέχρι και 0,02 μg τοξίνης / g τροφής. 2.5.5 Τοξίνη του συνδρόμου τοξικής καταπληξίας (TSST1) Πρόκειται για μια εξωτοξίνη, που παράγεται από ειδικά στελέχη του S. aureus (φαγοκυτταρικής ομάδας Ι και λυσιτύπου 29). Ο λυσίτυπος αυτός δεν ανήκει στη φυσιολογική χλωρίδα του ρινοφάρυγγα και του δέρματος. Προκαλεί το σύνδρομο της τοξικής καταπληξίας, αν και έχουν αναφερθεί περιπτώσεις του συνδρόμου, που οφείλονταν σε σταφυλόκοκκο πηκτάση αρνητικό και στρεπτόκοκκο πυογόνο [33,34]. Η παραγωγή της τοξίνης αυτής ρυθμίζεται από γονίδιο που εδρεύει στο χρωμόσωμα, ενώ για τη σύνθεση της απαραίτητο είναι και το μαγνήσιο [35]. Είναι υπεραντιγόνο και έχει την ιδιότητα να ενεργοποιεί τα Τ λεμφοκύτταρα [36]. Θεωρείται επίσης ότι προάγει την παραγωγή του παράγοντα νέκρωσης των όγκων (tumor necrosis factor) [37] και της ιντερλευκίνης1 [10, 38]. H ανίχνευση της τοξίνης γίνεται με διάφορες μεθόδους, όπως RIA, ELISA ή με κροκυδωτικές μεθόδους [39]. 2.5.6 Λευκοκτονίνη Η Panton Valentine (PV) λευκοκτονίνη και η γαιμολυσίνη θεωρείται ότι ανήκουν σε μία ομάδα συνεργουμενοτροπικών τοξινών. Υπάρχουν τουλάχιστον πέντε διαφορετικές πρωτεΐνες που ανήκουν στην οικογένεια αυτή και χωρίζονται σε δύο τάξεις, F (Fast) και S (Slow), με βάση τον διαχωρισμό τους με την χρωματογραφική μέθοδο με στήλες. Oι πρωτεΐνες HlgA, HlgC και LukSPV ανήκουν στην τάξη S, ενώ οι HlgB και LukFPV στην τάξη F [40]. Τα δύο κλάσματα της τοξίνης ενεργούν συνεργικά στη μεμβράνη των φαγοκυττάρων, δημιουργώντας πόρους και έτσι αυξάνεται η διαπερατότητα της μεμβράνης και η έξοδος των κατιόντων [28]. Διαφέρουν όμως μεταξύ τους, αφού η δράση της PV δεν είναι αιμολυτική και παράγεται μόνο από το 2% των S. aureus [40]. Καταστρέφει τα λευκά αιμοσφαίρια του ανθρώπου και του κουνελιού. Ένεση λευκοκτονίνης προκαλεί αναστρέψιμη ακοκκιοκυτταραιμία.

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 28 Η καταστροφή της μεμβράνης των κυττάρων μπορεί να διαπιστωθεί μικροσκοπικά μέσα σε 60 λεπτά. Έχει παρατηρηθεί επίσης δερμονεκρωτική δράση αυτής, μετά από ενδοδερμική ένεση σε κουνέλια [41]. Η σημασία της για την παθογόνο δράση του σταφυλοκόκκου δεν είναι πλήρως διευκρινισμένη. 2.5.7 Αποφολιδωτική τοξίνη Η τοξίνη αυτή περιλαμβάνει 2 τουλάχιστον πρωτεΐνες (Exfolative Toxin AETA και Exfolative Toxin BETB), οι οποίες διαφέρουν ορολογικά και βιοχημικά και παρουσιάζουν 40% ομολογία στις αλληλουχίες τους [42,43,44]. Η αποφολιδωτική τοξίνη Α (ΕΤΑ) αποτελείται από 242 αμινοξέα, με μοριακό βάρος 26,950kDa, ενώ η αποφολιδωτική τοξίνη Β (ΕΤΒ) έχει 246 αμινοξέα με μοριακό βάρος 27,274 kda. Η αποφολιδωτική τοξίνη Α εκφράζεται από γονίδιο που εδρεύει στο χρωμόσωμα, είναι θερμοανθεκτική και απενεργοποιείται από το EDTA, ενώ η αποφολιδωτική τοξίνη Β έχει πλασμιδιακή προέλευση [47], είναι σχετικά θερμοευαίσθητη και δεν επηρεάζεται από το EDTA [10]. Η τοξίνη αυτή παράγεται μόνο από ορισμένα στελέχη, χωρίς να έχει βρεθεί σχέση μεταξύ του φαγοτύπου και του τύπου της τοξίνης που παράγουν. Στην αποφολιδωτική τοξίνη οφείλεται το σταφυλοκοκκικό σύνδρομο αποκολλήσεως της επιδερμίδας (Staphylococcal scalded skin syndromessss), που εμφανίζεται συνήθως στα βρέφη και ονομάζεται νόσος Ritter. Καταστρέφει τη σύνδεση μεταξύ των κυττάρων του δέρματος και προκαλεί μεγάλες περιοχές απολέπισης, που μοιάζουν με έγκαυμα. Τα πειράματα των Melish και συν. [45] στις αρχές της δεκαετίας του 70 απέδειξαν ότι οι αποφολιδωτικές τοξίνες του σταφυλοκόκκου είναι υπεύθυνες για το φυσαλιδώδες μολυσματικό κηρίο (bullus impetigo) και το SSSS. Τελευταίες έρευνες δείχνουν ότι οι αποφολιδωτικές τοξίνες διασπούν την δεσμογλεϊνη 1(Dsg1), μια σημαντική δεσμοσωματική πρωτεΐνη [46]. Έχουν αναφερθεί δύο ακόμα τύποι σταφυλοκοκκικής αποφολιδωτικής τοξίνης, που προσβάλλουν ζώα [48, 49]. Ο Staphylococcus hyicus είναι υπεύθυνος για την εξιδρωματική επιδερμίτιδα των νεαρών χοίρων, που είναι

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 29 μικρότερα του ενός μηνός. Η υπεύθυνη τοξίνη ShET έχει πρόσφατα απομονωθεί από τον Staphylococcus hyicus [49]. 2.5.8 Σταφυλοκινάση Σε πολλά στελέχη S. aureus υπάρχει ένας ενεργοποιητής του πλασμινογόνου, η σταφυλοκινάση, η οποία σχετίζεται γενετικά με λυσογονικούς βακτηριοφάγους. Το σύμπλεγμα που δημιουργείται ανάμεσα στην σταφυλοκινάση και το πλασμινογόνο ενεργοποιεί μια πρωτεολυτική δράση παρόμοια της πλασμίνης, η οποία προκαλεί διάλυση των θρόμβων της ινικής [21]. 2.5.9 Άλλες ουσίες Εκτός από τις παραπάνω, ο S. aureus παράγει και άλλες ουσίες, όπως η υαλουρονιδάση, η οποία βοηθά στη διεισδυτικότητα του λόγω διασπάσεως του υαλουρονικού οξέος, λιπάσες καθώς και βλακταμάσες που παράγονται από στελέχη ανθεκτικά στις πενικιλλίνες.

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 30 3. ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΠΡΟΛΗΨΗ 3.1 Επιδημιολογία του S. aureus Η επιδημιολογία των λοιμώξεων από τον S. aureus μπορεί να περιγραφεί καλύτερα, παρατηρώντας τις αλλαγές που παρουσιάζει η αποίκηση του ανθρώπου από το μικρόβιο κατά τη διάρκεια της ζωής του. Λίγο μετά τη γέννηση πολλά νεογνά αποικίζονται από το άμεσο ανθρώπινο περιβάλλον τους στο δέρμα, στον ομφάλιο λώρο, στην περινεϊκή χώρα και σε μερικές περιπτώσεις και στο γαστεντερικό σωλήνα. Τα παιδιά και οι ενήλικες μπορούν να γίνουν φορείς του S. aureus με συχνότερο σημείο εντοπισμού την πρόσθια ρινική κοιλότητα, όπου φαίνεται ότι μπορεί να γίνει εύκολα η προσκόλληση του μικροοργανισμού με τη βοήθεια των τειχοϊκών οξέων [10]. Η ρινική φορεία στους ενήλικες υπολογίζεται ότι είναι στο 2040% του πληθυσμού και εξαρτάται από την εποχή και από τοπικούς επιδημιολογικούς παράγοντες [10] [241]. Υπολογίζεται ότι μόνο 20% του πληθυσμού δεν θα αποικιστούν από στέλεχος S. aureus κατά τη διάρκεια της ζωής τους. Κάποιες ομάδες του πληθυσμού εμφανίζουν μεγαλύτερα ποσοστά φορείας. Στις ομάδες αυτές συμπεριλαμβάνονται το ιατρονοσηλευτικό προσωπικό, οι ασθενείς με ινσουλινοεξαρτώμενο διαβήτη, οι ασθενείς που υπόκεινται σε αιμοκάθαρση ή περιτοναική διάλυση και οι χρήστες ενδοφλεβίων ουσιών [10]. Οι φορείς μπορούν να μεταφέρουν το μικρόβιο από τις πρόσθιες ρινικές κοιλότητες στο δέρμα τους, οπότε σε περίπτωση που υπάρχει τραυματισμός μπορεί να γίνει η είσοδος του μικροβίου και να προκαλέσει τοπική ή γενικευμένη λοίμωξη. Για την εκρίζωση της ρινικής φορείας χορηγείται τοπικά μουπιροσίνη, η κλινική χρησιμότητα της οποίας αναλύεται στο σχετικό κεφάλαιο. 3.2 Επιδημιολογία των νοσοκομειακών MRSA στελεχών Η αυξανόμενη εξάπλωση σε όλο τον κόσμο των S. aureus ανθεκτικών στην μεθικιλλίνη (MRSA) η οποία ξεκίνησε από τις αρχές του 1960 [154] έχει

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 31 δημιουργήσει σοβαρά προβλήματα στην αντιμικροβιακή θεραπεία. Τα ποσοστά εμφάνισης των στελεχών αυτών ποικίλλουν ανάλογα με την γεωγραφική περιοχή. Στην Ευρώπη, ενώ στα Σκανδιναβικά νοσοκομεία είναι σπάνια (<2%) στην Μεσόγειο τα ποσοστά αγγίζουν το 40% [155]. Το ποσοστό των MRSA στελεχών αποτελεί δείκτη της ποιότητας της υγιεινής ενός νοσοκομείου [153]. Τα ανθεκτικά στελέχη παίζουν σπουδαίο ρόλο, γιατί είναι συνήθη αίτια ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων και η συχνότητα απομόνωσης τους είναι συνεχώς αυξανόμενη, στους νοσοκομειακούς ασθενείς αλλά και στον υπόλοιπο πληθυσμό. Συχνά μόνο η βανκομυκίνη είναι το φάρμακο εκλογής, αν και μερικά στελέχη είναι ευαίσθητα στις κινολόνες, στην τριμεθοπρίμησουλφομεθαξαζόλη, στην γενταμυκίνη ή την ριφαμπικίνη. Η μετάδοση των στελεχών αυτών γίνεται από ασθενή σε ασθενή μέσω των χεριών του ιατρονοσηλευτικού προσωπικού, από επιμολυσθέντα αντικείμενα ή μέσω του αέρα. Επομένως τα μέτρα πρόληψης περιλαμβάνουν το σχολαστικό πλύσιμο των χεριών του προσωπικού, την νοσηλεία των φορέων MRSA σε ξεχωριστούς θαλάμους, τον έλεγχο των αντικειμένων στο χώρο του νοσοκομείου για την παρουσία ΜRSA στελεχών και τον συχνό έλεγχο του προσωπικού για φορεία καθώς και την έγκαιρη αντιμετώπιση της. 3.3 Επιδημιολογία των κοαγκουλάση αρνητικών Σταφυλοκόκκων Ο S. epidermidis βρίσκεται σε όλο το δέρμα του ανθρώπου και στο δέρμα όλων των θερμόαιμων ζώων ως μόνιμη μικροβιακή χλωρίδα. Αποικίζει τους βλεννογόνους του αναπνευστικού, τις ρινικές κοιλότητες, το αυτί και τους οφθαλμούς. Βρίσκεται στη φύση στο νερό, τα τρόφιμα και στο έδαφος [35]. Ο S. epidermidis είναι ο πιο συχνά απομονωμένος σταφυλόκοκκος σε ποσοστό 6590% και ακολουθεί ο S. hominis [104]. O S. haemolyticus είναι παροδικό μέρος της φυσιολογικής χλωρίδας του δέρματος και των βλεννογόνων, ενώ ο

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 32 S. saprophyticus αποικίζει παροδικά τον κόλπο και την ουρήθρα ιδιαίτερα των νεαρών γυναικών [35]. Οι περισσότερες λοιμώξεις που οφείλονται στον S. epidermidis είναι ενδονοσοκομειακές. Εξαίρεση αποτελούν οι λοιμώξεις των φυσικών καρδιακών βαλβίδων, οι οποίες είναι σπάνιες. Αντίθετα οι λοιμώξεις που οφείλονται στον S. saprophyticus είναι λοιμώξεις της κοινότητας [104]. Τα νοσοκομειακά στελέχη S. epidermidis εμφανίζονται πολυανθεκτικά, γεγονός που αποδεικνύει την εκλεκτική πίεση που ασκείται από την ευρεία και μερικές φορές αλόγιστη χορήγηση των αντιβιοτικών στα νοσοκομεία.

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 33 4. ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ 4.1 Παθογένεια της λοίμωξης από S. aureus Η παθογόνος δράση του S. aureus εξαρτάται από την ικανότητα του να διεισδύει μέσα στους ιστούς (βλεννογόνο, δερματική βλάβη, αποστήματα) και από την παραγωγή εξωκυττάριων ουσιών, όπως τοξίνες και ένζυμα. Η αποίκηση του ξενιστή από το S. aureus, προϋποθέτει την προσκόλληση του στα κύτταρα του ξενιστή, η οποία μπορεί να ακολουθήσει τρεις δρόμους: α) προσκόλληση στο ρινικό βλεννογόνο, μέσω των τειχοϊκών οξέων, η οποία είναι πολύ συχνή σε χρόνιους φορείς σταφυλοκόκκου καθώς και σε άτομα μετά από λοίμωξη με τον ιό της ινφλουέντζα τύπου Α [22]. β) προσκόλληση σε επιφάνειες τραυματισμένες ή ξένες επιφάνειες, μέσω 4 πρωτεϊνών (ινωδογόνο, ινωδονεκτίνη, λαμινίνη, κολλαγόνο IV) [23, 24]. γ) προσκόλληση σε ενδοθηλιακά κύτταρα κατά τη διάρκεια σηψαιμίας, όπου σημαντικό ρόλο παίζουν το ίδιο το ενδοθήλιο, η ινωδονεκτίνη (fibronectin) και η λαμινίνη (laminin) [23]. Όταν εισβάλει ο μικροοργανισμός μέσω του βλεννογόνου ή του επιθηλίου, τίθενται σε λειτουργία οι αμυντικοί μηχανισμοί της φυσικής ανοσίας του ξενιστή με τη φαγοκυττάρωση και τη θανάτωση του εισβολέα από τα πολυμορφοπύρηνα και από το σύστημα μονοπυρήνωνμακροφάγων. Η μικροβιοκτόνος δράση των φαγοκυττάρων έναντι των σταφυλοκόκκων επιτελείται κυρίως με τον οξειδωτικό μηχανισμό, που έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή προϊόντων με ισχυρή αντιμικροβιακή δράση, όπως το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ), το υπεροξειδικό ανιόν (O 2 ), και την υδροξυλική ρίζα (OH ). Ο σταφυλόκοκκος διαθέτει δικό του μηχανισμό διαφυγής του οξειδωτικού μηχανισμού της φαγοκυττάρωσης, όπως το H 2 O 2, αφού παράγει ο ίδιος καταλάση. Ο μη οξειδωτικός μηχανισμός περιλαμβάνει την υψηλή οξύτητα εντός των φαγολυσωμάτων (ph 3,54), τη λακτοφερίνη, η οποία συνδεόμενη με σίδηρο ασκεί την αντιμικροβιακή δράση της, και τις κατιονικές πρωτεΐνες των λυσοσωμάτων [10].

ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΗ ΜΟΥΠΙΡΟΣΙΝΗ ΣΕ ΣΤΕΛΕΧΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 34 Η κινητοποίηση (χημειοταξία) των φαγοκυττάρων στο σημείο της ανάπτυξης του μικροοργανισμού εξαρτάται από την επεξεργασία των ερεθισμάτων τόσο από το μικρόβιο όσο και από το ξενιστή. Η πεπτιδογλυκάνη, τα τειχοϊκά οξέα και η πρωτεΐνη Α παίζουν σημαντικό ρόλο στο στάδιο αυτό. Το σπουδαιότερο ερέθισμα της κινητοποίησης, αποτελεί η ενεργοποίηση του συμπληρώματος. Όλα τα στοιχεία του τοιχώματος μπορούν να προάγουν αυτήν την αντίδραση, προάγοντας την παραγωγή κυρίως του παράγοντα του συμπληρώματος C5a, ο οποίος είναι ένας κύριος χημειοτακτικός παράγοντας [25]. Ελλάτωση της χημειοταξίας παρατηρείται σε άτομα που εμφανίζουν το σύνδρομο Job (υπερπαραγωγή της IgE), σε αυτοάνοσα νοσήματα, σε σακχαρώδη διαβήτη, ή σε θεραπευτική χορήγηση IL2, σύνδρομο Down, σοβαρές βακτηριακές λοιμώξεις κ.α [10, 26]. Η αναγνώριση του S. aureus από τα φαγοκύτταρα γίνεται μέσω των υποδοχέων τους για το Fc τμήμα της ανοσοσφαιρίνης IgG, τους υποδοχείς για το ενεργό κλάσμα του συμπληρώματος C3b και ίσως και από άλλους υποδοχείς. Οι υποδοχείς αυτοί προάγουν την προσκολλητικότητα και την φαγοκυττάρωση, με τελικό αποτέλεσμα την καταστροφή του μικροβίου. Αυτό βέβαια προϋποθέτει την ενεργοποίηση του συμπληρώματος στην επιφάνεια του σταφυλοκόκκου, η οποία προκαλεί την παραγωγή και εναπόθεση των κλασμάτων C3b και ic3b. Τα κλάσματα αυτά συνδεόμενα με τις κυτταρικές επιφάνειες με υδρογονικούς δεσμούς, δρουν ως οψωνίνες. Έχει βρεθεί, ότι σε ορισμένα στελέχη, η οψωνινοποίηση γίνεται αποκλειστικά μετά την ενεργοποίηση της εναλλακτικής οδού του συμπληρώματος, ενώ σε άλλα παίρνει μέρος και μια ειδική IgG ανοσοσφαιρίνη [26]. Η πεπτιδογλυκάνη παίζει σημαντικό ρόλο στην οψωνοποίηση, αφού φαίνεται ότι μπορεί να ενεργοποιήσει το συμπλήρωμα με την εναλλακτική και την κλασική οδό. Ο ρόλος των τειχοϊκών οξέων δεν είναι διευκρινισμένος, αν και φαίνεται ότι δρουν έμμεσα στην ενεργοποίηση του συμπληρώματος [10].