17 0 Πανελλήνιο Συνέδριο Νοσημάτων Θώρακος Μεταγραφική έκφραση της ανάστροφης μεταγραφάσης της τελομεράσης (htert) και της 2,3-διοξυγονάσης της ινδολεαμiνης νης (IDO) στον καρκίνο του πνεύμονα ΘΚερενίδη, Μ Ζαμανάκου, ΣΤσόχας, ΜΝάκου, Θ Πουλαράκης, ΑΧέβας, J Dahadreh, Κ Γουργουλιάνης, Α Γερμενής, Β Καρανίκας Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας
Τελομερή Δομές στα άκρα των ευκαρυωτικών χρωμοσωμάτων που διασφαλίζουν τη διατήρηση της γενετικής σταθερότητας Επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA 5 -TTAGGG-3 Τελομερή επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες Τελομεράση Κυτταρικός θάνατος hterc htert TEP1 Αθανατοποιημένα καρκινικά κύτταρα
IDO Κυτοσολική μονομερής αιμοπρωτεΐνη 430 αμινοξέα (ΜΒ 45,324 D)
IDO και καρκίνος Ανοσοκατασταλτική δράση Επιχώριος λεμφαδένας είωση της συγκέντρωσης της τρυπτοφάνης Παραγωγή τοξικών μεταβολιτών για τα Τ κύτταρα (L-kynurenine, 3-hydroxyanthranilic acid) unn D, et al. Trends ol ed 2004, unn DH, J Clin Invest 2007, Zamanakou et al, Immunol Lett 2007
Σκοπός Μεταγραφική έκφραση htert και IDO α. σε κυτταρικές σειρές ΜΜΚΠ β. σε καρκινικό ιστό και σε παρακείμενο μη προσβεβλημένο ιστό (συγκριτικά) από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα Συσχέτιση με κλινικοεργαστηριακές παραμέτρους και με την επιβίωση των ασθενών
ΥΛΙΚΟ 9 καρκινικές κυτταρικές σειρές ΚΠ: CALU-1, CALU-6, GILI, ONET, S-LU-1, NCI-H441, NCI-H460, NCI-H596, NCI-H661 28 ασθενείς 23 άνδρες και 5 γυναίκες (μέση ηλικία 63.4 ± 9.7 έτη) 19 λοβεκτομές,, 1 διλοβεκτομή και 8 πνευμονεκτομές Πλήρης εκτομή (complete resection-r0) Ιστός αναφοράς: Αμάρτωμα
15 15 56 56 15 15 27 27 120 120 52 52 57 57 35 35 55 55 26 26 1188 1188 361 361 54 54 8 42 42 14 14 12 12 27 27 37 37 23 23 14 14 13 13 29 29 428 428 225 225 120 120 150 150 31 31 Όγκος (cm (cm 3 ) - - - - Ιστός Ασθενείς Νo ύλο Ηλικία Τύπος Διαφοροποίηση Διαφοροποίηση ptn ptn pστάδιο Στάδιο 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 10 11 11 12 12 13 13 14 14 15 15 16 16 17 17 18 18 19 19 20 20 21 21 22 22 23 23 24 24 25 25 26 26 27 27 28 28 F F F F F 56 56 65 65 65 65 48 48 59 59 73 73 55 55 60 60 65 65 74 74 48 48 71 71 61 61 67 67 55 55 79 79 70 70 63 63 79 79 59 59 62 62 59 59 58 58 76 76 40 40 75 75 74 74 59 59 LC LC -BAC BAC -BAC BAC -BAC BAC Υψηλή Υψηλή T1N10 T3N00 T1N20 1N20 T1N00 1N00 T2N20 2N20 T2N00 2N00 T4N20 4N20 T2N10 2N10 T3N00 3N00 T2N00 2N00 T3N10 3N10 T2N20 2N20 T2N01 2N01 T1N00 1N00 T2N10 2N10 T2N00 2N00 T2N00 2N00 T3N10 3N10 T2N00 2N00 T2N10 2N10 T2N00 T2N00 T1N10 T1N10 T2N00 T2N00 T2N00 T2N00 T3N10 T3N10 T2N00 T2N00 T2N10 T2N10 T4N01 T4N01 IIA IIA I I IIIA IIIA IA IA IIIA IIIA II II I I I I IIIA IIIA IIIA IIIA IV IV IA IA I I IIIA IIIA I I IIA IIA II IIIA IA I I IV IV - ΥΛΙΚΟ
Σχεδιασμός-Μέθοδοι Καρκινικός ιστός ασθενών Εκχύλιση RNΑ RNeasy, Qiagen Παρακείμενος μη προσβεβλημένος ιστός Σύνθεση cdna Omniscript RT kit, Qiagen Καρκινικές κυτταρικές σειρές Ιστός αναφοράςαμάρτωμα PCR για: 1) β-actin 2) htert Qiagen Taq astermix qrt PCR για: 1) IDO 2) ABL SYBR supermix kit
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
Έκφραση της htert στις καρκινικές σειρές L ONET CALU-1 CALU-6 GILI NCIH- 596 NCI- 460 NCI- 661 NCI- 441 S- LU-1 400 200 8/9 καρκινικές σειρές ΚΠ Σχετική έκφραση 68.96 ± 31.33 htert Καρκινικές Σειρές 120 100 80 Τiμή R 60 40 20 0 ONET CALU-1 CALU-6 GILI NCIH596 NCIH460 NCIH661 NCIH441 S-LU-1
Ανίχνευση της μεταγραφικής έκφρασης της htert 21/24 δείγματα καρκινικού ιστού (87%) 71.00 ± 68.50 3/27 δείγματα παρακείμενου μη προσβεβλημένου ιστού (11%) 1.00 (1.00-48.10)
Συσχέτιση της έκφρασης της htert με κλινικοεργαστηριακές παραμέτρους p-value n mean ± SD ΗΛΙΚΙΑ <70 70 16 8 67.05 ± 72.92 78.87 ± 62.57 0.699 ΥΛΟ ΜΗ-ΚΑΠΝΙΣΤΕΣ 19 5 4250 70.16 ± 71.17 74.16 ± 64.57 p=0.017 34.08 ± 14.45 0.910 ΚΑΠΝΙΣΜΑ ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΟΣ ΤΥΠΟΣ ΔΙΑΟΡΟΠΟΙΗΣΗ T N ΠΡΩΗΝ ΚΑΠΝΙΣΤΕΣ ΚΑΠΝΙΣΤΕΣ ΑΔΕΝΟ ΠΛΑΚΩΔΕΣ G1-G2 G3 T1-T2 T3-T4 N0 N1-N2 0 1 mrna htert mrna htert mrna htert 200 7 150 100 13 50 15 250 8 0 200 11 13150 250 17 100 200 7 150 13 111000 22 50 2 0 63.69 ± 75.32 86.29 ± 73.24 p=0.037 70.49 ± 64.57 51.58 ± 53.43 79.90 T1-2± 67.01 T3-4 p=0.001 63.46 Τ-παράγοντας ± 71.53 50.26 ± 51.33 121.30 ± 82.40 47.25 ± 48.29 99.06 ± 79.96 74.57± I-II 70.55 III-IV 31.65± Στάδιο 1.20 νόσου 0.406 0.487 0.569 0.017 0.063 ΣΤΑΔΙΟ ΟΓΚΟΣ ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΟΣ I II 15 48.79 <50 ± 45.95 >50 0.037 III-IV 9 Όγκος 108.00 νεοπλάσματος ± 85.62 (cm 3 ) <50 cm 3 12 29.49 ± 24.12 0.001 50 cm 3 12 112.50 ± 73.96
Η έκφραση του mrna της htert στον παρακείμενο μη προσβεβλημένο ιστό, βρέθηκε σημαντικά μικρότερη από αυτή στον αυτόλογο καρκινικό ιστό, αλλά και από αυτή στις καρκινικές σειρές Δεν φάνηκε στατιστικά σημαντική διαφορά της έκφρασης της μεταξύ καρκινικού ιστού και καρκινικών σειρών p=0.0008 p<0.0001 p=0.914 250 mrna htert 150 50 Κ ΚΣ
Έκφραση της IDO στις καρκινικές σειρές Ανιχνεύτηκε στις 3 από τις 9 καρκινικές σειρές 4.68 ± 11.08 (0.00-33.94) 4.840 1.778
Μεταγραφική έκφραση της IDO στους ασθενείς 21 / 24 δείγματα καρκινικού ιστού (87.5%) 21 / 25 δείγματα παρακείμενου μη προσβεβλημένου ιστού (84%) Κ Σύνολο ασθενών 8.46 ± 15.18 3.28 ± 2.51 ΑΔΕΝΟ 11.75 ± 18.52 3.32 ± 2.54 ΠΛΑΚΩΔΕΣ 3.22 ± 2.96 3.32 ± 2.75
Μόνο στο αδενοκαρκίνωμα η σχετική έκφραση της IDO ήταν μεγαλύτερη στον καρκινικό ιστό έναντι του παρακείμενου μη προσβεβλημένου ιστού Δεν βρέθηκε διαφορά μεταξύ των δύο ιστολογικών τύπων στον καρκινικό ιστό καθώς και στον παρακείμενο μη προσβεβλημένο ιστό p=0.998 20 p=0.046 p=0.075 p=0.945 mrna IDO 15 10 5 0 ΑΔ-Κ ΑΔ- ΠΛ-Κ ΠΛ-
Δεν βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά της έκφρασης της IDO σε σχέση με τις κλινικοεργαστηριακές n παραμέτρους mean ± SD p-value ΗΛΙΚΙΑ <70 70 16 8 7.07 ± 9.06 11.24 ± 23.83 0.538 ΥΛΟ 19 5 5.67 ± 8.17 19.06 ± 29.10 0.078 ΜΗ ΚΑΠΝΙΣΤΕΣ 4 12.55 ± 16.73 ΚΑΠΝΙΣΜΑ ΠΡΩΗΝ ΚΑΠΝΙΣΤΕΣ 7 5.18 ± 5.64 0.590 ΚΑΠΝΙΣΤΕΣ 13 8.96 ± 18.53 ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΟΣ ΤΥΠΟΣ ΑΔΕΝΟ ΠΛΑΚΩΔΕΣ 15 8 11.75 ± 18.52 3.22 ± 2.96 0.075 ΔΙΑΟΡΟΠΟΙΗΣΗ G1-G2 G3 11 13 9.90 ± 20.14 7.24 ± 10.00 0.772 T T1-T2 T3-T4 17 7 7.90 ± 16.45 9.82 ± 12.59 0.309 N N0 N1-N2 13 11 10.77 ± 20.28 5.73 ± 4.59 0.417 0 1 22 2 8.86 ± 15.80 4.05 ± 3.60 ΣΤΑΔΙΟ ΟΓΚΟΣ ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΟΣ I II 15 10.58 ± 18.99 III-IV 9 4.93 ± 2.98 0.551 <50cm 3 12 4.40 ± 4.53 50cm 3 12 12.53 ± 20.62 0.340
Η σχετική έκφραση της IDO στις καρκινικές σειρές βρέθηκε μικρότερη τόσο από αυτή στον παρακείμενο μη προσβεβλημένο ιστό όσο και στον καρκινικό ιστό Δεν βρέθηκε διαφορά μεταξύ παρακείμενου μη προσβεβλημένου ιστού και καρκινικού ιστού p=0.014 20 p=0.021 p=0.236 mrna IDO 15 10 5 0 ΚΣ Κ
Στατιστικά σημαντική συσχέτιση της έκφρασής της στον καρκινικό ιστό, με τη συνολική επιβίωση των ασθενών 100 Επιβίωση % 80 60 40 20 0 p=0.033 IDO<3.8 1έτους 100%, 3ετής 87% IDO>3.8 1έτους 73%, 3ετής 48% S=627 μέρες 0 250 500 750 1000 1250 Ημέρες μετά το χειρουργείο
Συνέκφραση htert και IDO Στα 18 / 24 δείγματα καρκινικού ιστού (75%), εκφράστηκε το mrna και των δύο γονιδίων χωρίς συσχέτιση μεταξύ τους
Συμπεράσματα Ανιχνεύτηκε η μεταγραφική έκφραση των γονιδίων της htert και της IDO - για πρώτη φορά με qrt-pcr PCR- στον καρκίνο του πνεύμονα. Η υψηλότερη έκφρασή της IDO στα δείγματα των ασθενών πιθανότατα να οφείλεται στην παραγωγή του ενζύμου και από άλλα κύτταρα εκτός των καρκινικών. Διαφάνηκε η πιθανή προγνωστική αξία της σχετικής έκφρασής τους. Ενώ η πλειοψηφία των καρκινικών δειγμάτων εκφράζει την htert, ένα ΤΑΑ ικανό να διεγείρει ειδικές CD8+ κυτταρικές απαντήσεις, η συνέκφραση της IDO παρεμποδίζοντας τον πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων, πιθανόν συμβάλλει στη διαφυγή των καρκινικών κυττάρων από την ανοσοεπιτήρηση του ξενιστή. (στόχο ανοσοθεραπείας)
Συνεργάτες: Πνευμονολογική Κλινική ΠΓΝΛ: Θ. Κερενίδη, Κ. Γουργουλιάνης Μονάδα Ανοσολογίας Καρκίνου, Εργαστήριο Ανοσολογίας- Ιστοσυμβατότητας ΠΓΝΛ: Μ. Ζαμανάκου, Σ. Τσόχας, Θ. Πουλαράκης, Α. Γερμενής, Β. Καρανίκας Εργαστήριο Παθολογικής Ανατομικής ΠΓΝΛ: Μ. Νάκου Θωρακοχειρουργική Κλινική ΠΓΝΛ: Α. Χέβας Θωρακοχειρουργική Κλινική, Ιατρικό Κέντρο Αθηνών: J. Dahadreh Επιδοτήσεις: Hellenic inistry of Education, PYTHAGORAS, EPAE II Project Grant EU arie Curie Incoming International Fellowship 021975-IRTALUNG Hellenic General Secretariat of R&T ΕΝΤΕΡ2004 Grant# 04ΕΡ 9 Hellenic General Secretariat of R&T atching funds
Ευχαριστώ πολύ