ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ TRK ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΤΩΝ ΝΕΥΡΟΤΡΟΦΙΝΏΝ ΣΤΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟ ΣΕ ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΜΕ ΤΟ ΦΛΕΓΜΟΝΩΔΕΣ ΕΝΤΕΡΟ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ

ΙΔΡΥΜΑ: ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ: ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ: ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ- ΙΣΤΟΛΟΓΙΑΣ- ΕΜΒΡΥΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ Ν. ΒΑΡΑΚΗΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ TRK ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΤΩΝ ΝΕΥΡΟΤΡΟΦΙΝΏΝ ΣΤΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟ ΣΕ ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΜΕ ΤΟ ΦΛΕΓΜΟΝΩΔΕΣ ΕΝΤΕΡΟ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ ΕΠΙΜΕΛΕΙΑ ΕΡΓΑΣΙΑΣ: ΛΑΪΝΑ ΕΛΕΝΗ ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ: ΑΣΗΜΑΚΟΠΟΥΛΟΥ ΜΑΡΘΑ ΠΑΤΡΑ, ΜΑΡΤΙΟΣ 2006 1

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗ 1. ΝΕΥΡΟΤΡΟΦΙΝΕΣ Γενικά... σελ.5 1.1 Υποδοχείς νευροτροφινών σελ.5 1.2 Ρόλος των νευροτροφινών σελ.8 2. ΔΟΜΗ ΕΝΤΕΡΟΥ 2.1 Στοιχεία ανατομίας.. σελ.13 2.1.1 Γενικά σελ.13 2.1.2 Αιμάτωση.. σελ.14 2.2 Στοιχεία Ιστολογίας Γενικά... σελ.16 2.2.1Βλεννογόνος σελ.17 2.2.1.1 επιθήλιο επιφανείας σελ.17 2.2.1.2 επιθήλιο των κρυπτών σελ.18 2.2.1.3 χόριο. σελ.18 2.2.1.4 βλεννογόνια μυϊκή στοιβάδα σελ.19 2.2.2Υποβλεννογόνιος συνδετικός ιστός. σελ.19 2.2.3Μυϊκός χιτώνας σελ.19 2.2.4Ορογόνος.. σελ.20 2.3 Στοιχεία Φυσιολογίας σελ.20 3. ΕΝΤΕΡΙΚΟ ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ 3.1 Στοιχεία ΕΝΣ.. σελ.23 3.2 Εμβρυονική ανάπτυξη σελ.24 4. ΕΛΚΩΔΗΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ Γενικά.. σελ.27 4.1Εμφάνιση σελ.27 4.2 Εντόπιση σελ.27 4.3 Συμπτώματα.. σελ.28 5. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ σελ.32 6. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ. σελ.35 7. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ σελ.42 7.1Πίνακες... σελ.49 7.2Εικόνες σελ.54 8. ΣΥΖΗΤΗΣΗ- ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ σελ.63 9. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ. σελ.68 2

Περίληψη Πρόσφατα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η έκφραση του p75 NTR και των Trk υποδοχέων των νευροτροφινών (TrkA, TrkB, TrkC) είναι ιδιαίτερα σημαντική όχι μόνο στη νευρωνική επιβίωση κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και την ενήλικο ζωή αλλά και σε ποικίλες κυτταρικές διαδικασίες όπως η ανοσολογική απάντηση του οργανισμού σε φλεγμονές. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να ερευνήσει την κυτταρική εντόπιση και κατανομή του p75 NTR και των Trk υποδοχέων των νευροτροφινών στην ελκώδη κολίτιδα σε σύγκριση με το φυσιολογικό έντερο του ενήλικα ανθρώπου χρησιμοποιώντας την ανοσοϊστοχημική μέθοδο. Στη μελέτη συμπεριελήφθησαν 45 περιπτώσεις ελκώδους κολίτιδας και 5 δείγματα φυσιολογικού εντέρου. Παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης όσον αφορά τους TrkA υποδοχείς τόσο στο επιθήλιο όσο και στα κύτταρα του εντερικού νευρικού συστήματος στο φλεγμονώδες σε σχέση με το φυσιολογικό έντερο. Έντονη έκφραση των TrkB υποδοχέων ταυτοποιήθηκε στο μυϊκό τοίχωμα των αγγείων και στα εντεροενδοκρινή κύτταρα του επιθηλίου στο φλεγμονώδες και στο φυσιολογικό έντερο. Μειωμένη έκφραση, τόσο στο επιθήλιο όσο και στο εντερικό νευρικό σύστημα, όσον αφορά την έκφραση των TrkB και TrkC υποδοχέων παρατηρήθηκε στις περιπτώσεις ελκώδους κολίτιδας σε σχέση με το φυσιολογικό έντερο. Ο p75 NTR παρουσίασε έκφραση αποκλειστικά στα πλέγματα του νευρικού συστήματος, τόσο στο φυσιολογικό όσο και στο φλεγμονώδες έντερο. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι οι νευροτροφίνες μέσω της δέσμευσής τους με τους Trk υποδοχείς και τον p75 NTR πιθανόν εμπλέκονται στην παθογένεια των φλεγμονών όπως η ελκώδης κολίτιδα κατά την ενήλικο ζωή. 3

1. ΝΕΥΡΟΤΡΟΦΙΝΕΣ 4

1. Νευροτροφίνες Οι νευροτροφίνες αποτελούν μια οικογένεια ομοδιμερών πολυπεπτιδίων (homodimeric polypeptides) αυξητικών παραγόντων απαραίτητων για την ανάπτυξη και τη διατήρηση του νευρικού συστήματος των σπονδυλωτών. Πιο συγκεκριμένα οι δράσεις των νευροτροφινών είναι η κυτταρική επιβίωση, διαφοροποίηση και κυτταρική αύξηση, η νευρωνική πλαστικότητα, οι μεταβολές του κυτταρικού κύκλου και η απόπτωση [6,22,28,29]. Οι νευροτροφίνες συντίθενται αρχικά ως προ νευροτροφίνες [6]. Ο Nerve Growth Factor (NGF) είναι το πιο χαρακτηριστικό μέλος της οικογένειας των νευροτροφινών. Άλλα μέλη της οικογένειας αυτής είναι οι: brain derived neurotrophic factor (BDNF), neurotrophin 3 (NT3) και neurotrophin 4/5 (NT4/5), neurotrophin 6, neurotrophin 7. 1.1 Υποδοχείς νευροτροφινών Οι νευροτροφίνες για να δράσουν, πρέπει να είναι δεσμευμένες στους υποδοχείς τους. Οι υποδοχείς των νευροτροφινών ανήκουν σε δύο διαφορετικούς δομικά τύπους. Αυτοί είναι ο p75 NTR που ανήκει στην TNF (tumor necrosis factor) υπεροικογένεια υποδοχέων και η οικογένεια των Trk υποδοχέων, όπου διακρίνουμε τρεις τύπους, τους TrkA, TrkB, TrkC, που έχουν δράση κινάσης τυροσίνης. Οι δύο τύποι υποδοχέων δεν εμφανίζουν καμία ομολογία ούτε στα ενδοκυττάρια, ούτε στα εξωκυττάρια τμήματά τους. Διαφέρουν ακόμα και ως προς την 5

εξειδίκευση στη δέσμευση των νευροτροφινών. Το κάθε ένα μέλος της οικογένειας των Trk δεσμεύει συγκεκριμένη νευροτροφίνη (πίνακας 1), ενώ ο p75 NTR δύναται να δεσμεύει όλες τις ώριμες νευροτροφίνες με την ίδια συγγένεια [41,43]. Νευροτροφίνες Υποδοχείς Nerve Growth Factor (NGF) Brain- derived Neurotrophin Factor (BDNF) Neurotrophin- 3 (NT-3) Neurotrophin- 4/5 (NT-4/5) Neurotrophin- 6 (NT-6) Neurotrophin- 7 (NT-7) TrkA, p75 NTR TrkB, p75 NTR TrkC, p75 NTR TrkB, p75 NTR Πίνακας 1. Οι νευροτροφίνες και οι υποδοχείς τους Ο p75 NTR έχει μια περιοχή θανάτου (death domain), η οποία αποτελείται από 6 α-έλικες σε αντιπαράλληλη διαμόρφωση στο ενδοκυττάριο τμήμα του, μήκους 70-80 αο. Το εξωκυττάριο τμήμα του είναι πλούσιο σε κυστείνη και αποτελεί την περιοχή δέσμευσης των νευροτροφινών [6]. Εκφράζεται στο σπλήνα, θύμο αδένα, πάγκρεας (β κύτταρα), κύτταρα ανοσοποιητικού (CD4 T cells). Είναι ο μόνος υποδοχέας που ανταποκρίνεται στην παρουσία NGF στα Schwann κύτταρα (Offenhauser et al, 1997). Οι Trk υποδοχείς παρουσιάζουν στο εξωκυττάριο τμήμα τους τρεις περιοχές πλούσιες σε λευκίνη, ανάμεσα σε δύο περιοχές πλούσιες σε κυστεϊνη. Αυτές βρίσκονται, μια στο αμινοτελικό τους άκρο και οι άλλες 6

κοντά σε δύο immunoglobulin-like περιοχές στο εγγύτερα της μεμβράνης τμήμα τους. Οι Trk υποδοχείς διαντιδρούν με τις νευροτροφίνες μέσω της δεύτερης immunoglobulin-like περιοχής (IgGC 2 ) (εικόνα 1). Οι Trk υποδοχείς εμφανίζουν διαφορετική ειδικότητα έναντι των νευροτροφινών, λόγω του διαφορετικού εξωκυττάριου τμήματός τους. Το ενδοκυττάριο τμήμα τους εμφανίζει δραστικότητα κινάσης τυροσίνης [6]. Εκφράζονται στο σπλήνα, στο πάγκρεας και σε κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος λεμφοκύτταρα, μακροφάγα. Γενικότερα εκφράζονται σε διάφορα επίπεδα σε όλους τους ιστούς, εκτός από την καρδιά και το ήπαρ [35]. Εικόνα 1. Δομή των Trk υποδοχέων και του p75 NTR. 7

1.2 Ρόλος των νευροτροφινών Πολλές μελέτες έχουν αποδείξει πως οι νευροτροφίνες παίζουν σημαντικό ρόλο στην επιβίωση και διατήρηση των νευρικών κυττάρων διατηρώντας την ισορροπία μεταξύ κυτταρικής επιβίωσης και απόπτωσης κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Ακόμη έχει δειχθεί πως οι νευροτροφίνες μπορούν να ρυθμίζουν την αξονική και δενδριτική επιμήκυνση και καθοδήγηση, τη σύνθεση μυελίνης από τα κύτταρα Schwann, τη δομή και τις συνδέσεις συνάψεων, την απελευθέρωση νευροδιαβιβαστών και τη συναπτική πλαστικότητα [22,26,29,43]. Όλες οι παραπάνω ενέργειες των νευροτροφινών είναι αποτέλεσμα συγκεκριμένων σηματοδοτικών μονοπατιών, που ξεκινούν όταν οι νευροτροφίνες δεσμεύονται στους υποδοχείς τους, p75 και Trks. - Ο τρόπος δράσης των νευροτροφινών μέσω των Trk υποδοχέων Όταν οι νευροτροφίνες δεσμεύονται στους Trk υποδοχείς συμβαίνει διμερισμός των υποδοχέων και έναρξη της δραστικότητας κινάσης τυροσίνης. Στην κυτταροπλασματική περιοχή κάθε Trk υποδοχέα υπάρχουν συντηρημένες δέκα τυροσίνες. Από αυτές, οι τρεις όταν φωσφορυλιωθούν, αυξάνουν περαιτέρω τη δραστικότητα της κινάσης. Η φωσφορυλίωση και των υπόλοιπων αμινοξέων, επάγει τη σηματοδότηση, δημιουργώντας θέσεις πρόσδεσης για πρωτεΐνες-προσαρμογείς που προάγουν την πυροδότηση ενδοκυττάριων σηματοδοτικών καταρρακτών. Από αυτούς οι πιο μελετημένοι είναι οι: Ras/ MAPK/ ERK οδός που προάγει την κυτταρική διαφοροποίηση, PI3K/ Akt kinase οδός που απενεργοποιεί προαποπτωτικά γεγονότα και PLC-γ1 οδός. Οι μεταγραφικοί παράγοντες που ενεργοποιούνται είναι οι: NFkB, Forkhead, p53 και CREB με τελικό αποτέλεσμα την επιβίωση και διαφοροποίηση του κυττάρου [2,18,22,23,28,29,30,31,32](εικόνα 2). 8

Εικόνα 2.Τα σηματοδοτικά μονοπάτια των υποδοχέων νευροτροφινών - Ο τρόπος δράσης των νευροτροφινών μέσω του ρ75 NTR Ο p75 NTR έχει λιγότερο γνωστό μηχανισμό δράσης για τη μεταγωγή σήματος και φυσιολογικού ρόλου σε σχέση με τους Trk υποδοχείς, αν και αυτός ανακαλύφθηκε πρώτος. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι ο p75 NTR μπορεί να συνεργάζεται με τους Trk υποδοχείς και η ικανότητά του για μεταγωγή σήματος επηρεάζεται από τη σύγχρονη ενεργοποίηση των Trk υποδοχέων [38]. Το σαφές είναι πως ο p75 NTR παίζει ρόλο στη ρύθμιση της νευρωνικής απόπτωσης, ενώ υπάρχουν δεδομένα που υποστηρίζουν το ρόλο του στην αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού καθώς και στην αξονική επιμήκυνση [8,9,22,25]. Σύμφωνα με νεώτερα δεδομένα, ο p75 NTR μπορεί κάτω από διαφορετικές συνθήκες να συμμετέχει σε οδούς μεταγωγής σήματος που προωθούν την κυτταρική επιβίωση, τον κυτταρικό θάνατο ή την αναστολή της αξονικής επιμήκυνσης [9]. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω συμπλόκων που δημιουργεί με άλλα μόρια. 9

Τα συμπλέγματα αυτά είναι : το σύμπλεγμα p75 NTR - Trk, στο οποίο ο p75 NTR κατέχει ρόλο αυξητικό-ενισχυτικό της δράσης των Trk υποδοχέων. Ο p75 NTR ενισχύει την ικανότητα των Trk υποδοχέων να δεσμεύονται και να απαντούν στις νευροτροφίνες και ενισχύει την ικανότητά τους να διακρίνουν συγκεκριμένες νευροτροφίνες ανάλογα με τις απαιτήσεις του οργανισμού [9,29]. Το σύμπλεγμα p75 NTR - Sortilin: η Sortilin είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη που εκφράζεται στο ΚΝΣ κατά την ανάπτυξη και την ενήλικο ζωή, η οποία συμπεριφέρεται ως συν -υποδοχέας του p75 NTR για τη δέσμευση pro-ngf (εικόνα 3), είναι σημαντική, για την απόπτωση [9,20]. Το σύμπλεγμα p75 NTR - Nogo R- Lingo 1, το οποίο φαίνεται πως παίζει ρόλο στην αξονική επιμήκυνση [9,17,29]. Στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου φαίνεται πως παίζει ρόλο ο p75 NTR όταν διαντιδρά με πρωτεΐνες που ανήκουν στην οικογένεια των TRAF (tumor necrosis factor receptor-associated factor family), οι οποίες δεσμεύονται στην κυτταροπλασματική περιοχή του p75 NTR [22,39]. Εικόνα 3. Δράση του p75 NTR μετά τη δέσμευση του στη Sortilin ή στους Trk υποδοχείς 10

Ο p75 NTR ενεργοποιεί οδούς μεταγωγής σήματος και σκοπεύει στην αύξηση των επιπέδων των Jun N-terminal kinase (JNK), NFkB, MAPK και ceramides (εικόνα 4). Εικόνα 4. Οδοί αγωγής σήματος μετά την ενεργοποίηση του p75 NTR 11

2. ΔΟΜΗ ΤΟΥ ΕΝΤΕΡΟΥ 12

2. Δομή του παχέος εντέρου 2.1 Στοιχεία Ανατομίας Το τελευταίο τμήμα του γαστρεντερικού σωλήνα αποτελείται από το παχύ έντερο (κόλον) με μήκος 1,3 μέτρα και από το ορθό με μήκος 15-20 εκατοστά. Το παχύ έντερο αρχίζει από την ειλεοκολική βαλβίδα και συνεχίζει με το τυφλό από το οποίο κρέμεται η σκωληκοειδής απόφυση. Στη συνέχεια υπάρχει το ανιόν κόλο, το οποίο εκτείνεται δεξιά προς τα άνω μέχρι το ήπαρ, όπου σχηματίζεται η δεξιά κολική ή ηπατική καμπή. Έπειτα το εγκάρσιο κόλο εκτείνεται τοξοειδώς προς τα αριστερά μέχρι το αριστερό άνω τμήμα της κοιλιάς όπου κατά τον πόλο του σπλήνα σχηματίζεται η αριστερή κολική καμπή ή σπληνική. Στη συνέχεια απαντάται το κατιόν κόλο, το οποίο εκτείνεται προς τα κάτω και πίσω κατά μήκος της αριστερής πλάγιας πλευράς της κοιλιακής χώρας. Η πρόσφυση του αριστερού κολικού συνδέσμου ή φρενοκολικού συνδέσμου, αποτελεί το έδαφος του χώρου που εντοπίζεται ο σπλήνας. Το κατιόν κόλο μεταβαίνει στο σιγμοειδές κόλο που πορεύεται αρχικά στον αριστερό λαγόνιο βόθρο και μετά εισέρχεται στην ελάσσονα πύελο σχηματίζοντας αγκύλη σαν S. Στο ύψος του 2 ου 3 ου ιερού σπονδύλου μεταβαίνει στο ορθό ή απευθυσμένο που καταλήγει στον πρωκτό (εικόνα 5). Το άνω τριτημόριο του ορθού είναι πιο διευρυσμένο και αποτελεί την λήκυθο. Ο πρωκτικός σωλήνας κλείνεται ενεργητικά με λείες μυϊκές ίνες, τον έσω σφιγκτήρα του πρωκτού και με γραμμωτές μυϊκές ίνες, τον έξω σφιγκτήρα του πρωκτού. Χαρακτηριστικό του παχέος εντέρου είναι ότι οι μυϊκές ίνες της έξω επιμήκους στοιβάδας έχουν περιορισθεί σε τρεις επιμήκεις ταινίες, πλάτους 1 εκατοστού, τις κολικές ταινίες. Η ελεύθερη ταινία εκτείνεται στην πρόσθια επιφάνεια, η επιπλοϊκή ταινία εκτείνεται πίσω και έξω και στο εγκάρσιο κόλο αντιστοιχεί στην πρόσφυση του μείζονος επιπλόου 13

(γαστροκολικός σύνδεσμος). Η μεσοκολική ταινία πορεύεται πίσω και έσω και στο εγκάρσιο κόλο αντιστοιχεί στην πρόσφυση του εγκάρσιου μεσόκολου. Το παχύ έντερο παρουσιάζει επίσης τα εκκολπώματα, που χωρίζονται μεταξύ τους με κυκλοτερείς περισφίξεις, οι οποίες προβάλλουν στο εσωτερικό και σχηματίζουν τις μηνοειδείς πτυχές. Εικόνα 5. Ανατομία Παχέος Εντέρου. 2.1.1 Αιμάτωση Η νήστιδα, ο ειλεός και το παχύ έντερο μέχρι την άνω μοίρα του ορθού αιματώνονται αποκλειστικά από τους κλάδους της άνω και κάτω μεσεντέριας αρτηρίας. Το όριο αιμάτωσης μεταξύ άνω και κάτω μεσεντέριας αρτηρίας αντιστοιχεί στην περιοχή του αριστερού τμήματος του εγκάρσιου κόλου και της κολικής καμπής. Οι φλέβες από τις περιοχές που διανέμονται οι άνω και οι κάτω μεσεντέριες αρτηρίες εκβάλλουν σε αντίστοιχες φλέβες του πυλαίου φλεβικού συστήματος. Οι φλέβες του μέσου και κάτω τμήματος του 14

ορθού (μέσες και κάτω αιμορροοιδικές) εκβάλλουν στην έσω λαγόνια φλέβα και από εκεί στην κάτω κοίλη φλέβα (εικόνα 6). Η λεμφική παροχέτευση ακολουθεί γενικά την πορεία των αντίστοιχων αγγείων. Εικόνα 6. Αιμάτωση Παχέος Εντέρου 2.1.2 Νεύρωση Το παχύ έντερο λαμβάνει παρασυμπαθητική νεύρωση (χαλάρωση σφιγκτήρων, αύξηση κινητικότητας και εκκρίσεων) από το πνευμονογαστρικό νεύρο έως την αριστερή κολική καμπή και από τα ιερά παρασυμπαθητικά νεύρα από εκεί και κάτω. Η συμπαθητική νεύρωση (ελάττωση κινητικότητας, σύσπαση σφιγκτήρων) προέρχεται από το κοιλιακό και τα άνω και κάτω μεσεντέρια γάγγλια. 15

2.2 Στοιχεία ιστολογίας Εικόνα 7. Οι στοιβάδες του φυσιολογικού παχέος εντέρου Το τοίχωμα του παχέος εντέρου όπως και του υπόλοιπου γαστρεντερικού σωλήνα αποτελείται από τέσσερις χιτώνες (εικόνα 7): 1. Βλεννογόνος : - Επιθήλιο - Χόριο - Βλεννογόνια μυϊκή στοιβάδα 2. Υποβλεννογόνιος χιτώνας 3. Μυϊκός χιτώνας : - Έσω στοιβάδα κυκλοτερών μυϊκών ινών - Έξω στοιβάδα επιμήκων μυϊκών ινών 4. Ορογόνος χιτώνας. 16

Ι= Εντερικός αδένας Μ= Βλεννογόνος S= Υποβλεννογόνος Εικόνα 8. Βλεννογόνος και υποβλεννογόνος του φυσιολογικού παχέος εντέρου 2.2.1 Βλεννογόνος 2.2.1.1 Επιθήλιο επιφανείας Το επιθήλιο του παχέος εντέρου είναι ένα απλό κυλινδρικό ή κυβικό επιθήλιο το οποίο λειτουργεί ως προστατευτική ασπίδα μεταξύ του εσωτερικού και του αυλού (εικόνα 8). Αποτελείται από απορροφητικά και λαγηνοειδή ή καλυκοειδή κύτταρα. Τα απορροφητικά κύτταρα είναι υπεύθυνα για την μεταφορά ύδατος και ηλεκτρολυτών. Τα καλυκοειδή κύτταρα συνθέτουν, αποθηκεύουν και εκκρίνουν κοκκία βλέννης. Μια λεπτή βασική μεμβράνη η οποία αποτελείται από κολλαγόνο και άλλες πρωτεΐνες υποστηρίζει το επιθήλιο. Η δομή αυτή είναι διαπερατή σε απορροφηθέντα ή εκκριθέντα ιόντα, πρωτεΐνες και νερό. 17

2.2.1.2 Επιθήλιο των κρυπτών Το απλό κυλινδρικό επιθήλιο το οποίο καλύπτει τις κρύπτες του παχέος εντέρου αποτελείται από ένα πολύ ετερογενή πληθυσμό κυττάρων. Aνώριμα και αδιαφοροποίητα πρώιμα κύτταρα καθώς και εξειδικευμένα νευροενδοκρινικά κύτταρα και κύτταρα Paneth βρίσκονται στις κρύπτες. Υπάρχουν δύο κατηγορίες νευροενδοκρινικών κυττάρων. Αυτά των οποίων η κορυφή έρχεται σε επαφή με τον αυλό του οργάνου και αυτά των οποίων η κορυφή καλύπτεται από άλλα επιθηλιακά κύτταρα. Πάντως ο αριθμός των νευροενδοκρινικών κυττάρων του παχέος εντέρου είναι σημαντικά μειωμένος σε σχέση με το λεπτό έντερο. Τα κύτταρα Paneth είναι εκκριτικά κύτταρα των οποίων η ακριβής λειτουργία δεν έχει διευκρινιστεί με βεβαιότητα. Είναι πυραμιδικά κύτταρα, που βρίσκονται φυσιολογικά μόνο στο τυφλό και στο εγγύς δεξιό κόλο. Μια από τις σπουδαιότερες λειτουργίες των κρυπτών είναι η ανανέωση του επιφανειακού επιθηλίου, τα κύτταρα του οποίου έχουν πεπερασμένο χρόνο ζωής και διαρκώς εκπίπτουν στον αυλό ή χάνονται διαμέσου της διεργασίας του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου γνωστού ως απόπτωση. Το βασικό 50% των κυττάρων της κρύπτης αποτελείται την ζώνη πολλαπλασιασμού ενώ το 25% των κυττάρων αποτελεί τη ζώνη ωρίμανσης. Τα περισσότερα από τα κύτταρα της ζώνης ωρίμανσης έχουν χάσει την ικανότητα πολλαπλασιασμού αλλά συνεχίζουν να διαφοροποιούνται και γίνονται όλο και περισσότερο λειτουργικά ώριμα μέχρι τελικά να εκπέσουν από την επιφάνεια. Τα επιθηλιακά κύτταρα του παχέος εντέρου αντικαθίστανται κάθε 6 ημέρες από άωρα κύτταρα. 2.2.1.3 Χόριο Το χόριο αποτελεί το στρώμα που υποστηρίζει το βλεννογόνο του παχέος εντέρου. Είναι ένα στρώμα χαλαρού συνδετικού ιστού, πλούσιο σε 18

αιμοφόρα αγγεία, λεμφικά κύτταρα, λεία μυικά κύτταρα, αδένες και λεμφοζίδια, που συχνά εκτείνονται μέσα στον υποβλεννογόνιο. Αυτή η αφθονία σε λεμφικό ιστό (GALT) έχει σχέση με τον άφθονο βακτηριακό πληθυσμό του παχέος εντέρου. Τα περισσότερα κύτταρα του χορίου είναι υπεύθυνα για τοπικούς ανοσολογικούς μηχανισμούς που εξασφαλίζουν την άμυνα ενάντια σε επιβλαβείς ξενιστές. Στο σύνολο των κυττάρων που εντοπίζονται στο χόριο περιλαμβάνονται τα πλασματοκύτταρα (Β cells), τα Τ λεμφοκύτταρα, τα Μ κύτταρα, τα ηωσινόφιλα και τα μαστοκύτταρα, οι ινοβλάστες, τα μακροφάγα καθώς και τα νευροενδοκρινικά κύτταρα. 2.2.1.4 Βλεννογόνια μυϊκή στοιβάδα Μια λεπτή στοιβάδα από μυ η βλεννογόνια μυϊκή στοιβάδα διαχωρίζει τον βλεννογόνο (επιθήλιο και χόριο) από τον υποβλεννογόνιο χαλαρό συνδετικό ιστό. Μερικά λεία μυϊκά κύτταρα από αυτήν τη στοιβάδα μπορεί να εκτείνονται προς τα επάνω στο χόριο και μπορεί να είναι πολυάριθμα σε περιοχές που βρίσκονται βλεννογονικές προβολές οι μηνοειδείς πτυχές. 2.2.2 Υποβλεννογόνιος χιτώνας Αποτελείται από πυκνό συνδετικό ιστό. Πολλά από τα κυτταρικά στοιχεία του χορίου βρίσκονται και μέσα στον υποβλεννογόνιο χιτώνα (λεμφοκύτταρα, πλασματοκύτταρα, ινοβλάστες, μακροφάγα). Μερικές όμως δομές του υποβλεννογόνιου όπως τα λιποκύτταρα δεν ανευρίσκονται στο χόριο. Περιέχει το υποβλεννογόνιο πλέγμα ή πλέγμα του Meissner. Είναι δυνατό να περιέχει αδένες. Οι αγγειακοί σχηματισμοί του υποβλεννογόνιου χιτώνα περιλαμβάνουν αρτηριόλια, φλεβίδια και λεμφαγγεία. 2.2.3 Μυϊκός χιτώνας Ο μυϊκός χιτώνας του παχέος εντέρου αποτελείται από λεία μυϊκά κύτταρα και περιλαμβάνει μια έσω κυκλοτερή στιβάδα και μία έξω 19

επιμήκη στιβάδα. Ο νευρικός ιστός του μυεντερικού πλέγματος του Auerbach βρίσκεται μεταξύ των δύο μυϊκών στιβάδων. Ο μυϊκός χιτώνας διαπερνάται από αιμοφόρα αγγεία και λεμφαγγεία. 2.2.4 Ορογόνος χιτώνας Ο ορογόνος είναι ένα λεπτό στρώμα χαλαρού συνδετικού ιστού, πλούσιου σε αιμοφόρα αγγεία, λεμφαγγεία και λιπώδη ιστό, που καλύπτεται από πλακώδες επιθήλιο (μεσοθήλιο). 2.3 Στοιχεία Φυσιολογίας Οι λειτουργίες του παχέος εντέρου είναι (1) η απορρόφηση νερού και ηλεκτρολυτών από το χυμό στον αυλό του εντέρου και (2) η εναποθήκευση του κοπρανώδους υλικού ώσπου να γίνει δυνατή η εξώθησή του. Γι αυτές τις λειτουργίες απαιτούνται αργές κινήσεις, που μπορούν να διακριθούν σε κινήσεις ανάμιξης, μεταξύ των οποίων κυριότερες είναι οι δακτυλιοειδείς συσπάσεις και σακοειδείς διευρύνσεις κατά μήκος του εντέρου, και κινήσεις προώθησης. Οι κινήσεις ανάμιξης βοηθούν ώστε η ποσότητα της κοπρανώδους μάζας να εκτίθεται βαθμιαία στη βλεννογόνια επιφάνεια του παχέος εντέρου και το υγρό της μέρος απορροφάται προοδευτικά ώσπου από τα 800 ml της ημερήσιας ποσότητας του χυμού στον αυλό του εντέρου να βγουν στα κόπρανα μόνο 80-150 ml. Η απορρόφηση ύδατος επιτελείται παθητικά ακολουθώντας την ενεργητική μεταφορά του νατρίου από τις βασικές επιφάνειες αυτών των επιθηλιακών κυττάρων. Φαίνεται ότι κατά ένα μέρος στο παχύ έντερο απορροφώνται και βιταμίνες, μερικές από τις οποίες συντίθενται από τα μικρόβιά του. Οι κινήσεις προώθησης ή μαζικές κινήσεις, ισχυρά περισταλτικά κύματα που επαναλαμβάνονται σε όλη τη διάρκεια της ημέρας, είναι υπεύθυνες για την προώθηση προς τον πρωκτό του κοπρανώδους 20

περιεχομένου. Για τις μαζικές κινήσεις είναι απαραίτητη η ακεραιότητα του μυεντερικού πλέγματος. Φυσιολογικά για να προωθηθεί το περιεχόμενο του παχέος εντέρου χρειάζονται 3-4 τέτοιες κινήσεις, οι οποίες όμως χρησιμεύουν μόνο στην μεταφορά και δεν έχουν άμεση σχέση με την αφόδευση. Η εμφάνιση των μαζικών κινήσεων μετά τα γεύματα προκαλείται κατά ένα μέρος από το γαστροκολικό και το δωδεκαδακτυλικό αντανακλαστικό. Έντονες μαζικές κινήσεις είναι δυνατό να προκαλέσει ο ερεθισμός του κόλου. Για παράδειγμα άτομα με παθολογικές καταστάσεις στο κόλο, όπως η ελκώδης κολίτιδα, παρουσιάζουν πολλές φορές σχεδόν αδιάκοπα πολλές φορές σχεδόν αδιάκοπα μαζικές κινήσεις. Η τελευταία απορρόφηση ύδατος συντελείται στο ορθό. Όταν η ανώτερη μοίρα του ορθού διαταθεί από το περιεχόμενό της, ερεθίζονται τασεοϋποδοχείς που διεγείρουν το αίσθημα για αφόδευση. Το κύριο έκκριμα του παχέος εντέρου είναι η βλέννα. Η βλέννα του παχέος εντέρου προστατεύει το τοίχωμα από τυχόν μικροτραυματισμούς, αποτελεί το συγκολλητικό μέσο που συγκρατεί τις κοπρανώδεις μάζες ενωμένες και προστατεύει το εντερικό τοίχωμα από την έντονη μικροβιακή δραστηριότητα που παρατηρείται μέσα στα κόπρανα και μαζί με την αλκαλικότητα του εκκρίματος αποτελεί φραγμό που εμποδίζει την προσβολή του τοιχώματος από τα οξέα που σχηματίζονται κατά τη ζύμωση των κοπράνων. Επιπλέον όταν κάποιο τμήμα του παχέος εντέρου διεγερθεί έντονα, όπως συμβαίνει στην οξεία μικροβιακή εντερίτιδα, ο βλεννογόνος, πέρα από τις φυσιολογικές ποσότητες βλέννης εκκρίνει μεγάλες ποσότητες νερού και ηλεκτρολυτών. 21

3. ΕΝΤΕΡΙΚΟ ΝΕΥΡΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ 22

3. Εντερικό νευρικό σύστημα 3.1 Στοιχεία ΕΝΣ Το εντερικό νευρικό σύστημα βρίσκεται στο τοίχωμα του γαστρεντερικού σωλήνα. Αποτελείται από νευρώνες (10 8 ) και τα κύτταρα που τους περιβάλλουν, τα οποία είναι τα εντερικά κύτταρα γλοίας, που μοιάζουν με τα αστροκύτταρα του ΚΝΣ, και τα ενδιάμεσα κύτταρα του Cajal, μεσεγχυματικής προέλευσης κύτταρα που διανέμονται σε συγκεκριμένες θέσεις μέσα στο μυϊκό χιτώνα του γαστρεντερικού σωλήνα και χρησιμεύουν σαν ηλεκτρικοί βηματοδότες και μεσολαβητές της εντερικής νευρομεταφοράς [7,16,42]. Τα κύτταρα του ΕΝΣ σχηματίζουν ένα δίκτυο γαγγλίων που εντοπίζεται σε όλο το μήκος του εντέρου [16]. Το μυεντερικό πλέγμα ή πλέγμα του Auerbach βρίσκεται ανάμεσα στην επιμήκη και την κυκλοτερή μυϊκή στοιβάδα. και το υποβλεννογόνιο πλέγμα ή πλέγμα του Meissner βρίσκεται στον υποβλεννογόνιο χιτώνα (εικόνα 9). Το μυεντερικό πλέγμα ελέγχει κυρίως τις γαστρεντερικές κινήσεις, ενώ το υποβλεννογόνιο πλέγμα έχει το σημαντικό έλεγχο της έκκρισης και ταυτόχρονα εξυπηρετεί πολλές αισθητικές λειτουργίες με την υποδοχή σημάτων κυρίως από το εντερικό επιθήλιο και από υποδοχείς τάσης του εντερικού τοιχώματος. Γενικά, η διέγερση του μυεντερικού πλέγματος αυξάνει την δραστηριότητα του εντέρου. Ορισμένες, όμως ίνες του είναι μάλλον ανασταλτικές παρά διεγερτικές. Το ενδογενές νευρικό σύστημα, δηλαδή το μυεντερικό και το υποβλεννογόνιο πλέγμα, ευθύνεται ειδικότερα για πολλά νευρογενή τοπικά αντανακλαστικά του εντέρου, όπως τα αντανακλαστικά που ξεκινούν από το επιθήλιο του βλεννογόνου και αυξάνουν την 23

δραστηριότητα του μυϊκού χιτώνα ή προκαλούν τοπική έκκριση πεπτικών υγρών από τους υποβλεννογόνιους αδένες [3,7,16,21,37]. Εικόνα 9. Το Εντερικό Νευρικό Σύστημα 3.2 Εμβρυονική ανάπτυξη Τα πρόδρομα κύτταρα των νευρώνων και της γλοίας του ΕΝΣ προέρχονται από μεταναστευτικά κύτταρα από τα : παρασυμπαθητικό, κεφαλο-στελεχιαίο και ιερό, επίπεδα της νευρικής ακρολοφίας. Από τα τρία αυτά επίπεδα, το παρασυμπαθητικό είναι το πιο καθοριστικό γιατί τα προερχόμενα από αυτό κύτταρα αποικίζουν όλο το έντερο, ενώ τα κύτταρα που προέρχονται από το κεφαλο-στελεχιαίο τμήμα της νευρικής ακρολοφίας αποικίζουν τον οισοφάγο και τον εγγύς σε αυτόν στόμαχο και από το ιερό τμήμα, το κάτωθεν του ομφαλού, έντερο. 24

Τα προερχόμενα από τη νευρική ακρολοφία κύτταρα, μεταναστεύουν μέσω καθορισμένων οδών που οδηγούν στο έντερο. Η τελική διαφοροποίηση δεν λαμβάνει χώρα μέχρι τουλάχιστον ένα ποσοστό να φτάσει στο εντερικό τοίχωμα και ν αλληλεπιδράσει με το εντερικό μικροπεριβάλλον, μέσω συγκεκριμένων συνδυασμών αυξητικών παραγόντων-υποδοχέων. Εάν αυτά το μόρια δεν είναι διαθέσιμα, συμβαίνει πρόωρη διακοπή της μετανάστευσης των προερχόμενων από τη νευρική ακρολοφία κυττάρων και η νεύρωση του εντέρου υπολείπεται. Σε αυτόν τον αποικισμό, έχουν βρεθεί να παίζουν ρόλο οι νευροτροφικοί παράγοντες: (Glial cell-derived Neurotrophin Factor) GDNF, NT-3, ο μεταγραφικός παράγοντας Mash-1 καθώς και οι πρωτείνες ΕΤ-3 (Endothelin-3), λαμινίνη-1, νετρίνες και σεμαφορίνες [16,44]. 25

4. ΕΛΚΩΔΗΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ 26

5. ΕΛΚΩΔΗΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ Η ελκώδης κολίτιδα είναι χρόνιο φλεγμονώδες νόσημα του παχέος εντέρου. Η ακριβής αιτιολογία της νόσου παραμένει άγνωστη. Επικρατεί η άποψη πως συνδέεται με μια πολύπλοκη αλληλεπίδραση μεταξύ γενετικής προδιάθεσης και αρκετών παραγόντων του περιβάλλοντος. Προσφάτως, βρέθηκαν αρκετές θέσεις στο ανθρώπινο γονιδίωμα (χρωμοσώματα) που προδιαθέτουν σε εμφάνιση της νόσου, αλλά που από μόνα τους είναι αδύνατον να την προκαλέσουν [11,27]. 4.1 Εμφάνιση Είναι κατεξοχήν νόσος των νέων. Τα πρώτα συμπτώματα της νόσου εμφανίζονται συνήθως στη δεκαετία από 15 έως 25 ετών. Μια άλλη δεκαετία έρχεται δεύτερη σε συχνότητα και είναι αυτή των 55 έως 65 ετών. Αυτό δεν σημαίνει ότι η νόσος δεν μπορεί να εμφανισθεί σε οποιαδήποτε άλλη ηλικία. Έτσι, το 2% των περιπτώσεων αφορά παιδιά κάτω των 10 ετών και το 30% σε παιδία ηλικίας 10 έως 19 ετών. Δεν υπάρχει διαφορά μεταξύ ανδρών και γυναικών. Η νόσος είναι συχνότερη στους κατοίκους της πόλης και στους αποφοίτους της τριτοβάθμιας εκπαίδευσης. Τα δεδομένα αυτά είναι στατιστικές επισημάνσεις και μέχρι στιγμής δεν έχουν οδηγήσει σε κανένα συμπέρασμα σχετικά με τις αιτίες της [11,27]. 4.2 Εντόπιση Προσβάλει τον βλεννογόνο του παχέος εντέρου και μάλιστα η φλεγμονή εντοπίζεται σε συνεχόμενο τμήμα του παχέος εντέρου. Στους μισούς περίπου ασθενείς εντοπίζεται στην ορθοσιγμοειδική περιοχή, στο 30% εκτείνεται μέχρι την αριστερή κολική καμπή και στο υπόλοιπο 20% καταλαμβάνει και το εγκάρσιο ή ολόκληρο το παχύ έντερο. Στις 27

περισσότερες περιπτώσεις η νόσος παραμένει εντοπισμένη στην έκταση της αρχικής προσβολής [11,27]. 4.3 Συμπτώματα Η νόσος χαρακτηρίζεται από εξάρσεις- κρίσεις που εναλλάσσονται με περιόδους υφέσεων. Η κρίση εκδηλώνεται με: πόνο στην κοιλιά, πέντε έως είκοσι διαρροϊκές και αιματηρές κενώσεις την ημέρα, αίσθημα επείγουσας κένωσης, πυρετό, ναυτία, εμετό, απώλεια βάρους, συνεχή εφίδρωση κατά τη διάρκεια της νύχτας, πρήξιμο στην κοιλιά, κόπωση, καταβολή, ανορεξία. Πολλοί ασθενείς εμφανίζουν συμπτώματα από άλλα όργανα του σώματος όπως: άφθες στο στόμα, αρθρίτιδα, ερύθημα και γαγγραινώδες πυόδερμα, ιριδοκυκλίτιδα, ηπατοπάθεια, οστεοπόρωση, κυψελίτιδα ή ίνωση. Η χαμηλή απορροφητικότητα βιταμινών και ιχνοστοιχείων οδηγεί σε: δυσχέρεια της νυχτερινής όρασης, κώφωση, αγευσία, ευαισθησία στις λοιμώξεις, τριχόπτωση, στειρότητα (στους άνδρες), απώλεια διάθεσης για σεξ, μείωση ανάπτυξης, αναιμία, δερματοπάθειες, χολολιθίαση, νεφρολιθίαση (δυσαπορρόφηση οξαλικού οξέος) [11,27]. 4.4 Παθολογοανατομικά χαρακτηριστικά Τα παθολογοανατομικά χαρακτηριστικά της ελκώδους κολίτιδας είναι αυτά της φλεγμονής, της εξέλκωσης και της χρόνιας βλάβης του βλεννογόνου. Παρατηρείται ατροφία του βλεννογόνου και παραμόρφωση της αρχιτεκτονικής του (εικόνα 10). Ο αριθμός των κρυπτών μειώνεται και όσες παραμένουν εμφανίζονται κοντές, δεν εφάπτονται στη βλεννογόνια μυϊκή στοιβάδα, χάνουν την παράλληλη διάταξή τους, επεκτείνονται και αποκτούν άναρχη δομή. Ενδέχεται να υπάρχουν 28

κύτταρα Paneth. Η βλεννογόνια μυϊκή στοιβάδα όταν υπάρχει στα δείγματα, είναι συνήθως υπερτροφική. Σχεδόν πάντα υπάρχει μια διάχυτη, φλεγμονώδης διήθηση του χορίου, κυρίως από μονοπύρηνα (εικόνα 12). Η διήθηση της επιθηλιακής στοιβάδας με ουδετερόφιλα μπορεί να προκαλέσει συλλογές ουδετεροφίλων στον αυλό των κρυπτών (κρυπτικό απόστημα) (εικόνα 11). Η περαιτέρω καταστροφή του βλεννογόνου οδηγεί σε πραγματική εξέλκωση, η οποία επεκτείνεται μέσα στον υποβλεννογόνιο και μερικές φορές αφήνει εκτιθέμενη τη μυϊκή στιβάδα. Κατά την ύφεση της ενεργού νόσου, κοκκιώδης ιστός γεμίζει τους κρατήρες των ελκών και ακολουθεί η αναγέννηση του βλεννογονικού επιθηλίου (εικόνα 13). Εικόνα 10. Ελκώδης κολίτιδα Εικόνα 11. Κρυπτικό απόστημα Εικόνα 12. Α, Β) Οξεία φλεγμονή παχέος εντέρου 29

Εικόνα 13. Αναγέννηση του βλεννογόνου σε ελκώδη κολίτιδα. 30

Η πιο σοβαρή επιπλοκή της ελκώδους κολίτιδας είναι η ανάπτυξη καρκίνου του κόλον. Δυο παράγοντες καθορίζουν τον κίνδυνο, η διάρκεια της νόσου και η επέκτασή της. 31

5. ΝΕΥΡΟΤΡΟΦΙΝΕΣ ΚΑΙ ΦΛΕΓΜΟΝΗ 32

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι οι νευροτροφίνες μπορεί να έχουν έναν ευρύτερο ρόλο από αυτόν που υποδηλώνει το όνομά τους. Υπάρχουν μελέτες που αναφέρουν ρόλο των νευροτροφινών στο ανοσοποιητικό και αιμοποιητικό σύστημα. Ειδικά για τον NGF, πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι παράγεται και τίθεται στην κυκλοφορία από μια ποικιλία κυττάρων του ΚΝΣ και του ΠΝΣ, καθώς και από κύτταρα του ανοσοποιητικού και ενδοκρινούς συστήματος. Σε μελέτες σε ποντίκια αρσενικά, έχει βρεθεί ότι ο NGF παράγεται σε μεγάλες ποσότητες από τους σιελογόνους αδένες. Η λειτουργική σημασία αυτού του γεγονότος δεν είναι πλήρως κατανοητή, παρόλο που τα πειραματικά δεδομένα δείχνουν ότι ο NGF παράγεται από τους αδένες και τίθεται στην αιματική κυκλοφορία ακολουθώντας μια επιθετική συμπεριφορά που επηρεάζει τα νευρικά κύτταρα, τα χρωμαφινικά, τα ιστικά και τα λεμφοκύτταρα, και ίσως παίζει ρόλο σε ομοιοστατικές απαντήσεις [36]. Πιο συγκεκριμένα έκφραση των νευροτροφινών βρέθηκε στα λεμφικά όργανα των σπονδυλωτών : θύμο αδένα, αμυγδαλές, σπλήνα, λεμφαδένες, μυελό των οστών, πλάκες Peyer. Τα Β-λεμφοκύτταρα και Τ-λεμφοκύτταρα εκφράζουν τους NGF και BDNF σε άνθρωπο, ποντίκι και αρουραίο, τα μακροφάγα και τα μονοκύτταρα εκφράζουν τους NGF και NT-3 σε άνθρωπο και ποντίκι, τα ουδετερόφιλα, βασεόφιλα, ηωσινόφιλα, ιστικά και άλλα κύτταρα εκφράζουν τον NGF σε άνθρωπο και ποντίκι [13,33,40]. Τα κύτταρα αυτά συνδέονται άμεσα με την ανοσολογική απάντηση του οργανισμού σε φλεγμονές. Οι νευροτροφίνες συνδέονται άμεσα με τις λειτουργίες αυτών των κυττάρων, όπως η χημειοταξία και η δημιουργία ερεθισμάτων για τη σύνθεση αντισωμάτων. Βασικές και προκλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι τα επίπεδα κυκλοφορίας του NGF δεν επηρεάζονται μόνο από νευροενδοκρινικές δυσλειτουργίες, αλλά επίσης από αλλαγές της ηλικίας που ακολουθούνται από νευρολογικές προσβολές, και κατά τη διάρκεια φλεγμονωδών 33

απαντήσεων, αυτοάνοσων ασθενειών, παρασιτικών λοιμώξεων και αλλεργικών αντιδράσεων [36]. Μελέτες κυρίως in vitro έχουν δείξει ότι η σύνθεση και η διάθεση του NGF συχνά συνδέεται με αύξηση των προφλεγμονωδών κυτοκινών, κυρίως της ιντερλευκίνης-1 βήτα (IL-1β) και του tumour necrosis factor-alpha (TNF-α)[36]. Σε ανοσολογικές απαντήσεις του οργανισμού συμμετέχει και το αιμοποιητικό σύστημα με τα λευκά και τα αιμοπετάλια. Οι νευροτροφίνες και συγκεκριμένα ο NGF έχει βρεθεί πως συμμετέχει στον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των αιμοτοποιητικών κυττάρων, στις αλλαγές στο σχήμα των αιμοπεταλίων και στην αύξηση της αγγειακής διαπερατότητας [40]. Υπάρχουν δεδομένα που προτείνουν ότι ο NGF πιθανόν εμπλέκεται στο σύμπλεγμα ελέγχου της αιμοποίησης, δρώντας ως μεσολαβητής της ενδοαντίδρασης μεταξύ του μικροπεριβάλλοντος του μυελού των οστών και των αιμοποιητικών stem cells [36]. Κάποιες μελέτες προτείνουν ότι οι νευροτροφίνες μπορούν να δρούν ως ορμόνες που ελευθερώνονται στην κυκλοφορία του αίματος σε καταστάσεις στρες και με αυτό τον τρόπο ενεργοποιούν ανοσοποιητικά κύτταρα σε όλο το σώμα. Αυτή η θεωρία βασίστηκε στην παρατήρηση ότι τα επίπεδα του NGF αυξήθηκαν στο πλάσμα κατά τη διάρκεια στρες και ανοσολογικών νοσημάτων [5]. Έχει βρεθεί ότι τα ανοσοποιητικά και αιμοποιητικά κύτταρα που βρίσκονται στα κύρια και δευτερεύοντα λεμφικά όργανα, φαίνεται να ρυθμίζουν απευθείας τις συνάψεις με τα νευρικά κύτταρα [15]. Αποτέλεσμα αυτού είναι η παρουσία συμπαθητικών ινών στους λεμφικούς ιστούς και την ικανότητα αυτών των ιστών να παράγουν τον NGF. Αυτή η διαπίστωση προτείνει μια δομική σύνδεση ανάμεσα στο νευρικό και ανοσοποιητικό σύστημα, που μπορεί να είναι σημαντική για τη μετάφραση των νευρικών μηνυμάτων σε χημικά, τα οποία μετά μπορούν 34

να αντιδρούν με κυτταρικά στοιχεία του ανοσοποιητικού συστήματος [36]. Γενικά οι νευροτροφίνες εκτός από την νευροτροφική τους δράση, προτείνεται ότι επιδεικνύουν μια ποικιλία επιδράσεων στην καταγωγή των ανοσοποιητικών και αιματολογικών κυττάρων. Παράλληλα έχει συζητηθεί η διαντίδραση μεταξύ του NGF και των ιστικών κυττάρων σε αλλεργικές αντιδράσεις και έχει προταθεί ένας δυναμικός ρόλος [36]. 5. 1 Σκοπός της μελέτης Ο ακριβής μηχανισμός που εμπλέκεται στις χρόνιες εντερικές φλεγμονές δεν είναι σαφής. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι οι νευροτροφίνες, όπως οι NGF, BDNF και η νευροτροφίνη-3, έχουν ταυτοποιηθεί στους φλεγμένοντες ιστούς διαφόρων ζώων και στον άνθρωπο. Οι μελέτες έδειξαν ότι υπάρχει αύξηση της έκφρασης του NGF και του υποδοχέα του, TrkA, σε φλεγμονώδεις νόσους του εντέρου [10,40]. Σκοπός της εργασίας αυτής είναι να γίνει σύγκριση σε φυσιολογικό και φλεγμονώδες έντερο, συγκεκριμένα από ελκώδη κολίτιδα, ως προς την έκφραση των υποδοχέων των νευροτροφινών TrkA, TrkB και TrkC. Επίσης μελετήθηκε η έκφραση του υποδοχέα των νευροτροφινών p75 NTR. 35

6. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ 36

6.1 Υλικό της μελέτης Τα δείγματα φλεγμονώδους εντέρου που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη προέρχονται από το αρχείο του Παθολογοανατομικού Εργαστηρίου του Γενικού Νοσοκομείου «Άγιος Ανδρέας». Τα δείγματα φυσιολογικού εντέρου προέρχονται από νεκροτομές, και για τη συλλογή τους ακολουθήθηκαν όλες οι νόμιμες διαδικασίες. Συλλέχθηκαν δείγματα φυσιολογικού και φλεγμονώδους παχέος εντέρου, από άνδρες και γυναίκες ηλικίας από 19 έως και 78 ετών. Συνολικά η μελέτη περιελάμβανε πενήντα (50) περιστατικά που εξετάσθηκαν από το 1996 2005. Συλλέχθηκαν πέντε (5) δείγματα φυσιολογικού εντέρου και σαράντα πέντε (45) δείγματα φλεγμονώδους. (Πίνακας 1) 6.2 Προετοιμασία του ιστού Όλα τα παρασκευάσματα μονιμοποιήθηκαν σε διάλυμα φορμόλης και στη συνέχεια εγκλείστηκαν σε κύβους παραφίνης. Τα δείγματα φλεγμονώδους εντέρου ήταν όλα βιοψίες. Οι τομές κόπηκαν σε πάχος 4μm και επιστρώθηκαν σε αντικειμενοφόρους πλάκες Polysine ( Menzel- Glaser, Germany), έτοιμες προς χρήση. Κατά την μονιμοποίηση μπορεί να υπάρξει απόκρυψη των αντιγονικών θέσεων από τη δημιουργία μεθυλενικών γεφυρών μεταξύ πρωτοταγών αμινών, αμιδίων, θειολών, αλκοολικών υδροξυλίων και κυκλικών αρωματικών δακτυλίων καθώς και δημιουργία ασθενών βάσεων Schiff. Για να αποκαλυφθούν αυτές οι θέσεις θερμάνθηκαν οι τομές σε φούρνο μικροκυμάτων με τη χρήση ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικού οξέος. 37

6.3 Αντισώματα Σε κάθε περίπτωση χρησιμοποιήθηκε η συνήθης ανοσοϊστοχημική χρώση με αντίσωμα εναντίον των Trk-A (Santa Cruz), Trk-B (Santa Cruz), Trk-C (Santa Cruz) και p75 NTR (NeoMarkers) υποδοχέων. Η αραίωση των αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν καθορίστηκε μετά από δοκιμαστικές μελέτες στις οποίες συγκρίθηκαν τα αποτελέσματα ως προς τη χρώση πολλών διαφορετικών αραιώσεων. Από αυτές επιλέχθηκε η αραίωση εκείνη η οποία συνδύαζε την καλύτερη ένταση χρώσης με τη μικρότερη μη ειδική χρώση του υποστρώματος (background). Πιο συγκεκριμένα για το TrkA και το TrkB επιλέχθηκε η αραίωση 1:200, ενώ για το TrkC η 1:250 και για το p75 NTR η 1:80. 6.4 Διαλύματα Tris Buffer 0.05 M: 6,1 gr Tris σε 1000 ml Η 2 Ο απιονισμένο. Ρύθμιση του ρη 7,4 7,6 με 1Ν HCl. HCl 1N: 8,5 gr HCl σε 100 ml H 2 O απιονισμένο. Διάλυμα NaCl : 9 gr NaCl σε 1000 ml H 2 O απιονισμένο Tris-buffer saline (TBS) : 900ml NaCl (διάλυμα) και 100 ml Tris Buffer ph 7,4-7,6 Κιτρικό Na buffer : 2,1 gr. κιτρικό Νa σε 1000 ml H 2 O απιονισμένο. Ρύθμιση ρη 6. Διάλυμα Η 2 Ο 2 3% : 97 ml H 2 O απιονισμένο και 3 ml H 2 O 2 30% 38

6.5 Ανοσοϊστοχημική μέθοδος Η ανοσοϊστοχημική μέθοδος είναι μια τεχνική που στηρίζεται στην πολύ ειδική σχέση που υπάρχει στις αντιδράσεις αντιγόνου αντισώματος. Ως μέθοδος εμφανίζει πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα. Τα πλεονεκτήματα της είναι ότι δίνει τη δυνατότητα μορφολογικής απεικόνισης των αποτελεσμάτων, εμφανίζει μεγάλη ευαισθησία, διακρίνεται από ευκολία και ταχύτητα και παρέχει τη δυνατότητα φύλαξης των ιστών σε παραφίνη ώστε να χρησιμοποιηθούν στο μέλλον αν παραστεί ανάγκη. Τα μειονεκτήματα της μεθόδου είναι ότι κάποια από τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται είναι καρκινογόνα, δεν υπάρχει αντικειμενικός τρόπος για την αξιολόγηση της έντασης της χρώσης και το κυριότερο ότι μπορεί κατά την επεξεργασία του ιστού να υπάρξει απόκρυψη των αντιγονικών θέσεων. Στην παρούσα εργασία για να γίνει η ανίχνευση των αντισωμάτων που δεσμεύτηκαν στους ιστούς χρησιμοποιήθηκε μια χρωμομετρική μέθοδος, που βασίζεται στη μετατροπή χρωμογόνου του υποστρώματος από κάποιο ένζυμο προς έγχρωμο προϊόν, το οποίο κατακρημνίζεται. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκαν το ένζυμο υπεροξειδάση και το χρωμογόνο υπόστρωμα διαμινοβενζιδίνη, που παράγουν ένα προϊόν αδιάλυτο στην αιθανόλη με χρώμα καφέ, το οποίο είναι ορατό στο οπτικό μικροσκόπιο. Για να ανιχνευθούν τα αντισώματα που έχουν δεσμευθεί στις αντιγονικές θέσεις, πρέπει να συνδεθεί σε αυτά το ένζυμο, ώστε με την προσθήκη του χρωμογόνου υποστρώματος να γίνει ορατό στις ειδικές θέσεις το προϊόν. Το πρωτεύον αντίσωμα μπορεί να σημανθεί απευθείας με την υπεροξειδάση, ή να ανιχνευτεί από δευτερεύον σημασμένο αντίσωμα, το οποίο θα έχει παραχθεί εναντίον των ανοσοσφαιρινών του οργανισμού από τον οποίο προέρχεται το πρώτο αντίσωμα. 39

Το σύστημα ενίσχυσης-ανίχνευσης Dako Envision ΤΜ που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη αυξάνει σημαντικά την αναλογία σήματος προς αντίσωμα. Στην συγκεκριμένη τεχνική το δευτερεύον αντίσωμα είναι συνδεδεμένο σε σύμπλεγμα από μεγαλομόριο δεξτράνης, που φέρει μεγάλο αριθμό μορίων ενζύμου, άρα σε ένα μόριο πρωτεύοντος αντισώματος, αντιστοιχούν πολλά μόρια υπεροξειδάσης, με αποτέλεσμα ισχυρότατη αντίδραση παραγωγής έγχρωμου προϊόντος. 6.6 Περιγραφή της ανοσοϊστοχημικής μεθόδου Αποπαραφίνωση των τομών παραφίνης στον κλίβανο στους 56ºC όλη νύχτα και εμβάπτισή τους σε ξυλόλη, 2 φορές επί 10 min κάθε φορά. Ενυδάτωση του ιστού σε κατιούσα σειρά αλκοολών ( 100º, 100º, 96º, 80º, 70º) επί 3 min σε κάθε αλκοόλη. Έκπλυση με H 2 O απιονισμένο επί 5 min. Κατανάλωση της ενδογενούς υπεροξειδάσης των ιστών με εμβάπτιση των τομών σε διάλυμα 3 % Η 2 Ο 2 σε νερό επί 20 min σε σκοτάδι. Έκπλυση των τομών με H 2 O απιονισμένο τρεις φορές επί 5min. Τοποθέτηση των τομών σε buffer κιτρικού Na ρη 6,0 και θέρμανσή τους σε φούρνο μικροκυμάτων 5min στα 700 Watt, 5 min στα 500 Watt και 5 min στα 300 Watt. Μετά το τέλος κάθε γύρου οι τομές παραμένουν εκτός του φούρνου για 5 min να κρυώσουν και αν χρειάζεται προστίθεται ρυθμιστικό διάλυμα, buffer κιτρικού Na, για αντιστάθμιση των απωλειών λόγω εξατμίσεως. Μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας στο φούρνο μικροκυμάτων οι τομές αφήνονται σε θερμοκρασία δωματίου για 20 min. Ακολουθεί έκπλυση των τομών με TBS τρεις φορές επί 5 min καθεμία. Επώαση με το ειδικό αντίσωμα αραιωμένο με TBS που περιέχει BSA 1% και γάλα 5%, επί δύο ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. 40

Έκπλυση των τομών με TBS τρεις φορές επί 5 min. Κατανάλωση ενδογενούς υπεροξειδάσης με εμβάπτιση των τομών σε διάλυμα 3% Η 2 Ο 2 σε Η 2 Ο για 3 min σε σκοτάδι. Έκπλυση των τομών με TBS τρεις φορές επί 5 min. Επώαση επί 45 min με το Envision σε θερμοκρασία δωματίου. Έκπλυση των τομών με TBS τρεις φορές επί 5 min. Ανίχνευση των θέσεων δέσμευσης της υπεροξειδάσης με την εφαρμογή διαλύματος τετραϋδροχλωρικής διαμινοβενζίνης ( DAB) για 10 min. Έκπλυση των τομών με H 2 O απιονισμένο και τρεχούμενο νερό βρύσης. Εμβάπτιση των τομών σε αιματοξυλίνη Harris για ένα λεπτό, για να χρωματισθούν οι πυρήνες με αντίθετη χρώση. Έκπλυση των τομών με τρεχούμενο νερό βρύσης. Αφυδάτωσή τους σε ανιούσα σειρά αλκοολών (70º, 80º, 96º, 100º, 100º). Εμβάπτιση σε ξυλόλη (2 μπανάκια) και επικόλληση καλυπτρίδων με χρήση διαλυτού στην ξυλόλη μέσου ( Entellan, Merch, Germany). 41

6.7 Αξιολόγηση της ανοσοϊστοχημικής χρώσης Μετά την ανοσοϊστοχημική μέθοδο, έγινε μελέτη των παρασκευασμάτων με τη χρήση φωτονικού μικροσκοπίου. Μελετήθηκε η παρουσία των υποδοχέων των νευροτροφινών, σε φυσιολογικό και φλεγμονώδες παχύ έντερο. Συγκεκριμένα ελέχθησαν τα νευρικά πλέγματα, τα επιθηλιακά κύτταρα και τα αγγεία. Η βαθμολόγηση της έντασης της χρώσης σε κάθε τομή έγινε ως εξής: 0=αρνητικό, 1+=αδρή χρώση, 2+=μέτρια χρώση, 3+=έντονη χρώση. Τα αποτελέσματα φαίνονται στον πίνακα 1. Λόγω του περιορισμένου υλικού, που προέρχονταν από βιοψίες, δεν ήταν δυνατή η λήψη πολλών τομών, με αποτέλεσμα να μην μπορούν όλα τα περιστατικά να ελεγχθούν και για τους τέσσερις υποδοχείς. Επιπλέον ορισμένες τομές δεν είχαν πλέγματα, με αποτέλεσμα να μην μπορούν να προσμετρηθούν στο σύνολο των στατιστικών αποτελεσμάτων. 42

7. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 43

- Trk-A Φυσιολογικό έντερο Κατά την παρατήρηση των αποτελεσμάτων στους ιστούς που επεξεργάστηκαν με αντίσωμα έναντι του υποδοχέα TrkA, βρέθηκε μέτρια κοκκιώδης χρώση στο κυτταρόπλασμα των επιθηλιακών κυττάρων και συγκεκριμένα, στο τμήμα άνω του πυρήνα (εικόνα 14). Η εντόπιση της χρώσης είναι σταθερή στο συγκεκριμένο τμήμα, με αποτέλεσμα στο σύνολό τους τα κύτταρα να δίνουν την αίσθηση δημιουργίας δακτυλίων γύρω από τους αυλούς σε εγκάρσιες τομές των λαχνών. Κοκκιώδης χρώση έντασης 2+ παρατηρήθηκε και στα κύτταρα των πλεγμάτων, κυρίως του υποβλεννογόνιου αλλά και του μυεντερικού (μικρότερη έκφραση). Φλεγμονώδες έντερο Σε αντιστοιχία με το φυσιολογικό και στο φλεγμονώδες υπάρχει έκφραση στο κυτταρόπλασμα των επιθηλιακών κυττάρων που εντοπίζεται στο ίδιο σημείο, άνω του πυρήνα (εικόνα 15). Η έντασή της όμως παρουσιάζει αύξηση (ένταση 3+) σε σχέση με το φυσιολογικό επιθήλιο (ένταση 2+). Η έκφραση αυξάνει (ένταση 3+) και στα πλέγματα σε σχέση με το φυσιολογικό έντερο (ένταση 2+) (πίνακες 1-4). (Εικόνες 16-18). - Trk-B Φυσιολογικό έντερο Η παρατήρηση των ιστών που επεξεργάστηκαν με αντίσωμα έναντι του υποδοχέα TrkB έδειξε επίσης κοκκιώδη χρώση. Υπάρχει χρώση μεμονωμένων κυττάρων του επιθηλίου, με ένταση που παραμένει σταθερή και έντονη (3+), σε όλα τα περιστατικά (εικόνα 24). Τα αγγεία είναι θετικά οπότε χρησιμοποιούνται ως ενδογενής θετικός έλεγχος για τη χρώση του TrkB (εικόνα19). Τα πλέγματα εμφανίζουν μέτρια έκφραση, (ένταση 2+) για τον TrkB (εικόνες 20-22). 44

Φλεγμονώδες έντερο Στους ιστούς αυτούς εξακολουθεί να υπάρχει έκφραση έντασης 3+ των μεμονωμένων κυττάρων του επιθηλίου (εικόνα 23). Στα πλέγματα υπάρχει μείωση της έκφρασης με το σύνολο των περιστατικών να είναι αρνητικά (πίνακες 1-4). - Trk-C Φυσιολογικό έντερο Η παρατήρηση των ιστών που επεξεργάστηκαν με αντίσωμα έναντι του υποδοχέα Trk-C έδειξε και εδώ κοκκιώδη χρώση. Παρατηρήθηκε μέτρια έκφραση (2+) κυρίως στα κύτταρα των πλεγμάτων, υποβλεννογόνιου (εικόνα 27) και μυεντερικού. Θετική χρώση έντονη που θα μπορούσε να χαρακτηριστεί 3+ διακρίνουμε και στη βλεννογόνια μυϊκή στοιβάδα. Όσον αφορά το επιθήλιο, παρατηρήθηκε έκφραση στο αδενικό επιθήλιο, με ένταση που κυμαίνεται μεταξύ 1+ και 2+.(Εικόνα 25). Φλεγμονώδες έντερο Στο σύνολο των περιστατικών που μελετήθηκε παρατηρήθηκε έκφραση έντασης 1+ για τον TrkC υποδοχέα στα πλέγματα (εικόνες 28, 29). Στο επιθήλιο, η έκφραση έδειξε μια μέση θετικότητα που κυμαίνεται κοντά στο 1,5+ στο σύνολο των περιστατικών ενώ στους άνδρες φαίνεται να το ξεπερνά και στις γυναίκες να τείνει κάτω από το 1+. Στην κολίτιδα, η έκφραση για τον TrkC υποδοχέα όταν υπάρχει είναι πάντα στο επιφανειακό επιθήλιο, ενώ σε κάποια ελάχιστα περιστατικά εμφανίζεται και στο αδενικό (εικόνα 26),(πίνακες 1-4). 45

- p75 NTR Φυσιολογικό έντερο Ο υποδοχέας αυτός εκφράζεται κατά αποκλειστικότητα στα κύτταρα των πλεγμάτων. Σε όλα τα δείγματα φυσιολογικού εντέρου που μελετήθηκαν υπήρχαν πλέγματα (μυεντερικό και υποβλεννογόνιο). Σε όλες τις περιπτώσεις παρατηρήθηκε έκφραση του p75 NTR με ένταση έκφρασης 3+ στα κύτταρα των πλεγμάτων (εικόνες 31,32). Φλεγμονώδες έντερο Στο φλεγμονώδες έντερο ο υποδοχέας p75 NTR εκφράζεται και πάλι αποκλειστικά στα πλέγματα. Η έκφρασή του όμως μειώνεται. Η μέση θετικότητα του κυμαίνεται από ένταση χρώσης 1+ έως 2+ στο σύνολο των περιστατικών, όπου υπήρχαν πλέγματα και τα οποία μελετήθηκαν για την έκφραση του p75 NTR (πίνακες 1-4).(Εικόνα 30). 46

Α/Α Trk-A Trk-B Trk-C P75 NTR ΥΛΙΚΟ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΦΥΛΟ ΗΛΙΚΙΑ ΠΛΕΓΜΑ ΕΠΙΘΗΛΙΟ ΠΛΕΓΜΑ ΕΠΙΘΗΛΙΟ MEMONΩMENA ΠΛΕΓΜΑ ΕΠΙΘΗΛΙΟ ΠΛΕΓΜΑ ΕΠΙΘΗΛΙΟ 1 2+ 2+ 2+ 0 3+ 1+ 1+ 3+ 0 ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟ ΑΡΡΕΝ 66 2 2+ 2+ 3+ 0 3+ 2+ 0 3+ 0 ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟ ΑΡΡΕΝ 66 3 2+ 2+ 2+ 1+ 3+ 2+ 2+ 1+ 0 ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟ ΑΡΡΕΝ 38 4 2+ 2+ 2+ 0 3+ 2+ 2+ 3+ 0 ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟ ΑΡΡΕΝ 52 5 3+ 2+ 2+ 0 3+ 2+ 1+ 3+ 0 ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟ ΘΗΛΥ 85 6 0 2+ 0 0 3+ 0 0 ΌΧΙ ΠΛΕΓΜΑ ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΕΛΚΩΔΗΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΑΡΡΕΝ 42 7 0 2+ 0 0 3+ 0 0 ΌΧΙ ΠΛΕΓΜΑ ΟΡΘΟ ΧΡΟΝΙΑ ΕΝΕΡΓΟΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ, ΛΟΙΜΩΔΗΣ, ΘΗΛΥ 38 ΕΛΚΩΔΗΣ 8 1+ 1+ 0 0 3+ 0 0 ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΕΛΚΩΔΗΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΘΗΛΥ 36 9 0 0 1+ 0 ΟΡΘΟ ΛΟΙΜΩΔΗΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΘΗΛΥ 60 10 0 1+ 2+ 0 ΣΙΓΜΟΕΙΔΕΣ ΧΡΟΝΙΑ ΜΗ ΕΙΔΙΚΗ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΑΡΡΕΝ 49 11 2+ 2+ 2+ 2+ 3+ 0 0 ΌΧΙ ΠΛΕΓΜΑ ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΧΡΟΝΙΑ ΕΝΕΡΓΟΣ ΦΛΕΓΜΟΝΗ ΘΗΛΥ 53 12 0 1+ ΌΧΙ ΠΛΕΓΜΑ ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΛΟΙΜΩΔΗΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ, ΙΦΝΕ ΘΗΛΥ 52 13 3+ 3+ 0 0 3+ 0 2+ ΌΧΙ ΠΛΕΓΜΑ ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ, ΙΦΝΕ, ΛΟΙΜΩΔΗΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΑΡΡΕΝ 46 ΣΙΓΜΟΕΙΔΕΣ 14 3+ 3+ 0 0 0 0 2+ 2+ 0 ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΧΡΟΝΙΑ ΕΛΚΩΔΗΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΑΡΡΕΝ 78 15 2+ 2+ 0 0 3+ ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΟΞΕΙΑ ΚΟΛΙΤΙΔΑ - ΛΟΙΜΩΔΗΣ ΑΡΡΕΝ 69 16 1+ 1+ 0 0 3+ 1+ 1+ 2+ 0 ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΧΡΟΝΙΑ ΜΗ ΕΙΔΙΚΗ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΑΡΡΕΝ 58 17 2+ 2+ 0 0 3+ 0 0 ΌΧΙ ΠΛΕΓΜΑ ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΕΛΚΩΔΗΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΑΡΡΕΝ 18 2+/3+ 2+ 0 0 3+ 1+/2+ 1+/2+ 1+ 0 ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΕΛΚΩΔΗΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΑΡΡΕΝ 58 19 1+ 2+ 2+ 0 ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΧΡΟΝΙΑ ΜΗ ΕΙΔΙΚΗ ΚΟΛΙΤΙΔΑ, ΛΟΙΜΩΔΗΣ ΘΗΛΥ 40 20 1+ 2+ 1+ 0 ΟΡΘΟ ΙΦΝΕ, ΕΛΚΩΔΗΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΘΗΛΥ 42 21 2+ 2+ 0 0 3+ 1+ 2+ 2+ 0 ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΙΦΝΕ, ΕΛΚΩΔΗΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΑΡΡΕΝ 32 22 2+ 2+ 2+ 0 3+ 1+ 0 1+ 0 ΟΡΘΟ ΕΛΚΩΔΗΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΑΡΡΕΝ 23 3+ 3+ BACKROUND 0 3+ ΌΧΙ ΠΛΕΓΜΑ ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΧΡΟΝΙΑ ΕΝΕΡΓΟΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΑΡΡΕΝ 25 24 1+ 1+ 0 0 3+ 0 0 ΌΧΙ ΠΛΕΓΜΑ ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΑΚΤΙΝΙΚΗ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΘΗΛΥ 59 25 1+ 1+ 0 0 3+ 0 0 ΌΧΙ ΠΛΕΓΜΑ ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΛΟΙΜΩΔΗΣ, ΙΣΧΑΙΜΙΚΗ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΘΗΛΥ 75 26 0 3+ 0 0 3+ 0 0 ΌΧΙ ΠΛΕΓΜΑ ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΕΛΚΩΔΗΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΘΗΛΥ 27 27 0 1+ ΌΧΙ ΠΛΕΓΜΑ ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΜΗ ΕΙΔΙΚΗ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΘΗΛΥ 31 28 2+ 3+ 0 0 3+ ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΧΡΟΝΙΑ ΜΗ ΕΙΔΙΚΗ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΘΗΛΥ 60 29 1+ 1+ 1+ 0 ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΛΟΙΜΩΔΗΣ/ ΕΛΚΩΔΗΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΑΡΡΕΝ 28 30 3+ 3+ 0 1+ 3+ ΟΡΘΟ, ΧΡΟΝΙΑ ΕΝΕΡΓΟΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ, ΕΛΚΩΔΗΣ, ΑΡΡΕΝ 44 ΣΙΓΜΟΕΙΔΕΣ ΛΟΙΜΩΔΗΣ 31 3+ 3+ 2+ 0 3+ 1+ 0 ΟΡΘΟ ΙΦΝΕ, ΕΛΚΩΔΗΣ ΟΡΘΙΤΙΔΑ ΑΡΡΕΝ 75 32 3+ 3+ 2+ 0 3+ ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΛΟΙΜΩΔΗΣ, ΙΣΧΑΙΜΙΚΗ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΑΡΡΕΝ 74 33 0 1+ ΌΧΙ ΠΛΕΓΜΑ ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΧΡΟΝΙΑ ΜΗ ΕΙΔΙΚΗ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΘΗΛΥ 66 34 1+ 1+ 0 0 ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΧΡΟΝΙΑ ΜΗ ΕΙΔΙΚΗ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΑΡΡΕΝ 72 35 0 2+ ΌΧΙ ΠΛΕΓΜΑ ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΧΡΟΝΙΑ ΜΗ ΕΙΔΙΚΗ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΑΡΡΕΝ 28 36 0 1+ ΌΧΙ ΠΛΕΓΜΑ ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΛΟΙΜΩΔΗΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ, ΙΦΝΕ, ΕΝΤΕΡΙΚΗ ΑΡΡΕΝ 78 ΙΣΧΑΙΜΙΑ 37 3+ 3+ 0 2+ 3+ 0 2+ 0 0 ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΧΡΟΝΙΕΣ ΦΛΕΓΜΟΝΩΔΕΙΣ ΔΙΗΘΗΣΕΙΣ ΑΡΡΕΝ 59 38 1+ 2+ 3+ 0 ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΕΝΕΡΓΟΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΑΡΡΕΝ 59 39 1+ 1+ 2+ 0 ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΑΚΤΙΝΙΚΗ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΘΗΛΥ 36 40 0 2+ 0 0 3+ ΌΧΙ ΠΛΕΓΜΑ ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΧΡΟΝΙΑ ΚΟΛΙΤΙΔΑ, ΙΣΧΑΙΜΙΚΗ, ΙΦΝΕ ΑΡΡΕΝ 72 41 3+ 3+ 0 0 3+ 0 2+ ΌΧΙ ΠΛΕΓΜΑ ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ, ΟΡΘΟΣΙΓΜΟΕΙΔΕΣ 47 ΧΡΟΝΙΑ ΕΝΕΡΓΟΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ, ΕΛΚΩΔΗΣ, ΛΟΙΜΩΔΗΣ ΑΡΡΕΝ 69

42 3+ 3+ 3+ 0 3+ 0 2+ ΌΧΙ ΠΛΕΓΜΑ ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ, ΧΡΟΝΙΑ ΕΝΕΡΓΟΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ, ΕΛΚΩΔΗΣ, ΑΡΡΕΝ 69 ΟΡΘΟΣΙΓΜΟΕΙΔΕΣ ΛΟΙΜΩΔΗΣ 43 3+ 3+ 3+ 0 ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΜΗ ΕΙΔΙΚΗ ΛΟΙΜΩΔΗΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΘΗΛΥ 70 44 3+ 3+ BACKROUND 3+ 0 1+ 1+ 0 ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΧΡΟΝΙΑ ΕΝΕΡΓΟΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΑΡΡΕΝ 52 45 2+/3+ 3+ 0 0 3+ 1+ 1+ 2+ 0 ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΛΟΙΜΩΔΗΣ/ ΕΛΚΩΔΗΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΑΡΡΕΝ 87 46 3+ 3+ 0 0 3+ 0 0 0 0 ΟΡΘΟ ΧΡΟΝΙΑ ΜΗ ΕΙΔΙΚΗ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΑΡΡΕΝ 23 47 1+ 1+ 0 0 3+ 0 0 0 0 ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ, ΙΣΧΑΙΜΙΚΗ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΑΡΡΕΝ 75 ΣΙΓΜΟΕΙΔΕΣ 48 3+ 3+ 0 0 3+ 0 2+ ΌΧΙ ΠΛΕΓΜΑ ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΕΝΕΡΓΟΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΘΗΛΥ 23 49 2+ 2+ 0 0 3+ 0 0 0 0 ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΕΝΕΡΓΟΣ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΘΗΛΥ 23 50 3+ 3+ 0 0 3+ 2+ 2+ 1+ 0 ΠΑΧΥ ΕΝΤΕΡΟ ΧΡΟΝΙΑ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΑΡΡΕΝ 48

ΈΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΝΕΥΡΟΤΡΟΦΙΚΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΣΕ ΕΛΚΩΔΗ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΣΤΟ ΣΥΝΟΛΟ ΤΩΝ 17 ΓΥΝΑΙΚΩΝ Αρνητικό 0 1+ 2+ 3+ TrkA ΠΛΕΓΜΑ - 3 (43%) 3 (43%) 1 (14%) ΕΠΙΘΗΛΙΟ - 3 (33,3%) 3 (33,3%) 3 (33,3%) TrkB ΠΛΕΓΜΑ 6 (86%) - 1 (14%) - ΕΠΙΘΗΛΙΟ 8 (89%) - 1 (11%) - ΜΕΜΟΝΩΜΕΝΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΟΥ ΕΠΙΘΗΛΙΟΥ (ΝΕΥΡΟΕΝΔΟΚΡΙΝΗ) - - - 100% TrkC ΠΛΕΓΜΑ 3 (43%) 3 (43%) - 1 (14%) ΕΠΙΘΗΛΙΟ 8 (50%) 4 (25%) 3 (18,75%) 1 (6,25%) P75 NTR ΠΛΕΓΜΑ 1 (16,7%) 2 (33,3%) 2 (33,3%) 1 (16,7%) ΕΠΙΘΗΛΙΟ 100% - - - Πίνακας 2. Αποτελέσματα στις γυναίκες 49

ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΝΕΥΡΟΤΡΟΦΙΚΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΣΕ ΕΛΚΩΔΗ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΣΤΟ ΣΥΝΟΛΟ ΤΩΝ 28 ΑΝΔΡΩΝ ΑΡΝΗΤΙΚΟ 0 1+ 1+ /2+ 2+ 2+ / 3+ 3+ TrkA ΠΛΕΓΜΑ - 2-4 2 12 (10%) (20%) (10%) (60%) ΕΠΙΘΗΛΙΟ - 2 (9%) - 7 (32%) - 13 (59%) TrkB ΠΛΕΓΜΑ 14 - - 3-1 (78%) (16,7%) (5,6%) ΕΠΙΘΗΛΙΟ 20 1-1 - - (91%) (4,5%) (4,5%) ΜΕΜΟΝΩΜΕΝΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΟΥ ΕΠΙΘΗΛΙΟΥ (ΝΕΥΡΟΕΝΔΟΚΡΙΝΗ) - - - - - 100% TrkC ΠΛΕΓΜΑ 6 8 1 1 - - (37,5%) (50%) (6,25%) (6,25%) ΕΠΙΘΗΛΙΟ 6 7 1 9-1 (25%) (29,17%) (4,17%) (37,5%) (4,17%) P75 NTR ΠΛΕΓΜΑ 4 5-5 - 1 (26,7%) (33,3%) (33,3%) (6,7%) ΕΠΙΘΗΛΙΟ 100% - - - - - Πίνακας 3. Αποτελέσματα στους άνδρες 50

ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΝΕΥΡΟΤΡΟΦΙΚΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΣΕ ΕΛΚΩΔΗ ΚΟΛΙΤΙΔΑ ΣΤΟ ΣΥΝΟΛΟ ΤΩΝ 45 ΑΣΘΕΝΩΝ ΑΡΝΗΤΙΚΟ 0 1+ 1+/ 2+ 2+ 2+/ 3+ 3+ TrkA ΠΛΕΓΜΑ - 5-7 2 13 (18,5%) (26%) (7,4%) (48,1%) ΕΠΙΘΗΛΙΟ - 5 (16%) - 10 (32%) - 16 (52%) TrkB ΠΛΕΓΜΑ 20 - - 4-1 (80%) (16%) (4%) ΕΠΙΘΗΛΙΟ 26 1-2 - - (90%) (3%) (7%) ΜΕΜΟΝΩΜΕΝΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΟΥ ΕΠΙΘΗΛΙΟΥ (ΝΕΥΡΟΕΝΔΟΚΡΙΝΗ) - - - - - 100% TrkC ΠΛΕΓΜΑ 9 11 1 1-1 (40%) (48%) (4%) (4%) (4%) ΕΠΙΘΗΛΙΟ 14 11 1 12-2 (35%) (27,5%) (2,5%) (30%) (5%) P75 NTR ΠΛΕΓΜΑ 5 7-7 - 2 (23,8%) (43,33%) (43,33%) (9,5%) ΕΠΙΘΗΛΙΟ 100% - - - - - Πίνακας 4. Αποτελέσματα σε όλους τους ασθενείς 51

Εικόνα 14. Έκφραση του Trk-A υποδοχέα σε επιθηλιακά κύτταρα φυσιολογικού παχέος εντέρου. Μεγένθυση 40Χ. Εικόνα 15. Έκφραση του Trk-A υποδοχέα μεγέθυνση 40Χ σε επιθηλιακά κύτταρα φλεγμονώδους παχέος εντέρου. Ένταση χρώσης 3+. 52

Εικόνα 16. Ανοσοεντόπιση του Trk-A υποδοχέα σε μυεντερικό πλέγμα φυσιολογικού παχέος εντέρου. Μεγέθυνση 10Χ. Εικόνα 17. Έκφραση του Trk-A υποδοχέα σε μυεντερικό πλέγμα φυσιολογικού εντέρου. Μεγέθυνση 20Χ. 53

Εικόνα 18. Ταυτοποίηση του Trk-A υποδοχέα στο υποβλεννογόνιο πλέγμα φλεγμονώδους παχέος εντέρου. Μεγέθυνση 40Χ. Εικόνα 19. Ταυτοποίηση του Trk-B υποδοχέα ένταση χρώσης 3+ στο τοίχωμα αγγείων. Μεγέθυνση 20Χ. 54

Εικόνες 20,21. Έκφραση του Trk-B υποδοχέα σε γαγγλιακά κύτταρα φυσιολογικού εντέρου. Μεγέθυνση 40Χ. Εικόνα 22. Έκφραση του Trk-B υποδοχέα σε υποβλεννογόνια γάγγλια φυσιολογικού εντέρου. Μεγέθυνση 40Χ. 55

Εικόνα 23. Ανοσοέκφραση του Trk-B υποδοχέα σε μεμονωμένα κύτταρα σε φλεγμονώδες έντερο. Μεγέθυνση 20Χ. Ένταση χρώσης 3+. Εικόνα 24. Ταυτοποίηση του Trk-B υποδοχέα ένταση χρώσης 3+ σε μεμονωμένα κύτταρα σε φυσιολογικό έντερο. Μεγέθυνση 40Χ. 56

Εικόνα 25. Έκφραση του Trk-C υποδοχέα σε επιθηλιακά κύτταρα φυσιολογικού παχέος εντέρου. Μεγέθυνση 20Χ. Εικόνα 26. Έκφραση του Trk-C υποδοχέα στο επιθήλιο επιφανείας και στο αδενικό, φλεγμονώδους παχέος εντέρου, 20Χ. Ένταση χρώσης 3+. 57