Η ΑΝΑΓΚΗ ΓΙΑ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΣΤΗΝ ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Οι Ενόργανες Μέθοδοι Ανάλυσης είναι σχετικές μέθοδοι και σχεδόν στο σύνολο τους παρέχουν την αριθμητική τιμή μιας φυσικής ή φυσικοχημικής ιδιότητας, η οποία όμως συνδέεται άμεσα ή έμμεσα με την τιμή της ποσοτικής πληροφορίας για την οποία ενδιαφερόμαστε, η οποία είναι η συγκέντρωση ή η απόλυτη ποσότητα μάζας. Προκειμένου η μετρούμενη φυσική/ φυσικοχημική παράμετρος να μετατραπεί σε συγκέντρωση/ μάζα της υπό προσδιορισμό ουσίας (αναλύτης) θα πρέπει να εφαρμοστεί μια κατάλληλη τεχνική ποσοτικοποίησης (quantification technique).
ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ ΣΥΣΧΕΤΙΣΕΩΝ ΜΕΤΡΟΥΜΕΝΗΣ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΥ ΚΑΙ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ Η ΜΑΖΑΣ Φασματομετρία: Νόμος Lambert- Beer (συσχέτιση απορρόφησης- συγκέντρωσης): A= ε b c Πολαρογραφία: Εξίσωση Ilkovic: (συσχέτιση ρεύματος διάχυσης- συγκέντρωσης): I d = 708 n D 1/2 m 2/3 t 1/6 c Φλογοφωτομετρία εκπομπής: Συσχέτιση ισχύος εκπεμπόμενης ακτινοβολίας με συγκέντρωση: P= k c Αεριοχρωματογραφία, Υγροχρωματογραφία: Συσχέτιση εμβαδού κορυφής με συγκέντρωση: Α= k c.
ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗΣ ΣΤΗΝ ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Οι κυριότερες τεχνικές ποσοτικοποίησης (quantification techniques) είναι: Εξωτερικό πρότυπο (external standard). Καμπύλη Αναφοράς (calibration curve). Τεχνική (απλής) προσθήκης γνωστής ποσότητας (standard addition). Τεχνική πολλαπλής προσθήκης γνωστών ποσοτήτων (multiple standard addition). Εσωτερικό πρότυπο (internal standard). Συνδυασμοί των παραπάνω τεχνικών.
ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗΣ: ΟΡΙΣΜΕΝΕΣ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ 1. Ο άμεσος υπολογισμός της συγκέντρωσης/ μάζας της ουσίας από την μετρούμενη φυσική/ φυσικοχημική παράμετρο προϋποθέτει την γνώση της συνάρτησης μεταξύ μετρούμενης ιδιότητας και συγκέντρωσης/ μάζας. Αυτό ισχύει μόνο για την κουλομετρία. 2. ΔΕΝ υπάρχει καμία τεχνική ποσοτικοποίησης που να είναι κατάλληλη σε ΟΛΕΣ τις περιπτώσεις αναλυτικών προβλημάτων. Η επιλογή γίνεται ανάλογα με βάση τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά της χημικής ανάλυσης που διενεργούμε.
ΜΕΘΟΔΟΣ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ ΠΡΟΤΥΠΟΥ Αποτελεί την περίπτωση βαθμονόμησης του οργάνου με χρήση ενός μόνο πειραματικού σημείου (αντί πολλών στην μέθοδο της καμπύλης αναφοράς) και προϋποθέτει όχι απλά γραμμική αλλά αναλογική σχέση μεταξύ σήματος- συγκέντρωσης (η ευθεία να διέρχεται από την αρχή των αξόνων). Έχει ασφαλώς μικρότερη ακρίβεια από την μέθοδο της καμπύλης αναφοράς. Παρασκευάζεται πρότυπο δείγμα του αναλύτη συγκέντρωσης C s και μετράται το σήμα του P s. Αν το άγνωστο δείγμα παρουσιάζει σήμα P x, η άγνωστη συγκέντρωση του αναλύτη C x δίνεται από την σχέση: Στην περίπτωση που η μέθοδος εμφανίζει σήμα λευκού δείγματος (blank), η τιμή του αφαιρείται από τις τιμές P x και P s.
TEXNIKH ΚΑΜΠΥΛHΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ (Calibration curve) Στηρίζεται στην βαθμονόμηση του οργάνου μέτρησης με χρήση πρότυπων (standards) της υπό προσδιορισμό ουσίας (αναλύτη). Μετράται η φυσική/ φυσικοχημική ιδιότητα κάτω από τις ίδιες συνθήκες μιας σειράς προτύπων που παρουσιάζουν διαφορετική (γνωστή) συγκέντρωση (ή μάζα) ως προς τον αναλύτη. Ο αριθμός των πρότυπων πρέπει να είναι τόσο μεγαλύτερος, όσο και η απαιτούμενη αξιοπιστία των μετρήσεων. Σε περιπτώσεις γραμμικής συσχέτισης σήματος- συγκέντρωσης, ο αριθμός των προτύπων μπορεί να κυμαίνεται από 3 έως 6. Τα πειραματικά σημεία μεταφέρονται σε διάγραμμα με τετμημένη την συγκέντρωση (ή μάζα) της ουσίας και τεταγμένη την μετρούμενη φυσική/ φυσικοχημική ιδιότητα. Στις περισσότερες ενόργανες μεθόδους ανάλυσης η συσχέτιση (καμπύλη βαθμονόμησης ή αναφοράς) είναι μια ευθεία γραμμή (γραμμικό μοντέλο) y= a x + b και για τον υπολογισμό της χρησιμοποιείται η μέθοδος των ελαχίστων τετραγώνων.
ΠΡΩΤΑ ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΩΝ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ ΣΕ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ: ΓΙΑΤΙ; Κακός συντελεστής συσχέτισης Έκτροπη τιμή Απομάκρυνση έκτροπης τιμής
ΤΕΧΝΙΚΗ ΚΑΜΠΥΛΗΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ: ΓΕΝΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ Η ιδανική καμπύλη αναφοράς παρουσιάζει τα εξής χαρακτηριστικά: 1) Είναι γραμμική (linear), 2) Διέρχεται από την αρχή των αξόνων, 3) Μπορεί να εφαρμοστεί σε ευρύτατη περιοχή συγκεντρώσεων. Στην πράξη παρουσιάζονται αποκλίσεις από την ιδανική καμπύλη βαθμονόμησης. Παραδείγματα: α) Αποκλίσεις από τον νόμο Lambert-Beer στην φασματομετρία λόγω πυκνών διαλυμάτων, παράσιτης ακτινοβολίας κ.λ.π., β) Φαινόμενα κορεσμού της επιφάνειας εργασίας στην αναδιαλυτική βολταμμετρία.
ΤΕΧΝΙΚΗ ΚΑΜΠΥΛΗΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ: ΣΤΑΔΙΟ 1: ΛΗΨΗ ΚΑΜΠΥΛΗΣ Συγκέντρωση Mg 2+ (mg/l) P (ισχύς ακτινοβολίας) 2 10.1 4 20.1 6 29.9 8 39.4 10 50.3
ΤΕΧΝΙΚΗ ΚΑΜΠΥΛΗΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ: ΣΤΑΔΙΟ 2: ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ Παράδειγμα: Φλογοφωτομετρικός προσδιορισμός Μg 2+ σε άγνωστο δείγμα Άγνωστο δείγμα: Ισχύς ακτινοβολίας Ρ= 23.2 μονάδες. Άγνωστη συγκέντρωση: Χ= (23.2-0.05) / 4.985 = 4.64 mg/l
ΤΕΧΝΙΚΗ ΚΑΜΠΥΛΗΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ: ΣΗΜΕΙΑ ΠΡΟΣΟΧΗΣ Σε περίπτωση αποκλίσεων από την γραμμικότητα θα πρέπει να λαμβάνονται περισσότερες πειραματικές μετρήσεις για την κατασκευή της καμπύλης αναφοράς. Η καμπύλη αναφοράς θα πρέπει να χρησιμοποιείται για τιμές συγκέντρωσης που βρίσκεται μεταξύ των τιμών που αντιστοιχούν στα πρότυπα με την μικρότερη και την μεγαλύτερη συγκέντρωση στο υπό προσδιορισμό συστατικό. Τα πρότυπα δείγματα θα πρέπει να έχουν παραπλήσια σύσταση με αυτή των δειγμάτων που θα αναλυθούν επειδή η διαφορά στην σύσταση τους μπορεί να οδηγήσει σε σημαντικά αναλυτικά σφάλματα (επίδραση μήτρας ή μητρικού υλικού, matrix effect).
ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΧΡΗΣΗΣ ΚΑΜΠΥΛΗΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Το μετρούμενο σήμα μπορεί να επηρεαστεί σημαντικά από την παρουσία άλλων ουσιών που βρίσκονται στο υπό ανάλυση δείγμα (matrix effect). Συγκεκριμένα επηρεάζεται τόσο η κλίση (ευαισθησία) της καμπύλης αναφοράς, όσο και ο σταθερός όρος. Αν οι πρόσθετες αυτές ουσίες δεν υπάρχουν στα πρότυπα δείγματα και η επίδραση τους στο σήμα είναι σημαντική, τότε η καμπύλη αναφοράς «αχρηστεύεται» και θα πρέπει να αναζητηθεί άλλη τεχνική ποσοτικοποίησης. Συνήθως επιλέγεται η μέθοδος προσθήκης. Αστάθεια του οργάνου που οδηγεί σε μεταβολές των όρων a και b της καμπύλης αναφοράς Συχνός επανέλεγχος της καμπύλης αναφοράς με γνωστά πρότυπα ή μέθοδος εσωτερικού προτύπου.
Περίπτωση που η μήτρα του δείγματος επηρεάζει την συσχέτιση σήματος/ συγκέντρωσης. Η συσχέτιση αυτή είναι διαφορετική μεταξύ δείγματος και πρότυπων διαλυμάτων που χρησιμοποιούνται στην βαθμονόμηση. Η μέθοδος εξωτερικής βαθμονόμησης (εξωτερικό πρότυπο/ καμπύλη αναφοράς) οδηγεί σε σφάλμα.
ΜΕΘΟΔΟΣ (ΑΠΛΗΣ) ΠΡΟΣΘΗΚΗΣ ΓΝΩΣΤΗΣ ΠΟΣΟΤΗΤΑΣ Κατά την μέθοδο αυτή πραγματοποιείται μέτρηση του σήματος Ρ 0 του άγνωστου δείγματος άγνωστης συγκέντρωσης C x. Στο άγνωστο δείγμα προστίθεται γνωστή ποσότητα πολύ μικρού όγκου*- προτύπου της υπό προσδιορισμό ουσίας. Η προσθήκη αντιστοιχεί σε αύξηση της συγκέντρωση κατά ΔC της ουσίας. Η προσθήκη πολύ μικρού όγκου σημαίνει ότι: 1) Δεν μεταβάλλεται ο όγκος του δείγματος, 2) Δεν διαταράσσεται η «μήτρα» του δείγματος. Μετράται ξανά το σήμα του δείγματος και βρίσκεται P. Ισχύει: Με διαίρεση κατά μέλη τελικά προκύπτει: Παρατηρήσεις: α) με τον νόμο της αραίωσης
ΜΕΘΟΔΟΣ ΠΡΟΣΘΗΚΗΣ (II) Στην περίπτωση προσθήκης υπολογίσιμου όγκου πρότυπου διαλύματος σε σχέση με το αρχικό δείγμα, θα πρέπει να ληφθεί υπόψη η μεταβολή του όγκου. Αρχικό Δείγμα: V x : Όγκος δείγματος, C x : Άγνωστη συγκέντρωση ουσίας Χ, Ρ x : Σήμα. Προστίθεται όγκος V s πρότυπου διαλύματος της ουσίας Χ συγκέντρωσης C s. Το νέο σήμα (μετά την προσθήκη) είναι P s. Με διαίρεση κατά μέλη προκύπτει: Σε περιπτώσεις προσθήκης σχετικά μεγάλου όγκου πρότυπου διαλύματος προτιμάμε όλα τα δείγματα (αρχικό + προσθήκες) να υφίστανται την ίδια τελική αραίωση (ίδια αραίωση της μήτρας του δείγματος). Υπολογισμοί με βάση τον νόμο της αραίωσης.
ΜΕΘΟΔΟΣ (ΑΠΛΗΣ) ΠΡΟΣΘΗΚΗΣ Παράδειγμα: Βολταμμετρικός Προσδιορισμός Cu 2+. Αρχικός όγκος άγνωστου διαλύματος: 10 ml Προσθήκη: 10 μl πρότυπου διαλύματος Cu 2+ 1000 mg/l Επειδή ο όγκος του αρχικού διαλύματος είναι 1000 φορές μεγαλύτερος του όγκου του πρότυπου διαλύματος της προσθήκης θεωρούμε πως δεν υπάρχει μεταβολή όγκου του αρχικού διαλύματος. V τελ = 10 ml + 10 μl 10 ml Η προστιθέμενη ποσότητα Cu 2+ αντιστοιχεί σε προσθήκη συγκέντρωσης στο διάλυμα: Ισχύει: Οπότε
ΤΕΧΝΙΚΗ (ΑΠΛΗΣ) ΠΡΟΣΘΗΚΗΣ: ΧΡΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ Εφαρμόζεται στις περιπτώσεις που το μητρικό υλικό (matrix) του δείγματος επηρεάζει σημαντικά την καμπύλη αναφοράς και δεν είναι δυνατή η παρασκευή προτύπων ίδιας σύστασης με τα άγνωστα. Παράδειγμα: Ανάλυση κλινικών δειγμάτων, ιδιαίτερα όταν υπάρχει σύνδεση της υπό προσδιορισμό ουσίας με πρωτεΐνες. Απαιτείται γραμμική συσχέτιση σήματος/ συγκέντρωσης και διέλευση της σχετικής ευθείας από την αρχή των αξόνων. Η μεγαλύτερη αξιοπιστία επιτυγχάνεται όταν το ΔC αντιστοιχεί από 50% έως 150% της συγκέντρωσης της ουσίας στο άγνωστο δείγμα. Η ακρίβεια που επιτυγχάνεται θεωρείται περιορισμένη κυρίως λόγω του μικρού αριθμού μετρήσεων (δυο συνολικά).
ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΑΒΕΒΑΙΟΤΗΤΑΣ ΣΤΙΣ ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΤΩΝ P KAI P 0 Η περιοχή διακύμανσης των τιμών C x ορίζεται από τα ζεύγη μεγαλύτερης τιμής Ρ 0 / μικρότερης τιμής Ρ (υψηλότερη τιμή C x ) και μικρότερης τιμής Ρ 0 / μεγαλύτερης τιμής Ρ (χαμηλότερη τιμή C x ).
ΑΣΚΗΣΗ Σε δείγμα υπογείου ύδατος μετράται η συγκέντρωση Νa με φασματομετρία ατομικής απορρόφησης (AAS). Η τιμή της απορρόφησης που μετράται κυμαίνεται σε 3.8-4.2 μονάδες αυθαίρετης κλίμακας. Σε 20 ml του ίδιου δείγματος νερού προστίθενται 60 μl πρότυπου διαλύματος Na + συγκέντρωσης 1000 mg/l Na +. Η απορρόφηση του διαλύματος που προκύπτει ανέρχεται σε 5.8-6.2 μονάδες. Μεταξύ ποιών τιμών (mg/ l) βρίσκεται η συγκέντρωση Na + στο δείγμα υπογείου νερού; Να θεωρήσετε πως υπάρχει γραμμική συσχέτιση μεταξύ απορρόφησης ακτινοβολίας και συγκέντρωσης Na.
ΤΕΧΝΙΚΗ ΠΟΛΛΑΠΛΗΣ ΠΡΟΣΘΗΚΗΣ Πρόκειται για βελτιωμένη μορφή της μεθόδου της (απλής) προσθήκης γνωστής ποσότητας. Αντί μιας, πραγματοποιούνται (συνήθως 2 ή 3) διαδοχικές προσθήκες προτύπων της υπό προσδιορισμό ουσίας. Κάθε προσθήκη αντιστοιχεί σε πολύ μικρή ποσότητα όγκου του προτύπου, με αποτέλεσμα η συνολική μεταβολή του όγκου του δείγματος να θεωρείται αμελητέα. Οι πολλαπλές προσθήκες σε σχέση με την απλή (μονή) προσθήκη προσφέρουν: 1) Καλύτερη ακρίβεια, 2) Έλεγχο της γραμμικότητας της σχέσης σήμα/ συγκέντρωση.
ΤΕΧΝΙΚΗ ΠΟΛΛΑΠΛΗΣ ΠΡΟΣΘΗΚΗΣ Παράδειγμα: Φλογοφωτομετρικός προσδιορισμός Ca 2+ με 3 προσθήκες. Δείγμα Προσθήκη Ca 2+ (mg/ l) Συνολική προσθήκη Ca 2+ (mg/ l) Αρχικό δείγμα - 25 1 η προσθήκη 10 10 40 2 η προσθήκη 10 20 55 3 η προσθήκη 10 30 70 Ένταση ακτινοβολίας (αυθαίρετες μονάδες) Από την εξίσωση που προέκυψε από την εφαρμογή της μεθόδου ελαχίστων τετραγώνων στα πειραματικά δεδομένα προκύπτει ότι:
ΜΕΘΟΔΟΣ ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΥ ΠΡΟΤΥΠΟΥ (INTERNAL STANDARD) Η φιλοσοφία της μεθόδου είναι πως οι σχετικές αυξομειώσεις της ευαισθησίας της μεθόδου στο συστατικό Α είναι ίδιες για το συστατικό Β, που ονομάζεται εσωτερικό πρότυπο. Στα πρότυπα και στα άγνωστα δείγματα προστίθεται μια ουσία (εσωτερικό πρότυπο) που ΔΕΝ υπάρχει στο δείγμα. Συνδυασμός με μέθοδο εξωτερικού προτύπου: Παρασκευάζεται πρότυπο δείγμα με συγκέντρωση ουσίας C x και συγκέντρωση εσωτερικού προτύπου C is. Τα σήματα θα δίνονται από τίς σχέσεις: Στο άγνωστο δείγμα προστίθεται γνωστή συγκέντρωση του εσωτερικού προτύπου και μετρούνται τα νέα σήματα C x και C is.
ΜΕΘΟΔΟΣ ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΥ ΠΡΟΤΥΠΟΥ (INTERNAL STANDARD) Η μέθοδος εσωτερικού προτύπου συνδυάζεται επίσης με την μέθοδο της καμπύλης αναφοράς. Στην περίπτωση αυτή προστίθεται αυστηρά η ΙΔΙΑ ποσότητα εσωτερικού προτύπου στα πρότυπα δείγματα και στα άγνωστα. Ο λόγος (P x /P is ) χρησιμοποιείται ως «διορθωμένο» σήμα για την κατασκευή της καμπύλης αναφοράς ή τον υπολογισμό της συγκέντρωσης του άγνωστου δείγματος. Η καμπύλη αναφοράς περιέχει ως τεταγμένη τον λόγο (σήμα αναλύτη/ σήμα εξωτερικού προτύπου) και ως τετμημένη την συγκέντρωση του συστατικού.
ΜΕΘΟΔΟΣ ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΥ ΠΡΟΤΥΠΟΥ (INTERNAL STANDARD) Η μέθοδος εφαρμόζεται στις περιπτώσεις που: 1) αναμένονται μεταβολές στην ευαισθησία του οργάνου μέτρησης από μέτρηση σε μέτρηση, 2) παρατηρείται μη επαναλαμβανόμενη επίδραση του μητρικού υλικού του δείγματος στην μέτρηση και στις λοιπές κατεργασίες του δείγματος πριν την μέτρηση. Κύρια πεδία εφαρμογής της μεθόδού είναι οι χρωματογραφικές τεχνικές (GC, LC) και οι ηλεκτροαναλυτικές τεχνικές (πολαρογραφία, αναδιαλυτική βολταμμετρία), οι οποίες επιτρέπουν τον ταυτόχρονο προσδιορισμό περισσοτέρων του ενός συστατικών. Χρησιμοποιείται επίσης στην φλογοφωτομετρία με δυνατότητα ταυτόχρονης μέτρησης σε 2 μήκη κύματος. Η καμπύλη αναφοράς περιέχει ως τεταγμένη τον λόγο (σήμα αναλύτη/ σήμα εξωτερικού προτύπου).
ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΟΥΣΙΑΣ ΓΙΑ ΧΡΗΣΗ ΩΣ ΕΣΩΤΕΡΙΚΟ ΠΡΟΤΥΠΟ Το ιδανικό εσωτερικό πρότυπο πρέπει να εμφανίζει παρόμοιες φυσικοχημικές ιδιότητες με τον αναλύτη, να εμφανίζει παραπλήσια συμπεριφορά στην αναλυτική μέθοδο και να μπορεί να προσδιορίζεται εκλεκτικά. Στην περίπτωση ύπαρξης σταδίου προκατεργασίας (παράδειγμα: εκχύλιση), το εσωτερικό πρότυπο να παρουσιάζει παρόμοια συμπεριφορά με τον αναλύτη. Η (ίδια) συγκέντρωση του εσωτερικού προτύπου που θα προστεθεί στα πρότυπα και στα άγνωστα δείγματα να οδηγεί σε παρόμοιο σήμα με τα αναμενόμενα άγνωστα δείγματα.
ΑΣΚΗΣΗ Δείγμα ιαματικού νερού αναλύεται με φασματομετρία εκπομπής πλάσματος (ICP-OES) ως προς τα επίπεδα χαλκού, καδμίου, χρωμίου και ψευδαργύρου χρησιμοποιώντας ως εσωτερικό πρότυπο (i.s.) το ύττριο (Y). Τα αποτελέσματα της ανάλυσης φαίνονται παρακάτω: Να υπολογιστούν οι συγκεντρώσεις των Cu, Cd και Cr στο δείγμα νερού Παρασιτοκτόνο Πρότυπα δείγματα Δείγμα προς ανάλυση Μήκος Συγκέντρω Κρούσεις Συγκέντρ Κρούσεις κύματος ση (μg/l) (counts) ωση (counts) (nm) (μg/l) Y (i.s.) 371.0 25 76000 20 64000 Cu 224.7 20 85000 Άγνωστη 98000 Cd 214.4 16 86000 Άγνωστη 78000 Cr 267.7 30 81000 Άγνωστη 123000