Διερεύνηση της έκφρασης των ζελατινασών σε ασθενείς με αθροιστικά λυσοσωμικά νοσήματα

262 Παιδιατρική ΒΟΡΕΙΟΥ Ε ΛΛΑ ΔΟΣ, 24: 262-271, Παιδιατρική 2012 ΒΟΡΕΙΟΥ ΕΛΛΑΔΟΣ, 24, 4 ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ Διερεύνηση της έκφρασης των ζελατινασών σε ασθενείς με αθροιστικά λυσοσωμικά νοσήματα Σ. Μπάτζιος, 1,2 Δ. Ζαφειρίου, 1 Ε. Βαργιάμη, 1 Γ. Καρακιουλάκης, 2 Ε. Παπακωνσταντίνου. 2 1 : Α Παιδιατρική Κλινική Α.Π.Θ., Ιπποκράτειο Γενικό Νοσοκομείο, Θεσσαλονίκη 2 : Β Εργαστήριο Φαρμακολογίας Α.Π.Θ., Ιατρική Σχολή, Θεσσαλονίκη Differential expression of gelatinases in patients with lysosomal storage disorders Batzios S, 1,2 Zafeiriou D, 1 Vargiami E, 1 Karakiulakis G, 2 Papakonstantinou E. 2 1 : 1 st Paediatric Department, Aristotle University of Thessaloniki, Hippokration General Hospital, Thessaloniki, Greece 2 : 2 nd Department of Pharmacology, Medical School, Aristotle University of Thessaloniki, Thessaloniki, Greece Paediatr Ν Gr 2012, 24: 262-271 Περίληψη: Εισαγωγή: Τα αθροιστικά λυσοσωμικά νοσήματα (LSDs) αποτελούν μία ετερογενή ομάδα γενετικών παθήσεων που μπορούν να παρουσιαστούν με πλήθος κλινικών εκδηλώσεων και ποικίλου βαθμού προσβολή διαφόρων οργάνων. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της ενζυμικής ενεργότητας και έκφρασης των ζελατινασών (MMP-2, MMP-9) αλλά και της έκφρασης των ιστικών αναστολέων τους (TIMP-1, TIMP-2), σε μία ομάδα ασθενών με LSDs. Ασθενείς και Μέθοδοι: Ελέγχθηκαν οροί αίματος 15 παιδιατρικών ασθενών (μέση ηλικία±sd: 10.3±6.4 έτη). Η μελέτη της ενεργότητας των ζελατινασών πραγματοποιήθηκε με ζυμογραφία ζελατίνης ενώ η συγκέντρωση των υπό εξέταση μορίων στον ορό των ασθενών διερευνήθηκε με τη μέθοδο ELISA. Αποτελέσματα: Συνολικά στoυς ασθενείς με βλεννοπολυσακχαριδώσεις, φάνηκε πως υπάρχει στατιστικά σημαντική ελάττωση της ενεργότητας και της έκφρασης της MMP-9 με παράλληλη αύξηση αυτών της MMP-2, σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες. Οι διαφορές αυτές παρουσιάζονται εντονότερα σε παιδιά με σύνδρομο Sanfilippo. Διαφορική έκφραση των ζελατινασών παρατηρήθηκε και στους ασθενείς με νόσο Krabbe και Niemann- Pick τύπου Β, καθώς και σε ασθενείς με νόσο του Pompe με μεταβολή των μετρούμενων παραμέτρων μετά την έναρξη ενζυμικής θεραπείας υποκατάστασης. Συμπεράσματα: Οι παρατηρούμενες μεταβολές στην έκφραση των ζελατινασών ενδέχεται να οδηγήσουν στην ανακάλυψη νέων βιοδεικτών για τη διάγνωση και την παρακολούθηση της εξέλιξης των LSDs Λέξεις-Κλειδιά: αθροιστικά λυσοσωμικά νοσήματα, ιστικές μεταλλοπρωτεάσες, ζελατινάσες, ιστικοί αναστολείς των μεταλλοπρωτεασών, βιοδείκτες Abstract: Introduction: Lysosomal storage disorders (LSDs) represent a heterogeneous group of hereditary diseases presenting with numerous clinical features. The aim of this study was to elucidate the expression and activity of gelatinases (MMP-2, MMP-9) and the expression of their tissue inhibitors (TIMP-1, TIMP-2) in the serum of pediatric patients with LSDs. Patients and Methods: Fifteen patients formed the study group (mean age±sd: 10.3±6.4 years). Serum gelatinase activity was assessed by gelatin zymography and the concentration of circulating MMP-2, MMP-9 and of their tissue inhibitors, TIMP-1 and TIMP-2, was measured by ELISA. Results: Serum activity and protein levels of MMP-9 were significantly reduced whereas those of MMP-2 were significantly increased in patients with Mucopolysaccharidoses, as compared to controls. The differences were even more pronounced in Sanfilippo patients. Differential expression of gelatinases was found in patients with Krabbe disease, Niemann-Pick Β disease, as well as in patients with Pompe disease where an alteration in the expression of studied molecules was noticed after the initiation of enzyme replacement therapy. Conclusions: The reported alterations in the expression of gelatinases suggest that these molecules may be used as potential biomarkers for the diagnosis, follow-up and estimation of the response to therapy in this group of disorders Key-words: lysosomal storage disorders, matrix metalloproteinases, gelatinases, tissue inhibitors of metalloproteinases, biomarkers

Παιδιατρική ΒΟΡΕΙΟΥ ΕΛΛΑΔΟΣ, 24 4 263 Συντομογραφίες LSDs= Αθροιστικά λυσοσωμικά νοσήματα (Lysosomal storage disorders), ERT= Θεραπεία ενζυμικής υποκατάστασης (Enzyme replacement therapy), ECM= Εξωκυττάριος χώρος (Extracellular matrix), MMPs= Μεταλλοπρωτεϊνάσες του συνδετικού ιστού (Matrix metalloproteinases), TIMPs= ιστικοί αναστολείς των μεταλλοπρωτεϊνασών (Tissue inhibitors of metalloproteinases), MPSs= Βλεννοπολυσακχαριδώσεις (Mucopolysaccharidoses). Εισαγωγή Το λυσόσωμα αποτελεί ένα σημαντικό κυτταρικό οργανίδιο, το οποίο εμπλέκεται σε πλήθος διεργασιών και λειτουργιών μέσω δυναμικών αλληλεπιδράσεων με άλλα κυτταρικά διαμερίσματα. Για αυτόν ακριβώς το λόγο η ανεπάρκεια ενζύμων που είναι απαραίτητα για τη λειτουργία των λυσοσωμάτων προκαλεί την εκδήλωση 70 περίπου γενετικών μεταβολικών παθήσεων, που είναι γνωστές ως Αθροιστικά Λυσοσωμικά Νοσήματα (Lysosomal Storage Disorders, LSDs) 1. Αν και αποτελούν σπάνιες καταστάσεις, η συνολική επίπτωσή τους ανέρχεται σε 1 περιστατικό σε κάθε 7.500 γεννήσεις ζώντων νεογνών 2, και μπορούν να παρουσιαστούν με πλήθος κλινικών εκδηλώσεων και ποικίλου βαθμού προσβολή διαφόρων οργάνων και συστημάτων. Η πολυσυστηματική φύση των LSDs καθιστά την αξιολόγηση των ασθενών με τη χρήση των κοινών κλινικών, εργαστηριακών και απεικονιστικών μεθόδων, δύσκολη στην καθημερινή πράξη. Ως εκ τούτου πραγματοποιείται σημαντική προσπάθεια για την ανεύρεση μορίων που να αντικατοπτρίζουν τις ενδοκυττάριες διεργασίες που συντελούνται στα πλαίσια της κάθε νόσου, ειδικών δηλαδή βιοδεικτών. Η ανακάλυψη της ενζυμικής θεραπείας υποκατάστασης (Enzyme Replacement Therapy, ERT) για τη νόσο Gaucher υπογράμμισε ακόμη περισσότερο την ανάγκη ανεύρεσης ειδικών βιοδεικτών, οι οποίοι είναι εξαιρετικά σημαντικοί τόσο για την αξιολόγηση των ασθενών όσο και για την εκτίμηση της αποτελεσματικότητας της εφαρμοζόμενης θεραπείας 3. Ο εξωκυττάριος χώρος (Extracellular Matrix, ECM) είναι ένα πολύπλοκο δίκτυο του οποίου τα μόρια αποτελούν στόχους στην ανακάλυψη βιοδεικτών σε πλήθος παθήσεων. Ανάμεσα σε αυτά τα μόρια ανήκουν οι μεταλλοπρωτεϊνάσες του συνδετικού ιστού (Matrix Metalloproteinases, MMPs) οι οποίες με βάση την δομή τους ταξινομούνται στις κολλαγενάσες, ζελατινάσες, στρομελυσίνες, ματριλυσίνες, μεμβρανικού τύπου και σε αταξινόμητες 4. Αποτελούν ένζυμα-κλειδιά στην αποδόμηση του ECM 5 και έχει αποδειχθεί πως συμμετέχουν σε πλήθος κυτταρικών διεργασιών, τόσο φυσιολογικών όσο και παθολογικών, που συνήθως συνδέονται με τη φλεγμονή και τον κυτταρικό θάνατο 6. Η σύνθεση των MMPs ρυθμίζεται κυρίως στο επίπεδο της μεταγραφής, ενώ η δραστηριότητά τους ελέγχεται τόσο μέσω πρωτεολυτικής ενεργοποίησης των προενζύμων ή ζυμογόνων, όσο και μέσω της αναστολής των ενεργών ενζύμων από τους ιστικούς αναστολείς των μεταλλοπρωτεασών (Tissue Inhibitors of Metalloproteinases, ΤΙΜΡs) 7. Η παρούσα μελέτη αποτέλεσε μία προοπτική έρευνα ασθενών-μαρτύρων με σκοπό τη διερεύνηση της ενζυμικής ενεργότητας και έκφρασης των ζελατινασών (MMP-2 και MMP-9) αλλά και της έκφρασης των ιστικών αναστολέων τους (TIMP- 1 και TIMP-2), σε μία ομάδα ασθενών με LSDs. Τα αποτελέσματα της έρευνας βοηθούν στην κατανόηση ορισμένων από τους αιτιοπαθογενετικούς μηχανισμούς που ενέχονται στην εκδήλωση των LSDs και ενδεχόμενα να οδηγήσουν στην ανακάλυψη νέων βιοδεικτών για τη διάγνωση και την παρακολούθηση της εξέλιξης των νοσημάτων αυτών. Ασθενείς -Μέθοδοι Συμμετείχαν 15 ασθενείς με LSDs διαφόρων τύπων, ηλικίας 1 έως 26 ετών (μέση ηλικία±sd: 10.3±6.4 έτη), οι οποίοι παρακολουθούνται στο Κέντρο Αναπτυξιακής Ιατρικής «Απόστολος Φωκάς» της Α Παιδιατρικής Κλινικής του Ιπποκρατείου ΓΝΘ. Τα χαρακτηριστικά των ασθενών παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Κριτήριο εισόδου στη μελέτη θεωρήθηκε η διάγνωση της νόσου, η οποία πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενζυμικών και γενετικών μεθόδων. Η διερεύνηση πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Ενζυμολογίας και Κυτταρικής λειτουργίας του Ινστιτούτου Υγείας Παιδιού στην Αθήνα και σε κέντρα αναφοράς του εξωτερικού. Ως κριτήρια αποκλεισμού θεωρήθηκαν η ταυτόχρονη παρουσία οξείας ή χρόνιας πάθησης, στην αιτιοπαθογένεια της οποίας συμμετέχει ο μηχανισμός της φλεγμονής και δεν δικαιολογείται από την παρουσία των LSDs, καθώς και η λήψη φαρμακευτικής αγωγής που καταστέλ-

264 Παιδιατρική ΒΟΡΕΙΟΥ ΕΛΛΑΔΟΣ, 24, 4 Πίνακας 1. Περιγραφικά στοιχεία των ασθενών με LSDs που συμμετείχαν στη μελέτη Φύλο Ηλικία Τύπος νόσου Ασθενής 1 Άρρεν 26 MPS VI Ασθενής 2 Άρρεν 7 MPS III Ασθενής 3 Θήλυ 7 MPS III Ασθενής 4 Άρρεν 16.5 MPS III Ασθενής 5 Θήλυ 21 MPS III Ασθενής 6 Άρρεν 14 MPS III Ασθενής 7 Άρρεν 5 MPS III Ασθενής 8 Άρρεν 4 MPS III Ασθενής 9 Άρρεν 8 MPS II Ασθενής 10 Άρρεν 11 Pompe Ασθενής 11 Άρρεν 9 Pompe Ασθενής 12 Άρρεν 1 Krabbe Ασθενής 13 Άρρεν 8 Krabbe Ασθενής 14 Άρρεν 10 Niemann-Pick Β Ασθενής 15 Άρρεν 7 Niemann-Pick Β λει τον μηχανισμό της φλεγμονής πέραν της ERT. Η ομάδα των μαρτύρων αποτελούνταν από υγιή άτομα ίδιου φύλου και ίδιας ηλικίας. Σε όλους τους συμμετέχοντες ασθενείς και μάρτυρες πραγματοποιήθηκε λήψη αίματος έπειτα από την ενυπόγραφη συγκατάθεση των γονέων ή κηδεμόνων. Επιπρόσθετα, στους ασθενείς με νόσο Pompe και σύνδρομο Maroteaux-Lamy ελήφθησαν διαδοχικά δείγματα μετά την έναρξη της ERT. Μετά το πέρας της αιμοληψίας, διαχωρίσθηκε δείγμα ορού το οποίο καταψύχθηκε στους -80 C, μέχρι τη χρήση του. Το σύνολο των ερευνητικών διαδικασιών της παρούσας μελέτης, διενεργήθηκε στο Β Εργαστήριο Φαρμακολογίας της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. Ζυμογραφία ζελατίνης Η ζελατινολυτική δραστηριότητα των MMPs μελετήθηκε με ζυμογραφία ζελατίνης, με τη χρήση SDS-PAGE ηλεκτροφόρησης σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου κάτω από συνθήκες που έχουν περιγραφεί στο παρελθόν 8. Παρασκευάστηκαν πηκτές πολυακρυλαμιδίου, συγκέντρωσης 8% (w/v) σε ακρυλαμίδιο, στο μίγμα των οποίων προστέθηκε 1 mg/ml ζελατίνη κολλαγόνου τύπου Ι, η οποία αποτελεί υπόστρωμα των MMP-2 και MMP-9. Η ενδεδειγμένη ποσότητα κάθε δείγματος (6μl) αναμείχθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα και τοποθετήθηκε με προσοχή στις κατάλληλες υποδοχές της πηκτής στοίβαξης. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιώντας κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα υπό σταθερή τάση 150V για 2h. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης, η πηκτή ξεπλύθηκε και ακολούθησε επώαση για 20 min στους 37 ο C στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα. Μετά το πέρας της διαδικασίας αυτής, η πηκτή χρωματίστηκε με ειδικό διάλυμα. Στη συνέχεια η πηκτή αποχρωματίσθηκε. Στις θέσεις όπου είχαν ηλεκτροφορηθεί οι MMP-2 και MMP-9, λόγω τοπικής αποδόμησης του υποστρώματος της ζελατίνης, εμφανίστηκαν διαφανείς ζώνες λύσεως. Η ένταση της λύσης των διαφανών ζωνών που δημιουργήθηκαν υπολογίσθηκε με πυκνομετρία σάρωσης, χρησιμοποιώντας ανάλογο λογισμικό πρόγραμμα. Με τη χρήση του ίδιου προγράμματος πραγματοποιήθηκε και η σύγκριση των ζωνών λύσης μεταξύ φυσιολογικών και παθολογικών δειγμάτων. Ο υπολογισμός της δραστηριότητας των ζελατινασών έγινε αρχικά με αυθαίρετες μονάδες και ακολούθως εκφράσθηκε ως εκατοστιαία αναλογία επί των επιπέδων του μάρτυρα ή ως εκατοστιαία αναλογία επί των ανιχθευθέντων πριν την έναρξη της θεραπείας. Όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν. Ποσοτικός προσδιορισμός των MMPs και TIMPs με ανοσοενζυμική μέθοδο ELISA Ο ποσοτικός προσδιορισμός των MMP-2, MMP-9, TIMP-1 και TIMP-2 (σε ng/ml) πραγματοποιήθηκε εις διπλούν με την ανοσοενζυμική μέθοδο ELISA σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η μέθοδος σε αντίθεση με την εκτίμηση της ενεργότητάς τους ως ζελατινάσες, αξιολογεί την συνολική ποσότητα των MMP-2 και MMP-9 (προένζυμα και ενεργές μορφές). Η αρχική διερεύνηση με τη χρήση των δειγμάτων των ασθενών καθόρισε την κατάλληλη αραίωση για κάθε ένα από τα υπό εξέταση μόρια, η οποία ορίστηκε ως εξής: MMP-2: 1:10, MMP-9: 1:40, TIMP-1: 1:100, TIMP-2: 1:50. Στατιστική επεξεργασία Η περιγραφή των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με περιγραφικές στατιστικές μεθόδους. Για τη σύγκριση μεταξύ των ανεξάρτητων δειγμάτων χρησιμοποιήθηκαν παραμετρικές και μη παραμετρικές δοκιμασίες, ανάλογα με την κατανομή των ποσοτικών μεταβλητών (Student s t-test, Mann-Whitney U test). Για τη συσχέτιση μεταξύ των ποσοτικών μεταβλητών χρησιμοποιήθηκαν

Παιδιατρική ΒΟΡΕΙΟΥ ΕΛΛΑΔΟΣ, 24 4 265 Πίνακας 2. Περιγραφικά στατιστικά της έκφρασης και της ενεργότητας των ζελατινασών και των ιστικών αναστολέων τους σε ασθενείς με σύνδρομο Sanfilippo Παράμετρος Ασθενείς (n=7) Μάρτυρες (n=21) Σημαντικότητα Ζυμογραφία ζελατίνης# prommp-9 2.504±743 7.516±2.123 p= 0.018 MMP-9 2.322±491 6.717±1.523 p= 0.037 prommp-2 16.032±1,232 16.651±589 p= 0.876 MMP-2 3.005±789 1.484±348 p= 0.048 Ανοσοενζυμική μέθοδος ELISA* MMP-2 310±55 182±17 0.024 MMP-9 189±54 350±55 0.046 TIMP-1 174±13 145±7 0.095 TIMP-2 58±15.5 58±8 0.089 #: οι τιμές αναπαριστούν μέσο όρο ± SD (αυθαίρετες μονάδες), *: οι τιμές αναπαριστούν μέσο όρο ± SD (ng/ml ορού), στατιστική σημαντικότητα: p 0.05 οι δείκτες Spearman s rho και Pearson s product. Η στατιστική επεξεργασία των δεδομένων έγινε με τη χρήση του βιοστατιστικού προγράμματος SPSS (17.0). Αποτελέσματα Διαφορική έκφραση της ζελατινολυτικής δραστηριότητας σε ασθενείς με LSDs Η μελέτη της ενεργότητας των ζελατινασών με τη χρήση της ζυμογραφίας ζελατίνης αποκάλυψε 4 ζώνες λύσης, οι οποίες αντιστοιχούν στην prommp-9 (92 kda), MMP-9 (78 kda), prommp-2 (72 kda) και MMP-2 (64 kda). Η ποσοτικοποίηση των ζωνών λύσης στους 7 ασθενείς με σύνδρομο Sanfilippo έδειξε ότι στο συγκεκριμένο τύπο βλεννοπολυσακχαρίδωσης υπάρχει στατιστικά σημαντική ελάττωση μεταξύ των ασθενών και των υγιών μαρτύρων, όσον αφορά στη δραστηριότητα της prommp-9 και MMP-9 (p= 0.018 και 0.037 αντίστοιχα) (Πίνακας 2). Παράλληλα στην ίδια ομάδα ασθενών, παρατηρήθηκε σταθερή αύξηση της ενζυμικής δραστηριότητας της MMP-2 σε σχέση με τους υγιείς εθελοντές, η οποία ήταν στατιστικά σημαντική (p=0.048), ενώ δεν βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με την prommp-2 (p= 0.876). Επιπρόσθετα παρατηρήθηκε πως ο λόγος της πρόδρομης μορφής της MMP-2 προς την ενεργή μορφή του ενζύμου ήταν 5:1, ενώ στους υγιείς μάρτυρες 11:1, φανερώνοντας αυξημένη ενεργοποίηση της MMP-2 στον ορό των ασθενών με σύνδρομο Sanfilippo. Εντούτοις, δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά στον λόγο των δύο μορφών της MMP-9 μεταξύ ασθενών και μαρτύρων. Παράλληλα, δεν διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στη δραστηριότητα των ζελατινασών, τόσο σε ενεργή μορφή όσο και σε μορφή προενζύμου, ανάμεσα στα δύο φύλα σε καμία από τις δύο ομάδες των συμμετεχόντων (prommp-9: p=0.146, MMP-9: p=0.201, prommp-2: p=0.497, MMP-2: p=0.612). Επίσης δεν υπήρξε συσχέτιση μεταξύ της ηλικίας και της ενζυμικής δραστηριότητας των MMP-2 και MMP-9 στον ορό των συμμετεχόντων (prommp-9: Pearson s product, r=-0.119, p=0.744), (MMP-9: Pearson s product, r=-0.279, p=0.435), (prommp-2: Pearson s product, r=0.622, p=0.055), (MMP-2: Pearson s product, r=-0.102, p=0.788). Η μελέτη της δραστηριότητας των ζελατινασών του ορού πραγματοποιήθηκε σε έναν ασθενή με σύνδρομο Hunter. Δεν βρέθηκε ζώνη λύσης η οποία να αντιστοιχεί στην prommp-9, την MMP-9 και την MMP-2, σε αντίθεση με τον υγιή μάρτυρα ο οποίος παρουσίασε ζώνες λύσης που αντιστοιχούν στις παραπάνω μορφές των ενζύμων. Αντίθετα, τόσο ο ασθενής όσο και ο μάρτυρας εμφάνισαν ζώνη λύσης η οποία αντιστοιχεί στην prommp-2. Η ποσοτικοποίηση των ζωνών αυτών έδειξε αύξηση της ενζυμικής δραστηριότητας της prommp-2 του ασθενούς κατά 1.6 φορές, σε σχέση με τον υγιή μάρτυρα ίδιου φύλου και ίδιας ηλικίας. Ανάλυση της ζελατινολυτικής δραστηριότητας με

266 Παιδιατρική ΒΟΡΕΙΟΥ ΕΛΛΑΔΟΣ, 24, 4 ζυμογραφία ζελατίνης πραγματοποιήθηκε στον ορό ενός ασθενούς με σύνδρομο Maroteaux- Lamy. Στον συγκεκριμένο τύπο βλεννοπολυσακχαρίδωσης μελετήθηκε η δραστηριότητα των ζελατινασών πριν από την έναρξη της θεραπείας και διαδοχικά 1, 2, 3, 4 και 6 μήνες μετά τη λήψη ERT. Δεν βρέθηκαν ζώνες λύσης που να αντιστοιχούν στην MMP-9 και MMP-2. Η ποσοτικοποίηση των ζωνών λύσης έδειξε πως η prommp-9 προ της θεραπείας ήταν ελαττωμένη κατά 30% ενώ αντίθετα αυξημένη κατά 146% παρουσιάσθηκε η ενεργότητα της prommp-2. Η ERT μετέβαλε την ενεργότητα των ζελατινασών. Ένα μήνα μετά την έναρξη της θεραπείας παρατηρήθηκε ελάττωση της δραστηριότητας της prommp-9, η οποία έφτασε τα επίπεδα του μάρτυρα 6 μήνες μετά την έναρξη της ERT. Η ενζυμική δραστηριότητα της prommp-2, παρά την αρχικά αυξημένη τιμή της σε σχέση με τον υγιή μάρτυρα, έφτασε σε φυσιολογικά επίπεδα μετά την πάροδο 2 μηνών ERT, επανήλθε όμως τελικά στα ίδια αυξημένα επίπεδα 6 μήνες μετά την έναρξη της χορηγούμενη θεραπείας. Η ζελατινολυτική δραστηριότητα διερευνήθηκε επιπρόσθετα σε 2 ασθενείς με νόσο του Pompe. Η μελέτη της ενεργότητας των ζελατινασών στους συγκεκριμένους ασθενείς πραγματοποιήθηκε, όπως και στην περίπτωση του συνδρόμου Maroteaux-Lamy, πριν από την έναρξη της θεραπείας και διαδοχικά 1, 2, 3, 4 και 6 μήνες μετά τη λήψη ERT. Δεν βρέθηκαν ζώνες λύσης που να αντιστοιχούν στην ενεργοποιημένη μορφή των υπό εξέταση μορίων. Η ποσοτικοποίηση των ζωνών λύσης έδειξε αύξηση τόσο της prommp-9 όσο και της prommp-2 κατά 10% και 75% αντίστοιχα. Έξι μήνες μετά την έναρξη της θεραπείας διαπιστώθηκε ελάττωση της ενεργότητας της prommp-9 κατά 8% (Ασθενής 10) και 42% (Ασθενής 11), ενώ αντίθετα δεν παρατηρήθηκαν μεταβολές σε σχέση με τη ζελατινολυτική δραστηριότητα της prommp-2. Μάλιστα η σημαντικότερη ελάττωση παρατηρήθηκε στον δεύτερο ασθενή ο οποίος ήταν συμπτωματικός κατά τον καιρό της διάγνωσης με την παρουσία ήπιας μυϊκής αδυναμίας. Στη νόσο του Krabbe η μελέτη της ενεργότητας των ζελατινασών σε 2 ασθενείς αποκάλυψε 4 ζώνες λύσης, οι οποίες αντιστοιχούν στην ενεργοποιημένη και ανενεργό μορφή των ενζύμων. Η ποσοτικοποίηση των ζωνών λύσης έδειξε αύξηση της ενεργότητας της prommp-9 κατά 1.2 φορές, της MMP-9 κατά 4.9 φορές, της prommp-2 κατά 1.3 φορές και της MMP-2 κατά 7.4 φορές, σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες. Τέλος η ανάλυση της ενζυμικής ενεργότητας των ζελατινασών πραγματοποιήθηκε σε 2 ασθενείς με νόσο Niemann-Pick τύπου Β. Όπως και στην περίπτωση των ασθενών με νόσο Krabbe, η ζυμογραφία ζελατίνης αποκάλυψε 4 ζώνες λύσης, η ποσοτικοποίηση των οποίων έδειξε μεταβολή στην ζελατινολυτική δραστηριότητα της MMP-2 και MMP-9. Παρατηρήθηκε αύξηση της prommp-9 κατά 0.7 φορές, της MMP-9 κατά 2.7 φορές, της prommp-2 κατά 1.1 φορές και της MMP-2 κατά 4.6 φορές, σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες. Ανοσοενζυμική μελέτη των MMPs και TIMPs Η συγκέντρωση των MMP-2, MMP-9, TIMP-1 και TIMP-2 ποσοτικοποιήθηκε στον ορό των ασθενών και των υγιών εθελοντών με την ανοσοενζυμική μέθοδο ELISA. Στους ασθενείς με Sanfilippo παρατηρήθηκε μία στατιστικά σημαντική αύξηση των επιπέδων της MMP-2 (p= 0.024), ενώ αντίθετα στατιστικά σημαντική ελάττωση σημειώθηκε στα επίπεδα της MMP-9 (p= 0.046). Σε σχέση με την συγκέντρωση των ιστικών αναστολέων, δεν παρατηρήθηκε σημαντική μεταβολή στα κυκλοφορούντα επίπεδα του TIMP-1 (p=0.095) και του TIMP-2 (p= 0.089) μεταξύ ασθενών και μαρτύρων (Πίνακας 2). Σε σχέση με τον ασθενή με σύνδρομο Hunter παρατηρήθηκε αύξηση της συγκέντρωσης της MMP- 2 κατά 2.6 φορές, ελάττωση της MMP-9 κατά 0.25 φορές, ενώ τέλος, η ποσοτικοποίηση των TIMP-1 και TIMP-2 φανέρωσε αύξηση της συγκέντρωσής τους κατά 1.6 και 2 φορές αντίστοιχα. Τα επίπεδα των υπό εξέταση μορίων αξιολογήθηκαν σε διαδοχικά δείγματα ορού προ της θεραπείας καθώς και 1, 2, 3, 4 και 6 μήνες μετά την έναρξη της ERT σε έναν ασθενή με σύνδρομο Maroteaux- Lamy. Η χορήγηση του ενζύμου οδήγησε σε μεταβολή της συγκέντρωσης των MMPs και TIMPs αλλά δεν παρατηρήθηκε σταθερή τάση ως προς την πορεία των τιμών τους. Η MMP-2 παρουσίασε αυξημένα επίπεδα κατά 1.5 φορές προ της θεραπείας, χωρίς σημαντική μεταβολή μέχρι και τον έκτο μήνα της χορήγησης του ενζύμου. Η MMP- 9 παρουσίασε πτώση κατά 60% στα επίπεδά της τον δεύτερο και τρίτο μήνα της έγχυσης, με τη συγκέντρωσή της να φθάνει τελικά στην αρχική τιμή προ της θεραπείας 6 μήνες μετά την έναρξη της ERT. Τέλος, σε σχέση με τους TIMPs, ο TIMP-2 εμ-

Παιδιατρική ΒΟΡΕΙΟΥ ΕΛΛΑΔΟΣ, 24 4 267 Εικ 1. Τα επίπεδα συγκέντρωσης της MMP-9 μετρήθηκαν με ELISA στον ορό 2 ασθενών με νόσο Pompe πριν και μετά την έναρξη ERT. Η χορήγηση του ανασυνδυασμένου ενζύμου οδήγησε σε σημαντική ελάττωση των επιπέδων της MMP-9 6 μήνες μετά την έναρξη της θεραπείας. Η πτώση στα επίπεδα της MMP-9 συσχετίσθηκε με την πτώση των τιμών των συνήθων βιοχημικών παραμέτρων που χρησιμοποιούνται στην παρακολούθηση των ασθενών. Ιδιαίτερα σημαντική βρέθηκε η ελάττωση της συγκέντρωσης της MMP-9 στον ορό του ασθενούς 11 (Εικόνα 1β), ο οποίος παρουσίαζε μυϊκή αδυναμία κατά τη διάγνωση, σε αντίθεση με τον ασθενή 10 (Εικόνα 1α) ο οποίος ήταν ασυμπτωματικός. φάνισε αύξηση κατά 1.6 φορές ενώ ο TIMP-1 καμία διαφορά σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες, με τα επίπεδά τους να παραμένουν αμετάβλητα κατά τη διάρκεια της ERT. Στη νόσο του Pompe, τα επίπεδα των υπό εξέταση μορίων μελετήθηκαν τόσο προ της θεραπείας όσο και κατά τη διάρκεια 6 μηνών από την έναρξη της ERT. Η συγκέντρωση της MMP-2 παρουσίασε αύξηση κατά 20% σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες ενώ αναφορικά με τα επίπεδα της MMP-9, αυτά εμφάνισαν σημαντική αύξηση κατά 2 φορές στον ορό των ασθενών. Μάλιστα στον έναν από τους 2 ασθενείς, ο οποίος ήταν συμπτωματικός κατά τη διάγνωση, βρέθηκε αύξηση της συγκέντρωσης της MMP-9 κατά 2.5 φορές. Αναφορικά με τα επίπεδα των TIMPs, δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στην τιμή τους πριν από τη χορήγηση της ERT σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες. Η χορήγηση του ενζύμου είχε σαν αποτέλεσμα μία σημαντική πτώση της τιμής της MMP-9 στον ορό των ασθενών, η οποία συσχετίσθηκε με την πτώση των τιμών στις βιοχημικές παραμέτρους που χρησιμοποιούνται στην παρακολούθηση των ασθενών με νόσο του Pompe, όπως είναι η CPK, η SGOT, η SGPT και η ALP (Εικόνα 1). Στη νόσο του Krabbe η μελέτη της συγκέντρωσης των ζελατινασών και των ιστικών αναστολέων τους αποκάλυψε σημαντικές διαφορές σε σχέση με τα αντίστοιχα επίπεδα των υγιών μαρτύρων. Παρατηρήθηκε αύξηση της MMP-9 κατά 4.4 φορές, της MMP-2 κατά 6.9 φορές, του TIMP-1 κατά 1.6 φορές και του TIMP-2 κατά 1.4 φορές, τα οποία παρόλα αυτά, λόγω του μικρού δείγματος των ασθενών δεν ήταν δυνατόν να ελεγχθούν με στατιστικές δοκιμασίες. Τέλος η ανάλυση των κυκλοφορούντων επιπέδων των υπό εξέταση μορίων πραγματοποιήθηκε σε 2 ασθενείς με νόσο Niemann-Pick τύπου Β. Οι ασθε-

268 Παιδιατρική ΒΟΡΕΙΟΥ ΕΛΛΑΔΟΣ, 24, 4 Πίνακας 3. Συγκεντρωτικά δεδομένα για την αύξηση ή ελάττωση της έκφρασης των ζελατινασών και των ιστικών αναστολέων τους στους ασθενείς με LSDs. Sanfilippo Hunter Maroteaux- Pompe Niemann-Pick Krabbe Lamy B Ζυμογραφία ProMMP-2 MMP-2 prommp-9 MMP-9 ELISA MMP-2 MMP-9 TIMP-1 TIMP-2 νείς παρουσίασαν σημαντική αύξηση στη συγκέντρωση των ζελατινασών με συνοδό ήπια αύξηση των τιμών των ιστικών αναστολέων τους. Παρατηρήθηκε αύξηση της MMP-9 κατά 1.9 φορές, της MMP-2 κατά 3.7 φορές, του TIMP-1 κατά 1.1 φορές και του TIMP-2 κατά 1.6 φορές, σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες. Τα συγκεντρωτικά δεδομένα για την αύξηση ή ελάττωση της έκφρασης των ζελατινασών και των ιστικών αναστολέων τους στο υπό εξέταση δείγμα φαίνονται στον Πίνακα 3. Συζήτηση Η αποκάλυψη των μεταβολικών οδών που επηρεάζονται και τελικά οδηγούν στην εκδήλωση των LSDs αποτελεί το πρώτο και ίσως το σημαντικότερο βήμα για την ανακάλυψη ειδικών βιοδεικτών για τα συγκεκριμένα νοσήματα. Η αρχική υπόθεση σε σχέση με την αιτιοπαθογένεια των LSDs ήταν πως η ενζυμική ανεπάρκεια που παρουσιάζουν οι ασθενείς οδηγεί σε ενδολυσοσωμική άθροιση μεταβολιτών και τελικά σε κυτταρική δυσλειτουργία και θάνατο. Σήμερα είναι κοινώς αποδεκτό πως η θεωρία αυτή είναι ανεπαρκής και όχι αντιπροσωπευτική για τα περισσότερα από τα LSDs, αφού το λυσόσωμα αποτελεί μέρος ενός πολύπλοκου ρυθμιστικού συστήματος 9 και εμπλέκεται σε πλήθος κυτταρικών διεργασιών. Ανάμεσα σε αυτές η αυτοφαγία, η φλεγμονή και η απόπτωση αποτελούν λειτουργίες που επηρεάζονται από την ενδολυσοσωμική άθροιση των μεταβολιτών 10 αλλά και από τη δράση πολλών μορίων του ECM. Παράλληλα, πρόσφατες μελέτες δείχνουν πως, πέραν της ενδολυσοσωμικής, παρατηρείται άθροιση μεταβολιτών και στον ECM σε αρκετά LSDs. Παραδείγματα τέτοιων νοσημάτων αποτελούν οι βλεννοπολυσακχαριδώσεις 11,12 (Mucopolysaccharidoses, MPS), η νόσος Fabry 13 και η νόσος Pompe 14. Τέλος, παρά την σημαντική πρόοδο σε σχέση με τη θεραπευτική αντιμετώπιση των LSDs, η γνώση μας αναφορικά με τη λειτουργία των λυσοσωμικών ενζύμων παραμένει ανεπαρκής. Πρόσφατα βρέθηκε πως πολλά από τα λυσοσωμικά ένζυμα έχουν βιολογικούς ρόλους που συνδέονται άμεσα με τον ECM 15-17, ενώ παράλληλα μπορούν και να αποτελούν τα ίδια μόρια του ECM 18. Όλα τα ανωτέρω αποτελούν απόδειξη πως ο ECM μπορεί να εμπλέκεται στην αιτιοπαθογένεια των LSDs και γίνεται καθαρά αντιληπτό πως η αναζήτηση ενός πιθανού βιοδείκτη ανάμεσα στα μόριά του μπορεί να δικαιολογηθεί πολύ εύκολα. Από την παρούσα μελέτη προέκυψαν συμπεράσματα που αφορούν σε ένα μικρό πληθυσμό ασθενών με LSDs. Η πλειοψηφία των ασθενών που μελετήθηκαν πάσχει από MPS τύπου ΙΙΙ, και μάλιστα από τον υπότυπο B, ο οποίος είναι ο συχνότερα παρατηρούμενος υπότυπος του συνδρόμου Sanfilippo στη χώρα μας. Με στόχο την αποσαφήνιση κάποιων από τους μηχανισμούς που ενέχονται στην αιτιοπαθογένεια των νοσημάτων αυτών αλλά και την ανακάλυψη δεικτών οι οποίοι επηρεάζονται στους πάσχοντες και θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν στη διάγνωση και παρακολούθηση της εξέλιξης των LSDs, μελετήθηκε η ενζυ-

Παιδιατρική ΒΟΡΕΙΟΥ ΕΛΛΑΔΟΣ, 24 4 269 μική δραστηριότητα και η έκφραση των ζελατινασών και των ιστικών αναστολέων τους στον ορό των ασθενών. Αρκετά μέλη της οικογένειας των MMPs έχουν αποτελέσει στο παρελθόν ερευνητικούς στόχους και έχουν μελετηθεί σε ιστούς πειραματοζώων με MPS. Κοινό χαρακτηριστικό όλων των μελετών αποτελεί η αύξηση της έκφρασης των MMPs που εξετάσθηκαν, όπως της MMP-1 και MMP-13 19, της MMP-12 20, καθώς και των ζελατινασών MMP-2 και MMP-9 21,22. Ωστόσο, ελάχιστη παραμένει η έρευνα σε σχέση με την ενζυμική δραστηριότητα των ζελατινασών, με την εξαίρεση μίας μελέτης, από τους Simonaro και συν., οι οποίοι βρήκαν αύξηση της in situ ενζυμικής δραστηριότητας των ζελατινασών, στις αρθρικές μεμβράνες πειραματοζώων με MPS VI και VII 22. Παρά τα ανωτέρω αποτελέσματα σε πειραματόζωα, δεν έχει μελετηθεί η έκφραση των μορίων αυτών σε ανθρώπους, με εξαίρεση την έρευνα των Di Natale και συν., οι οποίοι βρήκαν ελάττωση της έκφρασης της MMP-9 στο αίμα ασθενών με σύνδρομο Maroteaux-Lamy σε σχέση με υγιείς μάρτυρες ίδιας ηλικίας 23. Η παρούσα έρευνα αποτελεί ουσιαστικά την πρώτη προσπάθεια μελέτης της ενζυμικής δραστηριότητας των ζελατινασών σε ανθρώπινο πληθυσμό με MPS. Συνολικά σε σχέση με τις MPS, φάνηκε πως υπάρχει ελάττωση της ενεργότητας και της έκφρασης της MMP-9 με παράλληλη αύξηση αυτών της MMP-2, σε σχέση με υγιείς μάρτυρες ίδιου φύλου και ίδιας ηλικίας. Μάλιστα οι διαφορές αυτές παρουσιάζονται εντονότερα στα παιδιά που πάσχουν από MPS III. Με δεδομένη την συμμετοχή των ζελατινασών στην παθογένεια διαφόρων παθήσεων του ΚΝΣ, όπως στη νόσο Alzheimer, στη νόσο Parkinson και στη πολλαπλή σκλήρυνση 24-26, αλλά και το γεγονός πως η αυξημένη παραγωγή των MMP-2 και MMP- 9 σχετίζεται με διαταραχή στην ακεραιότητα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού 27, τα συγκεκριμένα μόρια θα μπορούσαν να αποτελέσουν βιοδείκτες σχετιζόμενους με το βαθμό συμμετοχής του ΚΝΣ στην εκδήλωση των νοσημάτων. Όσον αφορά στη χρήση των μορίων αυτών ως δεικτών για τη παρακολούθηση της εξέλιξης της νόσου κατά την εφαρμογή της ERT, τα αποτελέσματα είναι ενθαρρυντικά, αφού φανερώνουν πως οι ζελατινάσες δεν παραμένουν ανεπηρέαστες από τη χορήγηση ανασυνδυασμένου ενζύμου. Η χρήση των ζελατινασών ως βιοδείκτες που φανερώνουν νευρολογική συμμετοχή θα μπορούσε να επεκταθεί και σε άλλα LSDs με σημειολογία από το ΚΝΣ, όπως στη νόσο Krabbe, όπου επίσης παρατηρήθηκε αύξηση τόσο στην ενζυμική ενεργότητα όσο και στην έκφραση των υπό εξέταση μορίων στους ασθενείς που μελετήθηκαν. Πρόσφατα, σε ένα μοντέλο πειραματοζώου με νευρωνική κηροειδή λιποφουσκίνωση, βρέθηκε διαταραχή στη λειτουργία του αιματοεγκεφαλικού φραγμού, η οποία συσχετίσθηκε με την αποδόμηση των πρωτεϊνών σύνδεσης από τις MMPs 28. Κατ αυτό τον τρόπο η παρούσα μελέτη έθεσε το ερώτημα εάν και κατά πόσο η αυξημένη έκφραση των ζελατινασών θα μπορούσε να αποτελεί τον αιτιοπαθογενετικό μηχανισμό της νευρολογικής σημειολογίας και σε άλλα LSDs, ενώ το σημαντικότερο εύρημά της είναι πως η διαιτητική παρέμβαση με μία αντιοξειδωτική/αντιφλεγμονώδη πολυφαινόλη οδηγεί σε ελάττωση της έκφρασης των MMPs με παράλληλη αύξηση των πρωτεϊνών σύνδεσης του αιματοεγκεφαλικού φραγμού, παρέχοντας για πρώτη φορά αποδείξεις για την πιθανή εφαρμογή μίας αποτελεσματικής θεραπείας για την διατήρηση της ακεραιότητάς του 28. Η έκφραση των ζελατινασών βρέθηκε να διαφέρει σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες και στη νόσο του Pompe. Η πρόσφατη μελέτη της βιοσύνθεσης του κολλαγόνου σε ιστό που ελήφθη από έναν ασθενή με υπερτροφία των ούλων οδήγησε στο συμπέρασμα πως υπάρχει αυξημένη έκφραση των πρόδρομων μορφών του κολλαγόνου στη συγκεκριμένη νόσο 29. Το συγκεκριμένο εύρημα θα μπορούσε να είναι ενδεικτικό μίας διαταραχής στην ομοιόσταση του κολλαγόνου που αποτελεί υπόστρωμα των ζελατινασών, οδηγώντας έτσι σε διαφορική έκφραση των υπό εξέταση μορίων. Παράλληλα, μία ερευνητική ομάδα έδειξε πως η νευραμινιδάση, η ανεπάρκεια της οποίας αποτελεί τη βιοχημική βάση ενός LSD που ονομάζεται σιαλίδωση, επηρεάζει την συμπεριφορά των μορίων του ECM, μεταβάλλοντας το περιεχόμενο διαφόρων ουσιών σε σιαλικό οξύ 16. Το εύρημα αυτό αποτελεί ένδειξη για την πιθανή συμμετοχή ενός λυσοσωμικού ενζύμου στην αναδιαμόρφωση του ECM και στηρίζει την υπόθεση πως τα νευρομυϊκά συμπτώματα των ασθενών που πάσχουν από σιαλίδωση ενδέχεται να προκύπτουν από μεταβολές στον ECM που προκαλούν εκφύλιση των μυϊκών ινών 16. Σε συνδυασμό με το γεγονός πως η έκφραση των ζελατινασών έχει βρεθεί διαφορετική σε σύγκριση με τον υγιή πληθυσμό σε διάφορες

270 Παιδιατρική ΒΟΡΕΙΟΥ ΕΛΛΑΔΟΣ, 24, 4 παθήσεις που χαρακτηρίζονται από μυϊκή προσβολή 30, η μεταβολή της έκφρασης της MMP-2 και MMP-9 στους ασθενείς της παρούσας μελέτης θα μπορούσε να αποδοθεί στην μυοπάθεια που παρουσιάζουν οι ασθενείς με νόσο του Pompe. Συμπεράσματα Η παρούσα μελέτη, παρά το γεγονός πως αφορά σε ένα μικρό πληθυσμό με LSDs, αποτελεί ουσιαστικά την πρώτη προσπάθεια διερεύνησης της έκφρασης των ζελατινασών στα νοσήματα αυτά. Οι ασθενείς που μελετήθηκαν παρουσιάζουν μεταβολές στην έκφραση των υπό εξέταση μορίων σε σχέση με τον υγιή πληθυσμό και επομένως οι MMPs θα μπορούσαν ενδεχόμενα να αποτελέσουν βιοδείκτες για τη διάγνωση και παρακολούθηση των ασθενών. Παρόλα αυτά για να εφαρμοσθεί η χρήση τους σε ευρεία κλίμακα απαραίτητη είναι η επιβεβαίωση των ευρημάτων σε έναν μεγαλύτερο πληθυσμό ασθενών. Τέλος, σε μία εποχή όπου η ανακάλυψη βιοδεικτών για την πρώιμη διάγνωση αποτελεί υπέρτατο στόχο της επιστημονικής κοινότητας, είναι σημαντικό να γίνει αντιληπτό πως οι ιστοί είναι φτιαγμένοι τόσο από κύτταρα όσο και από τον περιβάλλοντα ECM και ότι σε πολύπλοκα νοσήματα όπως τα LSDs, η διερεύνηση και των δύο αυτών παραμέτρων θα πρέπει να γίνεται ιδανικά ταυτόχρονα. Βιβλιογραφία 1. Cox TM, Cachón-González MB. The cellular pathology of lysosomal diseases. J Pathol 2012, 226: 241-54. 2. Meikle PJ, Hopwood JJ, Clague AE, Carey WF. Prevalence of lysosomal storage disorders. JAMA 1999, 281: 249-54. 3. Aerts JJ, Kallemeijn WW, Wegdam W, Joao Ferraz M, van Breemen MJ, Dekker N, et al. Biomarkers in the diagnosis of lysosomal storage disorders: proteins, lipids, and inhibodies. J Inherit Metab Dis 2011, 34: 605-19. 4. Nagase H, Woessner JF Jr. Matrix metalloproteinases. J Biol Chem 1999, 274: 21491 4. 5. Woessner JF Jr. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in connective tissue remodeling. FASEB J 1991, 5: 2145 54. 6. Rydlova M, Holubec L Jr, Ludvikova M Jr, Kalfert D, Franekova J, Povysil C, et al. Biological activity and clinical implications of the matrix metalloproteinases. Anticancer Res 2008, 28:1389 97. 7. Clark IM, Swingler TE, Sampieri CL, Edwards DR. The regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors. Int J Biochem Cell Biol 2008, 40:1362 78. 8. Papakonstantinou E, Aletras AJ, Glass E, Tsogas P, Dionyssopoulos A, Adjaye J, et al. Matrix metalloproteinases of epithelial origin in facial sebum of patients with acne and their regulation by isotretinoin. J Invest Dermatol 2005, 125: 673-84. 9. Walkley SU. Pathogenic mechanisms in lysosomal disease: a reappraisal of the role of the lysosome. Acta Paediatr Suppl 2007, 96: 26-32. 10. Tessitore A, Pirozzi M, Auricchio A. Abnormal autophagy, ubiquitination, inflammation and apoptosis are dependent upon lysosomal storage and are useful biomarkers of mucopolysaccharidosis VI. Pathogenetics 2009, 2: 4. 11. Young RD, Liskova P, Pinali C, Palka BP, Palos M, Jirsova K, et al. Large proteoglycan complexes and disturbed collagen architecture in the corneal extracellular matrix of mucopolysaccharidosis type VII (Sly syndrome). Invest Ophthalmol Vis Sci 2011, 52: 6720-8. 12. Martin DC, Atmuri V, Hemming RJ, Farley J, Mort JS, Byers S, et al. A mouse model of human mucopolysaccharidosis IX exhibits osteoarthritis. Hum Mol Genet 2008, 17: 1904-15. 13. Askari H, Kaneski CR, Semino-Mora C, Desai P, Ang A, Kleiner DE, et al. Cellular and tissue localization of globotriaosylceramide in Fabry disease. Virchows Arch 2007, 451: 823-34. 14. Chien YH, Lee NC, Huang PH, Lee WT, Thurberg, BL, Hwu WL. Early pathologic changes and responses to treatment in patients with later-onset Pompe disease. Pediatr Neurol 2012, 46: 168-71. 15. Bhattacharyya S, Kotlo K, Shukla S, Danziger RS, Tobacman JK. Distinct effects of N-acetylgalactosamine-4- sulfatase and galactose-6-sulfatase expression on chondroitin sulfates. J Biol Chem 2008, 283: 9523-30. 16. Zanoteli E, van de Vlekkert D, Bonten EJ, Hu H, Mann L, Gomero EM, et al. Muscle degeneration in neuraminidase 1-deficient mice results from infiltration of the muscle fibers by expanded connective tissue. Biochim Biophys Acta 2010, 1802: 659-72. 17. Stern R. Hyaluronan catabolism: a new metabolic pathway. Eur J Cell Biol 2004, 83: 317-25. 18. Fujita K, Teramura N, Hattori S, Irie S, Mitsunaga- Nakatsubo K, Akimoto Y, et al. Mammalian arylsulfatase A functions as a novel component of the extracellular matrix. Connect Tissue Res 2010, 51: 388-96. 19. Simonaro CM, D Angelo M, He X, Eliyahu E, Shtraizent N, Haskins ME, et al. Mechanism of glycosaminoglycanmediated bone and joint disease: implications for the mucopolysaccharidoses and other connective tissue diseases. Am J Pathol 2008, 172:112-22. 20. Ma X, Tittiger M, Knutsen RH, Kovacs A, Schaller L,