Τυποποίηση HLA Εργαστήριο Ανοσολογίας Εαρινό εξάμηνο 2019 Υπεύθυνες Διδασκαλίας: Βογιατζάκη Χρυσάνθη, Τσουμάνη Μαρία
Μείζον σύμπλεγμα ιστοσυμβατότητας και ΗLA Ορόσημο στην ανοσολογία των μεταμοσχεύσεων αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων αποτελεί η ανακάλυψη και μελέτη του εξαιρετικά πολυμορφικού Μείζονος Συμπλέγματος Ιστοσυμβατότητας (MHC) --HLA (Human Leukocyte Antigens) για τον άνθρωπο Ο όρος Μείζον υπενθυμίζει ότι υπάρχουν πολυάριθμες γονιδιακές θέσεις. Ο όρος Σύμπλεγμα υποδηλώνει την πολυπλοκότητα των γονιδιακών θέσεων ενώ ο όρος Ιστοσυμβατότητα αναφέρεται στο γεγονός ότι η αναγνώριση των μορίων του M.H.C από τους υποδοχείς των Τ-λεμφοκυττάρων και τα αντισώματα καθορίζει τη συμβατότητα ή μη ανάμεσα στους ιστούς. Αρχικά τα HLA θεωρούνταν κάτι ως οµάδες αίµατος επί των λευκών αιµοσφαιρίων αλλά τελικά αποδείχτηκε ότι ανευρίσκονται σε όλα τα εµπύρηνα κύτταρα του οργανισµού και στα αιµοπετάλια Το σύστημα HLA είναι μια ομάδα γλυκοπρωτεϊνικών αντιγόνων που βρίσκονται στη μεμβράνη όλων των εμπύρηνων κυττάρων
1937, P. Gorer, G. Snell 1955, E.D.Thomas ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ H-2 σύστημα ιστοσυμβατότητας ποντικού ΜΜΟ σε πειραματόζωα και ανθρώπους 1958, J. Dausset (Νobel 1980) δημοσίευσε το άρθρο παρουσία αντιγόνων ιστοσυμβατότητας στα ανθρώπινα λευκοκύτταρα 1958, JJ Van Rood δημοσίευσε το άρθρο identification of histocompatibility antigens using sera of multiparous women 1964, TERRASAKI &MACCLELLAND Εφαρμογή της μικρολεμφοκυτταροτοξικής μεθόδου 1980 Έρευνα του HLA συστήματος σε επίπεδο DNA Johannes J. van Rood
ΚΛΗΡΟΝΟΜΙΚΗ ΜΕΤΑΒΙΒΑΣΗ HLA ΓΟΝΙΔΙΩΝ Τα HLA κληρονομούνται με τη μορφή απλοτύπων. Κάθε άτομο φέρει δύο απλότυπους ένα από τον πατέρα του και ένα από τη μητέρα του Εδράζεται στο βραχύ σκέλος του χρωµοσώµατος 6 (6p21.31 και 6p21.33) Καταλαµβάνει έκταση µεγέθους 4Χ10 6 bp Αντιπροσωπεύει το 1/1000 της γενετικής πληροφορίας και αποτελεί την πλέον πολύµορφη γενετική περιοχή του ανθρ. γονιδιώµατος (252 εκφραζόµενα και µη γονίδια)
ΓΕΝΕΤΙΚΟΣ ΧΑΡΤΗΣ HLA ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ HLA τάξης Ι: Α, Β, C (κλασσικά) Ε, F, G, (µη κλασσικά) HLA τάξης ΙΙ: DRB, DQA, DQB, DPB HLA τάξης ΙΙΙ: πρωτεΐνες συµπληρώµατος, κυτταροκίνες, ένζυµα
Αριθμός κλασικών HLA αλληλίων
Τάξης Ι και II HLA-αντιγόνα Τα κλασσικά HLA τάξης Ι (A/B/C) και τάξης ΙΙ (DR/DQ/DP) εκφράζονται στα εμπύρηνα κύτταρα του σώματος μας. Οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες των αντιγόνων αναδιπλώνονται και σχηματίζουν σχισμοειδή θήκη για την παρουσίαση «ίδιων» και «ξένων» πεπτιδίων (βιολογικός ρόλος HLA). Τα HLA τάξης Ι εκφράζονται στην 6η εµβρυική εβδοµάδα όλα τα εµπύρηνα κύτταρα (πλην των σπερµατικών και κυττάρων τροφοβλάστης) ενώ τα HLA τάξης ΙΙ εκφράζονται στην 20η -32η εβδοµάδα στα Β λεµφοκύτταρα, τα ενεργοποιηµένα Τ λεµφοκύτταρα, τα επιθηλιακά κύτταρα του θύµου αδένα, τα µακροφάγα και τα δενδριτικά κύτταρα Τα HLA τάξης Ι συνδράμουν στην αναγνώριση ενδογενούς αντιγόνου από τα Τ- κυτταροτοξικά κύτταρα (CD 8 ). Τα HLA τάξης ΙΙ Συνδράμουν στην αναγνώριση εξωγενούς αντιγόνου από τα Τ- βοηθητικά (CD 4 ) και Τ-κατασταλτικά κύτταρα. παραμένουν αμετάβλητα καθ όλη τη διάρκεια της ζωής
Δομή των HLA τάξης Ι και ΙΙ μορίων διαµεµβρανικά ετεροδιµεροί τάξης Ι µια ελαφριά µη πολυµορφική άλυσο την β2- µικροσφαιρίνη (χρωµόσωµα 15) µία βαριά α γλυκοζυλιωµένη πολυµορφική αλυσίδα (γονίδια MHC) τα α1 και α2 σχηµατίζουν την σχισµοειδή θήκη που αποτελεί τη θέση δέσµευσης του ενδογενούς/εξωγενούς αντιγονικού πεπτιδίου τάξης ΙΙ Μια βαριά γλυκοπρωτεϊνική αλυσίδα β (MHC γονίδια) μια ελαφριά γλυκοπρωτεϊνική αλυσίδα α (MHC γονίδια) τα α1 και β1 σχηµατίζουν την σχισµοειδή θήκη που αποτελεί τη θέση δέσµευσης του ενδογενούς/εξωγενούς αντιγονικού πεπτιδίου
Θέση δέσμευσης του αντιγονικού πεπτιδίου Σχισμοειδής θήκη Οι διαφορές αμινοξέων της πολυπεπτιδικής αλυσίδας εντοπίζονται κατά κανόνα στη σχισμοειδή θήκη των μορίων και συμβάλουν στον πολυμορφισμό του συστήματος με αποτέλεσμα: να επιτρέπουν στα HLA να παρουσιάζουν στο ανοσολογικό μας σύστημα πολλά ξένα πεπτίδια (βιολογικός ρόλος HLA) καθιστώντας δυνατή την αντιµετώπιση µεγάλου εύρους παθογόνων που απειλούν τον οργανισµό να είναι σημαντικός φραγμός στην ανεύρεση HLA συμβατού δότη για μεταμόσχευση καθώς καθορίζει την ειδικότητα των HLA αντιγόνων Κάθε HLA τάξης Ι και ΙΙ µόριο µπορεί να συνδέεται µε ένα µεγάλο φάσµα πεπτιδίων τα οποία έχουν διαφορετική αµινοξική ακολουθία αλλά φέρουν τα ίδια ή παρόµοια (βασικά, υδρόφοβα) αµινοξέα σε δύο ή τρεις συγκεκριµένες θέσεις της πεπτιδικής ακολουθίας
Πολυμορφισμός των HLA-μορίων τάξης ΙΙ Οι θέσεις των πολυμορφικών περιοχών λειτουργικοί επίτοποι- των HLA- DR και HLA-DQ μορίων εμφανίζονται με κίτρινο χρώμα. Αριστερά: το μοντέλο ενός HLA-DR μορίου: α αλυσίδα πολυμορφική (μώβ), β αλυσίδα (DRB1) πολυμορφική (μπλε), πεπτίδιο στη σχισμοειδή θήκη (πράσινο). Δεξιά: το μοντέλο ενός HLA-DQ μορίου: α αλυσίδα (DQA1) πολυμορφική (μώβ), β αλυσίδα (DQB1) πολυμορφική (μπλέ), πεπτίδιο στη σχισμοειδή θήκη (καφέ)
Ορολογικές τεχνικές HLA τυποποίηση Μικρολεµφοκυτταρική τεχνική των δύο σταδίων Μοριακές τεχνικές 1. Απομόνωση του DNA από τα εμπύρηνα κύτταρα του ολικού αίματος 2. PCR (Polymerase Chain Reaction ) Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης Τεχνική εκλεκτικού πολλαπλασιασμού συγκεκριμένων αλληλουχιών DNA 3. Aνίχνευση προϊόντος πολλαπλασιασμού του DNA 4. Aνάλυση και ερμηνεία των αποτελεσμάτων
Κλινική σημασία του HLA συστήματος Μεταµοσχεύσεις ιστών και συµπαγών οργάνων Μεταγγίσεις αιμοπεταλίων Έλεγχος πατρότητας Ιατροδικαστική Ανθρωπολογικές µελέτες Συσχετίσεις HLA µε διάφορα νοσήµατα
Κέντρα Δότη (Donor Centers) Δυστυχώς μόνο το 30% των ασθενών διαθέτει συγγενή ιστοσυμβατό δότη. Για τους υπόλοιπους να πρέπει να αναζητηθεί μη-συγγενής (εθελοντής) δότης (volunteer unrelated donor, VUD) ανάμεσα σε εθελοντές που έχουν εκφράσει την επιθυμία να δωρίσουν ΑΑΚ (αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα) είτε κατάλληλη μονάδα ομφαλοπλακουντιακού αίματος (ΟπΑ) που προορίζεται για αλλογενή μη συγγενική μεταμόσχευση. Λόγω των πολυμορφισμών του HLA συστήματος η πιθανότητα ανεύρεσης συμβατού μη συγγενή εθελοντή δότη εξαρτάται από το μέγεθος του μητρώου και την φυλή στην οποία ανήκει ο ασθενής. Η διαφορετική συχνότητα HLA απλοτύπων ανάμεσα στις φυλές επιβεβαιώνει την ανάγκη δημιουργίας εθνικών δεξαμενών εθελοντών δοτών αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων. Η προσέλκυση δοτών, η ανεύρεση ιστοσυμβατών δοτών και η προμήθεια μοσχευμάτων γίνεται μέσα από οργανωμένες δομές που ονομάζονται Κέντρα Δότη (Donor Centers).
Κέντρα Δότη (Donor Centers) Η Shirley Nolan δημιούργησε το 1974 την πρώτη οργανωμένο φορέα ενημέρωσης και προσέλκυσης εθλεοντών δοτών μυελού των οστών (Anthony Nolan Bone Marrow Register) στο Westminster Children s Hospital της Αγγλίας. Τα επόμενα χρόνια άρχισαν να δημιουργούνται σε διάφορες χώρες δεξαμενές εθελοντών δοτών μυελού των οστών (registries) Το 1986 δημιουργείται η Παγκόσμια Δεξαμενή Δοτών (Bone Marrow Donors Worldwide, BMDW) στο Leiden της Ολλανδίας. Στην βάση του BMDW είναι καταγεγραμμένοι περισσότεροι από 30 εκατομμύρια δότες από 75 δεξαμενές Δοτών και 350 Κέντρα Δοτών από 52 χώρες. Το 1988 δημιουργείται η Παγκόσμια Οργάνωση Αρχείων Δοτών (World Marrow Donor Association, WMDA). Από τον Ιανουάριο του 2017, το BMDW (και το NetCord που ασχολείται με τα ομφαλικά μοσχεύματα) ενσωματώθηκαν στο WMDA. Επίσης λειτουργεί το πρωτόκολλο ηλεκτρονικής επικοινωνίας European Marrow Donor Information System (EMIDS). Η ηλεκτρονική επικοινωνία μέσω του EDMIS μεταξύ των κέντρων δοτών γίνεται με σύναψη διμερών συμφωνιών, εφόσον και τα δύο κέντρα εκπληρώνουν κάποιες προϋποθέσεις λειτουργίας.
Εφαρμογές HLA τυποποίησης 1. Μεταμόσχευση ιστών και οργάνων 2. Έλεγχος πατρότητας 3. Πρόγνωση κληρονομικών ασθενειών 4. Φυλογενετικές μελέτες 5. Διάγνωση και πρόληψη εκτρώσεων
Προσδιορισμός HLA με τη μέθοδο της μικρολεμφοκυτταροτοξικότητας Η τεχνική της μικρολεμφοκυτταροτοξικότητας είναι μέθοδος ρουτίνας για την ορολογική τυποποίηση και την άμεση διασταύρωση δότη-λήπτη. Τροποποιήσεις της τεχνικής αυτής έγιναν αρκετές, κυρίως αλλάζοντας τις χρωστικές που χρησιμοποιούνται για την εκτίμηση των νεκρών κυττάρων αλλάζοντας τους χρόνους και τις θερμοκρασίες επώασης. Παρ' όλα αυτά, αρχή της μεθόδου παραμένει ίδια. Η αρχή μεθόδου βασίζεται στην ένωση αντιγόνου (αντιγόνο HLA κυτταρικής μεμβράνης) με ειδικό αντίσωμα (αντιορός HLA) παρουσία περίσσειας συμπληρώματος προκαλεί βλάβη της κυτταρικής μεμβράνης (οπές) και θάνατο του κυττάρου. Συγκεκριμένα, για την αναγνώριση των HLA αντιγόνων (ή HLA αντισωμάτων), κυτταροτοξικά HLA αντισώματα γνωστής ειδικότητας (ή HLA-τυποποιημένα λεμφοκύτταρα) επωάζονται παρουσία συμπληρώματος με λεμφοκύτταρα (ή με ορό) ενός δείγματος δότη. Τα HLA αντισώματα αντιδρούν με τα αντίστοιχα HLA αντιγόνα στην κυτταρική μεμβράνη των λεμφοκυττάρων. Τα σύμπλοκα αντιγόνων-αντισωμάτων που σχηματίζονται κατ' αυτόν τον τρόπο ενεργοποιούν το προστιθέμενο συμπλήρωμα. Το ενεργοποιημένο συμπλήρωμα προκαλεί λύση της μεμβράνης των λεμφοκυττάρων και μια χρωστική η οποία επίσης προστίθεται (όπως ηωσίνη ή πορτοκαλί ακριδίνη/βρωμιούχο αιθίδιο) μπορεί να διεισδύσει στο κύτταρο και να το χρωματίσει (= θετική αντίδραση). Εάν δεν λάβει χώρα καμία αντίδραση αντισώματος-αντιγόνου, τότε το συμπλήρωμα δεν ενεργοποιείται, δεν υπάρχει λύση των λεμφοκυττάρων και η χρωστική δεν μπορεί να διεισδύσει στο κύτταρο (= αρνητική αντίδραση). Η μέθοδος καθορίζει τα αντιγόνα (πρωτεϊνες) που εκφράζονται στα κύτταρα
Στάδια ορολογικής τυποποίησης HLA αντιγόνων 1. Απομόνωση των λεμφοκυττάρων από ολικό αίμα με χρήση του αντιδραστηρίου της φικόλης 2. Απομόνωση των επιθυμητών λεμφοκυττάρων Τ ή Β με ανοσομαγνητικά σφαιρίδια. 3. Προσδιορισμός HLA με την μέθοδο της μικρολεμφοκυτταροτοξικότητας. 4. Μικροσκόπηση πλάκας terassaki σε μικροσκόπιο ανοσοφθορισμού ή ανάστροφης φάσεως. 5. Εκτίμηση HLA I και HLA II δότη και λήπτη σε μικροσκόπιο ανάστροφου φθορισμού.
Απαιτούμενα αντιδραστήρια για HLA αντιγόνα Κύτταρα: Λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος Λεμφοκύτταρα λεμφαδένα Λεμφοκύτταρα σπλήνα Συμπλήρωμα: Ορός κονίκλου Αντιοροί HLA: Εγκυμονούσες ή πολύτοκες γυναίκες Πλακούντας Πολυμεταγγιζόμενα άτομα Άτομα που μεταμοσχεύθηκαν κ.α.
Απαιτούμενο δείγμα για τυποποίηση HLA Λαμβάνονται από τον εξεταζόμενο (δότη ή λήπτη) 18 cc γενικής αίματος EDTA. Μεταφέρονται 5 cc σε πλαστικό σωληνάριο το οποίο αναδεύεται για 4 5 λεπτά σε αναδευτήρα γενικής αίματος. Στο σωληνάριο τοποθετούνται μαγνητικά σφαιρίδια από 100 μl HLA Class I ή 100 μl HLA Class II. Στο ίδιο σωληνάριο προσθέτονται 5 ml PBS/Citrate
Μέθοδος μικρολεμφοκυτταροτοξικότητας (1) Απομόνωση λεμφοκυττάρων με ανοσομαγνητικά σφαιρίδια 1. Τα σωληνάρια με το δείγμα τοποθετούνται σε ειδικό στατώ με μαγνήτες για 3 min. 2. Απορρίπτεται το υπερκείμενο από το σωληνάριο χωρίς να απομακρύνεται από το μαγνητικό στατώ. Tα κύτταρα που πρόκειται να απομονωθούν παραμένουν επικολλημένα μαζί με τα μαγνητικά σφαιρίδια στο τοίχωμα του σωληναρίου που εφάπτεται στο μαγνητικό στατώ.
Στάδιο έκπλυσης Μέθοδος μικρολεμφοκυτταροτοξικότητας (2) 3. Το άδειο πλέον σωληνάριο (περιέχει μόνο τα λεμφοκύτταρα που έχουν κολλήσει στην επιφάνεια) γεμίζει με διάλυμα PBS/Citrate 4. Απορρίπτεται το υπερκείμενο και επαναλαμβάνεται το πλύσιμο με PBS/Citrate επί τρεις φορές. Μετά το τελευταίο πλύσιμο απομακρύνονται και οι τελευταίες σταγόνες από το σωληνάριο έτσι ώστε να μείνει τελείως στεγνό.
Μέθοδος μικρολεμφοκυτταροτοξικότητας (3) 5. Προστίθενται 250 μl FCS (fetal calf serum) στα κύτταρα για έλεγχο HLA τάξης Ι και 150 μl για έλεγχο HLA τάξης ΙΙ. 6. Λαμβάνεται το εναιώρημα λεμφοκυττάρων και διανέμεται ανά 1 μl σε όλες τις οπές της αντίστοιχης πλάκας terassaki. Χρησιμοποιείται για αυτό μονή πιπέττα Hamilton. Προηγείται πλύσιμο της πιπέττας Hamilton με αποσταγμένο νερό. Μονή πιπέττα Hamilton Πλάκα terassaki
Μέθοδος μικρολεμφοκυτταροτοξικότητας (4) 7. Επώαση 30 min στο σκοτάδι 8. Προστίθεται συμπλήρωμα (5 μl) σε όλες τις οπές της πλάκας terassaki με πενταπλή πιπέττα Hamilton.
Μέθοδος μικρολεμφοκυτταροτοξικότητας (5) 9. Επώαση 45 min στο σκοτάδι. 10. Προστίθεται 1 μl χρωστικής Acridine orange/ethidium bromide σε κάθε οπή της πλάκας terassaki. 11. Μικροσκόπηση σε ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού Θετικός μάρτυρας Αρνητικός μάρτυρας
Μικροσκόπηση σε ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού 100% κόκκινα στίγματα: Βαθμός 8 80% κόκκινα στίγματα: Βαθμός 6 50% κόκκινα στίγματα: Βαθμός 4 20% κόκκινα στίγματα: Bαθμός 2 0% κόκκινα στίγματα ή 100% πράσινα στίγματα: Βαθμός 0. (αρνητικό).
Μικροσκόπηση σε μικροσκόπιο ανάστροφης φάσης
Απάντηση τυποποίησης HLA I class
Α Β C D E F NEG POS A1 A1 A10 20 A4 A6 A6 A9 A20 A21 A28 A62 Α Β C D E F 0 8 0 0 8 8 6 6 6 0 2 4
Aποτελέσματα ανάγνωσης πλάκας HLA Class I Α1 (1) Α2 (6) Α11 (2) Α24 (6-8) Α25 (1) Α26 (6) Α29 (4) Α30 (1) Α31 (2) Α32 (1) Α33 (6-8) Α34(1) Β13 (1) Β38 (1) Β51 (2) Β52 (1) Β62 (8) Β63 (2) Β78 (8) B81 (4) Cwk 25 (4) O εξεταζόμενος έχει τα αλληλόμορφα Α24, Α33, Β62, Β78 και δευτερευόντως τα αλληλόμορφα Α26, C wk 25 και Β81.
Απάντηση τυποποίησης HLA class II
Aποτελέσματα ανάγνωσης πλάκας HLA Class II DR1 (8) DR4 (4) DR7 (2) DR8 (1) DR10 (4) DR11 (1) DR12 (1) DR14 (4) DR15 (1) DR16 (1) DR17 (6) DR18 (1) DR1303 (1) DR51 (1) DR52(8) DR53 (1) DQ4 (4) DQ5 (1) DQ6 (1) DQ2 (8) WkDQ5 (1) O εξεταζόμενος έχει τα αλληλόμορφα DR1, DR52, DQ2, λιγότερο τo DR17 και δευτερευόντως τα DR4, DR10, DR14.