ΠΡΟЇΟΝΤΑ ΕΣΩΚΛΕΙΣΤΑ ΦΥΛΛΑΔΙΑ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΚΑΙ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΠΟΥ ΠΕΡΙΛΑΜΒΑΝΟΥΝ Ο ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΤΙΜΩΝ ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΚΑΙ ΑΛΛΕΣ ΣΧΕΤΙΚΕΣ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ο IVD ΠΡΟЇΟΝΤΑ ΕΣΩΚΛΕΙΣΤΑ ΦΥΛΛΑΔΙΑ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΚΑΙ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΠΟΥ ΠΕΡΙΛΑΜΒΑΝΟΥΝ Ο ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΤΙΜΩΝ ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΚΑΙ ΑΛΛΕΣ ΣΧΕΤΙΚΕΣ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ Σύνοψη Στο κεφάλαιο αυτό θα περιγραφούν οι απαιτήσεις της αγοράς και της διεθνούς Επιστημονικής κοινότητας για τα in vitro διαγνωστικά προϊόντα και αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται στα εργαστήρια Κλινικής Χημείας: ποιες πληροφορίες πρέπει να περιλαμβάνονται στα εσώκλειστα φυλλάδια τους που αφορούν στη σωστή φύλαξη και χρήση τους και ποιες πρέπει να είναι οι ιδιότητές τους. Ιδιαίτερη έμφαση θα δοθεί στα κλινικά και αναλυτικά χαρακτηριστικά τους που πρέπει να ελεγχθούν και να αναφερθούν από τους κατασκευαστές. Ανάμεσά τους και ο προσδιορισμός των τιμών αναφοράς που είναι και το χαρακτηριστικό που χρησιμοποιείται περισσότερο από τους κλινικούς ιατρούς ώστε να πάρουν τη ορθή απόφαση για τη διάγνωση, την πρόγνωση και την παρακολούθηση του ασθενούς. Προαπαιτούμενες γνώσεις Στο παρόν κεφάλαιο θα διδαχθούν γνώσεις χρήσιμες για την καθημερινότητα του κλινικού εργαστηρίου. Δεν υπάρχουν προαπαιτούμενες γνώσεις από άλλα κεφάλαια. Γνώσεις από τη Στατιστική και τη Χημειομετρία θα ήταν χρήσιμες για την κατανόηση βασικών αρχών του κεφαλαίου. Μικρή εισαγωγή σε αυτό το κεφάλαιο γίνεται και στο δεύτερο μέρος του Κεφαλαίου 1 όπου γίνεται αναφορά στα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης των αναλυτικών μεθόδων. 9.1 Εισαγωγή για τα IVDs Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται από τα Κλινικά εργαστήρια οφείλουν να πληρούν συγκεκριμένες προδιαγραφές πριν κυκλοφορήσουν στην αγορά, ενώ η χρήση και η παραγωγή τους πρέπει να τελεί κάτω από συνεχή παρακολούθηση από τις αρμόδιες αρχές (Regulatory authorities) και από τους αρμόδιους κοινοποιημένους οργανισμούς (Notified Bodies) αντίστοιχα. Είναι πολύ σημαντικό να υπάρχει αποτελεσματικός μηχανισμός επαγρύπνησης (vigilance), ώστε να προληφθούν η λανθασμένη χρήση τους αλλά και οι λανθασμένες ιατρικές επιλογές που μπορούν να οδηγήσουν σε σοβαρές επιπλοκές ή ακόμη και σε θάνατο του ασθενούς. Για την Ελλάδα ισχύει η Οδηγία 98/79/EC που αφορά στη διακίνηση και τον έλεγχο των in vitro διαγνωστικών ιατροτεχνολογικών προϊόντων (IVD, βλ. Κεφάλαιο 7) στην Ευρωπαϊκή Ένωση (Directive, 1998). Στην κατηγορία αυτή ανήκουν όλα τα προϊόντα που χρησιμοποιούνται από τα κλινικά εργαστήρια: τα εμπορικά διαθέσιμα διαγνωστικά kits των κατασκευαστών (manufacturers), αλλά και τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για τις εσωτερικές μεθόδους του εργαστηρίου (in-house tests ή αλλιώς LTDs, laboratory-developed tests) μόνο για διαγνωστική χρήση (και όχι για ερευνητικούς σκοπούς). Ουσιαστικά στην κατηγορία αυτή ανήκουν όλα τα αντιδραστήρια ή τα αναλώσιμα ή ο εξοπλισμός τα οποία χρησιμοποιούνται για τη διενέργεια εργαστηριακών εξετάσεων που καλύπτονται οικονομικά μερικώς ή ολικώς από τα συστήματα υγείας ανά τον κόσμο (κρατικούς και ιδιωτικούς ασφαλιστικούς οργανισμούς). Τα αντιδραστήρια τα οποία συμμορφώνονται με την οδηγία αυτή κυκλοφορούν στα κράτη-μέλη της Ευρωπαϊκής Ένωσης με το χαρακτηριστικό σήμα CE (Conformité Europeéne) για IVD (Σχήμα 9.1). Η οδηγία αυτή οδήγησε σε αύξηση της ασφάλειας της χρήσης των συγκεκριμένων αντιδραστηρίων αλλά και της καινοτομίας για τα προϊόντα που είτε παράγονται είτε εισάγονται στην Ευρωπαϊκή Ένωση κατ αντιστοιχία με άλλες περιοχές του πλανήτη όπως π.χ. στις ΗΠΑ όπου ισχύουν οι οδηγίες του FDA (Food and Drug Administration). 1

Ωστόσο, είναι γεγονός ότι από την υιοθέτηση της Οδηγίας 98/79/EC το 1998 έως τώρα, έχουν προκύψει καινούργια δεδομένα καθώς έχουν εισαχθεί πολλές νέες εργαστηριακές παράμετροι αλλά και υπάρχει αυξημένη πίεση από ευρωπαϊκές ενώσεις ασθενών και Οργανισμούς Υγείας για βελτιωμένη ποιότητα και ασφάλεια όλων αυτών των αντιδραστηρίων Στην ισχύουσα οδηγία προβλέπονται απαιτήσεις επικύρωσης της χρήσης και αυξημένου στατιστικού ελέγχου της παραγωγής μόνο όσων αντιδραστηρίων χρησιμοποιούνταν για την ανάλυση παραμέτρων κυρίως της Λίστας Α (HIV1/2, HTLV, HBV, HCV, HDV, ABO, Rhesus) και κατά δεύτερο λόγο της Λίστας Β (TORCH panel, HLA A/B/DR, τρισωμία 21, φαινυλοκετονουρία, PSA, παρακλίνια ανίχνευση γλυκόζης). Πολλές επιστημονικές ενώσεις - ανάμεσά τους και η IFCC (International Federation of Clinical Chemistry) και η EFLM (European Federation of Laboratory Medicine) - βοήθησαν μέσω συμμετοχών μελών τους σε ομάδες εργασίας, επιτροπές και διεθνή φόρα στο να ζητηθεί η αναθεώρηση της οδηγίας 98/79/EC και μάλιστα να αναβαθμισθεί πλέον σε Κανονισμό (Regulation), κάτι που θα έχει ως αποτέλεσμα την αυστηροποίηση του θεσμικού πλαισίου. Μετά από δημόσια διαβούλευση με τους ενδιαφερόμενους φορείς που διήρκεσε περίπου 2 χρόνια, η Ευρωπαϊκή επιτροπή (Commission) στις 26/09/2012 δημοσίευσε προτεινόμενο Κανονισμό και ξεκίνησαν οι διαδικασίες για την ψήφισή του. Στο Ευρωπαϊκό Κοινοβούλιο (Europarliament) ψηφίστηκε με σημαντικές τροποποιήσεις στις 24 Οκτωβρίου 2013 και έκτοτε γίνεται διαπραγμάτευση με το Ευρωπαϊκό συμβούλιο (council) που αντιπροσωπεύεται από τις εκάστοτε Προεδρίες ώστε τα 3 μέρη (trilogue) να καταλήξουν σε συμφωνία για το τελικό κείμενο. Έχουν ήδη συμφωνηθεί τα ακόλουθα: Ο προτεινόμενος κανονισμός θα στηρίζει την προτεινόμενη από την GHTF (Global Harmonization Task Force, πλέον το νέο όνομα της είναι International Medical Device Regulators Forum) ορθολογική κατάταξη των αντιδραστηρίων σε 4 κατηγορίες (από το A έως το D) με βάση 7 κανόνες (rules-based classification) που αξιολογούν τον ατομικό και δημόσιο κίνδυνο του νοσήματος που ελέγχει το υπό εξέταση αντιδραστήριο. Η κατάταξη αυτή θα αντιστοιχεί σε αυξανόμενες απαιτήσεις τόσο στον κατασκευαστή για τη διατήρηση συστημάτων ολικής διαχείρισης ποιότητας (total quality management system ή TQM) και για την υποβολή πλήρους φακέλου (Summary Technical Documentation ή STED) με τη σχετική τεκμηρίωση για την αναλυτική και κλινική επικύρωση των παραγόμενων αντιδραστηρίων όσο και στην εκάστοτε ελέγχουσα Αρχή για επιτόπιους ελέγχους της συμμόρφωσης του κατασκευαστή (Conformity assessment). Η αλυσίδα παραγωγής και διακίνησης θα μπορεί να ελέγχεται και με μη-προγραμματισμένες επιθεωρήσεις (unannounced audits). Το κάθε αντιδραστήριο θα φέρει μοναδιαίο αριθμό UDI (unique device identification) με το οποίο θα ταυτοποιείται τόσο το είδος του όσο και η παρτίδα παραγωγής. Η παρακολούθηση προβλημάτων που απορρέουν από τη χρήση των IVD αντιδραστηρίων (post-market surveillance), μέσω του αριθμού UDI θα καταχωρείται στην εξειδικευμένη βάση δεδομένων EudaMed. Επίσης αναφορικά με τα in-house tests που χρησιμοποιούνται για διαγνωστική χρήση κυριαρχεί η ά- ποψη ότι θα επιτρέπονται για όλες τις κατηγορίες αντιδραστηρίων, αρκεί να εκτελούνται από κλινικά εργαστήρια διαπιστευμένα σύμφωνα με το πρότυπο ISO15189 το οποίο απαιτεί πλήρη επικύρωση των in-house μεθόδων που χρησιμοποιούν (EN ISO 15189: 2012). Συμπερασματικά, η προτεινόμενη κατάταξη θα πολλαπλασιάσει σημαντικά τον αριθμό των εργαστηριακών παραμέτρων με αυξημένες απαιτήσεις και κατά συνέπεια και το τελικό κόστος σε κατασκευαστές και εργαστήρια. Στόχος βέβαια του νέου κανονισμού θα πρέπει να είναι ο συγκερασμός των απόψεων του κοινού για αυξημένη ασφάλεια αλλά και των κατασκευαστών, ώστε να συνεχίσουν να παράγουν και να προσφέρουν αντιδραστήρια στην Ευρωπαϊκή αγορά καθώς επίσης και να βελτιώνουν τα προϊόντα τους ή να αναζητούν λύσεις σε σπάνια νοσήματα (Favaloro et al., 2011). 2

Σχήμα 9.1 Χαρακτηριστικό σήμα για CE marking που πρέπει να υπάρχει στην ετικέτα και τα εσώκλειστα ενός IVD αντιδραστηρίου (πρέπει να έχει μέγεθος μικρότερο των 5 mm). 9.2 Γενικές προδιαγραφές των IVDs Τα ΙVD προϊόντα πρέπει να έχουν σχεδιασθεί και κατασκευασθεί με τέτοιο τρόπο ώστε, εφ όσον χρησιμοποιηθούν για την ενδεικνυόμενη χρήση και με τρόπο σύμφωνο με τις οδηγίες του κατασκευαστή, να μη θέτουν σε κίνδυνο ούτε τους ασθενείς αλλά ούτε και το εργαστηριακό προσωπικό που τα χειρίζεται. Εάν υπάρχουν κίνδυνοι για τους ανωτέρω χρήστες αυτοί πρέπει να ελαχιστοποιηθούν και οι χρήστες να ενημερωθούν για τυχόν υπολειπόμενο κίνδυνο ή άλλους περιορισμούς (limitations) στη χρήση τους. Η επίδοση τους δεν πρέπει να επηρεάζεται από τις συνθήκες μεταφοράς και αποθήκευσης (σύμφωνα πάντα με τις οδηγίες του κατασκευαστή). Πρέπει να είναι κατάλληλα προς κλινική χρήση, συνεπώς πρέπει να πληρούν τις προδιαγραφές που έχουν τεθεί για τη διαγνωστική ευαισθησία και τη διαγνωστική ειδικότητα. Πρέπει να επιτυγχάνουν τα αναλυτικά χαρακτηριστικά τα οποία έχει υπολογίσει και έχει αναφέρει ο κατασκευαστής στον φάκελο STED, ώστε να εκδώσει το πιστοποιητικό συμμόρφωσης και να πάρει το σήμα CE για IVD (Declaration of conformity). Τα χαρακτηριστικά αυτά πρέπει να αναφέρονται στα εσώκλειστα φυλλάδια των προϊόντων αυτών με τις οδηγίες χρήσης (θα αναφερθούν εκτενέστερα στις επόμενες Ενότητες 9.3-9.4). Η ιχνηλασιμότητα τους (όπου υπάρχει μετρητική ιδιότητα) πρέπει να αναφέρεται σε πρότυπες μεθόδους ή υλικά αναφοράς υψηλής τάξης, όπου υπάρχουν (οι έννοιες αυτές θα αναφερθούν εκτενέστερα στο επόμενο Κεφάλαιο 10). Πιο ειδικά τα ΙVD προϊόντα πρέπει: Να είναι σχεδιασμένα ώστε να φέρουν κατάλληλες φυσικοχημικές ιδιότητες κατά την παραγωγή τους για να μη διαρρέουν και να μην επιμολύνουν τους μεταφορείς και το προσωπικό που τα αποθηκεύει και τα χειρίζεται. Όταν περιέχουν μικροοργανισμούς ή άλλα βιολογικά υλικά, να έχουν ελάχιστο κίνδυνο μετάδοσης λοίμωξης. Πρέπει να κατασκευάζονται με ελεγχόμενες περιβαλλοντικά συνθήκες σε καθαρές εγκαταστάσεις. Να χρησιμοποιούνται επικυρωμένες μέθοδοι για την αποστείρωση όσων ΙVD προϊόντων έχουν χαρακτηρισθεί ανάλογα και φέρουν την αντίστοιχη σήμανση. Πρέπει να είναι εργονομικά κατασκευασμένα και να μην επηρεάζεται η απόδοσή τους από εξωτερικούς παράγοντες όπως πίεση, ηλεκτρομαγνητικά πεδία, υγρασία και θερμοκρασία. Να είναι, κατά το δυνατόν, φιλικά προς το περιβάλλον κατά την ασφαλή απόρριψή τους. Όταν είναι κατασκευασμένα να εκπέμπουν ραδιενέργεια, η ποσότητα αυτής πρέπει να είναι ελεγχόμενη και οι χρήστες να είναι ενήμεροι για το είδος της και τους τρόπους προστασίας τους. Πρέπει τα ΙVD προϊόντα με ραδιενεργά υλικά να φέρουν εμφανώς την ειδική σήμανση. Να είναι ασφαλή, όταν συνδέονται με το ηλεκτρικό ρεύμα (για την αποφυγή ηλεκτροπληξιών) ή με το υ- δραυλικό δίκτυο ή με αέριο (όπου χρειάζεται). Ιδιαίτερη φροντίδα πρέπει να υπάρχει, ώστε να μην επηρεάζονται ηλεκτρομαγνητικά άλλες συσκευές στον ίδιο χώρο. Οι δονήσεις και ο θόρυβος που προκαλούν πρέπει να είναι ο ελάχιστος δυνατός. Εάν αποτελούνται από κινητά μέρη και υπάρχουν μηχανικοί κίνδυνοι κατά τη συναρμολόγηση ή την αποσυναρμολόγηση τους (πχ. κατά τη συντήρησή τους), οι κατάλληλες προφυλάξεις πρέπει να είναι γνωστές. 3

9.3 Ετικέτα και εσώκλειστα φυλλάδια των IVDs Κάθε ΙVD προϊόν πρέπει να συνοδεύεται από επαρκείς πληροφορίες εκ μέρους του κατασκευαστή η οποία να εμπεριέχεται στην ετικέτα και στα εσώκλειστα φυλλάδια με τις οδηγίες χρήσης. Η χρήση συμβόλων, σημάτων κινδύνου ή/και χρωματικής επισήμανσης είναι υποχρεωτική και γίνεται με βάση σχετικά εναρμονισμένα πρότυπα (harmonized standards). Η ετικέτα ενός ΙVD προϊόντος πρέπει να περιέχει τα ακόλουθα: όνομα και διεύθυνση του κατασκευαστή και, εάν πρόκειται για εισαγόμενο είδος στην Ευρωπαϊκή Ένωση, να περιλαμβάνει επιπλέον και το όνομα και τη διεύθυνση του εξουσιοδοτημένου αντιπροσώπου, ταυτοποίηση του είδους και του περιεχομένου, ένδειξη STERILE για αποστειρωμένο είδος ή αναφορά σε μικροβιολογικό φορτίο (όπου απαιτείται), αριθμό παρτίδας παραγωγής του αντιδραστηρίου (lot number) ή τον σειριακό αριθμό (serial number) του εξοπλισμού, ημερομηνία λήξεως ασφαλούς χρήσης του, συνθήκες χειρισμού και αποθήκευσής του, τυχόν προειδοποιητικά σύμβολα ή ενδείξεις χρήσης. Οι οδηγίες χρήσης στο εσώκλειστο φυλλάδιο ενός ΙVD προϊόντος πρέπει να περιλαμβάνουν τα κάτωθι: δεδομένα από την ετικέτα εκτός του αριθμού παρτίδας ή εξοπλισμού και της ημερομηνία λήξεως, ημερομηνία και αριθμό έκδοσης (version) της οδηγίας χρήσης, σκοπό χρήσης και περιορισμούς (όπου υπάρχουν), κατάλογο περιεχομένων με αναφορά σε συγκεντρώσεις ουσιών, (όπου χρειάζεται), συνθήκες αποθήκευσης και χρόνο σταθερότητας, όταν ανοιχθεί η συσκευασία, προφυλάξεις από μηχανικούς ή βιολογικούς ή ραδιενεργούς κινδύνους, τι άλλο είδος εξοπλισμού ή τι άλλα αντιδραστήρια απαιτούνται, είδος των δειγμάτων για τα οποία είναι κατάλληλο, αρχή της μεθόδου, τον τρόπο συναρμολόγησης ή ελέγχου του εξοπλισμού ή της ανασύστασης διαλυμάτων ή της αραίωσης των δειγμάτων ή της αποστείρωσης υλικών (όπου απαιτούνται), πρωτόκολλο εργασίας, τυχόν μαθηματική σχέση που απαιτείται για την εξαγωγή του αναλυτικού αποτελέσματος ή τυχόν λογισμικό το οποίο απαιτείται, εάν απαιτείται ειδική εκπαίδευση για το προσωπικό που θα το χειρισθεί, τρόπο και συχνότητα βαθμονόμησης, ιχναλησιμότητα της μεθόδου με πιστοποιημένο υλικό αναφοράς ή σύγκριση με μέθοδο αναφοράς (θα αναφερθεί στο Kεφάλαιο 10), αναλυτικά χαρακτηριστικά της μεθόδου (θα αναφερθούν στην Ενότητα 9.4), οδηγία για τον εσωτερικό έλεγχο ποιότητας, τιμές αναφοράς (θα αναφερθούν στην Ενότητα 9.5), τρόπο ασφαλούς απόρριψης των αποβλήτων ή και ανακύκλωσης, όπου είναι αυτό δυνατό, προφυλάξεις για τυχόν έκθεση σε εξωτερικούς παράγοντες, όπως πίεση, ηλεκτρομαγνητικά πεδία, υγρασία και θερμοκρασία, οδηγίες για το τι χρειάζεται να γίνει σε περίπτωση που η συσκευασία έχει πειραχθεί ή αλλοιωθεί, συχνότητα συντήρησης. Αυξημένες απαιτήσεις υπάρχουν για τα ΙVD προϊόντα αυτοεξέτασης (self-testing) καθώς αποτελούν μια ιδιαίτερη κατηγορία των παρακλίνιων (POCT βλ. Κεφάλαιο 7) προϊόντων: εκτελούνται από τον κοινό άνθρωπο στην οικία του και όχι από εκπαιδευμένο εργαστηριακό προσωπικό. Συνεπώς πρέπει να είναι σχεδιασμένα έτσι, ώστε η επίδοσή τους να μην εξαρτάται ιδιαίτερα από την τεχνική και το περιβάλλον του χρήστη. 4

Πρέπει να είναι επισημασμένα με ανάλογη ετικέτα και οι οδηγίες χρήσης να είναι απλές και ξεκάθαρες ώστε να αποφεύγονται λάθη στο χειρισμό και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Όπου είναι εφικτό, πρέπει να υπάρχουν τρόποι ελέγχου από το χρήστη, ώστε να εξασφαλιστεί ότι εκτελεί κατάλληλα τη διαδικασία ανάλυσης. Οι οδηγίες χρήσης πρέπει να ερμηνεύουν ένα αποτέλεσμα ως θετικό ή αρνητικό ή απροσδιόριστο και να υποδεικνύουν τη πιθανότητα ψευδώς αρνητικού ή θετικού αποτελέσματος. Πρέπει να είναι σαφές στον χρήστη ότι δεν μπορεί να λάβει ιατρικές αποφάσεις, εάν δεν επικοινωνήσει με τον θεράποντα ιατρό και ότι, εάν το προϊόν χρησιμοποιείται για παρακολούθηση θεραπείας, ότι δεν πρέπει να αλλάξει το θεραπευτικό του σχήμα, εάν δεν είναι κατάλληλα εκπαιδευμένος. 9.4 Αναλυτικά χαρακτηριστικά των ΙVD αντιδραστηρίων Τα αναλυτικά χαρακτηριστικά των IVD προϊόντων που έχουν μετρητική ιδιότητα (measuring function) όπως π.χ. τα kit αντιδραστηρίων, λαμβάνονται από δεδομένα επικύρωσης (validation) η οποία εκτελείται από τους κατασκευαστές. Ελέγχονται δε, σύμφωνα με τις διεθνείς ισχύουσες προδιαγραφές. Είναι τα ακόλουθα τα οποία πρέπει και να αναφέρονται στα εσώκλειστα φυλλάδια (Λεϊμονή, 2006ˑ Κουππάρης, 2008ˑ EURACHEM/LGC, 1998ˑ Μητρόπουλος, 2003ˑ Thompson et al., 2002ˑ Παναγιωτάκης, 2003): 1) Μεθοδολογικά χαρακτηριστικά (methodology characteristics): - Αναλυτική ευαισθησία (analytical sensitivity): να μην συγχέεται με το όριο ανίχνευσης, είναι ουσιαστικά η κλίση της καμπύλης αναφοράς σήματος (signal) προς συγκέντρωση C (ds/dc) ή μάζα μετρούμενης ουσίας. - Αναλυτική ειδικότητα (analytical specificity): τα αντιδραστήρια ανιχνεύουν μόνο τη ζητούμενη παράμετρο και δεν έχουν διασταυρούμενη δραστικότητα (cross reactivity) με άλλες παρεμφερείς ή όχι ουσίες. Εάν υπάρχει παρεμβολή (interference) με ουσίες παρεμποδιστές, αυτή πρέπει να αναφέρεται. 2) Χαρακτηριστικά επίδοσης (performance characteristics): Πιστότητα (precision): μετράει τη διασπορά επαναλαμβανόμενων αποτελεσμάτων σε ένα δείγμα και αντανακλά το τυχαίο σφάλμα της μεθόδου (random error) όταν η μέθοδος εκτελείται κάτω από ρητά προκαθορισμένες συνθήκες. Μέτρα της μη-πιστότητας (imprecision) αποτελούν η τυπική απόκλιση SD (Standard Deviation) και η σχετική τυπική απόκλιση RSD (Relative Standard Deviation) ή αλλιώς, ο συντελεστής μεταβλητότητας CV (Coefficient of Variation) όπως αυτός ορίζεται στην Εξίσωση 9.1: CV = SD 100 Μέσος όρος μετρήσεων (Εξίσωση 9.1) Υποσύνολα αποτελούν: α) η επαναληπτικότητα r (repeatability) που εκτελείται σε βραχύ χρονικό διάστημα συνήθως εντός της ίδιας αναλυτικής σειράς (within-run) ή τουλάχιστον εντός της ίδιας ημέρας (within-day) και β) η ενδιάμεση αναπαραγωγιμότητα R (intermediate reproducibility) που εκτελείται μεταξύ διαφορετικών αναλυτικών σειρών ή ημερών (between-run, between days). Αναμένεται ότι SD R>SD r. Συστήνεται να εκτελείται σε βάθος χρόνου (έως 3-6 μήνες) εντός του ίδιου εργαστηρίου με διαφορετικές παρτίδες αντιδραστηρίου και διαφορετικούς χρήστες. Για τη λήψη δεδομένων πιστότητας χρησιμοποιούνται 2 ή 3 επίπεδα συγκεντρώσεων της υπό εξέταση εργαστηριακής παραμέτρου (φυσιολογικό, άνω- ή κάτω του φυσιολογικού) σε συνθετικά δείγματα ελέγχου (synthetic controls) ή/και σε πραγματικά δείγματα ασθενών ή υγιών μαρτύρων. Με στατιστική ανάλυση ANOVA από τα δεδομένα σε διαφορετικά επίπεδα συγκεντρώσεων μπορεί να ληφθεί μια μόνο τιμή πιστότητας, η συνδυασμένη πιστότητα (combined precision). Με την αναπαραγωγιμότητα σχετίζεται και το χαρακτηριστικό της αντοχής (ruggedness) της μεθόδου, όταν εκτελείται η μέτρηση με διαφορετικές παρτίδες αντιδραστηρίου σε διαφορετικά αναλυτικά συστήματα ή/και εργαστήρια με διαφορετικούς χειριστές. Επίσης όταν λαμβάνονται δεδομένα πιστότητας με μικρές προσχεδιασμένες μεταβολές του πρωτοκόλλου εργασίας (π.χ. μεταβολή στις συνθήκες αποθήκευσης, ph, θερμοκρασίας, χρόνου επώασης κλπ.) τότε έχουμε εικόνα της ανθεκτικότητας (robustness) της μεθόδου. Ως προδιαγραφή αποδοχής της πιστότητας του αντιδραστηρίου, συνήθως χρησιμοποιείται, εάν υπάρχει, η βιολογική μεταβλητότητα (biological variation) η οποία εκφράζει την περιοδική και τυχαία διακύμανση γύρω από μια πραγματική τιμή in vivo. Τέτοια δεδομένα βιολογικής μεταβλητότητας μπορούν να ανευρεθούν 5

στη βιβλιογραφία (Ricos et al., 1999) ή στο διαδίκτυο (π.χ. στον διαδικτυακό τόπο www.westgard.com). Έτσι ορίζεται ότι η μέγιστη μη-πιστότητα πρέπει να είναι CV max 0,5 CV bw όπου bw είναι η ενδο-ατομική βιολογική μεταβλητότητα (inter-individual, b w) στο ίδιο άτομο με τη πάροδο του χρόνου. Όταν δεν υπάρχουν δεδομένα βιολογικής μεταβλητότητας, μπορεί να χρησιμοποιηθεί και η εξίσωση Horwitz (Εξίσωση 9.2) όπου C είναι η συγκέντρωση της μετρούμενης ουσίας: CV 2 (1 0,5logC) (Εξίσωση 9.2) Ορθότητα (trueness): είναι η διαφορά του μέσου όρου των μετρήσεων από την αληθή τιμή λόγω συστηματικού σφάλματος της μεθόδου (systematic error) όταν αυτή εκτελείται σύμφωνα με τις οδηγίες εργασίας. Μέτρα της μη-ορθότητας αποτελούν συνήθως η απόλυτη διαφορά ή αλλιώς μεροληψία (bias) ή η εκατοστιαία διαφορά (Β%). Ιδανικά λαμβάνεται με πιστοποιημένα υλικά αναφοράς ειδάλλως με κατάλληλα δείγματα εσωτερικού ελέγχου controls -είτε εμπορικώς διαθέσιμα είτε του ίδιου του kit αντιδραστηρίων- που διαθέτουν τιμή στόχο. Το z-score ορίζεται με βάση την Εξίσωση 9.3 ως: z = Αποτέλεσμα μεθόδου Τιμή στόχος control SDμετρήσεων (Εξίσωση 9.3) Επίσης εκτίμηση της ορθότητας λαμβάνεται και από την επίδοση της μεθόδου σε συμμετοχή σε ενδοεργαστηριακές συγκρίσεις (ring trials, interlaboratory comparisons) και σχήματα ικανότητας (proficiency testing) ή εξωτερικού ελέγχου ποιότητας (EQAs, external quality assessments). Στην περίπτωση αυτή, ορίζεται αντίστοιχα ο δείκτης SDI (standard deviation index), όπου στην εξίσωση 9.2 αντί της τιμής στόχου χρησιμοποιείται η τιμή consensus, που λαμβάνεται από στατιστική επεξεργασία του συνόλου των εργαστηρίων (μετά την αφαίρεση των ακραίων τιμών, outliers). Και οι δύο δείκτες υποδεικνύουν το ίδιο: την απόσταση σε τιμές τυπικής απόκλισης που φέρει το αποτέλεσμα της μεθόδου από την εκάστοτε ιδανική (ή αληθή) τιμή. Η μέθοδος που χρησιμοποιεί το IVD αντιδραστήριο είναι άριστη όταν οι δείκτες z ή SDI είναι < 1, ενώ είναι οριακή καλή, όταν είναι μεταξύ 2 και 3 και μη αποδεκτή, όταν υπερβαίνει το 3. Ένας άλλος τρόπος ελέγχου της ορθότητας είναι η ανάκτηση (recovery) όταν προστίθεται μικρή ποσότητα μετρούμενης ουσίας σε υψηλή συγκέντρωση σε ένα λευκό (τυφλό) ή θετικό δείγμα (spiking). Συνίσταται η ανάμειξη 9:1 ενός δείγματος χαμηλής συγκέντρωσης και ενός βαθμονομητή υψηλής συγκέντρωσης καθώς με τον τρόπο αυτό ελέγχεται και η ύπαρξη επίδρασης του υποστρώματος (αλλιώς, της μήτρας) του δείγματος (matrix effect). Η ανάκτηση είναι άριστη όταν είναι μεταξύ 95-105%, ενώ είναι πολύ καλή, όταν είναι μεταξύ 90-110%. Ως προδιαγραφή για την αποδοχή της ορθότητας του αντιδραστηρίου (εφ όσον υπάρχουν δεδομένα βιολογικής μεταβλητότητας) ορίζεται το μέγιστο bias (%) στην εξίσωση 9.4 όπου bg είναι η διατομική βιολογική μεταβλητότητα (intra-individual, b g) μεταξύ διαφόρων ατόμων: Max Bias (%) < 0,25 (CVbw) 2 + (CVbg) 2 (Εξίσωση 9.4) Ακρίβεια (accuracy): είναι το άθροισμα της ορθότητας και της πιστότητας της μεθόδου που θα ληφθεί από μία μόνο μέτρηση και ουσιαστικά δείχνει την αξιοπιστία της. Στο Σχήμα 9.2 δίνονται παραδείγματα: α) ορθής μεθόδου χωρίς όμως καλή πιστότητα β) μη ορθής μεθόδου χωρίς καλή πιστότητα γ) μη ορθής μεθόδου με καλή πιστότητα και τέλος δ) αξιόπιστης μεθόδου με καλή ακρίβεια: ορθή και με καλή πιστότητα. 6

Σχήμα 9.2 Παραδείγματα μεθόδων με διαφορετική ακρίβεια σε σχέση με την ορθότητα και την πιστότητα. Μέτρο της ανακρίβειας (inaccuracy) είναι το μέγιστο ολικό αναλυτικό σφάλμα που ισούται με το άθροισμα του συστηματικού και του τυχαίου σφάλματος. Στο Σχήμα 9.3 φαίνονται διαγραμματικά όλες οι τιμές που μπορεί να πάρει το σφάλμα σε μέτρηση παραμέτρου όπου το τυχαίο σφάλμα διαθέτει κανονική κατανομή κατά Gauss: τότε το μέγιστο τυχαίο σφάλμα για διάστημα εμπιστοσύνης 95% είναι δύο φορές η τυπική απόκλιση και εάν προσθέσουμε και το συστηματικό σφάλμα λαμβάνουμε το ολικό αναλυτικό σφάλμα (συμβαίνει όταν οι δύο συνιστώσες του σφάλματος δρουν προς την αντίθετη κατεύθυνση). Σχήμα 9.3 Ολικό σφάλμα σε μετρήσεις με κανονική κατανομή. Έχει ορισθεί ως προδιαγραφή για την αποδοχή της ακρίβειας ότι το αποδεκτό ολικό σφάλμα TE a (Total allowable error) πρέπει να πληροί την Εξίσωση 9.5: 7

ΤΕa < μέγιστο επιτρεπτό συστηματικό σφάλμα + 1,65 (μεγίστο επιτρεπτό τυχαίο σφάλμα) (Εξίσωση 9.5) Όριο ανίχνευσης (limit of detection ή LOD) Μπορεί να ορισθεί με στατιστικό τρόπο μετά από επαναλαμβανόμενες μετρήσεις ενός λευκού (τυφλού, blank) δείγματος και ενός πολύ αραιού δείγματος (ή control) με πείραμα επαναληπτικότητας. Στην αρχή υπολογίζεται το LOB (limit of blank) με μετρήσεις του λευκού (Εξίσωση 9.6): LOB = Μέσος όρος μετρήσεων (blank) + 1,645 SDblank (Εξίσωση 9.6) Κατόπιν στην Εξίσωση 9.7 υπολογίζεται το LOD με αντικατάσταση από την Εξίσωση 9.6 και λόγω του ότι SD blank SD αραιού προκύπτει: LOD = LOB + 1,645 SDαραιού Μέσος όρος μετρήσεων (blank) + 3,3 SDαραιού (Εξίσωση 9.7) Για ευκολία ορίζουμε LOD = 3,3 SD αραιού, καθώς ο μέσος όρος του λευκού δείγματος μπορεί να θεωρηθεί μηδέν. Εναλλακτικά, με εμπειρικό τρόπο και με μέτρηση πολύ αραιών δειγμάτων ορίζεται το LOD ως η συγκέντρωση της μετρούμενης παραμέτρου η οποία μπορεί να ανιχνευθεί στο ~95% των μετρήσεων (π.χ. 19 στις 20 προσπάθειες) ή ακόμη καλλίτερα, με στατιστική probit ανάλυση. Το όριο ανίχνευσης είναι ένα πολύ χρήσιμο αναλυτικό χαρακτηριστικό στη σύγκριση ικανότητας διαφορετικών μεθόδων και ιδιαίτερα σε αυτές τις παραμέτρους όπου υπάρχει μεγάλη κλινική σημασία. Απαιτείται η αναφορά του από τον κατασκευαστή και στις ποιοτικές ή ημιποσοτικές μεθόδους. Όριο ποσοτικοποίησης ( limit of quantification ή LOQ ή Lower limit of quantification ή LLQ): Ορίζεται με στατιστικό τρόπο ως 3,3 LOD (συνεπώς με βάση τα ανωτέρω: LOQ = ~10 SD αραιού) Εναλλακτικά, ορίζεται ως η χαμηλότερη συγκέντρωση της παραμέτρου όπου η μέθοδος ακόμη διαθέτει ικανοποιητικό CV (π.χ. 20% στις ανοσοχημικές δοκιμασίες). Γραμμικότητα (linearity) μεθόδου και αναλυτικό εύρος μέτρησης (measuring range) Εκτελείται με τουλάχιστον 6 πρότυπα διαλύματα ή βαθμονομητές (calibrators) ή δείγματα σε σειριακή αραίωση πυκνού βαθμονομητή, εις τριπλούν (σε τουλάχιστον 5 καμπύλες αναφοράς). Αφού αποκλεισθούν οι ακραίες τιμές, γίνεται έλεγχος με γραμμική παλινδρόμηση (linear regression simple ή κατά Deming). Όταν r 2 0,99 το μοντέλο γραμμικότητας είναι καλό και γίνονται αποδεκτά όλα τα σημεία της καμπύλης αναφοράς και ορίζεται το αναλυτικό εύρος μέτρησης (measuring range ή αλλιώς, analytical measuring interval, AMR ή απλά measuring interval) ως: LOQ όριο γραμμικότητας (μέγιστος αποδεκτός βαθμονομητής). Διαφορετικά, γίνεται απόρριψη των σημείων μη-γραμμικότητας και μικραίνει το εύρος μέτρησης. Σημειώνεται ότι, όταν γίνεται αραίωση των δειγμάτων, προκύπτει και το αναφερόμενο εύρος (reportable range) το οποίο θα είναι πάντοτε ευρύτερο του AMR. Για τα τελευταία αυτά αναλυτικά χαρακτηριστικά συνήθως δεν υπάρχουν προδιαγραφές, όμως οι κατασκευαστές των IVD αντιδραστηρίων οφείλουν να τα μετρήσουν και να τα αναφέρουν. Επίσης αναφέρουν και τη σύγκριση της μεθόδου (method comparison) τους με πρότυπη μέθοδο αναφοράς ή με άλλη παλαιότερη διαθέσιμη και αποδεκτή διεθνώς μέθοδο. Όταν η νέα μέθοδος είναι ποσοτική με ευρύ πεδίο τιμών μετράται ένας μεγάλος αριθμός δειγμάτων (> 40, εις διπλούν) και με τις δύο μεθόδους και γίνεται συγκριτικό διάγραμμα και στατιστική ανάλυση με γραμμική παλινδρόμηση (κατά Deming ή Passing-Bablock) (Linnet, 1998ˑ Passing Bablok, 1984). Καταρχήν, ελέγχεται εάν υπάρχει αποδεκτό εύρος τιμών (r > 0,975). Η συμφωνία των μεθόδων ελέγχεται ως εξής: δεν υπάρχει αναλογική μεροληψία όταν η κλίση (slope) της παλινδρόμησης είναι μεταξύ 8

0,95-1,05 ενώ δεν υπάρχει σταθερή μεροληψία όταν εκτελώντας t-test της τεταγμένης του κάθετου άξονα (intercept) με το μηδέν υπολογίζεται ότι το p> 0,5. Εναλλακτικά, μπορεί να γίνει και διάγραμμα διαφοράς τιμών (Difference plot κατά Bland-Altman) μεταξύ των δύο μεθόδων (Bland Altman, 1986). Όταν η νέα μέθοδος είναι ποσοτική με μικρό εύρος τιμών, μπορεί και να γίνει απλά ένα t-test κατά ζεύγη (paired). Όταν η νέα μέθοδος είναι ποιοτική, τότε μπορεί να υπολογιστεί το ποσοστό συμφωνίας θετικών/αρνητικών (% Concordance) και να υπολογισθεί ο συντελεστής kappa (> 0,8 όταν υπάρχει μεγάλη συμφωνία) ή να γίνει Mc Nemar s στατιστικό τεστ. 9.5 Προσδιορισμός τιμών αναφοράς Η ερμηνεία των αποτελεσμάτων των κλινικών εργαστηρίων υποβοηθείται σημαντικά από την ύπαρξη τιμών αναφοράς (reference values) ανά παράμετρο. Τα όρια των τιμών αναφοράς (reference limits) είναι συνήθως δύο και το διάστημα μεταξύ τους καλείται διάστημα ή εύρος τιμών αναφοράς (reference interval ή range). Σε ορισμένες παραμέτρους δεν υπάρχουν τιμές αναφοράς αλλά όρια αποφάσεων (decision limits) για τη λήψη θεραπείας (π.χ. στη χοληστερόλη, στη γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη κ.λπ.). Δεν πρέπει να παραβλεφθεί το γεγονός ότι η παρακολούθηση σημαντικών μεταβολών μιας παραμέτρου ακόμη και εντός του διαστήματος αναφοράς μπορεί να υποδηλώνει αρχή νοσήματος (συνεπώς παλαιότερα καλούνταν λανθασμένα φυσιολογικές τιμές). Προκύπτουν από στατιστική επεξεργασία των μετρήσεων της παραμέτρου σε «φαινομενικά υγιή» πληθυσμό αναφοράς (reference population) ο οποίος είναι κατάλληλα επιλεγμένος (Dybkaer, 1982). Ο προσδιορισμός τους ακολουθεί τα παρακάτω βήματα: 1. Απαριθμούνται όλοι οι παράγοντες βιολογικής και αναλυτικής μεταβλητότητας για την υπό μέτρηση παράμετρο με βάση τη βιβλιογραφία. 2. Με βάση την ανωτέρω λίστα καθορίζονται κριτήρια αποκλεισμού (exclusion criteria) και κριτήρια διαχωρισμού του πληθυσμού αναφοράς (partition criteria). Στα πρώτα μπορεί να ανήκουν π.χ. μια οξεία ή χρόνια παθολογική κατάσταση, η χρόνια λήψη φαρμάκων, η παχυσαρκία, η εγκυμοσύνη, το κάπνισμα, η μακροχρόνια κατανάλωση αλκοόλ ή ναρκωτικών, η εντατική άσκηση κλπ. Τα δεύτερα είναι συνήθως το φύλο, η ηλικία, η φυλή κ.λπ. καθώς αυτά αποτελούν συνήθως παράγοντα για διαφορετικά όρια τιμών αναφοράς ή ακόμη και για αποκλεισμό των συγκεκριμένων ατόμων. 3. Έγγραφη συγκατάθεση των συμμετεχόντων στον προσδιορισμό των τιμών αναφοράς και συμπλήρωση κατάλληλου ερωτηματολογίου. 4. Με βάση τα κριτήρια αποκλεισμού και τις απαντήσεις στο ερωτηματολόγιο, αποκλεισμός ορισμένων συμμετεχόντων και προετοιμασία των υπολοίπων για τη σωστή δειγματοληψία. 5. Λήψη των δειγμάτων και απαρέγκλιτη τήρηση των κατάλληλων προαναλυτικών συνθηκών για τη συλλογή, το χειρισμό, τη μεταφορά και την αποθήκευσή τους. 6. Ανάλυση των δειγμάτων και έλεγχος του ιστογράμματος των αποτελεσμάτων ώστε να απαλειφθούν τυχόν ακραίες τιμές. 7. Στατιστική ανάλυση είτε α) με παραμετρικό τρόπο όταν η κατανομή των μετρούμενων τιμών ακολουθεί την κανονική κατανομή (ή την ακολουθεί μετά από κατάλληλο μετασχηματισμό) και χρήση του μέσου όρου και της τυπικής απόκλισης για την εύρεση του εύρους των τιμών αναφοράς με κάλυψη του 95% του πληθυσμού, είτε β) με μη-παραμετρικό τρόπο. Στη δεύτερη περίπτωση απαιτούνται τουλάχιστον 120 δείγματα (όμως σε μερικές περιπτώσεις όπως π.χ. σε παιδιατρικό πληθυσμό ή σε ιδιαίτερα ακριβές εξετάσεις ή σε ιδιαίτερα δύσκολες ως προς τη δειγματοληψία εξετάσεις, ο αριθμός αυτός δεν είναι δυνατόν να συμπληρωθεί, οπότε συνίσταται να είναι τουλάχιστον 40). Με αυτόν τον τρόπο ευρίσκεται η διάμεσος τιμή και ορίζεται το διάστημα τιμών αναφοράς ως το διάστημα μεταξύ 2,5 ου και 97,5 ου εκατοστημορίου. Για ορισμένες παραμέτρους όπως π.χ. τους καρκινικούς ή τους καρδιακούς δείκτες το διάστημα αυτό μπορεί να διευρυνθεί π.χ. μεταξύ 1 ου και 99 ου εκατοστημορίου. Το διάστημα εμπιστοσύνης (confidence interval) για κάθε όριο αναφοράς δεν πρέπει να ξεπερνάει το 1/5 του διαστήματος των τιμών αναφοράς. Η μεταφορά τιμών αναφοράς για την ίδια παράμετρο από μια αναλυτική μέθοδο σε μια άλλη ή σε άλλο αναλυτικό σύστημα στο εργαστήριο μπορεί να γίνει με ένα από τους ακόλουθους δύο τρόπους: Α) Ουσιαστικά με σύγκριση μεθόδων ή αναλυτικών συστημάτων με μετρήσεις ίδιων δειγμάτων (όχι απαραίτητα δειγμάτων από πληθυσμό αναφοράς) και με τον τρόπο που προαναφέρθηκε στο 9.4: επισκοπείται η 9

γραμμική παλινδρόμηση και εάν η κλίση είναι κοντά στο 1 και εντός προκαθορισμένων ορίων, τότε μπορεί να εκληφθεί ως συμπέρασμα ότι δεν υπάρχει συστηματική διαφορά. Συνεπώς μπορεί να γίνει η μεταφορά των τιμών αναφοράς. Β) με σύγκριση των πληθυσμών αναφοράς είτε με βιβλιογραφικά και γεωγραφικά, εθνολογικά κλπ. κριτήρια είτε με επαλήθευση των τιμών αναφοράς ως εξής: γίνεται επιλογή 20 δειγμάτων πληθυσμού αναφοράς με ίδια κριτήρια αποκλεισμού και διαχωρισμού και, εάν μετά την απαλοιφή ακραίων τιμών 2 τιμές μετρήσεων εντοπίζονται εκτός του διαστήματος αναφοράς, τότε η μεταφορά των τιμών αναφοράς γίνεται αποδεκτή. Εάν είναι 3 ή 4 τα δείγματα εκτός του διαστήματος αναφοράς, τότε επαναλαμβάνεται η διαδικασία για άλλα 20 δείγματα. Εάν είναι πάνω από 4, τότε πρέπει να ξεκινήσει από την αρχή η πλήρης διαδικασία προσδιορισμού των τιμών αναφοράς. 10

Αναφορές 1. ΚΟΥΠΠΑΡΗΣ, Μ. (2008) Σημειώσεις Χημειομετρίας. Αθήνα: Πανεπιστήμιο Αθηνών. 2. ΛΕΪΜΟΝΗ, Ε. (2006; pp. 32-40) Επαλήθευση Αναλυτικών Μεθόδων Κλινικών Εργαστηρίων. In: Πιστοποίηση-Διαπίστευση Κλινικών Εργαστηρίων, 1ο Σεμινάριο Συνεχιζόμενης Εκπαίδευσης, Αθήνα: Ελληνική Εταιρεία Κλινικής Χημείας-Κλινικής Βιοχημείας. 3. ΜΗΤΡΟΠΟΥΛΟΣ, Σ. (2003; pp.86-98) Χαρακτηριστικά και αξιολόγηση αναλυτικών μεθόδων. In: Αναλυτική Αξιολόγηση Εργαστηριακών Μετρήσεων 1 ο Εκπαιδευτικό Σεμινάριο, Ed. Αθήνα: Ελληνική Εταιρεία Κλινικής Χημείας-Κλινικής Βιοχημείας. 4. ΠΑΝΑΓΙΩΤΑΚΗΣ, Ο. (2003; pp.52-85) Αναλυτικά σφάλματα και υπολογισμός τους. In: Αναλυτική Αξιολόγηση Εργαστηριακών Μετρήσεων. 1 ο Εκπαιδευτικό Σεμινάριο. Αθήνα: Ελληνική Εταιρεία Κλινικής Χημείας-Κλινικής Βιοχημείας. 5. FAVALORO, E., PLEBANI, M., LIPPI, G. (2011) Regulation of in vitro diagnostics (IVDs) for use in clinical diagnostic laboratories: towards the light or dark in clinical laboratory testing? Clin Chem Lab Med, 49, p. 1965-73. 6. RICOS, C., ALVAREZ, V., CAVA F., et al. (1999) Current databases on biological variation: pros, cons and progress. Scand J Clin Lab Invest, 59, p. 491-500. 7. THOMPSON, M., ELLISON, SL., WOOD, R. (2002) Harmonized guidelines for single-laboratory validation of methods of analysis. Pure Appl Chem, 74, p. 835-55. 8. Directive 98/79/EC of the European Parliament and of the Council of 27 October 1998 on in vitro diagnostic medical devices. Official Journal of the European Communities 1998; L331: 1-37. 9. EN ISO 15189: 2012 Medical laboratories Requirements for quality and competence. 3rd ed. 10.EURACHEM/LGC. (1998) The fitness for purpose of analytical methods. 11