ΜΕΛΗ ΕΠΤΑΜΕΛΟΥΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ 1. Παπαπετροπούλου Μαρία Επιβλέπουσα Καθηγήτρια Καθηγήτρια Περιβαλλοντικής Μικροβιολογίας Τµήµατος Ιατρικής, Παν

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΙΑΤΡΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΥΓΙΕΙΝΗΣ Πρόγραµµα Μεταπτυχιακών Σπουδών στις Κλινικές και Κλινικοεργαστηριακές Ειδικότητες Μαρία Παπαπετροπούλου Καθηγήτρια Περιβαλλοντικής Μικροβιολογίας Προσδιορισµός της ανθρώπινης ή µη προέλευσης του κολοβακτηριδίου που αποµονώνεται από το υδάτινο περιβάλλον µε καλλιεργητικές και µοριακές τεχνικές Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΑΝΑΗ ΒΕΝΙΕΡΗ Βιολόγος ΠΑΤΡΑ 2005

ΜΕΛΗ ΕΠΤΑΜΕΛΟΥΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ 1. Παπαπετροπούλου Μαρία Επιβλέπουσα Καθηγήτρια Καθηγήτρια Περιβαλλοντικής Μικροβιολογίας Τµήµατος Ιατρικής, Παν/µίου Πατρών 2. Βανταράκης Απόστολος (Μέλος Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής) Επίκ. Καθηγητής Υγιεινής Τµήµατος Ιατρικής, ηµοκριτείου Παν/µίου Θράκης 3. Σπηλιοπούλου Ίριδα (Μέλος Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής) Αναπλ. Καθηγήτρια Μικροβιολογίας Τµήµατος Ιατρικής, Παν/µίου Πατρών 4. Αθανασιάδου Αγλαΐα (Μέλος Επταµελούς Επιτροπής) Καθηγήτρια Γενικής Βιολογίας Τµήµατος Ιατρικής, Παν/µίου Πατρών 5. Ηλιοπούλου Ιωάννα (Μέλος Επταµελούς Επιτροπής) Καθηγήτρια Ζωολογίας Τµήµατος Βιολογίας, Παν/µίου Πατρών 6. Παληογιάννη Φωτεινή (Μέλος Επταµελούς Επιτροπής) Αναπλ. Καθηγήτρια Μικροβιολογίας Τµήµατος Ιατρικής, Παν/µίου Πατρών 7. Λεοτσινίδης Μιχάλης (Μέλος Επταµελούς Επιτροπής) Επικ. Καθηγητής Υγιεινής Τµήµατος Ιατρικής, Παν/µίου Πατρών

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η εργασία αυτή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Υγιεινής του τµήµατος Ιατρικής Πανεπιστηµίου Πατρών στο πλαίσιο του Ερευνητικού Προγράµµατος Ενίσχυσης Ερευνητικού υναµικού ΠΕΝΕ 2001 µε τίτλο: Ανάπτυξη µοριακών µεθόδων α) για την ανίχνευση και τυποποίηση εντεροϊών, αδενοϊών και ρότα-ιών β) για τη διάκριση προέλευσης (ανθρώπινης ή ζωικής) της Escherichia coli που αποµονώνεται από ακατέργαστα λύµατα. Η χρηµατοδότηση του προγράµµατος πραγµατοποιήθηκε από τη Γ.Γ.Ε.Τ. και την Ε.Υ.Α.Π. Θα ήθελα να εκφράσω τις θερµές ευχαριστίες µου προς την κ. Μαρία Παπαπετροπούλου, Καθηγήτρια Περιβαλλοντικής Μικροβιολογίας για την εµπιστοσύνη που επέδειξε στο πρόσωπό µου και την εποικοδοµητική καθοδήγηση καθ όλη τη διάρκεια της εκπόνησης αυτής της διατριβής. Οι πολύτιµες παρατηρήσεις και υποδείξεις της συνέβαλαν καθοριστικά στην ολοκλήρωση της µελέτης. Επίσης, ευχαριστώ θερµά τον κ. Απόστολο Βανταράκη, Επικ. Καθηγητή Υγιεινής που µου παρείχε την αµέριστη υποστήριξη κι ενθάρρυνση, τόσο απαραίτητες για το έργο µου. Η βοήθεια, οι παρατηρήσεις και οι γνώσεις του συνέβαλαν ουσιαστικά στην ολοκλήρωση και βελτίωση της διατριβής. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την κ. Ίριδα Σπηλιοπούλου, Αναπλ. Καθηγήτρια Μικροβιολογίας για τις εύστοχες παρατηρήσεις και το ειλικρινές ενδιαφέρον που έδειξε για την προσπάθειά µου. Ευχαριστώ θερµά την κ. Ελένη Σαζακλή για την καθοριστική βοήθεια όσον αφορά στην επεξεργασία των αποτελεσµάτων. Σε όλα τα µέλη του Εργαστηρίου Υγιεινής εκφράζω τις ευχαριστίες µου για την άριστη συνεργασία µας και τη φιλική αντιµετώπιση. Τέλος, ευχαριστώ τους γονείς και την αδελφή µου για την ηθική συµπαράσταση και κατανόησή τους και τη φίλη µου και συνεργάτιδα Ζωρζέττα για την ανεκτίµητη βοήθειά της.

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Γενικό µέρος σελ. 1. Εισαγωγή...2 1. Τυποποίηση µικροοργανισµών ιάκριση µεθόδων...3 Α. Φαινοτυπικές µέθοδοι τυποποίησης µικροοργανισµών...... 5 Β. Μέθοδοι τυποποίησης βασιζόµενες στο γενετικό υλικό µικροοργανισµών. 8 Γ. Σύγκριση µεθόδων τυποποίησης.....11 2. Μέθοδοι διάκρισης προέλευσης µικροβιακών πληθυσµών 14 Α. ιασφάλιση µικροβιακής ποιότητας υδάτων.....14 Β. Σκοπιµότητα διάκρισης προέλευσης κοπρανώδους µόλυνσης....15 Γ. Προτεινόµενες µέθοδοι για τη διάκριση προέλευσης κοπρανώδους µόλυνσης..19 3. Random Amplified Polymorphic DNA-PCR..23 Α. Γενικά στοιχεία για τη µέθοδο.23 Β. Ιδανικές συνθήκες για την πραγµατοποίηση της RAPD-PCR 29 Γ. Παράγοντες αναστολής της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης...32. Πλεονεκτήµατα µειονεκτήµατα της µεθόδου RAPD-PCR..33 Ε. Εφαρµογές της RAPD-PCR.36 4. Έλεγχος ευαισθησίας σε ποικιλία αντιβιοτικών (µέθοδος διάχυσης των αντιβιοτικών).38 Α. Γενικά στοιχεία για τη µέθοδο 38 Β. Πρότυπη µέθοδος Bauer-Kirby. Ιδανικές συνθήκες εφαρµογής της µεθόδου 40 Γ. Αξιολόγηση της µεθόδου των δίσκων.47. Εφαρµογές της µεθόδου ελέγχου πολυαντοχής σε αντιβιοτικά.50 5. Escherichia coli 52 Α. Γενικά στοιχεία για την Escherichia coli... 52 Β. Καλλιέργεια.56 Γ. Ετερογένεια πληθυσµών Escherichia coli.57. Οικολογία 57 Ε. Παθογένεση Νόσοι από Escherichia coli 58 2. Σκοπός...60 iv

Ειδικό µέρος 3. Υλικά... 64 4. Μεθοδολογία... 70 Α. ειγµατοληψία στελεχών Escherichia coli....71 Β. Αποµόνωση στελεχών Escherichia coli.73 Γ. Μέθοδος πολλαπλής ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά 75. Μέθοδος Random Amplified Polymorphic DNA-PCR (RAPD-PCR)..77 I. Αποµόνωση γενετικού υλικού βακτηρίων...77 II. Προσδιορισµός της ποσότητας και ποιότητας του αποµονωµένου γενετικού υλικού..78 III. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης RAPD-PCR..79 IV. Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της RAPD-PCR..79 V. Επεξεργασία των ζωνών ηλεκτροφόρησης.80 VI. Εξοµάλυνση ζωνών ηλεκτροφόρησης....80 VII. Έλεγχος επαναληψιµότητας της µεθόδου RAPD-PCR..80 VIII. Συντελεστής οµοιότητας στελεχών E. coli & συντελεστής επαναληψιµότητας των ζωνών DNA κατά τους ελέγχους επαναληψιµότητας της RAPD-PCR...83 IX. Έλεγχος ειδικότητας της µεθόδου RAPD-PCR......85 Ε. Οµαδοποίηση και ταξινόµηση των στελεχών Escherichia coli.85 I. Οµαδοποίηση και ταξινόµηση των στελεχών E. coli βάσει της µεθόδου πολλαπλής ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά (MAR)..85 II. Οµαδοποίηση και ταξινόµηση των στελεχών E. coli βάσει της µεθόδου RAPD- PCR 86 ΣΤ. ιαχωριστική ανάλυση (Discriminant analysis) στελεχών Escherichia coli.88 5. Αποτελέσµατα πειραµάτων..90 Α. Ανάπτυξη µεθόδων για τη διάκριση προέλευσης στελεχών Escherichia coli αποµονωµένων από ανθρώπινο και ζωικό κοπρανώδες υλικό...91 I. Στελέχη Escherichia coli γνωστής προέλευσης..91 II. Μέθοδος πολλαπλής ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά..94 III. Random amplified polymorphic DNA PCR (RAPD-PCR) 100 v

Β. ιάκριση προέλευσης στελεχών Escherichia coli άγνωστης προέλευσης τα οποία αποµονώθηκαν από δείγµατα πόσιµου νερού δικτύου..113 I. Μέθοδος πολλαπλής ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά 113 II. Random amplified polymorphic DNA PCR (RAPD-PCR)...123 III. Σύγκριση αποτελεσµάτων µεθόδων RAPD-PCR & MAR για τις E. coli πόσιµου νερού 130 Γ. ιάκριση προέλευσης στελεχών Escherichia coli άγνωστης προέλευσης τα οποία αποµονώθηκαν από δείγµατα ακατέργαστων λυµάτων..133 I. Μέθοδος πολλαπλής ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά 133 II. Random amplified polymorphic DNA PCR (RAPD-PCR)...142 III. Σύγκριση αποτελεσµάτων µεθόδων RAPD-PCR & MAR για τις Ε.coli λυµάτων..150 6. Συζήτηση συµπεράσµατα...153 7. Παράρτηµα...177 8. Περίληψη...187 9. Summary 190 10. Βιβλιογραφία..192 vi

Εισαγωγή

Εισαγωγή 1. Τυποποίηση µικροοργανισµών ιάκριση µεθόδων Η τυποποίηση µικροοργανισµών περιλαµβάνει τη σύγκριση των χαρακτηριστικών τους και την οµαδοποίησή τους ανάλογα µε το σύνολο οµοιοτήτων και διαφορών που εµφανίζουν. Ο απώτερος στόχος είναι η διάκριση οργανισµών, οι οποίοι συσχετίζονται επιδηµιολογικά και γενετικά (Tenover et al 1995). Οι µέθοδοι τυποποίησης βακτηριακών στελεχών δύνανται να αποβούν χρήσιµες σε περιπτώσεις µελέτης επιδηµιών για την πιστοποίηση και σκιαγράφηση του µοντέλου µετάδοσης της ασθένειας από έναν ή περισσότερους κλώνους καθώς και σε περιπτώσεις όπου µελετώνται η προέλευση και ο τρόπος µετάδοσης παθογόνων µικροοργανισµών. Ακολούθως, η τυποποίηση βακτηρίων συµβάλλει αποφασιστικά στην αντιµετώπιση επιδηµικών εξάρσεων υποδεικνύοντας τα παθογόνα στελέχη µικροοργανισµών, την προέλευσή τους και τη µετάδοσή τους στον υπό εξέταση πληθυσµό (Struelens 1998). Επεξηγηµατικές έννοιες Στέλεχος Αποµονωµένος µικροοργανισµός, ο οποίος διακρίνεται από άλλα στελέχη του ίδιου γένους και είδους βάσει φαινοτυπικών και γονοτυπικών χαρακτηριστικών. Ουσιαστικά πρόκειται για περιγραφική υποµονάδα του είδους. Επιδηµιολογικά συσχετιζόµενα στελέχη: Πρόκειται για στελέχη οργανισµών που έχουν αποµονωθεί και ανακαλλιεργηθεί από κλινικό ή περιβαλλοντικό δείγµα ή κάποια µολυσµατική ουσία, υπό συνθήκες επαρκώς καθορισµένες ώστε να είναι σαφής η προέλευσή τους. Γενετικά συσχετιζόµενα στελέχη (κλώνοι): Στελέχη οργανισµών στα οποία δεν διακρίνονται διαφορές στο γενετικό τους υλικό µε την εφαρµογή µεθόδων όπως είναι η ανάλυση ριβοτύπου ή η ηλεκτροφόρηση σε παλλόµενο ηλεκτρικό πεδίο. Ο µεγάλος βαθµός οµοιότητάς τους ενισχύει την υπόθεση ότι προέρχονται από κοινό προγονικό κύτταρο. Tenover et al. 1995 3

Εισαγωγή Τα στελέχη ενός είδους µικροοργανισµού που προέρχονται από την ίδια πηγή ή από τον ίδιο ξενιστή ενδεχοµένως να συνδέονται κλωνικά έχοντας σηµαντικές οµοιότητες στο γενετικό τους υλικό. Αυτό αποτελεί και την αρχή στην οποία βασίζεται η τυποποίηση βακτηριακών στελεχών. Γενικά, πληθυσµοί βακτηρίων που αναπτύσσονται σε διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες εµφανίζουν φαινοτυπικές και γονοτυπικές διαφορές εξαιτίας της ροής γονιδίων, των διαφορετικών µεταλλάξεων στις οποίες υπόκεινται και της πίεσης της φυσικής επιλογής. Οι µέθοδοι τυποποίησης εστιάζουν στις διαφορές αυτές και τα διακριτά χαρακτηριστικά των οργανισµών µε απώτερο σκοπό τη διάκρισή τους σε οµάδες. Οι παράγοντες που πρέπει να ληφθούν υπόψη για την τυποποίηση µικροοργανισµών είναι το είδος που πρόκειται να µελετηθεί και οι ιδιαιτερότητές του, οι δυνατότητες και περιορισµοί της εκάστοτε µεθόδου τυποποίησης καθώς και το περιβάλλον ανάπτυξης του οργανισµού δεδοµένης της φυσικής επιλογής, των µεταλλάξεων και της ροής γονιδίων που λαµβάνουν χώρα στον πληθυσµό (Olive & bean 1999). Τα τελευταία χρόνια οι µέθοδοι µοριακής τυποποίησης έχουν αναπτυχθεί και βελτιωθεί σηµαντικά καθώς εφαρµόζονται εκτεταµένα για την ανάλυση πολυµορφισµών στο γενετικό υλικό. Παρ όλα αυτά, η ταχεία διαφοροποίησή τους και η ελλιπής σύγκριση αποτελεσµατικότητας µεταξύ τους προκαλούν σύγχυση όσον αφορά στην επιλογή της ενδεδειγµένης µεθόδου για την επίλυση του εκάστοτε προβλήµατος, είτε αυτό περιλαµβάνει διερεύνηση προέλευσης του µικροοργανισµού είτε κάποια επιδηµιολογική µελέτη (http://homepages.tcp.co.uk/~davidk/academic/moltype.html 2003). Για την επιλογή της βέλτιστης τεχνικής έχουν προταθεί ορισµένα κριτήρια, τα οποία πρέπει να ικανοποιούνται. Τα κριτήρια αυτά περιλαµβάνουν τα εξής: Ικανότητα τυποποίησης: Αναφέρεται στο ποσοστό των υπό εξέταση στελεχών τα οποία δύνανται να οµαδοποιηθούν βάσει των οµοιοτήτων τους σε οµάδες αποτελώντας ένα συγκεκριµένο «τύπο». Επαναληψιµότητα της µεθόδου: Ικανότητα της µεθόδου τυποποίησης να κατατάσσει ένα στέλεχος στην ίδια οµάδα, κατόπιν επαναλήψεων της εφαρµογής της. Σταθερότητα: Πρόκειται για τη δυνατότητα της µεθόδου να ταξινοµεί µαζί στελέχη µικροοργανισµών όµοιας γενετικής δοµής ανεξάρτητα από το χρόνο και τις γενιές που έχουν παρέλθει. 4

Εισαγωγή ιακριτική ικανότητα: Είναι το κύριο χαρακτηριστικό της µεθόδου αφού υποδεικνύει την πιθανότητα στελέχη που έχουν κοινές αλληλουχίες στο γενετικό υλικό να αποτελούν µέρος της ίδιας οµάδας. Επιδηµιολογική αρµονία: Αφορά κυρίως σε επιδηµιολογικές µελέτες και είναι η ικανότητα κοινής κατάταξης στελεχών που συνδέονται επιδηµιολογικά µε τα ίδια περιστατικά (Struelens 1998). Ακόµη όµως κι αν µια µέθοδος ικανοποιεί όλα τα παραπάνω κριτήρια είναι κοινώς αποδεκτή η αναγκαιότητα σύγκρισης των αποτελεσµάτων της µε µία ή περισσότερες τεχνικές. Επιπλέον, λαµβάνονται υπόψη και κάποια πρακτικά χαρακτηριστικά όπως η δυσκολία εφαρµογής και επεξεργασίας αποτελεσµάτων, το κόστος και η διαθεσιµότητα αντιδραστηρίων, καθώς και η ταχύτητα εξαγωγής αποτελεσµάτων, κυρίως όταν πρόκειται για θέµατα διασφάλισης της δηµόσιας υγείας και αντιµετώπισης περιπτώσεων µολύνσεων (Sargeant 1999, Simpson et al. 2002, Stoeckel et al. 2004). Οι συνολικές εκτιµήσεις δεν καθορίζουν την ιδανική µέθοδο µοριακής τυποποίησης. Αντιθέτως, κάθε φορά εξετάζονται οι περιοριστικοί παράγοντες, τα γενικά χαρακτηριστικά του υπό ανάλυση οργανισµού και οι απαιτήσεις της εκάστοτε τυποποίησης. Γενικά, οι µέθοδοι που ανιχνεύουν πολυµορφισµούς στο γενετικό υλικό θεωρούνται ενδεδειγµένες για την τυποποίηση και οµαδοποίηση κυρίως βακτηριακών στελεχών και ανώτερες από τις µεθόδους που ανιχνεύουν και αναλύουν φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των οργανισµών (Struelens 1998, Malakoff 2002, Stoeckel et al. 2004). Α. Φαινοτυπικές µέθοδοι τυποποίησης µικροοργανισµών Οι παραδοσιακές µέθοδοι µικροβιακής τυποποίησης βασίζονται εξ ολοκλήρου σε φαινοτυπικά χαρακτηριστικά του οργανισµού. Κάποια από αυτά θεωρούνται αρκετά αξιόπιστα και ευαίσθητα όπως ο φαινότυπος ανθεκτικότητας σε ποικιλία αντιβιοτικών, η ανάλυση ισοενζύµων και η χρωµατογραφική ανάλυση λιπιδίων της κυτταρικής µεµβράνης. Οι µέθοδοι αυτές παρουσιάζουν µια πρώτη εικόνα ταξινόµησης στελεχών ανάλογα µε την προέλευση και το περιβάλλον ανάπτυξής τους. 5

Εισαγωγή Α.1 Μελέτη ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά Το αντιβιόγραµµα είναι από τις πιο συνηθισµένες µεθόδους τυποποίησης και αφορά στον έλεγχο αντοχής βακτηριακών στελεχών σε ποικιλία αντιβιοτικών. Ως µέθοδος χαρακτηρίζεται εύκολη και γρήγορη µε δυνατότητα εφαρµογής σε διαδικασία ρουτίνας στο εργαστήριο. Παρόλο που τα αντιβιογράµµατα έχουν χρησιµοποιηθεί επιτυχώς για να παρουσιάσουν συσχέτιση βακτηριακών στελεχών, συχνά κρίνονται ως τεχνικές περιορισµένης εµβέλειας, καθώς όµοιοι οργανισµοί ενδεχοµένως να παρουσιάσουν διαφορετική συµπεριφορά σε αντιµικροβιακούς παράγοντες (Tang et al., 1997). Εντούτοις, τα τελευταία χρόνια η δοκιµή πολλαπλής ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά έχει εφαρµοστεί για τον έλεγχο προέλευσης βακτηριακών στελεχών και συγκεκριµένα για το αν προέρχονται από ανθρώπινη πηγή ή όχι. Η προσέγγιση αυτή βασίζεται στο γεγονός ότι στο περιβάλλον όπου αναπτύσσονται µικροοργανισµοί είτε ασκείται φυσική επιλογή και υποκινούνται µεταλλάξεις στο χρωµοσωµικό και πλασµιδιακό γενετικό υλικό (Wiggins et al. 2003, Bryan et al. 2004, Hayes et al. 2004), είτε πραγµατοποιείται µεταφορά πλασµιδίων µεταξύ των βακτηρίων (Maynard et al. 2004), γεγονότα που οδηγούν στη δηµιουργία ευαίσθητων/ανθεκτικών στελεχών σε διάφορα αντιβιοτικά. Για την εφαρµογή της συγκεκριµένης µεθόδου απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή στην επιλογή των αντιβιοτικών προκειµένου να µην εξαχθούν λανθασµένα συµπεράσµατα τυποποίησης των υπό εξέταση βακτηριακών στελεχών. Παράλληλα, επιβάλλεται η επανάληψη της τεχνικής και η δοκιµή ανθεκτικότητας των στελεχών από δύο έως τρεις φορές, ώστε να γίνει σωστή εκτίµηση των ζωνών αναστολής. Συνιστάται επίσης η εξέταση µεγάλου αριθµού µικροοργανισµών που έχουν αποµονωθεί από όλη την έκταση της εκάστοτε γεωγραφικής περιοχής για να υπάρξει όσο το δυνατόν ολοκληρωµένη εικόνα των µοντέλων ανθεκτικότητας, δεδοµένου ότι πρόκειται για φαινοτυπική µέθοδο τα αποτελέσµατα της οποίας επηρεάζονται από την πίεση φυσικής επιλογής (Sargeant 1999). Α.2 Ανάλυση βιοτύπου Πρόκειται για τη µελέτη φαινοτυπικών χαρακτηριστικών µικροοργανισµών όπως µορφολογικά χαρακτηριστικά, παράµετροι ανάπτυξης και βιοχηµική χρήση οργανικών υποστρωµάτων. Η ανάλυση βιοτύπου αφορά στη µελέτη όλων αυτών των χαρακτηριστικών, τα οποία όµως δεν είναι σταθερά εξαιτίας περιβαλλοντικών συνθηκών, γενετικών µεταλλάξεων και αλλαγών στο πλασµιδιακό γενετικό υλικό. Γενικά, ο βιότυπος υπόκειται στον υποκειµενικό παράγοντα, δεδοµένου ότι ο ερευνητής επιλέγει κάθε φορά το συνδυασµό 6

Εισαγωγή των χαρακτηριστικών ιδιοτήτων που θα τυποποιήσουν τους µικροοργανισµούς της µελέτης. Γι αυτόν το λόγο απαιτείται η ταυτόχρονη εφαρµογή και άλλων µεθόδων τυποποίησης (Bettelheim et al. 2005). Α.3 Ανάλυση πρωτεϊνών Η µελέτη αντιγονικών πρωτεϊνών της κυτταρικής µεµβράνης µικροοργανισµών καθώς και η χρωµατογραφική ανάλυση πρωτεϊνών σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου επιτρέπουν τη σύγκριση στελεχών και την ταξινόµησή τους καθώς έτσι αντικατοπτρίζονται διαφορές στο γενετικό υλικό και στην ύπαρξη συγκεκριµένων γονιδίων. Παρ όλα αυτά η απουσία ορισµένων πρωτεϊνών δεν συνεπάγεται απαραίτητα την απουσία του αντίστοιχου γονιδίου, καθώς το ίδιο ενδεχοµένως να µην εκφράζεται ενώ παράλληλα µεταλλάξεις στο DNA που δεν επηρεάζουν το πρωτεϊνικό αποτύπωµα δεν θα συµπεριληφθούν στην τυποποίηση των µικροβιακών στελεχών. Έτσι, υπάρχουν επιφυλάξεις ως προς την αξιοπιστία της µεθόδου και τη δυνατότητα που έχει να διαχωρίζει και να ταξινοµεί µικροοργανισµούς (Tang et al. 1997). Α.4 Λυσιτυπία Οι βακτηριοφάγοι, οι ιοί που προσβάλλουν και λύουν βακτήρια, είναι εξειδικευµένοι για την προσβολή συγκεκριµένων στελεχών ενός είδους. Όταν ένα βακτηριακό στέλεχος εκτίθεται σε µια οµάδα βακτηριοφάγων καθορίζεται το σύνολο των φάγων που δύνανται να µολύνουν και να καταστρέψουν το βακτήριο. Η λυσιτυπία µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την τυποποίηση των στελεχών κάποιου είδους, δεδοµένου ότι στελέχη που έχουν µεγαλύτερη συγγένεια ή που προέρχονται από το ίδιο περιβάλλον έχουν και ίδιο λυσίτυπο. Αυτή η µέθοδος τυποποίησης έχει χρησιµοποιηθεί επιτυχώς για την οµαδοποίηση και διάκριση στελεχών διαφόρων ειδών, είναι όµως χρονοβόρα κι επιπλέον καθίσταται απαραίτητος κάθε φορά ο έλεγχος διαφορετικού συνόλου φάγων ειδικό για το υπό ανάλυση βακτηριακό είδος. Παράλληλα, έχει διαπιστωθεί αδυναµία ως προς την επαναληψιµότητα και ερµηνεία των εξαγόµενων αποτελεσµάτων (Mora et al. 2004). Α.5 Χρωµατογραφική ανάλυση Η χρωµατογραφική ανάλυση και διάκριση των λιπαρών οξέων της κυτταρικής µεµβράνης, κυρίως των αναερόβιων βακτηρίων, αναδεικνύει σχέσεις των στελεχών µεταξύ τους. Η αέριος χρωµατογραφία εφαρµόζεται για την τυποποίηση συγκεκριµένων βακτηρίων 7

Εισαγωγή και κρίνεται αξιόπιστη µέθοδος όταν οι συνθήκες ανάπτυξης των βακτηριακών στελεχών είναι ταυτόσηµες και οι τεχνικές εξαγωγής των λιπαρών οξέων από την κυτταρική µεµβράνη αυστηρά καθορισµένες. Οι παράγοντες αυτοί περιορίζουν την ακρίβεια και χρήση της χωρίς όµως να παραγνωρίζεται το γεγονός ότι τα αποτυπώµατα των λιπαρών οξέων πολλών βακτηρίων οδηγούν σε συµπεράσµατα για το βαθµό συγγένειάς τους και το περιβάλλον ανάπτυξης (Tang et al. 1997). Β. Μέθοδοι τυποποίησης βασιζόµενες στο γενετικό υλικό µικροοργανισµών Οι µέθοδοι µοριακής τυποποίησης που βασίζονται στη γενετική δοµή βακτηρίων εφαρµόζονται για τη µελέτη της γενετικής δοµής και εξέλιξης των οργανισµών, για την ανεύρεση τρόπου µετάδοσής τους σε περιπτώσεις επιδηµίας και για τον προσδιορισµό της πηγής προέλευσής τους (Stefani 2000). Η ανάδειξη πολυµορφισµών και τροποποιήσεων στο χρωµοσωµικό γενετικό υλικό των οργανισµών θεωρείται ο πλέον ενδεδειγµένος τρόπος τυποποίησης, κυρίως όταν πρόκειται να πραγµατοποιηθούν συγκριτικές µελέτες µε µεγάλο αριθµό στελεχών (Struelens 1998). Το βασικό πλεονέκτηµα έναντι της µελέτης φαινοτυπικών χαρακτηριστικών έγκειται στο ότι εντοπίζονται αλλαγές και τροποποιήσεις στο DNA, οι οποίες είτε θα εκδηλωθούν πολύ αργότερα στο βακτηριακό πληθυσµό είτε δεν θα επηρεάσουν καθόλου το φαινότυπο. Παράλληλα, σε ορισµένες περιπτώσεις δεν πραγµατοποιείται το στάδιο καλλιέργειας των στελεχών, το οποίο σε ορισµένες περιπτώσεις είναι δύσκολο και προκαλεί ποικίλα προβλήµατα (Cockeril III 1999). Οι µοριακές αυτές µέθοδοι που χρησιµοποιούνται σήµερα βασίζονται στον ηλεκτροφορητικό διαχωρισµό τµηµάτων DNA των οργανισµών διαφορετικού µήκους και µοριακού βάρους, τα οποία έχουν προκύψει κατόπιν κατάλληλης επεξεργασίας. Η απεικόνιση των αποτελεσµάτων είναι υπό µορφή ζωνών DNA σε πήκτωµα αγαρόζης δηµιουργώντας τα γενετικά αποτυπώµατα των οργανισµών, τα οποία µε τη σειρά τους συγκρίνονται µεταξύ τους ώστε να εντοπιστούν οι οµοιότητες και διαφορές. Η µοριακή τυποποίηση που βασίζεται στο χρωµοσωµικό DNA εµφανίζει υψηλή διακριτική ικανότητα και επαναληψιµότητα ενώ παράλληλα επιτρέπει τη δηµιουργία εκτεταµένων βάσεων δεδοµένων που είναι ξεχωριστές για τους διάφορους οργανισµούς. 8

Εισαγωγή Β.1 Ανάλυση ριβοτύπου Η ανάλυση του ριβοτύπου των βακτηρίων χρησιµοποιείται εκτεταµένα και αφορά την ανάλυση µε Southern blot και υβριδισµό µε ιχνηθέτες (probes) για το ριβοσωµικό RΝΑ. Τα r-dna γονίδια χαρακτηρίζονται ως εξελικτικά συντηρηµένη περιοχή του γονιδιώµατος µε αποτέλεσµα να µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως ιχνηθέτες συγκεκριµένων βακτηρίων. Σηµαντικά παθογόνα που ανήκουν στα Enterobacteriaceae, Listeria spp., Pseudomonas spp. και στους σταφυλοκόκκους έχουν περισσότερα των πέντε ριβοσωµικών οπερονίων, σχηµατίζοντας έτσι ριβοτύπους από 5 έως 15 ζώνες υβριδισµού. Η διακριτική ικανότητα αυτής της µεθόδου περιορίζεται από το γεγονός ότι τα ριβοσωµικά οπερόνια καλύπτουν µικρότερο από το 0.1% του χρωµοσωµικού µήκους και τείνουν να οµαδοποιούνται σε συγκεκριµένη περιοχή στο γονιδίωµα. Εξίσου σηµαντική είναι η επιλογή των ενζύµων περιορισµού (Parveen et al. 1999, Bernhard & Field 2000, Carson et al. 2001, Hartel et al. 2002, Scott et al. 2003, Samadpour et al. 2005). Β.2 Restriction Fragment Length Polymorphism µέθοδος (RFLP) Η ανάλυση RFLP εφαρµόζεται εκτεταµένα για την τυποποίηση βακτηρίων και τον καθορισµό της εξελικτικής τους σχέσης. Το χρωµοσωµικό DNA πέπτεται µε ένα ένζυµο περιορισµού, τα τµήµατα που προκύπτουν διαχωρίζονται µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης. Οι πολυµορφισµοί του γενετικού υλικού που ανιχνεύονται µε αυτόν τον τρόπο αποκαλύπτουν συγγένειες µεταξύ των οργανισµών. Ο βασικός περιορισµός της RFLP είναι ότι ενδείκνυται για µελέτες που περιλαµβάνουν µικρό αριθµό στελεχών (Nagashima et al. 2003). Β.3 Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) Η AFLP στηρίζεται στην εφαρµογή PCR επιλεκτικά για ορισµένα τµήµατα του γενετικού υλικού των οργανισµών. Συγκεκριµένα, αφού αποµονωθεί το DNA ακολουθεί πέψη µε δύο ένζυµα περιορισµού και σύνδεση των κοµµατιών του DNA µε δίκλωνους «προσαρµοστές» (adapters). Το επόµενο στάδιο είναι PCR µε εκκινητές εξειδικευµένους για την περιοχή σύνδεσης των κοµµατιών DNA µε τους adapters και τέλος ηλεκτροφόρηση των προϊόντων σε πήκτωµα πολυακρυλαµυδίου συγκέντρωσης 5%. Τα στελέχη διαχωρίζονται µε βάση το διαφορετικό πρότυπο ζωνών DNA που εµφανίζουν. Η µέθοδος AFLP χαρακτηρίζεται από µεγάλη διακριτική ικανότητα και επαναληψιµότητα. Οι δυσκολίες που 9

Εισαγωγή παρουσιάζονται εντοπίζονται στο υψηλό κόστος και στην απαίτηση εξαιρετικά ευαίσθητων χειρισµών (Vos et al. 1995, Jansen et al. 1996, Savelkoul et al. 1999, Guan et al. 2002, Vancanneyt et al. 2002). Β.4 Random Amplified Polymorphic DNA-PCR (RAPD-PCR) Η RAPD-PCR αρχικά εφαρµόστηκε και εδραιώθηκε από τους Williams et al. το 1990 και αποτελεί παραλλαγή της κλασσικής PCR. Βασίζεται στη χρήση εκκινητών που αποτελούνται από 9-10 βάσεις νουκλεοτιδίων τυχαίας αλληλουχίας. Οι εκκινητές αυτοί υβριδίζονται µε τις αντίστοιχες αλληλουχίες του χρωµοσωµικού DNA του οργανισµού και η όλη αντίδραση πραγµατοποιείται σε χαµηλές θερµοκρασίες επαναδιάταξης. Τα προϊόντα της PCR ηλεκτροφορούνται σε πήκτωµα αγαρόζης και ακολουθεί επεξεργασία των προϊόντων DNA που εµφανίζει κάθε µικροοργανισµός. Ανάλογα µε το είδος του οργανισµού και την προέλευσή του παράγονται διαφορετικά προϊόντα PCR, δηλαδή τµήµατα DNA διαφορετικού αριθµού και µοριακού βάρους (Gelsomino et al. 2002, Khan et al 2002, Vancanneyt et al. 2002, Mättö et al. 2004). Β.5 Ηλεκτροφόρηση σε παλλόµενο ηλεκτρικό πεδίο (Pulsed-Field Gel Electrophoresis PFGE) ολικού χρωµοσωµικού DNA. Η ηλεκτροφόρηση σε παλλόµενο ηλεκτρικό πεδίο (PFGE) αποτελεί µία από τις µεθόδους µοριακής τυποποίησης βακτηρίων. Τα βακτηριακά στελέχη αφού αναπτυχθούν σε υγρό ή στερεό θρεπτικό υλικό εµβυθίζονται σε δίσκους αγαρόζης, λύονται παρουσία ενζύµων και στη συνέχεια ακολουθεί πέψη του χρωµοσωµικού DNA µε κατάλληλα ένζυµα περιορισµού. Τα τµήµατα του DNA ηλεκτροφορούνται σε πήκτωµα αγαρόζης σε παλλόµενο ηλεκτρικό πεδίο, του οποίου η πολικότητα µεταβάλλεται σε καθορισµένα χρονικά διαστήµατα. Το παλλόµενο ηλεκτρικό πεδίο επιτρέπει τον καλό διαχωρισµό τµηµάτων DNA µοριακού βάρους εύρους 10kb έως 800 kb, τα οποία γίνονται ορατά και φωτογραφίζονται στο υπεριώδες. Η σύγκριση των ηλεκτροφορητικών εικόνων των οργανισµών καταλήγει στον προσδιορισµό του βαθµού συγγένειας που έχουν µεταξύ τους όσον αφορά στην επιδηµιολογική και γενετική συσχέτιση. Ο Tenover και οι συνεργάτες του (1995) πρότειναν και εδραίωσαν τον καθορισµό συγγένειας στελεχών βάσει των ζωνών DNA που εµφανίζουν στο ηλεκτροφόρηµα. Έτσι, όταν δύο οργανισµοί έχουν ακριβώς την ίδια εικόνα PFGE τότε πρόκειται για το ίδιο ακριβώς στέλεχος µε την ίδια προέλευση. Όταν τα τµήµατα DNA 10

Εισαγωγή διαφέρουν από µία έως τρεις ζώνες, γεγονός που δηλώνει µία γενετική διαφορά, τότε οι οργανισµοί έχουν κοντινή συγγένεια. ιαφορές σε ένα έως και σε έξι τµήµατα DNA υποδηλώνουν γενετικά συγγενή στελέχη (ένας κλώνος), ενώ περισσότερες από εφτά διαφορές ταυτοποιούν ξεχωριστούς κλώνους (Kariuki et al. 1999, Khan et al 2002, Vancanneyt et al. 2002, McLellan 2003, Mora et al. 2004). Β.6 Αποτύπωµα επαναλαµβανόµενου εξωγονιδιακού παλινδροµικού DNA (Rep-PCR fingerprinting) Τα γονιδιώµατα των προκαρυωτικών και κάποιων απλών ευκαρυωτικών οργανισµών διαθέτουν πολυάριθµες µικρές επαναλαµβανόµενες αλληλουχίες, οι οποίες παρέχουν στοιχεία για τη γενετική ανάλυση και τυποποίηση πολλών µικροοργανισµών, κυρίως των εντεροβακτηρίων (Lupski & Weinstock 1992). Η εφαρµογή PCR γι αυτές τις αλληλουχίες χρησιµοποιώντας ένα ή συνδυασµό εκκινητών επιτρέπει τη µελέτη και τυποποίηση µεγάλου αριθµού στελεχών και συµβάλλει στην ανίχνευση προέλευσής τους και την ανεύρεση διαφοροποιήσεων που έχουν στο γενετικό υλικό (Johnson & O Bryan 2000, Dombek et al. 2000, Seurinck et al. 2003, Johnson, L.K. et al. 2004, McLellan 2003, McLellan 2004). Γ. Σύγκριση µεθόδων τυποποίησης Η επιλογή της µεθόδου τυποποίησης µικροοργανισµών εξαρτάται από πολλούς παράγοντες, οι οποίοι πρωτίστως καθορίζονται από το είδος και τις απαιτήσεις της µελέτης, αλλά ταυτόχρονα και από την επιστηµονική κατάρτιση του ερευνητικού δυναµικού και τις οικονοµικές δυνατότητες του εκάστοτε εργαστηρίου. Μία µέθοδος τυποποίησης ενδέχεται να έχει µεγάλη διακριτική ικανότητα και καλό επίπεδο επαναληψιµότητας, όµως περιορισµοί όπως περίπλοκο πρωτόκολλο πειραµατικής πορείας, δυσκολία ερµηνείας των αποτελεσµάτων καθώς και υψηλό οικονοµικό κόστος ίσως να µην επιτρέπουν την εφαρµογή και εδραίωσή της. Είναι κοινώς αποδεκτό το γεγονός ότι οι µέθοδοι που βασίζονται στην ανίχνευση πολυµορφισµών στο γενετικό υλικό οργανισµών διαθέτουν ικανοποιητικό επίπεδο διακριτικής ικανότητας, ευαισθησίας και επαναληψιµότητας µε συνέπεια να προτιµώνται στις σύγχρονες ερευνητικές εργασίες. Εντούτοις, προτείνεται ο συνδυασµός τους µε κάποια 11

Εισαγωγή µέθοδο που εξετάζει τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των υπό ανάλυση στελεχών για την εξαγωγή εµπεριστατωµένων συµπερασµάτων (Stefani 2000, Parveen 2001). Ο έλεγχος πολυαντοχής σε ποικιλία αντιβιοτικών θεωρείται απλή, γρήγορη και οικονοµική τεχνική, η οποία σε συνδυασµό µε κάποια µέθοδο µοριακής τυποποίησης καταλήγει σε συγκρίσιµα και ικανοποιητικά αποτελέσµατα (Guan et al. 2002). Οι µέθοδοι που αφορούν παραλλαγές της απλής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης όπως η RFLP-PCR, RAPD και η Rep-PCR γενικά χαρακτηρίζονται ως απλές και προσιτές στην εφαρµογή τους. Χαρακτηρίζονται από µεγάλη διακριτική ικανότητα αλλά παρουσιάζουν µη επαναλήψιµα αποτελέσµατα που εξαρτώνται από τον εξοπλισµό και τα αντιδραστήρια που χρησιµοποιούνται κάθε φορά, µε συνέπεια η επαναληψιµότητα των τεχνικών αυτών να περιορίζεται συχνά σε ενδοεργαστηριακό πλαίσιο (Meunier & Grimont 1993, Brikun et al. 1994, Tyler et al. 1997, Grif et al. 1998, Perez et al. 1998, Chansiripornchai et al. 2001, Radu et al. 2001, Chattopadhyay 2003). Η PFGE παρουσιάζει επαναλήψιµα αποτελέσµατα αλλά ο χρόνος διεξαγωγής πειραµάτων είναι µεγάλος. Επίσης, αναφέρονται δυσκολίες ως προς την εύρεση κατάλληλων ενζύµων περιορισµού, ώστε να προκύπτει κάθε φορά ικανοποιητικός και συγκρίσιµος αριθµός ζωνών DNA µεταξύ των στελεχών (Tenover et al. 1995, Grif et al. 1998, Radu et al. 2001, Sontag et al. 2004). Η ανάλυση ριβοτύπου κρίνεται δύσκολη λόγω της αναγκαιότητας πιστής εφαρµογής του πειραµατικού πρωτοκόλλου και η διακριτική της ικανότητα δεν είναι ικανοποιητική, αλλά παράγονται επαναλήψιµα αποτελέσµατα (Hermans et al. 1995, Aarestrup et al. 1997, Zanetti et al. 1999, Carson et al. 2001). Η µέθοδος AFLP έχει µεγάλη διακριτική ικανότητα και επαναληψιµότητα µε βασικό όµως µειονέκτηµα τη δύσκολη επεξεργασία των αποτελεσµάτων και την τελική εξαγωγή συµπερασµάτων δεδοµένου των πολυάριθµων ζωνών DNA στις ηλεκτροφορήσεις. Γενικά, η χρήση της περιορίζεται εξαιτίας δύσκολων χειρισµών των δειγµάτων και απαίτησης µεγάλης εργαστηριακής εµπειρίας (Savelkoul et al. 1999). Εντούτοις, εφαρµόζεται εκτεταµένα σε επιδηµιολογικές µελέτες και έρευνες τυποποίησης γενετικού υλικού µικροοργανισµών (Vos et al. 1995, Arias et al. 1997, Janssen et al. 1996 Kunene et al. 2000). Η σύγκριση των µεθόδων τυποποίησης αφορά και τον εργαστηριακό εξοπλισµό, το συνολικό κόστος εγκατάστασης και το κόστος της κάθε ανάλυσης. Από τις µεθόδους που ήδη αναφέρθηκαν η AFLP και η PFGE έχουν το µεγαλύτερο κόστος εξαιτίας του απαιτούµενου εξοπλισµού, συσκευών και αναλωσίµων. Επιπλέον, το κόστος συνδέεται άµεσα και µε το χρονικό διάστηµα που απαιτείται για τη διεξαγωγή της κάθε ανάλυσης. Το χρονικό διάστηµα που απαιτείται για να ολοκληρωθεί το πειραµατικό πρωτόκολλο για την PFGE είναι µεγάλο 12

Εισαγωγή εν αντιθέσει µε άλλες τεχνικές όπως η RAPD, η οποία τελείται υπό χαµηλό κόστος και η κάθε ανάλυση ολοκληρώνεται σε σύντοµο χρονικό διάστηµα. Ένα ακόµη κριτήριο που πρέπει να ληφθεί υπόψη είναι η δυνατότητα της εκάστοτε µεθόδου να εξετάσει µεγάλο αριθµό βακτηριακών στελεχών ανάλογα µε τις απαιτήσεις της κάθε µελέτης. Οι µέθοδοι που βασίζονται στην PCR κρίνονται κατάλληλες για µελέτες που περιλαµβάνουν µεγάλο αριθµό στελεχών κι ενδείκνυνται όταν τα γενετικά αποτυπώµατα των οργανισµών πρόκειται να φυλαχθούν και να διατηρηθούν για περαιτέρω αναλύσεις. Η επικρατούσα µέχρι σήµερα άποψη είναι η τέλεση δύο ή περισσότερων µεθόδων τυποποίησης µικροοργανισµών, προκειµένου να υπάρχει σύγκριση και διασταύρωση των αποτελεσµάτων. Κάθε ερευνητική οµάδα επιλέγει τη µεθοδολογία διεξαγωγής των πειραµάτων της ανάλογα µε τον εργαστηριακό εξοπλισµό και τις οικονοµικές δυνατότητες, ενώ παράλληλα λαµβάνεται υπόψη η εµπειρία του προσωπικού και τα χρονικά περιθώρια εντός των οποίων απαιτείται η ολοκλήρωση των πειραµατικών διαδικασιών. Οι φαινοτυπικές τεχνικές ενώ είναι πολύ προσιτές µειονεκτούν λόγω των ασταθών φαινοτύπων και τη χαµηλή τους ευαισθησία σε αντιδιαστολή µε τις τεχνικές µοριακής τυποποίησης, οι οποίες επιτρέπουν τη δηµιουργία µεγάλων βιβλιοθηκών αναφοράς τυποποιηµένων οργανισµών ανάλογα µε το είδος και τις απαιτήσεις της εκάστοτε µελέτης. Ο απώτερος στόχος είναι η εφαρµογή συγκεκριµένων πειραµατικών διαδικασιών ώστε να επιτυγχάνεται σύγκριση και µεταφορά δεδοµένων µεταξύ διαφορετικών εργαστηρίων, µε κατάληξη την επισήµανση αποδεκτών τροποποιήσεων στο γενετικό υλικό και την εξαγωγή συµπερασµάτων που αφορούν στον πληθυσµό των µικροοργανισµών (Olive & Bean 1999). Χαρακτηριστικό Μεθοδολογία PFGE PCR-RFLP Rep-PCR RAPD Ανάλυση ριβοτύπου AFLP αθµός δυσκολίας Μέτριος Μικρός Μικρός Μικρός Μέτριος Μέτριος ρµηνεία ποτελεσµάτων Εύκολη Εύκολη Εύκολη Εύκολη Μέτρια ύσκολη ακριτική ικανότητα Υψηλή Μέτρια Υψηλή Υψηλή Μέτρια Υψηλή ρόνος διεξαγωγής άλυσης (ηµέρες) νδοεργαστηριακή αναληψιµότητα παναληψιµότητα ταξύ εργαστηρίων 3 1 1 1 2 2 Καλή Καλή Καλή Καλή Καλή Καλή Καλή Καλή Μέτρα Μέτρια Καλή Καλή όστος εγκατάστασης Μέτριο Μέτριο Μέτριο Μέτριο Μέτριο Υψηλό όστος ανάλυσης Μέτριο Χαµηλό Χαµηλό Χαµηλό Χαµηλό Μέτριο Πίνακας 1: Κύρια χαρακτηριστικά µοριακών µεθόδων που εφαρµόζονται για την τυποποίηση βακτηριακών στελεχών (Olive & Bean 1999). 13

Εισαγωγή 2. Μέθοδοι διάκρισης προέλευσης µικροβιακών πληθυσµών Α. ιασφάλιση µικροβιολογικής ποιότητας υδάτων Η διατήρηση της µικροβιολογικής ποιότητας του υδάτινου περιβάλλοντος είναι υψίστης σηµασίας δεδοµένων των κινδύνων που ενέχονται για τη δηµόσια υγεία. Τα υδάτινα συστήµατα (πόσιµο νερό, νερά αναψυχής) πρέπει να πληρούν ορισµένες προδιαγραφές όσον αφορά στο µικροβιολογικό φορτίο που φέρουν, ώστε να διασφαλίζεται η ανθρώπινη υγεία (Scott et al. 2002). Τα κυριότερα προβλήµατα που πλήττουν τη δηµόσια υγεία αφορούν επιδηµίες που προκύπτουν από κατανάλωση ή επαφή µε µολυσµένο νερό, όπως αναφέρεται σε επιδηµιολογικές µελέτες που έχουν διεξαχθεί στις Η.Π.Α. Οι µολυσµατικοί παράγοντες µεταδίδονται στο ευρύ κοινό µέσω επιφανειακών και υπογείων υδάτων, θέτοντας σε κίνδυνο ανάλογα µε το είδος τους ολόκληρες κοινότητες (Simpson et al. 2002). Η µικροβιολογική ποιότητα των υδάτων αξιολογείται µε την ανίχνευση της κοπρανώδους µόλυνσης, µε τον έλεγχο της παρουσίας και συγκέντρωσης συγκεκριµένων µικροοργανισµών - δεικτών (Graves et al. 2002). Τέτοιοι µικροοργανισµοί - δείκτες είναι τα κοπρανώδη κολοβακτηριοειδή, η Escherichia coli και οι κοπρανώδεις στρεπτόκοκκοι (Simpson et al. 2002). Η παρουσία τους σχετίζεται άµεσα µε κοπρανώδες υλικό ποικίλης προέλευσης, το οποίο µπορεί να αποτελέσει ουσιώδες υγειονοµικό και περιβαλλοντικό πρόβληµα, λαµβάνοντας υπόψη ότι µπορεί να περιέχει παθογόνα βακτήρια, πρωτόζωα και ιούς (Wiggins et al. 2003). Η κοπρανώδης µόλυνση των υδάτων υποβαθµίζει την ποιότητά τους, θέτει σε κίνδυνο τη δηµόσια υγεία, είτε αφορά πόσιµο είτε νερό αναψυχής, ενώ παράλληλα έχει και σοβαρές οικονοµικές προεκτάσεις (Scott et al. 2003). Η µόλυνση κάποιου υδάτινου συστήµατος καθιστά άµεση και απαραίτητη την υπόδειξη µέτρων εξυγίανσης, τα οποία πρέπει να τεθούν σε εφαρµογή για την αντιµετώπιση του εκάστοτε προβλήµατος. Ανάλογα µε την έκταση της µικροβιολογικής µόλυνσης ποικίλει και το αντίστοιχο οικονοµικό κόστος, το οποίο µπορεί να έχει πολλές προεκτάσεις ανάλογα αν πρόκειται για πόσιµο ή νερό αναψυχής. Έτσι, αναφερόµαστε σε οικονοµικές απώλειες για την εταιρεία ύδρευσης (πόσιµο νερό), αντίστοιχες απώλειες για οστρακοκαλλιέργειες και αλιείς ψαριών ή ακόµη και απαγόρευση προσέγγισης σε ακτές κολύµβησης µε συνέπεια απώλειες από τουριστικά κέρδη (Bernhard & Field 2000). Ωστόσο, η ανίχνευση κοπρανώδους µόλυνσης στο υδάτινο περιβάλλον δεν είναι επαρκής προκειµένου να οριοθετηθεί ο κίνδυνος για τη δηµόσια υγεία και να υποδειχθούν οι 14

Εισαγωγή κατάλληλοι τρόποι αντιµετώπισης του προβλήµατος. Εκείνο που καθίσταται απαραίτητο είναι η διάκριση και δη ο ακριβής προσδιορισµός της προέλευσης της κοπρανώδους µόλυνσης, η οποία εστιάζεται κυρίως στο ανθρώπινο και το ζωικό κοπρανώδες υλικό. Πιο συγκεκριµένα, κοπρανώδης µόλυνση ενδέχεται να προκύψει από εκροή ακατέργαστων λυµάτων, υπερχείλιση υπονόµων, απορροές βιολογικών καθαρισµών και βιοµηχανικών µονάδων καθώς και από απορροές αγροτικών περιοχών, απόβλητα κτηνοτροφικών µονάδων, τα οποία µπορεί να διασπείρονται σε εκτεταµένες περιοχές (Parveen et al. 1997, Seurinck et al. 2003). Οι δύο βασικές παράµετροι, οι οποίες θέτουν την αναγκαιότητα διάκρισης είναι α) ο καθορισµός των πιθανών λοιµώξεων που δύνανται να προκληθούν στον άνθρωπο και β) οι κοινωνικές και οικονοµικές επιπτώσεις (Malakoff 2002, Wiggins et al. 2003). Β. Αναγκαιότητα διάκρισης προέλευσης κοπρανώδους µόλυνσης Προάσπιση δηµόσιας υγείας Στο κοπρανώδες υλικό ανευρίσκεται µεγάλη ποικιλία παθογόνων ιών, βακτηρίων και παρασίτων, τα οποία µεταδίδονται µε το νερό. Εντούτοις, η κοπρανώδης µόλυνση του υδάτινου περιβάλλοντος ενέχει διαφορετικούς κινδύνους για τον καταναλωτή ανάλογα µε το εάν είναι ανθρώπινης ή ζωικής προέλευσης. Γενικά, είναι κοινώς αποδεκτό το γεγονός ότι το ανθρώπινο κοπρανώδες υλικό δύναται να προκαλέσει περισσότερες και σηµαντικότερες ασθένειες στον άνθρωπο απ ό,τι το αντίστοιχο ζωικό (Wiggins 1996, Wiggins et al. 1999, Harwood et al. 2000, Guan et al. 2002), δεδοµένης της διαπιστωµένης διαφοροποίησης ως προς τους περιεχόµενους µικροοργανισµούς (πίνακας 2). Το ανθρώπινο κοπρανώδες υλικό περιέχει συνήθως πολλά ανθρώπινα παθογόνα, σηµαντικά για τη δηµόσια υγεία όπως είναι Salmonella enterica οροτύπου Typhi, Shigella spp., ιός Ηπατίτιδας Α και Νοροϊοί. (Kudva et al. 1997, Heuvelink et al. 1998, Gyles et al. 1998, Kahn et al. 2002, Scott et al. 2002, Simpson et al. 2002, Pulz et al. 2003, Scott et al. 2003, Mora et al. 2004, Pearce et al. 2004). Παράλληλα, εξετάζοντας τη σύσταση του ζωικού κοπρανώδους υλικού, µόνο ένας µικρός αριθµός ζωικών παθογόνων που µεταδίδονται µε το νερό µπορούν να προκαλέσουν σοβαρές ασθένειες στον άνθρωπο. Μεταξύ αυτών συγκαταλέγονται παράσιτα και συγκεκριµένα η Giardia lamblia και είδη του Cryptosporidium spp., η Salmonella typhimurium DT104, συγκεκριµένοι ορότυποι Shigella spp., το Campylobacter jejuni και η Escherichia coli O157:H7, τα οποία ανιχνεύονται και αποµονώνονται σε µεγάλες 15

Εισαγωγή συγκεντρώσεις από κόπρανα υγιών ατόµων βοοειδών, προβάτων και κατσικών, που είναι οι φυσιολογικοί ξενιστές τους (Olson 1999, Parveen et al. 1999, Dombek et al. 2000, Scott et al. 2002, Scott et al. 2003, McLellan 2004). Συγκεκριµένα η E.coli O157:H7, όπως και άλλοι ορότυποι της έχουν συνδεθεί τα τελευταία χρόνια µε αρκετά κρούσµατα γαστρεντερίτιδας, αιµορραγικής κολίτιδας και αιµολυτικού-ουραιµικού συνδρόµου που έχουν προκληθεί κυρίως από κατανάλωση µολυσµένου νερού και τροφής (Kudva et al. 1997, Heuvelink et al. 1998, Gyles et al. 1998, Kahn et al. 2002, Pulz et al. 2003, Mora et al. 2004, Pearce et al. 2004). Άνθρωπος Βοοειδή Χοίροι Πουλερικά Salmonella spp. 1% 0-13% 0-38% 10-100% E.coli O157:H7 1% 16% 0,4% 1,3% Campylobacter jejuni 1% 1% 2% 100% Yersinia enterocolitica 0,002% <1% 18% 0% Giardia lamblia 1-5% 10-100% 1-20% 0% Cryptosporidium spp. 1% 1-100% 0-10% 0% Πίνακας 2: Παρουσία εντερικών παθογόνων στον άνθρωπο, βοοειδή, χοίρους και πουλερικά (Olson 1999) ιάκριση παθογόνων ανάλογα µε την προέλευσή τους Σύµφωνα µε τα υπάρχοντα επιδηµιολογικά στοιχεία, είναι λίγες οι έρευνες, που υποδεικνύουν τον αιτιολογικό παράγοντα των αναφεροµένων κρουσµάτων. Εντούτοις, έχει γίνει προσπάθεια ταύτισης και σύγκρισης του µολυσµατικού παράγοντα που ανευρίσκεται στο νερό µε τα προκαλούµενα συµπτώµατα και την ασθένεια που εµφανίζεται στον καταναλωτή. Στις Η.Π.Α. ένα εξαιρετικά µεγάλο ποσοστό ασθενειών που συνδέονται µε την κατανάλωση µολυσµένου νερού πιθανολογείται ότι είναι ιικής προέλευσης. Σύµφωνα µε τον Craun (1991) οι εντεροϊοί, οι οποίοι ευθύνονταν για την πλειοψηφία των κρουσµάτων γαστρεντερίτιδας καταγράφηκαν από τον ίδιο ερευνητή ότι ήταν ανθρώπινης προέλευσης. Η συγκεκριµένη µελέτη αφορούσε και περιστατικά που οφείλονται στον ιό Ηπατίτιδας Α, τα οποία καταγράφηκαν ξεχωριστά αλλά σχετίστηκαν και αυτά µε κοπρανώδες υλικό ανθρώπινης προέλευσης. Η παρουσία του στο νερό ήταν επακόλουθο κοπρανώδους 16

Εισαγωγή µόλυνσης εξαιτίας εισόδου λυµάτων στο δίκτυο. Ανάλογα περιστατικά γαστρεντερίτιδας από εντεροϊούς ανθρώπινης προέλευσης έχουν αναφερθεί και στη Νέα Ζηλανδία, ενώ παράλληλα έχει υποδειχθεί η σηµασία των αδενοϊών, ροτα ιών και νοροϊών (Sinton et al. 1997). Η πρόκληση ασθενειών από ιούς καθιστά την ανθρώπινη κοπρανώδη µόλυνση περισσότερο επικίνδυνη για τη δηµόσια υγεία. Ορισµένα ζώα αποτελούν φυσιολογικούς ξενιστές παρασίτων, στα οποία µε τη σειρά τους έχουν αποδοθεί διάφορα περιστατικά ασθενειών. Η Giardia lamblia είναι το πιο συχνό εντερικό παθογόνο του ανθρώπου µε παγκόσµια διασπορά. Η µολυσµατική της δόση είναι 100 κύστεις και η γιαρδίαση αποτελεί την πιο συχνή ασθένεια µεταδιδόµενη µε το νερό. Περιστατικά γιαρδίασης έχουν καταγραφεί σε έρευνες στην Ευρώπη, τις Η.Π.Α. και τον Καναδά, όπου έχει τονιστεί ότι ορισµένα στελέχη αυτού του οργανισµού έχουν υψηλότερη πιθανότητα πρόκλησης νόσου στον άνθρωπο (Olson 1999). Το Cryptosporidium spp. είναι κι αυτό σηµαντικό παράσιτο το οποίο προκαλεί τη λεγόµενη κρυπτοσποριδίοση στον άνθρωπο κατά τη µετάδοσή του από διάφορα ζώα. Στην Ευρώπη και τις Η.Π.Α. συγκαταλέγεται στα πρωτόζωα που µεταδίδονται από κατανάλωση µολυσµένου νερού και που είναι σε θέση να απειλήσουν την ανθρώπινη ζωή Sinton et al. 1997). Ανευρίσκεται σε µεγάλες συγκεντρώσεις στα κόπρανα βοοειδών, προβάτων, χοίρων και πουλερικών. Ωστόσο, έχουν αναφερθεί περιστατικά κρυπτοσποριδίοσης στον άνθρωπο κατόπιν πόσης νερού που είχε µολυνθεί από αστικά απόβλητα (Olson 1999). Όσον αφορά στα βακτήρια που διαβιώνουν στα ζώα τα σηµαντικότερα για τη δηµόσια υγεία είναι η Salmonella typhimurium DT 104, η E.coli O157:H7 και τα τελευταία χρόνια έχει ενταχθεί και το Campylobacter spp. Ο συγκεκριµένος ορότυπος της Salmonella έχει καταγραφεί ως το κύριο αίτιο για κρούσµατα γαστρεντερίτιδας στον άνθρωπο στην Ευρώπη, τον Καναδά και τις Η.Π.Α., εισερχόµενος στο σύστηµα ύδρευσης µε απορροές κτηνοτροφικών µονάδων κατόπιν έντονης βροχόπτωσης. Κατά τον ίδιο τρόπο µολύνουν το πόσιµο νερό και το Campylobacter spp. µε την E.coli O157:H7, τα οποία αναπτύσσονται στο έντερο υγιών ζώων, κυρίως βοοειδών, προβάτων και χοίρων (Franke et al. 1995, Olson 1999, Cornick et al. 2000, Guan et al. 2002). Μελέτες διάκρισης κοπρανώδους µόλυνσης Ο δεύτερος άξονας στον οποίο κινούνται οι µελέτες διερεύνησης της προέλευσης της κοπρανώδους µόλυνσης στο υδάτινο περιβάλλον είναι ο προσδιορισµός µέτρων εξυγίανσης και αντιµετώπισης του εκάστοτε προβλήµατος (http://www.nwri.ca/envirozine/ issue33-17

Εισαγωγή e.html 2004). Όπως έχει ήδη πραγµατοποιηθεί σε πολλές έρευνες, ο σωστός και όσο το δυνατόν ακριβής προσδιορισµός πηγής κοπρανώδους υλικού στο νερό έχει οδηγήσει στην αποτελεσµατική αντιµετώπιση της µόλυνσης, περιορίζοντας έγκαιρα τις επιπτώσεις στη δηµόσια υγεία και καταλήγοντας στην εξοικονόµηση σηµαντικού χρηµατικού ποσού (Harwood et al. 2000, Malakoff 2002). Έτσι, ο Hagedorn και οι συνεργάτες του (1999) σε ένα περιστατικό µόλυνσης του υδάτινου περιβάλλοντος στην Virginia των H.Π.Α. υπέδειξαν ως αιτία τα περιττώµατα βοοειδών κτηνοτροφικών µονάδων γειτονικών περιοχών. Αυτό είχε ως αποτέλεσµα οι κάτοικοι της περιοχής να προβούν σε άµεσες λύσεις όπως φράξιµο των µολυσµένων εκτάσεων και απαγόρευση προσέγγισης των βοοειδών στο υδάτινο περιβάλλον. Οι ενέργειες αυτές είχαν ως αποτέλεσµα την εξυγίανση του υδροφόρου ορίζοντα της περιοχής και τον κατά πολύ περιορισµό της κοπρανώδους µόλυνσης. Σε ανάλογα συµπεράσµατα µε τον Hagedorn κατέληξαν ο Graves και οι συνεργάτες του (2001) και ο Wiggins και οι συνεργάτες του (2003) τελώντας έρευνα στην ίδια περιοχή. Αντίστοιχες µελέτες έχουν οδηγήσει σε παρεµφερή αποτελέσµατα. Ο Parveen και οι συνεργάτες του (1997) διέκριναν το ανθρώπινο κοπρανώδες υλικό από το αντίστοιχο ζωικό στη Florida των Η.Π.Α. υποδεικνύοντας µέτρα αντιµετώπισης της µόλυνσης στην περιοχή, ενώ η έρευνα επαναλήφθηκε και επεκτάθηκε από τον Scott και τους συνεργάτες του (2003), προκειµένου να καθοριστεί η ακριβής πηγή του ζωικού κοπρανώδους υλικού µεταξύ βοοειδών, πουλερικών και χοίρων. Επίσης, ο Goñi-Urriza και οι συνεργάτες του (2000) διερεύνησαν την επίδραση αστικών αποβλήτων στο υδάτινο περιβάλλον µιας ευρύτερης αγροτικής περιοχής στην Ισπανία, προκειµένου να διαπιστωθεί εάν ήταν απαραίτητο να εφαρµοστούν κατάλληλα µέτρα για τον περιορισµό της κοπρανώδους µόλυνσης, ενώ παράλληλα η McLellan (2004) διεξήγαγε αντίστοιχη µελέτη στην Καλιφόρνια των Η.Π.Α. Επιπλέον, έρευνες που πραγµατοποιήθηκαν το 2002 και το 2003 σε διάφορες περιοχές των Η.Π.Α. (http://www.chbr.noaa.gov/newsletter/octobernews/ sourcetracking.htm 2004) ως προς την προέλευση κοπρανώδους µόλυνσης κατέληξαν στην επιβολή µέτρων όπως διαµόρφωση κατάλληλης υποδοµής του υδάτινου συστήµατος, απαγόρευση της ανεξέλεγκτης απόρριψης λυµάτων και περιορισµό των ζωικών πληθυσµών, µε συνέπεια την προάσπιση της δηµόσιας υγείας. 18

Εισαγωγή Γ. Προτεινόµενες µέθοδοι για τη διάκριση προέλευσης κοπρανώδους µόλυνσης είκτες κοπρανώδους µόλυνσης Η απευθείας ανίχνευση των ανθρώπινων εντερικών παθογόνων καθίσταται δύσκολη δεδοµένου ότι ανευρίσκονται στο περιβάλλον σε εξαιρετικά χαµηλές συγκεντρώσεις, ενώ παράλληλα η µολυσµατική τους δόση κυµαίνεται σε χαµηλά επίπεδα. Προκειµένου να προσδιοριστεί η προέλευση των εντερικών παθογόνων σε κάποιο υδάτινο σύστηµα καταφεύγουµε στον προσδιορισµό συγκεκριµένων δεικτών κοπρανώδους µόλυνσης. Οι συνήθεις δείκτες που χρησιµοποιούνται σε µελέτες που αφορούν στο πόσιµο και θαλασσινό νερό είναι οι κοπρανώδεις στρεπτόκοκκοι και η Escherichia coli, µε τις απόψεις πολλών ερευνητών να διίστανται για το ποιος είναι ο πιο ενδεδειγµένος. Οι κοπρανώδεις στρεπτόκοκκοι επιβιώνουν περισσότερο στο υδάτινο περιβάλλον µε άµεση συνέπεια να ανευρίσκονται και να αποµονώνονται σε µεγαλύτερες συγκεντρώσεις. Εντούτοις, υπάρχει η άποψη ότι εξαιτίας της ανθεκτικότητάς τους η παρουσία τους στο περιβάλλον δεν υποδηλώνει πρόσφατη κοπρανώδη µόλυνση οπότε µπορεί να συντελέσει στην εξαγωγή συγκεχυµένων συµπερασµάτων για την αντιµετώπισή της (Dombek et al. 2000). Παρ όλα αυτά οι µικροοργανισµοί αυτοί έχουν προτιµηθεί από αρκετούς ερευνητές σε µελέτες διάκρισης κοπρανώδους µόλυνσης (Hagedorn et al. 1999, Wiggins et al. 1999, Graves et al. 2002, Wiggins et al. 2003, Hayes et al. 2004). Η Escherichia coli από την άλλη πλευρά, η οποία φυσιολογικά δεν χαρακτηρίζεται παθογόνος είναι ο κατεξοχήν δείκτης κοπρανώδους µόλυνσης του υδάτινου περιβάλλοντος (http://www.sourcemolecular.com/fingerprint.htm 2004) και θεωρείται ότι υποδηλώνει πρόσφατη µόλυνση του υδάτινου συστήµατος (Harwood et al. 2000). Παράλληλα, ανευρίσκεται σε συγκεντρώσεις πολύ υψηλότερες από τα παθογόνα, των οποίων υποδηλώνει την παρουσία (Scott et al. 2003). Το γεγονός ότι διαβιώνει τόσο στον εντερικό σωλήνα του ανθρώπου όσο και των θερµόαιµων ζώων καθώς και η µελέτη συγκεκριµένων χαρακτηριστικών της έχουν συντελέσει στην ολοκλήρωση ερευνών διάκρισης προέλευσης κοπρανώδους υλικού και τον αποτελεσµατικό τρόπο αντιµετώπισης του εκάστοτε προβλήµατος (Kaspar et al. 1990, Parveen et al. 1997, Parveen et al. 1999, Kariuki et al. 1999, Souza et al. 1999, Harwood et al. 2000, Guan et al. 2002, McLellan et al. 2003, Nagashima et al. 2003, Seurinck et al. 2003, Scott et al. 2003, Johnson, L.K. et al. 2004, Maynard et al. 2004, McLellan 2004, Mora et al. 2004). 19

Εισαγωγή Μέθοδοι διάκρισης κοπρανώδους µόλυνσης Η προσπάθεια στην οποία έχουν επιδοθεί πολλές ερευνητικές οµάδες προκειµένου να διακρίνουν την προέλευση της κοπρανώδους µόλυνσης στο υδάτινο περιβάλλον έχει συντελέσει στην ανάπτυξη πολλών διαφορετικών µικροβιολογικών και χηµικών µεθόδων (Πίνακας 3). Οι χηµικές µέθοδοι διάκρισης αφορούν στην ανίχνευση συγκεκριµένων ουσιών, οι οποίες υποδηλώνουν κυρίως την παρουσία ανθρώπινης µόλυνσης. Τέτοιες ουσίες είναι η καφεΐνη, οι κοπρανώδεις στερόλες και συστατικά απορρυπαντικών. Παρ όλα αυτά η παρουσία των ουσιών αυτών στο περιβάλλον δεν µπορεί να αποδοθεί µε ακρίβεια στον ανθρώπινο παράγοντα. Οι µέχρι τώρα µελέτες δεν έχουν δείξει σαφή συσχέτιση ανθρώπινης κοπρανώδος µόλυνσης και συγκεκριµένων χηµικών ουσιών ενώ συγχρόνως οι χηµικές µέθοδοι χαρακτηρίζονται από έλλειψη ευαισθησίας καταλήγοντας συχνά σε περιορισµένα κι ενδεχοµένως λανθασµένα συµπεράσµατα σχετικά µε την πηγή της εκάστοτε κοπρανώδους µόλυνσης (Sargeant 1999, Scott et al. 2002). Όσον αφορά στις µικροβιολογικές µεθόδους, ο βασικός άξονας όπου κινούνται περιλαµβάνει τη δηµιουργία µιας λεγόµενης «βιβλιοθήκης» (βάση δεδοµένων), που απαρτίζεται από χαρακτηριστικά γνωρίσµατα δεικτών κοπρανώδους µόλυνσης (Escherichia coli, κοπρανώδεις στρεπτόκοκκοι), γνωστής προέλευσης, βάσει της οποίας, πραγµατοποιείται διαχωρισµός άγνωστων στελεχών αποµονωµένων από το υδάτινο περιβάλλον. Η δηµιουργία βάσης δεδοµένων µπορεί να αποφευχθεί, όταν επιχειρείται η ανίχνευση και αποµόνωση συγκεκριµένων ειδών µικροοργανισµών, οι οποίοι υποδηλώνουν απευθείας την προέλευσή τους. Έτσι για παράδειγµα ο Enterococcus faecium δηλώνει ανθρώπινη κοπρανώδη µόλυνση ενώ ο Streptococcus bovis ζωική. Η αποφυγή δηµιουργίας «βιβλιοθήκης» γνωστών στελεχών µε την αναζήτηση ορισµένων ειδών µικροοργανισµών κρίνεται ως ένας οικονοµικός και γρήγορος τρόπος για τη διερεύνηση πηγής κοπρανώδους µόλυνσης (Vancanneyt et al. 2002, Scott et al. 2005). Εντούτοις, οι προτάσεις των περισσότερων ερευνητών αφορούν στη δηµιουργία βάσης δεδοµένων γνωστών στελεχών και διακρίνονται σε δύο ευρείες κατηγορίες, τις φαινοτυπικές και γονοτυπικές. 1. Φαινοτυπικές µέθοδοι διάκρισης κοπρανώδους µόλυνσης Πρόκειται για µεθόδους που βασίζονται στη µελέτη φαινοτυπικών χαρακτηριστικών οργανισµών που αποµονώνονται από το υδάτινο περιβάλλον. Μεταξύ αυτών οι κυριότερες 20

Εισαγωγή είναι η αναλογία κοπρανωδών κολοβακτηριοειδών προς κοπρανώδεις στρεπτοκόκκους, η ανάλυση βακτηριοφάγων και η µελέτη ανθεκτικότητας σε ποικιλία αντιβιοτικών. Η αναλογία των συγκεκριµένων µικροοργανισµών έβρισκε εφαρµογή σε προγενέστερα χρόνια καθώς είχε διαπιστωθεί ότι στα ανθρώπινα κόπρανα είχε τιµή µεγαλύτερη ή ίση µε 4,0 ενώ στα ζωικά µικρότερη του 0,7. Εντούτοις, η µέθοδος αυτή έχει αµφισβητηθεί έντονα δεδοµένης της µεταβολής της σύστασης του κοπρανώδους υλικού ανάλογα µε το περιβάλλον στο οποίο ανευρίσκεται. Συγκεκριµένα για τους κοπρανώδεις στρεπτοκόκκους έχει διαπιστωθεί ότι η συγκέντρωσή τους διαφοροποιείται σε µεγάλο βαθµό ανάλογα µε τη δίαιτα του ατόµου (Sargeant 1999, Simpson et al. 2002). Η ανίχνευση συγκεκριµένων τύπων βακτηριοφάγων στο υδάτινο περιβάλλον και η περαιτέρω ανάλυσή τους οδηγεί στον προσδιορισµό της πηγής της κοπρανώδους µόλυνσης. Συγκεκριµένα χρησιµοποιείται ο φάγος του Bacteroides fragilis HSP40, ο οποίος έχει ανιχνευτεί µόνο σε ανθρώπινα κόπρανα και οι F-RNA κολιφάγοι. Για τους τελευταίους έχει διαπιστωθεί ότι χωρίζονται σε τέσσερις οµάδες (Ι, ΙΙ, ΙΙΙ και ΙV) ανάλογα µε την προέλευσή τους. Έτσι, οι οµάδες Ι και ΙV υποδηλώνουν κοπρανώδη µόλυνση κυρίως ζωικής προέλευσης ενώ αντίστοιχα οι οµάδες ΙΙ και IΙΙ υποδηλώνουν παρουσία ανθρώπινου κοπρανώδους υλικού µε µια εξειδίκευση για την οµάδα ΙΙ, η οποία έχει ανιχνευθεί κυρίως σε απόβλητα (Mora et al. 2004, Ha and Stenstrom 2005). Η µελέτη ανθεκτικότητας σε ποικιλία αντιβιοτικών, µικροοργανισµών όπως είναι οι κοπρανώδεις στρεπτόκοκκοι και η E. coli έχει εφαρµοστεί εκτεταµένα για τη διάκριση της προέλευσης κοπρανώδους υλικού στο υδάτινο περιβάλλον (Kaspar & Burgess 1990, Wiggins 1996, Parveen et al. 1997, Hagedorn et al. 1999, Kariuki et al. 1999, Souza et al. 1999, Wiggins et al. 1999, Harwood et al. 2000, Goñi-Urriza et al. 2000, Graves et al. 2002, Khan et al 2002, Wiggins et al. 2003, Bryan et al. 2004, Hayes et al. 2004). Η αρχή στην οποία στηρίζεται είναι ότι µικροοργανισµοί ζωικής προέλευσης έχουν µικρότερη ανθεκτικότητα σε σχέση µε τους αντίστοιχους ανθρώπινης προέλευσης. Επίσης, ορισµένα ζώα έχουν την τάση να διαθέτουν ενδογενή βακτήρια µε ανθεκτικότητα σε συγκεκριµένους τύπους αντιβιοτικών (http://www.sourcemolecular.com/fingerprint.htm 2004). Με τον κατάλληλο συνδυασµό αντιβιοτικών και την κατάλληλη για την περίπτωση επεξεργασία των δεδοµένων (διαχωριστική ανάλυση discriminant analysis ) είναι δυνατόν να επιτευχθεί ο προσδιορισµός πηγής προέλευσης κάποιου άγνωστου στελέχους. Τα κύρια χαρακτηριστικά της µεθόδου που την καθιστούν ιδιαίτερα προσφιλή είναι η ευκολία και η ταχύτητα διεξαγωγής αποτελεσµάτων καθώς και το µικρό κόστος (Harwood et al. 2000, Wiggins et al. 2003, Samadpour et al. 2005). 21