ΚΕΦΑΛΑΙΟ 10 ο ΥΛΙΚΑ ΑΝΑΦΟΡΑΣ - ΙΧΝΗΛΑΣΙΜΟΤΗΤΑ ΔΙΑΠΙΣΤΕΥΣΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ Η ΕΝΝΟΙΑ ΤΗΣ ΑΒΕΒΑΙΟΤΗΤΑΣ

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 10 ο ΥΛΙΚΑ ΑΝΑΦΟΡΑΣ - ΙΧΝΗΛΑΣΙΜΟΤΗΤΑ ΔΙΑΠΙΣΤΕΥΣΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ Η ΕΝΝΟΙΑ ΤΗΣ ΑΒΕΒΑΙΟΤΗΤΑΣ Σύνοψη Στο κεφάλαιο αυτό θα περιγραφεί η χρήση των υλικών αναφοράς, από τους κατασκευαστές και τα εργαστήρια, ώστε να εξασφαλισθούν η τυποποίηση και η ιχνηλασιμότητα των μεθόδων και των αντιδραστηρίων που παράγουν ή χρησιμοποιούν αντίστοιχα. Προς το παρόν, δεν υπάρχουν υλικά αναφοράς για όλες τις παραμέτρους της εργαστηριακής ιατρικής, σε ορισμένες δε μόνο, υπάρχει διαθεσιμότητα για την ανώτερη τάξη αυτών των υλικών, τα ονομαζόμενα πιστοποιημένα υλικά αναφοράς. Πρόκειται για υλικά τα οποία είναι παγκοσμίως αναγνωρισμένα, διαθέτουν πιστοποιητικό και τιμή αβεβαιότητας. Θα εξηγηθεί η έννοια της αβεβαιότητας και θα δοθεί σχετικό παράδειγμα προσδιορισμού της σε ποσοτική μέτρηση παραμέτρου κλινικής χημείας. Η ιχνηλασιμότητα με υλικά αναφοράς, η διακρίβωση του εξοπλισμού και η εκτίμηση της αβεβαιότητας είναι ιδιαίτερα σημαντικές απαιτήσεις για την εκπλήρωση των προαπαιτούμενων και για τη διαπίστευση των κλινικών εργαστηρίων κατά ISO 15189. Όλα τα κλινικά εργαστήρια πρέπει να προσπαθήσουν προς αυτή την κατεύθυνση καθώς η διαπίστευση αποτελεί την ισχυρότερη απόδειξη ότι ένα εργαστήριο διαθέτει ποιότητα και παράγει αξιόπιστα αποτελέσματα. Προαπαιτούμενες γνώσεις Στο παρόν κεφάλαιο θα διδαχθούν γνώσεις χρήσιμες για την καθημερινότητα στο κλινικό εργαστήριο. Υπάρχουν προαπαιτούμενες γνώσεις από τα Kεφάλαια 1 και 9. Οι γνώσεις από τη Στατιστική και τη Χημειομετρία θα ήταν επίσης χρήσιμες για την κατανόηση βασικών αρχών του κεφαλαίου. 10.1 Υλικά αναφοράς Ιχνηλασιμότητα Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται από τα κλινικά εργαστήρια οφείλουν να διαθέτουν ιχνηλασιμότητα (traceability), όπου βέβαια αυτό είναι δυνατόν: η ιχνηλασιμότητα ορίζεται ως η ιδιότητα του αποτελέσματος μιας μέτρησης ή της τιμής ενός βαθμονομητή (calibrator) να συσχετισθεί με γνωστά υλικά αναφοράς (reference materials), συνήθως εθνικά ή διεθνή πρότυπα, μέσω μιας άρρηκτης αλυσίδας συγκρίσεων που έ- χουν όλα γνωστές αβεβαιότητες (EURACHEM/CITAC, 2003ˑ Ευαγγελόπουλος et al., 2006ˑ Λειμονή, 2008). Θα πρέπει να γίνει η διευκρίνιση ότι ο όρος ιχνηλασιμότητα ενίοτε χρησιμοποιείται και για τη δυνατότητα που υπάρχει στο εργαστήριο, όταν μέσω του συστήματος ποιότητας μπορεί να ανευρεθεί ανά πάσα στιγμή το ποιος, που, πότε, έκανε κάτι κατά την προ-αναλυτική, αναλυτική και μετα-αναλυτική φάση μιας κλινικής δοκιμής (sample, document, instrument, material traceability). Επίσης, αναφορικά με την έννοια της αβεβαιότητας (uncertainty) απαιτείται να αναφερθεί ήδη από αυτή την Ενότητα, ότι συνδέεται με το αποτέλεσμα μιας μέτρησης και είναι η διασπορά των τιμών, που λογικά μπορούν να αποδοθούν στη προσδιοριζόμενη παράμετρο (JCGM 100:2008, 2008ˑ Λυκόκα et al., 2006). Ιδανικά για κάθε μια μετρήσιμη εργαστηριακή παράμετρο (measurand), αφού ορισθεί το συστατικό που μας ενδιαφέρει (component) και το είδος της ποσότητας (kind of quantity π.χ. συγκέντρωση, ενεργότητα, αριθμός σωματιδίων κ.λπ.) που πρέπει να μετρηθεί σε ένα ορισμένο υπόστρωμα (π.χ. ορός), καθώς και η μονάδα μέτρησης, απαιτούνται πρότυπη μέθοδος μέτρησης, που θα μπορεί να εφαρμόζεται σε εξειδικευμένα εργαστήρια αναφοράς, και πρότυπο υλικό αναφοράς. Ωστόσο είναι λίγες οι παράμετροι που διαθέτουν πλήρες σύστημα αναφοράς: και πρότυπη μέθοδο και πρότυπο υλικό (περίπου 65) (Panteghini, 2009). Τα υλικά αναφοράς ανήκουν στη μεγάλη οικογένεια των υλικών ελέγχου ποιότητας (quality control materials ή QCM) μαζί με τους βαθμονομητές και τα controls: είναι υλικά που ελέγχονται για την ομοιογένεια και σταθερότητα τους (π.χ. ακόμη και μετά από 6 μήνες σε συνθήκες επιταχυνόμενης αποικοδόμησης στους 45 C ή/και 65 C, και ενίοτε με ανοιχτά σωληνάρια) (Emons et al., 2006ˑ Emons, 2006). 1

Σχήμα 10.1 Οικογένεια υλικών ελέγχου ποιότητας (με μπλε χρώμα οι βαθμονομητές και οι ιδιότητες τους και με κόκκινο χρώμα τα πιστοποιημένα υλικά αναφοράς και οι ιδιότητες τους) από (Emons et al., 2006ˑ Emons, 2006). Τα πιστοποιημένα υλικά αναφοράς (certified reference materials ή CRMs ή αλλιώς standard reference materials ή SRMs) είναι τα ανώτερα ιεραρχικά υλικά αναφοράς και διαθέτουν πιστοποιητικό, το οποίο αναφέρει τη ταυτότητα (με βάση τη δομή ή τη λειτουργία) και την ποσότητα του μετρούμενου συστατικού μαζί με δηλωμένη αβεβαιότητα, την ιχνηλασιμότητα του στο διεθνές SI σύστημα ή σε άλλη πρότυπη μέθοδο και τις οδηγίες ανασύστασης, εάν π.χ. είναι λυοφιλοποιημένο στερεό ή τις οδηγίες αποθήκευσης, εάν είναι υγρό. Επίσης, αναφέρει την καθαρότητά του ή το ποσοστό υγρασίας, (εάν υπάρχει) και τις αντίστοιχες μεθόδους ελέγχου, αλλά και όταν δεν είναι καθαρή ουσία, σε τι υπόστρωμα εντοπίζεται (καθαρό διαλύτη ή ανθρώπινο ορό ή οτιδήποτε άλλο) (Dybkaer, 1991ˑ European co-operation for Accreditation, 2003aˑ Μητρόπουλος, 2003). Τα υλικά αυτά παρασκευάζονται από διεθνείς οργανισμούς ή συμπράξεις επιστημονικών ενώσεων ή εμπορικές εταιρείες όπως οι JRC-IRMM, NIST, WHO, NIBSC, CDC, ATCC/Coriell, NGRL, LGC, Acrometrix, Advanced Biotechnologies, MMQCI κ.λπ. Στο τέλος του κεφαλαίου υπάρχουν παραπομπές για εύρεση υλικών αναφοράς μέσω διαδικτύου. Τα πιστοποιημένα υλικά αναφοράς είναι κατάλληλα για την επικύρωση της ορθότητας μιας μεθόδου, τη βαθμονόμηση, τον έλεγχο γραμμικότητας, την εύρεση του ορίου ανίχνευσης (κεφάλαιο 9) και ενίοτε, όταν το υπόστρωμα προσομοιάζει το αντίστοιχο του δείγματος των ασθενών και για τον εσωτερικό έλεγχο ποιότητας. Όταν πιστοποιημένα υλικά αναφοράς δεν είναι διαθέσιμα για τη μέθοδο που το εργαστήριο επιθυμεί να επικυρώσει ή επαληθεύσει, τότε μπορεί να χρησιμοποιήσει υλικά από εργαστήρια αναφοράς ή από διεργαστηριακά σχήματα εξωτερικού ελέγχου ποιότητας. Εάν και τέτοια υλικά δεν υπάρχουν, τότε μόνο το εργαστήριο θα στραφεί στα εμπορικά διαθέσιμα control (π.χ. από τον κατασκευαστή ή καλύτερα, εάν υπάρχουν, από άλλη εταιρεία που παρασκευάζει controls και είναι ανεξάρτητη από τον κατασκευαστή του αντιδραστηρίου). Για να γίνουν περισσότερο αντιληπτά τα ανωτέρω, παρατίθεται ως παράδειγμα στο Σχήμα 10.2 το πλήρες σύστημα αναφοράς για την ποσοτική παράμετρο της γλυκόζης με δύο πιστοποιημένα υλικά αναφοράς και δύο μεθόδους αναφοράς (primary, secondary) και το οποίο είναι ιδιαίτερα χρήσιμο στους κατασκευαστές σχετικών αντιδραστηρίων αλλά και στα εργαστήρια για την ιχνηλασιμότητα της μεθόδου που παράγουν ή χρησιμοποιούν. 2

Σχήμα 10.2 Σύστημα αναφοράς για τον ποσοτικό προσδιορισμό της γλυκόζης με δύο πρότυπες μεθόδους αναφοράς (σταθμική ανάλυση και φασματοσκοπία μάζας με τεχνική αραίωσης ισοτόπου ID-MS), που εκτελούνται από εργαστήρια αναφοράς και δύο πιστοποιημένα υλικά αναφοράς: ένα πρωτοταγές (primary), το οποίο αποτελείται από καθαρή κρυσταλλική γλυκόζη και ένα δευτεροταγές (secondary) που χρησιμοποιεί υπόστρωμα ίδιο με τα δείγματα των ασθενών. Αφού υπάρχει ιχνηλασιμότητα με πρότυπο υλικό ή/και πρότυπη μέθοδο, στη συνέχεια αναλαμβάνει ο κάθε κατασκευαστής να παρασκευάσει τους δικούς του βαθμονομητές: αρχικά τον master βαθμονομητή εργασίας για τη βαθμονόμηση της εσωτερικής μεθόδου που έχει επιλέξει (μπορεί να διαθέτει περισσότερες από μία) και στη συνέχεια το βαθμονομητή του προϊόντος (product) του αντιδραστηρίου που διαθέτει στα εργαστήρια («πελάτες») για συγκεκριμένη μέθοδο και για συγκεκριμένο αναλυτή που διαθέτουν. Όπως παρατηρούμε στο Σχήμα 10.3, η ιχνηλασιμότητα της μεθόδου είναι μέγιστη στα αρχικά στάδια, ενώ η αβεβαιότητα της μέτρησης είναι αντιστρόφως ανάλογη και μεγαλύτερη στα τελικά στάδια όταν παραλαμβάνεται και το τελικό αποτέλεσμα από τον ασθενή από το εργαστήριο ρουτίνας. 3

Σχήμα 10.3 Αλυσίδα της ιχνηλασιμότητας μιας μεθόδου από το εργαστήριο αναφοράς στον κατασκευστή και κατόπιν στον «καταναλωτή» που είναι το εργαστήριο ρουτίνας (Berding et al., 2010). Η παρασκευή του master βαθμονομητή είναι πολύ κρίσιμη για τη διαχρονική ακρίβεια της μεθόδου που προσφέρει ο κατασκευαστής, καθώς ο κατασκευαστής οφείλει να ελέγχει σε τακτά χρονικά διαστήματα την ιχνηλασιμότητα. Μόνο με αυτόν τον τρόπο, δηλαδή με συνεχείς βαθμονομήσεις, αποδόσεις τιμών και εσωτερικό έλεγχο ποιότητας, όπως φαίνεται στη στρατηγική που ακολουθείται στο Σχήμα 10.4Α, διασφαλίζεται η τυποποίηση (standardization) της μεθόδου (Berding et al., 2010ˑ Panteghini, 2009). Ο master βαθμονομητής μπορεί να είναι είτε ένα πιστοποιημένο (εάν υπάρχει) υλικό αναφοράς και οι αραιώσεις του, είτε ένα σετ δειγμάτων ασθενών τα οποία έχουν μετρηθεί με πρότυπη μέθοδο και διαθέτουν ένα ευρύ εύρος τιμών. Συνεπώς αυτά τα δείγματα χρησιμοποιεί ο κατασκευαστής για τη βαθμονόμηση της επιλεγμένης μεθόδου του (Σχήμα 10.4Β). Ο master βαθμονομητής διαμοιράζεται σε ισομερίδια (aliquots) σε βαθιά κατάψυξη για όσο χρονικό διάστημα θεωρείται ότι είναι σταθερός. Παράλληλα φυλάσσονται με ανάλογο τρόπο άλλα δείγματα ασθενών που χρησιμοποιούνται για τη σύγκριση μεταξύ της επιλεγμένης μεθόδου του κατασκευαστή και της πρότυπης μεθόδου. Για την ισοδυναμία των μεθόδων πρέπει να ισχύουν τα προαναφερθέντα στην Ενότητα 9.4, δηλαδή η κλίση του διαγράμματος σύγκρισης να μην διαφέρει στατιστικά από το 1 και η τεταγμένη στον κάθετο άξονα από το 0 (Σχήμα 10.4C). 4

Α Β C Σχήμα 10.4 Τυποποίηση της μεθόδου ενός κατασκευαστού (έχει αφαιρεθεί το όνομά του για ευνόητους λόγους) για τον ποσοτικό προσδιορισμό της τεστοστερόνης: Α) διαδοχική σειρά τεσσάρων βαθμονομήσεων (Cal 0-Cal 3) και πέντε αποδόσεων τιμών (value assignments I-V) με χρήση δύο προτύπων μεθόδων της σταθμικής ανάλυσης και του ID-MS σε ζυγισμένη καθαρή ουσία (δεν υπάρχει πιστοποιημένο υλικό αναφοράς), Β) βαθμονόμηση Cal 1 με τη βοήθεια δειγμάτων μετρημένων με ID-MS και C) σύγκριση της επιλεγμένης από τον κατασκευαστή και της ID-MS μεθόδου με άλλα δείγματα ασθενών τα οποία χρησιμοποιούνται ως εσωτερικός έλεγχος ποιότητας (QC R1) (Berding, et al., 2010). 5

Πρέπει να τονισθεί ότι, όταν χρησιμοποιούνται για τη βαθμονόμηση μιας μεθόδου, τα υλικά αναφοράς ή οι βαθμονομητές πρέπει να συμπεριφέρονται εναλλάξιμα (commutable) με τα κλινικά δείγματα δηλαδή να συμπεριφέρονται με τον ίδιο τρόπο (να συνδέονται με το σήμα της μεθόδου με την ίδια μαθηματική σχέση) (Miller et al., 2011). Η έννοια αυτή μπορεί να γίνει καλύτερα αντιληπτή εάν παρατηρήσουμε προσεκτικά στο διάγραμμα σύγκρισης της μεθόδου του κατασκευστού με μια άλλη (κατά προτίμηση πρότυπη) μέθοδο που εντοπίζονται οι τιμές των συγκεκριμένων υλικών (Σχήμα 10.5). Σχήμα 10.5 Στο αριστερό σχήμα, τα υλικά αναφοράς ή οι βαθμονομητές συμπεριφέρονται με τον ίδιο τρόπο όπως τα κλινικά δείγματα γι αυτό και συνεντοπίζονται στη γραμμή παλινδρόμησης της σύγκρισης δύο μεθόδων ενώ το ίδιο δεν συμβαίνει στο δεξιό σχήμα: εδώ υπάρχει πρόβλημα εναλλαξιμότητας (commutability) (Miller et al., 2011). Σε παραμέτρους όπου δεν υπάρχουν ούτε πιστοποιημένα υλικά αναφοράς ούτε πρότυπες μέθοδοι υ- πάρχει πραγματικά διεθνές πρόβλημα, καθώς ο κάθε κατασκευαστής παράγει τους δικούς του βαθμονομητές χωρίς να υπάρχει ιχνηλασιμότητα, με συνέπεια να μην μπορεί να υπάρξει αξιόπιστη φορητότητα των αποτελεσμάτων των ασθενών. Απαιτείται ιδιαίτερη προσπάθεια από τις επιστημονικές εταιρείες για τη δημιουργία κατάλληλων υλικών αναφοράς, ώστε να υπάρχει τουλάχιστον διεθνώς μια εναρμόνιση των μεθόδων (harmonization). 10.2 Διαπίστευση κλινικών εργαστηρίων Το ακρωνύμιο της παγκόσμιας οργάνωσης-δικτύου για την τυποποίηση (International Organization for Standardization) είναι για όλες τις γλώσσες το ίδιο και είναι το ISO, το οποίο προήλθε από την ελληνική λέξη «ίσος». Είναι δε ενδεικτικό του στόχου αυτού του παγκόσμιου φορέα, ο οποίος ιδρύθηκε το 1946 και έχει ως μέλη εθνικούς οργανισμούς τυποποίησης, να εκδίδει - μέσω τεχνικών επιτροπών - πρότυπα για την εναρμόνιση των προϊόντων και υπηρεσιών σε διάφορους τομείς της οικονομίας σε όλα τα κράτη-μέλη. Την Ελλάδα αντιπροσωπεύει σε αυτόν τον οργανισμό ο Ελληνικός Οργανισμός Τυποποίησης (ΕΛ.Ο.Τ.). Η εφαρμογή προτύπων και στα κλινικά εργαστήρια προέκυψε από την ανάγκη για τεκμηρίωση και αμοιβαία αναγνώριση των εργαστηριακών αποτελεσμάτων, που διακινούνται και παρέχονται παγκοσμίως. Αυτό οδηγεί σε μια ελεύθερη διακίνηση των υπηρεσιών των κλινικών εργαστηρίων διεθνώς, ισοδυναμία ελέγχων σε όλα τα κράτη-μέλη, εναρμόνιση μέσω ομοιόμορφης εφαρμογής οδηγιών, αποδοχή της αξιοπιστίας αποτελεσμάτων και δημόσιων πιστοποιητικών από όλα τα κράτη και υγιή ανταγωνισμό, ο οποίος αποβαίνει τελικά προς όφελος του «πελάτη-ασθενή» (Μπακέας, 2006). Στη σύγχρονη ιατρική πρακτική, ο ρόλος του κλινικού εργαστηρίου γίνεται ολοένα και πιο σημαντικός για τη διάγνωση, πρόγνωση, παρακολούθηση και θεραπευτική α- γωγή των ασθενών. Η απαίτηση συνεπώς για εργαστηριακά αποτελέσματα ακριβή και αξιόπιστα είναι προφανής και αναγκαία (Βογιατζάκης, 2007). Ένα κλινικό εργαστήριο πέραν της φήμης του, που ασφαλώς δεν αποτελεί μετρήσιμη και αντικειμενική ιδιότητα, μπορεί να επιδείξει κάποια από τα ακόλουθα επίσημα έγγραφα σε ιατρούς ή ασθενείς, τα οποία θα αποδεικνύουν την αξία του: 6

Αδειοδότηση (licensing): επίσημη άδεια λειτουργίας από το κράτος σε ένα εργαστήριο ότι με βάση τη νομοθεσία μπορεί να διεξάγει εργαστηριακές μετρήσεις. Πιστοποίηση (certification): γραπτή βεβαίωση από διαπιστευμένο φορέα πιστοποίησης ότι το εργαστήριο «συμμορφώνεται» σε ένα Πρότυπο ή σε μια Οδηγία με την εφαρμογή συστήματος διαχείρισης ποιότητας. Διαπίστευση (accreditation): επίσημη αναγνώριση από τον αρμόδιο Εθνικό φορέα ότι ένα εργαστήριο είναι «τεχνικά επαρκές» να διεξάγει συγκεκριμένες δοκιμασίες. Μερικά από τα ανωτέρω έγγραφα είναι υποχρεωτικά ανάλογα με τη νομοθεσία κάθε κράτους, ενώ άλλα αναμένεται να γίνουν με τη πάροδο του χρόνου, π.χ. στην Ευρώπη είναι υποχρεωτική η διαπίστευση στη Γαλλία και στη Ρουμανία σε όλα τα κλινικά εργαστήρια, στο Βέλγιο και στη Γερμανία μόνο σε εκείνα που παρέχουν γενετικά αποτελέσματα ή/και νεογνικό έλεγχο. Σε άλλα κράτη η κάλυψη ή η αποζημίωση από δημόσιους ή ιδιωτικούς ασφαλιστικούς οργανισμούς για εκτέλεση παραπεμπτικών με εργαστηριακές εξετάσεις, γίνεται μόνο όταν αυτές διενεργούνται από διαπιστευμένα εργαστήρια. Φορείς πιστοποίησης μπορεί να υπάρχουν πολλοί, ωστόσο μόνο ένας αρμόδιος φορέας διαπίστευσης λειτουργεί ανά χώρα. Στην Ελλάδα είναι το Ε.ΣΥ.Δ (Εθνικό Σύστημα Διαπίστευσης) το οποίο έχει ενταχθεί μαζί με τον ΕΛ.Ο.Τ. και το Ε.Ι.Μ. (Ελληνικό Ινστιτούτο Μετρολογίας) στο Εθνικό Σύστημα Υποδομών Ποιότητας (Ε.Σ.Υ.Π.). Το Ε.ΣΥ.Δ συμμετέχει σε συμφωνίες αμοιβαίας αναγνώρισης με πολλούς αντίστοιχους εθνικούς φορείς άλλων χωρών, αλλά και με ανώτερους διακρατικούς οργανισμούς, όπως η EA (European co-operation for Accreditation) και η ILAC (International Laboratory Accreditation Cooperation). Οι φορείς πιστοποίησης διαπιστεύονται για πιστοποίηση σε διάφορους τομείς, από τον φορέα διαπίστευσης. Το κατάλληλο πρότυπο για τα κλινικά εργαστήρια είναι το ISO 15189, το οποίο αρχικά συντάχθηκε το 2003 από την τεχνική επιτροπή TC 212 για να αναθεωρηθεί στη συνέχεια το 2007 και προσφάτως το 2012 (Huisman, 2012ˑ International Standards Organisation, 2012). Το πρότυπο έχει και διοικητικές και διαχειριστικές απαιτήσεις, οι οποίες είναι παρόμοιες με αυτές του προτύπου πιστοποίησης ISO 9001:2000 και από το Σεπτέμβριο του 2009 υπάρχει διεθνή συμφωνία με βάση την οποία θεωρείται ότι τα διαπιστευμένα εργαστήρια πληρούν ταυτόχρονα τις απαιτήσεις πιστοποίησης κατά ISO 9001. Τα οφέλη της διαπίστευσης ενός κλινικού εργαστηρίου κατά ISO 15189 είναι πολλά για το εργαστήριο, τους ασθενείς και το κράτος. Για το εργαστήριο είναι η απόδειξη ότι εφαρμόζει σύστημα ποιότητας, είναι τεχνικά επαρκές και παράγει αξιόπιστα αποτελέσματα, σύμφωνα με διεθνή πρότυπα. Η κάλυψη των απαιτήσεων του προτύπου επιφέρει αρχικά οικονομικό «κόστος ποιότητας» στο εργαστήριο, ωστόσο εκτιμάται ότι μέσω των μειωμένων επαναλήψεων των εργαστηριακών εξετάσεων, των μειωμένων άστοχων ενεργειών του εργαστηρίου, αλλά και της αυξημένης ικανοποίησης των ιατρών και των ασθενών, η οποία δημιουργεί αυξημένο κύρος στο εργαστήριο, μακροπρόθεσμα δημιουργούνται οικονομικά οφέλη. Για τους ασθενείς διασφαλίζει την αξιοπιστία των αποτελεσμάτων τους και οδηγεί σε μικρότερη ανάγκη για επανέλεγχο (ειδικά, όταν πρέπει να μεταβούν στο εξωτερικό). Για τους κρατικούς φορείς, υπάρχει αυξημένη εμπιστοσύνη για τη λήψη αποφάσεων στον τομέα της Υγείας με βάση τεκμηριωμένα δεδομένα, μείωση της «αβεβαιότητας» και αύξηση της αποτελεσματικότητας των ελέγχων. Οι κυριότερες από τις διοικητικές απαιτήσεις που εξετάζει το πρότυπο ISO 15189:2012 αναφέρονται στη συνέχεια επιγραμματικά (International Standards Organisation, 2012ˑ Μπακέας, 2006): α) οργανόγραμμα ορισμός υπευθύνου ποιότητας, β) σύστημα ποιότητας και εγχειρίδιο ποιότητας, γ) συμβάσεις-υπηρεσίες και προμήθειες, δ) τήρηση και έλεγχος αρχείων, ε) αρχείο παραπόνων, στ) καταγραφή και έλεγχος μη συμμορφώσεων (non-conformities), ζ) διορθωτικές και προληπτικές ενέργειες (corrective and preventive actions), η) διεξαγωγή εσωτερικών επιθεωρήσεων (internal audits), θ) θέσπιση δεικτών ποιότητας (quality indicators) και ι) ανασκόπηση από τη διοίκηση (management review). Η λειτουργία ενός συστήματος ποιότητας ασφαλώς απαιτεί γραφειοκρατική εργασία κατά την εγκατάστασή του, αλλά και τη διατήρησή του, ωστόσο τα πέντε σημεία στα οποία πρέπει να επικεντρωθούν οι εργαστηριακοί επιστήμονες και είναι και τα πιο δύσκολα, αλλά και τα πιο σημαντικά για την αναγνώριση της «τεχνικής επάρκειας» ενός κλινικού εργαστηρίου κατά ISO15189 είναι τα ακόλουθα (Κρούπης, 2008ˑ Κρούπης, 2009ˑ Σταθάκη-Φερδερίγου et al., 2006): Α) Υποδομή εργαστηρίου: Το προσωπικό πρέπει να είναι επαρκές σε αριθμό και γνώσεις και να ακολουθεί πρόγραμμα συνεχιζόμενης εκπαίδευσης. Οι εγκαταστάσεις πρέπει να είναι άριστες ως προς την άνεση και την ασφάλεια χώρου και φιλικές ως προς το περιβάλλον (κατάλληλη διαχείριση βιολογικών αποβλήτων). Πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα για την ασφάλεια του προσωπικού από δυνητικά επικίνδυνα δείγματα και αντιδραστήρια. Ο κρίσιμος μετρητικός εξοπλισμός για τη λειτουργία ενός εργαστηρίου πρέπει να διακριβώνεται 7

για την ορθή λειτουργία του ως προς τα διεθνή πρότυπα όταν υπάρχουν ή να γίνεται έλεγχος καλής επίδοσης (performance check), όταν αυτά δεν υπάρχουν. Ψυγεία, καταψύκτες, φυγόκεντροι, vortex, ζυγοί και πεχαμετρικές συσκευές πρέπει να καθαρίζονται και να συντηρούνται. Β) Επιλογή των κατάλληλων εργαστηριακών μεθόδων για τις υπό διαπίστευση παραμέτρους με βάση τη βιβλιογραφία και συγκεκριμένους στόχους (π.χ. ελάττωση του εργαστηριακού σφάλματος, κλινική χρησιμότητα) και τα πρακτικά χαρακτηριστικά της εφαρμογής της (application characteristics): είδος και ποσότητα δείγματος, ταχύτητα προσδιορισμού και χρόνος απόκρισης του εργαστηρίου, είδος δοκιμασίας (π.χ. screening test), απαιτούμενοι χειρισμοί του δείγματος, απαιτούμενες γνώσεις από το προσωπικό, κόστος, συχνότητα βαθμονόμησης εξοπλισμού και μεθόδου, διαθεσιμότητα υλικών ελέγχου ποιότητας, δυνατότητα αποθήκευσης του δείγματος κ.λπ. (Κρούπης, 2008ˑ Κρούπης, 2009). Οι παράμετροι για τις οποίες διαπιστεύεται το εργαστήριο και οι αντίστοιχοι μέθοδοι και υποστρώματα περιγράφονται πλήρως στο επίσημο πεδίου διαπίστευσης, ΕΠΕΔ (scope of accreditation) το οποίο αναρτάται στο διαδίκτυο. Υπάρχει σύσταση και οδηγία, ώστε στο μέλλον τα εργαστήρια να διαπιστεύονται σε πιο «ευέλικτο πεδίο» (flexible scope) και με τον τρόπο αυτό να διευκολυνθεί η ταχεία εισαγωγή καινοτόμων μεθοδολογιών από το εργαστήριο (Thelen et al., 2015). Οι μέθοδοι πρέπει να περιγράφονται επαρκώς στο εγχειρίδιο των μεθόδων και να ακολουθεί η σύνταξη τυποποιημένων οδηγιών (Standard Operating Procedures ή SOPs) για την κατάλληλη εφαρμογή τους από το προσωπικό του εργαστηρίου. Η πιστή εκτέλεση των ανωτέρω μεθόδων, αλλά και των κανόνων της ορθής εργαστηριακής πρακτικής (Good Laboratory Practice ή GLP), πρέπει να είναι αντικείμενο συχνών εσωτερικών επιθεωρήσεων. Πρέπει να γίνεται προσπάθεια μείωσης της προ-αναλυτικής διακύμανσης με κατάλληλες οδηγίες προς το προσωπικό, τους «χρήστες» (ιατρούς) και τους «πελάτες» (ασθενείς) για τη σωστή προετοιμασία του ασθενούς, για τη δειγματοληψία στο σωστό χρονικό σημείο αναφορικά με τη πορεία της νόσου (specimen timing), τη σωστή επιλογή αντιπηκτικού για το σωληνάριο δειγματοληψίας, τη σωστή ταυτοποίηση του δείγματος, το σωστό χειρισμό και την ταχεία μεταφορά του δείγματος, τη θερμοκρασία μεταφοράς και αποθήκευσής του έως την ώρα του προσδιορισμού, τη σωστή φυγοκέντρηση κ.λπ. (Guder et al., 2003). Επίσης πρέπει να ελέγχονται και οι μετα-αναλυτικές διαδικασίες, που αφορούν την τήρηση των χρονικών διαστημάτων για τη φύλαξη των δειγμάτων, τη σωστή μεταφορά των ληφθέντων δεδομένων και των αποτελεσμάτων (π.χ. ιδανικά μέσω Laboratory Information System ή LIS) και τέλος το σωστό τρόπο παρουσίασης στην έκθεση των αποτελεσμάτων (report). Το πρότυπο περιλαμβάνει επίσης, μέριμνα για την ασφάλεια του εργαστηριακού υπολογιστικού συστήματος καθώς και για τον κώδικα Δεοντολογίας στην εργαστηριακή Ιατρική (αναφορικά με τη συλλογή προσωπικών δεδομένων και δειγμάτων, το ιατρικό απόρρητο, την πρόσβαση και την διατήρηση αρχείων με εργαστηριακά αποτελέσματα και τις οικονομικές συναλλαγές του εργαστηρίου). Γ) Επικύρωση ή επαλήθευση μεθόδων. Το εργαστήριο καλείται απλά να επαληθεύσει (verification) τις μεθόδους που επιλέγει όταν αυτές είναι πρότυπες μέθοδοι αναφοράς ή αποδεκτές τυποποιημένες (π.χ. εγκεκριμένες από το FDA ή IVD-CE αντιδραστήρια ή kits), καλείται δηλαδή να αποδείξει ότι στα «δικά του χέρια», στις δικές του εργασιακές συνθήκες, με το δικό του προσωπικό και εξοπλισμό, μπορεί να επιτύχει τα ίδια ή καλύτερα αποτελέσματα στα χαρακτηριστικά επίδοσης από αυτά που αναφέρει ο κατασκευαστής. Εάν επιλέξει να αναπτύξει δική του εσωτερική in-house μέθοδο, τότε πρέπει να διεξάγει πειράματα βελτιστοποίησης (optimization), να τα καταγράψει κατάλληλα (documentation) και στη συνέχεια να επικυρώσει τη μέθοδο ως προς: α) τα αναλυτικά χαρακτηριστικά που περιγράφηκαν στην Ενότητα 9.4 και β) τα κλινικά χαρακτηριστικά (clinical validation). Η μέθοδος προς διαπίστευση πρέπει να δίνει ικανοποιητικά αποτελέσματα για τον ενδεικνυόμενο σκοπό (fit for purpose), ο οποίος είναι η ανίχνευση ενός νοσήματος (πρέπει λοιπόν η μέθοδος να διαθέτει ικανοποιητική διαγνωστική κλινική ευαισθησία και ειδικότητα, αρνητική και θετική προβλεπτική αξία). Επίσης πρέπει να έχει κλινική αξία (clinical utility), δηλαδή, να είναι χρήσιμη στη διάγνωση και στη θεραπεία του ασθενούς και όχι να έχει απλά ερευνητική χρήση. Οπου είναι δυνατόν, πρέπει να αποδεικνύεται η ιχνηλασιμότητα των μετρήσεων με σύγκριση με μεθόδους αναφοράς και η χρήση πιστοποιημένων υλικών αναφοράς, όπως προαναφέρθηκε στην Ενότητα 10.1 (Panteghini, 2009). Στις ποσοτικές μεθόδους ο- φείλει να εκτιμήσει την αβεβαιότητά τους (Ενότητα 10.3) Δ) Εσωτερικός έλεγχος ποιότητας (βλ. Κεφάλαιο 11). Ε) Εξωτερικός έλεγχος ποιότητας (βλ. Κεφάλαιο 11). 8

Η μη επιτυχής επίδοση του εργαστηρίου σε οποιονδήποτε από τους ανωτέρω πέντε τομείς οι οποίοι αποτελούν τους «πυλώνες της ποιότητας» αποτελεί σοβαρή μη συμμόρφωση (non conformity) και μπορεί να αποτελέσει αιτία για τη μη απονομή ή για την απώλεια της διαπίστευσης του, είτε κατά την αρχική αξιολόγηση, είτε και κατά την ετήσια επιτήρηση ή την επαναξιολόγηση ανά τετραετία, αντίστοιχα (Κρούπης, 2014). 10.3 Αβεβαιότητα Η έννοια της αβεβαιότητας αντιμετωπίστηκε παγκοσμίως αρχικά με σκεπτικισμό από τα κλινικά εργαστήρια, καθώς είχαν συνηθίσει στη χρήση του ολικού σφάλματος. Όμως το ολικό σφάλμα αθροίζει δύο ποσότητες, εκ των οποίων η μία - η μεροληψία - έχει πρόσημο και αυτό αποτελεί πρόβλημα στον ακριβή υπολογισμό του (Kallner, 2013). Η αβεβαιότητα ορίζεται ως η διασπορά των τιμών που λογικά μπορούν να αποδοθούν στη προσδιοριζόμενη παράμετρο (Ευαγγελόπουλος et al., 2006ˑ CLSI, 2012ˑ Λεϊμονή, 2008ˑ Λυκόκα et al., 2006ˑ EURACHEM/CITAC CG4, 2000ˑ JCGM 100:2008, 2008ˑ JCGM 200:2008, 2008). Η εκτίμηση της αβεβαιότητας εκτός από το ότι πλέον αποτελεί απαίτηση της διαπίστευσης κατά ISO 15189 είναι πολύ χρήσιμη: α) στην εκτίμηση της ορθότητας της μεθόδου, εάν μετρηθεί ένα πιστοποιημένο υλικό αναφοράς και συγκριθεί η τιμή μέτρησης με την πιστοποιημένη τιμή, β) στη σύγκριση δύο τιμών που προέρχονται από το ίδιο εργαστήριο με την ίδια μέθοδο, γ) στη σύγκριση δύο μεθόδων και την επιλογή αυτής με τη μικρότερη αβεβαιότητα και δ) στη λήψη θεραπείας σε σχέση με ένα κλινικό όριο απόφασης ή μια κρίσιμη τιμή (Σχήμα 10.6). Συνεπώς, η αβεβαιότητα δεν υπονοεί την αμφιβολία για την αξιοπιστία του αποτελέσματος, αντίθετα μας δίνει αυξημένη σιγουριά για το εύρος στο οποίο βρίσκεται η πραγματική τιμή. Σχήμα 10.6 Η χρήση της αβεβαιότητας μιας μέτρησης σε σχέση με ένα ανώτερο όριο λήψης θεραπευτικής απόφασης: οι περιπτώσεις I και IV είναι με βεβαιότητα πάνω και κάτω από το κρίσιμο αυτό όριο ενώ το ίδιο δεν ισχύει για τις περιπτώσεις II και III (EURACHEM/CITAC, 2007). Μία μέθοδος για τη γραφική απεικόνιση των πηγών αβεβαιότητας στο αποτέλεσμα μίας μέτρησης είναι το διάγραμμα Ishikawa ή διάγραμμα αιτίας και αποτελέσματος (cause and effect diagram) ή διάγραμμα ψαροκόκαλο (fish-bone diagram), καθώς μοιάζει με τον σκελετό ψαριού (Σχήμα 10.7). Δημιουργήθηκε από τον καθηγητή χημικής μηχανικής του Πανεπιστημίου του Τόκιο Kaoru Ishikawa το 1968, αρχικά για την μέθοδο της ανάλυσης αιτίας και αποτελέσματος (Cause and Effect Analysis) και ως ένα εργαλείο για τον έλεγχο ποιότητας, αλλά στη συνέχεια άρχισε να χρησιμοποιείται και για άλλες μεθόδους. 9

Σχήμα 10.7 Το διάγραμμα ψαροκόκαλο καταδεικνύει τις πιθανές πηγές αβεβαιότητας στο αποτέλεσμα μιας μετρούμενης ποσότητας (Καπετανστρατάκη, 2015). Παρ όλο που είναι πολύ σημαντικό να ελαχιστοποιούμε τις αβεβαιότητες που σχετίζονται με την προ-αναλυτική και τη μετα-αναλυτική φάση πριν και μετά τη μέτρηση, η αβεβαιότητα της μέτρησης που μπορεί πιο εύκολα να υπολογίσει το κλινικό εργαστήριο αφορά μόνο τις αβεβαιότητες που προκύπτουν από το σύστημα της μέτρησης, δηλαδή από την προετοιμασία του δείγματος έως και τη λήψη του αποτελέσματος της μέτρησης. Ο καθορισμός των μεταβλητών από τις οποίες αποτελείται η συνάρτηση μέτρησης (measurement function) y = f(x 1, x 2, x 3, x n), της επιρροής τους και ο υπολογισμός των τυπικών τους αβεβαιοτήτων και των αλληλεπιδράσεών τους στο μοντέλο καλείται προϋπολογισμός αβεβαιότητας (uncertainty budget). Η αβεβαιότητα συνήθως, εκφράζεται μαθηματικά ως τυπική απόκλιση ή ως σχετική τυπική απόκλιση (βλ. Ενότητα 2.1) και οι αβεβαιότητες που σχετίζονται με τις επί μέρους ποσότητες, όταν είναι εκφρασμένες ως τυπικές αποκλίσεις ονομάζονται τυπικές αβεβαιότητες (standard uncertainties) και συμβολίζονται ως u(x) ή u x. Οι τυπικές αβεβαιότητες μπορούν να εκτιμηθούν είτε πειραματικά με στατιστική ανάλυση μίας σειράς από μετρήσεις (Τύπου Α), είτε από άλλες πηγές πληροφόρησης (Τύπου Β, π.χ. δεδομένα κατασκευαστών, βιβλιογραφία, προηγούμενη εμπειρία κ.λπ.), είτε από έναν συνδυασμό των δύο αυτών μεθόδων. Η επιλογή εξαρτάται από την φύση της μέτρησης και την διαθεσιμότητα της απαιτούμενης πληροφορίας. Στη συνέχεια οι τυπικές αυτές αβεβαιότητες συνδυάζονται, για να δώσουν τη συνδυασμένη τυπική αβεβαιότητα u c(y) (combined standard uncertainty) της μέτρησης με τη χρήση των κανόνων μετάδοσης σφάλματος (error propagation rules). Οι ακόλουθοι κανόνες είναι οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενοι (Καπετανστρατάκη, 2015): 1) Όταν η συνάρτηση μέτρησης έχει τη μορφή y = x 1 ± x 2 και τα x 1 και x 2 είναι ανεξάρτητα μεταξύ τους (δηλαδή η συμμεταβλητότητα cov(x 1, x 2) = 0), τότε η συνδυασμένη τυπική αβεβαιότητα του y δίνεται από την Εξίσωση 10.1: u c (y) = u(x 1 ± x 2 ) = u 2 (x 1 ) + u 2 (x 2 ) (Εξίσωση 10.1) 2) Όταν η συνάρτηση μέτρησης έχει τη μορφή y = x 1 * x 2 ή y = x 1/x 2 και τα x 1 και x 2 είναι ανεξάρτητα (δηλαδή cov(x 1, x 2) = 0), τότε η σχετική συνδυασμένη τυπική αβεβαιότητα (relative combined uncertainty) του y δίνεται από την Εξίσωση 10.2: u c (y) = u(x 1 x 2 ) y (ή = u(x 1 x 2 ) ) = ( u(x 1) ) 2 + ( u(x 2) ) 2 (Εξίσωση 10.2) x 1 x 2 x 1 x 2 x 1 x 2 όπου το y αντιστοιχεί στην απόλυτη τιμή της συνάρτησης και επομένως η συνδυασμένη τυπική αβεβαιότητα δίνεται από την Εξίσωση 10.3: 10

u c (y) = y ( u(x1) x1 )2 + ( u(x2) x2 )2 (Εξίσωση 10.3) Όταν τα x 1 και x 2 δεν είναι ανεξάρτητα [cov(x 1, x 2) 0] ή υπάρχει ύψωση σε δύναμη ή λογαρίθμηση ισχύουν άλλοι κανόνες. Για να υπάρχει ένα επίπεδο εμπιστοσύνης που αντιστοιχεί σε μία καθορισμένη πιθανότητα, η συνδυασμένη αβεβαιότητα πολλαπλασιάζεται με έναν συντελεστή κάλυψης k (coverage factor): U(y) = ±k u c (y) (Εξίσωση 10.4) Επομένως, η αβεβαιότητα που προκύπτει μετά από τον πολλαπλασιασμό με τον συντελεστή αυτό ονομάζεται διευρυμένη αβεβαιότητα U(y) (expanded uncertainty) της μέτρησης. Το διάστημα που προκύπτει με τη χρήση k = 2 δίνει 95% εμπιστοσύνη ότι η πραγματική τιμή βρίσκεται εντός του διαστήματος, ενώ για k = 3 το επίπεδο εμπιστοσύνης είναι 99%. Αυτές οι τιμές όμως προϋποθέτουν ότι η κατανομή των ποσοτήτων επιρροής y είναι κανονική και ότι ο υπολογισμός της συνδυασμένης τυπικής αβεβαιότητας έγινε με την εκτίμηση ενός ικανοποιητικού αριθμού παρατηρήσεων n (συνήθως n > 10). Η αβεβαιότητα μέτρησης μπορεί να εκτιμηθεί με δύο διαφορετικές προσεγγίσεις: Bottom up modeling approach: Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην πλήρη κατανόηση των αιτιών από τις οποίες εξαρτάται η αβεβαιότητα ενός αποτελέσματος και της επιρροής τους στη συνάρτηση μέτρησης. Η μέθοδος αυτή συνήθως αναφέρεται ως μέθοδος GUM (Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement) (JCGM 100:2008, 2008). Top down modeling approach: Η μέθοδος αυτή που χρησιμοποιείται συνηθέστερα από τα κλινικά εργαστήρια και περιγράφεται με ένα παράδειγμα στη συνέχεια. Χρησιμοποιεί στατιστικές αρχές για να εκτιμήσει απευθείας την συνολική αβεβαιότητα ενός συστήματος μέτρησης, συνήθως με την εκτίμηση πειραματικών δεδομένων από ειδικά πρωτόκολλα, από έλεγχο ποιότητας (Quality Control ή QC data) ή από επαλήθευση μίας μεθόδου. Ιδανικά οι αβεβαιότητες που εκτιμώνται από τις δύο μεθόδους θα πρέπει να είναι παρόμοιες. Σύνοψη των βημάτων με τη μέθοδο top down Βήμα 1: Προσδιορισμός της μετρούμενης ποσότητας. Βήμα 2: Υπολογισμός της ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας (u prec ). Βήμα 3: Υπολογισμός της μεροληψίας της μέτρησης (u bias ) με χρήση των u(c ref ) και u rep. Βήμα 4: Υπολογισμός της συνδυασμένης τυπικής αβεβαιότητας. Εάν η τιμή της μεροληψίας δεν είναι στατιστικά σημαντική τότε u c = u prec, αλλιώς: u c = u bias 2 + u prec 2 (Εξίσωση 10.5) Επανεξέταση και αν είναι απαραίτητο, επαναξιολόγηση των πηγών με μεγάλη αβεβαιότητα. Βήμα 5: Υπολογισμός της διευρυμένης αβεβαιότητας- Παρουσίαση των αποτελεσμάτων. Παράδειγμα: Εκτίμηση της αβεβαιότητας μέτρησης για την κρεατινίνη στον ανθρώπινο ορό με τη μέθοδο top down (Καπετανστρατάκη, 2015). Βήμα 1: Προσδιορισμός της μετρούμενης ποσότητας (συγκέντρωσης) 11

Μετρούμενη Ποσό της συγκέντρωσης της κρεατινίνης στον ανθρώπινο ορό ποσότητα Μονάδες mmol/l Διαδικασία μέτρησης Φασματοφωτομετρική διαδικασία Jaffe με αλκαλικό διάλυμα πικρικού οξέος Ιχνηλασιμότητα NIST SRM 967a Βήμα 2: Υπολογισμός της ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας Τα δεδομένα για την ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα για ορό ελέγχου ποιότητας λήφθηκαν για τουλάχιστον 6 μήνες και έδωσαν μέση τιμή 0,4041 mmol/l και τυπική απόκλιση 0,01136 mmol/l με CV 2,81%. Στο διάστημα αυτό οι συνθήκες αναπαραγωγιμότητας περιλάμβαναν διαφορετικές παρτίδες αντιδραστηρίων και βαθμονομητών, αρκετές αλλαγές στους χειριστές καθώς και συντήρηση ρουτίνας στα όργανα. Βήμα 3: Υπολογισμός της μεροληψίας Η πιστοποιημένη τιμή της συγκέντρωσης για το υγρό υλικό αναφοράς για την κρεατινίνη που αποκτήθηκε από το NIST (National Institute of Standards and Technology) με κωδικό SRM 967a 0,3427 ± 0,0072 mmol/l. Η αβεβαιότητα της πιστοποιημένης τιμής είναι μία διευρυμένη αβεβαιότητα για επίπεδο εμπιστοσύνης 95%. Επομένως, για τον υπολογισμό της τυπικής αβεβαιότητας του πιστοποιημένου δείγματος u (Cref) αρκεί να διαιρέσουμε τη διευρυμένη του αβεβαιότητα με k = 2: u (Cref) = U/2 = 0,0072/2 = 0,0036 mmol/l και να την εκφράσουμε ως σχετική τυπική αβεβαιότητα: u(c ref ) = 0,0036 100% = 1,05% 0,3427 Για να ελεγχθεί η ορθότητα της μεθόδου του εργαστηρίου, εκτελούνται 10 μετρήσεις του υλικού α- ναφοράς κρεατινίνης κάτω από συνθήκες επαναληψιμότητας και υπολογίζεται η τυπική αβεβαιότητα επαναληψιμότητας, u rep. Από τις μετρήσεις, λαμβάνεται μέση τιμή 0,3518 mmol/l και υπολογίζεται η τυπική απόκλιση 0,0076 mmol/l. Επομένως, μπορούμε τώρα να υπολογίσουμε την αβεβαιότητα επαναληψιμότητας, από τη σχέση: u rep = SD n = 0,0076 = 0,0024 mmol/l 10 Και να την εκφράσουμε ως σχετική τυπική αβεβαιότητα: u rep = 0,0024 100% = 0,68% 0,3518 Τέλος, υπολογίζουμε την τιμή και την αβεβαιότητα της μεροληψίας, σύμφωνα με την Εξίσωση 10.5: b = x x ref = 0,3518 0,3427 = 0,0091 mmol/l u bias = u(c ref ) 2 + u rep 2 = 0,0036 2 + 0,0024 2 = 0,0043 mmol/l και την εκφράζουμε ως σχετική τυπική αβεβαιότητα: u bias = u(c ref ) 2 + u rep 2 = 1,05 2 + 0,68 2 = 1,25% 12

Βήμα 4: Υπολογισμός της συνδυασμένης τυπικής αβεβαιότητας Αρχικά θα πρέπει να εκτιμηθεί εάν η μεροληψία είναι στατιστικά σημαντική και αυτό μπορεί να γίνει με ένα από τους κάτωθι τρόπους: α) Με σύγκριση της μεροληψίας (0,0091 mmol/l) με τη διευρυμένη U bias = 2 * u bias = 2 * 0,0043 = 0,0086 mmol/l (k = 2). Εφ όσον η απόλυτη τιμή της μεροληψίας είναι μεγαλύτερη της αβεβαιότητας, τότε η μεροληψία είναι σημαντική και το αποτέλεσμα της μέτρησης του υλικού αναφοράς από το εργαστήριο διαφέρει στατιστικά από την πιστοποιημένη του τιμή. β) Με t-test: σύγκριση της μέσης τιμής των μετρήσεων επαναληψιμότητας με την πιστοποιημένη τιμή του υλικού αναφοράς και έλεγχο εάν το p < 0,05. γ) Πιο απλά όμως με εμπειρικό τρόπο, το u bias μπορεί να συγκριθεί με την ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα u prec και να ελεγχθεί εάν υπερβαίνει το 10%: u bias = 1,25% u prec 2,81% = 0,445 => u bias = 44,5% u prec Από τη στιγμή λοιπόν που η αβεβαιότητα της μεροληψίας με όλους τους ανωτέρω τρόπους είναι σημαντική σε σχέση με την ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα, πρέπει να συμπεριληφθεί στην εκτίμηση της συνδυασμένης τυπικής αβεβαιότητας u c μιας μέτρησης: u c = u bias 2 + u prec 2 = 1,25 2 + 2,81 2 = 3,075% Βήμα 5: Υπολογισμός της διευρυμένης αβεβαιότητας Για τον υπολογισμό της διευρυμένης αβεβαιότητας U θα χρησιμοποιήσουμε για συντελεστή κάλυψης το 2 έτσι ώστε να έχουμε 95% επίπεδο εμπιστοσύνης: U = k x u c = 2 x 3,075% = 6,15% Παρουσίαση των αποτελεσμάτων: Έστω ότι η τιμή της συγκέντρωσης της κρεατινίνης ενός ασθενούς με την ανωτέρω μέθοδο στον αναλυτή (μοναδιαία μέτρηση) του εργαστηρίου ευρέθη 0,1453 mmol/l. Η διευρυμένη αβεβαιότητα της τιμής αυτής με k = 2, είναι 6,15% x 0,1453 = 0,0089 mmol/l. Το μετρούμενο αποτέλεσμα της κρεατινίνης για το δεδομένο άτομο είναι: 0,1453 ± 0,0089 mmol/l. Η αληθής τιμή με επίπεδο εμπιστοσύνης της τάξης του 95% εντοπίζεται στο διάστημα [0,1453-0,0089 έως 0,1453 + 0,0089] ή αλλιώς [0,1364 0,1542] mmol/l. Σχόλια: Συνήθως στα κλινικά εργαστήρια δεν χρησιμοποιούνται περισσότερα από δύο σημαντικά ψηφία, συνεπώς το αποτέλεσμα κρεατινίνης του ασθενούς με την αβεβαιότητα αναγράφεται ως 0,15 ± 0,01 mmol/l (European cooperation for Accreditation, 2003b). Το γεγονός ότι η μεροληψία είναι σημαντική σε μια μέθοδο που είναι ιχνηλάσιμη, πρέπει να οδηγήσει το εργαστήριο σε διορθωτικές ενέργειες για την εξάλειψη ή τη μείωση του λάθους π.χ. με διόρθωση τιμής μέσω λογισμικού, με επαναβαθμονόμηση κ.λπ. (EURACHEM/CITAC CG4, 2000ˑ JCGM 100:2008, 2008). Πηγές από το διαδίκτυο για εύρεση υλικών αναφοράς http://www.nist.gov/srm/index.cfm (τελευταία προσπέλαση 10/9/2015) 13

https://ec.europa.eu/jrc/en/reference-materials (τελευταία προσπέλαση 10/9/2015) http://www.nibsc.org/products/brm_product_catalogue.aspx (τελευταία προσπέλαση 10/9/2015) http://www.who.int/bloodproducts/ref_materials/en/ (τελευταία προσπέλαση 10/9/2015) Αναφορές 1. ΒΟΓΙΑΤΖΑΚΗΣ, Ε.Δ. (2007) Αξιολόγηση της ποιότητας των εργαστηριακών εξετάσεων. Αρχεία Ελληνικής Ιατρικής, 24, p. 58-78. 2. ΕΥΑΓΓΕΛΟΠΟΥΛΟΣ, Α., ΘΩΜΑΪΔΗΣ, Σ., ΚΟΥΠΠΑΡΗΣ, Μ. (2006) Αβεβαιότητα και ιχνηλασιμότητα στο βιοχημικό εργαστήριο: νέα θεώρηση κλασικών όρων. Δελτίον Ελληνικής Μικροβιολογικής Εταιρείας, 51, p. 82-94. 3. ΚΑΠΕΤΑΝΣΤΡΑΤΑΚΗ, Μ. (2015) Στατιστικές μέθοδοι για την επαλήθευση και τον έλεγχο ποιότητας εργαστηριακών μεθόδων. ΜΠΣ Βιοστατιστική, Ιατρική Σχολή και Τμήμα Μαθηματικών Πανεπιστημίου Αθηνών. 4. ΚΡΟΥΠΗΣ, Χ. (2014) Διαπίστευση, πιστοποίηση, έλεγχος ποιότητας κλινικών εργαστηρίων. Ελληνικά Αρχεία AIDS, 22, p. 4-9. 5. ΚΡΟΥΠΗΣ, Χ. (2009; pp. 17-24) Διαπίστευση εργαστηρίων Μοριακής Διαγνωστικής κατά ISO 15189, 8o Πανελλήνιο Συνέδριο Κλινικής Χημείας, ed., Πάτρα: Ελληνική Εταιρεία Κλινικής Χημείας-Κλινικής Βιοχημείας. 6. ΚΡΟΥΠΗΣ, Χ. (2008; pp. 19-30) Διαπίστευση κλινικών εργαστηρίων κατά ISO 15189: εφαρμογή στις δοκιμές κυτταρομετρίας ροής, 5o Πανελλήνιο Συνέδριο Κυτταρομετρίας, ed., Ολυμπία: Ελληνική Εταιρεία Κυτταρομετρίας. 7. ΛΕΪΜΟΝΗ, Ε.Δ. (2008) Διακρίβωση εξοπλισμού-ιχνηλασιμότητα, In: Πιστοποίηση και Διαπίστευση εργαστηρίων: πρακτικές διαδικασίες και οδηγίες εφαρμογής, Αθήνα: Ελληνική Αιματολογική Εταιρεία. 8. ΛΥΚΟΚΑ, Ε. Χ., ΠΟΥΛΑΚΗ, Ε., ΠΡΙΓΚΟΣ, Ν., ΠΙΠΕΡΑΚΗ, Κ., ΣΤΑΘΑΚΗ-ΦΕΡΔΕΡΊΓΟΥ, Α. (2006; pp. 41-52) Αβεβαιότητα μετρήσεων στην Κλινική Χημεία, In: Πιστοποίηση-Διαπίστευση Κλινικών Εργαστηρίων, 1 ο Σεμινάριο Συνεχιζόμενης Εκπαίδευσης, ed., Αθήνα: Ελληνική Εταιρεία Κλινικής Χημείας- Κλινικής Βιοχημείας. 9. ΜΗΤΡΟΠΟΥΛΟΣ, Σ. (2003; pp. 14-25) Πρότυπα υλικά και μέθοδοι - Οροί ελέγχου, In: Ο έλεγχος ποιότητας στο εργαστήριο Κλινικής Χημείας, 2ο Εκπαιδευτικό Σεμινάριο, ed., Αθήνα: Ελληνική Εταιρεία Κλινικής Χημείας-Κλινικής Βιοχημείας. 10. ΜΠΑΚΕΑΣ, Ε. Β. (2006; pp. 7-11) Διαπίστευση Εργαστηρίων Δοκιμών, In: Πιστοποίηση-Διαπίστευση Κλινικών Εργαστηρίων, 1ο Σεμινάριο Συνεχιζόμενης Εκπαίδευσης, ed., Αθήνα: Ελληνική Εταιρεία Κλινικής Χημείας-Κλινικής Βιοχημείας. 11. ΣΤΑΘΑΚΗ-ΦΕΡΔΕΡΙΓΟΥ, Α., ΠΟΥΛΑΚΗ, Ε., ΠΡΙΓΚΟΣ, Ν., ΛΥΚΟΚΑ, Ε. Χ., ΠΙΠΕΡΑΚΗ, Κ. (2006; pp. 53-6) Οδηγίες διασφάλισης ποιότητας κλινικών εργαστηρίων, In: Πιστοποίηση-Διαπίστευση Κλινικών Εργαστηρίων, 1ο Σεμινάριο Συνεχιζόμενης Εκπαίδευσης, ed., Αθήνα: Ελληνική Εταιρεία Κλινικής Χημείας- Κλινικής Βιοχημείας. 12. BERDING, C., CIESIOLKA, T., FISCHER, A., & EHRHARDT, V. (2010) Procedures of Standardization of Clinical Chemistry and Immuno Assays from Roche Diagnostics Roche Diagnostics AG. 13. DYBKAER, R. (1991) Reference materials--a main element in a coherent reference measurement system. Eur.J.Clin Chem Clin Biochem, 29, p. 241-6. 14. CLSI (2012) C51-A Expression of measurement uncertainty in Laboratory Medicine; Approved Guideline Wayne, PA, Clinical and Laboratory Standards Institute. 15. EMONS, H., FAJGELJ, A., VAN DER VEEN, A.M.H. et al., (2006) New definitions on reference materials. Accred Qual Assur, 10, p. 576-8. 16. EMONS, H. (2006) The 'RM family' Identification of all of its members. Accred.Qual Assur, 10, p. 690-1. 17. EUROPEAN CO-OPERATION FOR ACCREDITATION (EA) (2003a) EA 4/14: The Selection and Use of Reference Materials. 14

18. EURACHEM/CITAC (2003) Traceability in Chemical Measurement. A guide to achieving comparable results in chemical measurement. 19. EURACHEM/CITAC CG4 (2000) Quantifying uncertainty in analytical measurement, 2nd ed. 20. EURACHEM/CITAC (2007) Use of uncertainty information in compliance assessment. 21. EUROPEAN CO-OPERATION FOR ACCREDITATION (EA) (2003b) EA-4/16: EA guidelines on the expression of uncertainty in quantitative testing. 22. GUDER, W.G., NARAYANAN, S., WISSER, H., & ZAWTA, B. (2003) Samples: from the patient to the laboratory. The impact of preanalytical variables on the quality of laboratory results, 3rd ed. Weinheim, Wiley-VCH. 23. HUISMAN, W. (2012) European medical laboratory accreditation. Present situation and steps to harmonisation. Clin Chem Lab Med, 50, p. 1147-52. 24. KALLNER, A. (2013) Estimation of uncertainty in measurements in the clinical laboratory. Clin.Chem.Lab Med., 51, p. 2249-51. 25. MILLER, G.W., MYERS, G.L., LOU, G.M. et al., (2011) Roadmap for harmonization of clinical laboratory measurement procedures. Clin Chem, 57, p. 1108-17. 26. PANTEGHINI, M. (2009) Traceability as a unique tool to improve standardization in laboratory medicine. Clin Biochem, 42, p. 236-40. 27. INTERNATIONAL STANDARDS ORGANISATION (2012) ISO 15189: Medical Laboratories-particular requirements for quality and competence. 28. THELEN, M.H., VANSTAPEL, F.J., KROUPIS, C. et al., (2015) Flexible scope for ISO 15189 accreditation: a guidance prepared by the European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (EFLM) Working Group Accreditation and ISO/CEN standards (WG-A/ISO). Clin Chem Lab Med, 53, p. 1173-80. 29. JCGM 200:2008 (2008) International vocabulary of metrology - Basic and general concepts and associated terms (VIM), 3rd ed. 30. JCGM 100:2008 (2008) Evaluation of measurement data-guide to the expression of uncertainty in measurement (GUM), 1st ed. 15