Απομόνωση των κυτταρικών συστατικών του αίματος

Απομόνωση των κυτταρικών συστατικών του αίματος

6

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΣΥΣΤΑΤΙΚΩΝ ΤΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ Σκοπός της άσκησης : η εξοικείωση του φοιτητή με φυγοκεντρικές μεθόδους διαχωρισμού όπως απλή φυγοκέντρηση (ίζημα-υπερκείμενο), διαφορική φυγοκέντρηση, φυγοκέντρηση σε ανωτική πυκνότητα, καθώς και με τη μικροσκοπική παρατήρηση των κυτταρικών συστατικών του αίματος. ΑΙΜΑ Το αίμα χαρακτηρίζεται ως ρευστός συνδετικός ιστός και αποτελείται από ένα διαλυτό μέρος, το πλάσμα (plasma) και τρεις κατηγορίες έμμορφων συστατικών, τα ερυθρά αιμοσφαίρια (red blood cells), τα λευκά αιμοσφαίρια (white blood cells) και τα αιμοπετάλια (platelets). Οι λειτουργίες που επιτελεί το αίμα είναι οι εξής: Μεταφορά αερίων (Ο 2, CO 2 ) και μεταβολικών παραγόντων Προστασία του οργανισμού με τη δημιουργία θρόμβου σε μια αιμορραγία Καταπολέμηση μικροοργανισμών που έχουν εισέλθει στον οργανισμό Όταν φυγοκεντρήσουμε ολικό αίμα σε σωληνάκι με αντιπηκτικό τότε θα πάρουμε ένα κόκκινο ίζημα από ερυθρά αιμοσφαίρια και ένα διαυγές κιτρινωπό υπερκείμενο που είναι το πλάσμα. Το ίζημα των ερυθρών αιμοσφαιρίων καταλαμβάνει περίπου το μισό όγκο του ολικού αίματος. Επάνω στο ίζημα των ερυθρών κυττάρων εμφανίζεται ένα πολύ λεπτό λευκό στρώμα που αποτελείται από τα λευκά αιμοσφαίρια και τα αιμοπετάλια. Πλάσμα Το διαλυτό μέρος του αίματος ονομάζεται πλάσμα και αποτελείται από νερό 90-92%, μέσα στο οποίο βρίσκονται διαλυμένες πρωτεΐνες 7-8% και περίπου 1% διάφορα άλατα. Σε πολύ μικρότερα ποσά υπάρχουν θρεπτικά συστατικά (λίπη, γλυκόζη, αμινοξέα κ.α.), μεταβολικά τοξικά παράγωγα (ουρία και αμμωνία), μεταβολικά συστατικά (ορμόνες, βιταμίνες κ.α.). 7

Λευκά αιμοσφαίρια Αιμοπετάλια Μη κοκκιώδη Κοκκιώδη Ερυθρά αιμοσφαίρια Εικόνα 1 : Διαχωρισμός των συστατικών του αίματος μετά από φυγοκέντρηση Ερυθρά αιμοσφαίρια Τα ερυθρά αιμοσφαίρια περιέχουν μια μεταφορική πρωτεΐνη, την αιμοσφαιρίνη (hemoglobulin), η οποία μεταφέρει Ο 2 από τους πνεύμονες και το απελευθερώνει στους ιστούς και στη συνέχεια δεσμεύει CO 2 από τους ιστούς και το μεταφέρει στους πνεύμονες όπου και το απελευθερώνει. Τα ερυθρά αιμοσφαίρια είναι απύρηνα κύτταρα με σχήμα αμφίκοιλου δίσκου. Η διάμετρος τους είναι 8 μm, ενώ το πάχος είναι 2 μm στην περιφέρεια και 1 μm στο κέντρο. Ο φυσιολογικός αριθμός τους είναι 4,6-6,2 x10 6 /μl στους άνδρες και 4,2-5,4 x10 6 /μl στις γυναίκες. 8

Το ποσοστό του όγκου του αίματος που καταλαμβάνουν τα ερυθρά αιμοσφαίρια λέγεται αιματοκρίτης (hematocrit) και κυμαίνεται από 40-54% στους άνδρες και 38-47% στις γυναίκες. Λευκά αιμοσφαίρια Ο ρόλος των λευκών αιμοσφαιρίων στο αίμα είναι η καταπολέμηση ιών και βακτηρίων που προσβάλλουν τον οργανισμό. Οι βασικοί τρόποι καταπολέμησης των εισβολέων είναι η φαγοκυττάρωση (phagocytosis) από τα ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα και η παραγωγή αντισωμάτων από τα λεμφοκύτταρα. Τα λευκά αιμοσφαίρια έχουν σφαιρικό ή ακανόνιστο σχήμα και είναι μεγαλύτερα από τα ερυθρά. Ο φυσιολογικός αριθμός τους είναι 4,5-11,0 x10 3 /μl. Τα λευκά αιμοσφαίρια διακρίνονται σε δύο κατηγορίες τα κοκκιώδη (granular) και τα μη κοκκιώδη (agranular). Στον παρακάτω πίνακα παρουσιάζονται αναλυτικά τα είδη και οι λειτουργίες των λευκών αιμοσφαιρίων. Κατηγορίες λευκών αιμοσφαιρίων Κοκκιώδη (πολυμορφοπύρηνα) μέγεθος Λειτουργία Ουδετερόφιλα Ηωζινόφιλα Βασεόφιλα Μη κοκκιώδη μέγεθος Λεμφοκύτταρα Μονοπύρηνα 9-12 μm 9-12 μm 9-12 μm 8-10 μm 10-20 μm Φαγοκυττάρωση βακτηρίων κυρίως Φαγοκυττάρωση συμπλόκων Ag-Ab Απελευθέρωση ισταμίνης στους ιστούς Λειτουργία Παραγωγή αντισωμάτων Φαγοκύτωση ιών και βακτηρίων ως μακροφάγα Αιμοπετάλια Τα αιμοπετάλια παίζουν σημαντικό ρόλο στην πήξη του αίματος και είναι κυτταρικά θραύσματα, που προέρχονται από συγκεκριμένη κατηγορία κυττάρων του μυελού των οστών, τα μεγακαρυοκύτταρα (megakaryocytes). Τα αιμοπετάλια είναι μικροί στρογγυλοί ή ωοειδείς δίσκοι με διάμετρο 2 μm. Ο αριθμός τους κυμαίνεται από 150-450x10 3 /μl και συμμετέχουν στην ενεργοποίηση του μηχανισμού πήξης του αίματος μέσω της ενεργοποίηση της προθρομβίνης (prothrombin) και του ινοδωγόνου (fibrinogen) για το σχηματισμό ινίνης (fibrin). 9

Εικόνα 2: Φωτογραφία από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης όπου εμφανίζεται ένα ερυθρό αιμοσφαίριο εγκλωβισμένο σε πλέγμα ινίνης ΦΥΓΟΚΕΝΤΡΗΣΗ (CENTRIFUGATION) Σε ένα σωματίδιο με μάζα m το οποίο βρίσκεται σε ένα φυγοκεντρικό πεδίο που δημιουργείται από περιστροφή με γωνιακή ταχύτητα ω και με απόσταση r από τον άξονα περιστροφής, ασκείται σε αυτό φυγόκεντρη δύναμη F=mω 2 r. Όταν το σωματίδιο βρίσκεται σε ένα υγρό διαλύτη τότε η κίνηση του εξαρτάται από τη μάζα του, τον όγκο του και την πυκνότητα του διαλύτη. Σύμφωνα με τα παραπάνω 1. Όσο μεγαλύτερη είναι η φυγόκεντρη δύναμη τόσο πιο γρήγορα καθιζάνουν τα σωματίδια 2. Τα πιο συμπαγή σωματίδια καθιζάνουν πιο γρήγορα 3. Όσο πιο μεγάλη είναι η πυκνότητα του διαλύτη τόσο πιο αργά καθιζάνουν τα σωματίδια 10

Σύμφωνα με τα προηγούμενα, σε ένα εναιώρημα κυττάρων μπορούμε να απομονώσουμε τα κύτταρα με μια απλή φυγοκέντρηση. Αν τα κύτταρα είναι διαφόρων μεγεθών, όπως στην περίπτωση του αίματος, μπορούμε να συνδυάσουμε φυγοκεντρήσεις σε διαφορετικές στροφές (διαφορετική φυγόκεντρη δύναμη F και συνεπώς διαφορετική καθίζηση) ή να χρησιμοποιήσουμε κάποιο διαλύτη με μεγαλύτερη πυκνότητα (μικρότερη τελική φυγόκεντρη δύναμη F λόγω άνωσης). Σχέση περιστροφής και φυγόκεντρης δύναμης Ένα σώμα μάζας m κινείται όταν εφαρμόζεται σε αυτό δύναμη F, σύμφωνα με το θεμελιώδη νόμο της δυναμικής F=mγ. Στην περίπτωση ενός φυγοκεντρικού πεδίου, που δημιουργείται από περιστροφή με συχνότητα ν και γωνιακή ταχύτητα ω : mγ = mω 2 r γ = ω 2 r = (2πv) 2 r = 4π 2 ν 2 r Ένα πείραμα είναι σωστό όταν είναι επαναλαμβανόμενο. Για να επαναληφθεί μια φυγοκέντρηση πρέπει η ίδια φυγόκεντρη δύναμη να ασκηθεί σε ένα δείγμα, για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα, σε κάθε πείραμα, ανεξάρτητα από το μέγεθος της φυγοκέντρου. Για το λόγο αυτό το μέγεθος γ πρέπει να είναι σταθερό. Αυτό επιτυγχάνεται όταν τροποποιούμε τη συχνότητα της περιστροφής ν (rpm = rotations per minute = στροφές ανά λεπτό) ανάλογα με την ακτίνα περιστροφής r που εξαρτάται από την κεφαλή της φυγοκέντρου που χρησιμοποιούμε κάθε φορά. Απλή φυγοκέντρηση Απλή φυγοκέντρηση χρησιμοποιούμε για να διαχωρίσουμε την διαλυτή φάση ενός εναιωρήματος από το ίζημα (είτε άμορφο είτε κυτταρικό). Στην περίπτωση άμορφου ιζήματος π.χ. κατακρημνισμένες πρωτεΐνες συνήθως φυγοκεντρούμε σε 10.000 στροφές για 5 λεπτά. Στην περίπτωση κυτταρικού εναιωρήματος, η φυγοκέντρηση γίνεται σε 3.000 στροφές για 5 λεπτά. Διαφορική φυγοκέντρηση (differential centrifugation) Σε περίπτωση ενός κυτταρικού εναιωρήματος με δύο τύπους κυτταρικών μορφών διαφορετικού όγκου, χρησιμοποιούμε ένα συνδυασμό δύο φυγοκεντρήσεων μια σε χαμηλές στροφές και μια σε υψηλές στροφές. Στην πρώτη φυγοκέντρηση σε χαμηλές στροφές (1.000 rpm) τα κύτταρα μεγάλου μεγέθους καθιζάνουν ενώ τα μικρού μεγέθους παραμένουν στο 11

υπερκείμενο. Περαιτέρω φυγοκέντρηση του υπερκείμενου σε υψηλές στροφές (3.000 rpm) έχει ως αποτέλεσμα την καθίζηση και απομόνωση των κυττάρων με μικρό μέγεθος. Φυγοκέντρηση σε πυκνότητα επίπλευσης (buoyant density) Όταν σε ένα κυτταρικό εναιώρημα υπάρχουν δύο τύποι κυττάρων παραπλήσιου όγκου τότε ο διαχωρισμός τους δεν μπορεί να γίνει με διαφορική φυγοκέντρηση. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιείται ένα ειδικό διάλυμα με αυξημένη πυκνότητα 1,077 g/ml. Το κυτταρικό εναιώρημα επιστοιβάζεται σε ίσο όγκο από το παραπάνω διάλυμα, σε ένα σωληνάκι και ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 3.500 στροφές για 25 λεπτά. Τα πιο συμπαγή και βαριά κύτταρα καθιζάνουν στο κάτω μέρος του σωλήνα ενώ τα ελαφρύτερα λόγω της άνωσης που ασκείται πάνω τους από το πυκνότερο διάλυμα, μαζεύονται-επιπλέουν σε μια στοιβάδα μεταξύ του διαλύματος και της υδατικής φάσης του κυτταρικού εναιωρήματος. Ακολουθεί συλλογή της διάμεσης στοιβάδας των κυττάρων, προσθήκη πενταπλάσιου όγκου φυσιολογικού ορού, ώστε να μειωθεί η πυκνότητα του διαλύτη. Τέλος φυγοκεντρούμε σε 3.000 στροφές για 5 λεπτά, οπότε και λαμβάνουμε τα κύτταρα αυτά ως ίζημα. 12

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΥΛΙΚΑ Σωληνάκι με 2,5 ml αίμα και αντιπηκτικό Na 2 EDTA Σωληνάρια RIA 4 ml με πώμα Σωληνάρια 15 ml με πώμα Πιπέτες Pasteur Αναδευτήρας Vortex Κλινική φυγόκεντρος Μικροσκόπιο Αιμοκυτταρόμετρο ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Φυσιολογικός ορός 0,9% NaCl Διάλυμα Ficoll με πυκνότητα 1,077 g/ml ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Απομόνωση ερυθρών αιμοσφαιρίων Σωληνάκι γενικής αίματος με αντιπηκτικό Na 2 EDTA Λήψη 1 ml αίματος σε σωληνάκι eppendorf Φυγοκέντρηση σε 3.000 στροφές για 5 λεπτά Αναρρόφηση του υπερκείμενου πλάσματος και της στοιβάδας των λευκών αιμοσφαιρίων Προσθήκη 1 ml φυσιολογικό ορό στο ίζημα των ερυθρών αιμοσφαιρίων Φυγοκέντρηση σε 1000 στροφές για 5 λεπτά Απόρριψη του υπερκείμενου πλάσματος Προσθήκη στο ίζημα 1 ml φυσιολογικό ορό Επαναιώρηση ερυθρών αιμοσφαιρίων Παρατήρηση στο μικροσκόπιο Μέτρηση ερυθρών με αιμοκυτταρόμετρο 13

Απομόνωση αιμοπεταλίων Σωληνάκι γενικής αίματος με αντιπηκτικό Na 2 EDTA Λήψη 1 ml αίματος σε σωληνάκι eppendorf Φυγοκέντρηση σε 500 g για 5 λεπτά Μεταφορά του υπερκείμενου πλάσματος με τα αιμοπετάλια σε νέο σωληνάκι Φυγοκέντρηση σε 3.000 g για 5 λεπτά Απόρριψη του υπερκείμενου πλάσματος Προσθήκη στο ίζημα 1 ml φυσιολογικό ορό Επαναιώρηση αιμοπεταλίων Φυγοκέντρηση σε 3.000 rpm για 5 λεπτά Απόρριψη του υπερκείμενου Προσθήκη στο ίζημα 1 ml φυσιολογικό ορό και επαναιώρηση των αιμοπεταλίων Παρατήρηση στο μικροσκόπιο Μέτρηση αιμοπεταλίων σε αιμοκυτταρόμετρο Απομόνωση λευκών αιμοσφαιρίων Σωληνάκι γενικής αίματος με αντιπηκτικό Na 2 EDTA Σε σωληνάκι των 15 ml προσθέτουμε 1 ml αίμα και 5 ml διάλυμα λύσης Περιμένουμε να γίνει αιμόλυση Φυγεκεντρούμε στις 3.000 στροφές για 25 λεπτά Αφαίρεση του υπερκείμενου αιμολύματος με πιπέτα Pasteur Προσθήκη 1 ml φυσιολογικό ορό Φυγοκέντρηση σε 3.000 στροφές για 5 λεπτά Απόρριψη του υπερκείμενου Επαναιώρηση των λευκών αιμοσφαιρίων σε 1 ml φυσιολογικό ορό Παρατήρηση στο μικροσκόπιο Μέτρηση λευκών αιμοσφαιρίων σε αιμοκυτταρόμετρο Απομόνωση λεμφοκυττάρων Σωληνάκι γενικής αίματος με αντιπηκτικό Na 2 EDTA Σε σωληνάριο RIA αναμειγνύουμε 1 ml αίμα και 1 ml φυσιολογικό ορό Σε σωληνάκι των 15 ml προσθέτουμε 1,5 ml lymphoprep Επιστοιβάζουμε προσεκτικά 2 ml αραιωμένο αίμα Φυγεκεντρούμε στις 2.200 στροφές για 40 λεπτά 14

Μετά το τέλος της φυγοκέντρησης παρατηρούμε τις διάφορες στοιβάδες Αφαίρεση της στοιβάδας των λεμφοκυττάρων με πιπέτα Pasteur Μεταφορά των λεμφοκυττάρων σε σωληνάριο RIA Προσθήκη 3 ml φυσιολογικό ορό Φυγοκέντρηση σε 3.000 στροφές για 5 λεπτά Απόρριψη του υπερκείμενου Επαναιώρηση των λεμφοκυττάρων σε 1 ml φυσιολογικό ορό Παρατήρηση στο μικροσκόπιο Μέτρηση λευκών αιμοσφαιρίων σε αιμοκυτταρόμετρο ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1. Υπολογισμός συγκέντρωσης ερυθρών αιμοσφαιρίων 2. Υπολογισμός συγκέντρωσης αιμοπεταλίων 3. Υπολογισμός συγκέντρωσης λευκών αιμοσφαιρίων 4. Υπολογισμός ποσοστού (%) των λεμφοκυττάρων επί των ολικών λευκών αιμοσφαιρίων 15

16