ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ : ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Γ.Ο. ΔΗΜΗΤΡΑΚΟΠΟΥΛΟΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ : ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Γ.Ο. ΔΗΜΗΤΡΑΚΟΠΟΥΛΟΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΕΣ «Εφαρμογή μοριακών μεθόδων ανίχνευσης μηχανισμών αντοχής σε αντιβιοτικά, παραγωγής τοξινών και συσχετισμός κλώνων σε κλινικά στελέχη Staphylococcus aureus» ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Βασιλική Π. Χίνη Βιολόγος ΠΑΤΡΑ 2007

Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ κ. Σπηλιοπούλου-Σδούγκου Ιρις, Αναπλ. Καθηγήτρια, Επιβλέπουσα Καθηγήτρια κ. Δημητρακόπουλος Γεώργιος, Καθηγητής, μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής κ. Αναστασίου Ευάγγελος, Καθηγητής, μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ κ. Σπηλιοπούλου-Σδούγκου Ιρις, Αναπλ. Καθηγήτρια, Επιβλέπουσα Καθηγήτρια κ. Δημητρακόπουλος Γεώργιος, Καθηγητής, Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής κ. Αναστασίου Ευάγγελος, Καθηγητής, Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής κ. Μπασιάρης Χαράλαμπος, Καθηγητής, Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής κ. Παληογιάννη Φωτεινή, Αναπλ. Καθηγήτρια, Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής κ. Χριστοφίδου Μυρτώ, Επικ. Καθηγήτρια, Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής κ. Κολονίτσιου Φεβρονία, Λέκτορας, Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής 2

ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 1. Chini V, E Petinaki, A Foka, S Paratiras, G Dimitracopoulos and I Spiliopoulou: Spread of Staphylococcus aureus clinical isolates carrying Panton-Valentin leukocidin genes during a three-year period in Greece. Clinical Microbiology and Infection. 2006; 12: 29-34. 2. Chini, V., G. Dimitracopoulos and I. Spiliopoulou. Occurrence of the enterotoxin gene cluster and the toxic shock syndrome toxin-1 gene among clinical isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus is related to clonal type and agr group. J Clin Microbiol 2006; 44: 1881-1883. 3. Sdougkos G, V Chini, D A Papanastasiou, G Christodoulou, G Tagaris, G Dimitracopoulos and I Spiliopoulou. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus producing Panton-Valentine leukocidin as a cause of acute osteomyelitis in children. Clinical Microbiology and Infection 2007; 13: 651-654. 4. Chini V, A Foka, G Dimitracopoulos and I Spiliopoulou. Absolute and relative real-time PCR in the quantification of tst gene expression among methicillinresistant Staphylococcus aureus: evaluation by two mathematical models. Letters Appl Microbiol 2007. (δεκτό προς δημοσίευση) 3

4 Στη μητέρα μου

5

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ...12 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ..15 ΣΚΟΠΟΣ 17 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ..19 1. Ιστορική αναδρομή 20 2. Ταξινόμιση των Σταφυλοκόκκων 22 3. Γενικά για τον S. aureus 23 4. Λοιμώξεις από S. aureus...24 4.1 Γενικά χαρακτηριστικά των λοιμώξεων...24 4.2 Γενικά για τις λοιμώξεις που προκαλεί ο S. aureus..24 5. Παθογένεια των λοιμώξεων από S. aureus..27 5.1 Παράγοντες επιφανείας 28 5.2 Ένζυμα.30 5.3 Τοξίνες του S. aureus...31 5.3.1 Λοιμώξεις που οφείλονται στις τοξίνες του S. aureus..38 5.3.2 Ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων τοξινών του S. aureus 40 6. Ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά...41 6.1 Γενικά...41 6.2 Μηχανισμοί δράσης των αντιβιοτικών.42 6.3 Μηχανισμοί ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά... 43 6.3.1 Γενικά....43 6.3.2 Μηχανισμοί ανθεκτικότητας του S. aureus στα αντιβιοτικά....44 6.3.2α) β-λακταμάσες (μηχανισμός ενζυμικής αδρανοποίησης του αντιβιοτικού)..44 6.3.2β) Τροποποιημένη PBP-σύνθεση PBP2a (μηχανισμός μεταβολής του μορίουστόχου) Ανθεκτικότητα στη methicillin (methicillin - resistant Staphylococcus aureus, MRSA)...48 6.3.2γ) Μειωμένη ευαισθησία και αντοχή στα γλυκοπεπτίδια..55 7. Επιδημιολογία των λοιμώξεων από methicillin-ανθεκτικά στελέχη S. aureus..56 6

7.1 Στρατηγική αντιμετώπισης και ελέγχου των MRSA λοιμώξεων.59 7.2 Στρατηγική αντιμετώπισης της μικροβιακής αντοχής 61 7.3 Γενικές οδηγίες για την καταγραφή των νοσοκομειακών λοιμώξεων 61 8. Ταξινόμηση των μεθόδων τυποποίησης των βακτηρίων..62 8.1 Φαινοτυπικές τεχνικές...62 8.1.1. Βιότυπος.62 8.1.2. Μέθοδοι ευαισθησίας στα αντιβιοτικά...62 8.1.3. Ορολογική Τυποποίηση..63 8.1.4. Βακτηριοφαγική τυποποίηση - Λυσιτυπία (Phage Typing)...63 8.1.5. Ανοσοαποτύπωση ή πρωτεϊνοτυπία με Western blot (immunoblotting)...64 8.1.6. Πολυτοπική ενζυμική ηλεκτροφόρηση (Multilocus enzyme electrophoresis, MLEE)..64 8.2 Γονοτυπικές τεχνικές...65 8.2.1. Πλασμιδιακή ανάλυση 66 8.2.2. Ανάλυση χρωμοσωμικού DNA μετά από επίδραση περιοριστικής ενδονουκλεάσης (Restriction Enzyme Analysis, REA) 66 8.2.3. Συστήματα τυποποίησης με βάση την Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR)...67 8.2.3α. Rep-PCR και RAPD PCR.67 8.2.4. Υβριδισμός κατά Southern χρησιμοποιώντας πολυμορφικούς DNAανιχνευτές..68 8.2.5. Ριβοτυπία (Ribotyping)...68 8.2.6. Δυαδική τυποποίηση στελεχών με ειδικούς σε στελέχη DNA-ανιχνευτές.69 8.2.7. Ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE).70 8.2.8. Τυποποίηση πολυτοπικού προσδιορισμού αλληλουχίας (Multilocus Sequence Typing, MLST).71 8.2.9. Τυποποίηση μονοτοπικού προσδιορισμού αλληλουχίας του γονιδίου της πρωτεΐνης Α (spa typing)..73 8.2.10. Μελέτη της έκφρασης γονιδίου με αντίστροφη μεταγραφή και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real-Time two step RT PCR)... 75 7

ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 80 Α. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ..80 Ι. ΣΤΕΛΕΧΗ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ 82 ΙΙ. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΥ..83 1. Ταυτοποίηση στελεχών σε επίπεδο είδους..83 2. Έλεγχος ευαισθησίας σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες.84 2.1. Μέθοδος διάχυσης του αντιβιοτικού στο άγαρ μέθοδος των δίσκων εμποτισμένων με αντιβιοτικό...85 2.2. Προσδιορισμός της ελάχιστης ανασταλτικής πυκνότητας του αντιβιοτικού, Ε-test......89 3. Έλεγχος παραγωγής β-λακταμάσης....90 4. Έλεγχος παραγωγής πενικιλλινοδεσμευτικών πρωτεϊνών (PBPs)...91 ΙΙΙ. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΓΟΝΟΤΥΠΟΥ..92 5. Παρασκευή χρωμοσωμικού DNA...92 5.1. Παρασκευή χρωμοσωμικού DNA σε ρυθμιστικό διάλυμα...92 5.2. Απομόνωση DNA και εγκλεισμός σε δίσκους αγαρόζης...93 6. Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (Polymerase chain reaction, PCR)..94 6.1. Αρχή της μεθόδου...95 6.2. Ελεγχος της ποιότητας του παραγόμενου DNA με PCR..96 6.3. Ανίχνευση γονιδίου meca...98 6.4. Ανίχνευση των γονιδίων τοξινών.....100 6.5. Πολλαπλή (Multiplex) PCR..103 7. Ένζυμα περιορισμού.108 7.1. Ανίχνευση του γονιδίου seu με ανάλυση πολυμορφισμού προϊόντος PCR (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP s).109 7.2. Ανάλυση θραυσμάτων χρωμοσωμικού DNA με SmaI και PFGE..110 8

7.3. Ανάλυση χρωμοσωμικού DNA μετά από επίδραση με ClaI και μεταφορά σε μεμβράνη..112 8. Υβριδισμός. 114 8.1. Σήμανση του DNA-ανιχνευτή με χημειοφωταύγεια...115 8.2. Προετοιμασία ρυθμιστικού διαλύματος υβριδισμού..116 8.3. Προ-υβριδισμός της μεμβράνης....116 8.4. Προετοιμασία του ανιχνευτή....117 8.5. Ανίχνευση του υβριδισμού....117 9. Παραγωγή των ανιχνευτών meca, luks-pv/lukf-pv, seo, sem, sei, sen, seg, ψent1/ψent2 και Tn554..118 9.1. meca, luks-pv/lukf-pv, seo, sem, sei, sen, seg, ψent1/ψent2 DNAανιχνευτές.....118 9.2. Tn554 ανιχνευτής..119 9.2.1. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA.. 119 9.2.2. Παρασκευή Tn554 ανιχνευτή....121 9.2.3. Απομόνωση DNA από χαμηλής τήξεως (low melting) αγαρόζη.. 121 10. Μελέτη της έκφρασης του γονιδίου tst με αντίστροφη μεταγραφή και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real-Time two step RT PCR).....123 10.1. Απομόνωση ολικού RNA (Total RNA isolation).. 123 10.2. Σύνθεση cdna Αντίστροφη μεταγραφή (Reverse transcription)..125 10.3. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real Time PCR).126 10.3.1. Αρχή της μεθόδου....127 10.3.2. Χημική βάση των μεθόδων ανίχνευσης των προϊόντων της Real Time PCR (Detection chemistries).....128 10.3.3. Βελτιστοποίηση συνθηκών της Real Time PCR.. 129 10.3.4. Συνθήκες της Real Time PCR..130 11. Ποσοτικοποίηση με Real Time PCR (Quantitative Real-Time PCR, QRT- PCR).132 11.1. Απόλυτη ποσοτικοποίηση (Real-Time Absolute QRT-PCR). 132 11.2. Σχετική ποσοτικοποίηση (Real-Time Relative QRT-PCR)...134 11.2.1. Μαθηματικά μοντέλα ανάλυσης αποτελεσμάτων στη σχετική ποσοτικοποίηση με Real Time PCR.....136 9

12. Multi Locus Sequence Typing (MLST) και τυποποίηση με εύρεση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας της πρωτεΐνης Α (spa typing)....137 12.1. Απομόνωση χρωμοσωμικού DNA (DNA extraction) με τη μέθοδο φαινόλης-χλωροφορμίου....139 12.2. Αραιώσεις του καθαρού DNA, που παρήχθη με τη μέθοδο φαινόλης: χλωροφορμίου 140 12.3. Ενίσχυση των γονιδίων της MLST και του spa typing, με αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR).....141 12.4. Καθαρισμός των προϊόντων της PCR...146 12.5. Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των γονιδίων της MLST και του γονιδίου spa (sequencing).....146 12.5.1. Αρχή της μεθόδου.....146 12.5.2. Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας με σημασμένα μόρια εκκινητών και τυποποίηση.....147 Β. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ...150 1. Κατανομή των MRSA....152 2. Συσχέτιση των MRSA με τις κλινικές και τα κλινικά δείγματα από τα οποία απομονώθηκαν.... 155 3. Μοριακή τυποποίηση...158 3.1. Χαρακτηρισμός κλώνων με PFGE 158 3.1.1. Συσχέτιση των τύπων PFGE με τις κλινικές και τα κλινικά δείγματα από τα οποία απομονώθηκαν... 164 3.2. Χαρακτηρισμός τύπων SCCmec και agr... 169 3.3. Χαρακτηρισμός τύπων ClaI/mecA και ClaI/Tn554...170 3.4. Τυποποίηση με MLST και spa typing...173 4. Αποτελέσματα του ελέγχου ευαισθησίας και συσχέτιση με τους κλώνους των MRSA......177 5. Αποτελέσματα από την ανίχνευση της παρουσίας των γονιδίων luks-pv και lukf-pv... 180 6. Αποτελέσματα από την ανίχνευση της παρουσίας των γονιδίων tst, seu, seo, sem, sei, sen, seg και της περιοχής των ψευδογονιδίων ψent1/ψent2....187 10

7. Επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων της ανίχνευσης των γονιδίων των τοξινών με PCR..191 8. Μελέτη της έκφρασης του γονιδίου tst με αντίστροφη μεταγραφή και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real-Time two step RT PCR).....191 Γ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ.196 ΠΕΡΙΛΗΨΗ..213 SUMMARY..216 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ.....218 11

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Στην Ελλάδα, όπως και σε πολλές άλλες χώρες, τα ανθεκτικά στη methicillin στελέχη Staphylococcus aureus (MRSA) παραμένουν ένα σοβαρό αίτιο ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων (HA-MRSA), ενώ ολοένα και πληθαίνουν οι αναφορές για λοιμώξεις, που οφείλονται σε MRSA που προέρχονται από την κοινότητα (CA-MRSA). Ιδιότητα των στελεχών αυτών είναι η τάση που έχουν να ενσωματώνουν στο γονιδίωμά τους εξωγενή γενετικά στοιχεία που φέρουν γονίδια αντοχής σε αντιβιοτικά, αλλά και γονίδια τοξινών. Τα τελευταία χρόνια η ταυτοποίηση νέων κλώνων MRSA με συγκεκριμένα φαινοτυπικά και γονοτυπικά χαρακτηριστικά φανερώνει το πόσο ευέλικτο είναι το γονιδίωμά τους. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με την αύξηση των λοιμώξεων από MRSA σε παγκόσμιο επίπεδο και την καταγραφή κρουσμάτων και μικροεπιδημιών στο ενδονοσοκομειακό και εξωνοσοκομειακό περιβάλλον, έχουν στρέψει τις έρευνες στη μελέτη της επιδημιολογίας των MRSA και τη διερεύνηση της μοριακής βάσης αυτής. Στα πλαίσια μιας τέτοιας συνολικής θεώρησης της επιδημιολογίας των MRSA και δεδομένου ότι παρόμοια μελέτη δεν είχε πραγματοποιηθεί στο παρελθόν στη χώρα μας, σκεφθήκαμε να διερευνήσουμε το μοριακό υπόβαθρο των συγκεκριμένων στελεχών, ώστε να το συσχετίσουμε με την παθογένειά τους και κατ επέκταση την αντιμετώπισή τους και να εφαρμόσουμε νέες τεχνικές για το σκοπό αυτό, όπως η Real-Time PCR και το sequencing. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών και καλύφθηκε οικονομικά σε μεγάλο μέρος από το πρόγραμμα «Κ. Καραθεοδωρή υπ αριθμόν Β116». Στην προσπάθεια αυτή βρήκα συνοδοιπόρους και συμπαραστάτες τους Καθηγητές μου και τους συναδέλφους μου, τους οποίους και αισθάνομαι την ανάγκη να ευχαριστήσω. Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή Μικροβιολογίας κ Γεώργιο Ο. Δημητρακόπουλο για το ότι με τίμησε με την ανάθεση του θέματος αυτού και για την επιστημονική καθοδήγησή του καθ όλη τη διάρκεια της προσπάθειάς μου, μέσω της οποίας μου μετέδωσε τις πολύτιμες γνώσεις του και τη μακρόχρονη εμπειρία του. Ιδιαίτερα αισθάνομαι την ανάγκη να ευχαριστήσω την επιβλέπουσα Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κα Ίρις Σπηλιοπούλου-Σδούγκου για την άψογη και αποδοτική συνεργασία μας. Μου μετέδωσε όλη τη γνώση που κατέχω σήμερα, 12

αποτέλεσμα μακροχρόνιας έρευνας και μελέτης της ιδίας, και με έμαθε να σκέφτομαι ανοιχτά και να αναζητώ πάντα αυτό που βρίσκεται πίσω από αυτό που βλέπουμε. Την ευχαριστώ επίσης, για το χρόνο που αφιέρωσε στη διόρθωση της διατριβής αυτής, τις πολύτιμες συμβουλές της και για την κατανόηση και συμπαράστασή της σε όλες τις στιγμές, εντός και εκτός εργαστηρίου, όχι μόνο ως Καθηγήτρια, αλλά και ως άνθρωπος. Κυρίως, όμως θέλω να την ευχαριστήσω για το ότι με εμπιστεύθηκε, πίστεψε σε μένα και με στήριξε σε κάθε προσπάθεια. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή κ Ευάγγελο Αναστασίου για την πολύτιμη συμβολή του στη βελτίωση και επιστημονική ορθότητα της παρούσας εργασίας με τις υποδείξεις και τις γνώσεις του και τη συνεχή παρακολούθηση. Ευχαριστώ θερμά την Επίκουρη Καθηγήτρια κα Μυρτώ Χριστοφίδου για την συμπαράσταση και υποστήριξη σε όλο το διάστημα της προσπάθειάς μου. Ιδιαίτερα αισθάνομαι την ανάγκη να την ευχαριστήσω για την άψογη συνεργασία μας τους τελευταίους μήνες, τις γνώσεις που μου μετέδωσε και την εμπιστοσύνη που έδειξε στο πρόσωπό μου, ώστε να με επιλέξει για συνεργάτη της. Την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κα Φωτεινή Παληογιάννη ευχαριστώ θερμά για τις εύστοχες υποδείξεις της και την αρμονική συνεργασία μας. Την Λέκτορα κα Φεβρονία Κολονίτσιου ευχαριστώ θερμά για τη συμπαράσταση, την κατανόηση και τις χρήσιμες υποδείξεις της. Ευχαριστώ τον Καθηγητή κ Χαράλαμπο Μπασιάρη για τον πολύτιμο χρόνο που αφιέρωσε στην κριτική θεώρηση της μελέτης αυτής και τις πολύτιμες υποδείξεις. Ξεχωριστή θέση μέσα μου κατέχουν οι συνάδελφοί μου, κα Αντιγόνη Φωκά, κα Ελεάννα Δρούγκα, κα Μαρία Κρεββατά, κα Κασσιανή Λιόπετα και κ Οδυσσέας Γ. Δημητρακόπουλος, με τους οποίους πέρασα τις περισσότερες ώρες στο εργαστήριο και μοιραστήκαμε στιγμές χαράς και λύπης, επιτυχίας και απογοήτευσης. Θα ήθελα να τους ευχαριστήσω όχι μόνο για τη συμπαράσταση σε κάθε στιγμή, επαγγελματική και προσωπική, που τους είχα ανάγκη, αλλά και για τη δυνατή φιλία που θα μας δένει στο μέλλον. Τίποτα, όμως από όλα αυτά δε θα είχε πραγματοποιηθεί αν δεν είχα την αμέριστη ηθική και υλική υποστήριξη από την οικογένεια μου. Ευχαριστώ τους γονείς μου για όλα όσα μου πρόσφεραν μέχρι σήμερα και κυρίως τη μητέρα μου, στην οποία και αφιερώνω τη διατριβή αυτή, ως ελάχιστο δείγμα ευγνωμοσύνης. Τέλος, ευχαριστώ τον σύντροφό μου κ Παναγιώτη Καρτάλο για την υπομονή και 13

κατανόηση που έδειξε όλα αυτά τα χρόνια και για το ότι ήταν πάντα δίπλα μου και με στήριζε σε όλες τις δύσκολες στιγμές. 14

ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ DNA Δεσοξυριβονουκλεϊκό οξύ cdna copy DNA RNA Ριβονουκλεϊκό οξύ DNase Δεσοξυριβονουκλεάση dntp Δεσοξυτριφωσφορικά νουκλεοτίδια dh 2 O Απιονισμένο ύδωρ mecα Γονίδιο που κωδικοποιεί την ανθεκτικότητα στη methicillin SCCmec Staphylococcal Cassette Chromosome mec agr accesory gene regulator PBP Penicillin Binding Protein MRSA Methicillin-Resistant Staphylococccus aureus MSSA Methicillin-Sensitive Staphylococccus aureus CA-MRSA Community-Acquired Methicillin-Resistant Staphylococccus aureus HA-MRSA Hospital-Acquired Methicillin-Resistant Staphylococccus aureus PCR Polymerase Chain Reaction Taq DNA πολυμεράση (Thermus aquaticus) bp base pair PVL Panton-Valentine Leucocidine luks-pv/lukf-pv Γονίδια που κωδικοποιούν τις υπομονάδες S και F της PVL TSST-1 Toxic Shock Syndrome Toxin -1 tst Γονίδιο που κωδικοποιεί την TSST-1 egc Enterotoxin gene cluster IgG Ανοσοσφαιρίνη G PTSAgs Pyrogenic Toxin Superantigens arcc Carbamate kinase aroe Shikimate dehydrogenase glpf Glycerol kinase gmk Guanylate kinase tpi Triosephosphate isomerase 15

pta yqil spa SSR PFGE RT-PCR Tm MLST ST CC Phosphate acetyltransferase Acetyl coenzyme A acetyltransferase Γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεϊνη A Short Sequence Repeat Pulsed-Field Gel Electrophoresis Real-Time Polymerase Chain Reaction melting Temperature Multi Locus Sequence Typing Sequence Type Clonal Complex 16

ΣΚΟΠΟΣ Σκοπός της παρούσας ερευνητικής εργασίας ήταν η επιδημιολογική μελέτη των σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων και κυρίως των λοιμώξεων από MRSA, τόσο στο ενδονοσοκομειακό περιβάλλον, όσο και στην κοινότητα, το διάστημα 2001-2006. Αρχικά, ταυτοποιήθηκαν ως MRSA όσα στελέχη έφεραν το γονίδιο meca. Στη συνέχεια, προσδιορίσθηκε ο φαινότυπος αντοχής των στελεχών στους αντιμικροβιακούς παράγοντες και ακολούθησε τυποποίηση σε κλώνους με PFGE και με υβριδισμό με ειδικούς ανιχνευτές για το γονίδιο meca και το τρανσποζόνιο Tn554. Η μοριακή τυποποίηση περιελάμβανε, επίσης, προσδιορισμό των τύπων SCCmec και agr και ολοκληρώθηκε με MLST, επιτρέποντας έτσι την κατάταξη των στελεχών σε συμπλέγματα κλώνων, διεθνώς γνωστών. Πραγματοποιήθηκε μελέτη της φορείας γονιδίων τοξινών και επιπλέον, ποσοτικός προσδιορισμός της έκφρασης του γονιδίου tst. Για την ποσοτικοποίηση του συγκεκριμένου γονιδίου αναπτύχθηκε μεθοδολογία με Real Time PCR και ανάλυση των αποτελεσμάτων με εφαρμογή δύο μαθηματικών μοντέλων. Πραγματοποιήθηκε καταγραφή των κλώνων, εντός και εκτός νοσοκομειακού περιβάλλοντος, κατά το διάστημα αυτό, παρακολούθηση της εμφάνισής τους, αλλά και εντοπισμός νέων κλώνων στη χώρα μας. Εγινε προσπάθεια συλλογικής θεώρησης των αποτελεσμάτων, με σκοπό τη συσχέτιση των κλώνων με το φαινότυπο και γονότυπο των στελεχών, καθώς και με την προέλευση των κλινικών δειγμάτων, ώστε, να βρεθούν πιθανές σχέσεις ή αλληλεπιδράσεις μεταξύ τους. Η ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (sequencing) των κλώνων επέτρεψε τη διερεύνηση της προέλευσης και διασποράς τους στη χώρα μας και τη σύγκριση με την παγκόσμια κατάσταση. Επιπλέον, η συγκεκριμένη μελέτη είναι η πρώτη ολοκληρωμένη καταγραφή των MRSA στη χώρα μας και αποτελεί μελέτη αναφοράς. 17

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 18

19

1. Ιστορική αναδρομή Η ονομασία Staphylococcus χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά το 1883, από τον Sir Alexander Ogston, για να περιγράψει σφαιρικά βακτήρια, τα οποία σχημάτιζαν αθροίσματα που έμοιαζαν με τσαμπιά από σταφύλια. Μετά από μια σειρά κλινικών και εργαστηριακών μελετών περιέγραψε τη σταφυλοκοκκική λοίμωξη (Ogston, 1883). Ο Rosenbach, το 1884, διαχώρισε τους σταφυλοκόκκους σε παθογόνους (S. aureus) και μη παθογόνους (S. epidermidis) (Rosenbach, 1884). Τα δύο είδη διαχωρίζονται μεταξύ τους και από την ικανότητα των στελεχών S. aureus να προκαλούν πήξη του πλάσματος. Η ορολογική ταξινόμηση προτάθηκε για πρώτη φορά το 1902, από τους Kolle και Otto, που ανέφεραν ότι με μεθόδους αιματοσυγκόλλησης ήταν δυνατό να διακριθούν τα παθογόνα από τα μη παθογόνα στελέχη. Ο Loeb το 1903, έδειξε ότι ο S. pyogenes aureus (όπως αναφέρετο ο S. aureus) προκαλούσε πήξη του πλάσματος μέσα σε μερικές ώρες, ενώ ο S. epidermidis albus δεν είχε αυτή την ικανότητα. Οι Menkin και Walston το 1935, απέδειξαν ότι υπεύθυνη για τη σταφυλοκοκκική οργανική βλάβη ήταν μια τοξίνη και όχι η πηκτάση. Ο Duthie (1954) έδειξε ότι υπήρχαν δυο μορφές σταφυλοκοκκικής πηκτάσης: η συνδεδεμένη πηκτάση (clumping factor ή bound coagulase) και η ελεύθερη πηκτάση (free coagulase) (Crossley and Archer, 1997 ). Το 1956, οι Knight, White, Foster και Wenzel, έδειξαν ότι οι νοσηλευόμενοι ασθενείς ήταν σε υψηλότερο ποσοστό φορείς S. aureus, σε σχέση με τον υπόλοιπο πληθυσμό και ότι το ποσοστό αυτό αυξανόταν ανάλογα με τη διάρκεια παραμονής τους στο νοσοκομείο. Η θέση αποικισμού ήταν η ανωτέρα αναπνευστική οδός και ο μικροοργανισμός πολλαπλασιαζόταν χωρίς διείσδυση στους ιστούς. Οι σουλφοναμίδες ήταν τα μοναδικά αποτελεσματικά φάρμακα για την αντιμετώπιση των σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων στον άνθρωπο, μέχρι την κλινική χρήση της πενικιλλίνης το 1941. Πολύ γρήγορα μετά την εισαγωγή της penicillin στην κλινική πράξη, απομονώθηκαν στελέχη ανθεκτικά στο αντιβιοτικό με ικανότητα παραγωγής β-λακταμάσης. Μεταξύ των πρώτων πειραμάτων για την απομόνωση των ανθεκτικών στην penicillin σταφυλοκόκκων, ήταν η τεχνική του Lederberg (1952). Σύμφωνα με αυτήν, όταν ένας φαινοτυπικά ευαίσθητος πληθυσμός αναπτυσσόταν σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα χωρίς αντιβιοτικό και μετά εμβολιαζόταν σε θρεπτικό 20

υλικό που περιείχε penicillin, οι αποικίες που αναπτύσσονταν ήταν οι μεταλλαγμένοι ανθεκτικοί κλώνοι (Crossley and Archer, 1997 ). Το 1960 άρχισε η θεραπευτική χρήση των ημισυνθετικών πενικιλλινών (oxacillin, methicillin, nafcillin), σε λοιμώξεις από στελέχη S. aureus που παρήγαγαν β-λακταμάσες. Το 1961 απομονώθηκαν τα πρώτα ανθεκτικά στη methicillin στελέχη S. aureus (methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) στην Αγγλία (Jevons, 1961). Ακολούθησαν μελέτες που περιέγραψαν τη διασπορά επιδημικών MRSA στελεχών τόσο στην Αγγλία, όσο και στην υπόλοιπη Ευρώπη, αλλά και Ασία, Αμερική, Αυστραλία, με ποσοστά απομόνωσης που ήταν ποικίλλα στις διάφορες περιοχές. Τα συγκεκριμένα στελέχη ήταν ανθεκτικά μόνο στα β-λακταμικά αντιβιοτικά, χωρίς να έχουν ταυτοποιηθεί ακόμη πολυανθεκτικά MRSA στελέχη. Επίσης, δε φαίνεται να είχαν αυξημένη λοιμογόνο ικανότητα σε σχέση με στελέχη ευαίσθητα στη methicillin S. aureus (methicillin-sensitive Staphylococcus aureus, MSSA) (Fluit and Schmitz, 2003). Κατά τη διάρκεια της δεκαετίας του 70 παρατηρήθηκε ύφεση της συχνότητας των MRSA λοιμώξεων. Στην επόμενη δεκαετία, όμως, και μέχρι σήμερα καταγράφηκαν επιδημίες οφειλόμενες σε πολυανθεκτικά MRSA στελέχη στα νοσοκομεία διαφόρων χωρών. Το πρόβλημα που ανακύπτει με τα νέα στελέχη είναι ότι εμφανίζουν αντοχή σε ένα ευρύ φάσμα χημειοθεραπευτικών, με αποτέλεσμα σε πολλές περιπτώσεις να παραμένουν ως μόνη θεραπευτική λύση τα γλυκοπεπτίδια (Sanyal et al, 1991). Τα MRSA στελέχη φέρουν το γονίδιο meca που κωδικοποιεί τη σύνθεση μιας νέας πενικιλλινοδεσμευτικής πρωτεΐνης (PBP2a) με μειωμένη συγγένεια προς τα β- λακταμικά αντιβιοτικά (Hartman and Tomasz, 1984; Berger-Bächi et al, 1997). Η περιοχή mec βρίσκεται σε μεταθετό στοιχείο DNA (τρανσποζόνιο) μεταξύ αλληλουχιών εισδοχής (IS) και με ικανότητα οριζόντιας μεταφοράς σε άλλα στελέχη του ίδιου ή άλλου είδους (Fluit and Schmitz, 2003; Ito et al, 2001). Η δομή της περιοχής mec στα MRSA επιτρέπει την ενσωμάτωση και άλλων γονιδίων που κωδικοποιούν παράγοντες αντοχής στα αντιβιοτικά, με συνέπεια τα συγκεκριμένα στελέχη να είναι πολυανθεκτικά και οι λοιμώξεις που προξενούν να είναι δύσκολο να αντιμετωπισθούν, ιδίως σε ασθενείς με υποκείμενη νόσο (Berger-Bächi et al, 1997; Ito et al, 2001). Τα τελευταία χρόνια έχει παρατηρηθεί αύξηση στη συχνότητα των 21

σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων γενικά, ειδικότερα όμως από MRSA στελέχη, ιδιαίτερα στην κοινότητα και στα νοσοκομεία (Fluit and Schmitz, 2003). 2. Ταξινόμιση των Σταφυλοκόκκων Οι σταφυλόκοκκοι είναι Gram θετικοί κόκκοι, διαμέτρου 0.5 έως 1.5 μm και ανήκουν στην οικογένεια Micrococcaceae. Τα γένη των οικογενειών Micrococcaceae και Streptococcaceae διαχωρίζονται με τη δοκιμασία παραγωγής της καταλάσης. Το ένζυμο καταλάση βρίσκεται σε όλα τα βακτήρια που έχουν κυτοχρώματα, όπως τα γένη της οικογένειας Micrococcaceae (Δημητρακόπουλος, 1987). Η οικογένεια Micrococcaceae περιλαμβάνει τα γένη Staphylococcus, Planococcus, Rothia και Micrococcus. Ο διαχωρισμός του γένους Staphylococcus από το γένος Micrococcus, που και αυτό αποτελεί μέρος της φυσιολογικής μικροβιακής χλωρίδας του ανθρώπου και σπάνια αποτελεί αίτιο λοιμώξεων, βασίζεται στην αναερόβια διάσπαση της γλυκόζης και στον έλεγχο ευαισθησίας στη bacitracin. Οι σταφυλόκοκκοι διασπούν τη γλυκόζη αεροβίως και αναεροβίως, ενώ οι μικρόκοκκοι τη διασπούν μόνο αεροβίως (Δημητρακόπουλος, 1987) και είναι ανθεκτικοί στη bacitracin ενώ οι μικρόκοκκοι είναι ευαίσθητοι (δίσκος 0.04U σε τρυβλίο με 5% αιματούχο άγαρ) (Forbes et al, 2002). Η κατάταξη των σταφυλοκόκκων βασίζεται σήμερα στην ταξινόμηση των Kloos και Schleifer (1975) και περιλαμβάνει 38 είδη, που διαχωρίζονται μεταξύ τους από τις βιοχημικές τους ιδιότητες. O S. aureus αποτελεί τον κύριο παθογόνο μικροοργανισμό, με δεύτερο κατά σειρά συχνότητας τον S. epidermidis, ο οποίος μαζί με τα υπόλοιπα είδη σταφυλοκοκκόκων είναι γνωστοί ως πηκτάση-αρνητικοί σταφυλόκοκκοι (Coagulase Negative Staphylococci, CNS). Το γεγονός ότι περισσότερο από τα υπόλοιπα είδη μελετήθηκε και μελετάται ο S. aureus, δείχνει την πρωταρχική σημασία που έχει ως παθογόνος μικροοργανισμός στον άνθρωπο. Οι έρευνες για τον S. aureus επικεντρώνονται κυρίως στην κατανόηση της παθογένειας, της ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά και την άντληση νέων πληροφοριών, τόσο για τη δομή του, όσο και για το εξαιρετικά ευέλικτο γονιδίωμά του. 22

3. Γενικά για τον S. aureus Τα Gram-θετικά βακτήρια έχουν πολλές χαρακτηριστικές ιδιότητες που τα διαχωρίζουν από τα Gram-αρνητικά. Το κυτταρικό τους τοίχωμα αποτελείται από μια παχειά στοιβάδα πεπτιδογλυκάνης (μουκοπεπτίδιο), τειχοϊκά οξέα, ενώ απουσιάζει ο λιποπολυσακχαρίτης, που υπάρχει σε όλα τα Gram-αρνητικά βακτήρια. Τα χαρακτηριστικά της δομής του κυτταρικού τοιχώματος των βακτηρίων είναι υπεύθυνα για τη χρώση τους κατά Gram. Τα Gram-θετικά βακτήρια εγκλωβίζουν το σύμπλοκο κρυσταλλικού ιώδους-ιωδιούχου καλίου στο κυτταρικό τους τοίχωμα, που έχει δομή πλούσια σε υδατάνθρακες, και δεν επιτρέπουν τη δράση του διαλύματος ακετόνης-αιθυλικής αλκοόλης, που χρησιμοποιείται για τον αποχρωματισμό στη διαδικασία της χρώσης και ως εκ τούτου βάφονται ιώδη (Δημητρακόπουλος, 1987). Οι σταφυλόκοκκοι βρίσκονται στον αέρα και το έδαφος, απομονώνονται από τα θηλαστικά και αποικίζουν το δέρμα και τους βλεννογόννους του ανθρώπου σε συγκεντρώσεις πάνω από 10 4-10 6 CFU/mL (Colony Forming Units/mL) (Noble and Pitcher, 1978). Μερικά είδη βρίσκονται μόνο σε ζώα, ενώ άλλα αποικίζουν συγκεκριμένες ανατομικές περιοχές του ανθρώπου. Ο S. aureus αποικίζει κυρίως τις ρινικές κοιλότητες και το δέρμα (Weistein, 1959). Αναπτύσσεται εύκολα στα κοινά θρεπτικά υλικά, σε αερόβιες συνθήκες και στους 37 0 C, αν και η ανάπτυξή του είναι δυνατή σε θερμοκρασίες που κυμαίνονται από 12-45 0 C. Επίσης, έχει την ικανότητα να αναπτύσσεται σε υλικά που περιέχουν 7.5-10% NaCl (Δημητρακόπουλος, 1987). Διασπά διάφορα σάκχαρα χωρίς την παραγωγή αερίου. Πολλά στελέχη παράγουν αποικίες που έχουν κίτρινο χρώμα, γι αυτό και παλαιότερα ο μικροοργανισμός χαρακτηρίστηκε ως S. aureus (Σταφυλόκοκκος ο χρυσίζων). Η ιδιότητα αυτή, όμως, δεν είναι σταθερή και δε χρησιμοποιείται σήμερα για χαρακτηρισμό του είδους (Δημητρακόπουλος, 1987). 23

4. Λοιμώξεις από S. aureus 4.1. Γενικά χαρακτηριστικά των λοιμώξεων 1. Οι λοιμώξεις που προκαλούνται από τον S. aureus αφορούν κυρίως τo δέρμα και τα μαλακά μόρια, την αναπνευστική οδό, τα οστά, τους συνδέσμους και το ενδοθήλιο των αγγείων. 2. Τα περισσότερα νοσοκομειακά στελέχη είναι συνήθως ανθεκτικά σε ένα μεγάλο φάσμα αντιβιοτικών, όπως methicillin και άλλα β-λακταμικά αντιβιοτικά, erythromycin, clindamycin, tetracycline, chloramphenicol, sulfamethoxazole-trimethoprim και αμινογλυκοσίδες. Γενικά θεωρείται ότι ένας πολυανθεκτικός φαινότυπος αποτελεί ενδονοσοκομειακό στέλεχος ικανό να προκαλέσει σοβαρή λοίμωξη. 4.2. Γενικά για τις λοιμώξεις που προκαλεί ο S. aureus Οι σταφυλοκοκκικές λοιμώξεις χαρακτηρίζονται από έντονη διαπυητική φλεγμονή των ιστών, με τάση σχηματισμού κύστης, καταλήγοντας σε απόστημα. Διακρίνονται σε επιπολής και εν τω βάθει. Ο S. aureus μπορεί να προκαλέσει πυοδερματίτιδα (μολυσματικό κηρίο). Χαρακτηρίζεται αρχικά από φυσαλίδες που γρήγορα μετατρέπονται σε πομφόλυγες οι οποίοι σπάνε και σχηματίζουν εφελκίδες. Εμφανίζεται κυρίως σε νεογνά και μικρά παιδιά και μεταδίδεται πολύ εύκολα (πχ από τη χρήση κοινών μολυσμένων πετσετών). Το μολυσματικό κηρίο εμφανίζεται κυρίως στο πρόσωπο και τα άκρα. Εκτεταμένη άτυπη πυοδερματίτιδα σχετίζεται με HIV μόλυνση (Δημητρακόπουλος, 1987). Η θυλακίτιδα είναι συχνή λοίμωξη από S. aureus κατά την οποία αναπτύσσεται φλεγμονή του θύλακα της τρίχας. Εμφανίζονται μικρές βλατίδες, που εξελίσσονται σε φλύκταινες. Μετά τη θυλακίτιδα μπορεί να αναπτυχθεί ένα φλεγμονώδες οζίδιο στο ίδιο σημείο, αυτό ονομάζεται δοθιήνας. Σε αυτή την περίπτωση, η λοίμωξη δεν περιορίζεται στο θύλακο των τριχών, αλλά επεκτείνεται και στον υποδόριο ιστό. Δοθιήνες αναπτύσσονται κυρίως στο πρόσωπο, τον αυχένα, τη μασχάλη και τους γλουτούς (Δημητρακόπουλος, 1987). Ο ψευδάνθρακας είναι λοίμωξη του δέρματος γύρω από το θύλακο των τριχών που επεκτείνεται μέχρι το υποδόριο λίπος. Εντοπίζεται κυρίως στον αυχένα, στο επάνω μέρος της πλάτης και στους μηρούς, ενώ συνοδεύεται από πυρετό, ρίγη 24

και λευκοκυττάρωση. Άλλες λοιμώξεις που προκαλεί ο S. aureus είναι η κριθή πρόκειται για λοίμωξη των σμηγματογόνων αδένων στο βλέφαρο και η παρονυχία, η οποία είναι λοίμωξη κατά μήκος του περιονυχίου. Η επιδερμολυτική νόσος χαρακτηρίζεται από την εμφάνιση επώδυνου κηλιδώδους εξανθήματος ακολουθούμενο από πομφόλυγες, που διασπούν την ακεραιότητα του δέρματος και οδηγούν στην απόπτωση της επιδερμίδας. Το εξάνθημα αρχίζει από το πρόσωπο, επεκτείνεται σε ολόκληρο το σώμα και συνοδεύεται από πυρετό, 38-40 0 C. Η νόσος προσβάλλει κυρίως τα νεογνά, τα βρέφη και τα παιδιά έως 5 ετών (πολύ σπάνια περιγράφεται σε ενήλικες) και οφείλεται στην επιδερμολυτική τοξίνη που εκκρίνει ο S. aureus (Δημητρακόπουλος, 1987). Ο S. aureus είναι υπεύθυνος και για πολλές εν τω βάθει λοιμώξεις, όπως οστεομυελίτιδα, αρθρίτιδα, ενδοκαρδίτιδα, μηνιγγίτιδα, πνευμονία, φλεγμονές στον νεφρό και στο μαστό (το τελευταίο αφορά μητέρες που νοσηλεύονται). Η οστεομυελίτιδα προσβάλλει συχνότερα τα αγόρια 3-10 ετών, εντοπίζεται στις περισσότερες περιπτώσεις στη μετάφυση των οστών των κάτω άκρων και στο βραχιόνιο και η μεταφορά του μικροβίου γίνεται με το αίμα. Σε άτομα >50 ετών εμφανίζεται οστεομυελίτιδα των σπονδύλων και παρατηρείται συνήθως μετά από ουρολοίμωξη και επεμβάσεις στον προστάτη. Στη σταφυλοκοκκική αρθρίτιδα, στο 90% των περιπτώσεων προσβάλλεται μόνο η μία άρθρωση. Στην ενδοκαρδίτιδα η θνητότητα φτάνει το 40%. Η μηνιγγίτιδα συνήθως αποτελεί επιπλοκή διαγνωστικών ή χειρουργικών επεμβάσεων στο ΚΝΣ. Η πνευμονία είναι κατά κύριο λόγο δευτερογενής, στους ενήλικες μετά από γρίπη, ενώ στα μικρά παιδιά (<2 ετών) παρατηρείται αιμορραγική νέκρωση του πνεύμονα και σχηματισμός αποστήματος, με θνητότητα 5-40%. Οι περισσότερες από αυτές τις λοιμώξεις, συμπεριλαμβανομένης της ενδοκαρδίτιδας, είναι συχνές στους τοξικομανείς. Σε πολλές από αυτές τις περιπτώσεις, ο σακχαρώδης διαβήτης, λευκοκυτταρικές ανεπάρκειες, ανοσοκαταστολή από αλκοολισμό, προχωρημένη ηλικία, χρήση κορτικοστεροειδών ή κυτταροτοξικές θεραπείες αποτελούν προδιαθεσικούς παράγοντες (Δημητρακόπουλος, 1987). Επίσης, σταφυλοκοκκικές λοιμώξεις, με πιο συχνή τη βακτηριαιμία, μπορεί να είναι οι κύριες μετεγχειρητικές επιπλοκές μετά από διουρηθρική εκτομή του προστάτη, από παρατεταμένη χρήση ενδοφλέβιων καθετήρων, με πηγή το μικροβιακό φορτίο του ίδιου του ασθενούς, άλλων ασθενών ή του ιατρικού και νοσηλευτικού προσωπικού. Ο S. aureus μπορεί επίσης να προκαλέσει εντεροκολίτιδα μετά από 25

χορήγηση αντιβιοτικών ευρέος φάσματος, όπου τα ανθεκτικά στα αντιβιοτικά στελέχη επικρατούν και διεισδύουν στον εντερικό βλεννογόνο. Οι εντεροτοξίνες του σταφυλόκοκκου προκαλούν τροφική δηλητηρίαση. Τα συμπτώματα ναυτία, εμετοί και διάρροια διαρκούν για 6 ώρες και η ανάρρωση είναι πλήρης σε 24 ώρες, ενώ σπάνια η νόσος καταλήγει στο θάνατο. Μια από τις σοβαρότερες καταστάσεις που προκαλεί ο S. aureus είναι το σύνδρομο τοξικής καταπληξίας (toxic shock syndrome), που οφείλεται στη σύνθεση της αντίστοιχης τοξίνης (toxic shock syndrome toxin, TSST-1). Το σύνδρομο χαρακτηρίζεται από πυρετό ( 38.9 0 C), υπόταση, κηλιδώδες εξάνθημα που καταλαμβάνει όλο το σώμα, τις παλάμες και τα πέλματα και δυσλειτουργία διαφόρων οργάνων (διάρροια, εμετοί, αύξηση τρανσαμινασών και χολερυθρίνης, υπασβεσταιμία, ελάττωση του αριθμού των αιμοπεταλίων, λευκοκυττάρωση με άωρες μορφές λευκών αιμοσφαιρίων, αύξηση κρεατινίνης, ολιγουρία, πυουρία χωρίς την ανεύρεση μικροοργανισμών, αρθραλγίες, μυαλγίες και διαταραχές από το ΚΝΣ) (Δημητρακόπουλος, 1987). Η θνητότητα της σταφυλοκοκκικής βακτηριαιμίας τα τελευταία χρόνια κυμαίνεται στο 11-43% (Mylotte et al, 1987). Παράγοντες που σχετίζονται με την αυξημένη θνητότητα είναι η ηλικία άνω των 50 ετών, σοβαρά καρδιακά επεισόδια, νευρολογικές και αναπνευστικές λοιμώξεις. Η βακτηριαιμία που προκαλείται από ανθεκτικά στη methicillin στελέχη δε σχετίζεται άμεσα με την αυξημένη θνητότητα, όμως η συχνότητα των επιπλοκών μετά από βακτηριαιμία είναι υψηλή (11-53%). Η έννοια της «παροδικής βακτηριαιμίας» ενδιαφέρει επίσης, διότι αν και στις περισσότερες περιπτώσεις πρόκειται για ασυμπτωματική κατάσταση, μερικές φορές μπορεί να προκαλέσει σοβαρές επιπλοκές όπως ενδοκαρδίτιδα, οστεομυελίτιδα και λοιμώξεις προσθετικών υλικών. Το 25-35% των περιπτώσεων μικροβιακής ενδοκαρδίτιδας οφείλεται στον S. aureus (Sanabria et al, 1990). Συμβαίνει πιο συχνά σε ασθενείς που λαμβάνουν ενδοφλέβια ναρκωτικά, σε ηλικιωμένους ασθενείς, σε ασθενείς με προσθετικές βαλβίδες, καθώς και σε άλλους νοσηλευόμενους ασθενείς. Η κλινική εκδήλωση της λοίμωξης είναι υποξεία και η απάντηση στη θεραπεία είναι καλή. Επιπλοκές εμφανίζονται αρκετά συχνά, περίπου στα 2/3 των ασθενών και περιλαμβάνουν: συστηματική θρόμβωση, συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια, απόστημα μυοκαρδίου, ανωμαλίες ηλεκτρικής αγωγιμότητας ή ρήξη των βαλβίδων (Caputo et al, 1987). Οστεομυελίτιδα εμφανίζεται κλινικά όταν αρκετός αριθμός λοιμογόνων μικροοργανισμών υπερβεί την άμυνα του ατόμου και προκαλέσει εστιακή λοίμωξη 26

στο οστό με διαπύηση και ισχαιμική νέκρωση, που ακολουθείται από ίνωση και οστική επανόρθωση. Τυπικά συμμετέχει όλο το οστό (μυελός, φλοιός και περιόστεο). Η οξεία αιματογενής οστεομυελίτιδα εμφανίζεται ως αποτέλεσμα του εντοπισμού στο οστό βακτηρίων που μεταφέρθηκαν αιματογενώς και είναι πιο συχνή σε παιδιά ηλικίας 10 ετών. Το συχνότερο βακτηριακό αίτιο είναι ο S. aureus, υπεύθυνος για 40-80% των περιπτώσεων. Τα βακτήρια έχουν την ικανότητα να προσκολλώνται στα στοιχεία από συνδετικό ιστό του οστού. Η πηγή της βακτηριαιμίας μπορεί να είναι μια εστιακή πυώδης φλεγμονή ή ένας κλινικά αφανής, απροσδιόριστος αποικισμός ή λοίμωξη. Η λοίμωξη, συνήθως αρχίζει στην περιοχή της μετάφυσης ενός μακρού οστού και τυπικά οδηγεί σε παραγωγή φλεγμονώδους εκκρίματος, το οποίο συσσωρεύεται υπό πίεση στο μυελό και το φλοιό. Αρκετό πύον μπορεί να συσσωρευτεί στον υποπεριοστικό χώρο και να ανυψώσει το μη πάσχον περιόστεο προκαλώντας διακοπή της παροχής αίματος από το περιόστεο, με τελικό αποτέλεσμα το σχηματισμό μιας περιοχής νεκρωμένου οστού, που καλείται απόλυμα (Crossley and Archer, 1997; Fluit and Schmitz, 2003). Οι πηκτάση-αρνητικοί σταφυλόκοκκοι είναι υπεύθυνοι για το 20-40% των λοιμώξεων των αρθρώσεων με προσθετικά υλικά, καταλαμβάνοντας τη δεύτερη θέση μετά τον S. aureus. Οι λοιμώξεις αυτές εμφανίζονται συνήθως μετά την παρέλευση 2-3 μηνών από τη χειρουργική επέμβαση και σε αυτήν την περίπτωση θεωρούνται φυσιολογικές, γιατί δεν προσβάλλουν τις αρθρώσεις. Οι λοιμώξεις που εμφανίζονται σε χρονικό διάστημα 2 έτη από τη χειρουργική επέμβαση είναι αποτέλεσμα αιματογενούς διασποράς του μικροβίου (Crossley and Archer, 1997; Fluit and Schmitz, 2003). 5. Παθογένεια των λοιμώξεων από S. aureus Από την πρώτη ταυτοποίηση των MRSA το 1961 έχει παρατηρηθεί διασπορά αυτών των στελεχών στο περιβάλλον των νοσοκομείων αλλά τα τελευταία χρόνια και στην κοινότητα, ενώ φαίνεται να αποικίζουν και το ρινικό βλεννογόνο ατόμων που δεν έχουν προηγούμενη επαφή με το νοσοκομειακό περιβάλλον (Crossley and Archer, 1997; Fluit and Schmitz, 2003). Παρά το γεγονός ότι η παρουσία του γονιδίου meca δε σχετίζεται με αύξηση της λοιμογόνου ικανότητας του βακτηρίου, εν τούτοις, η διασπορά των MRSA μετά από αποικισμό, η ανάπτυξή τους παρουσία 27

χαμηλών συγκεντρώσεων β-λακταμικών αντιβιοτικών και η εξάπλωση των στελεχών που σχετίζονται με λοιμώξεις της κοινότητας και που φέρουν γονίδια παραγωγής τοξινών, καθιστά τα συγκεκριμένα στελέχη αντικείμενο συνεχιζόμενης έρευνας. Οι παράγοντες που συμβάλλουν στη λοιμογόνο ικανότητα του S. aureus και προάγουν την προσκόλληση, την καταστροφή των ιστών, τη διείσδυση και την κυτταροτοξικότητα κατατάσσονται σε τρεις κατηγορίες: παράγοντες της επιφανείας του κυττάρου, ένζυμα που εκκρίνονται εξωκυττάρια και οι εξωτοξίνες (Πίνακας 1) (Δημητρακόπουλος, 1987; Crossley and Archer, 1997; Fluit and Schmitz, 2003). Η σύνθεση των ανωτέρω παραγόντων ρυθμίζεται από γονίδια και οπερόνια που άλλοτε παίζουν ρόλο θετικό, ενεργοποιώντας, και άλλοτε αρνητικό καταστέλλοντας την έκφραση γονιδίων, ανάλογα με τις συνθήκες του περιβάλλοντος και τη φάση ανάπτυξης του βακτηρίου (Bronner et al, 2004; Valle et al, 2003; Jarraud et al, 2002). Ο S. aureus έχει εξελιχθεί σε έναν άριστα προσαρμοσμένο παθογόνο μικροοργανισμό και σε αυτό έχουν συμβάλλει οι πολυπαραγοντικοί παθογόνοι μηχανισμοί που διαθέτει. 5.1 Παράγοντες επιφανείας Έλυτρο: είναι μια πολυσακχαριδική στιβάδα που περιβάλλει περίπου το 90% των στελεχών. Φαίνεται ότι συντίθεται πολύ συχνότερα in vivo παρά στα τεχνητά θρεπτικά υλικά. Διακρίνονται 11 αντιγονικοί τύποι του ελύτρου με τους τύπους 5 και 8 να απομονώνονται συχνότερα από λοιμώξεις. Το έλυτρο αναστέλλει τη χημειοταξία και τη φαγοκυττάρωση του βακτηρίου από τα πολυμορφοπύρηνα (PMNs) καλύπτοντας επιφανειακές πρωτεΐνες και μόρια C3b, και προάγει την προσκόλλησή του σε προσθετικά βιοϊατρικά υλικά (καθετήρες, συνθετικά μοσχεύματα, βαλβίδες) (Δημητρακόπουλος, 1987; Crossley and Archer, 1997; Fluit and Schmitz, 2003). Πεπτιδογλυκάνη: αποτελείται από υπομονάδες N-ακετυλογλυκοζαμίνης/Nακετυλομουραμικού οξέος με γέφυρες 4-5 πεπτιδίων και γέφυρες πενταγλυκίνης. Η πεπτιδογλυκάνη προάγει τη σύνθεση IL-1 από τα μονοπύρηνα, ενεργοποιεί το συμπλήρωμα και έλκει τα PMNs, γεγονός που συμβάλλει στο σχηματισμό του αποστήματος (Δημητρακόπουλος, 1987; Crossley and Archer, 1997). Τειχοϊκά οξέα: είναι πολυμερή ειδικά του είδους και στον S. aureus αποτελούνται από ριβιτόλη με ομάδες N-ακετυλογλυκοζαμίνης (πολυσακχαρίδιο Α), που συνδέονται με την πεπτιδογλυκάνη ή με την κυτταροπλασματική μεμβράνη δια μέσου λιπόφιλων ομάδων (λιποτειχοϊκά οξέα). Συνδέονται με την ινωδονεκτίνη 28

(fibronectin) και προάγουν την προσκόλληση του βακτηρίου στους βλεννογόνους του ξενιστή (Δημητρακόπουλος, 1987; Crossley and Archer, 1997). Πρωτεΐνες επιφανείας: πρόκειται για διαφορετικές πρωτεΐνες που ανήκουν στην ομάδα των MSCRAMMS (Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules), έχουν κάποιες κοινές αλληλουχίες και είναι συνδεδεμένες στο κυτταρικό τοίχωμα (Fluit and Schmitz, 2003). Πρωτεΐνες που συνδέουν την ινωδονεκτίνη: έχουν ταυτοποιηθεί δυο πρωτεΐνες με ικανότητα σύνδέσης της ινωδονεκτίνης, με αποτέλεσμα αναστολή της επούλωσης. Επομένως, φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη των φλεγμονών των τραυμάτων (Fluit and Schmitz, 2003). Πρωτεΐνη Α: είναι πρωτεΐνη συνδεδεμένη στην πεπτιδογλυκάνη του βακτηρίου η οποία έχει μεγάλη τάση σύνδεσης με το Fc τμήμα των IgG1, IgG2, IgG4, IgM και IgA2, με αποτέλεσμα να αποτρέπει τη καταστροφή του μικροοργανισμού με τη βοήθεια των αντισωμάτων (Δημητρακόπουλος, 1987; Crossley and Archer, 1997). Η πρωτεΐνη Α αποτελείται από πέντε επαναλαμβανόμενες ομόλογες περιοχές α-έλικας, περίπου 60 αμινοξέων η καθεμία, οι οποίες ενέχονται στην προσκόλληση με το Fc τμήμα των Igs. Έτσι, ο μικροοργανισμός προσκολλάται στα αντισώματα με τέτοιον προσανατολισμό που δεν προκαλεί την ενεργοποίησή τους. Αυτό το γεγονός, εμποδίζει τη φαγοκυττάρωση και κατά κάποιο τρόπο «κρύβει» τον μικροοργανισμό από το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή, εμποδίζοντας την περαιτέρω ενεργοποίηση του τελευταίου. Έχει επίσης την ικανότητα σύνδεσης με το Fab τμήμα των αντισωμάτων προξενώντας πολυκλωνική διέγερση, παρόμοια με αυτή των υπεραντιγόνων και οδηγώντας σε απόκριση τύπου Th1 (Fluit and Schmitz, 2003). Πρωτεΐνες που συνδέουν το κολλαγόνο: μια πρωτεΐνη του S. aureus έχει αυτή την ιδιότητα. Η σύνθεσή της κωδικοποιείται σε γονίδιο που εδράζεται σε μεταθετό τμήμα DNA και τα στελέχη αυτά σχετίζονται με εν τω βάθει λοιμώξεις (Fluit and Schmitz, 2003). Σχηματισμός βιομεμβράνης (biofilm): Για τη δημιουργία της βιομεμβράνης είναι απαραίτητη η αρχική προσκόλληση του βακτηρίου σε κάποιο υπόστρωμα και η σύνθεση ακολούθως πολυσακχαριδικής ουσίας μεταξύ των κυττάρων που προάγει την πολυκυττάρια δομή σε στοιβάδες. Οι επιφανειακές πρωτεΐνες του S. aureus είναι υπεύθυνες για την αρχική προσκόλληση και η σύνθεση του πολυσακχαρίτη (PIA) που 29

κωδικοποιείται στο οπερόνιο ica συμβάλλουν από κοινού στη δημιουργία της βιομεμβράνης (Fluit and Schmitz, 2003). 5.2 Ένζυμα Ο S. aureus παράγει και εκκρίνει ένζυμα τα οποία συμβάλλουν στην παθογένεια των λοιμώξεων που προξενεί. Αυτά είναι: καταλάση, πηκτάση, ινωδολυσίνη, υαλουρονιδάση, λιπάσες, πρωτεϊνάσες, νουκλεάσες (Δημητρακόπουλος, 1987; Crossley and Archer, 1997). Έχει επίσης χαρακτηρισθεί μια εξωκυττάρια πρωτεΐνη, γνωστή ως CHIP (Chemotaxis Inhibitory Protein) η οποία αναστέλλει τη δράση του C5a (Fluit and Schmitz, 2003). Πηκτάση Η πηκτάση ή κοαγκουλάση (Coa) παράγεται σχεδόν αποκλειστικά από τον S. aureus (με εξαίρεση λίγα στελέχη του S. intermedius) και γενικά χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό του S. aureus. Η πηκτάση συνδέεται με μια ουσία του αίματος που μοιάζει με την προθρομβίνη και καλείται coagulase reacting factor, σχηματίζοντας ένα σύμπλεγμα, γνωστό ως σταφυλοθρομβίνη, που μπορεί να μετατρέψει το ινωδογόνο σε ινώδες. Η δράση της πηκτάσης διαφέρει από το φυσιολογικό μηχανισμό πήξης του αίματος, επειδή δε χρειάζεται την παρουσία Ca 2+ και δεν αναστέλλεται από την ηπαρίνη. Εκτός από την ελεύθερη πηκτάση, τα περισσότερα στελέχη S. aureus, παράγουν και μια άλλη πηκτάση, που είναι προσκολλημένη στην επιφάνεια των μικροβιακών κυττάρων και καλείται συνδεδεμένη πηκτάση (bound coagulase). Η συνδεδεμένη πηκτάση διαφέρει αντιγονικώς από την ελεύθερη και μετρατρέπει το ινοδογώνο σε ινώδες χωρίς την παρουσία του coagulase reacting factor (Δημητρακόπουλος, 1987). Έχουν ταυτοποιηθεί δύο συνδεδεμένες πηκτάσες, οι ClfΑ και Β. Δομικά μοιάζουν, αλλά συνδέονται σε διαφορετικά σημεία στο ινωδογόνο και προάγουν και την προσκόλληση του βακτηρίου σε προσθετικά υλικά που έχουν επικάλυψη. Ο παράγοντας Α συνδέεται και στα αιμοπετάλια αναστέλλοντας τη συγκόλλησή τους (Fluit and Schmitz, 2003). Σταφυλοκινάση Η σταφυλοκινάση (Sak) είναι δυνητικός ενεργοποιητής του πλασμινογόνου και δυνητικός θρομβολυτικός παράγοντας. Προκαλεί λύση του ινώδους, όμως δεν πρόκειται για πραγματική ινοδωλυσίνη (πλασμίνη), αλλά για ουσία η οποία ενεργοποιεί το πλασμινογόνο και το μετατρέπει σε πλασμίνη, η οποία προκαλεί τη λύση του ινώδους. Η σταφυλοκινάση μπορεί να δεσμευθεί και απευθείας στο 30

πλασμινογόνο, αλλά αυτό το σύμπλεγμα είναι ανενεργό (σε αντίθεση με την στρεπτοκινάση). Το αποτέλεσμα είναι τοπική (όχι συστηματική) θρόμβωση (Δημητρακόπουλος, 1987). Πρωτεάσες Οι πρωτεάσες πιστεύεται ότι παίζουν ρόλο στην κατάλυση της αντίστασης του ξενιστή, με την αποδόμηση των πρωτεϊνών του, στη διεισδυτική του ικανότητα, με την αποδόμηση των συστατικών του στρώματος (matrix) και στη διατροφή του κυττάρου, με την παραγωγή αμινοξέων από την αποδόμηση των πρωτεϊνών. 5.3 Τοξίνες του S. aureus O S. aureus παράγει μεγάλη ποικιλία τοξινών, που είναι υπεύθυνες για πολλές διαταραχές που προκαλεί στον άνθρωπο. Αυτές είναι οι αιμολυσίνες α, β, γ, δ και οι λευκοκτονίνες, η οικογένεια των υπεραντιγόνων, που περιλαμβάνει την τοξίνη του συνδρόμου τοξικής καταπληξίας (Toxic Shock Syndrome-1, TSST-1), τις εντεροτοξίνες (SEA-E και SEG-O) και τις επιδερμολυτικές τοξίνες (ETA, B, C, D). Στην παρούσα εργασία, ασχοληθήκαμε με τη λευκοκτονίνη Panton-Valentine (PVL), την TSST-1, τις εντεροτοξίνες SEG-O και τις επιδερμολυτικές ΕΤΑ και ΕΤΒ. Αιμολυσίνες: πρόκειται για κυτταροτοξίνες που διακρίνονται σε τέσσερεις τάξεις: άλφα, βήτα, γάμα και δέλτα τοξίνες. Η α-αιμολυσίνη (α-τοξίνη) παράγεται από τα περισσότερα στελέχη S. aureus, λύει τα ερυθρά αιμοσφαίρια του κουνελιού και έχει δερμονεκρωτική και νευροτοξική δράση. Κωδικοποιείται από το γονίδιο hla του χρωμοσώματος και στην επιφάνεια του κυττάρου-στόχου με τη μορφή επταμερών σχηματίζει πόρους που επιτρέπουν την απώλεια Κ + και μικρομοριακών ουσιών και την είσοδο Νa + και Ca 2+, με αποτέλεσμα τη λύση του κυττάρου (Δημητρακόπουλος, 1987; Dinges, 2000; Kaneko and Kamio, 2004). Η β-αιμολυσίνη (β-τοξίνη ή σφιγγομυελινάση) παράγεται επίσης από πολλά στελέχη S. aureus, ιδίως αυτά που απομονώνονται από ζώα, και κωδικοποιείται από το γονίδιο hlb του χρωμοσώματος. Έχει δράση φωσφορυλάσης C, και επομένως εμφανίζει ειδικότητα για τη σφιγγομυελίνη και φωσφατιδυλοχολίνη. Έτσι, είναι πολύ τοξική για τα ερυθρά προβάτου. Η δράση της β-αιμολυσίνης χρησιμοποιείται στη δοκιμασία CAMP για την ταυτοποίηση των Στρεπτοκόκκων ομάδας Β (ενίσχυση της αιμόλυσης σε αιματούχο άγαρ αν εμβολιασθούν κάθετα, χωρίς επαφή μεταξύ των 31

στελεχών S. aureus και Streptococcus ομάδας B) (Δημητρακόπουλος, 1987; Dinges, 2000; Kaneko and Kamio, 2004). Η γ-αιμολυσίνη παράγεται όπως και η α- από την πλειονότητα των στελεχών S. aureus. Ανήκει σε μια κοινή ομάδα τοξινών μαζί με τις λευκοκτονίνες, τις τοξίνες που αποτελούνται από δυο υπομονάδες, την S (Slow-eluting) και F (Fast-eluting). Τα γονίδια που κωδικοποιούν τη σύνθεση της τοξίνης βρίσκονται στο χρωμόσωμα στο γενετικό τόπο hlg. Η υπομονάδα S κωδικοποιείται από δύο γονίδια (hlga και hlgc), με αποτέλεσμα τη σύνθεση δύο διαφορετικών υπομονάδων, που συνδυάζονται με μια υπομονάδα F (γονίδιο hlgb) (Dinges, 2000; Menestrina et al, 2001; Gouaux, 1998). Ο συνδυασμός αυτών των μορίων γίνεται στην επιφάνεια του κυττάρου-στόχου, όπου πρώτα συνδέεται το μόριο S, φωσφορυλιώνεται και ακολουθεί το μόριο F. Ο πολυμερισμός των μορίων σε αναλογίες 4:4 ή 3:4 ή 4:3 οδηγεί στο σχηματισμό πόρων και λύση του κυττάρου. Η ύπαρξη δύο μορίων για την υπομονάδα S έχει ως συνέπεια τη σύνθεση δυο τοξινών με τους συνδυασμούς HlgA/HlgB και HlgC/HlgB, με διαφορετική ειδικότητα ως προς τα κύτταρα-στόχος. Η γ-αιμολυσίνη μπορεί να καταστρέψει λευκοκύτταρα και ερυθρά αιμοσφαίρια διαφόρων θηλαστικών (Menestrina et al, 2001). Η δ-αιμολυσίνη (δ-τοξίνη, δ-λυσίνη) συντίθεται επίσης από το 97% των στελεχών S. aureus και από το 50-70% των πηκτάση-αρνητικών σταφυλοκόκκων (CNS). Κωδικοποιείται από το γονίδιο hld και λύει ερυθρά και άλλα κύτταρα, καθώς και πρωτοπλάστες και σφαιροπλάστες. Έχει παρατηρηθεί και δερμονεκρωτική δράση, όμως παραμένει αδιευκρίνιστος ο ρόλος της στην παθογένεια των σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων. Η ταχεία δράση της στην κυτταροπλασματική μεμβράνη οδηγεί στο συμπέρασμα ότι έχει δράση απορρυπαντικού (Dinges, 2000). Λευκοκτονίνες: στην ομάδα αυτή ανήκουν η Panton-Valentine (PVL, γονίδια luks-pv και lukf-pv), η LukE/D (γονίδια lukε και lukd) και η lukm/f -PV like (γονίδια lukμ και lukf ) με δομή ίδια με εκείνη της γ-αιμολυσίνης, αποτελούμενες από δύο υπομονάδες, μια luks και μια lukf υπομονάδα (Dinges, 2000; Menestrina et al, 2001). Τα γονίδιά τους έχουν βρεθεί στο χρωμόσωμα, ενώ της PVL και σε υπολοιμογόνο βακτηριοφάγο, υποδηλώνοντας τη δυνατότητα οριζόντιας διασποράς. Οι υπομονάδες έχουν τοξική δράση μόνο ως διμερή, ενώ μεμονωμένες είναι ανενεργείς (Crossley and Archer, 1997). Επιπλέον, τα συγκεκριμένα γονίδια έχουν μεγάλη ομολογία βάσεων μεταξύ τους καθώς και με τα γονίδια της γ-αιμολυσίνης. Πολλοί ερευνητές πιστεύουν ότι προέρχονται από ένα αρχικό κοινό γονίδιο που με 32

διπλασιασμούς και μεταλλάξεις οδηγήθηκε σε αυτή τη γενετική ποικιλομορφία (Dinges, 2000; Menestrina et al, 2001; Gouaux, 1998). Οι λευκοκτονίνες σχηματίζουν οκταμερή (αναλογία υπομονάδων 4:4) στην επιφάνεια των μονοκυττάρων, μακροφάγων και πολυμορφοπυρήνων, με αποτέλεσμα τη λύση των κυττάρων (Menestrina et al, 2001). Οι τοξίνες Luk δρουν και σε ερυθρά αιμοσφαίρια. Ισχυρό πλεονέκτημα των στελεχών S. aureus που κωδικοποιούν στο γονιδίωμά τους τις λευκοκτονίνες και την γ-αιμολυσίνη είναι ότι μπορούν τελικά να συνθέσουν τοξίνεςυβρίδια (π.χ. η S υπομονάδα από το γονίδιο hlga και η F από το lukf-pv), με αποτέλεσμα να προκύπτουν τοξίνες με ευρύτερο φάσμα κυττάρων-στόχων και τελική ενίσχυση της λοιμογόνου ικανότητας του στελέχους (Menestrina et al, 2001; Gouaux, 1998; Morinaga et al, 2003; Von Eiff et al, 2004). Τα στελέχη S. aureus που συνθέτουν λευκοκτονίνες έχουν απομονωθεί με συνεχώς αυξανόμενη συχνότητα από λοιμώξεις των μαλακών μορίων, νεκρωτική πνευμονία και σπανιότερα από εν τω βάθει λοιμώξεις (Πίνακας 1) (Chini et al, 2006; Von Eiff et al, 2004). Η ικανότητα των προαναφερθέντων τοξινών να σχηματίζουν πόρους αποτελεί σημαντικό στοιχείο στην παθογένεια των σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων. Η λύση των κυττάρων-στόχων που είναι το αποτέλεσμα της δράσης των τοξινών, απελευθερώνει μεγάλα ποσά μορίων που προάγουν τη φλεγμονή και ουσίες που είναι απαραίτητες για τον πολλαπλασιασμό των μικροβίων, ενώ συγχρόνως δημιουργεί και κύτταραφαντάσματα που αποπροσανατολίζουν το ανοσοποιητικό σύστημα. Η PVL είναι τοξική για τα πολυμορφοπύρηνα λευκοκύτταρα και μονοκύτταρα και τα μακροφάγα, αλλά δεν έχει αιμολυτική δράση (σε αντίθεση με τη γ-αιμολυσίνη). Είναι ικανή να επάγει την έκκριση κοκκίων στα πολυμορφοπύρηνα και την απελευθέρωση φλεγμονωδών παραγόντων (λευκοτριένη Β4 και ιντερλευκίνη 8). Επίσης, η PVL σχετίζεται με δερματικές λοιμώξεις και οξεία νεκρωτική πνευμονία, κυρίως σε μικρά παιδιά. Ο μηχανισμός δράσης της είναι ο εξής. Αρχικά προσκολλάται στην κυτταρική μεμβράνη η S υπομονάδα (που είναι και η μεγαλύτερη). Η προσκόλληση της S αποτελεί προϋπόθεση για τη δέσμευση της μικρότερης υπομονάδας F. Όταν έχουν δεσμευθεί και οι δυο υπομονάδες αυξάνεται η διαπερατότητα της μεμβράνης, με αποτέλεσμα είσοδο ιόντων. Οι τοξίνες, πιθανώς, δεσμεύονται στην φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη. Η διέγερση της αντλίας ιόντων προκαλεί ενεργοποίηση των ουδετερόφιλων και λεμφοκυττάρων. Επίσης, η PVL έχει αναφερθεί ότι επάγει την παραγωγή της λευκοτριένης Β4, με αποτέλεσμα να εμποδίζει τη σωστή λειτουργία 33

των ουδετερόφιλων και να προκαλεί αύξηση της συγκέντρωσης νατρίου και οίδημα στην περιοχή της λοίμωξης (Crossley and Archer, 1997). Πίνακας 1. Τοξίνες που συνθέτει ο S. aureus και συσχετισμός με κλινικά σύνδρομα. Λοιμώξεις Πυοδερματίτιδα Θυλακίτιδα Δοθιήνας Πνευμονία Ψευδάνθρακας Κριθή Παρονυχία Οστεομυελίτιδα Μικροβιακή αρθρίτιδα Σύνδρομο τοξικής καταπληξίας Τοξίνες +/- PVL, Luk +/- PVL, Luk +/- PVL, Luk +/- PVL, Luk +/- PVL, Luk +/- PVL, Luk +/-PVL, Luk -/+ PVL, Luk -/+ PVL, Luk TSST-1, ETs, SEs Τροφική δηλητηρίαση SEs Επιδερμολυτική νόσος ETs Μολυσματικό κηρίο ETs, PVL, Luk Μηνιγγίτιδα - Ενδοκαρδίτιδα - Βακτηριαιμία - Εντεροκολίτιδα - Επιδερμολυτικές τοξίνες: πλήρως χαρακτηρισμένες είναι δύο, η Α και η Β (ΕΤΑ, ΕΤΒ) κωδικοποιούμενες από τα αντίστοιχα γονίδια (χρωμοσωμικό eta, πλασμιδιακό etb) (Dinges, 2000). Πρόσφατα ανιχνεύθηκαν δύο ακόμη επιδερμολυτικές τοξίνες, οι ETC και ETD, σε στελέχη S. aureus που σχετίζονταν με επιδερμολυτική νόσο αλλά και με επιμολύνσεις τραυμάτων (Ladhani, 2003). Οι επιδερμολυτικές τοξίνες είναι το αίτιο της επιδερμολυτικής νόσου (Staphylococcal 34