IN VITRO ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙ ΡΑΣΗΣ ΤΗΣ QUERCETIN ΣΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΗΣ ΟΞΕΙΑΣ ΜΥΕΛΟΓΕΝΟΥΣ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑΣ. ΙΩΑΝΝΑ Γ. ΚΥΡΙΑΚΟΠΟΥΛΟΥ ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΣ BSc, MSc

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ Β ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Μ. ΡΑΠΤΟΠΟΥΛΟΥ ΓΙΓΗ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ 2007-2008 Αριθµ. ιατριβής 2618 IN VITRO ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙ ΡΑΣΗΣ ΤΗΣ QUERCETIN ΣΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΗΣ ΟΞΕΙΑΣ ΜΥΕΛΟΓΕΝΟΥΣ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑΣ ΙΩΑΝΝΑ Γ. ΚΥΡΙΑΚΟΠΟΥΛΟΥ ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΣ BSc, MSc Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2008 1

2

Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΙΩΑΝΝΙ ΟΥ ΕΛΙΣΑΒΕΤ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΚΛΩΝΙΖΑΚΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΧΑΡΑΛΑΜΠΙ ΟΥ- ΒΡΑΝΙΤΣΑ ΣΤΥΛΙΑΝΗ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ H ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΙΩΑΝΝΙ ΟΥ ΕΛΙΣΑΒΕΤ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΚΛΩΝΙΖΑΚΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΧΑΡΑΛΑΜΠΙ ΟΥ-ΒΡΑΝΙΤΣΑ ΣΤΥΛΙΑΝΗ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΟΡΦΑΝΟΥ-ΚΟΥΜΕΡΚΕΡΙ ΟΥ ΕΛΕΝΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΚΥΡΙΑΖΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΑΡΥΠΙ ΟΥ-ΒΡΑΤΣΚΙ ΟΥ ΒΑΣΙΛΕΙΑ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΒΑΚΑΛΟΠΟΥΛΟΥ ΣΟΦΙΑ, ΕΠΙΚΟΥΡΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ «Η έγκρισις της ιδακτορικής ιατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλοί αποδοχήν των γνωµών του συγγραφέως» (Νόµος 5343/32, αρθρ. 202 2 και ν.1268/82, αρθρ. 50 8) 3

4

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕ ΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ Β. ΝΤΟΜΠΡΟΣ ΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ ΤΟΥ ΤΟΜΕΑ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΜΑΡΙΑ ΡΑΠΤΟΠΟΥΛΟΥ - ΓΙΓΗ 5

6

Στους γονείς µου Στον αδελφό µου 7

8

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΚΥΡΙΟΤΕΡΕΣ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ 13 ΠΡΟΛΟΓΟΣ.. 17 ΜΕΡΟΣ ΠΡΩΤΟ ΓΕΝΙΚΟ 21 1. Αιµοποίηση 23 1.1. Φυσιολογική αιµοποίηση..23 1.2. Λευχαιµική αιµοποίηση 26 1.2.1. Η ιδέα του λευχαιµικού stem cell (LSC) 28 2. Οξεία Μυελογενής Λευχαιµία (ΟΜΛ) 29 2.1. Ιστορικά στοιχεία.. 29 2.2. Επιδηµιολογία της ΟΜΛ... 30 2.3. Aιτιολογικοί παράγοντες της ΟΜΛ.. 31 2.4. ΟΜΛ και ηλικιωµένοι 32 2.5. Προγνωστικοί παράγοντες της ΟΜΛ.. 33 2.5.1. Ηλικία.33 2.5.2. Κατάσταση ικανότητας.. 33 2.5.3. Προηγούµενες αιµατολογικές διαταραχές.33 2.5.4. Ανεπάρκεια οργάνων ή οργανικών συστηµάτων 34 2.5.5. ΟΜΛ µετά από θεραπεία 34 2.5.6. Έκφραση δεικτών πολυφαρµακευτικής ανθεκτικότητας 35 2.5.7. Καρυοτυπικές ανωµαλίες 35 2.6. Ταξινόµηση της ΟΜΛ..38 2.6.1. Ταξινόµηση κατά FAB..38 2.6.2. Ταξινόµηση κατά ΠΟΥ..43 2.7. Εργαστηριακός έλεγχος της ΟΜΛ 44 2.7.1. Εργαστηριακά ευρήµατα της ΟΜΛ 45 2.7.2. Μορφολογία της ΟΜΛ.. 45 2.7.3. Κυτταροχηµικές χρώσεις 46 2.7.4. Κυτταρογενετική (χρωµοσωµατική) µελέτη..47 2.8. Ανοσοφαινότυπος στη διάγνωση της ΟΜΛ..47 2.8.1. Αρχή Μεθόδου 48 2.8.2. ιάκριση της ΟΜΛ.48 2.8.3. Κατάταξη υποτύπων ΟΜΛ.49 2.9. Θεραπεία της ΟΜΛ 49 2.9.1.Θεραπεία Οξείας Μυελοβλαστικής Λευχαιµίας πλήν της ΟΠΛ.50 2.9.2. Θεραπεία Οξείας Προµυελοκυτταρικής Λευχαιµίας (ΟΠΛ). 53 2.10. Νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις 55 2.11. Ερευνητική θεραπεία.. 56 2.11.1. Αναστολείς της P-γλυκοπρωτεΐνης..56 9

2.11.2. Gemtuzumab ozogamicin.56 2.11.3. Αναστολείς της Φαρνεσυλτρανσφεράσης (FTI)...57 2.11.4. Αναστολείς της κινάσης της τυροσίνης 57 2.11.5. Αναστολείς της µεταγωγής σήµατος 58 2.11.6 Άλλοι παράγοντες..58 2.12. Μεταµόσχευση µυελού των οστών.58 3. Απόπτωση 60 3.1. Ιστορικά στοιχεία...60 3.2. Χαρακτηριστικά της απόπτωσης...61 3.3. Η απόπτωση σε αντίθεση µε τη νέκρωση.63 3.4. Ο ρόλος των µεταβολών της µεµβράνης στην αναγνώριση των αποπτωτικών κυττάρων.64 3.5. Ρύθµιση της απόπτωσης 65 3.6. Απόπτωση και κασπάσες...65 3.7. Απόπτωση και καρκίνος 67 4. Πρωτεϊνικοί αναστολείς της απόπτωσης (inhibitor of apoptosis proteins IAPs) 68 5. Survivin... 68 5.1. Μοριακή οργάνωση, δοµή και λειτουργία της survivin 68 5.2. Ισοµορφές της survivin..70 5.3. O ρόλος της survivin στα φυσιολογικά κύτταρα...76 5.3.1. Ο ρόλος της survivin στη µίτωση και στην κυτταρική διαίρεση76 5.3.2. Ο ρόλος της survivin στην απόπτωση.77 5.4. Ρύθµιση της survivin..79 5.5. Έκφραση της survivin στους φυσιολογικούς ιστούς.81 5.6. Έκφραση της survivin στους ανθρώπινους όγκους...82 5.7. Η survivin στη θεραπεία του καρκίνου..84 6. Φλαβονοειδή- quercetin..87 6.1. Βιολογικές ιδιότητες..88 6.2. Βιοχηµεία...88 6.3. Βιοσύνθεση....89 6.4. ιαθεσιµότητα 89 6.5. Μεταβολισµός....90 6.6. Aπορρόφηση και φαρµακοκινητική της quercetin 91 6.7. Ασφάλεια της quercetin.92 6.8. Kυριότεροι µοριακοί µηχανισµοί δράσης της quercetin 93 6.8.1. Ελάττωση της έκφρασης της µεταλλαγµένης p53 πρωτεΐνης 93 6.8.2. ιακοπή στο στάδιο G1 του κυτταρικού κύκλου 93 6.8.3. Αναστολή της τυροσινικής κινάσης 94 10

6.8.4. Ικανότητα να συνδέεται µε υποδοχείς οιστρογόνων... 94 6.8.5. Αναστολή των πρωτεϊνών θερµικής καταπληξίας.. 95 6.8.6. Αναστολή της έκφρασης των Ras πρωτεϊνών.95 6.8.7. Αναστολή του πρωτεασώµατος..96 6.9. In vitro µελέτες µε quercetin..96 6.10. In vivo µελέτες µε quercetin.97 6.11. Κλινικά συµπεράσµατα 98 6.11.1 Επίδραση της quercetin στην αύξηση του όγκου...98 6.11.2 Αντιπολλαπλασιαστική δράση της quercetin ως αναστολέας πρωτεϊνικής κινάσης. 98 6.11.3. Αντινεοπλασµατική δράση της quercetin. 99 6.11.3.1 Ως αναστολέας της µεταφοράς γαλακτικού οξέος..99 6.11.3.2 Ως αναστολέας της καλµοδουλίνης...99 6.12. Χρήση της quercetin ταυτόχρονα µε standard ογκολογικές θεραπευτικές.99 6.12.1. Ραδιοθεραπεία/ Ακτινοθεραπεία...99 6.12.2. Χηµειοθεραπεία 99 6.13. Μελλοντικές ερευνητικές κατευθύνσεις 100 ΜΕΡΟΣ ΕΥΤΕΡΟ ΕΙ ΙΚΟ 101 Ι. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ. 103 1. Ασθενείς της µελέτης..103 2. Ερευνητικό πρωτόκολλο.104 3. Βασικές αρχές της κυτταροµετρίας ροής 105 3.1. Αρχές λειτουργίας ενός κυτταροµετρητή ροής 105 3.1.1. Υδροδυναµικό σύστηµα ροής...105 3.1.2. Οπτικό σύστηµα....105 3.1.3. Ηλεκτρονικό σύστηµα ανάλυσης δεδοµένων...106 3.2. Εργαστηριακή ανάλυση δείγµατος..106 3.3. Παράµετροι του κυτταροµετρητή ροής...107 4. Τυποποίηση οξείας λευχαιµίας...107 5. Κυτταροµετρία ροής έναντι ανοσοφθορισµού 108 6. Κυτταροµετρία ροής έναντι µοριακών τεχνικών 108 7.YΛΙΚΑ....109 7.1. Χηµικά αντιδραστήρια- Quercetin..109 7.2. Παρασκευή πλήρους θρεπτικού υλικού...109 7.3. Υλικό για ηµίρρευστες καλλιέργειες...110 8. ΜΕΘΟ ΟΙ.111 8.1. Προετοιµασία δείγµατος ολικού αίµατος- Γενική Αίµατος.111 11

8.2. Μελέτη ανοσοφαινότυπου βλαστών περιφερικού αίµατος.112 8.2.1. Μεµβρανική σήµανση...112 8.2.2. Eνδοκυττάρια και µεµβρανική σήµανση..113 8.2.3. Ανάλυση µε κυτταροµετρία ροής.115 8.3. Κυτταροκαλλιέργειες µυελού των οστών...117 8.3.1. Αποµόνωση των λευχαιµικών κυττάρων..117 8.3.2. Καλλιέργειες λευχαιµικών κυττάρων µε και χωρίς την επίδραση quercetin.. 117 8.4. Μέτρηση της βιωσιµότητας των κυττάρων.119 8.5. Μέτρηση της συγκέντρωσης των κυττάρων 119 8.6. Μελέτη της απόπτωσης 119 8.6.1. Μορφολογική εκτίµηση της απόπτωσης...119 8.6.2. Μέτρηση της απόπτωσης µε Annexin V...119 8.7. Μελέτη της έκφρασης της survivin..122 8.8. Ηµίρρευστες καλλιέργειες...123 8.8.1. Προετοιµασία των ηµίρρευστων καλλιεργειών 125 8.8.2. Ανάλυση αποικιών 126 9. Στατιστική µεθοδολογία...128 II. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ.129 1. Επίδραση της quercetin στη βιωσιµότητα των ΟΜΛ κυττάρων 129 2. Επίδραση της quercetin στη συγκέντρωση των ΟΜΛ κυττάρων...134 3. Επίδραση της quercetin στην απόπτωση των ΟΜΛ κυττάρων. 139 3.1. Μορφολογική εκτίµηση της απόπτωσης 139 3.2. Μέτρηση της απόπτωσης µε Αnnexin V...139 4. Έκφραση της survivin στα ΟΜΛ κύτταρα, πρίν και µετά την επίδραση quercetin.143 5. Συσχέτιση µεταξύ των αποτελεσµάτων της απόπτωσης και της έκφρασης της survivin....148 6. Επίδραση της quercetin στην ανάπτυξη αποικιών.149 III. ΣΥΖΗΤΗΣΗ...152 IV. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ...167 V. ΠΕΡΙΛΗΨΗ..168 VI. SUMMARY. 170 ΛΕΞΙΛΟΓΙΟ.. 172 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...176 12

ΚΥΡΙΟΤΕΡΕΣ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ AIF Apoptosis Inducing Factor AML Acute Myeloid Leukemia AMLCG Acute Myeloid Leukemia Cooperative Group ANAE α- naphthyl acetate esterase AP-1 Activator Protein-1 Apaf-1 Apoptotic Protease Activating Factor-1 API4 Apoptosis Inhibitor 4 APML Acute ProMyelocytic Leukemia ATP Adenosine Triphosphate ATRA All-Trans Retinoic Acid AU Arbitrary Units BAX Bcl-2-associated X protein BCRP Breast Cancer Resistance Protein bfgf Basic Fibroblast Growth Factor BFU Burst Forming Unit BIR Baculoviral IAP Repeat BIRC5 Baculoviral IAP Repeat Containing Protein 5 BSA Bovine Serum Albumin CALGB Cancer and Leukemia Group B CD Cluster of Differentiation Cdc2 Cell Division Cycle 2 CDK Cyclin Dependent Kinase cdna Complementary DNA CFU-E Colony Forming Unit - Erythroid CFU-G Colony Forming Unit- Granulocyte CFU-GM Colony Forming Unit- Granulocyte, Macrophage CFU-M Colony Forming Unit- Macrophage ciap1 cellular Inhibitor of Apoptosis 1 ciap2 cellular Inhibitor of Apoptosis 2 CLP Common Lymphoid Progenitor CMP Common Myeloid Progenitor COX-2 Cyclooxygenase-2 CSF Colony Stimulating Factor DMBA Dimethylbenzanthracene DNA Deoxyribonucleic Acid Π εν πραγµατοποιήθηκε ΕCD Texas Red - X EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 13

EGFR Epidermal Growth Factor Receptor EGIL European Group for the Immunological Characterization of Leukemias EndoG Endonuclease G EORTC European Organization for the Research and Treatment of Cancer ER Estrogen Receptor ER I type I estrogen receptor ER II type II estrogen receptor ERK Extracellular signal-regulated Kinase EST Expressed Sequence Tags FAB French-American-British FAS-L Fas ligand FBS Fetal Bovine Serum FCS Fetal Calf Serum FDA Food and Drug Administration FITC Fluorescein Isothiocyanate FLT3 FMS-like tyrosine kinase 3 FS Forward Scatter FT Farnesyltransferase FTI Farnesyltransferase Inhibitor G-CSF Granulocyte - Colony Stimulation Factor GM-CSF Granulocyte Monocyte- Colony Stimulation Factor GMP Myelomonocytic Progenitor GO Gemtuzumab Ozogamicin GVHD Graft Versus Host Disease Hb Heamoglobin HBXIP Hepatitis B X-Interacting Protein HLA Human Leukocyte Antigen HPV Human Papilloma Virus HS Horse Serum HSC Haematopoietic Stem Cell HSILs High-grade Squamous Intraepithelial Lesions Hsp Heat shock protein Ht Heamatocrit HTERT Human Telomerase Reverse Transcriptase IAP Inhibitor of Apoptosis Protein IARC International Agency for Research on Cancer IC Inhibitory Concentration IL Interleukin 14

ΙΝCENP Kb KDa LF LOX LRP LSC LSILs LTBMC LT-HSC mab Μ Σ MDR MEP ΜΕΦ MLIAP ΜPO MPP MRC mrna MRP ΜΤ NAIP NF-κΒ NK NOD/SCID ΟΛΛ ΟΜΛ ΟΠΛ ΟRF ΠΟΥ ΠΥ PAS PBS PCR PE Pgp PI PI3k PKC inner centromere protein kilobase Kilo Dalton Lactoferin Lipooxygenase Lung Resistance-related Protein Leukemic Stem Cell Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions Long Term Bone Marrow Culture Long-term Haematopoietic Stem Cell Monoclonal Antibody Μυελοδυσπλαστικό Σύνδροµο Multidrug Resistance Megakaryotic Erythroid Progenitor Μέση Ένταση Φθορισµού Melanoma Inhibitor of Apoptosis Protein Myeloperoxidase Multipotent Progenitor Medical Research Council Messenger RNA Multidrug Resistant Protein Μέση Τιµή Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein Nuclear factor-kappa B Natural Killer Nonobese Diabetic/ Severe Combined Immunodeficient Oξεία Λεµφοβλαστική Λευχαιµία Οξεία Μυελογενής Λευχαιµία Οξεία Προµυελοκυτταρική Λευχαιµία Open Reading Frame Παγκόσµιος Οργανισµός Υγείας Πλήρης Ύφεση Periodic Acid Schiff Phosphate Buffered Saline Polymerase Chain Reaction Phycoerythrin P-glycoprotein Propidium Iodide Phosphatidylinositide 3-kinase Protein Kinase C 15

PLT Platelets PML Promyelocytic Leukemia PML-RARa Promyelocytic Leukemia Retinoic Acid Receptor α Q Quercetin RBC Red Blood Cells rh Recombinant human RNA Ribonucleic Acid RNAi RNA interference SD Standard Deviation SE Standard Error SS Side Scatter STAT Signal Transducer and Activator of Transcription ST-HSC Short-term Haematopoietic Stem Cell SWOG Southwest Oncology Group Τhr Threonine TNF Tumor Necrosis Factor VEGF Vascular Endothelial Growth Factor WBC White Blood Cells WHO World Health Organization XIAP X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein ΧΜΛ Χρόνια Μυελογενής Λευχαιµία 16

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η Οξεία Μυελογενής Λευχαιµία (ΟΜΛ) αντιπροσωπεύει ποσοστό περίπου 90% των οξειών λευχαιµιών στους ενήλικες και προσβάλλει περισσότερο άτοµα ηλικίας άνω των 60 ετών. Καθώς είναι µια ταχέως εξελισσόµενη νόσος, µε θανατηφόρες επιπλοκές χωρίς θεραπεία, η επιβίωση του ασθενούς δεν ξεπερνά συνήθως τις λίγες εβδοµάδες. Για το λόγο αυτό είναι απαραίτητη η ταχεία διάγνωση, ταξινόµηση και έναρξη της ανάλογης θεραπείας. Η εντατική χηµειοθεραπεία και η µεταµόσχευση των αρχέγονων αιµοποιητικών κυττάρων έχουν βελτιώσει την πρόγνωση της ΟΜΛ στους νέους και στους µέσης ηλικίας ασθενείς, αλλά ελάχιστα ωφέλησαν τους ηλικιωµένους. Οι θεραπείες αυτές είναι ιδιαίτερα τοξικές µε αποτέλεσµα να µην είναι ανεκτές από τους ηλικιωµένους ασθενείς, οι οποίοι συχνά εµφανίζουν και άλλα προβλήµατα υγείας που περιπλέκουν περισσότερο την κατάστασή τους. Επίσης, οι ηλικιωµένοι ασθενείς µε ΟΜΛ εµφανίζουν εξαρχής µεγαλύτερη αντίσταση στη χηµειοθεραπεία, σε σχέση µε τους νέους. Όλα αυτά έχουν ως συνέπεια, οι ασθενείς ηλικίας άνω των 60 ετών να έχουν απογοητευτική απάντηση στην «κλασική θεραπεία» που εφαρµόζεται σήµερα. Είναι λοιπόν απαραίτητο να βρεθούν νέες επιπρόσθετες θεραπευτικές προσεγγίσεις, πολύ πιο αποτελεσµατικές και µε λιγότερες παρενέργειες από τη συµβατική χηµειοθεραπεία, που θα υπερπηδούν δυσµενείς προγνωστικούς παράγοντες και θα οδηγούν µε ασφάλεια στην ύφεση της ΟΜΛ στους ηλικιωµένους ασθενείς. Τα τελευταία χρόνια το ενδιαφέρον των ερευνητών έχει επικεντρωθεί στη δράση παραγόντων που περιέχονται στη διατροφή και συντελούν στην πρόληψη ασθενειών όπως ο καρκίνος. Σ αυτήν την τάξη των στοιχείων ανήκει η quercetin (3, 3', 4', 5, 7- πεντοϋδροξυφλαβόνη), το κυριότερο φλαβονοειδές στη διατροφή µας και πολλές από τις δράσεις της την καθιστούν ως έναν πιθανό αντικαρκινικό παράγοντα. Στην επιτυχηµένη κυτταροτοξική θεραπεία διαφόρων τύπων καρκίνου συµπεριλαµβανοµένης και της ΟΜΛ συνεισφέρει η απόπτωση. Μεταξύ των ρυθµιστών της απόπτωσης, το ενδιαφέρον έχει επικεντρωθεί στην πρόσφατα ανακαλυφθείσα πρωτεΐνη survivin η οποία ανήκει στην οικογένεια των πρωτεϊνικών αναστολέων της απόπτωσης. Σκοπός της παρούσας µελέτης ήταν να ερευνηθεί, η in vitro επίδραση της quercetin στην απόπτωση των λευχαιµικών κυττάρων των ηλικιωµένων ασθενών µε ΟΜΛ, χωρίς προηγούµενη θεραπεία, 17

καθώς επίσης και η έκφραση της αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης survivin από τα ίδια κύτταρα. Η µελέτη περιλαµβάνει δύο µέρη, το γενικό και το ειδικό. Στο γενικό, πρώτο µέρος, γίνεται περιγραφή της φυσιολογικής και λευχαιµικής αιµοποίησης και µια ανασκόπηση της ΟΜΛ. Ακολουθεί ο ρόλος της απόπτωσης στον καρκίνο και οι πρωτεϊνικοί αναστολείς της απόπτωσης όπου αναφέρεται η σύγχρονη βιβλιογραφία της survivin. Τέλος, γίνεται ανασκόπηση της βιβλιογραφίας σχετικά µε την quercetin. Στο ειδικό, δεύτερο µέρος, αρχικά περιγράφονται το υλικό και η µεθοδολογία της µελέτης, ενώ στη συνέχεια αναλύονται και συγκρίνονται τα αποτελέσµατα. Ακολουθούν η συζήτηση των αποτελεσµάτων και η συσχέτισή τους µε τα έως σήµερα δεδοµένα της βιβλιογραφίας, τα κύρια συµπεράσµατα και η περίληψη στην ελληνική και αγγλική γλώσσα. Τέλος ένα σύντοµο λεξιλόγιο επιβοηθητικό των όρων της εργασίας, καθώς και η βιβλιογραφία που χρησιµοποιήθηκε. Το ερευνητικό µέρος της µελέτης αυτής εκπονήθηκε εξ ολοκλήρου στη Β Παθολογική Κλινική του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, στο Εργαστήριο Αιµατολογίας και στο Εργαστήριο Κλινικής Ανοσολογίας. Στο σηµείο αυτό αισθάνοµαι την ανάγκη να εκφράσω τη βαθιά µου ευγνωµοσύνη στην επιβλέπουσα της παρούσας διατριβής, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Παθολογίας-Αιµατολογίας κ. Ελισσάβετ Ιωαννίδου-Παπαγιαννάκη, για την όλη ιδέα, σχεδιασµό και ανάθεση αυτής της διατριβής. Την ευχαριστώ πολύ, για τη συνεχή επίβλεψη, καθοδήγηση και αµέριστη συµπαράσταση που µου προσέφερε σε όλα τα στάδια της εκπόνησης και της συγγραφής της διδακτορικής διατριβής. Ευχαριστώ ιδιαίτερα τον Καθηγητή Παθολογίας-Αιµατολογίας κ. Ιωάννη Κλωνιζάκη, ιευθυντή του Αιµατολογικού Εργαστηρίου της Β Παθολογικής Κλινικής για τη µεθοδική επίβλεψη, την αµέριστη συµπαράστασή του και τη δυνατότητα που µου έδωσε να χρησιµοποιήσω τον εξοπλισµό και την υποδοµή του Αιµατολογικού Εργαστηρίου. Ευχαριστώ θερµά την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Παθολογίας- Αιµατολογίας, κ. Στυλιανή Χαραλαµπίδου-Βρανίτσα, για τις σηµαντικές υποδείξεις, συµβουλές της καθώς και τη συνεχή εµψύχωση και συµπαράστασή της. Ευχαριστώ πολύ την Καθηγήτρια κ. Παναγιώτα Μπούρα, υπεύθυνη του εργαστηρίου Κλινικής Ανοσολογίας της Β Παθολογικής 18

Κλινικής, για την εµπιστοσύνη που µου έδειξε ώστε να εργασθώ στο εργαστήριο Κλινικής Ανοσολογίας. Ευχαριστώ επίσης όλα τα µέλη του εργαστηρίου της Κλινικής Ανοσολογίας για την άψογη συνεργασία τους. Θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες µου στην Καθηγήτρια κ. Μαρία Ραπτοπούλου- Γιγή, ιευθύντρια της Β Παθολογικής Κλινικής του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, για τη συνεχή και αποτελεσµατική υποστήριξή της όλα αυτά τα χρόνια. Ευχαριστώ τον οµότιµο Καθηγητή Αιµατολογίας κ. Ζαχαρία Σινάκο, ο οποίος µας δώρισε την quercetin και µας εµπιστεύτηκε τη µελέτη της καθώς και τον οµότιµο Καθηγητή Καρδιολογίας κ. Νικόλαο Λευκό, ο οποίος µε ενθάρρυνε να αναλάβω την εκπόνηση διδακτορικής διατριβής. Πολλές ευχαριστίες οφείλω στην Επίκουρη Καθηγήτρια Αιµατολογίας, κ. Ευδοκία Μανδαλά, η οποία βοήθησε σηµαντικά στη συλλογή υλικού της µελέτης. Επίσης ευχαριστώ θερµά την Επιµελήτρια Α Ε.Σ.Υ. κ. Ευθυµία Βλαχάκη και τον ειδικευόµενο ιατρό στην Αιµατολογία κ. Στέφανο ηµούδη, για τη βοήθειά τους στη συλλογή του υλικού της µελέτης. Θα ήταν παράλειψή µου να µην ευχαριστήσω τον Βιολόγο κ. Αναστάσιο Κουρκουτέλη, υπεύθυνο κυτταροµετρίας ροής της εταιρίας Π.Ν.Γ. Γερολυµάτος, που µε βοήθησε στην εκµάθηση της χρήσης του κυτταροµετρητή ροής. Τον ευχαριστώ πολύ για τη συνεχή συµπαράσταση και τις συµβουλές του. Τέλος ευχαριστώ πολύ, τον Βιολόγο του Αιµατολογικού Εργαστηρίου κ. Αθανάσιο Καλογερίδη, την παρασκευάστρια κ. Ιωάννα Χριστοδούλου, καθώς και τις βιολόγους κ. Αγγελική Αυγητίδου και κ. Αλεξάνδρα Τσίγκα για τη συνεργασία τους σε όλη τη διάρκεια της µελέτης. 19

20

ΜΕΡΟΣ ΠΡΩΤΟ ΓΕΝΙΚΟ 21

22

1. Αιµοποίηση 1.1. Φυσιολογική αιµοποίηση Στους ενηλίκους απαιτείται η καθηµερινή παραγωγή σηµαντικού αριθµού διαφοροποιηµένων κυττάρων του αίµατος. Τα τελευταία προκύπτουν από τα αδιαφοροποίητα αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα (Haematopoietic Stem Cells, HSC) µέσω πολύπλοκων και όχι πλήρως κατανοητών µηχανισµών 1. Το αιµοποιητικό stem cell δεν αναγνωρίζεται µορφολογικά κατά την παρατήρηση των επιχρισµάτων του µυελού των οστών, η δε ύπαρξή του καθώς και οι ιδιότητές του αποκαλύφθηκαν µετά από µακρά και επίπονη ερευνητική προσπάθεια που συνεχίζεται έως σήµερα 2. Η ύπαρξη του αιµοποιητικού stem cell έγινε εµφανής το 1961 από τους Ford και συν. µε το κλασικό πείραµα της έγχυσης δείγµατος µυελού των οστών από υγιείς επίµυες σε επίµυες του ίδιου είδους που είχαν ακτινοβοληθεί µε θανατηφόρο δόση ακτινοβολίας (ακτίνες Χ). Αυτή ήταν η πρώτη πειραµατική µεταµόσχευση και είχε ως αποτέλεσµα την επιβίωση των ακτινοβοληθέντων επιµύων για µεγάλο διάστηµα, παρόµοιο µε το χρόνο επιβίωσης των υγιών επιµύων του ίδιου είδους, σε αντίθεση µε το αναµενόµενο, λόγω του περιορισµένου αριθµού των χορηγηθέντων κυττάρων. Το συµπέρασµα στο οποίο κατέληξαν οι ερευνητές ήταν ότι στο δείγµα του µυελού που χορηγήθηκε υπήρχαν κάποια κύτταρα ικανά να επανασυστήσουν πλήρως το αιµοποιητικό σύστηµα των ακτινοβοληθέντων επιµύων, µέσω της ικανότητάς τους να αυτοανανεώνονται. Τα αιµοποιητικά stem cells καθώς και τα δεσµευµένα προγονικά κύτταρα εκφράζουν στην επιφάνειά τους το αντιγόνο CD34 σε ποσοστό 1-4% των εµπύρηνων κυττάρων του µυελού των οστών. Μελέτες µεταµόσχευσης CD34 + κυττάρων απέδειξαν ότι τα κύτταρα αυτά είναι υπεύθυνα για τη βραχύχρονη αποκατάσταση της αιµοποίησης και πιθανόν και για τη µακρόχρονη. Ο κυτταρικός πληθυσµός CD34 + CD38 - Lin - είναι περισσότερο εµπλουτισµένος σε κύτταρα µε ιδιότητες stem cell 2. Νεότερα δεδοµένα δείχνουν ότι κύτταρα µε φαινότυπο CD34 - CD38 - Lin - είναι επίσης ικανά να επανασυστήσουν πλήρως το µυελό των NOD/SCID(nonobese diabetic/ severe combined immunodeficient) επιµύων και ίσως η έκφραση του CD34 είναι επιγενές φαινόµενο κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, καταρρίπτοντας το δόγµα ότι τα HSC είναι CD34 + 2. 23

Το αιµοποιητικό σύστηµα µπορεί να σχηµατοποιηθεί σαν µια σειρά από κυτταρικά διαµερίσµατα µε αλληλοεπικαλυπτόµενες λειτουργικές ιδιότητες (εικόνα 1). Το διαµέρισµα των αρχέγονων αιµοποιητικών κυττάρων (HSC) αποτελείται από σπάνια (συχνότητα 1: 100.000 στο µυελό των οστών) κύτταρα τα οποία βρίσκονται στη φάση G0 (quiescent) του κυτταρικού κύκλου και έχουν τρία βασικά χαρακτηριστικά: α) Τη δυνατότητα της αυτοανανέωσης, δηλαδή να αναπαράγουν κύτταρα ίδια προς το µητρικό ως προς την ικανότητα πολλαπλασιασµού, διαφοροποίησης και αυτοανανεωτικής ικανότητας. β) Την ικανότητα διαφοροποίησης προς όλες τις ώριµες µορφές του περιφερικού αίµατος (πολυδύναµο κύτταρο). γ) Την πλαστικότητα (plasticity), δηλαδή την ικανότητα να δίνουν γένεση σε κύτταρα διαφορετικού τύπου ιστών (εκτός του αιµοποιητικού), όπως ηπατοκύτταρα, χονδροκύτταρα, κύτταρα µυϊκού και νευρικού ιστού 3,4. Η µετάβαση των αρχέγονων µητρικών κυττάρων στην επόµενη κυτταρική προβαθµίδα η οποία περιλαµβάνει τα προγονικά αιµοποιητικά κύτταρα χαρακτηρίζεται από την προοδευτική ελάττωση της ικανότητας αυτοανανέωσης και την έναρξη της διαδικασίας της δέσµευσης. Η τελευταία πραγµατώνεται µε την απώλεια ή απόκτηση διάφορων υποδοχέων αυξητικών παραγόντων και υποδηλώνει τον περιορισµό της δυνατότητας διαφοροποίησης προς αυστηρά καθορισµένη κατεύθυνση. Η συνεχής διατήρηση του ισοζυγίου µεταξύ πολλαπλασιασµού-ωρίµανσης και απόπτωσης, καθώς και η δυνατότητα του αιµοποιητικού συστήµατος να ανταπεξέρχεται σε καταστάσεις αυξηµένων απαιτήσεων (stress hematopoiesis), υπόκεινται σε µηχανισµούς θετικής και αρνητικής ρύθµισης, που περιλαµβάνουν την έκκριση αυξητικών ή ανασταλτικών αιµοποιητικών παραγόντων, αλληλεπιδράσεις µε το αιµοποιητικό µικροπεριβάλλον, την έκφραση των µορίων προσκόλλησης και τον προγραµµατισµένο κυτταρικό θάνατο γνωστό ως απόπτωση 1. Οι αυξητικοί αιµοποιητικοί παράγοντες αποτελούν µια ετερόκλητη οµάδα γλυκοπρωτεϊνών που δρούν µέσω ενδοκυττάριας µεταφοράς µηνύµατος (signal transduction) όταν προσδεθούν στους αντίστοιχους υποδοχείς της µεµβράνης των κυττάρων και ρυθµίζουν τον πολλαπλασιασµό, τη διαφοροποίηση και την επιβίωση των προγονικών κυττάρων, καθώς και τη λειτουργία των ωριµότερων µορφών. Η επιβίωση ή όχι ενός αιµοποιητικού κυττάρου βασίζεται στην παρουσία ή απουσία αντίστοιχα αυξητικών παραγόντων. Τα 24

κύτταρα πεθαίνουν µε το µηχανισµό της απόπτωσης, κατά την οποία το DNA του κυττάρου κατακερµατίζεται, µε αποτέλεσµα να διατηρείται η οµοιόσταση του αιµοποιητικού συστήµατος 6. Εικόνα 1: Γενεαλογία των αιµοποιητικών και προγονικών κυττάρων. Τα HSC διαιρούνται σε LT-HSC (µακράς διαρκείας HSC), κύτταρα µε µεγάλη δυνατότητα αυτοανανέωσης που στηρίζουν την αιµοποίηση σε όλη τη διάρκεια της ζωής και σε ST-HSC (βραχείας διαρκείας HSC), που επίσης στηρίζουν την αιµοποίηση αλλά για περιορισµένο χρονικό διάστηµα. Τα ST- HSC διαφοροποιούνται σε MPP (πολυδύναµα προγονικά) τα οποία έχουν την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε ολιγοδύναµα προγονικά που τελικά δίνουν διαφοροποιηµένα προγονικά κύτταρα. Τα CLP (κοινά λεµφικά προγονικά κύτταρα) δίνουν τα Τ-λεµφοκύτταρα, τα Β-λεµφοκύτταρα και τα φυσικά κυτταροκτόνα (ΝΚ) κύτταρα. Τα CMP (κοινά µυελικά προγονικά κύτταρα) δίνουν τα GMP (µυελοµονοκυτταρικά προγονικά κύτταρα), τα οποία διαφοροποιούνται σε µονοκύτταρα/ µακροφάγα και πολυµορφοπύρηνα, και τα MEP (µεγακαρυοτικά/ προγονικά της ερυθράς) τα οποία παράγουν µεγακαρυοκύτταρα/ αιµοπετάλια και ερυθροκύτταρα. Τόσο τα CLP όσο και τα CMP µπορούν να δώσουν δενδριτικά κύτταρα 5. 25

1.2. Λευχαιµική αιµοποίηση Το κλασικό µοντέλο της λευχαιµικής αιµοποίησης (εικόνα 2) θεωρεί πως αρκετοί τύποι προγονικών κυττάρων είναι ευάλωτοι σε γενετικές βλάβες ενώ το στάδιο διαφοροποίησης του λευχαιµικού κυττάρου καθορίζει και τον υπότυπο της οξείας µυελογενούς λευχαιµίας 7. Το µοντέλο αυτό αποδίδει την ίδια δυνατότητα λευχαιµικής µετάλλαξης σε όλα τα άωρα προγονικά κύτταρα, έρχεται όµως σε αντίθεση µε τα πειραµατικά δεδοµένα που δείχνουν πως µόνο ένας µικρός υποπληθυσµός λευχαιµικών κυττάρων µπορεί να προκαλέσει λευχαιµία σε πειραµατόζωα 8. Εικόνα 2: Κλασικό µοντέλο λευχαιµιογένεσης. Μοντέλο της ετερογένειας της ΟΜΛ που θεωρεί ότι τα λευχαιµιογόνα γεγονότα συµβαίνουν σε διάφορα στάδια διαφοροποίησης των κυττάρων. Τα βέλη δείχνουν το λευχαιµιογόνο γεγονός 9. 26

Το µοντέλο του αρχέγονου λευχαιµικού κυττάρου (leukemic stem cell, LSC) αντιθέτως, περιγράφει πως οι λευχαιµιογόνες µεταλλάξεις συµβαίνουν µόνο στα HSC, ενώ ο προκύπτων κλώνος οργανώνεται σύµφωνα µε την αιµοποιητική ιεραρχία (εικόνα 3). Η τελική ετερογένεια του λευχαιµικού φαινοτύπου καθορίζεται τόσο από την αρχική γενετική βλάβη, όσο και από δευτερογενείς, επιπρόσθετες βλάβες οι οποίες περιορίζουν σε άλλοτε άλλο βαθµό τη δυνατότητα διαφοροποίησης του λευχαιµικού κλώνου 10. Παρά όµως τη στήριξη από τα πειραµατικά δεδοµένα, το µοντέλο αυτό αδυνατεί να προσδιορίσει ένα λευχαιµικό HSC στην οξεία προµυελοκυτταρική λευχαιµία, στην οποία έχει αποδειχθεί ότι η µετάλλαξη συµβαίνει σε πιο διαφοροποιηµένο προγονικό κύτταρο της µυελικής σειράς 1,9. Τέλος, ένα τρίτο µοντέλο προσπαθώντας να συµβιβάσει τα παραπάνω, προτείνει πως η απόκτηση της ιδιότητας αυτοανανέωσης από προγονικές µορφές άλλες των HSC αποτελεί το πρώτο λευχαιµιογόνο γεγονός, το οποίο ακολουθείται στη συνέχεια από αναστολή της διαφοροποίησης 11. Εικόνα 3: Μοντέλο του αρχέγονου λευχαιµικού κυττάρου. Μοντέλο της ετερογένειας της ΟΜΛ που θεωρεί ότι τα λευχαιµιογόνα γεγονότα συµβαίνουν στα αρχέγονα στελεχιαία κύτταρα µε αποτέλεσµα αυξηµένη αυτοανανέωση, ακύρωση της φυσιολογικής διαφοροποίησης και δηµιουργία ενός λευχαιµικού στελεχιαίου κυττάρου που αποτελεί την έναρξη της λευχαιµικής ιεραρχίας 9. 27

1.2.1. Η ιδέα του λευχαιµικού stem cell (LSC) Στις αρχές του 1970 η ιδέα του λευχαιµικού stem cell προέκυψε βασιζόµενη σε αρκετές µελέτες 12,13,14 που έδειχναν ότι µόνο ένας υποπληθυσµός των λευχαιµικών κυττάρων ήταν ικανός για εκτεταµένο πολλαπλασιασµό in vitro και in vivo. Το 1997 µελέτες των Blair και συν. 15 καθώς και των Bonnet και Dick 10, έδειξαν ότι τα περισσότερα λευχαιµικά κύτταρα δεν ήταν ικανά να πολλαπλασιαστούν και µόνο ένας µικρός, περιορισµένος υποπληθυσµός κυττάρων ήταν σταθερά κλωνογόνος. Στις µελέτες αυτές, το LSC για την ΟΜΛ αναγνωρίστηκε και προσδιορίστηκε ως CD90 -, CD34 +, CD38 -. Αυτά τα κύτταρα αντιπροσωπεύουν µια µικρή και µεταβλητή οµάδα του συνόλου των ΟΜΛ κυττάρων (0,2-1% εξαρτώµενη από τον ασθενή). Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι οι λευχαιµίες αρχίζουν από λίγα λευχαιµικά stem cells που είναι ετερογενή όσον αφορά την προέλευσή τους (εικόνα 4). Μπορούν να είναι είτε αιµοποιητικά stem cells τα οποία έγιναν λευχαιµικά µετά από µεταλλάξεις, είτε πιο ώριµα προγονικά κύτταρα που απέκτησαν την ικανότητα των stem cells για αυτοανανέωση 5. Εικόνα 4: Προέλευση του LSC. Η λευχαιµία µπορεί να ερµηνευτεί ως ένας καινούριος µη φυσιολογικός αιµοποιητικός ιστός, που αρχίζει από λίγα LSC υποκείµενα σε παρεκκλίνουσα και πτωχά ρυθµιζόµενη διδικασία πολλαπλασιασµού ανάλογη µε αυτή των φυσιολογικών HSC. Τα LSC µπορούν να είναι είτε HSC τα οποία έγιναν λευχαιµικά ως αποτέλεσµα συσσωρευµένων µεταλλάξεων, είτε πιο ώριµα προγονικά κύτταρα που απέκτησαν την ικανότητα αυτοανανέωσης ανάλογης των stem cells στα πλαίσια της λευχαιµικής µετάλλαξης 5. 28

2. Οξεία Μυελογενής Λευχαιµία (ΟΜΛ) Οι λευχαιµίες ονοµάζονται και κατατάσσονται ανάλογα µε το είδος του αιµοποιητικού κυττάρου που εµπλέκεται πρωταρχικά. Οι µυελικές λευχαιµίες επηρεάζουν τους απογόνους των κυττάρων της µυελικής σειράς ενώ οι λεµφοκυτταρικές λευχαιµίες έχουν σχέση µε ανωµαλίες στη λεµφική κυτταρική σειρά. Οι λευχαιµίες µπορεί να είναι οξείες ή χρόνιες ή να έχουν ενδιάµεσες και ευµετάβλητες µορφές 16. Οι οξείες λευχαιµίες είναι κακοήθεις νεοπλασίες των άωρων κυττάρων του αίµατος. Τα νεοπλασµατικά κύτταρα διατηρούν την ικανότητα πολλαπλασιασµού τους αλλά έχουν απωλέσει σε µεγάλο βαθµό την ιδιότητα να µετατρέπονται σε ωριµότερες κυτταρικές µορφές. Τα άωρα αυτά κύτταρα καλούνται βλάστες και πιο ειδικά µυελοβλάστες, όταν προέρχονται από τη µυελική σειρά και λεµφοβλάστες, όταν προκύπτουν από τη λεµφική σειρά. Ανάλογα οι οξείες λευχαιµίες διακρίνονται σε οξείες µυελοβλαστικές ή µυελογενείς (ΟΜΛ) και σε οξείες λεµφοβλαστικές ή λεµφογενείς λευχαιµίες (ΟΛΛ). Ο όρος οξείες µυελογενείς λευχαιµίες είναι γενικός και περιλαµβάνει τις οξείες λευχαιµίες της κοκκιώδους (µυελικής), της µονοκυτταρικής, της ερυθράς και της µεγακαρυοκυτταρικής σειράς. Για το λόγο αυτό, πολλοί συγγραφείς χρησιµοποιούν τον όρο οξείες µη λεµφοκυτταρικές λευχαιµίες. Η ΟΜΛ είναι µια κλωνική διαταραχή της αιµοποίησης που χαρακτηρίζεται από συσσώρευση ανώριµων µη λειτουργικών κυττάρων, των βλαστών, που αποτυγχάνουν να διαφοροποιηθούν φυσιολογικά 17. 2.1. Ιστορικά στοιχεία Η πρώτη περιγραφή περιστατικού λευχαιµίας στην ιατρική ιστορία, όπως αναφέρεται 18, χρονολογείται από το 1827 όταν ένας Γάλλος παθολόγος ο Velpeau περιέγραψε έναν 67 χρονο ανθοπώλη, ο οποίος ανέπτυξε µια ασθένεια χαρακτηριζόµενη από πυρετό, αδυναµία, λιθίαση ουροποιητικού συστήµατος και σηµαντική µεγέθυνση ήπατος και σπληνός. Ο Velpeau παρατήρησε ότι το αίµα του ασθενούς είχε συνοχή «σαν χυλός» και θεώρησε ότι η εµφάνιση του αίµατος οφειλόταν στα άσπρα σωµατίδια. Το 1845, ένας αριθµός ασθενών που πέθανε από σπληνοµεγαλία και αλλαγές στο «χρώµα και συνοχή» του αίµατός τους, αναφέρθηκε από τον J.H. Bennett, παθολόγο στο Εδιµβούργo 18,19. Χρησιµοποίησε τον όρο «λευκοκυτταραιµία» ώστε να περιγράψει την παθολογική κατάσταση 19. 29

Ο όρος «λευχαιµία» επινοήθηκε το 1856 από τον Rudolf Virchow, το γνωστό Γερµανό παθολόγο 18,20. Ως πρωτοπόρος στη χρήση του οπτικού µικροσκοπίου στην παθολογία, ο Virchow ήταν ο πρώτος που περιέγραψε το ανώµαλο πλεόνασµα των λευκών κυττάρων του αίµατος στους ασθενείς µε το κλινικό σύνδροµο 20 που περιγράφηκε από τους Velpeau και Bennett. Καθώς όµως ο Virchow δεν ήταν σίγουρος για την αιτία του πλεονασµού των λευκών κυττάρων, χρησιµοποίησε τον περιγραφικό όρο «λευχαιµία» από την ελληνική γλώσσα που σηµαίνει «λευκό αίµα» για να αναφερθεί στην κατάσταση 20. Περαιτέρω πρόοδος στην κατανόηση της οξείας µυελογενούς λευχαιµίας συνέβη ραγδαία µε την ανάπτυξη της τεχνολογίας. Το 1877, ο Paul Ehrlich ανέπτυξε µια τεχνική χρώσης επιχρισµάτων αίµατος που του επέτρεπε να περιγράφει µε λεπτοµέρεια φυσιολογικά και ανώµαλα λευκά κύτταρα του αίµατος. Ο Wilhelm Ebstein εισήγαγε τον όρο «οξεία λευχαιµία» το 1889 ώστε να διαφοροποιήσει τις γρήγορα εξελισόµενες και θανατηφόρες λευχαιµίες από τις πιο νωθρές χρόνιες λευχαιµίες 18,21. Ο Newmann το 1869, ο πρώτος που αναγνώρισε ότι τα λευκά κύτταρα του αίµατος παράγονται από το µυελό των οστών, επινόησε τον όρο «µυελική» βασιζόµενος στην ελληνική λέξη «µυελός». Η τεχνική της εξέτασης του µυελού των οστών για τη διάγνωση της λευχαιµίας περιγράφηκε πρώτη φορά το 1879 από τον Mosler 18,22. Τέλος, το 1900 ο µυελοβλάστης που είναι το κακόηθες κύτταρο στην ΟΜΛ, χαρακτηρίστηκε από τον Naegeli, o οποίος διαίρεσε τις λευχαιµίες σε µυελικές και λεµφοκυτταρικές 18,23. 2.2. Επιδηµιολογία της ΟΜΛ Η ΟΜΛ αποτελεί το 34% όλων των λευχαιµιών, το 13% των λευχαιµιών σε παιδιά έως 10 ετών και το 90% των οξειών λευχαιµιών στους ενήλικες 24. Στις ΗΠΑ, η επίπτωση στο σύνολο του πληθυσµού, υπολογίζεται ότι προσβάλλει περίπου 13300 άτοµα ανά έτος 25. Η νόσος έχει βαρύτατη πρόγνωση και παρά τη σπανιότητά της έχει δυσανάλογη επίπτωση στις στατιστικές επιβίωσης των ασθενών, ιδιαίτερα για τα παιδιά και τους νεαρούς ενήλικες 24. Έτσι ενώ συνιστούν µαζί µε την ΟΛΛ ποσοστό µικρότερο του 3% όλων των κακοηθειών αποτελούν την κύρια αιτία θανάτου στις ΗΠΑ για άτοµα ηλικίας µικρότερης των 35 ετών 24. Η ΟΜΛ είναι ελαφρά συχνότερη στους άνδρες σε σχέση µε τις γυναίκες (1,3:1), διαφορά που ενισχύεται στις µεγαλύτερες ηλικίες, πιθανώς λόγω επαγγελµατικής έκθεσης ή λόγω της µεγαλύτερης 30

νοσηρότητας των ανδρών από µυελοδυσπλαστικά σύνδροµα (Μ Σ) τα οποία συχνά καταλήγουν σε οξεία λευχαιµία 26. Αν και η νόσος συναντάται σπάνια κάτω των 40 ετών, αυξάνεται προοδευτικά µε την ηλικία. Η επίπτωσή της υπολογίζεται σε 1/ 100000 στην ηλικία των 40 ετών, 3,5/ 100000 στα 50, 15/ 100000 στα 70 και 35/ 100000 στην ηλικία των 90. Η µέση ηλικία έναρξης της ΟΜΛ είναι τα 65 έτη 24. Υπάρχει κάποια γεωγραφική κατανοµή στα περιστατικά της ΟΜΛ. Στους ενήλικες, τα µεγαλύτερα ποσοστά ΟΜΛ εµφανίζονται στη Βόρεια Αµερική, Ευρώπη και Ωκεανία ενώ είναι σαφώς µικρότερα στην Ασία και Λατινική Αµερική 27,28. Αντίθετα, η ΟΜΛ στα παιδιά είναι λιγότερο συχνή στη Βόρεια Αµερική και στην Ινδία απ ό,τι σε άλλα µέρη της Ασίας 29. Αυτές οι διαφορές µπορεί να οφείλονται σε γενετικούς ή περιβαλλοντικούς παράγοντες ή σε συνδυασµό και των δύο. 2.3. Aιτιολογικοί παράγοντες της ΟΜΛ Αρκετοί παράγοντες όπως φαρµακευτική αγωγή, περιβαλλοντική έκθεση, επαγγελµατική ενασχόληση (έκθεση σε καρκινογόνες ουσίες) και γενετική προδιάθεση ευθύνονται για την αιτιολογία της ΟΜΛ. Όµως για τους περισσότερους ασθενείς µε ΟΜΛ δεν έχει αναγνωριστεί κανένας εµφανής αιτιολογικός παράγοντας. Είναι φανερό ότι η λευχαιµιογένεση αποτελεί πολυσταδιακή διαδικασία µε προϋπόθεση την ύπαρξη ενός ευένδοτου προγονικού αιµοποιητικού κυττάρου. Οι υποκατηγορίες της ΟΜΛ έχουν διαφορετικούς αιτιολογικούς µηχανισµούς και είναι πιθανή η σύνδεση µιας µοριακής ανωµαλίας ή µετάλλαξης µε ένα συγκεκριµένο αιτιολογικό παράγοντα. Παρόλα αυτά η λευχαιµία δεν εµφανίζεται σε όλα τα άτοµα που εκτίθενται στην επίδραση των θεωρουµένων αιτιολογικών παραγόντων 24. Καταστάσεις που συνδέονται µε την εµφάνιση ΟΜΛ περιλαµβάνουν: 1) Προηγηθείσα αιµατολογική διαταραχή. Η συχνότερη αιτία εµφάνισης ΟΜΛ είναι η εκτροπή από M Σ. Ακόµη σε ΟΜΛ καταλήγουν και άλλα αιµατολογικά νοσήµατα όπως η απλαστική αναιµία, η νυκτερινή παροξυσµική αιµοσφαιρινουρία, η µυελoΐνωση, η αληθής πολυκυτταραιµία καθώς και η Χρόνια Μυελογενής Λευχαιµία (ΧΜΛ) 24. 2) Γενετική προδιάθεση. Υπάρχουν συγγενείς διαταραχές οι οποίες οδηγούν στην εµφάνιση ΟΜΛ κατά την παιδική ηλικία όπως: το σύνδροµο Down, το σύνδροµο Bloom, η συγγενής ουδετεροπενία, η αναιµία Fanconi, το σύνδροµο αταξίας- τελαγγειεκτασίας, η 31

νευροϊνωµάτωση, το σύνδροµο Li-Fraumeni, το σύνδροµο Wiskott- Aldrich, το σύνδροµο Diamond- Blackfan 24. 3) Περιβαλλοντική έκθεση. Το τραγικό γεγονός της έκρηξης της ατοµικής βόµβας στην Ιαπωνία έχει αποτελέσει πηγή για ερευνητικές µελέτες και η συσχέτιση της καταστροφικής ακτινοβολίας για το DNA µε την εµφάνιση της ΟΜΛ έχει επιβεβαιωθεί 24,30. Στρατιωτικό προσωπικό που εξετέθη σε ακτινοβολία (Ιρακ, Κόσοβο) εµφανίζουν επίσης µεγαλύτερη επίπτωση ΟΜΛ. Αµφιλεγόµενη βεβαίως είναι η επίδραση της έκθεσης σε χαµηλή δόση ακτινοβολίας καθώς επίσης και η επίδραση των ηλεκτροµαγνητικών πεδίων 24. 4) Χρόνια έκθεση σε χηµικά. Υπάρχει σαφής συσχέτιση εµφάνισης απλαστικής αναιµίας όσο και ΟΜΛ µε την έκθεση σε βενζένιο. Ο βασικός µηχανισµός οφείλεται σε µεταλλάξεις στα RAS ογκογονίδια 24,31. 5) Κάπνισµα. Η εµφάνιση της οξείας λευχαιµίας σε καπνιστές έχει συνδεθεί µε δοσοεξαρτώµενο τρόπο και µε συγκεκριµένη χρωµοσωµική ανωµαλία (-7) 24. 6) Προηγηθείσα έκθεση σε χηµειοθεραπευτικούς παράγοντες. Ασθενείς µε Hodgkin, ΟΛΛ, Ca µαστού, αληθή πολυκυτταραιµία, µεταµόσχευση µυελού εµφανίζουν συχνά δευτεροπαθή ΟΜΛ. Αξίζει να σηµειωθεί ότι ανάλογα µε την προηγηθείσα θεραπεία είναι δυνατόν να εµφανιστούν δύο τύποι δευτεροπαθούς ΟΜΛ 24. α) Μετά από χορήγηση αλκυλιωτικών παραγόντων (µε ή χωρίς ακτινοβολία) εµφανίζονται διαταραχές των χρωµοσωµάτων 5 και 7, µετά από χρονική περίοδο 3-5 ετών και συνήθως µετά από Μ Σ. β) Μετά από χορήγηση αναστολέων της τοποϊσοµεράσης ΙΙ (επιποδοφυλλοτοξίνες και ανθρακυκλίνες), χωρίς προηγούµενο M Σ, εντός 12-18 µηνών και µε µεταλλάξεις που αφορούν το 11q23 και το γονίδιο MLL. 2.4. ΟΜΛ και ηλικιωµένοι Η ΟΜΛ προσβάλλει κυρίως ενήλικες ασθενείς και η επίπτωσή της αυξάνεται µε την πρόοδο της ηλικίας. Παρά το ότι οι επιδηµιολογικές µελέτες δείχνουν ότι η διάµεση ηλικία προσβολής των ασθενών µε ΟΜΛ είναι µεταξύ 65 και 70 έτη, η αντίστοιχη ηλικία των ασθενών που εντάσσεται σε κλινικές µελέτες θεραπείας είναι κατά 15-20 έτη µικρότερη 32. Έτσι το ποσοστό των ασθενών ηλικίας άνω των 60 ετών που συµπεριλαµβάνεται στις µελέτες αυτές αποτελεί το 1/3 του συνολικού αριθµού των ηλικιωµένων ασθενών 33. Η µη συµµετοχή µεγάλου αριθµού ηλικιωµένων ασθενών στις κλινικές µελέτες µπορεί 32

να ερµηνευτεί είτε σαν αποκλεισµός των ασθενών λόγω ιατρικών αντενδείξεων, είτε σαν άρνηση των ασθενών να συµµετάσχουν ή σαν απροθυµία των θεραπόντων ιατρών να εκθέσουν τον ασθενή στην τοξικότητα της αντιλευχαιµικής θεραπείας. Παρά τους πιο πάνω περιορισµούς, η σύγκριση των ποσοστών υφέσεως από µεγάλες πολυκεντρικές µελέτες ασθενών δείχνει σταθερά πτωχότερα θεραπευτικά αποτελέσµατα για τους ασθενείς ηλικίας άνω των 60 ετών 34. 2.5. Προγνωστικοί παράγοντες της ΟΜΛ 2.5.1. Ηλικία Ασθενείς ηλικίας 55-65 ετών παρουσιάζουν µεγαλύτερα ποσοστά πλήρων υφέσεων και συνολικής επιβίωσης µετά από συνδυασµένη χηµειοθεραπεία σε σχέση µε ασθενείς ηλικίας 65-80 ετών. Ασθενείς άνω των 80 ετών επιτυγχάνουν πολύ πτωχά αποτελέσµατα µετά χορήγηση συνδυασµένης χηµειοθεραπείας και για πολλούς συγγραφείς η ηλικία αυτή είναι απαγορευτική για την εφαρµογή εντατικών θεραπευτικών πρωτοκόλλων 34,35. 2.5.2. Κατάσταση ικανότητας Ασθενείς µε καλή φυσική κατάσταση παρουσιάζουν καλύτερα ποσοστά συνολικής επιβίωσης και λιγότερους τοξικούς θανάτους από τη χηµειοθεραπεία. Μεγάλη ηλικία και άλλες νοσηρές καταστάσεις είναι πτωχοί προγνωστικοί παράγοντες στους ηλικιωµένους ασθενείς µε ΟΜΛ. Πολλοί απ αυτούς τους ασθενείς δεν ανέχονται την εντατική χηµειοθεραπεία καθώς και τις επακόλουθες επιπλοκές. Η οξεία τοξικότητα από τη χηµειοθεραπεία είναι µεγαλύτερη στους ασθενείς µε χρόνια καρδιακή, πνευµονική, ηπατική ή νεφρική δυσλειτουργία. Για παράδειγµα, η µείωση στο κλάσµα εξώθησης µπορεί να περιορίσει τη χρήση ανθρακυκλινών ή µιτοξανδρόνης. Οι ηλικιωµένοι ασθενείς έχουν επίσης µικρότερη ικανότητα αναγέννησης του µυελού των οστών, ακόµη και µετά από µια επιτυχηµένη µείωση των λευχαιµικών κυττάρων. Η νοσηρότητα των ηλικιωµένων στις µεγάλες περιόδους πανκυτταροπενίας σε συνδυασµό µε την κακή διατροφή καθώς και η τοξικότητα των χρησιµοποιούµενων αντιβιοτικών είναι οι παράγοντες που σχετίζονται µε την αποτυχία της θεραπευτικής αγωγής 36. 2.5.3. Προηγούµενες αιµατολογικές διαταραχές Προϋπάρχουσες µυελοδυσπλαστικές ή µυελοπαραγωγικές διαταραχές είναι συχνές στους ηλικιωµένους ασθενείς µε ΟΜΛ και 33

αναφέρονται σε ποσοστό 24% έως 40% των περιπτώσεων. Η ΟΜΛ στους ηλικιωµένους ασθενείς συχνά εµφανίζεται µετά από µια χρόνια διαδροµή ενός µυελοδυσπλαστικού ή µυελοπαραγωγικού συνδρόµου. Θεωρείται ότι η συσσώρευση γενετικών ανωµαλιών κατά τη χρόνια φάση αυτών των καταστάσεων οδηγεί στην εµφάνιση ΟΜΛ. Ασθενείς µε δευτερογενή ΟΜΛ λόγω προηγούµενων αιµατολογικών ασθενειών έχουν πτωχή απάντηση στη θεραπεία από ό,τι αυτοί µε de novo ασθένεια και ως εκ τούτου χειρότερη πρόγνωση. Για παράδειγµα, στη µελέτη της Southwest Oncology Group (SWOG) τα ποσοστά πλήρους υφέσεως ήταν 21% και 52%, αντίστοιχα. 2.5.4. Ανεπάρκεια οργάνων ή οργανικών συστηµάτων Αρκετοί ηλικιωµένοι ασθενείς παρουσιάζουν ανεπάρκεια βασικών οργάνων, στοιχείο που αποτελεί δυσµενή προγνωστικό παράγοντα για τη συνολική επιβίωση, συνοδευόµενο από µεγάλα ποσοστά τοξικών θανάτων 34. 2.5.5. ΟΜΛ µετά από θεραπεία Μια καθαρή αιτία της λευχαιµίας µπορεί να βρεθεί σε µια µειοψηφία των ασθενών µε ιστορικό προηγούµενης χηµειοθεραπείας ή ραδιοθεραπείας. Τέτοιες δευτεροπαθείς λευχαιµίες πολλές από τις οποίες είναι µυελογενείς, δύσκολα θεραπεύονται. Έκθεση σε αλκυλιωτικούς παράγοντες όπως η µελφαλάνη και η κυκλοφωσφαµίδη αυξάνει τον κίνδυνο για δευτεροπαθή ΟΜΛ. Ο κίνδυνος για δευτεροπαθή ΟΜΛ είναι µεγαλύτερος 2 έως 9 χρόνια µετά τη θεραπεία και 85% των περιτώσεων συµβαίνει πριν από το δέκατο χρόνο ενώ συχνά συνδέονται µε ανωµαλίες των χρωµοσωµάτων 5 και 7. Ένας άλλος αναγνωρισµένος τύπος δευτεροπαθούς λευχαιµίας αναπτύσσεται έπειτα από έκθεση σε παράγοντες όπως η ετοποσίδη και οι ανθρακυκλίνες. Αυτός ο τύπος εκδηλώνεται συντοµότερα και συνδέεται µε ανωµαλίες του µεγάλου τµήµατος του χρωµοσώµατος 11. Οι χρωµοσωµικές ανωµαλίες που συχνά παρατηρούνται στις δευτεροπαθείς λευχαιµίες συνδέονται µε πτωχή πρόγνωση, ακόµη και αν παρατηρούνται σε ασθενείς χωρίς ιστορικό προηγούµενης θεραπείας ή έκθεση σε τοξικούς παράγοντες. Ιδιαίτερα στην περίπτωση των αλκυλιωτικών παραγόντων που προκαλούν λευχαιµία, η απάντηση στην θεραπεία είναι πτωχή. 34

2.5.6. Έκφραση δεικτών πολυφαρµακευτικής ανθεκτικότητας Ασθενείς ηλικίας άνω των 55 ετών παρουσιάζουν σε ποσοστό µεγαλύτερο του 70% έκφραση δεικτών πολυφαρµακευτικής ανθεκτικότητας (MDR- multidrug resistance) σύµφωνα µε µελέτη της SWOG, πράγµα που αποτελεί δυσµενή προγνωστικό παράγοντα για την επίτευξη πλήρους ύφεσης. Ο φαινότυπος MDR1 εµφανίζεται κατά τη διάρκεια της εξελικτικής διαδικασίας των λευχαιµικών κυττάρων. Στη µελέτη της SWOG, 71% των ηλικιωµένων ασθενών µε ΟΜΛ εξέφραζε MDR1 σε σύγκριση µε το 30% των νεότερων ασθενών 35. Ασθενείς µε MDR1- θετικό ήταν λιγότερο πιθανό να έχουν πλήρη ύφεση. Η σηµασία αυτού του γεγονότος δεν είναι ξεκάθαρη καθώς άλλες µελέτες έχουν δείξει ότι η παρουσία του MDR1 φαινότυπου µπορεί να συνδέεται 37, µπορεί όµως και όχι 38, µε τη µειωµένη επιβίωση στην ΟΜΛ. Από την άλλη πλευρά, στη µελέτη SWOG, οι ηλικιωµένοι ασθενείς που είχαν MDR1- αρνητικό και ευνοϊκούς ή ενδιάµεσης πρόγνωσης καρυότυπους είχαν ποσοστό πλήρους υφέσεως 81% 35. Σε µια άλλη µελέτη που περιελάµβανε 153 ασθενείς µε ΟΜΛ, χωρίς προηγούµενη θεραπεία, µε θετικό το προϊόν του γονιδίου MDR, την P- γλυκοπρωτεΐνη (Pgp) αυτή δεν επηρέαζε την επίτευξη πλήρους ύφεσης ή ολοκληρωτικής επιβίωσης εκτός αν η Pgp εκφραζόταν µαζί µε την lung resistance-related protein (LRP). Η µέση ηλικία αυτού του τελευταίου υποπληθυσµού (LRP+/Pgp+) ήταν τα 64 έτη ενώ αυτή των άλλων οµάδων (LRP+/Pgp-, LRP-/Pgp+, και LRP-/Pgp-) ήταν τα 48 έτη (P=0,009) δείχνοντας έτσι ότι αυτός ο πτωχής πρόγνωσης συνδυασµός ήταν περισσότερο συχνός στους ηλικιωµένους 39. 2.5.7. Καρυοτυπικές ανωµαλίες Οι ηλικιωµένοι ασθενείς παρουσιάζουν µεγαλύτερο ποσοστό δυσµενών καρυοτυπικών ανωµαλιών (21-33%) σε σχέση µε ασθενείς ηλικίας µικρότερης των 55 ετών, σύµφωνα µε στοιχεία από τις µελέτες της Γερµανικής οµάδας συνεργασίας για την ΟΜΛ (AMLCG) και της Βρετανικής οµάδας (MRC AML) 40. Ανώµαλα καρυοτυπικά χαρακτηριστικά είναι συχνά στην ΟΜΛ (πίνακας 1). Η σηµασία του καρυότυπου είναι βασική στην παθοφυσιολογία και στην απάντηση της θεραπείας της οξείας λευχαιµίας 41. Το γεγονός αυτό υποστηρίζεται από την αυξηµένη επικράτηση ποικίλων χρωµοσωµικών ανωµαλιών στους ηλικιωµένους σε σχέση µε τους νεότερους ασθενείς µε ΟΜΛ. Οι γενετικές µεταλλάξεις που συχνά συνδέονται µε αποτυχία της θεραπείας στους 35

νέους ασθενείς µε ΟΜΛ (π.χ. ανωµαλίες των χρωµοσωµάτων 5 ή 7 ή πολύπλοκο καρυότυπο) είναι σαφώς πιο συχνές στους ηλικιωµένους και συναντώνται στο 32% µε 57% των ασθενών 40. Αντιθέτως, όλες οι ευνοϊκές κυτταρογενετικές ανωµαλίες όπως t(8;21), t(15;17) ή inv(16) είναι πιο συχνές στα νεότερα άτοµα και ευθύνονται εν µέρει για την καλύτερη επιβίωση 42. Αποτελέσµατα από τη Βρετανική MRC AML 11 δοκιµή, στην οποία ο µέσος όρος ηλικίας ήταν τα 66 έτη, ταυτοποίησαν τις ακόλουθες προγνωστικές οµάδες: Ευνοϊκής πρόγνωσης οµάδα: t(15;17), t(8;21) και inv(16) Πλήρης ύφεση 72% και 5-ετής επιβίωση 34% Ενδιάµεσης πρόγνωσης οµάδα: (φυσιολογικός καρυότυπος ή µη πολύπλοκος καρυότυπος) Πλήρης ύφεση 53% και 5-ετής επιβίωση 10-15% Πτωχής πρόγνωσης οµάδα (πολύπλοκοι καρυότυποι) Πλήρης ύφεση 26% και 5-ετής επιβίωση 2% Οι οµάδες αυτές είναι όµοιες µε αυτές που έχουν οριστεί για νεότερους ενήλικες, παρόλο που τα ποσοστά επιβίωσης είναι µικρότερα. Μια µελέτη 35 της SWOG περιέλαβε 211 ηλικιωµένους ασθενείς µε ΟΜΛ (µέση ηλικία τα 68 έτη). Μη ευνοϊκοί καρυότυποι ήταν παρόντες σε ποσοστό 32%, αυτοί οι ασθενείς είχαν αναλογία πλήρους υφέσεως µικρότερη από αυτούς µε ευνοϊκούς ή ενδιάµεσους καρυότυπους (21% έναντι 55%). Παρόµοια αποτελέσµατα έχουν αναφερθεί από την Γερµανική AMLCG οµάδα 43 και από µια µεγάλη Σουηδική µελέτη 44. Η παρουσία συγκεκριµένων κυτταρογενετικών ανωµαλιών µπορεί να χρησιµοποιηθεί ως οδηγός στη θεραπεία. Για παράδειγµα, µια µελέτη από την Cancer and Leukemia Group B (CALGB) συµπεριέλαβε 42 ασθενείς µε µεµονωµένη τρισωµία 8. Ποσοστό 60% αυτών των ασθενών είχαν ηλικία µεγαλύτερη των 60 ετών και ο µέσος όρος επιβίωσης ήταν χαµηλότερος στους ασθενείς άνω των 60 ετών από ό,τι στους νεότερους (4,8 έναντι 17,5 µήνες). Μεταξύ των ηλικιωµένων ασθενών δεν υπήρχαν µεγάλης διάρκειας επιζώντες. Οι µόνοι µεγάλης διάρκειας επιζώντες ήταν οι µικρότεροι των 60 ετών οι οποίοι θεραπεύτηκαν µε αυτόλογη ή αλλογενή µεταµόσχευση stem cells ενώ βρίσκονταν σε πρώτη πλήρη ύφεση 45. 36

Πίνακας 1: Κυτταρογενετική ταξινόµηση για οµάδες κινδύνου στην ΟΜΛ 46. Κυτταρογενετική διαταραχή Παιδιά Ενήλικες Γονίδια Σύντηξης Βιολογικοί Μετατροπείς Α. Ευνοϊκή Πρόγνωση t(8;21) 12% 5-8% <55 έτη AML1/ETO FLT3ITD 9% +del 9 + complex inv(16) 12% 10% <45 έτη CBFβ/ MYH11 FLT3ITD 7% t(15;17) 7% 15% <45 έτη PML-RARa FLT3ITD 37% Ποικιλίες t(11;17)q23q11 PLZF-RARa t(5;17)q32q11 NMP-RARa t(11;17)q13q11 NuMA-RARa B. Ενδιάµεση Πρόγνωση +8 σπάνια 10% FLT3ITD 28% Φυσιολογικός καρυότυπος FLT3ITD 34% -Y MLLITD 10% +6 FLT3ITD 20-30% Γ. Μη Ευνοϊκή Πρόγνωση Ανωµαλία 11q23 >50% 5-7% MLL Ποικιλίες t(4;11)q21q23 MLL/AF4 t(9;11)p22q23 7% MLL/AF9 t(11;19)q23p13.1 MLL/ELL t(11;19)q23p13.3 MLL/ENL t(6;9)p23q34 1% DEK/CAN t(3;3)q21q26 3% 3-5% Ribophorin/ EVI1 5del / (5q) <10% 45 έτη, >10% >45έτη 7del / (7q) 10% <10% 45 έτη, >10% >45έτη FLT3ITD 17% MDR FLT3ITD 0% MDR FLT3ITD 7% 37

2.6. Ταξινόµηση της ΟΜΛ Tα δύο πιο συχνά χρησιµοποιούµενα σχήµατα ταξινόµησης για την ΟΜΛ είναι το παλαιότερο French-American-British (FAB) σύστηµα και το νεότερο σύστηµα της Παγκόσµιας Οργάνωσης Υγείας (ΠΟΥ) - World Health Organization (WHO). Παρόλο που η ταξινόµηση κατά ΠΟΥ µπορεί να είναι ευχερέστερη, η ταξινόµηση κατά FAB χρησιµοποιείται ευρέως ακόµη και σήµερα. 2.6.1. Ταξινόµηση κατά FAB Το σύστηµα ταξινόµησης κατά FAB, που προτάθηκε από οµάδα επιστηµόνων από τη Γαλλία, την Αµερική και τη Μεγάλη Βρετανία, διαιρεί την ΟΜΛ σε 8 υπότυπους, Μ 0 έως Μ 7 (πίνακας 2), βασιζόµενο στη µορφολογία των λευχαιµικών κυττάρων του περιφερικού αίµατος και του µυελού των οστών καθώς επίσης και στο βαθµό ωριµότητάς τους 47. Οι τέσσερις πρώτοι τύποι (Μ 0, Μ 1, Μ 2, Μ 3 ) χαρακτηρίζουν λευχαιµίες της κοκκιώδους σειράς, ενώ διαφέρουν ως προς το βαθµό διαφοροποίησής τους. Η Μ 4 σχετίζεται µε την κοκκιοκυτταρική και τη µονοκυτταρική σειρά. Η Μ 5 προέρχεται κυρίως από τη µονοκυτταρική σειρά. Η Μ 6 προέρχεται από την ερυθρά σειρά και η Μ 7 έχει κυρίως µεγακαρυοκυτταρικά χαρακτηριστικά. Η Μ 0, Μ 1 και Μ 2 καλύπτουν το 50% των ΟΜΛ, η Μ 4 το 25%, η Μ 3 το 10%, η Μ 5 το 10%, η Μ 6 το 5% και η Μ 7 µόλις το 3% (πίνακας 3). Πίνακας 2 : Ταξινόµηση της ΟΜΛ κατά FAB 48. Κατηγορίες Μ0 Μ1 Μ2 Μ3 Μ4 Μ5 Μ6 Μ7 Ονοµατολογία Οξεία µυελοβλαστική λευχαιµία χωρίς ωρίµανση Οξεία µυελοβλαστική λευχαιµία µε ελάχιστη ωρίµανση Οξεία µυελοβλαστική λευχαιµία µε ωρίµανση Οξεία προµυελοκυτταρική λευχαιµία Οξεία µυελοµονοκυτταρική λευχαιµία Οξεία µονοκυτταρική λευχαιµία Οξεία ερυθρολευχαιµία Οξεία µεγακαρυοβλαστική λευχαιµία 38

Πίνακας 3: Ποσοστά ενηλίκων ασθενών µε ΟΜΛ και πρόγνωση σε σχέση µε τον υπότυπο 48. Υπότυπος FAB Όνοµα % ενηλίκων µε ΟΜΛ Πρόγνωση της ΟΜΛ Μ0 Αδιαφοροποίητη ΟΜΛ 7% Πτωχή Μ1 Μυελοβλαστική λευχαιµία 15% Ενδιάµεση µε ελάχιστη ωρίµανση Μ2 Μυελοβλαστική λευχαιµία 25% Καλή µε ωρίµανση Μ3 Προµυελοκυτταρική 10% Άριστη λευχαιµία Μ4 Μυελοµονοκυτταρική 20% Ενδιάµεση λευχαιµία Μ4 eos Μυελοµονοκυτταρική 5% Καλή λευχαιµία µε ηωσινοφιλία Μ5 Μονοκυτταρική λευχαιµία 10% Ενδιάµεση Μ6 Ερυθρολευχαιµία 5% Πτωχή Μ7 Μεγακαρυοβλαστική λευχαιµία 3% Πτωχή Μ 0 Το βλαστικό κύτταρο είναι σχεδόν αδιαφοροποίητο, όπως φαίνεται στο κοινό µικροσκόπιο και µε τη χρήση ιστοχηµικών χρώσεων. Η ταυτοποίηση του λευχαιµικού κυττάρου γίνεται µε τον καθορισµό ειδικών αντιγόνων της µυελικής σειράς στην επιφάνειά του, µε τη χρήση της κυτταροµετρίας ροής (ανοσοφαινότυπος). H µυελοϋπεροξειδάση (MPO) είναι αρνητική είτε ασθενώς θετική (dim) 2-10%. Η Μ 0 έχει κυτταροπλασµατικό CD13 θετικό και συχνά επιφανειακά CD13, CD117, CD33 θετικά, ενώ µπορεί να εκφράζεται ασθενώς CD7 ή Tdt και σπάνια CD10. Συνήθως, είναι CD34 θετική. Υπάρχουν πολλαπλές καρυοτυπικές ανωµαλίες 49. Μ 1 Χαρακτηρίζει την ΟΜΛ µε βλαστικά κύτταρα µορφολογικά αδιαφοροποίητα ή λίγο διαφοροποιηµένα. Σπανίως υπάρχουν µικρά αζουρόφιλα κοκκία. Σπάνια είναι και τα ραβδία Auer. Περίπου 10% των κυττάρων παρουσιάζουν ωρίµανση προς την προµυελοκυτταρική σειρά. Χρειάζονται κυτταροχηµικές χρώσεις για να διαφοροδιαγνωσθεί η µορφή αυτή από την L 2 µορφή της Οξείας Λεµφογενούς Λευχαιµίας (ΟΛΛ). Τουλάχιστον το 3% των Μ 1 κυττάρων είναι θετικά στην 39

υπεροξειδάση. Περισσότερα θετικά κοκκία στην υπεροξειδάση (MPO) µπορούµε να δούµε µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο.η ειδική εστεράση για την κοκκιοκυτταρική σειρά naphthol AS-D chloroacetate, µπορεί να είναι θετική. Ανοσοφαινοτυπικά χαρακτηρίζεται από CD13 (+), CD33 (+), CD34 (+), HLA- DR (+), Tdt (++), CD15 (-), CD14 (+/-). Καρυοτυπικές ανωµαλίες που σχετίζονται µε τη µορφή αυτή είναι : t (9; 22), +21, +8, -5 ή 5q- 49. Μ 2 Τα βλαστικά κύτταρα της Μ 2 διαφέρουν σαφώς από αυτά της Μ 1, ως προς την ωρίµανση. Μυελοβλάστες µε αζουρόφιλα κοκκία και προµυελοκύτταρα αποτελούν το 50% των εµπύρηνων κυττάρων, ενώ τα προγονικά κύτταρα της µονοκυτταρικής σειράς είναι λιγότερα από το 20%. Η αντίδραση υπεροξειδάσης είναι έντονα θετική, ενώ η αντίδραση εστεράσης είναι αρνητική στα περισσότερα κύτταρα. Ανοσοφαινοτυπικά παρουσιάζει : CD13 (+), CD33 (+), CD15 (+), HLA- DR (+), TdT (-), CD34 (-) και µερικές φορές συνεκφράζεται το CD19. Οι συχνότερες γενετικές ανωµαλίες που συναντώνται στη Μ 2, είναι η t (6; 9) (p23: q34) και η t (8; 21) (q22; q22) µε συµµετέχον ογκογονίδιο το AML/ETO. Ο τύπος Μ 2 µε την αντιµετάθεση t(8;21) µπορεί να εκφράζει ασθενώς CD19 ή και να συνεκφράζει CD34/CD56. Υπάρχει επίσης, τύπος Μ 2 µε απουσία έκφρασης µυελικών δεικτών CD13, CD33 στην επιφάνεια και στο κυτταρόπλασµα αλλά µε έκφραση MPO και CD117, ο οποίος θεωρείται ο πλέον ειδικός µυελικός δείκτης 49. Μ 3 Η οξεία προµυελοκυτταρική λευχαιµία αναγνωρίζεται εύκολα από την κυριαρχία των προµυελοκυττάρων (περισσότερα από 50%), πολλά από τα οποία περιέχουν µεγάλα αζουρόφιλα και ροδόχροα ή πορφυρά κοκκία. Τα ραβδία Auer είναι άφθονα. Ευκαιριακά, µπορεί να είναι συγκεντρωµένα σε σωρούς (κύτταρα Fagot). Η καταστροφή των κυττάρων κατά την προετοιµασία των πλακιδίων είναι συχνή, µε αποτέλεσµα να υπάρχει ένα υπόστρωµα κοκκίων και ραβδίων Auer. Η αντίδραση χλωροοξεικής εστεράσης είναι εντονότατα θετική. Μια µορφολογική ποικιλία της Μ 3, η Μ 3v (microgranular variant) εµφανίζει δίλοβους, πολύλοβους ή νεφροειδείς πυρήνες και ελάχιστα ή καθόλου κυτταροπλασµατικά κοκκία. Αυτή η επονοµαζόµενη µικροκοκκιώδης ποικιλία της οξείας προµυελοκυτταρικής λευχαιµίας, έχει τα ίδια κλινικά και κυτταρογενετικά χαρακτηριστικά, όπως η υπερκοκκιώδης. 40