ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Γ.Ο. ΔΗΜΗΤΡΑΚΟΠΟΥΛΟΣ Επιδημιολογική μελέτη πολυανθεκτικών στελεχών Staphylococcus που απομονώνονται από ενδονοσοκομειακές λοιμώξεις ασθενών ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Χριστίνα Μπαρτζάβαλη-Λουκή BSc (Hons) Microbiology Πάτρα 2003

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Γ.Ο. ΔΗΜΗΤΡΑΚΟΠΟΥΛΟΣ Επιδημιολογική μελέτη πολυανθεκτικών στελεχών Staphylococcus που απομονώνονται από ενδονοσοκομειακές λοιμώξεις ασθενών ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Χριστίνα Μπαρτζάβαλη-Λουκή BSc (Hons) Microbiology Πάτρα 2003 2

Στον Πέτρο και στον Αντώνιο 3

Η διατριβή αυτή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας του Ιατρικού Τμήματος του Πανεπιστημίου Πατρών. Η επταμελής εξεταστική επιτροπή είναι: 1. κ. Δημητρακόπουλος Ο. Γεώργιος, Καθηγητής (επιβλέπων καθηγητής) 2. κ. Σπηλιοπούλου-Σδούγκου Ίρις, Επίκουρος καθηγήτρια (μέλος τριμελούς επιτροπής) 3. κ. Χριστοφίδου Μυρτώ, Επίκουρος καθηγήτρια (μέλος τριμελούς επιτροπής) 4. κ. Αναστασίου Δ. Ευάγγελος, Καθηγητής 5. κ. Σκουτέλης Αθανάσιος, Καθηγητής 6. κ. Παληογιάννη Φωτεινή, Επίκουρος καθηγήτρια 7. κ. Κολονίτσιου Φεβρονία, Λέκτορας 4

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ 9 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 11 1. ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ 12 2. ΚΑΤΑΤΑΞΗ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ 14 3. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ 15 3.1. Γενικά 15 3.2. Staphylococcus aureus 3.2.1. Έλυτρο 16 3.2.2. Πρωτεϊνες Επιφανείας 16 3.2.3. Ένζυμα και Τοξίνες 17 3.3. Staphylococcus epidermidis 19 3.3.1. Μη ειδική προσκόλληση 19 3.3.2. Ειδική προσκόλληση 19 3.3.3. Παραγωγή slime 20 3.4. Staphylococcus saprophyticus 21 3.5. Άλλα είδη πηκτάση-αρνητικών σταφυλόκοκκων 22 4. ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΙΚΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ 24 5. ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ ΑΠΟ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΟΥΣ 26 5.1. Γενικά χαρακτηριστικά των λοιμώξεων 26 5.2. Ειδικές λοιμώξεις 26 5.2.1. Βακτηριαιμία 26 5.2.2. Ενδοκαρδίτιδα 27 5.2.3. Σύνδρομο Τοξικής Καταπληξίας 28 5.2.4. Εντεροκολίτιδα 28 5.2.5. Τροφική Δηλητηρίαση 29 5.2.6. Πνευμονία 29 5.2.7. Οστεομυελίτιδα 29 5.2.8. Λοιμώξεις του ουροποιητικού συστήματος 30 5.2.9. Λοιμώξεις αρθρώσεων με προσθετικά υλικά 30 5.2.10. Λοιμώξεις ενδοφλέβιων καθετήρων 30 5

6. ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ 32 6.1. Ιστορία των αντιμικροβιακών ουσιών 32 6.2. Μηχανισμοί δράσης των αντιμικροβιακών ουσιών 32 6.3. Αντιμικροβιακή αντοχή 33 6.4. β-λακταμικά αντιβιοτικά 35 6.4.1. Γενικά 35 6.4.2. Μηχανισμός δράσης β-λακταμικών αντιβιοτικών 36 6.4.3. Πενικιλλίνες 38 6.4.4. Κεφαλοσπορίνες 39 6.4.5. Βανκομυκίνη 40 6.5. Άλλα αντισταφυλοκοκκικά αντιβιοτικά 41 6.5.1. Αμινογλυκοσίδες 41 6.5.2. Μακρολίδες 42 6.5.3. Σουλφοναμίδες 44 6.5.4. Co-trinoxazole 44 6.5.5. Κινολόνες 45 7. ΑΝΤΟΧΗ ΤΩΝ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ ΣΤΑ Β-ΛΑΚΤΑΜΙΚΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ 7.1. Β-λακταμάσες 46 7.1.1. Εισαγωή, Ταξινόμηση, Βιοχημική ταυτότητα 46 7.1.2. Γενετική ρύθμιση της παραγωγής των β-λακταμασών 47 7.1.3. Πλασμίδια β-λακταμάσης 48 7.1.4. Τρανσποζόνια 49 8. ΑΝΤΟΧΗ ΤΩΝ ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΩΝ ΣΤΗ ΜΕΘΙΚΙΛΛΙΝΗ 49 8.1. Λειτουργική ικανότητα της PBP2a 52 8.2. Ετερογενής έκφραση αντοχής στην μεθικλλίνη 53 8.3. Χρωμοσωμικά γονίδια που επηρεάζουν τα επίπεδα αντοχής στην μεθικιλλίνη 54 8.4. Εξωγενείς παράγοντες που επηρεάζουν τα επίπεδα αντοχής στην μεθικιλλίνη 55 8.5. Οριακή αντοχή στην μεθικιλλίνη 55 9. ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΚΑΙ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ 57 10. ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΑΚΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ 61 10.1. Γενικά 10.2. Ταξινόμηση μεθόδων Τυποποίησης 64 10.2.1. Φαινοτυπικές Τεχνικές 64 10.2.1 α. Βιότυπος 64 10.2.1 β. Μέθοδοι ευαισθησίας στα αντιβιοτικά 65 10.2.1 γ. Καψική τυποποίηση (Capsular typing) 67 6

10.2.1 δ. Βακτηριοφαγική τυποποίηση-λυσίτυπος (Phage typing) 67 10.2.1 ε. Ανοσοαποτύπωση ή Πρωτεϊνοτυπία με Western Blott (immunoblotting) 68 10.2.1 στ. Πολυτοπική ενζυμική ηλεκτροφόρηση (Multilocus enzyme electrophoresis) 68 10.2.2. Γονοτυπικές Τεχνικές 69 10.2.2 α. Πλασμιδιακή ανάλυση 70 10.2.2 β. Ανάλυση χρωμοσωμικού DNA μετά από επίδραση περιοριστικής ενδονουκλεάσης (REA)71 10.2.2 γ. Συστήματα τυποποίησης με βάση την PCR 71 10.2.2 δ. Υβριδισμός κατά Southern με πολυμορφικούς DNA-ανιχνευές 73 10.2.2 ε. Ριβοτυπία (Ribotyping) 74 10.2.2 στ. Δυαδική τυποποίηση στελεχών με ειδικούς σε στελέχη DNA-ανιχνευές 74 10.2.2 ζ. Ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο (PFGE) 76 10.2.2 η. Τυποποίηση πολυτοπικού προσδιορισμού αλληλουχίας (Multilocus sequence typing) 78 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 80 I. ΣΤΕΛΕΧΗ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ 81 ΙΙ. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΥ 86 Α. Ταυτοποίηση στελεχών σε επίπεδο είδους 86 Β. Έλεγχος παραγωγής slime 88 Γ. Έλεγχος ευαισθησίας στα χημειοθεραπευτικά 89 Δ. Έλεγχος παραγωγής β-λακταμάσης 100 Ε. Έλεγχος ευαισθησίας στη σπεκτινομυκίνη 100 III. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΓΟΝΟΤΥΠΟΥ 101 Α. Παρασκευή χρωμοσωμικού DNA 101 Β. Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης 104 Γ. Μέθοδοι ηλεκτροφόρησης 110 Δ. Ένζυμα περιορισμού 115 Ε. Μέθοδοι μεταφοράς σε μεμβράνη 118 ΣΤ. Υβριδισμός 120 Ζ. Σχεδιασμός των ανιχνευτών meca, Tn554 και mure 125 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 134 I. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΣΤΕΛΕΧΩΝ 135 ΙΙ. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΥ 137 7

Α. Βιότυποι 137 Β. Παραγωγή slime 137 Γ. Έλεγχος ευαισθησίας 139 Δ. Παραγωγή β-λακταμάσης 143 ΙΙΙ. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΓΟΝΟΤΥΠΟΥ 145 Α. Ορισμοί 145 Β. Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης 145 Γ. Υβριδισμός 151 Δ. Ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο 160 Ε. Κλώνοι των MRSA 161 ΣΤ. Κλώνοι των MR-CNS 164 Ζ. Υβριδισμοί SmaI-τμημάτων χρωμοσωμικού DNA με ειδικούς DNA-ανιχνευτές 165 Η. Συσχετισμός κλώνων με κλινικά δείγματα και ασθενείς από διαφορετικές κλινικές στο ΠΠΓΝΠ 165 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 188 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 203 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 225 SUMMARY 227 8

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Τα ανθεκτικά στη μεθικιλλίνη στελέχη σταφυλοκόκκου παραμένουν ένα σοβαρό πρόβλημα στις ενδονοσοκομειακές λοιμώξεις παγκοσμίως, εξαιτίας της πολλαπλής αντοχής και της ικανότητάς τους να διασπείρονται πολύ γρήγορα μέσα σε νοσηλευτικά ιδρύματα προκαλώντας υψηλή νοσηρότητα και θνητότητα. Ιδιότητα των στελεχών αυτών είναι η τάση που έχουν να συγκεντρώνουν επιπλέον στοιχεία γενετικού υλικού που φέρουν γονίδια αντοχής σε αντιβιοτικά και τα οποία δεν προέρχονται μόνον από στελέχη του ιδίου γένους. Επιδημίες παρατηρούνται ιδιαίτερα σε Μονάδες Εντατικής Θεραπείας ενηλίκων και νεογνών, σε Μονάδες Μεταμόσχευσης και Χειρουργικές Μονάδες. Σκεφθήκαμε και προσπαθήσαμε να συλλάβουμε το θέμα αυτό σε μια δυναμική εξελικτική διαδικασία, μελετώντας την επιδημιολογία πολυανθεκτικών στελεχών σταφυλοκόκκου που απομονώθηκαν από κλινικά δείγματα ασθενών του Περιφερειακού Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών, με μοριακές τεχνικές. Η μελέτη οργανώθηκε και πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας του Ιατρικού Τμήματος Πανεπιστημίου Πατρών και καλύφθηκε οικονομικά από το πρόγραμμα «Καραθεωδορή υπ αριθμόν 1953». Η σημαντική εμπειρία και η μακρόχρονη έρευνα του επιβλέποντος Καθηγητή Μικροβιολογίας Γ. Δημητρακόπουλου σε συνδυασμό με την εξειδίκευση της Επίκουρου καθηγήτριας Ι. Σπηλιοπούλου στις μοριακές τεχνικές, καθώς και το προσωπικό μου ενδιαφέρον, μας οδήγησαν στην επιλογή του συγκεκριμένου αντικειμένου μελέτης. Μέσα από αυτές τις γραμμές θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου σε όσους στάθηκαν συμπαραστάτες στην προσπάθειά μου αυτή: 9

Στον επιβλέποντα Καθηγητή Μικροβιολογίας Γ.Ο. Δημητρακόπουλο, όχι μόνο για την αμέριστη συμπαράσταση και επιστημονική καθοδήγηση σε όλες της φάσεις της μελέτης αλλά κυρίως γιατί με τίμησε ιδιαίτερα με την ανάθεση του θέματος. Επίσης, τον ευχαριστώ για την εμπιστοσύνη που μου παρείχε κατά το διάστημα της μελέτης, και κυρίως γιατί μου μετέδωσε την γνώση και την εμπειρία του στην Μικροβιολογία. Στην Επίκουρο καθηγήτρια Ι. Σπηλιοπούλου για την βοήθειά της στο πειραματικό μέρος της μελέτης, η εργαστηριακή πείρα και η επιστημονική κατάρτιση της οποίας με βοήθησαν ουσιαστικά. Επίσης, την ευχαριστώ για τον πολύτιμο χρόνο που αφιέρωσε στην κριτική διόρθωση και επιμέλεια του κειμένου. Στην Επίκουρο καθηγήτρια Μ. Χριστοφίδου για την συνεχή παρακολούθηση της πορείας αυτής της μελέτης αλλά και την αμέριστη υπομονή και συμπαράστασή της που οδήγησαν στην ολοκλήρωση αυτής της διατριβής. Την ευχαριστώ θερμά για την βοήθειά της στην κριτική διόρθωση του κειμένου. Στον Καθηγητή Ε. Αναστασίου του οποίου το συνεχές ενδιαφέρον σε συνδυασμό με την πολύχρονη εμπειρία του στο θέμα της μελέτης, στάθηκαν σημαντικά. Τον ευχαριστώ θερμά για την βοήθεια και την άριστη συνεργασία του κατά την διάρκεια αυτής της μελέτης. Στην Επίκουρο καθηγήτρια Φ. Παλιογιάννη για τις χρήσιμες υποδείξεις της αλλά και τη συνεχή παρακολούθηση της πορείας αυτής της διατριβής. Στην Λέκτορα Φ. Κολονίτσιου για την αμέριστη συμπαράστασή της αλλά και τις χρήσιμες υποδείξεις της σε όλη την πορεία αυτής της διατριβής. Στους συναδέλφους μου, κ. Γ. Λαγουμιντζή και κ. Σ. Μπούμπαλη που μαζί αφιερώσαμε πολλές ώρες στο ερευνητικό εργαστήριο. Θα ήθελα να τους ευχαριστήσω θερμά, αφού η συνεργασία μαζί τους ήταν όχι μόνον άριστη αλλά και ευχάριστη. Στην κ. Κ. Μητροκόντη για την άριστη συνεργασία της καθώς και τις χρήσιμες υποδείξεις της στον υπολογιστή. Η διατριβή αυτή πιθανόν δεν θα είχε ξεκινήσει, αλλά και θα ήταν πολύ δύσκολο να ολοκληρωθεί χωρίς την βοήθεια των γονέων μου και ιδιαίτερα του συζύγου μου Πέτρου, οι οποίοι όλα αυτά τα χρόνια με στήριξαν ηθικά και συναισθηματικά. Σε αυτούς τους αγαπημένους μου ανθρώπους αφιερώνω την διατριβή αυτή, ως μικρό δείγμα της ευγνωμοσύνης μου. 10

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 11

1. Iστορική Αναδρομή Η ονομασία Staphylococcus εισήχθηκε για πρώτη φορά από τον Sir Alexander Ogston, το 1883, για να περιγράψει σφαιρικά βακτήρια τα οποία σχηματίζουν αθροίσματα (σωρούς) που μοιάζουν με τσαμπιά από σταφύλια. Μετά από μια σειρά κλινικών και εργαστηριακών μελετών περιέγραψε την σταφυλοκοκκική λοίμωξη Ogston 1883. O Rosenbach, το 1884, διαχωρίζει τους σταφυλόκοκκους σε παθογόνους (S. aureus) και μη παθογόνους (S. epidermidis) Rupp et al., 1994. Τα δυο είδη διαχωρίζονται μεταξύ τους από την ικανότητα των παθογόνων στελεχών να προκαλούν πήξη του πλάσματος. Η ορολογική ταξινόμηση προτάθηκε για πρώτη φορά το 1902, από τους Kolle και Otto, που ανέφεραν ότι με μεθόδους αιματοσυγκόλλησης ήταν δυνατό να διακριθούν τα παθογόνα από τα μη παθογόνα στελέχη Kolle and Otto 1902. Ο Loeb το 1903, αποδεικνύει ότι ο S. pyogenes aureus προκαλεί πήξη του πλάσματος μέσα σε μερικές ώρες, ενώ ο S. epidermidis albus δεν είχε αυτή την ικανότητα Loeb et al., 1903. Οι Menkin και Walston το 1935, απέδειξαν ότι υπεύθυνη για την σταφυλοκοκκική οργανική βλάβη, ήταν μια τοξίνη και όχι η πηκτάση. Ο Duthie (1954) απέδειξε ότι υπήρχαν δυο μορφές σταφυλοκοκκικής πηκτάσης: συνδεδεμένη πηκτάση (clumping factor ή bound coagulase) και ελεύθερη πηκτάση (free coagulase) Duthie et al., 1954. Οι Wilson και Stuart Wilson et al., 1965 αναφέρουν λοιμώξεις χειρουργικών τραυμάτων από πηκτάση αρνητικούς σταφυλόκοκκους. 12

To 1956, οι Knight, White, Foster, και Wenzel, απέδειξαν ότι οι νοσηλευόμενοι ασθενείς ήταν σε υψηλότερο ποσοστό φορείς S. pyogenes, σε σχέση με τον υπόλοιπο πληθυσμό και ότι το ποσοστό αυτό αυξάνονταν ανάλογα με τη διάρκεια παραμονής τους στο νοσοκομείο. Η θέση αποικισμού ήταν η ανώτερη αναπνευστική οδός και ο μικροοργανισμός πολλαπλασιάζεται χωρίς καμία διείσδυση στους ιστούς. Οι σουλφοναμίδες ήταν τα μοναδικά αποτελεσματικά φάρμακα για την αντιμετώπιση σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων στον άνθρωπο Domagk 1937, μέχρι την κλινική χρήση της πενικιλίνης το 1941. Πολύ γρήγορα μετά από την εισαγωγή της πενικιλίνης στη κλινική πράξη, απομονώθηκαν στελέχη ανθεκτικά στο αντιβιοτικό τα οποία είχαν την ικανότητα παραγωγής β-λακταμάσης. Μεταξύ των πρώτων πειραμάτων για την απομόνωση των ανθεκτικών στην πενικιλλίνη σταφυλοκόκκων, ήταν η τεχνική του Lederberg (1952). Σύμφωνα με την οποία, όταν ένας φαινοτυπικά ευαίσθητος πληθυσμός αναπτύσσονταν σε θρεπτικό υλικό άγαρ χωρίς αντιβιοτικό και μετά εμβολιαζόταν μέσα σε θρεπτικό υλικό άγαρ που περιείχε πενικιλλίνη, οι αποικίες που αναπτύσσονταν ήταν οι μεταλλαγμένοι ανθεκτικοί κλώνοι. Το 1960 αρχίζει η θεραπευτική χρήση των ημισυνθετικών πενικιλλινών (oxacillin, methicillin, nafcillin κλπ.), σε λοιμώξεις από στελέχη S. aureus που παρήγαγαν β- λακταμάσες. Το 1961 απομονώθηκαν τα πρώτα ανθεκτικά στη μεθικιλλίνη στελέχη S. aureus (MRSA) στην Αγγλία Jevons, 1961. Ακολούθησαν μελέτες που περιέγραψαν την διασπορά επιδημικών MRSA στελεχών τόσο στην Αγγλία, όσο και στην υπόλοιπη Ευρώπη αλλά και Ασία, Αμερική, Αυστραλία Pavillard et al., 1982. Το ποσοστό απομόνωσης MRSA στελεχών ποικίλει στις διάφορες περιοχές Cookson et al., 1988. Τα πρώτα αυτά στελέχη, ήταν ανθεκτικά μόνον στα β-λακταμικά αντιβιοτικά, χωρίς να έχουν ταυτοποιηθεί ακόμη πολυανθεκτικά MRSA στελέχη Catalano et al., 1989. Επίσης δεν φαίνεται να είχαν αυξημένη λοιμογόνο ικανότητα σε σχέση με τα ευαίσθητα στη μεθικιλλίνη στελέχη S. aureus. Κατά την διάρκεια της δεκαετίας του 1970 παρατηρείται μια ύφεση της συχνότητας των λοιμώξεων που οφείλονται σε στελέχη MRSA Casewell, 1986. Στην επόμενη δεκαετία όμως και μέχρι σήμερα καταγράφονται επιδημίες οφειλόμενες σε πολυανθεκτικά στελέχη MRSA στα νοσοκομεία διαφόρων χωρών Mulligan et al., 1993. Το πρόβλημα που ανακύπτει με τα νέα αυτά στελέχη είναι ότι εμφανίζουν αντοχή σε ένα ευρύ φάσμα χημειοθεραπευτικών, με αποτέλεσμα σε πολλές 13

περιπτώσεις να παραμένουν ως μόνη θεραπευτική λύση τα γλυκοπεπτίδια Sanyal et al., 1991. Παράλληλα με την έξαρση των ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων που οφείλονται σε MRSA στελέχη, εμφανίζονται με αυξανόμενη συχνότητα και λοιμώξεις που οφείλονται σε πηκτάση-αρνητικούς σταφυλόκοκκους. Η χρήση ενδοφλέβιων καθετήρων και προσθετικών υλικών στην κλινική πράξη έχει ως αποτέλεσμα την απομόνωση στελεχών S. epidermidis όπως επίσης S. hominis και S. haemolyticus από τους καθετηριασμένους ασθενείς. Πολλά από τα στελέχη αυτά εμφανίζονται ανθεκτικά στη μεθικιλλίνη και σε άλλα αντιβιοτικά Archer, 1988. Η καταγραφή και η επιδημιολογική μελέτη των MRSA, πολυανθεκτικών στελεχών καθώς και των πηκτάση-αρνητικών πολυανθεκτικών στελεχών σταφυλοκόκκων καθίσταται απαραίτητη στην αντιμετώπιση των επιδημιών και των εξάρσεων των ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων που προκαλούν. 2. Κατάταξη των Σταφυλοκόκκων Οι σταφυλόκοκκοι είναι Gram θετικοί κόκκοι, διαμέτρου 0.5 έως 1.5 μm περίπου, ακίνητοι που ανήκουν στην οικογένεια Micrococcaceae. Η οικογένεια Micrococcaceae περιλαμβάνει τα γένη Staphylococcus και Micrococcus. Ο διαχωρισμός των δυο γενών βασίζεται στην αναερόβια διάσπαση της γλυκόζης. Οι σταφυλόκοκκοι διασπούν τη γλυκόζη αεροβίως και αναεροβίως, ενώ οι μικρόκοκκοι τη διασπούν μόνο αεροβίως Δημητρακόπουλος, 1987. Η κατάταξη των σταφυλόκοκκων βασίζεται σήμερα στην ταξινόμηση των Kloos και Schleifer (1975) και περιλαμβάνει 34 είδη, που διαχωρίζονται μεταξύ τους από τις βιοχημικές τους ιδιότητες. Ο S. aureus αποτελεί το κύριο παθογόνο μικροοργανισμό με δεύτερο κατά σειρά συχνότητας τον S. epidermidis, που μαζί με όλα τα υπόλοιπα είδη σταφυλόκοκκων είναι γνωστοί ως πηκτάση-αρνητικοί σταφυλόκοκκοι (Coagulase Negative Staphylococcus-CNS). Οι σταφυλόκοκκοι βρίσκονται στον αέρα και το έδαφος, απομονώνονται από τα θηλαστικά και αποικίζουν το δέρμα και τους βλεννογόνους του ανθρώπου σε 14

συγκεντρώσεις πάνω από 10 4-10 6 cfu/cm 2 Noble και Pitcher, 1978. Μερικά είδη βρίσκονται μόνο σε ζώα ενώ κάποια άλλα είδη αποικίζουν συγκεκριμένες ανατομικές περιοχές του ανθρώπου. Ο S. aureus αποικίζει κυρίως τις ρινικές κοιλότητες και το δέρμα Weinstein, 1959. Ο S. epidermidis απομονώνεται συνήθως από μεγάλο εύρος ανατομικών θέσεων, όπως οι βλεννογόνοι, η βουβωνική και η μασχαλιαία περιοχή, το δέρμα και αποτελεί το 65-90% όλων των σταφυλόκοκκων της μικροβιακής χλωρίδας Δημητρακόπουλος, 1987. Όλα τα είδη αναπτύσσονται εύκολα στα κοινά θρεπτικά υλικά, σε αερόβιες συνθήκες και στους 37C, αν και η ανάπτυξή τους είναι δυνατή σε θερμοκρασίες που κυμαίνονται από 12-45C. Έχουν επίσης την ικανότητα να αναπτύσσονται σε υλικά που περιέχουν 7.5-10% NaCl. 3. Χαρακτηριστικές ιδιότητες 3. 1)Γενικά Τα Gram-θετικά βακτήρια έχουν πολλές χαρακτηριστικές ιδιότητες που τα διαχωρίζουν από τα Gram-αρνητικά. Το κυτταρικό τους τοίχωμα αποτελείται από μια στοιβάδα πεπτιδογλυκάνης (μουκοπεπτίδιο), τεϊχοικά οξέα ενώ απουσιάζει ο λιποπολυσακχαρίτης όπως έχει χαρακτηρισθεί στα Gram-αρνητικά βακτήρια. Αυτά τα χαρακτηριστικά της δομής του κυτταρικού τοιχώματος είναι υπεύθυνα για την χρώση τους κατά Gram. Τα Gram-θετικά βακτηριακά κύτταρα εγκλωβίζουν το σύμπλοκο κρυσταλλικού ιώδους-ιωδιούχου καλίου στο κυτταρικό τους τοίχωμα που έχει δομή πλούσια σε υδατάνθρακες οι οποίοι δεν αποδομούνται από την αιθυλική αλκοόλη που χρησιμοποιείται για τον αποχρωματισμό στην Gram χρώση Δημητρακόπουλος, 1987. Τα γένη των οικογενειών Micrococcaceae και Streptococcaceae διαχωρίζονται με την δοκιμασία παραγωγής της καταλάσης. Το ένζυμο καταλάση βρίσκεται σε όλα τα βακτήρια που έχουν κυτοχρώματα, όπως τα γένη της οικογένειας Micrococcaceae Δημητρακόπουλος, 1987. 15

3.2) Staphylococcus aureus Πολλά στελέχη S. aureus σχηματίζουν αποικίες που έχουν κίτρινο χρώμα για αυτό παλαιότερα χαρακτηρίζονταν ως «Σταφυλόκοκκος ο χρυσίζων». Ο S. aureus έχει αρκετές ιδιότητες που συμβάλλουν στην ικανότητά του να προκαλέσει μια λοίμωξη. Αυτές οι παθογενετικές ιδιότητες δεν βρίσκονται σε όλα τα στελέχη S. aureus. Ο S. aureus, αλλά και αρκετά στελέχη S. epidermidis, παράγουν το ένζυμο δεοξυριβονουκλεάση (DΝΑse). Χαρακτηριστική ιδιότητα του S. aureus είναι η παραγωγή θερμοανθεκτικής DΝΑse, η οποία δεν καταστρέφεται στους 100ºC για 15 λεπτά. Μεταξύ όλων των βακτηρίων μόνον ο S. aureus παράγει θερμοανθεκτική DΝΑse, ενώ η DΝΑse των άλλων βακτηρίων είναι θερμοευαίσθητη και καταστρέφεται μετά από θέρμανση σε θερμοκρασία >44ºC. Η παραγωγή θερμοανθεκτικής DΝΑse από τον S. aureus αποτελεί βασικό κριτήριο για το χαρακτηρισμό του είδους και έχει την ίδια σημασία με την παραγωγή πηκτάσης για την τυποποίηση του S. aureus Δημητρακόπουλος, 1987. 3.2.1. Έλυτρο. Μερικά στελέχη S. aureus παράγουν έναν εξωκυττάριο πολυσακχαρίτη που σχηματίζει γύρω από το βακτηριακό κύτταρο το έλυτρο Δημητρακόπουλος, 1987. Το έλυτρο προστατεύει τα βακτήρια αναστέλλοντας τη φαγοκυττάρωση από πολυμορφοπύρηνα λευκοκύτταρα. Επίσης, συμβάλλει στην προσκόλληση των βακτηρίων σε καθετήρες και άλλα προσθετικά υλικά. Τα κλινικά στελέχη S. aureus έχουν ταξινομηθεί σε οκτώ τύπους με βάση το αντιγόνο του πολυσακχαρίτη του ελύτρου. Οι ορολογικοί τύποι 5 και 8 ευθύνονται για το 75-80% των λοιμώξεων στον άνθρωπο. Τα περισσότερα ανθεκτικά στη μεθικιλλίνη στελέχη S. aureus είναι τύπου 5 [Lee, 1996] ενώ ο τύπος 8 σχετίζεται με άλλες λοιμογόνες ιδιότητες του S. aureus όπως το σύνδρομο τοξικής καταπληξίας [Altemeier et al., 1982]. 3.2.2. Πρωτεΐνες επιφανείας. Το κυτταρικό τοίχωμα των στελεχών S. aureus περιέχει την πρωτεΐνη Α. Το μεγαλύτερο μέρος της πρωτεΐνης αυτής συνδέεται με την πεπτιδογλυκάνη του κυτταρικού τοιχώματος με ομοιοπολικό δεσμό ενώ το υπόλοιπο παραμένει ελεύθερο. Έχει τη μοναδική ιδιότητα να συνδέεται μη ειδικά με το Fc 16

τμήμα των ανοσοσφαιρινών IgG1, IgG2 και IgG4, ενώ έχει αποδειχθεί ότι ορισμένες IgM και IgA2 αντιδρούν επίσης με την πρωτεΐνη Α Δημητρακόπουλος, 1987. Η ένωση της πρωτεΐνης Α με το Fc τμήμα των ανοσοσφαιρινών προκαλεί διάφορα βιολογικά φαινόμενα, όπως π.χ. αναστολή της οψωνικής δράσεως των αντισωμάτων, ελευθέρωση ισταμίνης από τα λευκοκύτταρα και διέγερση των Β λεμφοκυττάρων του ανθρώπου. Πολλές άλλες πρωτεΐνες επιφανείας των σταφυλόκοκκων έχουν δομικά χαρακτηριστικά, που περιλαμβάνουν ένα ελεύθερο αμινο-τελικό άκρο (N-terminal), ένα υδρόφοβο διαμεμβρανικό τμήμα και μια περιοχή πρόσδεσης στο καρβοξυτελικό άκρο. Η τριτοταγής δομή του αμινοτελικού άκρου στην επιφάνεια του βακτηριακού κυττάρου δίνει την ικανότητα σε μερικές από αυτές τις πρωτεΐνες να δρουν ως προσκολλητίνες. Μερικές άλλες επιφανειακές πρωτεΐνες συνδέονται με μόρια της εξωκυττάριας στοιβάδας και έχουν ορισθεί ως στοιχεία μικροβιακής επιφάνειας που αναγνωρίζουν μόρια προσκολλητινών, microbial-surface compoments recognizing adhesive matrix molecules (MSCRAMM). Πιο πρόσφατες μελέτες έχουν αποδείξει το ρόλο των πρωτεϊνών αυτών στην ικανότητα των σταφυλόκοκκων να αποικίζουν τα κύτταρα του ξενιστή. 3.2.3. Ένζυμα και Τοξίνες. Οι σταφυλόκοκκοι παράγουν μεγάλο αριθμό ενζύμων και τοξινών. Πολλά από αυτά χρησιμεύουν για την τυποποίησή τους, πχ. τα ένζυμα καταλάση, πηκτάση. Η πηκτάση είναι ένα εξωκυττάριο ένζυμο που προκαλεί πήξη του πλάσματος του ανθρώπου και διαφόρων ζώων και παράγεται μόνον από στελέχη S. aureus. Εκτός από την ελεύθερη πηκτάση τα περισσότερα στελέχη S. aureus παράγουν και μια άλλη πηκτάση που είναι προσκολλημένη στην επιφάνεια των μικροβιακών κυττάρων και καλείται συνδεδεμένη πηκτάση (bound coagulase). Και οι δύο πηκτάσες συμβάλλουν στην κάλυψη των βακτηρίων με ινώδες, με αποτέλεσμα να γίνονται τα κύτταρα ανθεκτικά στην οψωνινοποίηση και τη φαγοκυττάρωση [Δημητρακόπουλος, 1987]. Η σταφυλοκινάση προκαλεί λύση του ινώδους και η υαλουρονιδάση υδρολύει τον πολυσακχαρίτη που αποτελεί το στρώμα των κυττάρων, με αποτέλεσμα την διασπορά των στελεχών S. aureus στους ιστούς του ξενιστή. Πολλά στελέχη S. 17

aureus παράγουν επίσης λιπάσες όπως η φωσφολιπάση C, που προάγουν την διείσδυση των βακτηρίων στους ιστούς [Δημητρακόπουλος, 1987]. Οι β-λακταμάσες είναι επίσης εξωκυττάρια ένζυμα που παράγονται από τους σταφυλοκόκκους και αδρανοποιούν την πενικιλλίνη και άλλα β-λακταμικά αντιβιοτικά. Οι πενικιλλινοδεσμευτικές πρωτεΐνες είναι ένζυμα που εδράζονται στην κυτταροπλασματική μεμβράνη και καταλύουν την σύνθεση της πεπτιδογλυκάνης του κυτταρικού τοιχώματος. Οι αιμολυσίνες του S. aureus έχουν διάφορες βιολογικές ιδιότητες. Η α- αιμολυσίνη καταστρέφει τα ανθρώπινα πολυμορφοπύρηνα και τα ερυθρά αιμοσφαίρια διαφόρων ειδών ζώων. Έχει επίσης δερμονεκρωτική δράση και δράση νευροτοξίνης. Η β-αιμολυσίνη είναι σφιγγομυελινάση, ενώ οι γ και δ -αιμολυσίνες προκαλούν λύση ερυθρών αιμοσφαιρίων διαφόρων ζώων [Δημητρακόπουλος, 1987]. Οι σταφυλόκοκκοι παράγουν και έναν μεγάλο αριθμό τοξινών που ταξινομούνται με βάση το μηχανισμό δράσης τους. Κυτταροτοξίνες, όπως μια 33 kda πρωτεΐνη, η άλφα τοξίνη, προκαλούν σχηματισμό πόρων και επάγουν αλλαγές στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Οι συνεπαγώμενες κυτταρικές βλάβες συνεισφέρουν σε εκδηλώσεις συνδρόμου σηψαιμίας [Bhakdi et al., 1991]. Τα υπερ-αντιγόνα της πυρετογόνου τοξίνης σχετίζονται δομικά και εμφανίζουν διαφόρου βαθμού ομολογία στην αλληλουχία των αμινοξέων. Η λειτουργία των υπερ-αντιγόνων μέσω σύνδεσης στις πρωτεΐνες του Μείζονος Συστήματος Ιστοσυμβατότητας (major histocompatibility complex, MHC) τάξεως II, προκαλεί εκτεταμένο πολλαπλασιασμό T-λεμφοκυττάρων και απελευθέρωση κυτταροκινών [Marrack et al., 1990]. Αυτές οι εξωκυττάριες πρωτεΐνες που παράγονται από τον σταφυλόκοκκο και έχουν υπερ-αντιγονικές ιδιότητες περιλαμβάνουν τις εντεροτοξίνες που διακρίνονται σε πέντε αντιγονικούς τύπους, A, B, C, D, και E, την τοξίνη TSST-1 και τις επιδερμολυτικές τοξίνες Α και Β. Μόρια εντεροτοξίνης είναι υπεύθυνα για τη τροφική δηλητηρίαση. Συνηθέστερος είναι ο τύπος Α, ενώ μικρός αριθμός στελεχών μπορεί να παράγει ταυτόχρονα τους τύπους Α και Β. Κατάλληλο υπόστρωμα για την ανάπτυξη του μικροοργανισμού και τη σύνθεση εντεροτοξίνης αποτελούν το κρέας, το γάλα και τα γαλακτοκομικά προϊόντα. Παρά τη μικρή ομολογία αλληλουχίας των αμινοξέων της τοξίνης τοξικής καταπληξίας (toxic shock syndrome toxin-1) (TSST-1), είναι δομικά παρόμοια με τις εντεροτοξίνες B και C. Το γονίδιο που κωδικοποιεί την TSST-1, βρίσκεται στο 20% 18

των στελεχών S. aureus [Marrack et al., 1990] και βρίσκεται σε μεταθετή γενετική περιοχή. Αν και τα υπερ-αντιγόνα (SΑgs) που παράγονται από τον σταφυλόκοκκο παίζουν σημαντικό ρόλο στο σηπτικό shock, δεν είναι ακόμη ξεκάθαρο ότι έχουν την ικανότητα από μόνα τους να προκαλέσουν σήψη. Όπως απέδειξε ο Shlievert, η TSST- 1 μόνη της προξενούσε πολύ ήπια συμπτώματα σε πειραματόζωα σε αντίθεση με την σοβαρή κλινική εικόνα του συνδρόμου της τοξικής καταπληξίας [Shlievert et al., 1981]. Επομένως, η σηψαιμία που προκαλείται από τους σταφυλόκοκκους είναι πιθανόν να σχετίζεται με την συνεργική δράση των υπερ-αντιγόνων και άλλων εξωκυττάριων παραγόντων όπως την πεπτιδογλυκάνη και τα λιποτειχοϊκά οξέα. Τοξίνες όπως, οι επιδερμολυτικές τοξίνες Α και Β, προκαλούν απόπτωση της επιδερμίδας και από μελέτες που πραγματοποιήθηκαν αποδείχθηκε ότι η έκθεση σε αυτή την τοξίνη, έχει ως αποτέλεσμα το διαχωρισμό των ενδοκυτταρικών δεσμών της εξωτερικής επιδερμίδας (δεσμοσώματα). Η λευκοκτονίνη προκαλεί την ελευθέρωση ενζύμων από τα λυσοσώματα των λευκών αιμοσφαιρίων. Τα ένζυμα ελευθερώνονται μέσα στο κυτταρόπλασμα και καταστρέφουν τα συστατικά των κυττάρων. Δύο εξωκυττάριες πρωτεΐνες έχουν δράση λευκοκτονίνης, η γ-αιμολυσίνη και η Panton-Valentine λευκοκτονίνη (PVL). 3.3) Staphylococcus epidermidis O S. epidermidis απομονώνεται σε ποσοστό 50-80% από τα κλινικά δείγματα των πηκτάση-αρνητικών σταφυλοκόκκων. Οι λοιμώξεις που προκαλούνται από τον S. epidermidis περιλαμβάνουν την ενδοκαρδίτιδα σε προσθετικές βαλβίδες, λοιμώξεις ενδοφλέβιων καθετήρων, περιτονίτιδα, βακτηριαιμία, οστεομυελίτιδα, λοιμώξεις προσθετικών αρθρώσεων καθώς και λοιμώξεις του ουροποιητικού. Σε αντίθεση με τον S. aureus, δεν έχει την ικανότητα παραγωγής τοξινών και ενζύμων. 3.3.1. Μη ειδική προσκόλληση. Το πρώτο βήμα για την εμφάνιση της λοίμωξης είναι η προσκόλληση του μικροβίου επάνω στην επιφάνεια του ξένου υλικού. Στο πρώτο στάδιο της προσκόλλησης παρεμβαίνουν μη ειδικοί μηχανισμοί, όπως το επιφανειακό φορτίο, η πολικότητα, δυνάμεις Van der Walls και η υδροφοβικότητα [Fleer et al., 1989]. Οι περισσότεροι ερευνητές πιστεύουν ότι στη φάση προσέγγισης του βακτηρίου σ οποιοδήποτε αδρανές υλικό, βασικό ρόλο παίζει η υδροφοβικότητα του μικροβιακού κυττάρου και του βιοϋλικού. Σύμφωνα με την κατάταξη του Martin και 19

συν. [Martin et al., 1989] και τους Schneider and Riley [Schneider and Riley, 1994], στελέχη με υδροφοβικότητα >70% θεωρούνται υψηλώς υδρόφοβα, ενώ εκείνα με υδροφοβικότητα <30% χαρακτηρίζονται ως υψηλά υδρόφιλα. Ο S. epidermidis εκφράζει σχετικά υψηλή επιφανειακή υδροφοβικότητα, η οποία εξαρτάται από την περιεκτικότητα της κυτταρικής επιφάνειας σε πρωτεΐνες (τα πρωτεολυτικά ένζυμα μειώνουν τον υδρόφοβο χαρακτήρα της επιφάνειας), [Vacheethasanee et al., 1998]. Επιπλέον, η εξωτερική επιφάνεια του S. epidermidis φέρει αρνητικό επιφανειακό φορτίο. 3.3.2. Ειδική προσκόλληση. Η ειδική προσκόλληση του S. epidermidis σε επιφάνειες καθετήρων έχει αναφερθεί ότι επιτυγχάνεται με μία πολυσακχαριδική προσκολλητίνη (PS/A: Polysaccharide-adhesin), [Tojo et al., 1988]. H PS/A είναι μεγάλου μοριακού μεγέθους (>500.000 daltons) πολυμερές γαλακτόζης και αραβινόζης, σε αναλογία 1:1 [Mϋller et al., 1993]. Η PS/A φαίνεται ότι αυξάνει τον αποικισμό των βιοϊατρικών υλικών στα πολύ αρχικά στάδια (προσκόλληση μετά από 15 λεπτά επαφής των υλικών με καλλιεργήματα μικροβίων σε ζωμό). Διάφορες μελέτες έχουν δείξει εκτός από τον S. epidermidis ότι ο S. capitis επίσης παράγει PS/A. Είναι γνωστό επίσης ότι ο S. epidermidis έχει την ικανότητα παραγωγής λιπασών, πρωτεασών και αιμολυσινών. 3.3.3. Παραγωγή slime. Μετά την προσκόλληση του βακτηρίου ακολουθεί το δεύτερο βήμα για την εμφάνιση της λοίμωξης το οποίο είναι η παραγωγή slime (ESS: extracellular slime substance), [Fleer et al., 1989; Jansen et al., 1989]. Η παραγωγή και ο ρόλος του slime στην παθογένεια αποτελεί πολυσυζητημένο θέμα το οποίο δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως. Πρώτοι, οι Bοyston και Penny, το 1972, περιέγραψαν την παραγωγή μιας βλεννώδους ουσίας από στελέχη S. epidermidis, και οι περισσότεροι συγγραφείς συνέδεσαν τη λοιμογόνο δύναμη των σταφυλοκόκκων με τη βλεννώδη ουσία. Από μελέτες που έγιναν με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο καθώς και από τον ανοσολογικό έλεγχο των στελεχών S. epidermidis που σχετίζονταν με λοιμώξεις προσθετικών υλικών, αποδείχθηκε ότι αυτά τα βακτήρια παράγουν μια βλεννώδη εξωκυττάρια ουσία (slime) που προάγει την προσκόλληση των βακτηρίων σε πλαστικά υλικά και ότι ο πολυσακχαρίτης είναι εμφανής στα τελικά στάδια της προσκόλλησης, και όχι στην αρχική φάση [Peters et al., 1982]. 20

Επίσης το slime προστατεύει τα βακτήρια από τους αντιμικροβιακούς παράγοντες που χρησιμοποιούνται στην θεραπεία αυτών των λοιμώξεων. Προστατεύει τον μικροοργανισμό από την φαγοκυττάρωση [Kristinsson et al., 1988] και δημιουργεί ένα προστατευτικό μικροβιακό περιβάλλον μέσα στο οποίο επικρατούν άριστες συνθήκες αναπτύξεως του μικροβίου. Υπάρχουν εμφανείς αποδείξεις ότι το slime αντιδρά με τον ξενιστή και με άλλους μηχανισμούς, εκτός από τον ρόλο που διαδραματίζει στο σχηματισμό της βιομεμβράνης. Σημαντικό ρόλο στην προσκόλληση του S. epidermidis στα προσθετικά υλικά και τον σχηματισμό βιομεμβρανών (biofilms) παίζουν και διάφορες πρωτεΐνες επιφανείας του βακτηρίου που έχουν χαρακτηρισθεί ως προσκολλητίνες [Tojo et al., 1988]. Μετά την έκθεση των βιοϊατρικών υλικών στα υγρά του σώματος, όπως αίμα, σίελος ή ούρα, προσροφώνται μακρομοριακά στοιχεία και σχηματίζουν μια «συμβατική μεμβράνη» [Reid et al., 1994; Reid et al., 1998]. Η συμβατική μεμβράνη αποτελεί τη βάση για το σχηματισμό της ώριμης βιομεμβράνης. Τα περισσότερα μακρομόρια που προσροφώνται έχουν πρωτεϊνική σύσταση, όπως αλβουμίνη, ινωδογόνο, κολλαγόνο και φιμπρονεκτίνη. Σύμφωνα με μελέτες που έγιναν στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας και στο Τμήμα Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών [Arvaniti et al., 1994], η χημική ανάλυση του ακατέργαστου εξωκυττάριου προϊόντος (crude slime) έδειξε ότι αποτελείται από μόρια πρωτεϊνών, πεπτιδογλυκανών, υδατανθράκων, νουκλεϊνικών και τειχοϊκών οξέων. Ο επικρατέστερος ουδέτερος μονοσακχαρίτης είναι η γλυκόζη, ενώ σε ένα στέλεχος ανιχνεύθηκε και γαλακτόζη. Η κλασμάτωση του slime έδειξε τη παρουσία πολυσακχαρίτη, διαφόρων πρωτεϊνών και νουκλεϊνικών οξέων. Χημικός χαρακτηρισμός των πολυσακχαριτικών κλασμάτων έδειξε ότι περιέχουν ουδέτερους μονοσακχαρίτες και εξοζαμίνες, οι οποίες έχουν τη δομή της γλυκοζαμίνης. Η μοριακή μάζα του πολυσακχαρίτη προσδιορίστηκε ίση με 2x10 4 (αντιστοιχεί περίπου σε 100-110 μονοσακχαρίτες). Το βασικό συστατικό του πολυσακχαρίτη (60-65% των μακρομορίων του slime που περιέχουν και υδατάνθρακες) είναι ένας θειωμένος, όξινος πολυσακχαρίτης 20 kda, [Karamanos et al., 1995]. Επίσης, περιέχει μία ομοιογενώς φορτισμένη όξινη πεπτιδογλυκάνη (80 kda), ένα πολυσακχαρίτη 12.5 kda, δύο μη ανιοντικούς υδατάνθρακες που είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένοι με πρωτεΐνες (250 και 125 kda), ένα μακρομόριο 60 kda που διασπάται με το πρωτεολυτικό ένζυμο παπαΐνη και τειχοϊκά οξέα [Karamanos et al., 1995]. 21

3.4) Staphylococcus saprophyticus Ανάμεσα στα είδη των πηκτάση-αρνητικών σταφυλοκόκκων ο S. saprophyticus είναι το πιο συχνό αίτιο λοιμώξεων του ουροποιητικού συστήματος σε νέες γυναίκες. Επίσης θεωρείται αίτιο πυελονεφρίτιδας, ουρηθρίτιδας και άλλων ουρολοιμώξεων μετά από καθετηριασμό σε ενήλικες γυναίκες και άνδρες. Μελέτες in vitro έδειξαν ότι ο S. saprophyticus προσκολλάται στα επιθηλιακά κύτταρα της ουρήθρας και των άλλων τμημάτων του ουροποιητικού συστήματος σε πολύ μεγαλύτερους αριθμούς από ότι άλλα είδη σταφυλοκόκκων ενώ δεν προσκολάται σε άλλες ανατομικές επιφάνειες, όπως τα κύτταρα της επιδερμίδας ή τα επιθηλιακά κύτταρα άλλων συστημάτων. 3. 5) Άλλα είδη πηκτάση-αρνητικών σταφυλοκόκκων Τα υπόλοιπα είδη των πηκτάση-αρνητικών σταφυλοκόκκων απαντώνται στον άνθρωπο και στα ζώα, ως μέρος της φυσιολογικής μικροβιακής τους χλωρίδας αλλά και ως λοιμογόνοι παράγοντες. Οι πηκτάση-αρνητικοί σταφυλόκοκκοι, εκτός των S. epidermidis και S. saprophyticus, συνήθως δεν απομονώνονται από σοβαρές λοιμώξεις, αλλά μερικά από αυτά τα είδη έχει αναφερθεί ότι απομονώνονται από φλεγμονές τραυμάτων, λοιμώξεις του ουροποιητικού, βακτηριαιμία και ενδοκαρδίτιδα. Τα είδη που έχουν απομονωθεί σε τέτοιες περιπτώσεις είναι τα εξής: S. haemolyticus, S. hominis, S. warneri, S. simulans, S. schleiferi, S. saccharolyticus, και S. lugdunensis. 22

Σχήμα 1. Δοκιμασίες που εφαρμόζονται για τον διαχωρισμό των ειδών σταφυλοκόκκου. Ουρεάση - S. capitis + S. simulans + νιτρικά + - μαννόζη S. haemolyticus S. cohnii - 23

Ζύμω ση μαννιτόλ ης S. aureus + - S. epiderm idis - νιτρικά Ν οβοβιοσίνη + S. hominis Α μαννόζη Ε S. warneri + - φωσφατάση μαλτόζη + S. capitis S. epiderm idis - Α ναγωγή νιτρικών + - λακτόζη - + S. hom inis S. saprophyticus + - S. cohnii S. saprophyticus ουρεάση + - S. sim ulans S. capitis 4. Παθογένεια Σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων Ο S. aureus έχει ένα ποικίλο οπλοστάσιο δομικών και εξωκυττάριων προϊόντων που συμβάλλουν στην παθογένεια των λοιμώξεων. Αυτά τα στοιχεία δρουν από κοινού ή το κάθε ένα ξεχωριστά. Θεωρητικά υπάρχουν λίγες πληροφορίες για την συνεργασία τους καθώς και την συνεργασία με παράγοντες του ξενιστή για την εξέλιξη της λοιμώξεως. Παρόλο που τα στελέχη S. aureus αποικίζουν την ρινική κοιλότητα, μασχαλιαία περιοχή, φάρυγγα και τραυματισμένες επιφάνειες δέρματος εμφανίζουν και εξαιρετική μολυσματική ικανότητα. Η έναρξη της λοιμώξεως οφείλεται σε λύση της συνέχειας του δέρματος ή του φραγμού των βλεννογόνων με αποτέλεσμα την διείσδυση του σταφυλοκόκκου στους εν τω βάθει ιστούς ή στην κυκλοφορία του αίματος. Η βιολογία του αποικισμού της ρινικής κοιλότητας που αποτελεί και την κύρια δεξαμενή των σταφυλοκόκκων, είναι ακόμα και σήμερα όχι πλήρως κατανοητή. 24

Πολλοί παράγοντες πλην της ανεπάρκειας του ανοσολογικού συστήματος του μεγαλοοργανισμού συμβάλλουν στην αύξηση της ευαισθησίας του ανθρώπου σε μια σταφυλοκοκκική λοίμωξη. Η φυσιολογική λειτουργία της φαγοκυττάρωσης παρουσία μολυσματικού παράγοντα παίζει πρωταρχικό ρόλο στην αντιμετώπιση της μόλυνσης και της εξέλιξής της σε λοίμωξη. Προσθετικά υλικά, όπως οι ενδοφλέβιοι καθετήρες, σύντομα μετά την εφαρμογή τους στους ασθενείς περιβάλλονται από συστατικά του ορού όπως είναι ινωδογόνο. Στα συστατικά αυτά ο σταφυλόκοκκος προσκολλάται με τη βοήθεια εξωκυττάριων πρωτεϊνών του (microbial-surface compoments recognizing adhesive matrix molecules-mscramm), και στη συνέχεια εκφράζει κάποιες γλυκοπρωτεΐνες που υποβοηθούν περαιτέρω την διαδικασία αποικισμού [Cheung et al., 1990]. Έτσι ερμηνεύεται το γεγονός ότι οι ενδοφλέβιοι καθετήρες σχετίζονται με την παθογένεια της βακτηριαιμίας από σταφυλόκοκκο, της ενδοκαρδίτιδας, και άλλων μεταστατικών λοιμώξεων, ή και σηπτικού shock σε νοσοκομειακούς ασθενείς. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα παίζουν βασικό ρόλο στην παθογένεια των σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων, όχι μόνο ως στόχο βλάβης, αλλά και ως μεσάζοντα στην εξέλιξη των ενδο-αγγειακών λοιμώξεων μετά την ενεργοποίησή τους. Οι σταφυλόκοκκοι μετά την ενεργοποίησή τους προσκολλώνται πάνω στα ενδοθηλιακά κύτταρα και συνδέονται με τις προσκολλητίνες τους σε κυτταρικούς υποδοχείς [Vercellotti et al., 1984]. Στην συνέχεια φαγοκυτταρώνονται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα [Ogawa et al., 1985]. Η ενδοκυττάρωση των σταφυλοκόκκων έχει ως συνέπεια την προστασία τους από την ανοσολογική απόκριση του μεγαλοοργανισμού όπως και από τη βακτηριοκτόνο δράση των αντιβιοτικών. Το γεγονός αυτό οδηγεί στην εμφάνιση χρόνιων ή διαλειπουσών λοιμώξεων όπως επίσης μπορεί να σημάνει την έναρξη κυτταρικών λειτουργιών, που οδηγούν στη παραγωγή αδιαφοροποίητων κυττάρων [Ogawa et al., 1985]. Στελέχη σταφυλοκόκκου που προκαλούν ενδοκαρδίτιδα, φαίνεται ότι προσκολλώνται σε τραυματισμένες και μη επιφάνειες βαλβίδων και ότι είναι ανθεκτικά σε βακτηριοκτόνες πρωτεΐνες που απελευθερώνονται από τα αιμοπετάλια [Wu et al., 1994]. Έτσι προάγεται η διασπορά τους σε παρακείμενους ιστούς [Wilkinson, 1990]. Τα κυτταρικά γεγονότα που εξελίσσονται κατά το σηπτικό shock σε λοιμώξεις από σταφυλόκοκκο είναι παρόμοια με εκείνα των λοιμώξεων από Gram-αρνητικά βακτήρια. Και στις δυο περιπτώσεις, τα μονοκύτταρα και τα μακροφάγα παίζουν 25

πολύ σημαντικό ρόλο, ενώ λαμβάνουν μέρος επίσης πολυμορφοπύρηνα λευκοκύτταρα, ενδοθηλιακά κύτταρα και αιμοπετάλια. Τα μονοκύτταρα απελευθερώνουν κυτταροκίνες όπως τον tumor necrosis factor α (TNF-α), ιντερλευκίνη-1, ιντερλευκίνη-6 και ιντερλευκίνη-8, αφού έρθουν σε επαφή με την πεπτιδογλυκάνη ή τα λιποτειχοϊκά οξέα του σταφυλόκοκκου [Timmerman et al., 1993]. Η έκφραση της ιντερλευκίνης-1 και ιντερλευκίνης-6 από τα ενδοθηλιακά κύτταρα απαιτεί να έχει προηγηθεί βακτηριακή φαγοκυττάρωση [Yao et al., 1995]. Σαν αποτέλεσμα της παραγωγής των κυτταροκινών και της κυτταρικής ενεργοποίησης, είναι η ενεργοποίηση του συμπληρώματος και των οδών πήξεως καθώς και η απελευθέρωση του παράγοντα ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων (platelet activating factor, PAF). Όλα αυτά τα γεγονότα, έχουν ως αποτέλεσμα την εμφάνιση υψηλού πυρετού, υπότασης, έκπτωσης της λειτουργίας του μυοκαρδίου καθώς και δυσλειτουργίας διαφόρων οργάνων. 5. Λοιμώξεις από Σταφυλοκόκκους 5.1. Γενικά χαρακτηριστικά των λοιμώξεων 1. Οι λοιμώξεις που προκαλούνται από τον S. aureus κυρίως αφορούν την επιδερμίδα, μαλακούς ιστούς, την αναπνευστική οδό, τα οστά, τους συνδέσμους και το ενδοθήλιο των αγγείων. 2. Οι λοιμώξεις που οφείλονται σε πηκτάση-αρνητικούς σταφυλοκόκκους είναι κατά κύριο λόγο λοιμώξεις ενδονοσοκομειακές και σχετίζονται άμεσα με ενδονοσοκομειακά στελέχη που απομονώνονται από ασθενείς και ιατρονοσηλευτικό προσωπικό. Εξαίρεση αποτελούν : α) ενδοκαρδίτιδα φυσικών βαλβίδων, β) ορισμένες περιπτώσεις ενδοκαρδίτιδας προσθετικών βαλβίδων που εμφανίζονται μετά από ένα χρόνο από την εμφύτευση, γ) μερικά επεισόδια περιτονίτιδας σε ασθενείς με συνεχή περιτοναϊκή διάλυση, και δ) λοιμώξεις ουροποιητικού που οφείλονται στον S. saprophyticus. 26

3. Τα περισσότερα νοσοκομειακά στελέχη είναι συνήθως ανθεκτικά σε μεγάλο αριθμό αντιβιοτικών, όπως μεθικιλλίνη και άλλα β-λακταμικά αντιβιοτικά, ερυθρομυκίνη, κλινδαμυκίνη, τετρακυκλίνες, χλωραμφενικόλη, τριμεθοπρίμησουλφαμεθοξαζόλη και αμινογλυκοσίδες. Γενικά, θεωρείται ότι ένας πολυανθεκτικός φαινότυπος αποτελεί ενδονοσοκομειακό στέλεχος ικανό να προκαλέσει λοίμωξη. 4. Η αύξηση της συχνότητας των λοιμώξεων από πηκτάση-αρνητικούς σταφυλοκόκκους σχετίζεται άμεσα με την αύξηση της χρήσης βιοϊατρικών υλικών και ενδοφλέβιων καθετήρων. 5.2. Ειδικές Λοιμώξεις 5.2.1. Βακτηριαιμία Η θνητότητα της σταφυλοκοκκικής βακτηριαιμίας τα τελευταία δεκαπέντε χρόνια, κυμαίνεται 11-43% [Mylotte et al., 1987]. Παράγοντες που σχετίζονται με την αυξημένη θνητότητα περιλαμβάνουν την ηλικία άνω των 50 ετών, σοβαρά καρδιακά επεισόδια, νευρολογικές και αναπνευστικές λοιμώξεις. Η βακτηριαιμία που προκαλείται από μεθικιλλίνη-ανθεκτικά στελέχη δεν σχετίζεται άμεσα με την αυξημένη θνητότητα. Η συχνότητα των επιπλοκών μετά από βακτηριαιμία είναι υψηλή και κυμαίνεται από 11-53%. Ποσοστό 31% των ασθενών με βακτηριαιμία που δεν έχουν ένδειξη ενδοκαρδίτιδας, έχουν ενδείξεις μεταναστευτικών λοιμώξεων [Ing et al., 1997]. Το αυξημένο ποσοστό των βακτηριαιμιών σχετίζεται άμεσα με τη χρήση καθετήρων. Ασθενείς με βακτηριαιμία ή πυρετό που επιμένει άνω των 72 ωρών μετά την απομάκρυνση του καθετήρα, είναι σε αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης επιπλοκών [Raad et al., 1992]. Η παρουσία ενδοκαρδίτιδας σε ασθενείς με καθετήρες αξιολογείται με βάση τα κλινικά συμπτώματα και είναι σχετικά χαμηλής συχνότητας (0-18%). Μερικές μελέτες όμως προτείνουν ότι η συχνότητα ενδοκαρδίτιδας μπορεί να είναι και υψηλότερη. Οι Espersen και Frimodt-M [Espersen et al., 1986], ανέφεραν ότι στο 55% των ασθενών που έλεγξαν η διάγνωση της ενδοκαρδίτιδας από S. aureus έγινε μόνο μετά από νεκροτομή ενώ δεν την υποπτεύθηκαν από την κλινική εικόνα. 27

Η έννοια της παροδικής βακτηριαιμίας ενδιαφέρει επίσης, διότι αν και στις περισσότερες περιπτώσεις πρόκειται για ασυμπτωματική κατάσταση, μερικές φορές μπορεί να προκαλέσει σοβαρές επιπλοκές όπως ενδοκαρδίτιδα, οστεομυελίτιδα και λοιμώξεις προσθετικών υλικών. 5.2.2. Ενδοκαρδίτιδα Το 25-35 % των περιπτώσεων μικροβιακής ενδοκαρδίτιδας οφείλεται στον S. aureus [Sanabria et al., 1990]. Συμβαίνει πιο συχνά σε ασθενείς που λαμβάνουν ενδοφλέβια ναρκωτικά, σε ηλικιωμένους ασθενείς, σε ασθενείς με προσθετικές ή φυσικές βαλβίδες καθώς και σε άλλους νοσηλευόμενους ασθενείς. Η κλινική εκδήλωση της λοίμωξης είναι υποξεία και η απάντηση στη θεραπεία είναι καλή. Επιπλοκές εμφανίζονται αρκετά συχνά περίπου στα 2/3 των ασθενών και περιλαμβάνουν: συστηματική θρόμβωση, συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια, απόστημα μυοκαρδίου, ανωμαλίες ηλεκτρικής αγωγιμότητας ή ρήξη των βαλβίδων Caputo et al., 1987. Σε αντίθεση με τη χαμηλή συχνότητα εμφανίσεως ενδοκαρδίτιδας σε άτομα με φυσικές βαλβίδες, οι πηκτάση-αρνητικοί σταφυλόκοκκοι και ο S. aureus είναι οι μικροοργανισμοί που προσβάλλουν τις προσθετικές βαλβίδες με την μεγαλύτερη συχνότητα. Σύμφωνα με τις τελευταίες αναφορές ο S. epidermidis είναι υπεύθυνος για το 40% των περιπτώσεων ενδοκαρδίτιδας Ing et al., 1997. Ομοίως, οι Fang et al., ανέφεραν ότι στο 43% των περιπτώσεων ενδοκαρδίτιδας σε ασθενείς με προσθετικές βαλβίδες που είχαν και νοσοκομειακή βακτηριαιμία, το συχνότερο αίτιο ήταν ο S. aureus. Λοιμώξεις από άλλα είδη πηκτάση-αρνητικών σταφυλοκόκκων είναι σπάνιες. Η θνητότητα της νοσοκομειακής σταφυλοκοκκικής ενδοκαρδίτιδας κυμαίνεται από 40-56%, ενώ είναι ακόμα υψηλότερο όταν ο παθογόνος παράγοντας είναι ειδικά ο S. aureus [Fernandez-Guerrero et al., 1995]. 5.2.3. Σύνδρομο Τοξικής Καταπληξίας (Toxic Shock Syndrome) Το σύνδρομο αυτό χαρακτηρίζεται από υψηλό πυρετό, υπόταση, κηλιδώδες εξάνθημα που καταλαμβάνει όλο το σώμα και δυσλειτουργία διαφόρων οργάνων. Το σύνδρομο τοξικής καταπληξίας περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1978 σε παιδιά [Todd et al., 1978]. Κατά την διάρκεια της δεκαετίας του 1980, επιδημιολογικά 28

στοιχεία έδειξαν ότι το σύνδρομο φαίνεται να σχετίζεται με νεαρές γυναίκες που χρησιμοποιούσαν tampons κατά τις ημέρες της εμμήνου ρήσεως [Koch et al., 1995]. Η λοίμωξη σχετίζονταν με τοξινογόνα στελέχη S. aureus που απομονώνονταν από τον κόλπο. Η TSST-1 ήταν η πρώτη τοξίνη που έδειξε να ευθύνεται για το σύνδρομο τοξικής καταπληξίας (TSS) και σήμερα θεωρείται ότι είναι το αίτιο του 75% όλων των περιπτώσεων. Η τοξίνη ανακαλύφθηκε ως νέα εξωτοξίνη του S. aureus το 1981 από μελέτες του Schlievert et al. (1981). H TSST-1 παράγεται σχεδόν από όλα τα στελέχη S. aureus που απομονώνονται από τον κόλπο σε περιόδους εμμήνου ρήσεως και σχετίζονται με TSS και περίπου από το 50% των στελεχών S. aureus που απομονώνονται από άλλα σημεία του σώματος. Κωδικοποιείται από το γονίδιο tsth που έχει εισαχθεί στο χρωμόσωμα ως μια μεγάλη ετερόλογη εισδοχή [Baird-Parker, 1974] και όπως άλλες εξωτοξίνες παράγεται κατά την μετα-λογαριθμική φάση ανάπτυξης του κυττάρου. 5.2.4. Εντεροκολίτιδα Μερικά στελέχη S. aureus μπορούν να προκαλέσουν εντεροκολίτιδα, η οποία χαρακτηρίζεται κλινικά από διάρροια, πυρετό και αφυδάτωση. Μετά από χορήγηση αντιβιοτικών ευρέος φάσματος είναι δυνατή η ανάπτυξη μεγάλου αριθμού ανθεκτικών σταφυλοκόκκων στον εντερικό σωλήνα. Οι σταφυλόκοκκοι εισδύουν στον εντερικό βλεννογόνο και προκαλούν οξεία εντεροκολίτιδα, η οποία πολλές φορές είναι θανατηφόρος. Πολλά από αυτά τα στελέχη παράγουν εντεροτοξίνη τύπου Β. 5.2.5. Τροφική Δηλητηρίαση Η τροφική δηλητηρίαση από S. aureus χαρακτηρίζεται από εμετούς, διάρροιες, συσπάσεις στην κοιλιακή χώρα ή ναυτία. Χαρακτηριστικός είναι ο μικρός χρόνος επώασης της νόσου και η μικρή διάρκεια των συμπτωμάτων. Τα συμπτώματα διαρκούν για έξι ώρες και η ανάρρωση είναι πλήρης σε 24 ώρες. Η ασθένεια σχετίζεται περισσότερο με τις μολυσμένες από τοξίνη τροφές παρά με τον παθογόνο μικροοργανισμό [Δημητρακόπουλος, 1987]. 5.2.6. Πνευμονία 29

Η πνευμονία από S. aureus παρατηρείται κυρίως σε παιδιά μικρής ηλικίας και σε ασθενείς με ινοκυστική νόσο, γρίππη, χρόνια πνευμονική νόσο και βρογχοπνευμονία. Παρατηρείται αιμορραγική νέκρωση του πνεύμονα και σχηματισμός αποστήματος. Η θνητότητα κυμαίνεται από 5-40%. Σχηματισμός αποστήματος θα συμβεί στο 10% των ασθενών με πνευμονία από S. aureus. Το 1/3 των περιπτώσεων πνευμονικού αποστήματος οφείλεται στον S. aureus. 5.2.7. Οστεομυελίτιδα Στα 2/3 των περιπτώσεων εντοπίζεται στη μετάφυση των οστών των κάτω άκρων και του βραχιονίου. Η μεταφορά του μικροβίου γίνεται με το αίμα. Θετικές καλλιέργειες αίματος αναφέρονται στο 50% των περιπτώσεων οστεομυελίτιδας. Η αιματογενής οστεομυελίτιδα των ενηλίκων αφορά συχνά τους σπονδύλους και χαρακτηρίζεται με αρχικά συμπτώματα έντονου πόνου στη μέση και υψηλό πυρετό. Το 70% των περιπτώσεων οστεομυελίτιδας οφείλεται στον S. aureus. 5.2.8. Λοιμώξεις του ουροποιητικού συστήματος Ο S. saprophyticus είναι ο δεύτερος κατά σειρά συχνότητας αιτιολογικός παράγοντας οξείας λοίμωξης του ουροποιητικού σε νέες (16-35), υγιείς, σεξουαλικά ενεργείς γυναίκες Gaterman et al., 1997. Πολύ σπάνια προκαλεί λοιμώξεις του ουροποιητικού στους άνδρες. Η δυσουρία αποτελεί συχνό εύρημα, ενώ η πυουρία και η αιματουρία ανευρίσκονται 80%. Συμπτωματική λοίμωξη ανώτερου ουροποιητικού παρατηρείται στο 41-86% [Δημητρακόπουλος, 1987]. Ο S. saprophyticus είναι ανθεκτικός στη νοβοβιοκίνη και στο ναλιδιξικό οξύ, ενώ είναι γενικά ευαίσθητος στα συνήθη αντιβιοτικά που χρησιμοποιούνται για τις ουρολοιμώξεις. Σε αντίθεση με τον S. saprophyticus που ευθύνεται για ουρολοιμώξεις εξωνοσοκομειακών ασθενών, το 80-90% των στελεχών S. epidermidis απομονώνεται από ούρα νοσηλευόμενων ασθενών με επιπλοκές από το ουροποιητικό σύστημα. Τα στελέχη αυτά είναι συνήθως πολυανθεκτικά. 5.2.9. Λοιμώξεις αρθρώσεων με προσθετικά υλικά 30

Οι πηκτάση-αρνητικοί σταφυλόκοκκοι είναι υπεύθυνοι για το 20-40% των λοιμώξεων των αρθρώσεων με προσθετικά υλικά, καταλαμβάνοντας τη δεύτερη θέση μετά τον S. aureus. Οι λοιμώξεις αυτές εμφανίζονται συνήθως μετά τη παρέλευση 2-3 μηνών από την χειρουργική επέμβαση και σε αυτή τη περίπτωση θεωρούνται φυσιολογικές γιατί δεν προσβάλλουν τις αρθρώσεις. Οι λοιμώξεις που εμφανίζονται σε 2 έτη από την χειρουργική επέμβαση είναι αποτέλεσμα αιματογενούς διασποράς του μικροβίου. 5.2.10. Λοιμώξεις ενδοφλέβιων καθετήρων Η διάγνωση της σηψαιμίας που σχετίζεται με καθετήρες είναι δύσκολη. Όταν συνυπάρχουν σημεία και συμπτώματα τοπικής φλεγμονής στο σημείο εμφυτεύσεως ή κατά μήκος του καθετήρα, η διάγνωση είναι ευχερής. Όμως, τα συμπτώματα αυτά είναι εμφανή μόνο σε ένα ποσοστό 50% των ασθενών. Γενικά, η κλινική εικόνα της ενδονοσοκομειακής λοίμωξης, που έχει σχέση με τη χρήση αγγειακών καθετήρων, εκδηλώνεται ως τοπική φλεγμονή, φλεβίτιδα, πυώδη θρομβοφλεβίτιδα ή ως γενικευμένη λοίμωξη, βακτηριαιμία, ενδοκαρδίτιδα και σήψη. Καθετήρες που τοποθετούνται διαδερμικά εμφανίζουν λιγότερες πιθανότητες λοίμωξης από εκείνους που χρησιμοποιούνται κατά τη διάρκεια χειρουργικής επέμβασης. 31

6. Aντιβιοτικά 6.1. Ιστορία των αντιμικροβιακών ουσιών 1550 π.χ. : Στον αιγυπτιακό πάπυρο του Ebers δίνονται πρακτικές οδηγίες θεραπείας διαφόρων μολύνσεων του δέρματος με βότανα. 1887 : Ο Γάλλος Garre παρατηρεί ότι η ανάπτυξη αποικιών σταφυλοκόκκου διακόπτεται παρουσία ψευδομονάδος. 1928 : Ο Άγγλος μικροβιολόγος γιατρός Α. Φλέμιγκ, παρατηρεί ότι παρουσία μυκήτων (Penicillium notatum), εμποδίζεται η ανάπτυξη ορισμένων κόκκων και βακτηριδίων. Αρχικά η άγνωστη αντιμικροβιακή ουσία παίρνει την ονομασία οπός υφό μύκητος (mould juice), αλλά ένα χρόνο αργότερα ονομάζεται πενικιλλίνη. 1940-41 : Από την Αγγλία και εν συνεχεία στις ΗΠΑ, οι Florey, Chain και Healty, κατορθώνουν να παράγουν μικρή ποσότητα Penicillin για θεραπευτικούς σκοπούς, ενώ το 1943 επιτυγχάνεται μαζική βιομηχανική παραγωγή. Από τότε ανακαλύφθηκαν εκατοντάδες αντιβιοτικών και αντιμικροβιακών ουσιών εν γένει, που παράγονται από μύκητες, ακτινομύκητες και βακτήρια. 32

6.2. Μηχανισμοί δράσης των αντιμικροβιακών ουσιών Οι αντιμικροβιακές ουσίες διακρίνονται σε δύο γενικές κατηγορίες : 1) Βακτηριοστατικά, είναι τα αντιβιοτικά που σταματούν αντιστρεπτά την περαιτέρω ανάπτυξη και πολλαπλασιασμό ορισμένων μικροβίων, δίνοντας χρόνο στη φυσική άμυνα του οργανισμού. Αντιβιοτικά που αναστέλλουν την πρωτεϊνική σύνθεση καθώς και τα σουλφοναμίδια είναι κατ εξοχήν βακτηριοστατικά. 2) Βακτηριοκτόνα, είναι τα αντιβιοτικά που βλάπτουν μη αντιστρεπτά ή και φονεύουν ορισμένα μικρόβια. Εδώ ανήκουν φάρμακα που δρούν στο κυτταρικό τοίχωμα ή την κυτταρική μεμβράνη. Αν ένα αντιβιοτικό είναι βακτηριοκτόνο ή όχι, εξαρτάται όχι μόνον από τον τύπο, τη συγκέντρωση ή τον τρόπο δράσης του αντιβιοτικού, αλλά και από το είδος του μικροβίου, τον αριθμό και τη φάση ανάπτυξης του μικροβίου, καθώς επίσης και από τη διάρκεια δράσης του αντιβιοτικού. Έτσι οι πενικιλλίνες και οι κεφαλοσπορίνες είναι βακτηριοκτόνα αντιβιοτικά μόνον σε ενεργά αναπτυσσόμενους μικροοργανισμούς, ενώ οι αμινογλυκοσίδες και η πολυμιξίνη δρουν και στη φάση ανάπαυσης των μικροβίων. Η βακτηριοκτόνος δράση ενός αντιβιοτικού είναι σημαντική τις πρώτες 4-8 ώρες μετά την χορήγησή του και θεωρείται κλινικά σημαντική αν ένα υψηλό ποσοστό μικροβίων (99%) φονεύονται στη διάρκεια αυτής της χρονικής περιόδου. Τα αντιμικροβιακά φάρμακα, σε θεραπευτικές δόσεις, εκδηλώνουν εκλεκτική τοξικότητα τόσο μεταξύ μολύνοντος μικροοργανισμού και ξενιστή, όσο και μεταξύ διαφορετικών μικροοργανισμών. Τα αντιβιοτικά δρουν με 4 τρόπους : α) Παρεμβαίνουν στη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος, και εμφανίζουν εκλεκτική τοξικότητα διότι το κυτταρικό τοίχωμα είναι συστατικό μόνον του μικροοργανισμού (προκαρυωτικό κύτταρο) και όχι του κυττάρου του ξενιστή (ευκαρυωτικό κύτταρο). Τέτοια αντιβιοτικά είναι οι πενικιλλίνες, κεφαλοσπορίνες, βανκομυκίνη, βακιτρακίνη, κυκλοσερίνη και νοβοβιοσίνη. β) Τροποποιούν τη δομή της κυτταρικής μεμβράνης, και συνδέονται εκλεκτικά μόνο με την κυτταρική μεμβράνη του μικροοργανισμού και όχι με αυτή του κυττάρου ξενιστή. Προκαλείται αλλαγή στη διαπερατότητα της μεμβράνης σε βαθμό ασύμβατο 33

με την επιβίωση των βακτηρίων. Αντιπροσωπευτικά φάρμακα είναι οι πολυμυξίνες και η τυροτριχίνη. γ) Αναστέλλουν την πρωτεΐνοσύνθεση μέσα στο κύτταρο είτε εμποδίζοντας τη σύνθεση του RNA (Rifampicin, Fucidic acid) ή του DNA (αναστολείς της γυράσης), είτε δρώντας στα ριβοσώματα και αναστέλλοντας εκεί την πρωτεϊνική σύνθεση (Chloramphenicol, Tetracycline, Erythromycin, Lincomycin, Aminoglycosides). δ) Αναστέλλουν ουσιώδες μεταβολικές διεργασίες μέσα στο κυτταρόπλασμα των μικροβίων (σουλφοναμίδες). Η εκλεκτική τοξικότητα που παρουσιάζουν οφείλεται στο ότι, η μεταβολική διεργασία που αναστέλλεται είναι ουσιώδης μόνο για το μικροοργανισμό και όχι το ξενιστή. 6.3. Aντιμικροβιακή αντοχή Αμέσως μετά την ανακάλυψη των αντιβιοτικών, ο έλεγχος των βακτηριακών λοιμώξεων ήταν άριστος. Πολύ σύντομα όμως πολλά παθογόνα βακτήρια απέκτησαν αντοχή στα περισσότερα από τα δραστικά αντιβιοτικά. Για παράδειγμα, η ανάπτυξη αντοχής στη πενικιλλίνη στον Staphylococcus aureus από την παραγωγή της β- λακταμάσης, γρήγορα μείωσε την χρησιμότητα της πενικιλλίνης στις σοβαρές σταφυλοκοκκικές λοιμώξεις, ιδίως σε νοσηλευόμενους ασθενείς, στους οποίους τα ανθεκτικά στελέχη διασπείρονται πολύ πιο γρήγορα από ότι στην κοινότητα. Αρχικά το πρόβλημα της αντοχής λύθηκε με την ανακάλυψη νέων ομάδων αντιβιοτικών όπως, αμινογλυκοσίδες, μακρολίδες, γλυκοπεπτίδια. Δεν υπάρχει όμως καμία βεβαιότητα ότι η ανάπτυξη νέων αντιμικροβιακών ουσιών μπορεί να κρατηθεί σε ρυθμό παράλληλο με εκείνον της ανάπτυξης αντοχής των παθογόνων μικροβίων. Επειδή οι γνώσεις μας για τους μηχανισμούς και την επιδημιολογία της αντοχής των αντιβιοτικών εμπλουτίζεται συνεχώς, είναι βέβαιο ότι τα βακτήρια εμφανίζουν αξιοθαύμαστους τρόπους ώστε να ξεπερνούν τα αντιβιοτικά. Μία και μοναδική μετάλλαξη μπορεί να συντελέσει σε αντοχή χωρίς να διαφοροποιηθεί η παθογένεια ή η βιωσιμότητα ενός βακτηριακού στελέχους. Περιστατικά μεταλλάξεων μπορεί επίσης, να διαφοροποιήσουν ήδη υπάρχοντες μηχανισμούς αντοχής, ώστε αυτοί να γίνουν πιο ενεργείς με μεγαλύτερο φάσμα δραστικότητας. Μεγαλύτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι τα βακτήρια επιζητούν εξωγενή γενετικά υλικά τα οποία συμβάλλουν στην αντιμικροβιακή αντοχή. Είδη βακτηρίων όπως pneumococci και meningococci μπορούν να 34