Γενικοί μηχανισμοί αντοχής βακτηρίων στα αντιβιοτικά

Γενικοί μηχανισμοί αντοχής βακτηρίων στα αντιβιοτικά Αλκιβιάδης Βατόπουλος Εθνική Σχολή Δημόσιας Υγείας 1

Μικροβιακή Αντοχή Βασικοί ορισμοί Δραστικότητα αντιβιοτικού Αντοχή Μικροοργανισμού Μικροβιολογική (in vitro). Μικροβιολογική (in vitro). Κλινική (in vivo). Κλινική (in vivo). 2

Δραστικότητα in vitro 3

Ιn n vitro κριτήριο Μικροβιολογικής Δραστικότητας Προσδιορισμός Ελάχιστης Ανασταλτικής πυκνότητας (ΕΑΠ, MIC) MIC: H ελάχιστη πυκνότητα του αντιβιοτικού που αναστέλλει την ανάπτυξη του μικροβίου 4

5

6

Ιn vitro Δραστικότητα Η δραστικότητα του αντιβιοτικού έναντι του μικροβίου εκφράζεται in vitro ως κατανομή τιμών MIC (ή διαμέτρων ζώνης αναστολής) H κατανομή είναι κανονική αν ο μικροβιακός πληθυσμός είναι γενετικά ομοιογενής. Wild Type population: Πληθυσμός χωρίς αντοχή 7

EUCAST Παρουσίαση των wild type distributions 8

9

10

11

12

Μικροβιολογική Αντοχή (μικροβιολογική) Εμφάνιση μηχανισμού αντοχής σε κάποια μικροβιακά στελέχη. Ελάττωση της δραστικότητας στα στελέχη (αύξηση MIC). Διαταραχή της κανονικότητας της κατανομής MIC Εμφάνιση υποπληθισμού (ών) 13

S. Pneumoniae Ιστογράμματα ΜΙC Penicillin G 60 Erythromycin 60 50 40 Ευαίσθητος υποπληθυσμός 50 40 % 30 20 Ανθεκτικός υποπληθυσμός % 30 20 Ευαίσθητος υποπληθυσμός 10 0.002.008.032.125.5 2 8 32 128 > <.004.016.064.25 1 4 16 64 256 10 0 Ανθεκτικός υποπληθυσμός <.002.004.008.016.032.064.125.25.5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 > Etest (mcg/ml) Etest (mcg/ml) 14

Histogram of zone diameters around ciprofloxacin disks, E. coli Greece. 16 14 % Resistance to CIP 12 10 8 6 4 2 0 Ανθεκτικοί υποπληθυσμοί >4 42 39 36 33 30 27 24 21 18 15 12 9 6 Zone diameter (mm) 15

Μικροβιολογικός ορισμός της αντοχής. Εμφάνιση εγκατάσταση μηχανισμού. Εμφάνιση υποπληθυσμού με αυξημένη MIC. 16

Δεν είναι πάντως υποχρεωτική η διαταραχή της κανονικής κατανομής. Αφανής παρουσία μηχανισμού Ο μηχανισμός δεν εκφράζεται Ιn vitro In vivo? 17

Μικροβιολογική Αντοχή Αποτέλεσμα γενετικής διαταραχής. Μηχανισμός Αντοχής. Επιδημιολογική Σημασία. Αποτέλεσμα εμφάνισης και διασποράς «νέου» μηχανισμού». Κλινική Σημασία ; 18

Μηχανισμοί Αντοχής 19

ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΑΝΤΟΧΗ ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΔΙΑΠΟΡΑΤΟΤΗΤΑ ENEΡΓΟΣ ΑΠΟΒΟΛΗ ΠΟΡΙΝΕΣ ΓΕΝΙΚΗ ΕΙΔΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΕΝΕΡΓΟΥ ΑΠΟΒΟΛΗΣ. ΚΑΤΑΣΤΡΟΦΗ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΟΥ ΑΛΛΑΓΗ ΣΤΟΝ ΣΤΟΧΟ ΔΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΟΥ 20 ΕΝΖΥΜΑ Β-ΛΑΚΤΑΜΑΣΕΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΟΥΝΤΑ ΤΙΣ ΑΜΙΝΟΓΛΥΚΟΣΙΔΕΣ ΜΕΤΑΛΛΑΓΕΣ ΣΤΗΝ ΓΥΡΑΣΗ (ΚΙΝΟΛΟΝΕΣ) ΣΤΟ ΡΙΒΟΣΩΜΑ (ΜΑΚΡΟΛΙΔΕΣ) ΣΤΙΣ ΤΡΑΝΣΠΕΠΤΙΔΑΣΕΣ (MRSA) ΣΤΑ ΕΝΖΥΜΑ ΣΥΝΘΕΣΗΣ ΠΥΡΙΝΩΝ (ΤΡΙΜΕΘΟΠΡΙΜΗ).

ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΑΝΤΟΧΗ ΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ Μεταλλαγές σε ήδη υπάρχοντα γονίδια. Εμπλουτισμός των μικροοργανισμών με «νέα» γονίδια ή/και με «νέες» ομάδες γονιδίων. Μεταλλαγές σε ήδη υπάρχοντα γονίδια αντοχής. 21

Το γενετικό υλικό. Ακίνητο Χρωμόσωμα «Κινητά» Πλασμίδια Μεταθετά στοιχεία Integrons Νησίδες παθογονικότητας (Pathogenicity Islands). 22 Βασικό Σταθερό. Βασικός Μεταβολισμός Πρόσθετο κινητό. Παθογονικότητα Αντοχή

http://www.scq.ubc.ca/attack-of-the-superbugs-antibiotic-resistance/ 23

Μηχανισμοί Διασποράς Γονιδίων Αντοχής 24

Μηχανισμοί Αντοχής 25 http://www.aenvirocure.com/db_data/contams/organic/bacteria.html

ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΑΝΤΟΧΗ ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΜΕΤΑΛΛΑΓΕΣ ΝΕΑ ΓΟΝΙΔΙΑ. ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝ ΜΕΤΑΘΕΤΩΝ ΣΤΟΙΧΕΙΩΝ ΚΑΣΣΕΤΤΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ (INTEGRONS) 26

Μικροβιακή Ανοχή Διασπορά: Μεταξύ ασθενών. Μεταξύ υγιών (Φορείς Χλωρίδα) Από διάφορα reservoir. Περιβάλλον Ζώα - Φυτά 27

In vivo δραστικότητα 28

Κλινική Δραστικότητα του Αντιβιοτικού. ΚΛΙΝΙΚΟ ΚΡΙΤΗΡΙΟ: Θα θεραπευτεί ο ασθενής; ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΚΟ ΚΡΙΤΗΡΙΟ: Είναι τα επίπεδα στον ορό (εστία λοίμωξης) ικανά να αναστείλουν τον μικροοργανισμό; Φαρμακοκινητικές / Φαρμακοδυναμικές παραμέτροι (PK/PD). 29

Κριτήρια ορισμού: Κλινική αντοχή Κλινική αποτυχία της θεραπείας. Αποτελέσματα κλινικών μελετών. Φαρμακολογικά κριτήρια: Αλλοίωση των PK/PD παραμέτρων. 30

Φαρμακοκινητικές / Φαρμακοδυναμικές παραμέτροι (PK/PD). http://www.rxkinetics.com/antibiotic_pk_pd.html 31

Φαρμακοκινητικές / Φαρμακοδυναμικές παραμέτροι (PK/PD) PK/PD). Χρόνος > MIC AUC /MIC (24ωρο) Cmax/MIC 32

Φαρμακοκινητικές / Φαρμακοδυναμικές παραμέτροι (PK/PD). IN VITRO μελέτες Concentration depended killing Time depended killing Post antibiotic effect Delayed regrowth Rapid regrowth 33

34

Turnidge & Paterson 2007 35

ΑΝΤΟΧΗ ΚΛΙΝΙΚΟ ΚΡΙΤΗΡΙΟ: ΘαΘα θεραπευτεί ο ασθενής; ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΚΟ ΚΡΙΤΗΡΙΟ: ΤαΤα επίπεδα στον ορό είναι ικανά να αναστείλουν τον μικροοργανισμό; ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΚΡΙΤΗΡΙΟ ΥπάρχειΥπάρχει μηχανισμός αντοχής; 36

ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ. ΩΣ ΙΔΙΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥ. Το αντιβιόγραμμα ανιχνεύει την παρουσία του μηχανισμού. Αντοχή <=>μηχανισμός μηχανισμός. «μικροβιολογική» αντοχή. ΩΣ ΙΔΙΟΤΗΤΑ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΕΤΑΙ ΜΕ ΤΟΝ ΑΣΘΕΝΗ. To αντιβιόγραμμα διαχωρίζει τα in vivo ανθεκτικά «Κλινική» αντοχή. 37

BREAKPOINT: ΣΗΜΕΙΟ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ Το «σημείο» στο αντιβιόγραμμα που διαχωρίζει την ευαισθησία από την αντοχή 38

BREAKPOINT: ΣΗΜΕΙΟ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ Εκφράζει ποσότητα αντιβιοτικού Η αναστολή του μικροβίου από μικρότερες ποσότητες δείχνει ευαισθησία. Η απαίτηση μεγαλύτερων από το breakpoint ποσοτήτων δείχνει αντοχή. Προφανώς διαφέρει ανά ομάδα αντιβιοτικών και μικροοργανισμών Bug Drug combination Εκφράζεται: Πρωτίστως σε μg/ml Μεταφράζεται σε mm διαμέτρου ζώνης αναστολής. 39

Συσχέτιση μεταξύ MIC και διαμέτρου ζώνης αναστολής. S pneumoniae 40

BREAKPOINT: ΣΗΜΕΙΟ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ. Μικροβιολογικό. Διαχωρίζει τα στελέχη που διαθέτουν μηχανισμό από τα μη διαθέτοντα. Στηρίζεται στις κατανομές MIC Κλινικό. Διαχωρίζει τα κλινικώς ανθεκτικά από τα ευαίσθητα. Το breakpoint σχετίζεται με τα επίπεδα του αντιβιοτικού στο αίμα. PK/PD κριτήρια 41

BREAKPOINT: ΣΗΜΕΙΟ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ. Μικροβιολογικό Κλινικό Διαχωρίζει το wild type population Διαχωρίζει κλινικώς ανθεκτικά Δείκτης με (κυρίως) επιδημιολογική βιολογική αξία Δείκτης με (κυρίως) κλινική αξία 42

BREAKPOINT: ΣΗΜΕΙΟ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ. Μικροβιολογικό: Κλινικό: Είναι «φυσικό» μέγεθος Καθορίζεται από το αποτέλεσμα στον άνθρωπο Εξαρτάται από Την in vitro μέθοδο που χρησιμοποιείται. Εναιώρημα κλπ Εξαρτάται από: Το δοσολογικό σχήμα. Την οδό χορήγησης 43

S. pyogenes. Clinical Breakpoints Βιολογικό BP Κλινικό ΒΡ 44

Histogram of zone diameters around ciprofloxacin disks, E. coli Greece. 16 14 Κλινικό ΒΡ Βιολογικό BP % Resistance to CIP 12 10 8 6 4 2 0 >4 42 39 36 33 30 27 24 21 18 15 12 9 6 Zone diameter (mm) 45

Περιορισμός: To κλινικό Breakpoint δεν πρέπει να διαχωρίζει τους (βιολογικά καθορισμένους) υποπληθυσμούς «σωστό» breakpoint «λάθος» breakpoint 46

Ποίος είναι ο «σπουδαιότερος» ορισμός; Ο κλινικός/φαρμακολογικός φαρμακολογικός: Για να αντιμετωπίσουμε την λοίμωξη. Ο μικροβιολογικός (ανίχνευση μηχανισμών): Για να μελετήσουμε την επιδημιολογία της λοίμωξης. 47

ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ Ως κλινικό πρόβλημα. Να θεραπεύσουμε τον (συγκεκριμένο) άρρωστο Ανιχνεύουμε την αντοχή με βάση τον κλινικό ορισμό Ως πρόβλημα Δημόσιας Υγείας. Να μελετήσουμε την επιδημιολογία Κρουσμάτων Μηχανισμών Ανιχνεύουμε τους μηχανισμούς 48

Μηχανισμός Αύξηση MIC Κλινικό πρόβλημα Επιδημιολογικό πρόβλημα 49

Κρίσιμα Ερωτήματα: Πόση αξία για την Δημόσια Υγεία έχει η παρακολούθηση ενός μηχανισμού αντοχής; Πόσο αξία για την Κλινική Πράξη έχει η παρουσία μηχανισμού ανοχής προβλέπει την ελάττωση της κλινικής δραστικότητας; Πόσο ένας νέος μηχανισμός θα τροποποιήσει τα Breakpoints; 50

Κρίσιμα Κλινικά Ερωτήματα: Για την πρόβλεψη της κλινικής δραστικότητας: Αρκεί ο απλός προσδιορισμός της MIC; Απαιτείται η ανίχνευση του μηχανισμού; Πόσο ένας νέος μηχανισμός θα τροποποιήσει τα Breakpoints; 51

Κρίσιμα Επιδημιολογικά Ερωτήματα Πόσο η εμφάνιση νέου μηχανισμού ανοχής επηρεάζει την κλινική δραστικότητα; Ένας νέος μηχανισμός αποτελεί ένα άμεσα ή εν δυνάμει πρόβλημα Δ. Υγείας; Προδικάζει η παρουσία μηχανισμού τυχόν κλινική αντοχή; Πόσο ένας νέος μηχανισμός θα τροποποιήσει τα Breakpoints; Πόσο αρκεί το αντιβιόγραμμα στην ανίχνευση της «νέας» αντοχής; Πόσο χρήσιμη είναι η έγκαιρη ανίχνευση του μηχανισμού; 52

Απαντήσεις: Συσχέτιση αποτελεσμάτων: Κλινικών Δοκιμών Μικροβιολογικών Δοκιμών Φαρμακολογικών Δοκιμών Στόχος: Ποιο κριτήριο καλύτερα διαχωρίζει τα κλινικώς ευαίσθητα από τα ανθεκτικά 53

Αντιβιόγραμμα ή Μηχανισμός; Παραδείγματα ESBL. VIM. KPC Συνεχής μείωση breakpoint. Ειδικές δοκιμασίες. Ανίχνευση γονιδίων. MRSA. Ανίχνευση mec Επέκταση αντοχής σε όλα τα β- λακταμικά 54

H Μικροβιολογική Αντοχή Αποτελεί ένα Φυσικό Βιολογικό Φαινόμενο Για την Κλινική Αντοχή και τα κριτήρια της αποφασίζουν Επιτροπές 55

Κριτήρια διαχωρισμού (κλινικής) ευαισθησίας / αντοχής Εθνικές Επιτροπές CLSI (USA) EUCAST (EU) BSAC DIN SFM Αναθεωρήσεις ανάλογα με τα επιστημονικά δεδομένα Κεφαλοσπορίνες γ-γενεάςγενεάς Πνευμονιόκοκκος Κινολόνες Καρβαπενέμες 56

Ειδικά τεστ Χρωματρομετρικός έλεγχος β-λακταμάσης Αιμόφιλοι Ναϊσσέριες Σταφυλόκοκκοι Ελεγχος Διπλής Συνέργιας Με Δίσκους Έλεγχος παρουσίας ESBL Έλεγχος παρουσίας μεταλλοενζύμων Έλεγχος ανταγωνισμού Ερυθρομυκίνης - Κλινδαμικίνης. Screening MRSA VRE 57

Εργαλεία στην μελέτη της μικροβιακής αντοχής. Το αντιβιόγραμμα Προσδιορισμός αντοχής του κλινικού στελέχους. Ερμηνευτικό διάβασμα του αντιβιογράμματος. Βιολογικές δόκιμες Ανίχνευση μηχανισμών αντοχής Την μοριακή βιολογία Ανίχνευση μηχανισμών αντοχής Διευκρίνηση τρόπου διασποράς αντοχής 58

Κριτήρια επιλογής αντιβιοτικών. Κλινική. Θεραπεία. Εμπειρική χημειοθεραπεία. Επιδημιολογία Παρακολούθηση φαινοτύπων (κλώνων). Παρακολούθηση μηχανισμών. 59

Πρόσφατα παραδείγματα προβληματισμού για αλλαγή Breakpoint Οι καρβαπενεμάσες VIM - β-λακταμάσες KPC β-λακταμάσες 60

Δεδομένα Επιδημική αύξηση στην απομόνωση VIM(+) Kl.. pneumonia από το 2003. Επιδημική αύξηση στην απομόνωση KPC(+) Kl.. pneumonia από το 2007 Μικροοργανισμοί που σε μεγάλη αναλογία εμφάνιζαν MIC μικρότερη από το CLSI Breakpoint. CLSI Breakpoint : 4 μg/ml EUCAST Breakpoint : 2 μg/ml Κλινική αξία αυτής της αντοχής; Φαινόμενο παγόβουνου; 61

Πιθανή απόφαση Αλλαγή Breakpoint 62

Εργαστηριακά Δεδομένα Στελέχη και με MIC > από 1 μg/ml μπορεί να έχουν ένζυμο (Petropoulou et all 2006) Βιολογικό breakpoint: Δυσδιάκριτο Απαραίτητες η βιολογικές δοκιμασίες για την ανίχνευση στελεχών με ένζυμο MEM EDTA IMP Απώλεια πορίνης: Οδηγεί σε αύξηση της MIC (Loli et all 2006) 63

Έλεγχος της παρουσίας MBL με δίσκο EDTA 24ωρο καλλιέργημα σε οποιοδήποτε στερεό υλικό. Επίστρωση εναιωρήματος 0,5 McFarland του προς μελέτη μικροοργανισμού σε τρυβλίο Muller Hinton με βαμβακοφόρο στυλεό. Τοποθέτηση δίσκου εμποτισμένου με 10μl διαλύματος EDTA 0,1 Μ ph 8 σε απόσταση 20mm (κέντρο με κέντρο) από δίσκους ιμιπενέμης (10μg) και κεφταζιδίμης (30μg) g). 24ωρη επώαση στους 37 ο C. Διεύρυνση της άλω αναστολής ιμιπενέμης ή/και κεφταζιδίμης θεωρείται θετικό αποτέλεσμα, ενδεικτικό της παρουσίας MBL. MEM EDTA EDTA IMP 64

Hodge test για την ανίχνευση παρουσίας καρβαπενεμάσης Αρχή του τέστ: Η παραγομένη από το υπό μελέτη στέλεχος καρβαπενεμάση, αναστέλλει την δράση της ιμιπενέμης γύρω από την «κρικιά» με συνέπεια την παραμόρφωση της ζωνης αναστολής τουευαίσθητουστελέχους Καρβαπενεμάση Αρνητικό Στέλεχος Δίσκος Ιμιπενέμης Καρβαπενεμάση Θετικό Στέλεχος «κρικιά» του ύποπτου στελέχους Παραμόρφωση Ενοφθάλμισμα ευαίσθητου στελέχους Ecoli (πχ του ATTC25922 ή κάποιου άλλου) σε πικνότητα 0,5 McFarland (αντιβιόγραμμα) 65

Κλινικές Μελέτες Βιολογικές δοκιμασίες σε στελέχη με MIC > από 1 μg/ml (animal model): Ασαφή αποτελέσματα, πιθανή θεραπεία των «ευαίσθητων στελεχών» με υψηλές δόσεις καρβαπενεμών (Daikos et all 2007). Πολυκεντρική μελέτη παρατήρησης: H Θνητότητα αυξάνει σε στελέχη με MIC > 4 μg/ml (Daikos et al 2007,) Σοβαρές λοιμώξεις ανεξαρτήτου MIC (Souli et al 2008) 66

Σωστή κλινική δοκιμή λείπει Θεραπευτικές αποφάσεις σε περιβάλλον πολυαντοχής 67

Συμπέρασμα Ο προσδιορισμός αντοχής και ευαισθησίας στην μικροβιολογία αποτελεί μια δυναμική διαδικασία που επηρεάζεται: Από την συνεχή εμφάνιση νέων μηχανισμών αντοχής Από τον συνεχή πρόοδο της επιστημονικής γνώσης & κλινικής και επιδημιολογικής παρατήρησης. 68