Ιn vitro και in vivo μελέτη της βακτηριοκτόνου δράσεως των καρβαπενεμών έναντι εντεροβακτηριακών που παράγουν μεταλλοένζυμα της ομάδας VIM

ΕΘΝΙΚΟ & ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Διευθυντής: Καθηγητής Αθανάσιος Ζ. Τσακρής Διατελέσαντες πρώην Διευθυντές: Καθηγητής Νικόλαος Ι. Λεγάκης 1996 2006 Αν. Καθηγήτρια: Α. Τσελένη- Κωτσοβίλη 2006-2009 Ιn vitro και in vivo μελέτη της βακτηριοκτόνου δράσεως των καρβαπενεμών έναντι εντεροβακτηριακών που παράγουν μεταλλοένζυμα της ομάδας VIM Αγγελική Κ. Παναγιωτακοπούλου Ιατρός Παθολόγος ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΑΘΗΝΑ 2013

2

Μέλη τριμελούς επιτροπής: Αν. Καθηγητής κ. Λ.Σ. Τζουβελέκης (Επιβλέπον μέλος ΔΕΠ) Αν. Καθηγητής κ. Γ. Λ. Δαΐκος Αν. Καθηγήτρια κα Λ. Ζέρβα Ημερομηνία αίτησης: 18 Απριλίου 2005 Ημερομηνία ορισμού τριμελούς επιτροπής: 23 Μαΐου 2005 Ημερομηνία κατάθεσης πρωτοκόλλου: 18 Ιουλίου 2005 Ημερομηνία κατάθεσης πρώτης έκθεσης προόδου: 2 Οκτωβρίου 2006 Ημερομηνία κατάθεσης δεύτερης έκθεσης προόδου: 4 Δεκεμβρίου 2008 Ημερομηνία κατάθεσης τρίτης έκθεσης προόδου: 20 Φεβρουαρίου 2012 Ημερομηνία κατάθεσης διατριβής: 1 Φεβρουαρίου 1013 Ημερομηνία κρίσης διατριβής: 19 Απριλίου 2013 Πρόεδρος Ιατρικής Σχολής: Καθηγητής κ. Αθανάσιος- Μελέτιος Δημόπουλος Μέλη επταμελούς επιτροπής: Αν. Καθηγητής κ. Λ. Σ. Τζουβελέκης Αν. Καθηγητής κ. Γ. Λ. Δαΐκος Αν. Καθηγήτρια κα. Λ. Ζέρβα Αν. Καθηγητής κ. Σ. Χατζηπαναγιώτου Αν. Καθηγήτρια κα Ε. Πετεινάκη Επ. Καθηγητής κ. Π. Θ. Τάσιος Επ. Καθηγήτρια κα Α. Βελεγράκη Βαθμός διδακτορικής διατριβής: Άριστα 3

ΣΤΗΝ ΙΕΡΗ ΜΝΗΜΗ ΤΟΥ ΠΑΤΕΡΑ ΜΟΥ ΣΤΗ ΜΗΤΕΡΑ ΜΟΥ 4

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΕΛ. Βιογραφικό Σημείωμα 9 Πρόλογος 13 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 14 1. Η ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ Enterobacteriaceae 15 1.1. ΓΕΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ 15 1.2. ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟ ΤΩΝ ΕΝΤΕΡΟΒΑΚΤΗΡΙΟΕΙΔΩΝ 16 1.3. ΤΑ ΜΕΛΗ ΤΗΣ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ Enterobacteriaceae 17 1.4. Klebsiella spp. ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΚΑΙ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ 17 1.5. ΠΑΘΟΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ Klebsiella spp. ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΡΟΚΛΗΣΗ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ 18 1.5.1 ΚΑΨΙΔΙΚΑ ΑΝΤΙΓΟΝΑ 19 1.5.2. ΙΝΙΔΙΑ (FIBRIAE) 19 1.5.3. ΒΑΚΤΗΡΙΟΚΤΟΝΟΣ ΔΡΑΣΗ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΛΙΠΟΠΟΛΥΣΑΚΧΑΡΙΤΕΣ 20 1.5.4. ΣΙΔΗΡΟΦΟΡΑ (SIDEROPHORES) 20 2. ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ 21 2.1. ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΑΚΕΣ ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ 21 2.2. ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ ΑΠΟ Gram AΡΝΗΤΙΚΑ ΣΕ ΜΟΝΑΔΕΣ ΕΝΤΑΤΙΚΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ 22 2.3. ΑΝΤΟΧΗ ΣΤΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ 22 3. ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΑ β-λακταμικα ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ 23 3.1 ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΤΗΣ ΕΞΩΤΕΡΙΚΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ (ΟΜΡs) 23 3.2 ΠΑΡΑΓΩΓΗ β-λακταμασων 24 4. β-λακταμασεσ 24 4.1. ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΔΡΑΣΗΣ β-λακταμασων 25 4.2. ΚΑΤΑΤΑΞΗ β-λακταμασων 25 5. ΚΑΡΒΑΠΕΝΕΜΑΣΕΣ 29 5.1. ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ ΚΑΙ ΜΕΤΑΔΟΣΗ 29 5.2. ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΚΑΡΒΑΠΕΝΕΜΑΣΩΝ -ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ 30 5.3. ΚΑΡΒΑΠΕΝΕΜΑΣΕΣ TAΞΗΣ Α 31 5.3.1. ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΕΣ ΚΑΡΒΑΠΕΝΕΜΑΣΕΣ ΤΑΞΗΣ Α 31 5.3.1. ΠΛΑΣΜΙΔΙΑΚΕΣ ΚΑΡΒΑΠΕΝΕΜΑΣΕΣ ΤΑΞΗΣ Α 31 5.4. ΚΑΡΒΑΠΕΝΕΜΑΣΕΣ ΤΑΞΗΣ D 32 5

5.5. ΜΕΤΑΛΛΟ-β-ΛΑΚΤΑΜΑΣΕΣ ΤΑΞΗΣ Β 32 5.5.1. ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΕΣ ΚΑΡΒΑΠΕΝΕΜΑΣΕΣ ΤΑΞΗΣ Β 33 5.5.2. ΕΠΙΚΤΗΤΕΣ ΚΑΡΒΑΠΕΝΕΜΑΣΕΣ ΤΑΞΗΣ Β 34 6. ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΚΑΡΒΑΠΕΝΕΜΑΣΩΝ 38 6.1. ΕΠΙΠΕΔΑ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΕ ΚΑΡΒΑΠΕΝΕΜΕΣ 38 6.2. ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕ ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ 39 6.2.1. Μέθοδος δίσκων : Double Disk Test (DDST) και Comdined Disk Test (CDT) 39 6.2.2. E-test 41 6.2.3. Modified Hodge Test ή cloverleaf test 41 6.2.4. Χρωμογόνα υλικά καλλιέργειας 42 6.3. ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ 42 6.3.1. Ισοηλεκτρική εστίαση 42 6.3.2. Φασματοφωτομετρική μέθοδος 42 6.3.3. Αντίδραση αλυσιδωτής πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) 43 6.3.4. Αλληλούχιση γονιδιακής περιοχής 43 7. ΓΕΝΕΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΚΑΙ ΑΝΤΟΧΗ 43 7.1. ΧΡΩΜΟΣΩΜATΙΚΟ DNA 44 7.2. ΠΛΑΣΜΙΔΙΑ 44 8. ΜΕΤΑΘΕΤΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ 45 8.1. ΤΡΑΝΣΠΟΖΟΝΙΑ 45 8.2. ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΕΣ ΕΙΣΔΟΧΗΣ 45 9. ΙΝΤΕΓΚΡΟΝΙΑ ΤΑΞΗΣ 1 46 9.1. ΓΟΝΙΔΙΑΚΕΣ ΚΑΣΣΕΤΕΣ 48 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 49 1. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 50 1.1 ΣΥΝΤΟΜΗ ΕΚΘΕΣΗ ΤΗΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗΣ ΠΟΡΕΙΑΣ 50 1.2. IN VITRO ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΒΑΚΤΗΡΙΟΚΤΟΝΟΥ ΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΚΑΡΒΑΠΕΝΕΜΩΝ ΕΝΑΝΤΙ ΕΝΤΕΡΟΒΑΚΤΗΡΙΑΚΩΝ ΤΗΣ ΟΜΑΔΑΣ VIM 51 1.2.1. ΕΠΙΛΟΓΗ ΣΤΕΛΕΧΩΝ 51 1.2.2. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΣΤΕΛΕΧΩΝ 51 1.2.3. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ 52 1.2.4. ΕΛΕΓΧΟΣ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ ΣΤΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ 53 1.2.4.α. ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΝΤΙΒΙΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ ΚΑΤΑ KIRBY-BAUER 53 1.2.4.β. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΛΑΧΙΣΤΩΝ ΑΝΑΣΤΑΛΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΕΛΑΧΙΣΤΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΟΣΤΑΤΙΚΩΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΕΩΝ ΤΩΝ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ 54 6

1.2.4.γ. ΜΕΘΟΔΟΣ E-TEST: 54 1.2.4.δ. MEΘΟΔΟΣ ΜΙΚΡΟΑΡΑΙΩΣΕΩΝ 54 1.2.5. Α ΠΕΙΡΑΜΑ: MEΛΕΤΗ ΚΙΝΗΤΙΚΗΣ ΘΑΝΑΤΩΣΗΣ / ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ ΕΝΟΦΘΑΛΜΙΣΜΑΤΟΣ 55 1.2.6. Β ΠΕΙΡΑΜΑ: MEΛΕΤΗ ΚΙΝΗΤΙΚΗΣ ΘΑΝΑΤΩΣΗΣ / ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ ΕΝΟΦΘΑΛΜΙΣΜΑΤΟΣ 56 1.2.7. Γ ΠΕΙΡΑΜΑ: MEΛΕΤΗ ΚΙΝΗΤΙΚΗΣ ΘΑΝΑΤΩΣΗΣ 56 1.3. ΙΝ VIVO ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΒΑΚΤΗΡΙΟΚΤΟΝΟΥ ΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΚΑΡΒΑΠΕΝΕΜΩΝ ΕΝΑΝΤΙ ΕΝΤΕΡΟΒΑΚΤΗΡΙΑΚΩΝ ΤΗΣ ΟΜΑΔΑΣ VIM 58 1.3.1. Α ΠΕΙΡΑΜΑ - ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΩΝ ΣΧΗΜΑΤΩΝ ΙΜΙΠΕΝΕΜΗΣ ΣΕ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΛΟΙΜΩΞΗ ΣΕ ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ 58 1.3.1.α.- ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ 58 1.3.1.β.- ΣΤΕΛΕΧΗ Klebsiella pneumoniae (KP VIM) 58 1.3.1.γ.- ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΕΝΟΦΘΑΛΜΙΣΜΑΤΟΣ 58 1.3.1.δ.- ΠΡΟΚΛΗΣΗ ΟΥΔΕΤΕΡΟΠΕΝΙΑΣ 59 1.3.1.ε.-ΔΟΣΟΛΟΓΙΚΑ ΣΧΗΜΑΤΑ 59 1.3.1.στ.-ΠΡΟΚΛΗΣΗ ΛΟΙΜΩΞΗΣ 59 1.3.1.ζ.-ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΑΓΩΓΗΣ 59 1.3.1.η.-ΦΑΡΜΑΚΟΚΙΝΗΤΙΚΗ ΙΜΙΠΕΝΕΜΗΣ 59 1.3.1.θ.-ΘΑΝΑΤΩΣΗ ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΩΝ 59 1.3.1.ι.-ΠΑΡΑΛΑΒΗ /ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΙΣΤΟΥ 59 1.3.1.κ.-ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ 60 1.3.2. Β ΠΕΙΡΑΜΑ: ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΩΝ ΣΧΗΜΑΤΩΝ ΜΕΡΟΠΕΝΕΜΗΣ ΣΕ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΛΟΙΜΩΞΗ ΣΕ ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ 60 1.3.2.α.- ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ 60 1.3.2.β.- ΣΤΕΛΕΧΗ Klebsiella pneumoniae (KP VIM) 60 1.3.2.γ.- ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΕΝΟΦΘΑΛΜΙΣΜΑΤΟΣ 60 1.3.2.δ.- ΠΡΟΚΛΗΣΗ ΟΥΔΕΤΕΡΟΠΕΝΙΑΣ 60 1.3.2.ε.-ΔΟΣΟΛΟΓΙΚΑ ΣΧΗΜΑΤΑ 61 1.3.2.στ.-ΠΡΟΚΛΗΣΗ ΛΟΙΜΩΞΗΣ 61 1.3.2.ζ.-ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΑΓΩΓΗΣ 61 1.3.2.η.-ΦΑΡΜΑΚΟΚΙΝΗΤΙΚΗ ΜΕΡΟΠΕΝΕΜΗΣ 61 1.3.2.θ.-ΘΑΝΑΤΩΣΗ ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΩΝ 61 1.3.2.ι.-ΠΑΡΑΛΑΒΗ /ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΙΣΤΟΥ 61 1.3.2.κ.-ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ 62 7

2. AΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 63 2.1. ΣΤΕΛΕΧΗ -ΕΛΕΓΧΟΣ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ ΣΤΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ 63 2.1.1. ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΝΤΙΒΙΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ ΚΑΤΑ KIRBY-BAUER 63 2.1.2. ΜΕΘΟΔΟΣ E-TEST 64 2.1.3. MEΘΟΔΟΣ ΜΙΚΡΟΑΡΑΙΩΣΕΩΝ 64 2.1.4. ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ 66 2.2. IN VITRO ΜΕΛΕΤH 67 2.2.1. Α ΠΕΙΡΑΜΑ : MEΛΕΤΗ ΚΙΝΗΤΙΚΗΣ ΘΑΝΑΤΩΣΗΣ / ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ ΕΝΟΦΘΑΛΜΙΣΜΑΤΟΣ 67 2.2.2. Β ΠΕΙΡΑΜΑ : MEΛΕΤΗ ΚΙΝΗΤΙΚΗΣ ΘΑΝΑΤΩΣΗΣ / ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ ΕΝΟΦΘΑΛΜΙΣΜΑΤΟΣ 73 2.2.3. ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟΥ ΕΝΟΦΘΑΛΜΙΣΜΑΤΟΣ (INOCULUM EFFECT) ME TH MEΘΟΔO E-ΤΕST 80 2.2.4. ΣΧΟΛΙΑΣΜΟΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 81 2.2.5. Γ ΠΕΙΡΑΜΑ : MEΛΕΤΗ ΚΙΝΗΤΙΚΗΣ ΘΑΝΑΤΩΣΗΣ 82 2.2.6. ΣΥΝΟΨΗ ΕΥΡΗΜΑΤΩΝ 92 2.3. ΙΝ VIVO ΜΕΛΕΤΗ 93 2.3.1. Α ΠΕΙΡΑΜΑ: ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΩΝ ΣΧΗΜΑΤΩΝ ΙΜΙΠΕΝΕΜΗΣ ΣΕ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΛΟΙΜΩΞΗ ΣΕ ΜΥΕΣ 93 2.3.1.α. ΜΕΤΡΗΣΗ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΙΜΙΠΕΝΕΜΗΣ ΣΤΟ ΑΙΜΑ 93 2.3.1.β. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 95 2.3.1.γ. ΣΥΝΟΨΗ ΕΥΡΗΜΑΤΩΝ 98 2.3.2. Β ΠΕΙΡΑΜΑ: ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΩΝ ΣΧΗΜΑΤΩΝ ΜΕΡΟΠΕΝΕΜΗΣ ΣΕ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΛΟΙΜΩΞΗ ΣΕ ΜΥΕΣ 99 2.3.2.α. ΦΑΡΜΑΚΟΚΙΝΗΤΙΚΗ ΜΕΡΟΠΕΝΕΜΗΣ 99 2.3.2.β. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 99 2.3.2.γ. ΣΥΝΟΨΗ ΕΥΡΗΜΑΤΩΝ 102 3. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΕΛΛΗΝΙΚΩΝ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ 103 3.1. ΣΥΝΟΨΗ ΕΥΡΗΜΑΤΩΝ 104 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ - ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 106 5. ΠΕΡΙΛΗΨΗ 117 6. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 119 7. SUMMARY 126 8

ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ Προσωπικά στοιχεία Όνομα: Aγγελική Επώνυμο: Παναγιωτακοπούλου Όνομα πατέρα: Κωνσταντίνος Όνομα μητέρας: Μαρία Ημερομηνία γέννησης: 27/ 1/1974 Τόπος γέννησης: Αθήνα Οικογενειακή κατάσταση: Έγγαμος Διεύθυνση: Ανδρούτσου 4 Νέα Πεντέλη Τηλέφωνο: 6974492510 Σπουδές Δευτεροβάθμια εκπαίδευση: 1 ο Λύκειο Αμαρουσίου Βαθμός απολυτηρίου: Άριστα Τριτοβάθμια εκπαίδευση: 1991-1997 Εθνικό Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Ιατρική Σχολή Βαθμός πτυχίου: Λίαν Καλώς (7.8) Επαγγελματική δραστηριότητα: 14/1/1998 13/1/1999 Υπηρεσία υπαίθρου -Περιφερικό Ιατρείο Ορχομενού Βοιωτίας 12/1999-4/2000 Χιονοδρομικό Κέντρο Παρνασσού 24/7/2000-17/12/2001 Άσκηση ειδικότητας Παθολογίας σε Γ.Ν.Ν.Χαλκίδας 24/12/ 2001-31/7/2005 Άσκηση ειδικότητας Παθολογίας σε Γ.Π.Ν. Σισμανόγλειο 10/9/2003-10/12/2003 Συμμετοχή και παρακολούθηση των κλινικών και ερευνητικών δραστηριοτήτων του Τμήματος Λοιμώξεων της Α Πανεπιστημιακής Προπαιδευτικής Κλινικής Πανεπιστημίου Αθηνών 25/8/2005 Απόκτηση τίτλου ειδικότητας Παθολογίας 17/5/2006 έως σήμερα Επιμελήτρια Παθολογίας στη Β Ογκολογική Κλινική του Νοσ. Ερρίκος Ντυνάν για περίπου ένα έτος και στη συνέχεια στη Β Παθολογική Κλινική Ιδιωτικό ιατρείο, Ρόδου 13 Αμαρούσιο 9

Ξένες Γλώσσες Αγγλικά (Certificate of Proficiency in English) Ξένες Δημοσιεύσεις Daikos, G. L., A. Panagiotakopoulou, E. Tzelepi, A. Loli, L. S. Tzouvelekis, V. Miriagou. (2007). Activity of imipenem against VIM-1 metallo-β-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae in the murine thigh infection model. Clinical Microbiology and Infection. 13(2):202-5. Panagiotakopoulou A., Daikos G.L., Miriagou V., Loli A., Tzelepi E., Tzouvelekis L.S. (2007) Comparative in vitro killing of carbapenems and aztreonam against Klebsiella pneumoniae producing VIM-1 metallo-beta-lactamase. International Journal of Antimicrobial Agents. 29(3):360-362. Ανακοινώσεις σε ελληνικά συνέδρια Κρυοσφαιριναιμία και χρόνια ηπατίτιδα C: Παρουσίαση περιστατικού Ε. Κοσμάογλου, Α. Παναγιωτακοπούλου, Κ. Μπούρας, Α. Καραγκούνης. 8 ο Πανελλήνιο Ηπατολογικό Συνέδριο. H συμβολή της ελικοειδούς υπολογιστικής τομογραφίας στη διαφορική διάγνωση της εξιδρωματικής, αιμορραγικής και νεκρωτικής παγκρεατίτιδας. Ταβερναράκη Κ., Πατέλης Ε., Παναγιωτακοπούλου Α., Δαλαμαρίνης Κ., Μαλαχίας Γ., Αντωνόπουλος Π. 4º Πανελλήνιο Συνέδριο Παγκρεατολογίας. Κυστικές παθολογικές αλλοιώσεις παγκρέατος. Εκτίμηση με ελικοειδή υπολογιστική τομογραφία. Πατέλης Ε, Ταβερναράκη Κ., Παναγιωτακοπούλου Α., Δαλαμαρίνης Κ., Μαλαχίας Γ., Αντωνόπουλος Π. 4º Πανελλήνιο Συνέδριο Παγκρεατολογίας. Μικροκυστικό αδένωμα παγκρέατος, διπλή καρκινική εντόπιση στο νεφρό, αιμαγγειοβλάστωμα παρεγκεφαλίδας σε ασθενή με Von Hippel Lindau νόσο. Πατέλης Ε., Ταβερναράκη Κ., Παναγιωτακοπούλου Α., Δαλαμαρίνης Κ., Αντωνόπουλος Π. 4º Ελληνικό Συνέδριο Ογκολογίας Πεπτικού. Διαφορική διάγνωση μακροκυστικού αδενώματος παγκρέατος ( βλεννώδες κυσταδένωμα ) και κυστικού αδενοκαρκινώματος παγκρέατος με βάση τα ευρήματα της Υ/Τ. 10

Ταβερναράκη Κ., Πατέλης Ε., Παναγιωτακοπούλου Α., Τζιόγκα Γ., Δαλαμαρίνης Κ., Αντωνόπουλος Π. 4º Ελληνικό Συνέδριο Ογκολογίας Πεπτικού. Φυματίωση του ουροποιογεννητικού συστήματος Παναγιωτακοπούλου Α., Δαΐκος Γ. Περιοδικό ΑΝΗΡ, 2005 7(1), 39-41. Νόσος Von Hippel- Lindau: Ένα σπάνιο γενετικό σύνδρομο -Διάγνωση με υπολογιστική τομογραφία. Π.Αντωνόπουλος, Ε.Πατέλης, Α.Παναγιωτακοπούλου, Κ. Ταβερναράκη, Κ. Δελαμαρίνης, Γ. Μαλαχίας. Περιοδικό ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΑΚΤΙΝΟΛΟΓΙΑ Τόμος 36, (4) 412-415, 2005. Επινεφριδιακές μεταστάσεις από ca πνεύμονα: Εκτίμηση με υπολογιστική τομογραφία. Ε.Πατέλης, Π.Αντωνόπουλος, Κ.Ταβερναράκη, Α. Παναγιωτακοπούλου, Κ. Αλεξίου, Γ. Μαλαχίας. 31 Πανελλήνιο Ιατρικό Συνέδριο, Μάϊος 2005. Τελική ειλεΐτις (Νόσος του Crohn ): Διαγνωστική προσέγγιση με ελικοειδή αξονική τομογραφία Φ. Κωνσταντινίδης, Ε. Πατέλη, Κ.Ταβερναράκη, Π. Γεωργούλης, Α.Παναγιωτακοπούλου, Π.Αντωνόπουλος. 4 Πανελλήνιο Συνέδριο Ιδιοπαθών Φλεγμονωδών Νοσημάτων του Εντέρου, Μάϊος 2005. Αξιολόγηση ιμιπενέμης έναντι στελεχών Klebsiella pneumoniae που παράγουν μεταλλοβ-λακταμάσες σε πειραματική λοίμωξη σε επίμυες. Α.Παναγιωτακοπούλου, Γ.Λ.Δαΐκος, Α.Λώλη, Κ.Παπαγιαννίτσης, Α.Ζιώγα, Λ.Σ.Τζουβελέκης, Ε.Τζελέπη, Β.Μυριαγκού. 32 Πανελλήνιο Ιατρικό Συνέδριο, Μαϊος 2006. ( Β Βραβείο Αμφιαραείου Ιδρύματος ) Ανίχνευση εξωτοξίνης Panton-Valentine σε ευαίσθητο στη μεθικιλλίνη στέλεχος Staphylococcus aureus προερχόμενο από την κοινότητα. Α.Παναγιωτακοπούλου, Ν.Σταυρέας, Ε.Α.Μασούρου, Δ.Μπουλουγούρη, Α.Βασιλογιαννακόπουλος. 1 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικών Σπουδών, Μάρτιος 2008. Περίπτωση αγγειοσαρκώματος ως αιτίου παρατεινομένου εμπυρέτου και οσφυοϊσχιαλγίας. Ε.Α.Μασούρου, Α.Παναγιωτακοπούλου, Ν. Σταυρέας, Δ. Μπουλουγούρη, Α.Πατέλη, Ε.Τζιβίσκου, Α.Βασιλογιαννακόπουλος. 1 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικών Σπουδών, Μάρτιος 2008. Τηλεϊατρική συμβουλευτική σε πλοία: η ελληνική εμπειρία Ε.Α.Μασούρου, Ν.Σταυρέας, Π.Κανελλόπουλος, Α.Παναγιωτακοπούλου, Δ. Μπουλουγούρη, Α.Βασιλογιαννακόπουλος. 2 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ταξιδιωτικής και Τροπικής Ιατρικής, Ιούνιος 2010. 11

ΜΕΤΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΑ ΣΕΜΙΝΑΡΙΑ Μετεκπαιδευτικά Μαθήματα στο Σακχαρώδη Διαβήτη, από το Διαβητολογικό Κέντρο της Β Παθολογικής Κλινικής του Ιπποκρατείου Νοσοκομείου, Νοέμβριος 2000. Ημέρες Παθολογίας 2001. Μετεκπαιδευτικά Μαθήματα στην Ενδοκρινολογία και το Μεταβολισμό από το Τμήμα Ενδοκρινολογίας, Διαβήτη και Μεταβολισμού του Γ.Π.Ν.Α. Ευαγγελισμός, Ιανουάριος 2002. Σεμινάριο Αντιμικροβιακής Χημειοθεραπείας από τη Δ Παθολογική Κλινική του Πανεπιστημίου Αθηνών, στο Γ.Π.Ν.Α. Σισμανόγλειο, Νοέμβριος 2002. Αυτοματισμός και Οργάνωση Ιατρικού Γραφείου με τη χρήση Η/Υ από τη SYSTEM Συμβουλευτική Α.Ε, Δεκέμβριος 2002. Γραμματειακή Υποστήριξη Ιατρικού Γραφείου, από τη SYSTEM Συμβουλευτική Α.Ε, Δεκέμβριος 2003. Αυτοματισμός και Οργάνωση Ιατρικού Γραφείου με τη χρήση Η/Υ από τη SYSTEM Συμβουλευτική Α.Ε, Δεκέμβριος 2004. 1º Mετεκπαιδευτικό Σεμινάριο Ιατρικής Μυκητολογίας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Ιανουάριος 2004. Μετεκπαιδευτικά Μαθήματα στην Ενδοκρινολογία και το Μεταβολισμό από το Τμήμα Ενδοκρινολογίας, Διαβήτη και Μεταβολισμού του Γ.Π.Ν.Α. Ευαγγελισμός, Ιανουάριος 2004. Αντιμετώπιση έκτακτων αναγκών από πυρηνο-βιο-χημική απειλή, φυσικές καταστροφές και μαζικά ατυχήματα. Σισμανόγλειο, Μάϊος 2004. New Frontiers in the Diagnosis and Management of GI Diseases, Νοσοκομείο Ερρίκος Ντυνάν, Δεκέμβριος 2004. «3 ος Δεκάλογος στις Λοιμώξεις», Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών, Μάρτιος 2007. Κλινικό Φροντιστήριο Σύγχρονης Παθολογίας, Ερρίκος Ντυνάν, Μάϊος 2007 Ιούνιος 2008. 12

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Ένα από τα σύγχρονα προβλήματα στην αντιμικροβιακή χημειοθεραπεία είναι η εμφάνιση και διασπορά βακτηρίων που παράγουν επίκτητες μεταλλο-β-λακταμάσες (μεταλλοένζυμα). Τα μεταλλοένζυμα εντοπίστηκαν αρχικά σε στελέχη Pseudomonas aeruginosa και μεταγενέστερα σε στελέχη εντεροβακτηριακών. Τα ένζυμα αυτά υδρολύουν σχεδόν όλα τα β-λακταμικά αντιβιοτικά πλην της αζτρεονάμης. Συνέπεια αυτού είναι η υψηλή εμφάνιση αντοχής στα νεώτερα β-λακταμικά συμπεριλαμβανομένων και των καρβαπενεμών. Στην Ελλάδα η διασπορά διαφόρων ειδών εντεροβακτηριακών που παράγουν μεταλλοένζυμα αποτελεί ένα από τα πιο σημαντικά προβλήματα μικροβιακής αντοχής. Στελέχη που παράγουν μεταλλοένζυμα, κυρίως Klebsiella pneumoniae, αλλά και σποραδικά Escherichia coli, Serratia spp. και Enterobacter spp., έχουν γίνει πλέον ενδημικά στα ελληνικά νονοσοκομεία, προκαλώντας λοιμώξεις με υψηλά ποσοστά νοσηρότητας και θνητότητας. Σκοπός αυτής της διατριβής ήταν να μελετηθεί η συσχέτιση μεταξύ της φορείας του μεταλλοενζύμου VIM -1 σε στελέχη Klebsiella pneumoniae και της ανταπόκρισης στις καρβαπενέμες τόσο in vitro όσο και in vivo σε πειραματόζωα. Τα πειράματα έγιναν στο Εργαστήριο Λοιμώξεων του Λαϊκού Νοσοκομείου και στο Τμήμα Βακτηριολογίας του Ελληνικού Ινστιτούτου Pasteur τους διευθυντές των οποίων κ.κ. Πετρίκκο Γεώργιο και Τζελέπη Εύα καθώς και το προσωπικό, ευχαριστώ για τη θερμή φιλοξενία και τη βοήθεια που μου πρόσφεραν. Ιδιαίτερα οφείλω να ευχαριστήσω τα μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής κκ Λεωνίδα Τζουβελέκη Αναπληρωτή Καθηγητή, Γεώργιο Δαΐκο Αναπληρωτή Καθηγητή και Λουκία Ζέρβα Αναπληρώτρια Καθηγήτρια για την καθοδήγηση και και το αδιάλειπτο ενδιαφέρον τους κατά την εκπόνηση της παρούσας μελέτης. Θεωρώ επίσης υποχρέωσή μου να εκφράσω τις ευχαριστίες μου στην κα Βιβή Μυριαγκού Αναπληρώτρια Διευθύντρια του Εργαστηρίου Βακτηριολογίας του Ελληνικού Ινστιτούτου Pasteur για τη συνεχή ενθάρρυνση και ενεργό συμμετοχή της. Τέλος, ένα μεγάλο ευχαριστώ χρωστώ στη μητέρα μου Μαρία Παναγιωτακοπούλου για την απεριόριστη υποστήριξη και την άνευ όρων αγάπη της που ήταν από τα πιο σημαντικά κίνητρα για να αναλάβω αυτή την προσπάθεια. 13

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 14

1. Η ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ Enterobacteriaceae 1.1. ΓΕΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ Η οικογένεια Enterobacteriaceae είναι η µεγαλύτερη οµάδα από τα µη φωτοσυνθετικά Gram αρνητικά βακτήρια. Τα περισσότερα μέλη της είναι ραβδοειδείς, ευθύγραµµοι ή καµπυλοειδείς βάκιλλοι με διαστάσεις 2-3μm x 0,4-0,6μm. Ορισµένα από τα εντεροβακτηριοειδή είναι ακίνητα, ενώ τα περισσότερα κινούνται µε µαστίγια τα οποία µπορεί να είναι περίτριχα, πολικά ή µεικτού τύπου (Prescott et al. Microbiology 4th edition). Εικόνα 1Α: Klebsiella pneumoniae Τα περισσότερα είδη αναπτύσσονται στους 37ºC αν και πολλά είδη αναπτύσσονται καλύτερα στους 25-30ºC. Τα εντεροβακτήρια είναι αρνητικά στη δοκιµή της οξειδάσης και, με ελάχιστες εξαιρέσεις, θετικά στην δοκιµή της καταλάσης (Prescott et al. Microbiology 4th edition). Εικόνα 1Β: Καλλιέργεια Klebsiella pneumoniae Τα εντεροβακτήρια βρίσκονται στο έδαφος, στο νερό, τα φυτά, καθώς και στα ζώα, από τα έντοµα, µέχρι το γαστρεντερικό σωλήνα του ανθρώπου. Τα εντεροβακτηριακά αποτελούν σημαντικά αίτια λοιμώξεων (π.χ. ουρολοιμώξεων) (Chen et al. 2009). Νοσηλευόμενα ή ανοσοκατεσταλμένα άτομα, ειδικά ασθενείς που λαμβάνουν αντιμικροβιακή θεραπεία, συχνά αποικίζονται από Gram αρνητικούς βάκιλλους συμπεριλαμβανομένων και των εντεροβακτηριοειδών, με συχνό αποτέλεσμα την πρόκληση λοίμωξης. 15

1.2. ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟ ΤΩΝ ΕΝΤΕΡΟΒΑΚΤΗΡΙΟΕΙΔΩΝ Εικόνα 2. Σχηματική παράσταση Gram αρνητικού βακτηριακού κυττάρου Το κύτταρο των εντεροβακτηριοειδών περιλαμβάνει κυτταρικό τοίχωμα που περιβάλλει την κυτταροπλασματική μεμβράνη, χρωμόσωμα αποτελούμενο από δίκλωνο DNA και ριβοσώματα μικρότερα και απλούστερα από αυτά των ευκαρυωτικών κυττάρων. Συχνά διαθέτει και εξωχρωμοσωματικό DNA με τη μορφή πλασμιδίων. Η κυτταροπλασματική μεμβράνη που περιβάλλει το βακτηριακό κύτταρο αποτελείται από φωσφολιπίδια και πρωτεΐνες. Η κυριότερη λειτουργία της είναι η ρύθμιση της ροής θρεπτικών συστατικών και προϊόντων του μεταβολισμού. Εικόνα 3. Δομή πεπτιδογλυκάνης Το κυριότερο συστατικό του κυτταρικού τοιχώματος είναι η πεπτιδογλυκάνη. Ο ρόλος της πεπτιδογλυκάνης είναι η προστασία του κυττάρου από την υψηλή ωσμωτική πίεση του κυτταροπλάσματος και η διατήρηση του σχήματος του βακτηριακού κυττάρου. Η πεπτιδογλυκάνη αποτελείται από αλυσίδες αμινοσακχάρων (Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη και Ν-ακετυλομουραμικό οξύ) που συνδέονται με πεπτιδικές γέφυρες. Εξωτερικά της πεπτιδογλυκάνης υπάρχουν τρεις στιβάδες: μια στιβάδα λιποπρωτεΐνης, μια εξωτερική φωσφολιπιδική μεμβράνη και η στιβάδα των λιποπολυσακχαριτών. Ο χώρος μεταξύ της κυτταροπλασματικής μεμβράνης και της εξωτερικής μεμβράνης του κυτταρικού τοιχώματος ονομάζεται περιπλασμικός χώρος. 16

1.3. ΤΑ ΜΕΛΗ ΤΗΣ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ Enterobacteriaceae Η οικογένεια Enterobacteriaceae περιλαµβάνει τα παρακάτω γένη: Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Yersinia, Proteus, Citrobacter, Edwardsiella, Shigella, Enterobacter, Habnia, Serratia, Erwinia, Arsenophonus, Budvicia, Buttiauxella, Cedecea, Ewingella, Kluyvera, Leclercia, Leminorella, Moellerella, Morganella, Obesumbacterium, Pantoea, Pragia, Prividencia, Rahnella, Tatumella,Yokenella, Xenorhabdus. Στη παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν στελέχη του είδους Klebsiella pneumoniae. 1.4. Klebsiella spp. ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΚΑΙ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ Συνηθέστεροι τόποι αποικισμού των στελεχών του γένους Klebsiella spp αποτελούν αφ ενός το ευρύτερο περιβάλλον (νερό, έδαφος, φυτά) και αφ ετέρου οι βλεννογονικές επιφάνειες των θηλαστικών (άνθρωποι, άλογα, χοίροι) (Podschun R., 1998). Η Klebsiella spp. αποικίζει το αναπνευστικό σύστημα και τα κόπρανα φυσιολογικών ανθρώπων σε ποσοστό 5 % (Jawetz, Med. Microbiology) προκαλώντας δια του αποικισμού του περινέου, ουρολοιμώξεις. Επίσης αποικίζει νωρίς το φάρυγγα νοσηλευόμενων ασθενών και ευθύνεται για λοιμώξεις του κατωτέρου αναπνευστικού. Περιλαμβάνει τα είδη Klebsiella pneumoniae, oxytoca, planticolla και terrigena. Η Klebsiella pneumoniae χωρίζεται σε τρία υποείδη (Gorbach, Inf.Diseases). - Klebsiella pneumoniae subsp. Το ουροποιητικό σύστημα αποτελεί την κυριότερη εστία λοίμωξης, ιδίως σε άτομα με προδιαθεσικούς παράγοντες όπως σακχαρώδη διαβήτη και νευρογενή ουροδόχο κύστη. Προκαλεί το 3 % των βακτηριακών πνευμονιών - ιδίως σε χρόνιους αλκοολικούς- πολλές φορές με εκτεταμένες αιμορραγικές νεκρωτικές βλάβες. Επίσης είναι υπεύθυνη για την πρόκληση λοιμώξεων όπως σηψαιμία, περιτονίτιδα, ηπατικά αποστήματα, μηνιγγίτιδα, λοιμώξεις μαλακών μορίων και χειρουργικών τραυμάτων και λοιμώξεις σχετιζόμενες με κεντρικούς φλεβικούς καθετήρες. Ως ευκαιριακό παθογόνο, προσβάλλει πρωτίστως ανοσοκατασταλμένους ασθενείς που νοσηλεύονται με σοβαρά υποκείμενα νοσήματα όπως σακχαρώδης διαβήτης, χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια, νεοπλασίες υπό χημειοθεραπευτική αγωγή, αλλά και πρόωρα νεογνά νοσηλευόμενα σε Μονάδες Εντατικής Θεραπείας. - Klebsiella ozenae. Έχει απομονωθεί από ρινικό βλεννογόνο ασθενών με όζαινα - νόσος που σχετίζεται με ατροφική ρινίτιδα. - Klebsiella rhinoscleromatis. Έχει απομονωθεί από ρινοσκλήρωμα -χρόνια κοκκιωματώδης νόσος της ρινός- ενδημική σε ορισμένες χώρες. 17

-H Klebsiella oxytoca απομονώνεται με αυξημένη συχνότητα από βακτηριαιμίες, λοιμώξεις αναπνευστικού και ουροποιητικού, με το γαστρεντερικό σύστημα να αποτελεί τον κύριο φορέα. -Η Klebsiella planticolla αποτελεί μικροοργανισμό που έχει απομονωθεί κυρίως από το φυτικό, υδάτινο περιβάλλον και το έδαφος. Σε μεμονωμένες κλινικές περιπτώσεις, όπως και η Klebsiella terrigena, έχουν απομονωθεί κυρίως από βρογχικές εκκρίσεις και λιγότερο από ούρα και τραύμα. -Η Klebsiella ornithinolytica έχει απομονωθεί σε περιορισμένα δείγματα. Η κλινική σημασία της είναι αμφίβολη. Στους ανθρώπους, η K. pneumoniae ανευρίσκεται ως σαπρόφυτο στο ρινοφάρυγγα και το γαστρεντερικό σύστημα. Τα ποσοστά αποικισμού διαφέρουν ανάλογα με τη μελέτη. Το ποσοστό ανίχνευσης στα κόπρανα ποικίλλει από 5 σε 38 %, ενώ στο ρινοφάρυγγα από 1 έως 6%. Επειδή οι συνθήκες του ανθρώπινου δέρματος δεν είναι ιδανικές για την ανάπτυξη Gram αρνητικών μικροβίων, η K. pneumoniae σπανίως απομονώνεται από εκεί και θεωρείται ως ευκαιριακή χλωρίδα. Τα τελευταία ποσοστά αλλάζουν δραματικά στο νοσοκομειακό περιβάλλον και αυξάνονται αναλογικά με τη διάρκεια νοσηλείας, ιδίως σε μονάδες εντατικής θεραπείας. Σε συγκεκριμένες μελέτες σε νοσηλευόμενους ασθενείς τα ποσοστά φορείας ανέρχονταν σε 77 % στα κόπρανα, 19 % στο ρινοφάρυγγα και 42 % στα χέρια των ασθενών (Podschun and Ullman, 1998). Τα υψηλά ποσοστά φορείας σχετίζονται άμεσα με την εκτεταμένη χρήση αντιβιοτικών ευρέος φάσματος. Η ικανότητα του μικροοργανισμού να μεταδίδεται γρήγορα και να συγκεντρώνει εύκολα γονίδια αντοχής σε αντιμικροβιακά μέσω πλασμιδίων, οδηγεί σε νοσοκομειακές επιδημίες, ιδίως σε μονάδες νεογνών. Οι ενδονοσοκομειακές λοιμώξεις που οφείλονται σε πολυανθεκτικά στελέχη εμφανίζουν υψηλά ποσοστά θνητότητας από 24 έως 70 % ανάλογα με τη μελέτη. Η ορθολογική χρήση των αντιβιοτικών, η αυστηρή τήρηση των κανόνων διαχείρησης ουροκαθετήρων, τραχειοστομιών και τραυμάτων, η σωστή συντήρηση του νοσοκομειακού εξοπλισμού και το τακτικό πλύσιμο των χεριών του ιατρονοσηλευτικού προσωπικού, αποτρέπουν την ενδονοσοκομειακή εξάπλωση του μικροοργανισμού. 1.5. ΠΑΘΟΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ Klebsiella spp. ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΡΟΚΛΗΣΗ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ Χρησιμοποιήθηκαν in vitro και κυρίως in vivo μοντέλα σε επίμυες, προκειμένου να ταυτοποιηθούν στοιχεία του μικροβίου τα οποία αλληλεπιδρούν με τα κύτταρα του ξενιστή για την πρόκληση λοιμώξεων. Έχουν αναφερθεί πέντε συγκεκριμένοι παράγοντες: 18

Εικόνα 4. Σχηματική απεικόνιση παθογενετικών μηχανισμών (Podschun 1998) 1.5.1. ΚΑΨΙΔΙΚΑ ΑΝΤΙΓΟΝΑ Το καψιδικό περίβλημα του μικροβίου το οποίο αποτελείται από επαναλαμβανόμενες πολυσακχαριδικές ομάδες από 4 έως 6 σάκχαρα και ουρονικά οξέα, στοιχειοθετεί σημαντικό παράγοντα για τη μολυσματικότητά του (virulence). Προστατεύει το βακτήριο από τη φαγοκυττάρωση από τα πολυμορφοπύρηνα αφ ενός και τη βακτηριοκτόνο δράση του συμπληρώματος αφ ετέρου. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι οι καψιδικοί πολυσακχαρίτες αναστέλλουν τη διαφοροποίηση και τη λειτουργικότητα του μακροφάγου in vitro. Έως σήμερα έχουν ταυτοποιηθεί 77 ορότυποι, με διαβάθμιση όσον αφορά τη μολυσματικότητα, με σημαντικότερους τους Κ1, Κ2, Κ4 και Κ5. Η διαβάθμιση σχετίζεται άμεσα με το ποσοστό μαννόζης του καψιδικού πολυσακχαρίτη. Οι αλληλουχίες μαννόζη-α- 2/3-μαννόζη ή L-ραμνόζη-α-2/3-L-ραμνόζη αναγνωρίζονται από τη λεκτίνη στην επιφάνεια του μακροφάγου και ενεργοποιούν μια διεργασία φαγοκύττωσης ανεξάρτητη οψωνίνης, γνωστή ως λεκτινοφαγοκύττωση, η οποία καταλήγει στη θανάτωση του μικροβίου. Μικροβιακά στελέχη τα οποία στερούνται των ανωτέρω καψιδικών αλληλουχιών, δεν φαγοκυτταρώνονται και επομένως καθίστανται μολυσματικότερα. 1.5.2. ΙΝΙΔΙΑ (FIBRIAE) Τα ινίδια ή φίμπρια είναι λεπτές προεκτάσεις της βακτηριακής επιφάνειας μήκους 10μm και διαμέτρου από 1 έως 11nm με τις οποίες το μικρόβιο προσκολλάται στα επιθηλιακά κύτταρα του ουροποιητικού, αναπνευστικού και γαστρεντερικού συστήματος του ξενιστή. Ο τύπος 1 των ινιδίων διαθέτει επιπλέον την ικανότητα να προσκολλάται σε διαλυτές γλυκοπρωτεΐνες των ούρων που περιέχουν μαννόζη, όπως η Tamm Horsfall ή και 19

στο σάλιο, δικαιολογώντας τον αποικισμό της ουροποιογεννητικής και αναπνευστικής οδού από αντίστοιχα στελέχη, διαταραχή της υπάρχουσας χλωρίδας και επακόλουθη πρόκληση λοίμωξης σε ασθενείς με παράγοντες κινδύνου (σακχαρώδης διαβήτης, μηχανικός αερισμός, κ.λ.π.) 1.5.3. ΒΑΚΤΗΡΙΟΚΤΟΝΟΣ ΔΡΑΣΗ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΛΙΠΟΠΟΛΥΣΑΚΧΑΡΙΤΕΣ Οι πρωτεΐνες συμπληρώματος του ορού διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην άμυνα του ξενιστή κατά των μικροβίων, όπως και η φαγοκύττωση των πολυμορφοπύρηνων κοκκιοκυττάρων. Στόχος των ενεργοποιημένων πρωτεϊνών του συμπληρώματος είναι η πρόκληση διαμεμβρανικών ρηγμάτων στην εξωτερική μεμβράνη των Gram αρνητικών μικροβίων με αποτέλεσμα την εισροή ιόντων Νa και την ωσμωτική λύση του κυττάρου. Ο ακριβής μηχανισμός βακτηριακής αντοχής στο συμπλήρωμα δεν έχει διευκρινιστεί. Για την Klebsiella υπάρχουν δύο υποθέσεις. 1. Οι καψιδικοί πολυσακχαρίτες καλύπτουν τον υποκείμενο λιποπολυσακχαρίτη LPS και κυρίως το Ο αντιγόνο, παρουσιάζοντας επιφανειακή δομή που δεν ενεργοποιεί το συμπλήρωμα. 2. Τα ευαίσθητα στο συμπλήρωμα στελέχη ενεργοποιούν την κλασσική και την εναλλακτική οδό του συμπληρώματος. Η ενεργοποίηση και των δύο οδών οδηγεί σε υψηλότερα επίπεδα ενεργοποιημένου συμπληρώματος C3b, άρα και σε μεγαλύτερη κυτταρική καταστροφή. Τα ανθεκτικά στο συμπλήρωμα στελέχη διαθέτουν μεγάλου μήκους διακλαδισμένους λιποπολυσακχαρίτες που επιτρέπουν την ενεργοποίηση μόνο της εναλλακτικής οδού. Επιπρόσθετα, η απόσταση του τελικού συμπλέγματος από την κυτταρική επιφάνεια δεν επιτρέπει την αποτελεσματική προσβολή του βακτηριακού τοιχώματος. 1.5.4. ΣΙΔΗΡΟΦΟΡΑ (SIDEROPHORES) Πρόκειται για χαμηλού μοριακού βάρους χηλικούς παράγοντες οι οποίοι εκκρίνονται από τα βακτήρια προκειμένου να δεσμεύσουν τα απαραίτητα για τις λειτουργίες τους ιόντα σιδήρου από τις σιδηροδεσμευτικές πρωτεΐνες του ξενιστή, όπως η τρανσφερρίνη και η λακτοφερρίνη. Τα κυριότερα σιδηροφόρα είναι η εντεροβακτίνη και η αεροβακτίνη. Για το γένος Klebsiella, η εντεροβακτίνη παράγεται από όλα σχεδόν τα στελέχη, χωρίς όμως να συνδέεται με αυξημένη νοσογόνο δράση. Αντιθέτως η αεροβακτίνη παράγεται σπανιώτερα, αλλά η συμβολή της στη νοσογόνο δράση του μικροβίου είναι σαφώς τεκμηριωμένη. 20

2. ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ 2.1. ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΑΚΕΣ ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ Νοσοκομειακές χαρακτηρίζονται οι λοιμώξεις που εκδηλώνονται μετά την εισαγωγή των ασθενών στο νοσοκομείο. Οι περισσότερες παρουσιάζονται μερικές ημέρες μετά την εισαγωγή του ασθενούς, ενώ κάποιες μπορούν να εκδηλωθούν αρκετά αργότερα, ανάλογα με το χρόνο επώασης του αιτιολογικού παράγοντα και την ανοσολογική κατάσταση του αρρώστου. Η αναγνώριση και μελέτη των νοσοκομειακών λοιμώξεων έχει στόχο τον έλεγχο και την πρόληψη τους, μέσω της κατάλληλης οργάνωσης της φροντίδας των ασθενών στο νοσοκομειακό περιβάλλον (Farr, 2004). Οι πρώτες νοσοκομειακές λοιμώξεις καταγράφηκαν το μεσαίωνα, την ίδια εποχή που οργανώθηκαν τα πρώτα νοσοκομεία στην Ευρώπη. Εκείνη την εποχή, οι χειρουργικές επεμβάσεις ακολουθούνταν σχεδόν πάντα από λοιμώξεις. Οι πρώτες απόψεις για τον τρόπο διάδοσης των νοσοκομειακών λοιμώξεων διατυπώθηκαν στα μέσα του 19 ου αιώνα. Ο Ignaz Philip Semmelweis, διευθυντής σε νοσοκομείο της Βιέννης το 1843, μετά από παρατηρήσεις για τον τρόπο μετάδοσης των λοιμώξεων επέβαλε στο προσωπικό το πλύσιμο των χεριών πριν την εξέταση κάθε ασθενούς. Μεσολάβησαν μερικά χρόνια μέχρι τη μελέτη του Joseph Lister για το ρόλο των βακτηρίων στις λοιμώξεις χειρουργικών τραυμάτων, η οποία οδήγησε στην καθιέρωση της χρήσης αντισηπτικών στο χειρουργείο (Farr, 2004). Τα νοσοκομειακά παθογόνα είναι είτε ενδογενή, είτε εξωγενή. Τα μεν ενδογενή προέρχονται από τη φυσιολογική χλωρίδα του δέρματος, του γαστρεντερικού σωλήνα ή του αναπνευστικού συστήματος του ασθενούς. Τα εξωγενή παθογόνα μεταφέρονται στον ασθενή από πηγές όπως το μικροβιακό απόθεμα άλλων ασθενών ή και, στις περισσότερες περιπτώσεις, από το νοσηλευτικό προσωπικό, μέσω μολυσμένων επιφανειών ή συσκευών. Στην εκδήλωση νοσοκομειακής λοίμωξης συμβάλλουν οι ακραίες ηλικίες (νεογνά ή ηλικιωμένοι), τα υποκείμενα νοσήματα, ο βαθμός ανοσοκαταστολής, η παρουσία ανοιχτών τραυμάτων ή και χειρουργικών τομών, η χρήση καθετήρων, κ.α. Τα νοσοκομειακά παθογόνα εξελίχθηκαν παράλληλα με τις θεραπευτικές πρακτικές. Πριν την εισαγωγή των αντιμικροβιακών φαρμάκων στην κλινική πράξη, οι περισσότερες λοιμώξεις οφείλονταν στους μικροοργανισμούς S. pyogenes και S. aureus. Ωστόσο, η αυξανόμενη χρήση των αντισταφυλοκοκκικών πενικιλλινών κατέστησε τα Gram αρνητικά βακτήρια κυρίαρχα νοσοκομειακά παθογόνα. Σήμερα, εντεροβακτηριακά όπως E. coli, K. pneumoniae και Enterobacter spp., αλλά και άλλα είδη Gram αρνητικών βακτηρίων, όπως Pseudomonas aeruginosa και Acinetobacter baumannii, περιλαμβάνονται μεταξύ των κυριότερων αιτιολογικών παραγόντων νοσοκομειακών λοιμώξεων (Jernigan, 2004). 21

Οι νοσοκομειακές λοιμώξεις συνιστούν σημαντικό πρόβλημα για τη δημόσια υγεία, εξαιτίας του υψηλού ποσοστού θνησιμότητας, αλλά και του κόστους που συνεπάγεται η αντιμετώπιση τους. Οι συχνότερες νοσοκομειακές λοιμώξεις είναι οι ουρολοιμώξεις, οι λοιμώξεις χειρουργικών τραυμάτων, η πνευμονία και η βακτηριαιμία. Τα ποσοστά θνησιμότητας στα περιστατικά βακτηριαιμίας και πνευμονίας είναι 25-50% και 7-27%, αντίστοιχα, ανάλογα με τον αιτιολογικό παράγοντα της λοίμωξης και την υποκείμενη νόσο. Παράλληλα, η νοσηλεία επιμηκύνεται κατά 5-10 ημέρες κατά μέσο όρο για τους ασθενείς με λοίμωξη, ενώ όλες οι σχετικές μελέτες δείχνουν ότι οι νοσοκομειακές λοιμώξεις αυξάνουν σημαντικά το κόστος των υπηρεσιών υγείας (Struelens and Byl, 2004). 2.2. ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ ΑΠΟ Gram AΡΝΗΤΙΚΑ ΣΕ ΜΟΝΑΔΕΣ ΕΝΤΑΤΙΚΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ Περισσότερο από το 20% των ασθενών που εισάγονται στις μονάδες εντατικής θεραπείας (ΜΕΘ) αναπτύσσουν λοιμώξεις κατά τη διάρκεια της νοσηλείας τους. Οι ασθενείς αυτοί έχουν μεγαλύτερη πιθανότητα ανάπτυξης ενδονοσοκομειακής λοίμωξης συγκριτικά με αυτούς που εισάγονται στα υπόλοιπα τμήματα του νοσοκομείου. Οι λοιμώξεις αυτές που συχνά οφείλονται σε πολυανθεκτικά παθογόνα, σχετίζονται με αυξημένη θνησιμότητα, αυξημένο χρόνο μηχανικής υποστήριξης και παραμονής στη ΜΕΘ, αυξημένη ενδονοσοκομειακή νοσηλεία και αυξημένο κόστος νοσηλείας (Vincent et al, 1995). Τα εντεροβακτηριακά, οι ψευδομονάδες και τα Acinetobacter spp. είναι τα σημαντικότερα αίτια νοσοκομειακών λοιμώξεων στις ΜΕΘ. Σύμφωνα με τα στοιχεία του National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) των ΗΠΑ κατά την περίοδο 1986-2003 συχνότερες εστίες ήταν το αναπνευστικό σύστημα και το ουροποιητικό σύστημα. 2.3. ΑΝΤΟΧΗ ΣΤΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ Σημαντική συνέπεια της ευρείας κλινικής χρήσης των αντιβιοτικών είναι η ανάδυση βακτηριακών στελεχών, ανθεκτικών στα αντιβιοτικά. Σε μικρό χρονικό διάστημα, η χρήση της πενικιλλίνης για την αντιμετώπιση σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων έπαψε να έχει αποτέλεσμα, αφού οι νοσοκομειακές λοιμώξεις από στελέχη S. aureus ανθεκτικά στην πενικιλλίνη πήραν διαστάσεις πανδημίας (Farr, 2004). Στις δεκαετίες του 1980 και 1990, η εντατική χρήση αντιμικροβιακών ευρέος φάσματος σε συνδυασμό με την επιμήκυνση του χρόνου επιβίωσης βαρειά ασθενών και του αυξανόμενου πληθυσμού ανοσοκατεσταλμένων ασθενών συνέβαλαν στην εξάπλωση των ανθεκτικών νοσοκομειακών παθογόνων. Οι ανθεκτικές στα αντιβιοτικά λοιμώξεις εντείνουν τα προβλήματα που ούτως ή άλλως θέτει μια νοσοκομειακή λοίμωξη, γιατί επιμηκύνουν το χρόνο νοσηλείας, αυξάνουν τον κίνδυνο επιπλοκών και θανάτου του ασθενούς και αυξάνουν το κόστος νοσηλείας περισσότερο από ότι οι λοιμώξεις από ευαίσθητα στα αντιβιοτικά βακτηριακά στελέχη. 22

Η ολοένα αυξανόμενη συχνότητα λοιμώξεων από ανθεκτικά βακτήρια, επιβάλλει τη λήψη δραστικών μέτρων. Έχει προταθεί ο περιορισμός της χρήσης νεότερων αντιβιοτικών, αν και αυτό το μέτρο δεν είναι πάντα ιδιαίτερα αποτελεσματικό (Farr, 2004). Μια πρακτική που φαίνεται να είναι αποτελεσματική, είναι ο εντοπισμός και η ιδιαίτερη αντιμετώπιση των αποικισμένων νοσηλευομένων ασθενών έτσι ώστε να περιορίζεται η διασπορά των ανθεκτικών στελεχών στο νοσοκομείο. 3. ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΑ β-λακταμικα ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ Tα Gram αρνητικά μικρόβια έχουν στη διάθεσή τους πληθώρα μηχανισμών αντίστασης στις καβαπενέμες και τις άλλες β-λακτάμες. Οι κυριότεροι μηχανισμοί είναι: - η τροποποίηση των πενικιλλινοδεσμευτικών πρωτεϊνών (τροποποίηση στόχου δράσης) - η παρεμπόδιση της εισόδου του φαρμάκου -συνήθως μέσω μεταλλάξεων στις πρωτεΐνες της εξωτερικής μεμβράνης - ενεργοποίηση αντλιών ενεργητικής αποβολής του αντιβιοτικού (αντλίες εκροής- efflux pumps). -η παραγωγή β-λακταμασών που υδρολύουν τις καρβαπενέμες (καρβαπενεμάσες). Στα εντεροβακτηριακά, η μείωση της διαπερατότητας της εξωτερικής μεμβράνης και η παραγωγή β-λακταμασών είναι οι σημαντικότεροι μηχανισμοί αντοχής στα β-λακταμικά αντιβιοτικά περιλαμβανομένων και των καρβαπενεμών. 3.1.ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΤΗΣ ΕΞΩΤΕΡΙΚΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ (ΟΜΡs) Εικόνα 5. Εξωτερική μεμβράνη βακτηριακού κυττάρου Η εξωτερική μεμβράνη του βακτηριακού κυττάρου διαχωρίζει το κυτταρόπλασμα από το εξωτερικό περιβάλλον και λειτουργεί ως φραγμός στην είσοδο ουσιών όπως τα αντιβιοτικά (Sutherland R., 1993). Τα β-λακταμικά αντιβιοτικά διέρχονται μέσω των πρωτεϊνικών πόρων της εξωτερικής μεμβράνης (Outer Membrane Porins, ΟΜΡs) για να αναστείλουν τα ένζυμα (τρανσπεπτιδάσες) που είναι υπεύθυνα για την παραγωγή της πεπτιδογλυκάνης. Αντοχή 23

μπορεί να προκύψει από μείωση είτε της λειτουργικότητας είτε της έκφρασης των πρωτεϊνικών πόρων. Οι αλλαγές αυτές οφείλονται σε ποικιλία μεταλλάξεων, είτε στα δομικά είτε στα αντίστοιχα ρυθμιστικά γονίδια (Nikaido H., 1989). 3.2. ΠΑΡΑΓΩΓΗ β-λακταμασων Η παραγωγή β-λακταμασών είναι ο σημαντικότερος μηχανισμός άμυνας των Gram αρνητικών βακτηρίων έναντι των β-λακταμικών αντιβιοτικών (Sanders et al. 1992). Οι β- λακταμάσες υδρολύουν το β-λακταμικό δακτύλιο με αποτέλεσμα να απενεργοποιούν το φάρμακο. Στα Gram αρνητικά βακτήρια, οι β-λακταμάσες παράγονται και δρουν στον περιπλασμικό χώρο μεταξύ της εξωτερικής και της κυτταροπλασματικής μεμβράνης, ενώ στα Gram θετικά βακτήρια οι β-λακταμάσες είναι εξωένζυμα που διαχέονται στο περιβάλλον των βακτηρίων (Sutherland R., 1993). Η πρώτη β-λακταμάση εντοπίστηκε πριν από την θεραπευτική χρήση της πενικιλλίνης (Αbraham and Chain, 1940, Kirby, 1944). Εξελικτικά, οι β-λακταμάσες πιθανά προέχονται από τις πενικιλλινοδεσμευτικές πρωτεΐνες (το στόχο των β-λακταμικών αντιβιοτικών), με τις οποίες παρουσιάζουν δομικές και λειτουργικές ομοιότητες (Richmond M. & Sykes R., 1973). Τα Gram αρνητικά βακτήρια παράγουν πολυάριθμες β-λακταμάσες, οι οποίες κωδικοποιούνται από γονίδια που εντοπίζονται στο βακτηριακό χρωμόσωμα, αλλά και σε πλασμίδια. 4. β-λακταμασεσ Εικόνα 6. Η πλασμιδιακή β-λακταμάση TEM-1 (Datta and Κontomichalou, 1965) Οι β-λακταμάσες είναι βακτηριακά ένζυμα που αδρανοποιούν τα β-λακταμικά αντιβιοτικά. Εκκρίνονται στον εξωκυττάριο χώρο στα Gram θετικά ενώ στα Gram αρνητικά εντοπίζονται κυρίως στον περιπλασμικό χώρο. Τα γονίδια που κωδικοποιούν τις β-λακταμάσες μπορούν να έχουν χρωμοσωματική ή πλασμιδιακή προέλευση. Οι β-λακταμάσες προϋπήρχαν της θεραπευτικής χρήσης των 24

αντιβιοτικών. Θεωρείται ότι αναπτύχθηκαν για να προστατεύσουν τα βακτήρια από τα φυσικά β-λακταμικά παράγωγα στρεπτομυκήτων, μυκήτων και άλλων μικροοργανισμών. Οι πλασμιδιακές β-λακταμάσες, φυλογενετικά προέρχονται από τις χρωμοσωματικές, αλλά τα γονίδιά τους φέρονται σε πλασμίδια ή μεταθετά στοιχεία. Θεωρείται ότι τα γονίδιά τους "αποσπάστηκαν από διάφορα χρωμοσώματα και ενσωματώθηκαν σε "κινητά στοιχεία" (πλασμίδια, μεταθετά στοιχεία). 4.1. ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΔΡΑΣΗΣ β-λακταμασων Οι β-λακταμάσες αδρανοποιούν τις β-λακτάμες υδρολύοντας τον αμιδικό δεσμό Ο=C-N του β-λακταμικού δακτυλίου. Στις περισσότερες β-λακταμάσες η υδρόλυση επιτυγχάνεται με αντίδραση ακυλίωσης μεταξύ του καρβονυλίου του β-λακταμικού δακτυλίου και του υδροξυλίου της σερίνης του ενεργού κέντρου. Η αντίδραση αυτή έχει ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό εστέρα, ο οποίος στη συνέχεια υδρολύεται. Το προϊόν υδρόλυσης του φαρμάκου είναι ανενεργό. Τα μεταλλοένζυμα αποτελούν μία μικρότερη κατηγορία β-λακταμασών με αυξανόμενη όμως κλινική σημασία. Ο μηχανισμός υδρόλυσης είναι διαφορετικός και απαιτεί την παρουσία ιόντων ψευδαργύρου. Οι β-λακταμάσες χαρακτηρίζονται από σχετική ειδικότητα υποστρώματος (το κάθε ένζυμο υδρολύει συνήθως μια μικρή ομάδα αντιβιοτικών). Εικόνα 7. Μεταλλο-ένζυμο με ιόντα ψευδαργύρου στο ενεργό κέντρο. 4.2. ΚΑΤΑΤΑΞΗ β-λακταμασων Η πρώτη προσπάθεια ταξινόμησης των β-λακταμασών έγινε από τους Richmond και Sykes βάσει λειτουργικών κριτηρίων, όπως το φάσμα και ο ρυθμός υδρόλυσης των υποστρωμάτων, το μοριακό βάρος και το ισοηλεκτρικό σημείο των β-λακταμασών (Richmond, 1973). Από τότε έχουν προταθεί αρκετά σχήματα με επικρατέστερα: α) το δομικό σχήμα κατά Ambler (Αmbler et al, 1980) και β) το λειτουργικό σχήμα κατά Bush- Jacoby-Medeiros (Bush, Jacoby and Medeiros, 1995). 25

Το πρώτο σχήμα ταξινόμησης με βάση την αλληλουχία και τη μοριακή δομή (μοριακή ταξινόμηση) προτάθηκε από τον Ambler το 1980. Η ταξινόμηση κατέληξε σε 4 μεγάλες ομάδες που συμβαδίζουν ικανοποιητικά με τη λειτουργική ταξινόμηση, αλλά υστερούν στην ανάλυση της ενζυμικής δραστηριότητας. Οι ομάδες A, C και D περιλαμβάνουν τις β-λακταμάσες με σερίνη στο ενεργό κέντρο και η ομάδα Β τα μεταλλοένζυμα με Zn στο ενεργό κέντρο. Με βάση τη λειτουργική ταξινόμηση που προτάθηκε για πρώτη φορά από την Bush το 1988, οι β-λακταμάσες χωρίζονται σε μεγάλες ομάδες (groups 1-4) με πολλαπλές υποομάδες της ομάδας 2 που διαφοροποιούνται ανάλογα με το υπόστρωμα υδρόλυσης και την ευαισθησία στους αναστολείς. Σ αυτή τη λειτουργική ταξινόμηση, οι καρβαπενεμάσες κατέχουν τις υποομάδες 2f, 2d και 3. Το νεότερο σύστημα κατάταξης των β-λακταμασών κατά Bush, Jacoby και Medeiros (Bush, Jacoby and Medeiros, 1995) είναι στην ουσία βελτίωση του λειτουργικού συστήματος κατά Bush. Τα δύο κυριότερα σχήματα ταξινόμησης των β-λακταμασών παρουσιάζονται συγκριτικά στον Πίνακα 1 που περιλαμβάνει τους αναστολείς, τα κύρια υποστρώματα, καθώς και τα βασικά χαρακτηριστικά της κάθε ομάδας. Πίνακας 1. Τα δύο κυριότερα σχήματα ταξινόμησης των β-λακταμασών Ταξινομικά σχήματα Κατά Bush, Κατά Jacoby Ambler και Medeiros Αναστολείς Αντιπροσωπευτικά ένζυμα/ Κύρια χαρακτηριστικά 2a Κλαβουλανικό οξύ Πενικιλλινάσες Gram θετικών βακτηρίων A 2b Κλαβουλανικό οξύ Ευρέος φάσματος (Βroad Spectrum) ΤΕΜ-1- TEM-2 SHV-1 Oρισμένες τύπου ΟΧΑ Πλασμιδιακές και χρωμοσωματικές 26

Ευθύνονται για την επίκτητη αντοχή στις πενικιλλίνες ευρέος φάσματος 2be 2br 2c 2e 2f Κλαβουλανικό οξύ Μικρή αναστολή από κλαβουλανικό οξύ Κλαβουλανικό οξύ Κλαβουλανικό οξύ Κλαβουλανικό οξύ - Ταζομπακτάμη Eκτεταμένου φάσματος (Extended Spectrum ESBL s) ΤΕΜ- και SHV- Προέρχονται από τις αρχικές ΤΕΜ 1 και 2 και SHV-1 Εμφανίστηκαν το 1983 και έκτοτε υπάρχει παγκόσμια διασπορά Παρουσιάζονται συχνότερα σε K. pneumoniae και E. coli Κωδικοποιούνται από γονίδια που φέρονται σε πλασμίδια (συχνά μαζί με άλλα γονίδια αντοχής) Υδρολύουν πενικιλλίνες, μονοβακτάμες και τις κεφαλοσπορίνες, εκτός από την κεφοξιτίνη Νεότερες ESBL s (τύπου CTX-M, 1-69) Άλλες ESBL s (GES- 1, -3, -7, -8, -9, PER-1, -2, -3, VEB 1-6, BES-1, BEL-1, SFO-1) Ανιχνεύονται με μέτρηση ζωνών αναστολής, δοκιμή συνέργειας των δύο δίσκων. Inhibitor Resistant TEM (IRT) TEM-30-TEM-50 Kαρβεκιλλινάσες PSE-1, PSE-3, PSE-4 Κεφουροξιμάσες Καρβαπενεμάσες τάξης Α Στο σύνολο τους επίκτητες Eμφανίστηκαν για πρώτη φορά πριν την κλινική χρήση της ιμιπενέμης, την δεκαετία του 80 σε στελέχη Enterobacter cloacae, Serratia marcescens και Klebsiella spp. Χρωμοσωματικές κυρίως (SME-1, -2, -3, IMI-1, -2, NMC-A) - αναστέλλονται εν μέρει από τους αναστολείς. Μεμονωμένες περιπτώσεις πλασμιδιακής ΙΜΙ-2 σε Enterobacter asburiae και Ε. cloacae. Πλασμιδιακές (KPC-1, -2, -3, -4 έως 12, GES/IBC) 27

B 3 EDTA C 1 - Οι KPC καρβαπενεμάσες φαίνεται ότι διαθέτουν τη μεγαλύτερη ικανότητα διασποράς και τα στελέχη που τις παράγουν είναι συχνά πολυανθεκτικά. Oι τιμές MIC της ιμιπενέμης μπορούν να ποικίλλουν από 4 μg/ml έως πλήρους αντοχής, γι αυτό και συχνά υποδιαγιγνώσκονταν σε έλεγχο ρουτίνας με τα κριτήρια του CLSI (2009). Υδρολύουν καρβαπενέμες, κεφαλοσπορίνες, πενικιλλίνες και αζτρεονάμη Μεταλλο-καρβαπενεμάσες Ταξινομούνται σε: VIM, IMP, GIM, SPM, SIM, NDM, ΚΗΜ, AIM και DIM. Παρουσιάζουν ευρεία διασπορά με κυριότερες στον ελλαδικό χώρο τις ενζυμικές ποικιλίες VIM-1, -2 και -4. Υδρολύουν όλα τα β-λακταμικά εκτός από την αζτρεονάμη και αναστέλλονται από το EDTA, ενώ δεν αναστέλλονται από το κλαβουλανικό οξύ. Κωδικοποιούνται από γονίδια που φέρονται συνήθως σε ενσωματόνια τάξης 1. Η παραγωγή μεταλλοενζύμου δεν αυξάνει πάντα την αντοχή στις καρβαπενέμες τόσο ώστε να θεωρηθεί ανθεκτικό το στέλεχος. Για την ανίχνευση τους, χρησιμοποιείται ένας αναστολέας του ενζύμου (EDTA) σε συνδυασμό με καρβαπενέμη ή/και κεφταζιδίμη. Το EDTA αναστέλλει την καρβαπενεμάση και ελαττώνει το επίπεδο αντοχής. AmpC β-λακταμάσες Κεφαλοσπορινάσες CIT-, ENT-, FOX-, MOX-, DHA-, CMY, LAT και ACC- Η έκφραση τους είναι ιδιοσυστασιακή, είτε επαγώγιμη, είτε αποκατεσταλμένη Παράδειγμα χρωμοσωματικών και επαγώγιμων: Enterobacter spp, Acinetobacter spp, Serratia spp., Pseudomonas spp. Παράδειγμα χρωμοσωματικών και μη επαγώγιμων: E. coli Παράδειγμα πλασμιδιακών: E. coli, Klebsiella spp, P. mirabillis Υδρολύουν όλα τα β-λακταμικά αντιβιοτικά, εκτός από την κεφεπίμη και τις καρβαπενέμες Έχει παρατηρηθεί αντοχή στις καρβαπενέμες σε συνδυασμό 28

D - 4 2d Ποικίλη αναστολή από κλαβουλανικό οξύ Κλαβουλανικό οξύ με απώλεια πορινών Δεν αναστέλλονται από το κλαβουλανικό οξύ Καρβαπενεμάσες τάξης D Πλασμιδιακές- Κυρίως σε Acinetobacter baumannii Ετερογενής ομάδα ως προς τη δομή και τις βιοχημικές ιδιότητες OXA-1- OXA-11-15-18-45, PSE-2 (ή ΟΧΑ-10) Έχουν ανιχνευτεί 102 διακριτές ΟΧΑ αλληλουχίες 9 υποομάδες με βάση την αλληλουχία αμινοξέων Οι ΟΧΑ καρβαπενεμάσες αποτελούν τον βασικότερο μηχανισμό αντοχής στις καρβαπενέμες στο γένος A. baumannii To φάσμα υδρόλυσης ποικίλλει. Υδρολύουν τις πενικιλλίνες, αλλά ελάχιστα έως καθόλου τις εκτεταμένου φάσματος κεφαλοσπορίνες και την αζτρεονάμη Έχουν χαμηλότερη υδρολυτική δράση έναντι των καρβαπενεμών σε σχέση με τα μεταλλοένζυμα. Ωστόσο σε κλινικά στελέχη παρουσιάζεται υψηλή αντοχή λόγω της συνύπαρξης άλλων μηχανισμών αντοχής. Πενικιλλινάσες από Pseudomonas cepacia 5. ΚΑΡΒΑΠΕΝΕΜΑΣΕΣ 5.1. ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ ΚΑΙ ΜΕΤΑΔΟΣΗ Οι καρβαπενέμες προέρχονται από τις θειεναμυκίνες- φυσικό προϊόν από τον μικροοργανισμό του εδάφους Streptomyces cattleya. Στην πραγματικότητα οι καρβαπενέμες και τα ολιβανικά οξέα αποτελούν τις πλέον φυσικές β-λακτάμες που αναγνωρίζονται σε διάφορες πηγές του περιβάλλοντος. Εξαιτίας της ύπαρξης αυτών των μορίων στο έδαφος, είναι αναμενόμενο ότι και και τα ένζυμα που τα αποδομούν θα παράγονται από μικροοργανισμούς του περιβάλλοντος, όπως Bacillus cereus και Βacillus anthracis, βακτήρια με καλά χαρακτηρισμένες μεταλλο-β-λακταμάσες οι οποίες έδωσαν πλεονέκτημα στην ανάπτυξη και επιβίωση των στελεχών αυτών. Αυτές οι χρωμοσωμικές β-λακταμάσες εξελίχθηκαν αρχικά ως μηχανισμός προστασίας του κυτταρικού τοιχώματος των μικροβίων, 29

αλλά επιπρόσθετα συμμετείχαν στη ρύθμιση της σύνθεσής του. Ομοίως ανευρέθη SFC-1 (class A καρβαπενέμάση) σε περιβαλλοντικό στέλεχος Serratia fonticola, OXA-50 σε Pseudomonas aeruginosa, OXA-51 σε Acinetobacter baumannii, OXA-62 σε Pandorea promenusa και OXA-54 σε Shewanella spp., ένζυμα τα οποία αποτελούν φυσικά παράγωγα του μικροβιακού γονιδιώματος. Το πρόβλημα της μετάδοσης της αντοχής στις καρβαπενέμες εντάθηκε όταν τα συγκεκριμένα γονίδια συνδέθηκαν με μεταθετά στοιχεία, όπως πλασμίδια και ιντεγκρόνια. Αντιστρόφως, μεταλλοένζυμα τα οποία αρχικά απομονώθηκαν σε νοσοκομεία, τώρα ανευρίσκονται και σε περιβαλλοντικά βακτήρια. Παράδειγμα αποτελεί η VIM-2 καρβαπενεμάση η οποία ανιχνεύεται σε στέλεχος Pseudomonas pseudoacaligenes σε νοσοκομειακό σύστημα διαχείρησης υδάτων, αλλά και η ανίχνευση ΙΜΙ-2 καρβαπενεμάσης σε πλασμίδιο σπάνιων στελεχών Εnterobacter asburiae από ποτάμια των ΗΠΑ τα οποία δεν συσχετίζονται με κατοικημένες περιοχές. Προφανώς η μετάδοση των γονιδίων που κωδικοποιούν καρβαπενεμάσες συμβαίνει σε δύο κατευθύνσεις: πηγές του φυσικού περιβάλλοντος παρέχουν το γενετικό υλικό των ενζύμων, αλλά και κλινικά στελέχη διαχέουν τα σχετικά γονίδια ενδονοσοκομειακά, αλλά και στο φυσικό περιβάλλον. 5.2. ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΚΑΡΒΑΠΕΝΕΜΑΣΩΝ -ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ Μεταξύ των β-λακταμασών, η οικογένεια των καρβαπενεμασών περιλαμβάνει ένζυμα με την ισχυρότερη υδρολυτική δράση και το ευρύτερο φάσμα υποστρωμάτων (Queenan and Bush, 2007). Οι καρβαπενεμάσες χωρίζονται σε δύο «μοριακές» οικογένειες με βάση τη συγκρότηση του ενεργού κέντρου και τον υδρολυτικό μηχανισμό. -Οι πρώτες καρβαπενεμάσες που περιγράφηκαν απομονώθηκαν από Gram θετικούς βάκιλλους. Σε αντίθεση με τις ως τότε γνωστές β-λακταμάσες, αναστέλλονταν από EDTA και χαρακτηρίστηκαν ως μεταλλοένζυμα. Αργότερα διαπιστώθηκε ότι περιείχαν τουλάχιστον ένα κατιόν ψευδαργύρου στο ενεργό κέντρο (συμπαράγοντας της ενζυμικής υδρόλυσης του β-λακταμικού δακτυλίου). -Στα μέσα της δεκαετίας του 1980 απομονώθηκαν από τα εντεροβακτηριακά, καρβαπενεμάσες που δεν αναστέλλονταν από το EDTA, αλλά από τους άλλους β- λακταμικούς αναστολείς (ταζομπακτάμη και κλαβουλανικό οξύ). Τα ένζυμα αυτά χρησιμοποιούσαν σερίνη στο ενεργό κέντρο τους Μέχρι τις αρχές της δεκαετίας του 1990, όλες οι καρβαπενεμάσες χαρακτηρίζονταν ως χρωμοσωμιακές, ειδικές για κάθε είδος, με πολύ συγκεκριμένα χαρακτηριστικά. Όμως η ανακάλυψη της πλασμιδιακά μεταφερόμενης ΙΜΡ-1 (καρβαπενεμάση τάξης Β) σε στέλεχος 30

Pseudomonas aeruginosa, της ΟΧΑ-23 (καρβαπενεμάση τάξης D) σε στέλεχος Acinetobacter baumannii και του ενζύμου KPC-1 (καρβαπενεμάση τάξης Α) σε στέλεχος Klebsiella pneumoniae, άλλαξε την επικρατούσα άποψη για τον τρόπο διασποράς των αντίστοιχων γονιδίων. 5.3. ΚΑΡΒΑΠΕΝΕΜΑΣΕΣ TAΞΗΣ Α Τα ένζυμα αυτά ανήκουν, ως αναφέρθηκε ανωτέρω, στη λειτουργική ομάδα 2f κατά Bush και φέρουν σερίνη στο ενεργό κέντρο τους. Eμφανίστηκαν για πρώτη φορά πριν την κλινική χρήση της ιμιπενέμης, την δεκαετία του 1980 και απομονώθηκαν είτε μεμομονωμένα είτε σε μικρές επιδημίες από στελέχη Enterobacter cloacae, Serratia marcescens και Klebsiella spp. Χαρακτηρίζονται από μειωμένη ευαισθησία στην ιμιπενέμη, αλλά οι MICs ποικίλλουν από 4 μg/ml έως πλήρους αντοχής, γι αυτό και συχνά υποδιαγιγνώσκονταν σε έλεγχο ρουτίνας με τα κριτήρια CLSI 2009. Υδρολύουν καρβαπενέμες, κεφαλοσπορίνες, πενικιλλίνες και αζτρεονάμη και αναστέλλονται από κλαβουλανικό οξύ και ταζομπακτάμη. 5.3.1. ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΕΣ ΚΑΡΒΑΠΕΝΕΜΑΣΕΣ ΤΑΞΗΣ Α -SME 1-2-3 (Serratia Μarcescens Enzyme) Aνιχνεύτηκαν πρώτη φορά το 1982 στην Αγγλία και στη συνέχεια στις ΗΠΑ σε στελέχη Serratia marcescens. -ΙΜΙ -1-2 (Imipenem-hydrolyzing β-lactamase) και -NMC-A (Non Metallo-enzyme Carbapenemase) Aνιχνεύτηκαν αρχικά σε στελέχη Enterobacter cloacae σε ΗΠΑ, Γαλλία και Αργεντινή. Είναι χρωμοσωμικά ένζυμα, αν και υπάρχουν μεμονωμένες περιπτώσεις απομόνωσης πλασμιδιακής ΙΜΙ -2 σε στελέχη του γένους Enterobacter. 5.3.2. ΠΛΑΣΜΙΔΙΑΚΕΣ ΚΑΡΒΑΠΕΝΕΜΑΣΕΣ ΤΑΞΗΣ Α -KPC 1-2-3-4 έως 12 (Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase) Ανιχνεύτηκαν πρώτη φορά το 1996 στις ΗΠΑ σε στέλεχος Klebsiella pneumoniae, ωστόσο έχουν απομονωθεί και από Enterobacter spp. και Salmonella spp. Παρά την ευρεία επικράτηση στην αμερικανική ήπειρο, πολύ σύντομα επεκτάθηκαν στην Ευρώπη και στην Κίνα. Διαθέτουν τη μεγαλύτερη ικανότητα διασποράς σε σχέση με άλλες καρβαπενεμάσες και τα στελέχη που τις παράγουν ενδημούν κυρίως σε νοσοκομειακό περιβάλλον. Συχνά είναι πολυανθεκτικά υδρολύοντας αποτελεσματικά πενικιλλίνες, κεφαλοσπορίνες, αζτρεονάμη και καρβαπενέμες, αφήνοντας περιορισμένες θεραπευτικές επιλογές και υψηλά ποσοστά θνητότητας (Nordmann et all, 2011). Η ανίχνευσή τους αποτέλεσε σημαντικό πρόβλημα διότι υπήρχε αναντιστοιχία μεταξύ των MICs και των ισχυόντων breakpoints στην ιμιπενέμη. 31

-GES/ IBC (Guiana Extended Spectrum / Integron-Borne Cephalosporinase) Aνιχνεύτηκαν πρώτη φορά το 2000 σε στέλεχος Enterobacter cloacae στην Ελλάδα και σε στέλεχος Klebsiella pneumoniae στη Γαλλική Γουϊάνα. Τα συγκεκριμένα γονίδια εδράζονταν σε ιντεγκρόνια ή πλασμίδια, γεγονός που συντέλεσε στην παγκόσμια εξάπλωσή τους, παρά το γεγονός ότι σχετίζονται κυρίως με σποραδικά κρούσματα και μικρής έκτασης νοσοκομειακές επιδημίες. 5.4. ΚΑΡΒΑΠΕΝΕΜΑΣΕΣ ΤΑΞΗΣ D Τα ένζυμα αυτά ανήκουν στη λειτουργική ομάδα 2d κατά Bush και φέρουν σερίνη στο ενεργό κέντρο τους. Αναφέρονται και ως ΟΧΑ (oxacillin-hydrolysing) β-λακταμάσες και αποτέλεσαν τις κυριότερες πλασμιδιακές β-λακταμάσες στα τέλη της δεκαετίας του 1970. Αποτελούν ετερογενή ομάδα ως προς τη δομή και τις βιοχημικές ιδιότητες. Έχουν ποικίλλη αναστολή από κλαβουλανικό οξύ. To φάσμα υδρόλυσης τους ποικίλλει. Υδρολύουν τις πενικιλλίνες, αλλά ελάχιστα έως καθόλου τις εκτεταμένου φάσματος κεφαλοσπορίνες και την αζτρεονάμη. Έχουν χαμηλότερη υδρολυτική δράση έναντι των καρβαπενεμών σε σχέση με τα μεταλλοένζυμα. Ωστόσο σε κλινικά στελέχη παρουσιάζεται υψηλή αντοχή λόγω της συχνής συνύπαρξης άλλων μηχανισμών. Έως σήμερα έχουν ταυτοποιηθεί 102 διακριτές ΟΧΑ β-λακταμάσες. Από αυτές, οι 9 αποτελούν ευρέος φάσματος β-λακταμάσες και τουλάχιστον 37 θεωρούνται καρβαπενεμάσες. Οι ΟΧΑ καρβαπενεμάσες αποτελούν τον βασικότερο μηχανισμό αντοχής στις καρβαπενέμες στο είδος A. baumannii. Έχουν ανιχνευτεί επίσης σε στελέχη Enterobacteriaceae και Pseudomonas aeruginosa. 5.5. ΜΕΤΑΛΛΟ-β-ΛΑΚΤΑΜΑΣΕΣ ΤΑΞΗΣ Β Αυτή η κατηγορία των β-λακταμασών που ανήκει στην ομάδα 3 κατά Bush, χαρακτηρίζεται από την ικανότητα υδρόλυσης όλων των β-λακταμών πλην της αζτρεονάμης. Ο μηχανισμός της υδρόλυσης εξαρτάται από την αλληλεπίδραση υποστρώματος με τα κατιόντα Zn στο ενεργό κέντρο του ενζύμου, προσδίδοντας έτσι το τυπικό χαρακτηριστικό της αναστολής από το EDTA (χηλικός παράγοντας δέσμευσης του Zn). Το κλαβουλανικό οξύ και η ταζομπακτάμη είναι αδρανή κατά των μεταλλο-β-λακταμασών. Συγκριτική ανάλυση των μεταλλο-β-λακταμασών έδειξε ότι όλα τα ένζυμα διατηρούν σταθερό ενεργό κέντρο με δύο περιοχές που δεσμεύουν ένα ή δύο κατιόντα Zn ανάλογα με την ποσότητα ελεύθερων κατιόντων Zn στον περιπλασμικό ή εξωκυττάριο χώρο και την ύπαρξη υποστρώματος (Wommer et al, 2002). Εξαιτίας της χαμηλής συγκέντρωσης των ελεύθερων κατιόντων Zn στον περιπλασμικό χώρο, οι μεταλλο-β-λακταμάσες πιθανολογείται ότι βρίσκονται σε κατάσταση αποενζύμου ελλείψει υποστρώματος. Η 32

παρουσία του τελευταίου πιθανά επάγει την ενεργοποίηση του ενζύμου με τη μονοκατιονική του μορφή. Η δικατιονική μορφή θεωρείται από μελετητές ότι σταθεροποιείται σε συνθήκες με σημαντικά υψηλή συγκέντρωση κατιόντων Zn και γι αυτό θεωρείται μάλλον τεχνητή, εκτός εάν το μοναδικό κατιόν μετακινείται μεταξύ των θέσεων πρόσδεσης κατά τη διάρκεια της κατάλυσης (Heinz U., 2004). Σε κάθε περίπτωση, η δομή του ενζύμου είναι τέτοια, ώστε να μπορεί να υποδέχεται και να υδρολύει τα περισσότερα β-λακταμικά αντιβιοτικά (Wang, 1999). Εικόνα 8. Ενεργό κέντρο μεταλλοενζύμου 5.5.1. ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΕΣ ΚΑΡΒΑΠΕΝΕΜΑΣΕΣ ΤΑΞΗΣ Β Οι πρώτες μεταλλο-β-λακταμάσες που ανιχνεύτηκαν και μελετήθηκαν αποτελούσαν χρωμοσωμιακά ένζυμα σε περιβαλλοντικά και ευκαιριακά παθογόνα, όπως Bacillus cereus, Flavobacterium spp., Chryseobacterium spp., Llegionella gormanii, Janthinobacterium lividum, Aeromonas spp. και Stenotrophomonas maltophilia, τα οποία εξέφραζαν τουλάχιστον μία β-λακταμάση με σερίνη στο ενεργό κέντρο. H συσχέτιση μεταξύ φορείας χρωμοσωμιακής καρβαπενεμάσης και αντοχής στις καρβαπενέμες αποδείχτηκε ατελής ειδικά για στελέχη Aeromonas, τα οποία συχνά εμφανίζονταν ευαίσθητα in vitro, αλλά παρουσίαζαν αντοχή μέσω μεταλλάξεων οι οποίες ενίσχυαν την έκφραση καρβαπενεμασών (Livermore DM et al, 2000). Με εξαίρεση στελέχη Stenotrophomonas maltophilia στα οποία η L-1 καρβαπενεμάση μπορεί να κωδικοποιηθεί από μεγάλα πλασμίδια, τα ανωτέρω στελέχη δεν σχετίστηκαν με σοβαρές νοσοκομειακές λοιμώξεις, καθ ότι ευκαιριακά παθογόνα. Επιπλέον οι χρωμοσωμιακές μεταλλο-β-λακταμάσες δεν μεταφέρονται εύκολα (Walsh et al, 2005). Η πρώτη μεταλλο-β-λακταμάση στην οποία έγινε νουκλεοτιδική αλληλούχιση ήταν η BCII που απομονώθηκε από στέλεχος Bacillus cereus και η οποία αποτέλεσε την πρωτότυπη μεταλλοβ-λακταμάση για πολλά χρόνια. Εκτεταμένος μοριακός χαρακτηρισμός έγινε στη Ccra 33

χρωμοσωμιακή μεταλλο-β-λακταμάση που απομονώθηκε από στελέχη Bacteroides fragilis (Queenan and Bush, 2007). 5.5.2. ΕΠΙΚΤΗΤΕΣ ΚΑΡΒΑΠΕΝΕΜΑΣΕΣ ΤΑΞΗΣ Β Σε αντίθεση με τις ιδιοσυστασιακές χρωμοσωμικές μεταλλο-β-λακταμάσες που αναφέρθηκαν προηγουμένως, τα τελευταία χρόνια σημειώθηκε ραγδαία αύξηση στην ανίχνευση και εξάπλωση των επίκτητων ή μεταφερόμενων μεταλλοενζύμων σε στελέχη Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp. και Enterobacteriaceae. Τα μεταλλοένζυμα ενσωματώνονται σε γονιδιακές κασσέτες κυρίως σε ιντεγκρόνια τύπου 1. Όταν τα ιντεγκρόνια σχετίζονται με πλασμίδια ή τρανσποζόνια, είναι προφανές ότι η μεταφορά των μεταλλοενζύμων μεταξύ των μικροβίων καθίσταται ιδιαίτερα ευχερής. Οι παγκοσμίως καταγεγραμένοι τύποι είναι οι IMP, VIM, SPM, GIM, SIM, NDM, ΚΗΜ, AIM και DIM, εκ των οποίων οι πλέον σημαντικοί λόγω ευρείας διασποράς στα μικρόβια της νοσοκομειακής χλωρίδας είναι οι IMP, VIM, SPM και NDM τύποι. -ΙΜΡ Το ένζυμο ΙΜΡ-1 (ιμιπενεμάση) απομονώθηκε για πρώτη φορά το 1990 στην Ιαπωνία σε συζευγμένο πλασμίδιο στελέχους Pseudomonas aeruginosa και στη συνέχεια σε ιντεγκρόνιο στελέχους Ser. marcescens και άλλων εντεροβακτηριακών στην ίδια χώρα. Παρατηρήθηκε ότι το ένζυμο αυτό υδρόλυε πενικιλλίνες, ευρέος φάσματος κεφαλοσπορίνες, ιμιπενέμη, αλλά όχι την αζτρεονάμη. Η υδρολυτική του δραστηριότητα αναστέλλονταν από EDTA και αποκαθίστατο μετά από προσθήκη κατιόντων Zn. Στην Ευρώπη το πρώτο ένζυμο της ομάδας, ΙΜΡ-2 ανιχνεύτηκε στην Ιταλία σε στέλεχος Acinetobacter baumannii. Έκτοτε η ομάδα ΙΜΡ εξαπλώθηκε παγκοσμίως και ιδιαίτερα σε ΗΠΑ και Αυστραλία με περισσότερους από 20 διαφορετικούς αλλοτύπους μερικοί από τους οποίους εμφανίζουν συγκεκριμένη γεωγραφική κατανομή. Eκτός από τα προαναφερθέντα στελέχη, το bla IMP-1 γονίδιο έχει απομονωθεί και σε άλλα στελέχη όπως Βrevieum diminuta, Burkholderia cepacia, Achromobacter xylosodans, Pseudomonas putida και Pseudomonas fluorescens υποδηλώνοντας την οριζόντια διασπορά του γονιδίου όχι μόνο μεταξύ στελεχών Pseudomonas aeruginosa και S. marcescens, αλλά και τη μεταφορά του από την κοινότητα στο νοσοκομείο (Nordmann P. 2002). -SPM (Sao Paolo Metallo-β-lactamase) Aνιχνεύτηκε το 1997 από στέλεχος Pseudomonas aeruginosa στο Σάο Πάολο Βραζιλίας, ευαίσθητο μόνο στην κολιστίνη. Γονιδιακή ανάλυση έδειξε ότι δεν αποτελούσε μέρος ιντεγκρονίου ή τρανσποζονίου, αλλά σχετιζόταν με κοινές περιοχές που περιείχαν μεταθετά στοιχεία και ειδικότερα αλληλουχίες εισδοχής ΙSCR4 της οικογενείας IS91. Έως σήμερα SPM ένζυμα απομονώνονται ως επί το πλείστον στη συγκεκριμένη χώρα. 34

-GIM-1 (German IMipenemase) Aπομονώθηκε στη Γερμανία το 2002 σε στέλεχος Pseudomonas aeruginosa από ιντεγκρόνιο τάξης 1 σε πλασμίδιο, το οποίο περιείχε γονίδια αντοχής στις αμινογλυκοσίδες aaca4, aada1 και τη β-λακταμάση ΟΧΑ-2. -SIM (Seoul IMipenemase) H οικογένεια επίκτητων μεταλλο-β-λακταμασών που περιγράφηκε απομονώθηκε από στελέχη Pseudomonas aeruginosa και Acinetobacter spp. στη Σεούλ της Κορέας. -VIM Το πρώτο ένζυμο της ομάδας VIM -1 (Verona Integron encoded Metallo-β-lactamase ) απομονώθηκε το 1997 στη Βερόνα της Ιταλίας και το αντίστοιχο VIM-2 το 1996 στη Γαλλία και τα δύο από ιντεγκρόνια τάξης 1 στελεχών Pseudomonas aeruginosa. Στη Νότια Ευρώπη και κυρίως στην Ιταλία και Ελλάδα η ανίχνευσηvim και IMP μεταλλο-β-λακταμασών είναι αδιάλειπτη με κυριότερο ένζυμο το VIM -1. To κλινικό αυτό στέλεχος παρουσίαζε αντοχή στα περισσότερα β-λακταμικά αντιβιοτικά, συμπεριλαμβανομένης της ιμιπενέμης και αναστελλόταν από το EDTA. Ο λεπτομερής χαρακτηρισμός του ενζύμου έδειξε μιά αλληλουχία 266 αμινοξέων. Το ισοηλεκτρικό σημείο (pi) ήταν 5,3. To φάσμα υπoστρωμάτων της VIM-1 ήταν τυπικό της τάξης Β κατά Ambler, συμπεριλαμβάνοντας τα περισσότερα β-λακταμικά πλην της αζτρεονάμης. Η αρχική αντοχή στην αζτρεονάμη που παρουσίαζε το κλινικό στέλεχος οφειλόταν στη συνύπαρξη άλλων μηχανισμών αντοχής. Το υπεύθυνο για την παραγωγή της VIM-1 γονίδιο, bla VIM-1, φερόταν ως γονιδιακή κασσέτα σε ένα ενσωματόνιο τάξης 1 χρωμοσωματικής εντόπισης. Το συγκεκριμένο ενσωματόνιο έφερε επίσης το aaca4 γονίδιο που καθιστούσε το στέλεχος ανθεκτικό στις αμινογλυκοσίδες. Στη συνέχεια το γονίδιο bla VIM- 1 βρέθηκε έπειτα στο ίδιο νοσοκομείο στη Βερόνα φερόμενο σε μη συζευκτικό πλασμίδιο σε στέλεχος Achromobacter xylosoxidans. Το VIM-1 ενσωματόνιο (In70) έφερε τέσσερις γονιδιακές κασσέτες (bla VIM-1 aaca4, apha15 και aada1) (Walsh et al, 2005). Εικόνα 9. Μεταλλοένζυμο τύπουvim Έκτοτε, η VIM-1 έχει βρεθεί σε στελέχη K. pneumοniae, P. aeruginosa, A. xylosoxidans, E. cloacae, S. marcescens, P. putida, Acinetobacter spp, P. stutzeri, C. freundii, E. coli και P. mirabilis σε πολλές χώρες όπως, μεταξύ άλλων, στη Γαλλία, στην Ελλάδα, στην Ιταλία, στην 35

Ισπανία, στην Κορέα, στην Ταϊβάν, στην Πορτογαλία, στην Πολωνία, στις ΗΠΑ, στην Κροατία, στο Βέλγιο, και σε χώρες της Νότιας Αμερικής (Protonotariou et al, 2008; Giakkoupi et al, 2003; Lauretti et al, 1999; Lee et al, 2002; Miriagou et al, 2003; Pournaras et al, 2002; Tsakris et al, 2000; Yan et al, 2001; Patzer et al, 2009). Έως σήμερα η οικογένεια των VIM ενζύμων αριθμεί περισσότερα από 30 μέλη, με τα VIM-1 και VIM-2 να είναι τα πλέον διαδεδομένα παγκοσμίως. Η φυλογενετική συγγένεια μεταξύ των ενζύμων τύπου VIM φαίνεται στo παρακάτω εικόνα δενδρόγραμμα. Δενδρόγραμμα 1. Μεταλλοένζυμα τύπου VΙΜ (Cornaglia, Giamarellou and Rossolini, 2011) Τα ένζυμα SPM, GIM και SIM (μεταλλο-β-λακταμάσες) δεν έχουν εξαπλωθεί πέραν της αρχικής χώρας ανακάλυψης. Εντούτοις, τα ένζυμα VIM και IMP συνεχίζουν να εξαπλώνονται παγκοσμίως κυρίως μεταξύ στελεχών Pseudomonas aeruginosa και εντεροβακτηριακών. -NDM-1(New Delhi Μetallo-β-lactamase) H τελευταία σημαντική οικογένεια επίκτητων μεταλλο-β-λακταμασών περιγράφηκε το 2008 στη Σουηδία σε απομονωθέν εντεροβακτηριακό στέλεχος Ινδού ασθενούς που προηγουμένως είχε νοσηλευτεί στο Νέο Δελχί, αποτελώντας το νέο επίκεντρο της παγκόσμιας προσοχής. Έκτοτε τα NDM-1 μεταλλοένζυμα έχουν απομονωθεί σε όλες τις ηπείρους με μόνη εξαίρεση την Κεντρική και Νότιο Αμερική σε στελέχη κυρίως E. coli και Klebsiella pneumoniae. To επίπεδο αντοχής στις καρβαπενέμες ποικίλλει και τα πλασμίδια που τα περιέχουν μεταφέρουν και άλλα 36

ένζυμα αντοχής στα αντιβιοτικά (OXA-48, VIM, ESBL, γονίδια αντοχής σε αμινογλυκοσίδες, μακρολίδες, ριφαμπικίνη, σουλφαμεθοξαζόλη). Ορισμένα στελέχη είναι ευαίσθητα σε τιγκεκυκλίνη, κολιστίνη και σε μικρότερο βαθμό στη φωσφομυκίνη. Ανησυχία προκαλεί η ευρεία διάδοσή τους σε νοσοκομειακά στελέχη όπως Klebsiella pneumoniae, σε στελέχη της κοινότητας όπως E.coli, αλλά και στο φυσικό περιβάλλον (Nordmann et al, 2011). Οι τελευταίες κατηγορίες που έχουν περιγραφεί, ΚΗΜ (Iαπωνία), ΑΙΜ (Αυστραλία ) και DIM (Ολλανδία) παρουσιάζουν χαμηλότερο βαθμό διασποράς και κλινική σημασία σε σχέση με τα NDM ένζυμα. Η διασπορά των γονιδίων bla VIM στον Ελλαδικό χώρο φαίνεται στην Εικόνα 10. Ιωάννινα P. aeruginosa (VIM- 2) Βόλος P. aeruginosa (VIM- 2) Ξάνθη P. aeruginosa (VIM- 2) Θεσσαλονίκη P. aeruginosa (VIM-2) K. pneumoniae (VIM- 1) P. mirabilis (VIM-1) Λάρισα P. aeruginosa (VIM-2,-4) K. pneumoniae (VIM-1, VIM- 12) A. baumannii (VIM-1) Πάτρα P. aeruginosa (VIM- 2) Αθήνα P. aeruginosa (VIM-2) K. pneumoniae (VIM- 1) E. coli (VIM-1,-2) E. cloacae (VIM-1) Κρήτη P. aeruginosa (VIM- 4) E. coli (VIM-1) Εικόνα 10. Διασπορά bla VIM στην Ελλάδα 37

Σχηματικά η παγκόσμια διασπορά των διαφορετικών τύπων μεταλλοενζύμων παρουσιάζεται στην εικόνα 11. Eικόνα 11. Παγκόσμια διασπορά μεταλλοενζύμων (Cornaglia, Giamarellou and Rossolini, 2011) 6.ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΚΑΡΒΑΠΕΝΕΜΑΣΩΝ 6.1. ΕΠΙΠΕΔΑ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΕ ΚΑΡΒΑΠΕΝΕΜΕΣ Η ανίχνευση δραστηριότητας καρβαπενεμάσης σε απομονωθέν στέλεχος αποτελεί πρόκληση για το μικροβιολογικό εργαστήριο. -Για τα μεταλλοένζυμα δεν υπάρχουν τυποποιημένες μέθοδοι ανίχνευσης και τα κριτήρια συχνά εξαρτώνται από το είδος του μικροβίου και την αυξημένη MIC στις καρβαπενέμες (Walsh et al, 2005). Τα εντεροβακτηριακά και κάποια Acinetobacter spp. που φέρουν μεταλλοένζυμα, συχνά παρουσιάζονται ευαίσθητα με χαμηλή MIC στην ιμιπενέμη (1-2 μg/ml). Oι ψευδομονάδες έχουν εγγενώς υψηλότερες τιμές MIC στις καρβαπενέμες από τα εντεροβακτηριακά. Μεταξύ στελεχών Pseudomonas aeruginosa που εκφράζουν VIM, IMP, GIM, SIM και SPM μεταλλο-β-λακταμάσες, έχουν αναφερθεί MIC στην ιμιπενέμη που ποικίλλουν από 8 έως >128 μg/ml. Εντούτοις όταν τα γονίδια για τα ένζυμα αυτά εισάγονται σε στελέχη E. coli η αντίστοιχη MIC στην ιμιπενέμη είναι σημαντικά χαμηλότερη. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει και την παρουσία και άλλων μηχανισμών που προσδίδουν αντοχή 38

στην ιμιπενέμη, όπως η απουσία της πορίνης OmpK36 και ο μηχανισμός αυξημένης αποβολής του φαρμάκου μέσω αντλίας στη κυτταρική μεμβράνη (efflux pump). To φαινόμενο αυτό έχει παρατηρηθεί σε στελέχη Acinetobacter baumannii και Klebsiella pneumoniae με μεταλλοένζυμα, όπως επίσης και με ΟΧΑ καρβαπενεμάσες. (Queenan and Bush, 2007). Η αυξημένη MIC στις καρβαπενέμες υποδηλώνει γενικά την παραγωγή καρβαπενεμάσης από τα Εντεροβακτηριακά, χωρίς ωστόσο να υπάρχει η αντίστοιχη κλινική έκφραση, για τους λόγους που αναφέρθηκαν ανωτέρω. -Οι KPC καρβαπενεμάσες είναι δύσκολο να ανιχνευθούν. Πολύ συχνά σχετίζονται με πολύ χαμηλές MIC στην ιμιπενέμη, ιδίως όταν χρησιμοποιείται χαμηλό αρχικό ενοφθάλμισμα με τη μέθοδο των μικροαραιώσεων (Queenan and Bush, 2007). Μελέτη ανίχνευσης καρβαπενεμάσης KPC σε στελέχη Klebsiella pneumoniae με τη χρήση μεθόδου μικροαραιώσεων, Ε-test και αυτοματοποιημένων συστημάτων VITEK, VITEK-2, Microscan WalkAway, BD Phoenix Sensititre Autoreader έδειξε ποικίλλη ευαισθησία στα αυτοματοποιημένα συστήματα 6.7-87% ανάλογα με τη μέθοδο (Tenover et al, 2006). Θετική υπήρξε η συμβολή της ερταπενέμης στην ανίχνευση αντοχής, η οποία παρουσιάζει τη μεγαλύτερη ευαισθησία στην ανίχνευση KPC στελεχών. Επιπλέον η ειδικότητα μπορεί να είναι μειωμένη λόγω και άλλων μηχανισμών αντοχής όπως η παραγωγή AmpC ή ESBL s μαζί με απώλεια πορίνης της εξωτερικής μεμβράνης. Στη μελέτη η μέθοδος των E-test κρίθηκε αναξιόπιστη λόγω εμφάνισης αποικιών εντός των ζωνών αναστολής (φαινόμενο ετεροαντοχής). - Η ανίχνευση NMC και ΙΜΙ καρβαπενεμασών σε Enterobacter cloacae σχετίζονται με MIC στην ιμιπενέμη 16-32 μg/ml και στην κεφταζιδίμη συχνά 2 μg/ml. - H ανίχνευση SME καρβαπενεμάσης σε Serratia marcescens θεωρείται επιβεβλημένη όταν το στέλεχος εκφράζει υψηλή αντίσταση στην ιμιπενέμη και ευαισθησία στην κεφταζιδίμη. 6.2. ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕ ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ 6.2.1. -Μέθοδος δίσκων : Double Disk Test (DDST) και Comdined Disk Test (CDT) Η ζώνη αναστολής γύρω από το β-λακταμικό δίσκο αλλάζει υπό την επίδραση του αναστολέα στη μεταλλο-β-λακταμάση που παράγει ο μικροοργανισμός. Έχει χρησιμοποιηθεί ιμιπενέμη, κεφταζιδίμη και κεφεπίμη στη συγκεκριμένη μέθοδο, ενώ ως αναστολέας έχει χρησιμοποιηθεί EDTA, EDTA με 1,10-φαινανθρολίνη, θειολικά παράγωγα (μερκαπτοπροπιονικό οξύ, μερκαπτοξεικό οξύ) και διπικολινικό οξύ. Θεωρείται ότι η προσθήκη Zn στο υλικό καλλιέργειας αυξάνει την ευαισθησία της μεθόδου. Στο DDST ο β-λακταμικός δίσκος τοποθετείται σε απόσταση από το δίσκο του αναστολέα. 39

Στο CDT ο αναστολέας (σε διαφορετική ποσότητα ανάλογα με τη μελέτη) τοποθετείται στον ίδιο δίσκο με τη β-λακτάμη. Παρατηρείται αυξημένη ζώνη αναστολής στο δίσκο με τον αναστολέα σε σχέση με το δίσκο που φέρει μόνο τη β-λακτάμη. Σε μία μελέτη οι συνδυασμοί ιμιπενέμης EDTA ήταν οι πιο ευαίσθητοι για την ανίχνευση μεταλλο-β-λακταμάσης σε στελέχη Pseudomonas aeruginosa και Acinetobacter baumannii. Ο συνδυασμός κεφταζιδίμης-κλαβουλανικού με EDTA ήταν περισσότερο εύστοχος σε στελέχη Klebsiella pneumoniae και ο συνδυασμός κεφεπίμης κλαβουλανικού με EDTA για στελέχη Enterobacter cloacae και C. freundii. Η συνολική ευαισθησία της μεθόδου ανήρχετο σε 86.7% (Yan et al, 2004). Η φαινοτυπική ανίχνευση των στελεχών που παράγουν KPC ένζυμα στηρίζεται σε μεγάλο βαθμό στην αναστολή τους από το βορονικό οξύ και τα παράγωγά του (φαινυλβορονικό και 3-αμινοφαινυλ-βορονικό οξύ). Τα τελευταία χρησιμοποιήθηκαν με βάση τις παραπάνω μεθόδους και ιδίως το CDT. Εικόνα 12. Μέθοδος δίσκων DDST ιμιπενέμη - EDTA στη 12 η ώρα και CDT στην 5 η ώρα ( S.Rai et al, 2011) Εικόνα 13: Combined Disk Test σε στέλεχος Kl.pneumoniae που εκφράζει IMP-4. Στην 9 η ώρα φαίνεται η αυξημένη ζώνη αναστολής στο δίσκο που περιέχει ΙΜΡ και 750μg EDTA σε σχέση με το δίσκο ΙΜΡ χωρίς EDTA στη 12 η ώρα. (Poirel et al, 2004) 40

6.2.2. -E-test Aποτελούν έτοιμες ταινίες διαβαθμισμένης συγκέντρωσης ιμιπενέμης -ιμιπενέμης /EDTA. Η δοκιμασία θεωρείται θετική όταν η MIC στην ιμιπενέμη είναι τουλάχιστον 3 φορές μεγαλύτερη παρουσία EDTA. Έχει ευαισθησία 94% και ειδικότητα 95% σε συγκεκριμένες μελέτες. Εντούτοις έχουν αναφερθεί ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα όταν το υπό μελέτη στέλεχος έχει MIC στην ιμιπενέμη <4 μg/ml. Έχει επίσης παρατηρηθεί ότι το ΕDTA καθ εαυτό έχει ανασταλτική δράση έναντι ορισμένων μικροβίων εξαιτίας της δράσης του κατά της εξωτερικής μεμβράνης με αποτέλεσμα την εξαγωγή ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων. Eικόνα 14: E-test IMP-IMP/EDTA 6.2.3. -Modified Hodge Test ή cloverleaf test Αποτελεί μικροβιολογική μέθοδο ανίχνευσης δραστηριότητας καρβαπενεμάσης στην οποία εναιωρήματα ολόκληρων κυττάρων ή εκχύλισμά τους εξετάζονται παρουσία ιμιπενέμης σε τρυβλίο με άγαρ. Αλλοιωμένη ανάπτυξη του μικροβίου-δείκτη γύρω από το δίσκο ιμιπενέμης αποτελεί θετικό αποτέλεσμα. Μειονέκτημα της μεθόδου αποτελεί η χρονοβόρος διαδικασία, η μειωμένη ειδικότητα ανίχνευσης στελεχών που παράγουν υψηλά επίπεδα AmpC β-λακταμασών και CTX-M στελεχών με μειωμένη διαπερατότητα κυτταρικής μεμβράνης, η μειωμένη ευαισθησία ανίχνευσης NDM στελεχών και γενικότερα η αδυναμία διάκρισης του τύπου της συγκεκριμένης καρβαπενεμάσης. Πλεονέκτημα της μεθόδου αποτελεί η δυνατότητα ανίχνευσης ενζύμων με ασθενή δραστηριότητα καρβαπενεμάσης, όπως OXA-23, GES-5 και GES -6. Είναι ιδιαίτερα χρήσιμη μέθοδος στην ανίχνευση KPC και OXA-48 στελεχών (Nordmann et al, 2011). Το Modified Hodge Test αποτελεί τη μόνη προτεινόμενη από το CLSI μέθοδο για ανίχνευση καρβαπενεμάσης (Miriagou et al, 2010). Εικόνα 15: Modified Hodge Test 41

6.2.4. -Χρωμογόνα υλικά καλλιέργειας. Είναι διαθέσιμα τουλάχιστον δύο εκλεκτικά υλικά καλλιέγειας (CHROMagar- KPC, Brilliance CRE agar) στα οποία οι αποικίες των μικροοργανισμών που παράγουν καρβαπενεμάσες διαχωρίζονται λόγω του διαφορετικού χρώματός τους. Έχουν χρησιμοποιηθεί σε μελέτες παρακολούθησης, χωρίς ωστόσο η αξιοπιστία τους να έχει εκτιμηθεί συστηματικά. 6.3. ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ 6.3.1. -Ισοηλεκτρική εστίαση Όταν ένα μίγμα αμφολυτών βρεθεί σε ηλεκτρικό πεδίο, σχηματίζεται μία κλίση ph. Αν μέσα στο ίδιο ηλεκτρικό πεδίο βρεθεί μία πρωτεΐνη, αυτή, διατρέχοντας την κλίση θα ακινητοποιηθεί στο ph εκείνο, στο οποίο το καθαρό ηλεκτρικό της φορτίο εξουδετερώνεται (Ισοηλεκτρική Eστίαση, Isoelectric Focusing, I.E.F.). Το ph αυτό ορίζεται ως Ισοηλεκτρικό Σημείο (pi) της συγκεκριμένης πρωτεΐνης και είναι χαρακτηριστικό της χημικής της δομής και επομένως καθοριστικό για την ταυτοποίησή της. Η I.E.F διαχωρίζει τις πρωτεΐνες με βάση το φορτίο τους και ανιχνεύει τις β- λακταμάσες με τη βοήθεια της χρωμογενούς κεφαλοσπορίνης νιτροσεφίνης. Επικάλυψη της γέλης με EDTA, κλαβουλανικό ή αζτρεονάμη, επιτρέπει την ανίχνευση ευαισθησίας των ενζύμων σε αυτούς τους αναστολείς υποδηλώνοντας έτσι την παρουσία Β, Α και C β- λακταμασών, αντίστοιχα. Παρά το γεγονός ότι η ισοηλεκτρική εστίαση δεν μπορεί να αναγνωρίσει συγκεκριμένη β-λακταμάση, μπορεί να δώσει πληροφορίες για το ισοηλεκτρικό σημείο και τα χαρακτηριστικά αναστολής. Η μέθοδος είναι ιδαίτερα χρήσιμη για την ανίχνευση πολλαπλών β -λακταμασών στο ίδιο βακτηριακό στέλεχος (Walsh et al, 2005). 6.3.2.-Η φασματοφωτομετρική μέθοδος χρησιμοποιώντας εκχυλίσματα κυττάρων (crude cell extracts) ή καθαρές (purified) β-λακταμάσες μπορεί με αξιοπιστία να ανιχνεύσει την υδρόλυση στην ιμιπενέμη. Εάν η υδρόλυση αφορά μεταλλοένζυμο, βραχεία επώαση με EDTA πριν την έναρξη της αντίδρασης θα έχει ως αποτέλεσμα χαμηλότερο ρυθμό υδρόλυσης. Πολύ ασθενείς καρβαπενεμάσες δεν είναι δυνατό να ανιχνευθούν, εκτός κι αν χρησιμοποιηθούν μεγάλες ποσότητες εκχυλίσματος κυττάρων. Η συγκεκριμένη μέθοδος δεν μπορεί να αποτελέσει μέθοδο ρουτίνας στο εργαστήριο, διότι είναι χρονοβόρος, απαιτεί εξειδικευμένο προσωπικό και ο διαχωρισμός μεταξύ των καρβαπενεμασών είναι δυσχερής. Θεωρείται όμως η μέθοδος αναφοράς για την πιστοποίηση παραγωγής καρβαπνεμάσης σε εξειδικευμένα κέντρα. 42

6.3.3. -Αντίδραση αλυσιδωτής πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) Αποτελεί το γρηγορότερο (4-6 ώρες) και ασφαλέστερο τρόπο αναγνώρισης καρβαπενεμασών με εξαιρετικά ποσοστά ευαισθησίας και ειδικότητας. Xρησιμοποιείται ευρέως σε ερευνητικά εργαστήρια προκειμένου να υπερκεραστούν προβλήματα φαινοτυπικής ανίχνευσης στελεχών που παράγουν καρβαπενεμάσες. Υπάρχουν διαθέσιμα PCR kits για την ανίχνευση bla VIM- 1-13, bla IMP- 1-22 και bla OXA γονιδίων απευθείας σε κλινικά στελέχη. 6.3.4. -Αλληλούχιση ολόκληρης της γονιδιακής περιοχής. Αποτελεί την ολοκληρωτική ανίχνευση του γονιδίου της καρβαπενεμάσης. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για επιδημιολογικούς λόγους. Ο χαρακτηρισμός ενός νέου ενζύμου δεν μπορεί να είναι πλήρης αν δεν υπάρχει μοριακή αλληλούχιση και προσδιορισμός του φάσματος υδρόλυσης και αναστολής του καθαρού ενζύμου. 7. ΓΕΝΕΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΚΑΙ ΑΝΤΟΧΗ To γενετικό υλικό των βακτηριών απαντά σε δύο διαφορετικές δομές: το χρωμόσωμα και τα πλασμίδια. Και στις δύο περιπτώσεις, ωστόσο, πρόκειται για διπλές δεξιόστροφες έλικες DNA, οι οποίες περιέχουν μεταξύ άλλων γονίδια που διακρίνονται σε δομικά και ρυθμιστικά. Ο βαθμός της ομολογίας μεταξύ του γενετικού υλικού των διαφορετικών βακτηρίων αποτελεί σημαντικό κριτήριο για τον προσδιορισμό της φυλογενετικής τους σχέσης (Dobrindt et al, 2001). Η αλληλουχία του γενετικού υλικού των βακτηρίων μπορεί να τροποποιηθεί είτε μέσω εξωγενών παραγόντων, όπως η ιονίζουσα ακτινοβολία, είτε αυτόματα, όπως στην περίπτωση της διαδικασίας της απαμίνωσης, ενώ λόγω των πολλαπλών σταδίων ελέγχου (προσυνθετικός έλεγχος, μετασυνθετικός έλεγχος, μετά-αντιγραφική επιδιόρθωση, ειδικά ένζυμα, κ.α.) τα λάθη σπανίζουν (Ambur et al, 2009). Ωστόσο, το DNA των βακτηρίων υφίσταται μεταλλάξεις, οι οποίες μπορεί να είναι σημειακές και να έχουν ως αποτέλεσμα την αλλαγή στο πλαίσιο διαβάσματος, είτε μεγαλύτερες του ενός ζεύγους βάσεων, όπως για παράδειγμα οι ελλείψεις. Εικόνα 16. DNA βακτηριακού κυττάρου που έχει υποστεί λύση. 43

7.1. ΧΡΩΜΟΣΩΜATΙΚΟ DNA Το βακτηριακό χρωμόσωμα αποτελείται από ένα κυκλικό δίκλωνο μόριο DNA. Το βακτηριακό χρωμόσωμα είναι υπεύθυνο για όλες τις μεταβολικές λειτουργίες που είναι απαραίτητες για την επιβίωση του βακτηρίου (Wang and Levin, 2009). Το βακτηριακό χρωμόσωμα είναι κατά κανόνα κυκλικό, αν και έχουν παρατηρηθεί και γραμμικά χρωμοσώματα (π.χ. Borrelia). Το μέγεθος του βακτηριακού χρωμοσώματος ποικίλλει (Hacker et al, 2003). 7.2. ΠΛΑΣΜΙΔΙΑ Ως ρεπλικόνια (replicons) χαρακτηρίζονται τα μόρια DNA, που έχουν την ικανότητα να αυτοπολλαπλασιάζονται, όπως το βακτηριακό χρωμόσωμα, τα πλασμίδια και οι φάγοι. Τα πλασμίδια είναι ρεπλικόνια, που ανευρίσκονται στα βακτήρια ως διακριτά εξωχρωμοσωματικά γενετικά στοιχεία. Φέρουν περιοχή έναρξης της αντιγραφής (origin of replication), οπότε είναι ικανά για αναδιπλασιασμό. Το μέγεθος των πλασμιδίων ποικίλλει από λίγες μέχρι αρκετές εκατοντάδες χιλιάδες βάσεις. Είναι κατά κανόνα κυκλικά, ενώ όπως και στην περίπτωση του βακτηριακού χρωμοσώματος έχουν παρατηρηθεί γραμμικά πλασμίδια. Τα μεγάλου μεγέθους πλασμίδια (>40 kbp) έχουν συνήθως μικρούς αριθμούς αντιγράφων και κωδικοποιούν για όλες τις λειτουργίες που είναι απαραίτητες για τον αναδιπλασιασμό και το διαχωρισμό τους στα θυγατρικά κύτταρα. Τα μικρά πλασμίδια (<7.5 kbp) υπάρχουν συνήθως σε μεγάλο αριθμό αντιγράφων. Εικόνα 17. Βακτηριακό χρωμόσωμα και πλασμίδιο Η ικανότητα ή όχι των πλασμιδίων να συνυπάρχουν σε ένα βακτηριακό κύτταρο τα κατατάσσει σε ομάδες ασυμβατότητας (incompatibility groups) (Carattoli et al, 2006). Συγγενικά πλασμίδια που ανήκουν στην ίδια ομάδα πλασμιδιακής ασυμβατότητας δεν μπορούν να συνυπάρξουν στον ίδιο ξενιστή. Τα πλασμίδια που μπορούν να αυτομεταφέρονται από ένα κύτταρο (δότη) σε κάποιο άλλο κύτταρο (δέκτη) ονομάζονται συζευκτικά πλασμίδια (conjugative plasmids) και κωδικοποιούν, μεταξύ άλλων (αντοχή, 44

παραγωγή τοξινών, σύνθεση κυτταρικών δομών, κ.α.) λειτουργίες, που επάγουν τη μεταφορά του πλασμιδίου μέσω βακτηριακής σύζευξης (Norman et al, 2009). Το κατά πόσο είναι συζευκτικό ένα πλασμίδιο εξαρτάται από την παρουσία ή απουσία των γονιδίων tra, που είναι υπεύθυνα για την βακτηριακή σύζευξη. Σε αντίθεση με το βακτηριακό χρωμόσωμα, οι λειτουργίες για τις οποίες είναι υπεύθυνα τα πλασμίδια δεν είναι απολύτως απαραίτητες. Ωστόσο, κάποια πλασμίδια ελέγχουν σημαντικές ιδιότητες των παθογόνων βακτηρίων, όπως η αντοχή στα αντιβιοτικά. 8. ΜΕΤΑΘΕΤΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ Τα μεταθετά στοιχεία είναι γενετικές μονάδες που έχουν την ικανότητα να μετακινούνται μεταξύ διαφορετικών ρεπλικονίων. Μέχρι σήμερα έχουν περιγραφεί δύο τύποι μεταθετών στοιχείων, τα τρανσποζόνια (transposons) και οι αλληλουχίες εισδοχής (insertion sequences) (Bennett, 2004). 8.1. ΤΡΑΝΣΠΟΖΟΝΙΑ Σε αντίθεση με τις αλληλουχίες εισδοχής, τα τρανσποζόνια προσδίδουν συνήθως στον φέροντα οργανισμό ένα συγκεκριμένο φαινότυπο. Πρόκειται για τμήματα DNA που μπορούν να μετακινηθούν από μια περιοχή του μορίου του DNA σε μια άλλη του ιδίου ή άλλου μορίου DNA, αλλά δεν έχουν τη δυνατότητα να αυτοπολλαπλασιάζονται. Παίζουν σημαντικό ρόλο στην αναδιάταξη του γενωμικού υλικού, στη μεταφορά γονιδίων και στην απενεργοποίηση γονιδίων. Κάθε τρανσποζόνιο κωδικοποιεί τις απαραίτητες λειτουργίες για τη μετάθεσή του, όπως για παράδειγμα την παραγωγή τρανσποζάσης. Κατά τη μετάθεση, μικρή αλληλουχία της περιοχής-στόχου διπλασιάζεται και το τρανσποζόνιο τοποθετείται μεταξύ της αρχικής αλληλουχίας και της επαναλαμβανόμενης αλληλουχίας (direct repeat). Το μήκος αυτού του διπλασιασμού είναι χαρακτηριστικό του κάθε τρανσποζονίου. Μερικά τρανσποζόνια εντίθενται τυχαία, ενώ άλλα απαιτούν ειδικές αλληλουχίες, στόχους. Η μεταφορά γίνεται με δύο τρόπους, εiτε με διπλασιασμό του τρανσποζονίου και μετάθεση του αντιγράφου, είτε με αποκοπή και μετάθεση του ίδιου του τρανσποζονίου. 8.2. ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΕΣ ΕΙΣΔΟΧΗΣ Οι αλληλουχίες εισδοχής (insertion sequences) είναι μεταθετά στοιχεία απλούστερα από τα τρανσποζόνια, αφού φέρουν αποκλειστικά και μόνο τα απαραίτητα για την μετακίνηση τους στοιχεία. Οι αλληλουχίες εισδοχής είναι μικρού μοριακού μεγέθους τμήματα DNA (<2,5 kb) και βρίσκονται συχνά τόσο στο βακτηριακό χρωμόσωμα, όσο και στα πλασμίδια. Παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον λόγω της ικανότητας τους να προκαλούν 45

γενετικές ανακατατάξεις. Επιπλέον, οι αλληλουχίες εισδοχής παίζουν σημαντικό ρόλο στη διασπορά γονιδίων αντοχής. Συγκεκριμένα, δύο αντίγραφα αλληλουχιών εισδοχής που αφορίζουν μια περιοχή, χαρακτηριζόμενη και ως «νησίδα» αντοχής, μπορούν να δράσουν σε συνδυασμό μετακινώντας αυτήν την περιοχή. Η τυπική δομή μιας αλληλουχίας εισδοχής περιλαμβάνει ακραίες ανεστραμμένες αλληλουχίες (inverted repeats, IR) μήκους 10-40bp. Οι ακραίες ανεστραμμένες αλληλουχίες οριοθετούν τα άκρα της αλληλουχίας εισδοχής και της τρανσποζάσης. 9. ΙΝΤΕΓΚΡΟΝΙΑ ΤΑΞΗΣ 1 Εικόνα 18. Ιντεγκράση Τα ενσωματόνια ή ιντεγκρόνια (integrons) είναι γενετικά στοιχεία που έχουν τη δυνατότητα να ενσωματώνουν γονίδια-κασσέτες αντοχής (Labbate et al, 2009). Πολλά από τα γονίδια αντοχής στα Gram αρνητικά βακτήρια συσσωρεύονται σε ενσωματόνια. Τα ενσωματόνια μεταφέρονται μέσω πλασμιδίων και τρανσποζονίων και λειτουργούν ως συστήματα μεταφοράς και έκφρασης γονιδίων. Έχουν περιγραφεί τουλάχιστον πέντε τάξεις ιντεγκρoνίων, που χαρακτηρίζονται κυρίως από την αλληλουχία της αντίστοιχης ιντεγκράσης. Τα ιντεγκρόνια που ανιχνεύονται πιο συχνά στα κλινικά στελέχη των Gram αρνητικών βακτηρίων, και ιδιαίτερα των εντεροβακτηριοειδών, είναι ιντεγκρόνια τάξης 1. Η βασική δομή των ιντεγκρονίων τάξης 1 περιλαμβάνει τρία μέρη τα οποία περιγράφονται αναλυτικά παρακάτω. (α) Το 5 συντηρημένο τμήμα (5 CS, Conserved Segment). Στο 5 CS βρίσκεται το γονίδιο inti1, που κωδικοποιεί για την ιντεγκράση, η οποία είναι ένα ένζυμο κατευθυνόμενου ανασυνδυασμού (recombinase). Στο 5 άκρο υπάρχει επίσης η ειδική θέση ανασυνδυασμού atti και ο υποκινητής μεταγραφής P. Η ιντεγκράση εξασφαλίζει τον ανασυνδυασμό μεταξύ της atti και μιας δεύτερης θέσης, που λέγεται attc (ή 59bp) και βρίσκεται στη γονιδιακή κασσέτα. Έτσι, το γονίδιο της κασσέτας ενσωματώνεται στο ενσωματόνιο και μπορεί να μεταγραφεί με υποκινητή τον P του 5 CS. 46

(β) Τη μεταβλητή περιοχή στην οποία ενσωματώνονται τα γονίδια-κασσέτες αντοχής. Έχουν περιγραφεί περισσότερες από 60 γονιδιακές κασσέτες, που σχετίζονται με αντοχή σε αμινογλυκοσίδες, πενικιλλίνες, κεφαλοσπορίνες, καρβαπενέμες, τριμεθοπρίμη, χλωραμφαινικόλη, ριφαμπικίνη, ερυθρομυκίνη, ενώσεις τεταρτοταγούς αμμωνίου και κινολόνες. Θεωρητικά, κάθε γονιδιακή κασσέτα, πριν από την ενσωμάτωσή της, είναι ένα κυκλικό μόριο DNA, που περιέχει την αλληλουχία attc και ένα γονίδιο χωρίς υποκινητή (σε αυτή τη μορφή η γονιδιακή πληροφορία δεν μπορεί να εκφραστεί). (γ) Το 3 συντηρημένο τμήμα (3 CS, Conserved Segment), που περιέχει το γονίδιο qaceδ1 για αντοχή στις ενώσεις του τεταρτοταγούς αμμωνίου, το γονίδιο sul1 για αντοχή στις σουλφοναμίδες, και το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης orf5, ο ρόλος του οποίου δεν είναι γνωστός. Τα ιντεγκρόνια αποτελούν συχνά τμήματα μεταθετών στοιχείων που βρίσκονται στο βακτηριακό χρωμόσωμα ή σε μεγάλα συζευκτικά πλασμίδια διαφόρων ομάδων ασυμβατότητας (Carattoli, 2001). Τα ιντεγκρόνια είναι ευρέως διαδεδομένα και η μεγάλη τους διασπορά οφείλεται και στη συσχέτιση τους με κινητά γενετικά στοιχεία, όπως τρανσποζόνια, αλληλουχίες εισδοχής και συζευκτικά πλασμίδια. Τα ιντεγκρόνια παίζουν σημαντικό ρόλο στη διασπορά της αντοχής των βακτηρίων στα αντιβιοτικά, αλλά και στην εξέλιξη και προσαρμογή των μικροβιακών ειδών. Τα περισσότερα, αν όχι όλα τα γονίδια που κωδικοποιούν μεταλλο-β-λακταμάσες βρίσκονται σε γονιδιακές κασσέτες σε ιντεγκρόνια τάξης 1, αν και ορισμένα που κωδικοποιούν ΙΜΡ ένζυμα βρίσκονται σε ιντεγκρόνια τάξης 3. Και ενώ οι γονιδιακές κασσέτες που περιέχουν τα γονίδια αντοχής μπορούν να μεταφερθούν εύκολα μεταξύ των ιντεγκρονίων, δεν μπορούν να μεταφερθούν μεταξύ των μικροοργανισμών χωρίς τη βοήθεια άλλων γενετικών στοιχείων όπως πλασμίδια και τρανσποζόνια. Στην πλειοψηφία τους τα MBL γονίδια βρίσκονται σε πλασμίδια 120-180Kb, έχουν όμως ανευρεθεί και σε συζευγμένα πλασμίδια 24 Κb στις ΗΠΑ. Παράλληλα έχουν ταυτοποιηθεί τρανσποζόνια, όπως το Τn5051 σε στέλεχος Pseudomonas aeruginosa υπεύθυνο για τη διασπορά τάξης 1 ιντεγκρονίου που κωδικοποιούσε μεταλλοένζυμο, μεταξύ χωρών της Ευρώπης. Αξίζει να σημειωθεί ότι δεν σχετίζονται όλα τα μεταλλοένζυμα με ιντεγκρόνια ή τρανσποζόνια. Σε στέλεχος Salmonella enterica το blaspm-1 γονίδιο κωδικοποιείται σε κοινή μεταθετή περιοχή η οποία σχετίζεται με άλλα μεταθετά στοιχεία που καλούνται SXT περιοχές. Αυτές οι περιοχές κινητοποιούνται όταν το φέρον βακτηριακό κύτταρο βρίσκεται σε κατάσταση stress (π.χ. έκθεση σε φθοριομένες κινολόνες) (Walsh 2005). 47

Εικόνα 19. Γονιδακή δομή ιντεγκρονίου Ιn 110 και In 70 από στέλεχος A.xylosodans που περιέχει bla VIM-1 (Lombardi et al, 2002) 9.1 ΓΟΝΙΔΙΑΚΕΣ ΚΑΣΣΕΤΕΣ Προσδιορίζονται από ένα γονίδιο αντοχής με θέση πρόσδεσης ριβοσώματος και θέση ανασυνδυασμού γνωστή ως 59-base element, τοποθετημένη στο γονίδιο της ιντεγκράσης (Nordmann CMI, 2002). Οι γονιδιακές κασσέτες μπορούν εύκολα να μετακινηθούν μεταξύ ιντεγκρονίων, όχι όμως μεταξύ των μικροοργανισμών χωρίς τη βοήθεια άλλων μεταθετών στοιχείων όπως πλασμίδια και τρανσποζόνια. 48

ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 49

1. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 1.1. ΣΥΝΤΟΜΗ ΕΚΘΕΣΗ ΤΗΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗΣ ΠΟΡΕΙΑΣ Κατά τη διάρκεια παρακολούθησης ασθενών με μικροβιαιμία από στελέχη Klebsiella pneumoniae και μελέτης τους στο εργαστήριο, επιλέχθηκαν επτά στελέχη με διαφορετική ευαισθησία στις καρβαπενέμες, τα οποία παρήγαγαν VIM-1 μεταλλο-β-λακταμάση. Τα στελέχη απομονώθηκαν από πέντε ελληνικά νοσοκομεία κατά την περίοδο 2003-2005. Η ταυτοποίηση των στελεχών έγινε με το σύστημα API20E (BioMerieux). H τυποποίηση των στελεχών Κ. pneumoniae έγινε με ηλεκτροφόρηση παλλόμενου πεδίου (PFGE). Ο έλεγχος ευαισθησίας των υπό μελέτη στελεχών στα αντιβιοτικά έγινε με τρεις μεθόδους: (α) με αντιβιογράμματα κατά Kirby-Bauer (β) με προσδιορισμό των ελάχιστων ανασταλτικών συγκεντρώσεων (MIC) των αντιβιοτικών με τη μέθοδο Etest (Biodisk) γ) με προσδιορισμό των ελάχιστων ανασταλτικών συγκεντρώσεων (Minimum Inhibitory Concentration, MIC) και των ελάχιστων βακτηριοκτόνων συγκεντρώσεων (Minimum Bactericidal Concetration MBC) με τη μέθοδο των μικροαραιώσεων. Η παρουσία του bla VIM γονιδίου, υπεύθυνου για την παραγωγή της β-λακταμάσης τύπου VIM, πιστοποιήθηκε με δοκιμασία αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). Στη συνέχεια ακολούθησε προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του προϊόντος της PCR με τη μέθοδο Sanger. Μετά την επιλογή, το χαρακτηρισμό και την ταυτοποίηση των στελεχών ακολούθησε in vitro μελέτη της κινητικής θανάτωσης των επτά στελεχών (killing curves) σε διαφορετικά ενοφθαλμίσματα (10 4, 10 6 και 10 8 cfu/ml ) υπό την επίδραση καρβαπενεμών (ιμιπενέμη, μεροπενέμη, ερταπενέμη) αλλά και άλλων αντιμικροβιακών (αζτρεονάμη και γενταμικίνη). Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε το ευαίσθητο στέλεχος Klebsiella pneumoniae που δεν περιείχε το bla VIM γονίδιο, αλλά το ειδικό για το είδος γονίδιο bla SHV-1 που αδρανοποιεί την αμπικιλλίνη. Στη συνέχεια επιλέγησαν τρία αντιπροσωπευτικά -όσον αφορά τις ελάχιστες ανασταλτικές συγκεντρώσεις MIC- VIM-θετικά στελέχη καθώς και ένα αρνητικό στέλεχος-μάρτυρας προκειμένου να μελέτηθεί in vivo η αλληλεπίδρασή τους με τις ευρέως χρησιμοποιούμενες καρβαπενέμες ιμιπενέμη και μεροπενέμη, με βάση το μοντέλο της εντοπισμένης λοίμωξης στο μηρό μύων. 50

1.2. IN VITRO ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΒΑΚΤΗΡΙΟΚΤΟΝΟΥ ΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΚΑΡΒΑΠΕΝΕΜΩΝ ΕΝΑΝΤΙ ΕΝΤΕΡΟΒΑΚΤΗΡΙΑΚΩΝ ΤΗΣ ΟΜΑΔΑΣ VIM 1.2.1. ΕΠΙΛΟΓΗ ΣΤΕΛΕΧΩΝ Για την εκπόνηση της διατριβής επιλέχθηκαν επτά στελέχη Klebsiella pneumoniae που παρήγαγαν VIM-1 μεταλλο-β-λακταμάση. Τα στελέχη είχαν απομονωθεί από καλλιέργειες αίματος ασθενών από νοσοκομεία της Αθήνας κατά τη χρονική περίοδο 2003-2005. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε το ευαίσθητο στέλεχος ΚΡ ΕΥ-1 Klebsiella pneumoniae που δεν περιείχε το bla VIM γονίδιο, αλλά το ειδικό για το είδος γονίδιο bla SHV-1 που κωδικοποιεί γιά πενικιλλινάση. To στέλεχος Klebsiella pneumoniae ΚΡ700 παρήγαγε, εκτός από την VIM-1 β-λακταμάση, και την ευρέoς φάσματος β-λακταμάση (ESBL) τύπου SHV-5 που υδρολύει οξυιμινοκεφαλοσπορίνες και αζτρεονάμη. Στελέχη Klebsiella pneumoniae : KP 151 KP 2152 MIC-imp 8 μg/ml MIC-imp 4 μg/ml KP 6/100 MIC-imp 2 μg/ml KP SEC2 MIC-imp 4 μg/ml KP SEC3 MIC-imp 64 μg/ml KP SEC4 MIC-imp 32 μg/ml KP 700 MIC-imp 2 μg/ml Στέλεχος- μάρτυρας : ΚΡ ΕΥ-1 MIC-imp 0.125 μg/ml 1.2.2. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΣΤΕΛΕΧΩΝ Η ταυτοποίηση των στελεχών έγινε με το σύστημα API20E (BioMerieux), το οποίο προσδιορίζει το είδος του κάθε στελέχους με βάση τις βιοχημικές του ιδιότητες. Το σύστημα API20E εξετάζει 20 βιοχημικές αντιδράσεις. Τα αντιδραστήρια, τα οποία βρίσκονται αφυδατωμένα, εμβολιάζονται με εναιώρημα κυττάρων του υπό εξέταση μικροοργανισμού. Οι μικροκαλλιέργειες επωάζονται στους 37 C για 16 ώρες και στη συνέχεια γίνεται παρατήρηση και καταγραφή της αλλαγής του χρώματος. Η ανάγνωση των αποτελεσμάτων (θετικές ή 51

αρνητικές χρωμογόνες αντιδράσεις) και η τελική ταυτοποίηση του βακτηριακού είδους έγινε σύμφωνα με τις οδηγίες της κατασκευάστριας εταιρίας με βάση τον αλγόριθμο που παρέχει. 1.2.3. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ H τυποποίηση των στελεχών Κ. pneumoniae έγινε με ηλεκτροφόρηση παλλόμενου πεδίου (PFGE). Η ύπαρξη του υπεύθυνου γονιδίου bla VIM που κωδικοποιεί τη VIM-1 επιβεβαιώθηκε με δοκιμασία αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης VIM PCR όπως περιγράφεται στον κάτωθι πίνακα: ΑΝΑΜΕΝΟΜΕΝΟ ΠΡΟΪΟΝ: 256bp ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ H 2 O (σε τελικό όγκο 50μl) Buffer 5X MgCl2 (25mM) dntps (10mM το καθένα) Εκκινητής A: VIMF (5 -AGTGGTGAGTATCCGACAG-3 ) Εκκινητής Β: VIMR (5 -ATGAAAGTGCGTGGAGAC-3 ) Flexi Taq Polymerase (Promega) 5U/μl DNA (200-300ng) ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΚΥΚΛΟΠΟΙΗΤΗ 95 C για 5 min 94 C για 1 min 54 C για 30sec 72 C για 1 min 72 C για 10 min 25.6μl 10μl 3μl 1μl 3μl 3μl 0,4μl 2μl 35 κύκλοι Πίνακας 2: Δοκιμασία αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης VIM PCR Για τη χαρτογράφηση του VIM ενσωματονίου στα κλινικά στελέχη πραγματοποιήθηκαν οι PCR που περιγράφονται στον κάτωθι πίνακα. Στο ίδιο πίνακα αναφέρονται και οι αντίστοιχοι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν. Ως σημείο αναφοράς χρησιμοποιήθηκε το ήδη χαρακτηρισμένο ενσωματόνιο In-541 κλάσης 1 που κωδικοποιεί την VIM-1 β-λακταμάση (Κωδικός πρόσβασης GenBank AY339625) (Miriagou et al, 2003). 52

Εκκινητές (5-3 ) Νουκλεοτίδια 5 CS (GGCATCCAAGCAGCAAG) 8809-8825 3 CS (AAGCAGACTTGACCTGA) 11872-11888 VIMF (AGTGGTGAGTATCCGACAG) 9023-9041 VIMR (ATGAAAGTGCGTGGAGAC) 9266-9283 dhfrif (TGGAGTTATCGGGAATGGC) 10455-10473 dhfrir (GTTAGAGGCGAAGTCTTGGG) 10838-10857 ant(3)iaf (ATGGCGGCCTGAAGCCA) 11101-11117 ant(3)iab (ATTGCCCAGTCGGCAGCGA) 11605-11623 qacf (ATCGCAATAGTTGGCGAAGT) 11965-11984 qace 1B (CAAGCTTTTGCCCATGAAGC) 12171-12190 sulf (CTTCGATGAGAGCCGGCGGC) 12326-12345 sulr (GCAAGGCGGAAACCCGCGCC) 12743-12762 IS26TRF (GATCACTCCACGATTTACCGC) 13978-13998 IS26RR (ACTGTTGCAAAGTTAGCGATG) 797-817 Πίνακας 3: Εκκινητές VIM PCR 1.2.4. ΕΛΕΓΧΟΣ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ ΣΤΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ Ο έλεγχος ευαισθησίας των υπό μελέτη στελεχών στα αντιβιοτικά έγινε με τρεις μεθόδους: (α) με αντιβιογράμματα κατά Kirby-Bauer (β) με προσδιορισμό των ελάχιστων ανασταλτικών συγκεντρώσεων (MIC) των αντιβιοτικών με τη μέθοδο Etest (Biodisk) και γ) με προσδιορισμό των ελάχιστων ανασταλτικών συγκεντρώσεων (Minimum Inhibitory Concentration, MIC) και των ελάχιστων βακτηριοκτόνων συγκεντρώσεων (Minimum Bactericidal Concetration, MBC) με τη μέθοδο των μικροαραιώσεων. 1.2.4.α. ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΝΤΙΒΙΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ ΚΑΤΑ KIRBY-BAUER Βακτηριακό εναιώρημα θολερότητας 0,5 της κλίμακας McFarland σε φυσιολογικό ορό επιστρώθηκε στην επιφάνεια στεγνού τρυβλίου Mueller Hinton άγαρ (Oxoid). Κατόπιν, με τη βοήθεια διανομέα, τοποθετήθηκαν οι δίσκοι αντιβιοτικών (Biorad). Τα τρυβλία επωάστηκαν στους 37 C για 18 ώρες. Τα στελέχη χαρακτηρίστηκαν ως ανθεκτικά, μετρίως ανθεκτικά ή ευαίσθητα με κριτήριο τη διάμετρο της άλω αναστολής της ανάπτυξης του βακτηρίου γύρω 53

από τον αντίστοιχο δίσκο, βάσει πρότυπων πινάκων που ισχύουν διεθνώς για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της μεθόδου (CLSI, 2009). 1.2.4.β. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΛΑΧΙΣΤΩΝ ΑΝΑΣΤΑΛΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΕΛΑΧΙΣΤΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΟΣΤΑΤΙΚΩΝ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΕΩΝ ΤΩΝ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ Ο προσδιορισμός των ελάχιστων ανασταλτικών συγκεντρώσεων (Minimum Inhibitory Concentration, MIC) για τα β-λακταμικά αντιβιοτικά έγινε 1) με τη μέθοδο Etest, η οποία εφαρμόστηκε σύμφωνα με τις οδηγίες της κατασκευάστριας εταιρίας (AB, Biodisk) και 2) με τη μέθοδο των μικροαραιώσεων (National Committee for Clinical Laboratory Standards 2002). Ως ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση ορίστηκε η μικρότερη συγκέντρωση αντιμικροβιακού που ανέστειλε την ορατή ανάπτυξη του μικροοργανισμού μετά από 18ωρη επώαση στους 37 C. Ο προσδιορισμός των ελάχιστων βακτηριοκτόνων συγκεντρώσεων (Minimum Bactericidal Concetration MBC) έγινε με τη μέθοδο των μικροαραιώσεων όπως περιγράφεται παρακάτω. 1.2.4.γ. ΜΕΘΟΔΟΣ E-TEST: Bακτηριακό εναιώρημα θολερότητας 0,5 της κλίμακας McFarland σε φυσιολογικό ορό, επιστρώθηκε στην επιφάνεια τρυβλίου Mueller Hinton άγαρ. Κατόπιν, εφαρμόστηκαν ταινίες Etest (AB, Biodisk) που περιέχουν διαβαθμισμένες συγκεντρώσεις του κάθε αντιβιοτικού. Η επώαση έγινε για 18 ώρες στους 37 C. Ως ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση λαμβανόταν η τιμή στην οποία η διαγραφόμενη από την αναστολή της ανάπτυξης του μικροβίου έλλειψη έτεμνε την βαθμονομημένη ταινία. Eικόνα 20: E-test IMP-IMP/EDTA 1.2.4.δ. MEΘΟΔΟΣ ΜΙΚΡΟΑΡΑΙΩΣΕΩΝ Έγινε προσδιορισμός των τιμών MIC και MBC γιά ιμιπενέμη, μεροπενέμη, ερταπενέμη, και αζτρεονάμη με τη μέθοδο των μικροαραιώσεων σε ζωμό Mueller-Hinton. Οι τιμές MIC υπολογίστηκαν με ενοφθαλμίσματα 5X10 5 cfu/ml και 5X10 7 cfu/ml, ενώ για τον προσδιορισμό των τιμών MBC χρησιμοποιήθηκε αρχικό ενοφθάλμισμα 5X10 5 cfu/ml. Οι καλλιέργειες επωάστηκαν για 16 ώρες στους 35 C υπό αερόβιες συνθήκες. Για τον προσδιορισμό των MBC χρησιμοποιήθηκαν τα κριτήρια CLSI. 54

IN VITRO ΜΕΛΕΤΕΣ Προσδιορίσθηκε η κινητική θανατώσεως των μικροβίων χρησιμοποιώντας καμπύλες θανατώσεως (killing curves) όπως περιγράφηκαν από Ferrara et al, 1989 και Pearson et al 1980, με συγκεντρώσεις ιμιπενέμης 4 και 8 φορές πολλαπλάσια της MIC και σε διάφορα ενοφθαλμίσματα (10 4, 10 6 και 10 8 cfu/ml ). Οι συγκεκριμένες συγκεντρώσεις επελέγησαν με βάση βιβλιογραφικά δεδομένα (Turnidge 1998, Bonapace et al 2002, Craig W. and Ebert 1990) από παρόμοια πειράματα με καμπύλες θανατώσεως στα οποία οι β-λακτάμες παρουσίασαν μεγίστη αντιμικροβιακή δράση σε συγκεντρώσεις τρεις και τέσσερις φορές πολλαπλάσιες της MIC. 1.2.5. Α ΠΕΙΡΑΜΑ : MEΛΕΤΗ ΚΙΝΗΤΙΚΗΣ ΘΑΝΑΤΩΣΗΣ / ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ ΕΝΟΦΘΑΛΜΙΣΜΑΤΟΣ - ΣΤΕΛΕΧΗ Klebsiella pneumoniae (KP VIM) ΚΡ 151 (MIC 8 μg/ml) ΚΡ 2152 (MIC 4 μg/ml) ΚΡ ΕΥ-1 (MIC 0.125 μg/ml) ως στέλεχος- μάρτυρας -ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΕΝΟΦΘΑΛΜΙΣΜΑΤΟΣ Χρησιμοποιήθηκε εναιώρημα λογαριθμικής καλλιέργειας των υπό μελέτη στελεχών σε ζωμό Luria Bertani πυκνότητας 10 8 cfu/ml (OD =O.3). O υπολογισμός της πυκνότητας του καλλιεργήματος έγινε με φωτομετρική μέθοδο (580nm, φωτόμετρο Hitachi U-2001). Από το αρχικό ενοφθάλμισμα 10 8 cfu/ml και με διαδοχικές αραιώσεις παρασκευάστηκε το δεύτερο ενοφθάλμισμα 10 6 cfu/ml. -ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΟΥΣΙΑΣ Παρασκευάσθηκαν διαλύματα ιμιπενέμης σε συγκεντρώσεις 4 και 8 φορές πολλαπλάσιες της MIC. -KAΜΠΥΛΗ ΘΑΝΑΤΩΣΗΣ Οι καμπύλες θανατώσεως προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τελικό όγκο διαλύματος 5 ml ζωμού Miller Hinton με αρχικό χαμηλό ενοφθάλμισμα 10 6 cfu/ml και υψηλό ενοφθάλμισμα 10 8 cfu/ml. Στη συνέχεια προσετέθη διάλυμα ιμιπενέμης σε συγκεντρώσεις 4x και 8x της MIC. Για κάθε στέλεχος υπήρχε σωληνάριο-control χωρίς προσθήκη αντιβιοτικού. Τα σωληνάρια επωάσθηκαν επί 18 ώρες σε θερμοκρασία 37ºC. Σε προκαθορισμένες χρονικές 55

στιγμές ( 0, 1, 3, 5 και 24 ώρες ) έγινε υπολογισμός των ζώντων μικροοργανισμών με τη μέθοδο των υποδεκαπλάσιων αραιώσεων σε φυσιολογικό ορό. 1.2.6. Β ΠΕΙΡΑΜΑ : MEΛΕΤΗ ΚΙΝΗΤΙΚΗΣ ΘΑΝΑΤΩΣΗΣ / ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ ΕΝΟΦΘΑΛΜΙΣΜΑΤΟΣ - ΣΤΕΛΕΧΗ Klebsiella pneumoniae (KP VIM) ΚΡ 6/100 (MIC 2 μg/ml) ΚΡ SEC2 (MIC 4 μg/ml) ΚΡ SEC4 (MIC 32 μg/ml) ΚΡ ΕΥ-1 (MIC 0.125 μg/ml) ως στέλεχος- μάρτυρας -ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΕΝΟΦΘΑΛΜΙΣΜΑΤΟΣ Χρησιμοποιήθηκε εναιώρημα λογαριθμικής καλλιέργειας των υπό μελέτη στελεχών σε ζωμό Luria Bertani πυκνότητας 10 8 cfu/ml (OD =O.3). O υπολογισμός της πυκνότητας του καλλιεργήματος έγινε με φωτομετρική μέθοδο (580nm, φωτόμετρο Hitachi U-2001). Από το αρχικό ενοφθάλμισμα 10 8 cfu/ml και με διαδοχικές αραιώσεις παρασκευάστηκαν τα χρησιμοποιούμενα ενοφθαλμίσματα 10 6 και 10 4 cfu/ml. -ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΟΥΣΙΑΣ Παρασκευάσθηκαν διαλύματα ιμιπενέμης σε συγκεντρώσεις 4 και 8 φορές πολλαπλάσιες της MIC. -KAΜΠΥΛΗ ΘΑΝΑΤΩΣΗΣ Οι καμπύλες θανατώσεως προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τελικό όγκο διαλύματος 5 ml ζωμού Miller Hinton με αρχικό χαμηλό ενοφθάλμισμα 10 4 cfu/ml και υψηλό ενοφθάλμισμα 10 6 cfu/ml. Στη συνέχεια προσετέθη διάλυμα ιμιπενέμης σε συγκέντρωση 4 και 8 φορές πολλαπλάσια της MIC. Για κάθε στέλεχος υπήρχε σωληνάριο-control χωρίς προσθήκη αντιβιοτικού. Τα σωληνάρια επωάσθηκαν επί 18 ώρες σε θερμοκρασία 37ºC. Σε προκαθορισμένες χρονικές στιγμές ( 0, 2, 6 και 24 ώρες ) έγινε υπολογισμός των ζώντων μικροοργανισμών με τη μέθοδο των υποδεκαπλάσιων αραιώσεων σε φυσιολογικό ορό. 1.2.7. Γ ΠΕΙΡΑΜΑ : MEΛΕΤΗ ΚΙΝΗΤΙΚΗΣ ΘΑΝΑΤΩΣΗΣ Στη συνέχεια τα στελέχη μελετήθηκαν με καμπύλες θανατώσεως (killing curves) σε συνθήκες όμοιες με τα ανωτέρω πειράματα χρησιμοποιώντας και άλλα αντιμικροβιακά, επί σταθερού ενοφθαλμίσματος. 56

Το αρχικό ενοφθάλμισμα ήταν 5x10 5 cfu/ml. Τα αντιμικροβιακά ιμιπενέμη, μεροπενέμη, ερταπενέμη, αζτρεονάμη και γενταμικίνη - χρησιμοποιήθηκαν σε σταθερές συγκεντρώσεις C (οι οποίες συνέπιπταν με τα όρια ευαισθησίας της CLSI (2009) και 2 φορές τη συγκέντρωση αυτή (2x C). -ANTIBIOTIKA: C 2XC (μg/ml) Ιμιπενέμη 16 32 Μεροπενέμη 16 32 Ερταπενέμη 8 16 Αζτρεονάμη 32 64 Γενταμικίνη 16 32 Για την ιμιπενέμη η συγκέντρωση 16 μg/ml προσεγγίζει την in vivo μέση συγκέντρωση στο πλάσμα (Szabo D et all 2001). Για κάθε στέλεχος υπήρχε σωληνάριο-μάρτυρας χωρίς προσθήκη αντιβιοτικού. Οι καλλιέργειες επωάστηκαν για 18 ώρες στους 35 C. Ως χρονικά σημεία στις καμπύλες θανατώσεως ορίστηκαν οι 0, 2, 6 και 24 ώρες. Ο υπολογισμός του αριθμού των ζώντων μικροβιακών κυττάρων έγινε με τη μέθοδο των υποδεκαπλάσιων αραιώσεων σε φυσιολογικό ορό. Οι αποικίες μετρήθηκαν μετά από 24ωρη επώαση σε τρυβλία Mueller- Hinton. 57

1.3. ΙΝ VIVO ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΒΑΚΤΗΡΙΟΚΤΟΝΟΥ ΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΚΑΡΒΑΠΕΝΕΜΩΝ ΕΝΑΝΤΙ ΕΝΤΕΡΟΒΑΚΤΗΡΙΑΚΩΝ ΤΗΣ ΟΜΑΔΑΣ VIM 1.3.1. Α ΠΕΙΡΑΜΑ - ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΩΝ ΣΧΗΜΑΤΩΝ ΙΜΙΠΕΝΕΜΗΣ ΣΕ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΛΟΙΜΩΞΗ ΣΕ ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ Στο δεύτερο μέρος μελετήθηκε η συμπεριφορά των ίδιων στελεχών σε πειραματόζωα χρησιμοποιώντας το μοντέλο της εντοπισμένης λοίμωξης στο μηρό, όπως περιγράφηκε από τους Fantin και συν 1991. Mελέτες με μοντέλα λοιμώξεων σε πειραματόζωα έχουν δείξει αντιστοιχία στις PK/PD παραμέτρους που χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της κλινικής και μικροβιολογικής αποτελεσματικότητας των αντιμικροβιακών, σε σχέση με κλινικές μελέτες σε ανθρώπους (Craig A. 2001). Η μελέτη έγινε σε ουδετεροπενικούς μύες διότι, αφενός πολλές λοιμώξεις από Gram αρνητικούς μικροοργανισμούς σε ουδετεροπενικούς ασθενείς είναι ανθεκτικές στην αντιμικροβιακή αγωγή, αφετέρου οι φαρμακοδυναμικές παράμετροι καθίστανται περισσότερο εμφανείς απουσία ουδετεροφίλων (Leggett J et al 1989), ενώ αποκλείεται η πιθανότητα παρεμβολής του φαινομένου postantibiotic leucocyte enhancement (PALE). To φαινόμενο αυτό αναφέρεται στην παρατήρηση ότι τα βακτήρια μετά την έκθεσή τους στην αντιμικροβιακή ουσία (postantibiotic phase) είναι περισσότερο ευάλωτα σε ενδοκυττάρια θανάτωσή ή σε φαγοκυττάρωση από τα λευκοκύτταρα, γεγονός το οποίο μπορεί να παρατείνει πιθανό in vivo postantibiotic effect (Craig W. 1998). To τελευταίο έχει παρατηρηθεί σε έκθεση στελεχών Pseudomonas aeruginosa και Acinetobacter baumanii σε καρβαπενέμες (Βustamante C et al 1984, Gudmundsson S et al 1986, Joly-Guillou M et al 1997 ). 1.3.1.α. -ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ Χρησιμοποιήθηκαν ουδετεροπενικοί θηλυκοί ICR μύες (Harlan Spraque Dawley, Inc.) ηλικίας 7 εβδομάδων και βάρους 28-32 g. 1.3.1.β. - ΣΤΕΛΕΧΗ Klebsiella pneumoniae (KP VIM) ΚΡ 6/100 (MIC 2 μg/ml) ΚΡ SEC2 (MIC 4 μg/ml) KP SEC4 (MIC 32 μg/ml) ΚΡ ΕΥ-1 (MIC 0.125 μg/ml) ως στέλεχος- μάρτυρας 1.3.1.γ. -ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΕΝΟΦΘΑΛΜΙΣΜΑΤΟΣ Χρησιμοποιήθηκε εναιώρημα λογαριθμικής καλλιέργειας των υπό μελέτη στελεχών σε ζωμό Luria Bertani πυκνότητας 10 8 cfu/ml (OD =O.3). 58

O υπολογισμός της πυκνότητας του καλλιεργήματος έγινε με φωτομετρική μέθοδο (580nm, φωτόμετρο Hitachi U-2001). 1.3.1.δ. -ΠΡΟΚΛΗΣΗ ΟΥΔΕΤΕΡΟΠΕΝΙΑΣ Η ουδετεροπενία (<100 πολυμορφοπύρηνα ανά mm 3 ) προκλήθηκε με ενδοπεριτοναϊκή έγχυση 150 και 100 mg κυκλοφωσφαμίδης ανά kg σωματικού βάρους, τέσσερις και μία ημέρες πριν την έναρξη της αντιμικροβιακής θεραπείας, αντίστοιχα. H ουδετεροπενία επιβεβαιώθηκε με μικροσκοπική εξέταση επιχρίσματος περιφερικού αίματος. 1.3.1.ε.-ΔΟΣΟΛΟΓΙΚΑ ΣΧΗΜΑΤΑ - Α=30 mg/kg σωματικού βάρους - Β= 60 mg/kg σωματικού βάρους. Στα πειραματόζωα-μάρτυρες χορηγήθηκε φυσιολογικός ορός. 1.3.1.στ.-ΠΡΟΚΛΗΣΗ ΛΟΙΜΩΞΗΣ Η λοίμωξη επιτεύχθηκε με έγχυση στο μηρό 0.1 ml ζωμού Luria-Bertani που περιείχε το υπό μελέτη βακτηριακό στέλεχος σε συγκέντρωση 10 7 cfu/ml. Χρησιμοποιήθηκαν τρεις ομάδες πειραματοζώων: Α, Β (με τα ανωτέρω δοσολογικά σχήματα) και C (control- μάρτυρας). Προκλήθηκε εντοπισμένη λοίμωξη στο δεξιό μηρό με ΚΡ ΕΥ-1 και με ΚΡ VIM στον αριστερό. Θανατώθηκαν 10 πειραματόζωα σε κάθε χρονικό σημείο. 1.3.1.ζ. -ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΑΓΩΓΗΣ Δύο ώρες μετά την πρόκληση της λοίμωξης, και κάθε 2 ώρες έως της συμπληρώσεως 24ώρου, χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά διάλυμα ιμιπενέμης στα ανωτέρω δοσολογικά σχήματα (συνολική δόση 360 και 720mg/kg ΣΒ για το θεραπευτικό σχήμα Α και Β αντίστοιχα). 1.3.1.η. -ΦΑΡΜΑΚΟΚΙΝΗΤΙΚΗ ΙΜΙΠΕΝΕΜΗΣ Τα επίπεδα του φαρμάκου στο πλάσμα των πειραματοζώων προσδιορίσθηκαν στα 15, 30, 60 και 120 min μετά εφ άπαξ ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση ιμιπενέμης και στα δύο δοσολογικά σχήματα. Χρησιμοποιήθηκε η μικροβιολογική μέθοδος (agar diffusion wells) με το πρότυπο στέλεχος Escherichia coli ATCC 25922 ως δείκτη. (Anhalt, J.P.1985) Χρησιμοποιήθηκαν για τη μέτρηση επιπέδων ιμιπενέμης δύο πειραματόζωα σε κάθε χρονικό σημείο. 1.3.1.θ. -ΘΑΝΑΤΩΣΗ ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΩΝ Τα πειραματόζωα θανατώθηκαν στις 0,6 και 24 ώρες, με αυχενική παρεκτόπιση, αφού προηγουμένως έγινε χρήση αναισθητικού. 1.3.1.ι. -ΠΑΡΑΛΑΒΗ /ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΙΣΤΟΥ Μετά τη θανάτωση, έγινε αποκοπή του μηρού, αφαίρεση του οστού και λειοτρίβηση του ιστού με 1 ml φυσιολογικού ορού χρησιμοποιώντας ειδικό ομοιογενοποιητή. Στη συνέχεια συλλέχθηκε το υπερδιήθημα προκειμένου να υπολογισθούν οι ζώντες μικροοργανισμοί. 59

1.3.1.κ. -ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ Οι αποικίες των μικροβίων υπολογίσθηκαν με τη μέθοδο των υποδεκαπλάσιων διαδοχικών αραιώσεων του αρχικού ομογενοποιήματος σε φυσιολογικό ορό και μετρήθηκαν μετά από 18ωρη επώασή τους στους 37 C σε τρυβλία Mueller- Hinton. 1.3.2. Β ΠΕΙΡΑΜΑ: ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΩΝ ΣΧΗΜΑΤΩΝ ΜΕΡΟΠΕΝΕΜΗΣ ΣΕ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΛΟΙΜΩΞΗ ΣΕ ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ Στο δεύτερο μέρος της in vivo μελέτης αξιολογήθηκε η βακτηριοκτόνος δράση της μεροπενέμης έναντι VIM θετικών στελεχών Klebsiella pneumoniae χρησιμοποιώντας το μοντέλο της εντοπισμένης λοίμωξης στο μηρό, όπως περιγράφηκε στο προηγούμενο πείραμα. 1.3.2.α. -ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ Χρησιμοποιήθηκαν ουδετεροπενικοί θηλυκοί ICR μύες (Harlan Spraque Dawley, Inc.) ηλικίας 7 εβδομάδων και βάρους 28-32 g. 1.3.2.β. - ΣΤΕΛΕΧΗ Klebsiella pneumoniae (KP VIM) ΚΡ SEC2 (MIC 4 μg/ml) KP SEC4 (MIC 1 μg/ml) ΚΡ ΕΥ-1 (MIC 0.016 μg/ml) ως στέλεχος- μάρτυρας 1.3.2.γ. -ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΕΝΟΦΘΑΛΜΙΣΜΑΤΟΣ Χρησιμοποιήθηκε εναιώρημα λογαριθμικής καλλιέργειας των υπό μελέτη στελεχών σε ζωμό Luria Bertani πυκνότητας 10 8 cfu/ml (OD =O.3). O υπολογισμός της πυκνότητας του καλλιεργήματος έγινε με φωτομετρική μέθοδο (580 nm, φωτόμετρο Hitachi U-2001). 1.3.2.δ. -ΠΡΟΚΛΗΣΗ ΟΥΔΕΤΕΡΟΠΕΝΙΑΣ Η ουδετεροπενία (<100 πολυμορφοπύρηνα ανά mm 3 ) προκλήθηκε με ενδοπεριτοναϊκή έγχυση 150 και 100 mg κυκλοφωσφαμίδης ανά kg σωματικού βάρους, τέσσερις και μία ημέρες πριν την έναρξη της αντιμικροβιακής θεραπείας αντίστοιχα. H ουδετεροπενία επιβεβαιώθηκε με μικροσκοπική εξέταση επιχρίσματος περιφερικού αίματος. 60

1.3.2.ε. -ΔΟΣΟΛΟΓΙΚΑ ΣΧΗΜΑΤΑ - Α=30 mg/kg σωματικού βάρους - Β= 60 mg/kg σωματικού βάρους. Στα πειραματόζωα-μάρτυρες χορηγήθηκε φυσιολογικός ορός. 1.3.2.στ. -ΠΡΟΚΛΗΣΗ ΛΟΙΜΩΞΗΣ Η λοίμωξη επιτεύχθηκε με έγχυση στο μηρό 0.1 ml ζωμού Luria-Bertani που περιείχε το υπό μελέτη βακτηριακό στέλεχος σε συγκέντρωση 10 7 cfu/ml. Χρησιμοποιήθηκαν τρεις ομάδες πειραματοζώων: Α, Β (με τα ανωτέρω δοσολογικά σχήματα) και C (control- μάρτυρας). Προκλήθηκε εντοπισμένη λοίμωξη στο δεξιό μηρό με ΚΡ ΕΥ-1 και με ΚΡ VIM στον αριστερό. Θανατώθηκαν 10 πειραματόζωα σε κάθε χρονικό σημείο. 1.3.2.ζ -ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΑΓΩΓΗΣ Δύο ώρες μετά την πρόκληση της λοίμωξης, και κάθε 2 ώρες έως της συμπληρώσεως 24ώρου, χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά διάλυμα μεροπενέμης στα ανωτέρω δοσολογικά σχήματα (συνολική δόση 360 και 720mg/kg ΣΒ για το θεραπευτικό σχήμα Α και Β αντίστοιχα). 1.3.2.η. -ΦΑΡΜΑΚΟΚΙΝΗΤΙΚΗ ΜΕΡΟΠΕΝΕΜΗΣ Έγινε μέτρηση επιπέδων μεροπενέμης μετά από μία δόση μεροπενέμης. Χρησιμοποιήθηκαν ομάδες των πέντε πειραματοζώων για κάθε δοσολογικό σχήμα. Αιμοληψίες έγιναν στα 0, 10, 20, 30, 60 και 120 λεπτά. Η μέτρηση των επιπέδων μεροπενέμης στο πλάσμα έγινε με μικροβιολογική δοκιμασία. Ο υπολογισμός των φαρμακοκινητικών παραμέτρων έγινε με το πρόγραμμα Kinetica. 1.3.2.θ. -ΘΑΝΑΤΩΣΗ ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΩΝ Τα πειραματόζωα θανατώθηκαν στις 0,6 και 24 ώρες, με αυχενική παρεκτόπιση, αφού προηγουμένως έγινε χρήση αναισθητικού. 1.3.2.ι. -ΠΑΡΑΛΑΒΗ /ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΙΣΤΟΥ Μετά τη θανάτωση έγινε αποκοπή του μηρού, αφαίρεση του οστού και λειοτρίβηση του ιστού με 1 ml φυσιολογικού ορού χρησιμοποιώντας ειδικό ομοιογενοποιητή. Στη συνέχεια συλλέχθηκε το υπερδιήθημα προκειμένου να υπολογισθούν οι ζώντες μικροοργανισμοί. 61

1.3.2.κ. -ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ Οι αποικίες των μικροβίων υπολογίσθηκαν με τη μέθοδο των υποδεκαπλάσιων διαδοχικών αραιώσεων του αρχικού ομογενοποιήματος σε φυσιολογικό ορό και προσμετρήθηκαν ύστερα από 18ωρη επώασή τους στους 37 C σε τρυβλία Mueller- Hinton. 62

. 2. AΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 2.1 ΣΤΕΛΕΧΗ -ΕΛΕΓΧΟΣ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ ΣΤΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ Χρησιμοποιήθηκαν επτά (Ν=7) νοσοκομειακά στελέχη με φαινοτυπικά χαρακτηριστικά συμβατά με παραγωγή β-λακταμασών τύπου VIM. 2.1.1. ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΝΤΙΒΙΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ ΚΑΤΑ KIRBY-BAUER Όλα τα κλινικά στελέχη παρουσίαζαν αντοχή ή μειωμένη ευαισθησία στην ιμιπενέμη σύμφωνα με τα πρόσφατα αναθεωρημένα κριτήρια του CLSI (CLSI 2010). Τα τελευταία χαρακτηρίζονταν μετρίως ευαίσθητα και ευαίσθητα σύμφωνα με τα προηγούμενα κριτήρια (CLSI 2009). Tα στελέχη παρουσίαζαν επίσης αντοχή ή μειωμένη ευαισθησία στις κεφαλοσπορίνες και στους συνδυασμούς β-λακταμικών αντιβιοτικών με αναστολείς β- λακταμασών. Όλα τα στελέχη ήταν ευαίσθητα στην αζτρεονάμη (β-λακτάμη που δεν υδρολύεται απο τα ένζυμα τύπου VIM), με εξαίρεση το στέλεχος ΚΡ 700. Παράλληλα, όλα τα στελέχη ήταν ανθεκτικά στην τομπραμυκίνη, καθώς και στην τριμεθοπρίμη και τις σουλφοναμίδες. Οι φαινότυποι αντοχής των στελεχών παρουσιάζονται στον κάτωθι πίνακα. Η διάμετρος της άλω για το κάθε αντιβιοτικό σημειώνεται ως δείκτης. ΦΑΙΝΟΤΥΠΟΣ ΑΝΤΟΧΗΣ 151 CRO 13 TCC 9 CAZ 0 IMP 18 ATM 32 AMC 11 FEP 13 FOX 8 PIP 10 TZP 9 CTX 11 TM 11 SSS 0 GM 20 TMP 0 2152 CRO 11 TCC 9 CAZ 0 IMP 18 ATM 32 AMC 9 FEP 12 FOX 8 PIP 9 TZP 8 CTX 10 TM 10 SSS 0 GM 19 TMP 0 6/100 CRO 9 TCC 9 CAZ 0 IMP 16 ATM 30 AMC 0 FEP 10 FOX 0 PIP 0 TZP 0 CTX 0 TM 9 SSS 0 GM 20 TMP 0 SEC 2 CRO 12 TCC 0 CAZ 0 IMP 17 ATM 32 AMC 0 FEP 13 FOX 0 PIP 8 TZP 8 CTX 8 TM 0 SSS 0 GM 22 TMP 0 SEC 4 CRO 12 TCC 0 CAZ 0 IMP 17 ATM 32 AMC 0 FEP 13 FOX 0 PIP 8 TZP 8 CTX 8 TM 0 SSS 0 GM 22 TMP 0 SEC3 CRO 0 TCC 0 CAZ 0 IMP 0 ATM 30 AMC 0 FEP 0 FOX 0 PIP 0 TZP 0 CTX 0 TM 8 SSS 0 GM 19 TMP 0 700 CRO 9 TCC 11 CAZ 0 IMP 10 ATM 0 AMC 0 FEP 9 FOX 0 PIP 0 TZP 0 CTX 0 TM 8 SSS 0 GM 20 TMP 0 EY 1 CRO 28 TCC 23 CAZ 28 IMP 27 ATM 32 AMC 20 FEP 35 FOX 24 PIP 23 TZP 21 CTX 32 TM 21 SSS 25 GM 22 TMP 17 Πίνακας 4: Φαινότυποι αντοχής των στελεχών Klebsiella pneumoniae Συντομογραφίες: CRO: κεφτριαξόνη, TCC: τικαρκιλλίνη-κλαβουλανικό οξύ, CAZ: κεφταζιδίμη, IMP: ιμιπενέμη, ATM: αζτρεονάμη, AMC: αμοξικιλλίνη-κλαβουλανικό οξύ, FEP: κεφεπίμη, FOX: κεφοξιτίνη, PIP: πιπερακιλλίνη, TZP: πιπερακιλλίνη-ταζομπακτάμη, 63

CTX: κεφοταξίμη, SSS: σουλφοναμίδες, GM: γενταμικίνη, TMP: τριμεθοπρίμη, ΤΜ: τομπραμυκίνη. 2.1.2. ΜΕΘΟΔΟΣ E-TEST Τα αποτελέσματα από τον προσδιορισμό των ελάχιστων ανασταλτικών συγκεντρώσεων των αντιβιοτικών έναντι των στελεχών της συλλογής έδειξαν ότι τα στελέχη K. pneumoniae της συλλογής εμφάνιζαν ποικιλία MIC στις καρβαπενέμες (1 ->32mg/L). Τα αντίστοιχα αποτελέσματα, καθώς και οι τιμές MIC της αζτρεονάμης, παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα: Στέλεχος Τιμές MIC (mg/l) ΙΜP MER ERT AZT KP ΕΥ1 0.125 0.016 0.004 0.032 KP 6/100 2 1 1 0.125 KP 151 8 2 2 0.25 KP 2152 4 2 2 0.125 KP SEC2 4 4 8 0.25 KP SEC3 64 32 32 1 KP SEC4 >32 1 1 0.5 ΚΡ 700 2 1 2 64 IMP: ιμιπενέμη, MER: μεροπενέμη, ERT: ερταπενέμη, AZT: αζτρεονάμη Πίνακας 5: Τιμές MIC (mg/l) των στελεχών Klebsiella pneumoniae με τη μέθοδο E-test 2.1.3. MEΘΟΔΟΣ ΜΙΚΡΟΑΡΑΙΩΣΕΩΝ Τα αποτελέσματα από τον προσδιορισμό των ελάχιστων ανασταλτικών και βακτηριοκτόνων συγκεντρώσεων των αντιβιοτικών έναντι των στελεχών K. pneumoniae παρουσιάζονται κάτωθι. 64

MICs (mg/l) 5X10 5 CFU/mL MICs (mg/l) 5X10 7 CFU/mL Στέλεχος IPM MER ERT ATM a IPM MER ERT ATM ΕΥ-1 0.125 0.016 0.016 0.032 0.25 0.016 0.032 0.06 ΚΡ6/100 2 1 1 0.125 8 8 4 0.125 ΚΡ700 2 1 2 64 16 16 32 128 ΚΡSEC2 4 4 8 0.25 128 32 32 0.5 ΚΡ2152 4 2 2 0.125 128 16 16 0.125 KP151 8 2 2 0.25 128 128 128 0.25 KPSEC4 32 1 1 0.5 128 16 32 0.5 KPSEC3 64 32 32 1 128 128 128 2 Πίνακας 6: Τιμές MIC (mg/l) των στελεχών Klebsiella pneumoniae με τη μέθοδο μικροαραιώσεων σε ενοφθάλμισμα 5X10 5 cfu/ml και 5X10 7 cfu/ml MBCs (mg/l) 5X10 5 CFU/mL Στέλεχος IPM MER ERT ATM ΕΥ-1 0.25 0.032 0.016 0.032 ΚΡ6/100 2 1 2 0.25 ΚΡ700 2 1 2 64 ΚΡSEC2 4 4 8 0.25 ΚΡ2152 8 2 2 0.25 KP151 8 2 2 0.5 KPSEC4 32 1 1 0.5 KPSEC3 64 32 32 1 Πίνακας 7: Τιμές MBC (mg/l) των στελεχών Klebsiella pneumoniae με τη μέθοδο μικροαραιώσεων σε ενοφθάλμισμα 5X10 5 cfu/ml 65

2.1.4. ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ: - Ως αναμένετο, η αζτρεονάμη παρουσίαζε χαμηλές τιμές MIC για όλα τα VIM θετικά στελέχη με εξαίρεση το στέλεχος ΚΡ 700 που παρήγαγε SHV-5. Εντούτοις οι MIC της αζτρεονάμης για τα VIM θετικά στελέχη ήταν υψηλότερες συγκρινόμενες με τις αντίστοιχες τιμές που παρατηρήθηκαν στο ευαίσθητο στέλεχος ΚΡ EY-1, και παρέμειναν ουσιωδώς ίδιες με την αύξηση του ενοφθαλμίσματος. - Οι MIC των VIM-1 θετικών στελεχών ποικίλλαν. Πέντε στελέχη είχαν MIC < 4 μg/ml στις καρβαπενέμες και χαρακτηρίζονται ευαίσθητα σύμφωνα με τα CLSI 2010 κριτήρια. Σύμφωνα με τα ίδια κριτήρια, τα στελέχη ΚΡ SEC4, KP 151 και ΚΡ 2152 χαρακτηρίζονται ανθεκτικά στην ιμιπενέμη και ευαίσθητα στις μεροπενέμη και ερταπενέμη, ενώ τα στελέχη KP SEC2 και KP SEC3 χαρακτηρίζονται ανθεκτικά σε όλες τις καρβαπενέμες. -Με όλα τα στελέχη παρουσιάστηκε σημαντικό φαινόμενο ενοφθαλμίσματος (inoculum effect) σε διαφορετικό βαθμό για κάθε στέλεχος. Με λογαριθμική αύξηση του αρχικού ενοφθαλμίσματος κατά δύο λογαρίθμους σημειώθηκε αύξηση της MIC από 2 έως 6 διαδοχικές αραιώσεις. Το φαινόμενο ενοφθαλμίσματος ήταν εμφανέστερο στην ιμιπενέμη συγκριτικά με τις άλλες καρβαπενέμες. - Οι τιμές MBC για τις καρβαπενέμες ήταν παρόμοιες με τις αντίστοιχες τιμές MIC. 66

2.2. IN VITRO ΜΕΛΕΤH 2.2.1. Α ΠΕΙΡΑΜΑ : MEΛΕΤΗ ΚΙΝΗΤΙΚΗΣ ΘΑΝΑΤΩΣΗΣ / ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ ΕΝΟΦΘΑΛΜΙΣΜΑΤΟΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: CONTROL 4X MIC 8X MIC 0 h 1 X 10 6 1 X 10 6 1 X 10 6 1 h 1.5 X 10 6 1 X 10 6 1 X 10 5 3 h 2 X 10 7 1 X 10 5 4 X10 3 5 h 1.5 X 10 8 1 X 10 6 1 X 10 4 24 h 1 X 10 9 1 X 10 9 1 X 10 9 Πίνακας 8: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ 151 με MIC 8 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 6 cfu/ml CONTROL 4X MIC 8X MIC 0 h 2 X 10 7 2 X 10 7 2 X 10 7 1 h 4 X 10 7 3 X 10 7 1 X 10 7 3 h 1 X 10 8 6 X 10 7 6 X 10 7 5 h 5 X 10 8 3 X 10 8 2 X 10 8 24 h 1 X 10 9 3 X 10 8 8 X 10 8 Πίνακας 9: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ 151 με MIC 8 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 8 cfu/ml 67

CONTROL 4X MIC 8X MIC 0 h 1 X 10 6 1 X 10 6 1 X 10 6 1 h 2 X 10 6 2 X 10 5 1 X 10 5 3 h 2 X 10 7 1 X 10 4 1 X 10 3 5 h 1 X 10 8 1 X 10 3 1 X 10 2 24 h 1 X 10 9 1 X 10 9 2 X 10 7 Πίνακας 10: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ 2152 με MIC 4 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 6 cfu/ml CONTROL 4X MIC 8X MIC 0 h 5 X 10 7 5 X 10 7 5 X 10 7 1 h 1 X 10 8 1 X 10 7 2 X 10 6 3 h 2 X 10 8 1 X 10 8 1 X 10 7 5 h 3 X 10 8 2 X 10 8 6 X 10 7 24 h 1 X 10 9 5 X 10 8 7 X 10 8 Πίνακας 11: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ 2152 με MIC 4 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 8 cfu/ml CONTROL 4X MIC 8X MIC 0 h 1 X 10 6 1 X 10 6 1 X 10 6 1 h 2 X 10 6 2 X 10 6 7 X 10 5 3 h 1 X 10 8 1 X 10 5 1 X 10 4 5 h 1 X 10 9 2 X 10 4 3 X 10 3 24 h 1 X 10 9 1 X 10 5 < 10 Πίνακας 12: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ ΕΥ-1 με MIC 0.125 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 6 cfu/ml 68

CONTROL 4X MIC 8X MIC 0 h 1 X 10 8 1 X 10 8 1 X 10 8 1 h 1.5 X 10 8 9 X 10 7 1 X 10 8 3 h 2 X 10 8 1.5 X 10 8 1.3 X 10 8 5 h 1 X 10 9 1 X 10 9 3 X 10 8 24 h 2 X 10 9 2 X 10 8 2 X 10 8 Πίνακας 13: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ ΕΥ-1 με MIC 0.125 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 8 cfu/ml Η σχηματική αναπαράσταση των ανωτέρω αποτελεσμάτων παρουσιάζεται στις παρακάτω γραφικές παραστάσεις των ζώντων μικροογανισμών (cfu/ml) σε συνάρτηση με το χρόνο (h). KP 151, Inoculum 1E+06 cfu/ml 1E+10 1E+08 1E+06 1E+04 1E+02 A0 A4 A8 1E+00 0 1 3 5 24 h Διάγραμμα 1: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ 151 με MIC 8 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 6 cfu/ml 69

KP 151, Inoculum 1E+08 cfu/ml 1E+10 1E+08 1E+06 1E+04 1E+02 B0 B4 B8 1E+00 0 1 3 5 24 h Διάγραμμα 2: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ 151 με MIC 8 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 8 cfu/ml KP 2152, Inoculum 1E+06 cfu/ml 1E+10 1E+08 1E+06 1E+04 1E+02 A0 A4 A8 1E+00 0 1 3 5 24 h Διάγραμμα 3: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ 2152 με MIC 4 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 6 cfu/ml 70

KP 2152, Inoculum 1E+08 cfu/ml 1E+10 1E+08 1E+06 1E+04 1E+02 B0 B4 B8 1E+00 0 1 3 5 24 h Διάγραμμα 4: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ 2152 με MIC 4 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 8 cfu/ml Kpn EY-1, Inoculum 1E+06 A0 cfu/ml 1E+09 1E+08 1E+07 1E+06 1E+05 1E+04 1E+03 1E+02 1E+01 1E+00 0 1 3 5 24 A4 A8 h Διάγραμμα 5: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ ΕΥ-1 με MIC 0.125 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 6 cfu/ml 71

Kpn EY-1, Inoculum 1E+08 cfu/ml 1E+10 1E+08 1E+06 1E+04 1E+02 B0 B4 B8 1E+00 0 1 3 5 24 h Διάγραμμα 6: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ ΕΥ-1 με MIC 0.125 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 8 cfu/ml 72

2.2.2 Β ΠΕΙΡΑΜΑ : MEΛΕΤΗ ΚΙΝΗΤΙΚΗΣ ΘΑΝΑΤΩΣΗΣ / ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ ΕΝΟΦΘΑΛΜΙΣΜΑΤΟΣ CONTROL 4X MIC 8X MIC 0 h 1 X 10 4 1 X 10 4 1 X 10 4 2 h 2.5 X 10 5 <10 <10 6 h 2 X 10 8 <10 <10 24 h 2 X 10 9 <10 <10 Πίνακας 14: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ 6/100 με MIC 2 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 4 cfu/ml CONTROL 4X MIC 8X MIC 0 h 1.7 X 10 6 1.7 X 10 6 1.7 X 10 6 2 h 3 X 10 7 5.5 X 10 4 1 X 10 3 6 h 7 X 10 8 6 X 10 7 1 X 10 3 24 h 1.7 X 10 9 2.3 X 10 9 2 X 10 9 Πίνακας 15: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ 6/100 με MIC 2 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 6 cfu/ml CONTROL 4X MIC 8X MIC 0 h 1.6 X 10 4 1.6 X 10 4 1.6 X 10 4 2 h 2.4 X 10 5 1 X 10 2 <10 6 h 3.5 X 10 8 <10 <10 24 h 5 X 10 8 <10 <10 Πίνακας 16: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ SEC2 με MIC 4 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 4 cfu/ml 73

CONTROL 4X MIC 8X MIC 0 h 1.5 X 10 6 1.5 X 10 6 1.5 X 10 6 2 h 1.5 X 10 7 2 X 10 3 2.5 X 10 3 6 h 3 X 10 8 4 X 10 3 3 X 10 2 24 h 8 X 10 8 6 X 10 8 4 X 10 8 Πίνακας 17: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ SEC2 με MIC 4 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 6 cfu/ml To στέλεχος ΚΡ SEC4 εξετάστηκε και με MIC 64 μg/ml η οποία υπολογίσθηκε με την τεχνική των μακροαραιώσεων. CONTROL 4X MIC 8X MIC 0 h 1.3 X 10 4 1.3 X 10 4 1.3 X 10 4 2 h 3.5 X 10 5 <10 <10 6 h 2.5 X 10 8 <10 <10 24 h 2.5 X 10 8 <10 <10 Πίνακας 17: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ SEC4 με MIC 32 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 4 cfu/ml CONTROL 4X MIC 8X MIC 0 h 1.3 X 10 4 1.3 X 10 4 1.3 X 10 4 2 h 3.5 X 10 5 <10 <10 6 h 2.5 X 10 8 <10 <10 24 h 2.5 X 10 8 <10 <10 Πίνακας 18: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ SEC4 με MIC 64 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 4 cfu/ml 74

CONTROL 4X MIC 8X MIC 0 h 7 X 10 5 7 X 10 5 7 X 10 5 2 h 2 X 10 7 1 X 10 2 <10 6 h 3 X 10 8 1 X 10 2 <10 24 h 7 X 10 8 6 X 10 8 2.5 X 10 4 Πίνακας 19: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ SEC4 με MIC 32 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 6 cfu/ml CONTROL 4X MIC 8X MIC 0 h 7 X 10 5 7 X 10 5 7 X 10 5 2 h 2 X 10 7 1 X 10 2 <10 6 h 3 X 10 8 <10 <10 24 h 7 X 10 8 6 X 10 4 <10 Πίνακας 20: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ SEC4 με MIC 64 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 6 cfu/ml CONTROL 4X MIC 8X MIC 0 h 3 X 10 4 3 X 10 4 3 X 10 4 2 h 2.5 X 10 5 1 X 10 3 6 X 10 2 6 h 4 X 10 8 <10 <10 24 h 1.5 X 10 9 <10 <10 Πίνακας 21: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ ΕΥ-1 με MIC 0.125 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 4 cfu/ml 75

CONTROL 4X MIC 8X MIC 0 h 1.5 X 10 6 1.5 X 10 6 1.5 X 10 6 2 h 3 X 10 7 2 X 10 4 4 X 10 3 6 h 6 X 10 8 2 X 10 2 1 X 10 2 24 h 1.6 X 10 9 4 X 10 6 2 X 10 4 Πίνακας 22: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ ΕΥ-1 με MIC 0.125 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 6 cfu/ml Η σχηματική αναπαράσταση των ανωτέρω αποτελεσμάτων παρουσιάζεται στις παρακάτω γραφικές παραστάσεις των ζώντων μικροογανισμών (cfu/ml) σε συνάρτηση με το χρόνο (h). KP 6/100, Inoculum 1E+04 Ia0 Ia4-IMP cfu/ml 1E+10 1E+08 1E+06 1E+04 1E+02 1E+00 0 2 6 24 Ia8-IMP h Διάγραμμα 7: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ 6/100 με MIC 2 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 4 cfu/ml 76

KP 6/100, Inoculum 1E+06 cfu/ml 1E+10 1E+08 1E+06 1E+04 1E+02 Ia0 Ia4-IMP Ia8-IMP 1E+00 0 2 6 24 h Διάγραμμα 8: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ 6/100 με MIC 2 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 6 cfu/ml Kpn SEC2, Inoculum 1E+04 cfu/ml 1E+10 1E+08 1E+06 1E+04 1E+02 Ib0 Ib4-IMP Ib8-IMP 1E+00 0 2 6 24 h Διάγραμμα 9: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ SEC2 με MIC 4 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 4 cfu/ml 77

Kpn SEC2, Inoculum 1E+06 Ib0 cfu/ml 1E+09 1E+08 1E+07 1E+06 1E+05 1E+04 1E+03 1E+02 1E+01 1E+00 0 2 6 24 Ib4-IMP Ib8-IMP h Διάγραμμα 10: Κινητική θανατώσεως του στελέχους SEC2 με MIC 4 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 6 cfu/ml Kpn SEC4, Inoculum 1E+04 R0 cfu/ml 1E+09 1E+08 1E+07 1E+06 1E+05 1E+04 1E+03 1E+02 1E+01 1E+00 0 2 6 24 R4-IMP R8-IMP h Διάγραμμα 11: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ SEC4 με MIC 32 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 4 cfu/ml 78

Kpn SEC4, Inoculum 1E+06 R0 R4(32)-IMP R8(32)-IMP cfu/ml 1E+09 1E+08 1E+07 1E+06 1E+05 1E+04 1E+03 1E+02 1E+01 1E+00 0 2 6 24 R4(64)-IMP R8(64)-IMP h Διάγραμμα 12: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ SEC4 με MIC 32 και 64 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 6 cfu/ml KP EY-1, Inoculum 1E+04 cfu/ml 1E+10 1E+08 1E+06 1E+04 1E+02 S0 S4-IMP S8-IMP 1E+00 0 2 6 24 h Διάγραμμα 13: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ ΕΥ-1 με MIC 0.125 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 4 cfu/ml 79

KP EY-1, Inoculum 1E+06 S0 cfu/ml 1E+10 1E+09 1E+08 1E+07 1E+06 1E+05 1E+04 1E+03 1E+02 1E+01 1E+00 0 2 6 24 S4-IMP S8-IMP h Διάγραμμα 14: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ ΕΥ-1 με MIC 0.125 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 10 6 cfu/ml 2.2.3. ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟΥ ΕΝΟΦΘΑΛΜΙΣΜΑΤΟΣ (INOCULUM EFFECT) ME TH MEΘΟΔO E-ΤΕST Tο αποτέλεσμα ενοφθαλμίσματος (inoculum effect) το οποίο καθίσταται προφανές από την κινητική θανάτωσης στις αρχικές συγκεντρώσεις των 10 4, 10 6 και 10 8 cfu/ml επιβεβαιώθηκε με τη μέθοδο Ε- test (AB Biodisc). Bακτηριακά εναιωρήματα θολερότητας 0,5 και 2 της κλίμακας McFarland σε φυσιολογικό ορό, επιστρώθηκαν στην επιφάνεια τρυβλίου Mueller Hinton άγαρ. Κατόπιν τοποθετήθηκαν στο άγαρ, ταινίες Etest (AB, Biodisk) που περιέχουν διαβαθμισμένες συγκεντρώσεις του κάθε αντιβιοτικού. Η επώαση έγινε για 18 ώρες στους 37 C. Ως ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση λαμβανόταν η τιμή στην οποία η διαγραφόμενη από την αναστολή της ανάπτυξης του μικροβίου έλλειψη έτεμνε την βαθμονομημένη ταινία. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα: 80

Πίνακας 23 : Τιμές MIC (mg/l) των στελεχών Klebsiella pneumoniae με τη μέθοδο E-test σε δύο ενοφθαλμίσματα ΙΜP MER ERT AZT GEN FEP ΚΡ ΕΥ1 0.125 /0.25 0.016 / 0.016 0.004/ 0.08 0.032 / 0.032 0.5 / 0.5 0.064 / 0.064 ΚΡ6/100 2 / 8 1 / 8 1 / 4 0.125 / 0.125 2 / 2 >32 / >32 ΚΡSEC2 4 / >32 4 / 32 8 / 32 0.25 / 0.5 2 / 2 >32 / >32 ΚΡSEC4 >32 / >32 1 / 4 1 / 2 0.5 / 0.5 2 / 2 >32 / >32 ΚΡ151 8 / > 32 2 / >32 2 / >32 0.25 / 0.25 2 / 2 >32 / >32 ΚΡ2152 4 / >32 2 / 4 2 / 16 0.125 / 0.125 2 / 2 >32 / >32 Με την έντονη γραφή υποδηλώνεται το πυκνότερο ενοφθάλμισμα ( 2 McFarland ) IMP: ιμιπενέμη, MER: μεροπενέμη, ERT: ερταπενέμη, AZT: αζτρεονάμη, GEN: γενταμικίνη, FEP: κεφεπίμη. 2.2.4. ΣΧΟΛΙΑΣΜΟΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ: -Το φαινόμενο ενοφθαλμίσματος (inoculum effect) ορίζεται ως η in vitro εκσεσημασμένη αύξηση της ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης ενός αντιμικροβιακού (MIC) όταν η συγκέντρωση του αρχικού ενοφθαλμίσματος αυξάνεται (Βrook I. 1989, Soriano F. 1992). Το φαινόμενο ενοφθαλμίσματος συνήθως παρατηρείται με β-λακταμικά αντιβιοτικά σε σχέση με βακτήρια που παράγουν β-λακταμάσες, αποδιδόμενο είτε στη σχετική συγκέντρωση β- λακταμικού και β-λακταμάσης και στην 1:1 αλληλεπίδραση μεταξύ τους, είτε σε αλλαγές σε πορίνες της εξωτερικής μεμβράνης (Rice L.B. and Bonomo R.A. 2000). Στα εντεροβακτηριακά το φαινόμενο ενοφθαλμίσματος έχει περιγραφεί με πενικιλλίνες, όχι όμως με αμινογλυκοσίδες, κινολόνες και ιμιπενέμη (Turnidge J.D. 1998, Βrook I. 1989). Στα ανωτέρω πειράματα το φαινόμενο ενοφθαλμίσματος (inoculum effect) για την ιμιπενέμη καθίσταται πλέον προφανές από την κινητική θανάτωσης στις αρχικές συγκεντρώσεις των 10 4, 10 6 και 10 8 cfu/ml και επιβεβαιώνεται με τη μέθοδο Ε- test. 81

-Στο Α Πείραμα η αντιμικροβιακή δράση της ιμιπενέμης ήταν μέγιστη για το ευαίσθητο VIM-αρνητικό στέλεχος, ενδιάμεση στο VIM-θετικό στέλεχος με τη χαμηλότερη MIC (παρά το γεγονός ότι χαρακτηρίζεται ανθεκτικό σύμφωνα με τα CLSI 2010 κριτήρια) και μικρότερη στο VIM-θετικό στέλεχος με τη μεγαλύτερη MIC. Σε όλες τις περιπτώσεις και ιδαιτέρως στο VIM-θετικό στέλεχος με τη χαμηλότερη MIC, η ιμιπενέμη παρουσίασε αυξημένη βακτηριοκτόνο δράση στην υψηλότερη συγκέντρωση (8x MIC). -Στο Β Πείραμα η ιμιπενέμη παρουσίασε ικανοποιητική αντιμικροβιακή δράση έως τις 6 ώρες για όλα τα VIM-θετικά στελέχη, ανεξαρτήτως MIC και για την υψηλότερη συγκέντρωση (8x MIC). -Σε όλες τις περιπτώσεις και για ενοφθάλμισμα 10 6 cfu/ml παρατηρήθηκε ανάκαμψη των βακτηριακών στελεχών, με εξαίρεση το ΚΡ SEC4 με MIC 64 μg/ml και για την υψηλότερη συγκέντρωση ιμιπενέμης (8x MIC). Το φαινόμενο της βακτηριακής ανάκαμψης στις 24 ώρες πιθανώς ενισχύθηκε από τη σημαντική αποδόμηση της ιμιπενέμης ύστερα από 24ωρη επώασή της στους 37 C (Swanson D. et al 1986, Baron E.J. and Hindler J.A.1984, Friedriech L.V et al 1995 ). 2.2.5. Γ ΠΕΙΡΑΜΑ : MEΛΕΤΗ ΚΙΝΗΤΙΚΗΣ ΘΑΝΑΤΩΣΗΣ ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΚΡ ΕΥ-1 MIC-imp 0.125 μg/ml C Ι 16 Ι 32 Μ 16 Μ 32 Ε 8 Ε 16 0 h 5 X 10 5 5 X 10 5 5 X 10 5 5 X 10 5 5 X 10 5 5 X 10 5 5 X 10 5 2 h 6.5 X 10 6 1 X 10 3 6 X 10 2 1 X 10 3 5 X 10 2 2 X 10 3 3 X 10 2 6 h 3.5 X 10 8 1 X 10 2 1 X 10 2 <10 <10 1 X 10 2 <10 24 h 1 X 10 9 <10 <10 <10 <10 <10 <10 Πίνακας 24: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ ΕΥ-1 με MIC 0.125 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 5x10 5 cfu/ml με ιμιπενέμη, μεροπενέμη, ερταπενέμη. 82

A 32 A 64 G 16 G 32 0 h 5 X 10 5 5 X 10 5 5 X 10 5 5 X 10 5 2 h 2 X 10 3 5 X 10 2 <10 <10 6 h <10 <10 <10 <10 24 h <10 <10 <10 <10 Πίνακας 25: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ ΕΥ-1 με MIC 0.125 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 5x10 5 cfu/ml με αζτρεονάμη και γενταμικίνη. ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΚΡ 6/100 MIC-imp 2 μg/ml C Ι 16 Ι 32 Μ 16 Μ 32 Ε 8 Ε 16 0 h 3.5 X 10 5 3.5 X 10 5 3.5 X 10 5 3.5 X 10 5 3.5 X 10 5 3.5 X 10 5 3.5 X 10 5 2 h 1 X 10 7 1 X 10 3 4 X 10 2 2 X 10 3 2 X 10 3 3 X 10 3 2 X 10 3 6 h 4.5 X 10 8 1 X 10 2 <10 3 X 10 2 1 X 10 3 7 X 10 3 4 X 10 3 24 h 1 X 10 9 6 X 10 8 <10 2 X 10 8 5 X 10 8 7 X 10 8 6 X 10 8 Πίνακας 26: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ 6/100 με MIC 2 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 5x10 5 cfu/ml με ιμιπενέμη, μεροπενέμη, ερταπενέμη. A 32 A 64 G 16 G 32 0 h 3 X 10 5 3 X 10 5 3.5 X 10 5 3.5 X 10 5 2 h 1 X 10 5 3 X 10 4 <10 <10 6 h <10 <10 <10 <10 24 h <10 <10 <10 <10 Πίνακας 27: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ 6/100 με MIC 2 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 5x10 5 cfu/ml με αζτρεονάμη και γενταμικίνη. 83

ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΚP SEC 2 MIC-imp 4 μg/ml C Ι 16 Ι 32 Μ 16 Μ 32 Ε 8 Ε 16 0 h 4 X 10 5 4 X 10 5 4 X 10 5 4 X 10 5 4 X 10 5 4 X 10 5 4 X 10 5 2 h 7 X 10 6 1 X 10 3 7 X 10 2 1.7 X 10 2 1.5 X 10 3 6.5 X 10 3 2 X 10 3 6 h 4.5 X 10 8 1.5 X 10 3 5 X 10 2 2 X 10 5 1 X 10 4 7 X 10 5 8 X 10 5 24 h 1 X 10 9 8 X 10 8 4 X 10 8 8.5 X 10 8 1 X 10 9 1 X 10 9 1.5 X 10 9 Πίνακας 28: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ SEC2 με MIC 4 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 5x10 5 cfu/ml με ιμιπενέμη, μεροπενέμη, ερταπενέμη. A 32 A 64 G 16 G 32 0 h 3 X 10 5 3 X 10 5 4 X 10 5 4 X 10 5 2 h 7 X 10 5 7 X 10 4 <10 <10 6 h 5 X 10 2 6 X 10 2 <10 <10 24 h <10 <10 <10 <10 Πίνακας 29: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ SEC2 με MIC 4 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 5x10 5 cfu/ml με αζτρεονάμη και γενταμικίνη. ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΚP SEC 4 MIC-imp 32 μg/ml C Ι 16 Ι 32 Μ 16 Μ 32 Ε 8 Ε 16 0 h 3.2 X 10 5 3.2 X 10 5 3.2 X 10 5 3.2 X 10 5 3.2 X 10 5 3.2 X 10 5 3.2 X 10 5 2 h 1.3 X 10 6 1 X 10 3 3 X 10 2 1.5 X 10 3 1 X 10 3 5.5 X 10 4 1 X 10 3 6 h 3.8 X 10 7 <10 3 X 10 2 7 X 10 4 3.5 X 10 3 4 X 10 4 1 X 10 4 24 h 7 X 10 7 2 X 10 7 5 X 10 7 5 X 10 7 4.5 X 10 7 4 X 10 7 3 X 10 7 Πίνακας 30: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ SEC4 με MIC 32 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 5x10 5 cfu/ml με ιμιπενέμη, μεροπενέμη, ερταπενέμη. 84

A 32 A 64 G 16 G 32 0 h 3.6 X 10 5 3.6 X 10 5 3.2 X 10 5 3.2 X 10 5 2 h 2 X 10 4 1.4 X 10 4 <10 <10 6 h 5 X 10 2 4 X 10 2 <10 <10 24 h <10 <10 <10 <10 Πίνακας 31: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ SEC4 με MIC 32 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 5x10 5 cfu/ml με αζτρεονάμη και γενταμικίνη. ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΚP SEC 3 MIC-imp 64 μg/ml C Ι 16 Ι 32 Μ 16 Μ 32 Ε 8 Ε 16 0 h 6 X 10 5 6 X 10 5 6 X 10 5 6 X 10 5 6 X 10 5 6 X 10 5 6 X 10 5 2 h 7 X 10 6 2.4 X 10 6 8 X 10 5 5.5 X 10 6 2.5 X 10 6 8 X 10 6 7 X 10 6 6 h 1 X 10 8 1 X 10 6 4 X 10 4 1 X 10 6 2.5 X 10 5 1.5 X 10 7 3 X 10 6 24 h 4 X 10 8 2 X 10 8 2 X 10 8 1.5 X 10 8 1 X 10 8 1 X 10 8 1 X 10 8 Πίνακας 32: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ SEC3 με MIC 64 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 5x10 5 cfu/ml με ιμιπενέμη, μεροπενέμη, ερταπενέμη. A 32 A 64 G 16 G 32 0 h 6 X 10 5 6 X 10 5 6 X 10 5 6 X 10 5 2 h 3 X 10 3 1.5 X 10 3 <10 <10 6 h 1 X 10 2 <10 <10 <10 24 h <10 <10 <10 <10 Πίνακας 33: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ SEC3 με MIC 64 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 5x10 5 cfu/ml με αζτρεονάμη και γενταμικίνη. 85

ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΚP 151 MIC-imp 8 μg/ml C Ι 16 Ι 32 Μ 16 Μ 32 Ε 8 Ε 16 0 h 4.5 X 10 5 4.5 X 10 5 4.5 X 10 5 4.5 X 10 5 4.5 X 10 5 4.5 X 10 5 4.5 X 10 5 2 h 1.5 X 10 7 3 X 10 3 1 X 10 3 4.5 X 10 3 3.5 X 10 3 6.5 X 10 3 2.5 X 10 3 6 h 2.5 X 10 8 1 X 10 3 3 X 10 2 1 X 10 5 4 X 10 5 2 X 10 5 3.5 X 10 4 24 h 1 X 10 9 1 X 10 9 4 X 10 8 1 X 10 9 1 X 10 9 1 X 10 9 7.5 X 10 8 Πίνακας 34: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ 151 με MIC 8 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 5x10 5 cfu/ml με ιμιπενέμη, μεροπενέμη, ερταπενέμη. A 32 A 64 G 16 G 32 0 h 4.5 X 10 5 4.5 X 10 5 4.5 X 10 5 4.5 X 10 5 2 h 1 X 10 4 2 X 10 3 <10 <10 6 h 6 X 10 2 2 X 10 2 <10 <10 24 h <10 <10 <10 <10 Πίνακας 35: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ 151 με MIC 8 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 5x10 5 cfu/ml με αζτρεονάμη και γενταμικίνη. ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΚP 700 MIC-imp 2 μg/ml C Ι 16 Ι 32 Μ 16 Μ 32 Ε 8 Ε 16 0 h 4 X 10 5 4 X 10 5 4 X 10 5 4 X 10 5 4 X 10 5 4 X 10 5 4 X 10 5 2 h 1 X 10 7 4 X 10 3 1.7 X 10 3 3 X 10 3 1 X 10 3 1.3 X 10 4 5 X 10 3 6 h 3 X 10 8 7 X 10 4 1 X 10 2 4 X 10 4 4 X 10 4 3 X 10 4 1 X 10 3 24 h 1 X 10 9 7 X 10 8 6 X 10 8 1 X 10 9 1 X 10 9 2 X 10 9 7.7 X 10 8 Πίνακας 36: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ 700 με MIC 2 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 5x10 5 cfu/ml με ιμιπενέμη, μεροπενέμη, ερταπενέμη. 86

A 32 A 64 G 16 G 32 0 h 4 X 10 5 4 X 10 5 4 X 10 5 4 X 10 5 2 h 1.3 X 10 7 3 X 10 5 <10 <10 6 h 2.5 X 10 8 1.6 X 10 8 <10 <10 24 h 6.5 X 10 8 6 X 10 8 <10 <10 Πίνακας 37: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ 700 με MIC 2 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 5x10 5 cfu/ml με αζτρεονάμη και γενταμικίνη. ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΚP 2152 MIC-imp 2 μg/ml C Ι 16 Ι 32 Μ 16 Μ 32 Ε 8 Ε 16 0 h 3.5 X 10 5 3.5 X 10 5 3.5 X 10 5 3.5 X 10 5 3.5 X 10 5 3.5 X 10 5 3.5 X 10 5 2 h 8.5 X 10 6 1 X 10 5 1 X 10 2 1.6 X 10 3 1.6 X 10 3 2.4 X 10 3 5 X 10 2 6 h 4 X 10 8 1 X 10 6 <10 2.7 X 10 4 2.3 X 10 4 6.5 X 10 4 5 X 10 2 24 h 8 X 10 8 7 X 10 8 6 X 10 8 7 X 10 8 5.5 X 10 8 6.5 X 10 8 5.7 X 10 8 Πίνακας 38: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ 2152 με MIC 2 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 5x10 5 cfu/ml με ιμιπενέμη, μεροπενέμη, ερταπενέμη. A 32 A 64 G 16 G 32 0 h 2.9 X 10 5 2.9 X 10 5 3.5 X 10 5 3.5 X 10 5 2 h 1 X 10 5 1 X 10 5 1 X 10 2 1 X 10 2 6 h 1 X 10 2 <10 <10 <10 24 h <10 <10 <10 <10 Πίνακας 39: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ 2152 με MIC 2 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 5x10 5 cfu/ml με αζτρεονάμη και γενταμικίνη. 87

Η σχηματική αναπαράσταση των αποτελεσμάτων παρουσιάζεται στις παρακάτω γραφικές παραστάσεις των ζώντων μικροογανισμών (cfu/ml) σε συνάρτηση με το χρόνο (h) Διάγραμμα 15: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ ΕΥ-1 με MIC 0.125 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 5x10 5 cfu/ml με ιμιπενέμη, μεροπενέμη, ερταπενέμη, αζτρεονάμη και γενταμικίνη. Διάγραμμα 16: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ 6/100 με MIC 2 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 5x10 5 cfu/ml με ιμιπενέμη, μεροπενέμη, ερταπενέμη, αζτρεονάμη και γενταμικίνη. 88

Διάγραμμα 17: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚP SEC2 με MIC 4 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 5x10 5 cfu/ml με ιμιπενέμη, μεροπενέμη, ερταπενέμη, αζτρεονάμη και γενταμικίνη. Διάγραμμα 18: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ SEC4 με MIC 32 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 5x10 5 cfu/ml με ιμιπενέμη, μεροπενέμη, ερταπενέμη, αζτρεονάμη και γενταμικίνη. 89

Διάγραμμα 19: Κινητική θανατώσεως του στελέχους KP SEC3 με MIC 64 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 5x10 5 cfu/ml με ιμιπενέμη, μεροπενέμη, ερταπενέμη, αζτρεονάμη και γενταμικίνη. Διάγραμμα 20: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ 151 με MIC 8 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 5x10 5 cfu/ml με ιμιπενέμη, μεροπενέμη, ερταπενέμη, αζτρεονάμη και γενταμικίνη. 90

Διάγραμμα 21: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ 700 με MIC 2 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 5x10 5 cfu/ml με ιμιπενέμη, μεροπενέμη, ερταπενέμη, αζτρεονάμη και γενταμικίνη. Διάγραμμα 22: Κινητική θανατώσεως του στελέχους ΚΡ 2152 με MIC 2 μg/ml σε ενοφθάλμισμα 5x10 5 cfu/ml με ιμιπενέμη, μεροπενέμη, ερταπενέμη, αζτρεονάμη και γενταμικίνη. 91