ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ Ανοσολογία Αντίδραση Ag-Ab, ανασυνδυασμός Διδάσκων: Αναπληρωτής Καθηγητής Γεώργιος Θυφρονίτης
Άδειες Χρήσης Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό υπόκειται σε άδειες χρήσης Creative Commons. Για εκπαιδευτικό υλικό, όπως εικόνες, που υπόκειται σε άλλου τύπου άδειας χρήσης, η άδεια χρήσης αναφέρεται ρητώς.
Aντίδραση Αg-Ab Σκοπός του μαθήματος Συγγένεια Ab Συνάφεια Ab Eιδικότητα Ab Ανοσοσυμπλέγματα Αρχές Ανοσοδοκιμασιών
Φυσικοχημικές ιδιότητες της αντίδρασης Ag-Ab Ab Μη ομοιοπολικός δεσμός, πρόσδεση μέσω δεσμών: Υδρογόνου, Δυνάμεων van der Waals Υδροφοβικών δεσμών. Συγγένεια Ab. Ισχύς δεσμού μεταξύ μίας θέσης πρόσδεσης του Ab και ενός επίτοπουτου Ag(Kd).H Kd των αντισωμάτων κυμαίνεται μεταξύ 10-7 και 10-9. Σε δευτερογενή απάντηση η Kdμπορεί να φτάσει μέχρι 10-11. Συνάφεια Ab. Εξαρτάται από το σθένος της αντίδρασης και αυτό από τη διαμόρφωση του Ag και τον ισότυποτου Ab. Λόγω της πολυσθενικότηταςτης αντίδρασης Ag-Ab δημιουργούνται ανοσοσυμπλέγματαστη ζώνη ισορροπίας που πυροδοτούν φλεγμονώδεις αντιδράσεις.
Συγγένεια/Συνάφεια Συνάφεια = Το άθροισμα της ισχύος πρόσδεσης μεταξύ ενός Αg με πολλούς Ag καθοριστές και ένα πολυσθενές αντίσωμα. K eq = 10 4 Συγγένεια 10 6 Συνάφεια 10 10 Συνάφεια
Συγγένεια Η ισχύς της αντίδρασης μεταξύ ενός αντιγονικού καθοριστή και μίας θέσης δέσμευσης του αντισώματος. Υψηλή συγγένεια Χαμηλή συγγένεια Ab Ab Ag Ag Συγγένεια= δυνάµεων έλκυσης και απώθησης
Ειδικότητα Η ιδιότητα ενός αντισώματος να αντιδρά με ένα μόνο αντιγονικό καθοριστή. Διασταυρούμενη αντιδραστικότητα (Cross reactivity). H ιδιότητα ενός Ab να αντιδρά με περισσότερους από 1 αντιγονικoύς καθοριστές. Cross reactions Anti-A Ab Anti-A Ab Anti-A Ab Ag A Ag B Κοινός επίτοπος Ag C Παρόμοιος επίτοπος
Δοκιμασίες Ανοσοσυγκόλλησης Δοκιμασίες που έχουν σαν τελικό σημείοτην συγκόλληση σωματιδιακού Ag. Ποσοτικές δοκιμασίες Ag ή Ab. +
Παθητική Ανοσοσυγκόλληση Δοκιμασίες ανοσοσυγκόλλησης που γίνονται με διαλυτό Ag που επικαλύπτει σωματίδια + Εφαρμογές Μέτρηση αντισώματος έναντι Ag
Δημιουργία ανοσοσυμπλεγμάτων Περίσσεια Ab Περίσσεια Ag Ζώνη ισορροπίας
οκιµασίες Ανοσοσυγκόλλησης Δοκιμασία ποσοτικής ανοσοσυγκόλλησης Τίτλος Patient 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Pos. Neg. Titer 1 64 2 8 3 512 4 5 6 7 8 <2 32 128 32 4
IgG1 protects against renal disease in a mouse model of cryoglobulinaemia 0 0 MO N T H 2 0 1 4 VO L 0 0 0 N AT U R E 1 Immunoglobulins protect against disease to a considerable extent by activating complement and stimulatory immunoglobulin crystallizable fragment receptors (Ig FcRs), and aggregating microbial pathogens1,2. Yet IgG1, the predominant murine serum Ig isotype, cannot activate complement by the classical pathway, binds more avidly to an inhibitory than to stimulatory FcRs, and has limited ability to aggregate pathogens1 3. In these regards, it resembles human IgG4 (ref. 4).We hypothesized that limited ability to activate effector mechanisms might protect against immune complex immunopathology. Here we show that IgG1-deficient (c12) mice5, immunized with a potent antigen, develop lethal renal disease soon after they begin to produce antigen-specific antibody, whereas similarly immunized wild type mice remain healthy. Surprisingly, renal disease in this model is complement and FcR independent and results from immune complex precipitation in glomerular capillaries, as in some cryoglobulinaemic humans6. IgG3,which self-associates to form large immune complexes7,8, accounts for more than 97% of the mouse Ig in this cryoglobulin;
Μέθοδος Ab σε γέλη Δοκιμασίες κατακρήμνησης Ag σε φρεάτιο Ερμηνεία Η διάμετρος του δακτυλίου είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του Ag. Ποσοτική Επίπεδα Ig (ανοσοσυγκόλληση) Diameter 2 Ab in gel Ag Ag Ag Ag Concentration Ag
Σωματικός Ανασυνδιασμός Σκοπός του μαθήματος Ανασυνδιασμός των γονιδιακών τμημάτων v, d, j αναγκαία συνθήκη για την ποικιλομορφία των Ab Μηχανισμοί ανασυνδιασμού Συνδυαστική ποικιλομορφία Συνδετική ποικιλομορφία
Οργάνωση του γονιδιακούτόπου των Ig Η βαριά αλυσίδα (Η) και οι δύο ελαφριές (κ & λ) αλυσίδες κωδικοποιούνται από 3-4 διαφορετικούς γονιδιακούς τόπους. Ο κάθε τόπος στην βλαστική του διαμόρφωση αποτελείται από τουλάχιστον 3 διαφορετικού τύπου γονιδιακά τμήματα, V, J & C. H βαριά αλυσίδα περιλαμβάνει και το D τμήμα. Στο 5 άκρο του κάθε γονιδιακού τόπου βρίσκονται τα V γονίδια και προς το 3 ακολουθούν τα J, D καιc γονίδια. Ο αριθμός των V, D, J και Cγονιδίων διαφέρει σε κάθε γονιδιακό τόπο και σε κάθε είδος ζώου.
Οργάνωση του γονιδιακούτόπου των Ag υποδοχέων
Ανασυνδιασμόςκαι έκφραση των γονιδίων των Ig http://www.youtube.com/watch?v=aximmnbyqtm
Αντιστοιχία γoνιδιακώντμημάτων και πρωτεϊνικών περιοχών της βαριάς αλυσίδας των Ig. Domains of Igand TCR proteins.the domains of Igheavy and light chains are shown in A, and the domains of TCR α and β chains are shown in B. The relationships between the Igand TCR gene segments and the domain structure of the antigen receptor polypeptide chains are indicated. The V and C regions of each polypeptide are encoded by different gene segments. The locations of intrachainand interchaindisulfide bonds (S-S) are approximate. Areas in the dashed boxes are the hypervariable(complementarity-determining) regions. In the Igμ chain and the TCR α and β chains, transmembrane(tm) and cytoplasmic(cyt) domains are encoded by separate exons.
Aνασυνδιασμόςτης βαριάς και ελαφριάς αλυσίδας.
Ποικιλότητα των Ag υποδοχέων
Ανασυνδιασμόςτου μεταβλητού τμήματος των Ig Η βλαστικού τύπου διαμόρφωση του Ig γονιδιακού τόπου έχει την ίδια διαμόρφωση σε όλα τα κύτταρα του οργανισμού εκτός των ώριμων Β κυτ. Κατά την διάρκεια της ωρίμανσης των Β κυττάρων το μη κωδικοποιούν DNA που βρίσκεται μεταξύ των V-D, D-Jαπαλείφεται με ανασυνδυασμό του DNAέτσι ώστε τα V, D, Jτμήματα διαμορφώνουν το VDJγονίδιο που κωδικοποιεί το μεταβλητό τμήμα της κάθε αλυσίδας. Το Cτμήμα παραμένει στην αρχική του διαμόρφωση δηλ. ξεχωριστά από το VDJ γονίδιο. Το RNA μετάγραφο αποτελείται από τη VDJτη Cκαι τις μεταξύ τους αλληλουχίες που απομακρύνονται κατά την ωρίμανση του αρχικού μετάγραφου σε mrna. Παρόμοιοι μηχανισμοί λειτουργούν και για την δημιουργία του γονιδίου που κωδικοποιεί το μεταβλητό τμήμα των αλυσίδων του TCR. http://www.youtube.com/watch?v=ipobkvbcdi4&feature=endscreen&nr=1
Μεθοδολογία ανίχνευσης ανασυνδυασμού. Antigen receptor gene rearrangements. Southern blot analysis of DNA from nonlymphoid cells and from two monoclonal populations of B lymphocyte lineage origin (e.g., B cell tumors) is shown in schematic fashion. The DNA is digested with a restriction enzyme, different-sized fragments are separated by electrophoresis, and the fragments are blotted onto a filter. The sites at which the restriction enzyme cleaves the DNA are indicated by arrows. The size of the fragments containing the J segment of the Ig κ light chain gene is determined by use of a radioactive probe that specifically binds to J segment DNA. In the hypothetical example shown, the size of the J segment containing DNA fragments from each of two B cells is smaller than that from non-b cell DNA. This indicates that the specific sites where the restriction enzyme cuts the DNA are in a different position in the genome of the B cells compared with the non-b cells. Thus, a rearrangement of the germline DNA sequenceintheigκlocushasoccurredinthebcells.notethat the fragment from the rearranged DNA may be larger or smaller than the fragment from the germline DNA, depending on the location of the sites where the restriction enzyme cuts the DNA. http://www.youtube.com/watch?v=ipobkvbcdi4&feature=endscreen&nr=1
Μηχανισμοί ανασυνδυασμού. Ο ανασυνδιασμός των V, D, J γονιδίων διαμεσολαβείται από την συντονισμένη δράση ενζύμων εκ των οποίων κάποια εκφράζονται μόνο σε ανώριμα λεμφοκύτταρα (Rag-1, Rag-2, TdT). Υπάρχουν ειδικές αλληλουχίες νουκλεoτιδίων (αλληλουχίες σήμανσης ανασυνδυασμού, recombination signal sequences) στο3 των V,5 και 3 των D και 5 των J γονιδίων που αναγνωρίζονται από ειδικά ένζυμα τις ρεκομπινάσες. Οι ρεκομπινάσες RAG-1και RAG-2που εκφράζονται μόνο στα Β/Τ κύτ αναγνωρίζουν τις ειδικές αλληλουχίες, προκαλούν θραύση του DNA και ακολουθεί συρραφή των σπασμένων άκρων του DNA από λιγάσες και απαλοιφή των ενδιάμεσων αλληλουχιών.
Μηχανισμοί ανασυνδιασμού. Ένζυμα που απαντώνται και σε άλλα κύτταρα εκτός των λεμφοκυττάρων συμμετέχουν στην επιδιόρθωση του DNA. Ku70, Ku80 DNA εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση (DNA-PK) Άρτεμις Το ένζυμο τελική δεοξυριβονουκλεοτιδική τρανσφεράση (TdT)συμμετέχει στην δημιουργία της τελικής ν.ο. αλληλουχίας. Το ένζυμο αυτό είναι ειδικό της λεμφικής σειράς.
Μηχανισμός Ανασυνδυασμού
Μηχανισμός Ανασυνδυασμού
Αύξηση της ποικιλομορφίας: προσθήκη Ν και Ρ νουκλεοτιδίων
Ποικιλομορφία Ag υποδοχέων Συνδιαστική ποικιλοµορφία (combinatorial diversity). Είναι αποτέλεσμα των διαφόρων συνδιασμώντων V, D, J γονιδίων και κατά συνέπεια ο αριθμός τους είναι πεπερασμένος. Επειδή δεν λαμβάνουν χώρα με την ίδια συχνότητα όλοι οι δυνατοί συνδυασμοί VDJ, ο πραγματικός αριθμός τους είναι μικρότερος από τον μαθηματικά αναμενόμενο. Συνδετική ποικιλοµορφία (Joinctional diversity). Ενδονουκλεάσεςμπορούν να αφαιρέσουν νουκλεοτίδια κατά την συρραφή του DNA. H RAG κόβει ασύμμετρα το DNA.Κατά την σύνδεση των ασύμμετρων άκρων προστίθενται νουκλεοτίδια(ρ νουκλεοτίδια). Επιπλέον μηχανισμός δημιουργίας ποικιλομορφίας είναι η τυχαία προσθήκη νουκλεοτιδίων, Nνουκλεοτίδια, (μέχρι και 20) στα σημεία συρραφής του DNA από το ένζυμο τελική δεοξυριβονουκλεοτιδική τρανσφεράση(tdt). ΚΟ ποντίκια για RAG, DNA-PK, TdT.
Ποικιλομορφία Ag υποδοχέων
Τέλος Ενότητας
Χρηματοδότηση Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό έχει αναπτυχθεί στα πλαίσια του εκπαιδευτικού έργου του διδάσκοντα. Το έργο «Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων» έχει χρηματοδοτήσει μόνο τη αναδιαμόρφωση του εκπαιδευτικού υλικού. Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούς πόρους.
Σημειώματα
Σημείωμα Ιστορικού Εκδόσεων Έργου Το παρόν έργο αποτελεί την έκδοση 1.0. Έχουν προηγηθεί οι κάτωθι εκδόσεις: Έκδοση 1.0 διαθέσιμη εδώ. http://ecourse.uoi.gr/course/view.php?id=1174.
Σημείωμα Αναφοράς Copyright Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων, Διδάσκων: Αναπληρωτής Καθηγητής Γεώργιος Θυφρονίτης. «Ανοσολογία. Αντίδραση Ag-Ab, ανασυνδυασμός». Έκδοση: 1.0. Ιωάννινα 2014. Διαθέσιμο από τη δικτυακή διεύθυνση: http://ecourse.uoi.gr/course/view.php?id=1174.
Σημείωμα Αδειοδότησης Το παρόν υλικό διατίθεται με τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Αναφορά Δημιουργού - Παρόμοια Διανομή, Διεθνής Έκδοση 4.0 [1] ή μεταγενέστερη. [1] https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/.