ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΜΙΚΡΟΡΕΥΣΤΟΝΙΚΩΝ ΙΑΤΑΞΕΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΝΙΣΧΥΣΗ DNA ΜΕΣΩ ΥΠΟΛΟΓΙΣΤΙΚΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ

ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΜΙΚΡΟΡΕΥΣΤΟΝΙΚΩΝ ΙΑΤΑΞΕΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΝΙΣΧΥΣΗ DNA ΜΕΣΩ ΥΠΟΛΟΓΙΣΤΙΚΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Β. Ε. Παπαδόπουλος, Ι. Ν. Κεφαλά, Γ. Κόκκορης και Α. Τσερέπη Ινστιτούτο Νανοεπιστήµης και Νανοτεχνολογίας, ΕΚΕΦΕ ηµόκριτος, 15310 Αγία Παρασκευή ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (Polymerase chain reaction, PCR) χρησιµοποιείται για την ενίσχυση δειγµάτων δεσοξυριβονουκλεϊκού οξέος (DNA). ύο τύποι µικροδιατάξεων που υλοποιούν την PCR, µια συνεχούς ροής (ΣΡ) και µια στατικού θαλάµου (ΣΘ), µε προδιαγραφές που προέρχονται από την τεχνολογία εύκαµπτων τυπωµένων κυκλωµάτων (flexible printed circuit technology, FPC), συγκρίνονται µέσω υπολογιστικής µελέτης. Η υπολογιστική µελέτη πραγµατοποιείται µε λεπτοµερές τριδιάστατο µαθηµατικό πρότυπο (µοντέλο) το οποίο συνδυάζει εξισώσεις συνέχειας, διατήρησης ορµής, διατήρησης της µάζας των συστατικών, µεταφοράς θερµότητας, παραγωγής θερµότητας µέσω του φαινοµένου Joule καθώς και ένα µοντέλο ελεγκτή θερµοκρασίας που υλοποιεί το πρωτόκολλο θερµοκρασίας για την PCR. Η σύγκριση γίνεται υπό τις ίδιες συνθήκες: Ίδια στοίβα υλικών, δηλαδή εύκαµπτα λεπτά πολυµερικά υµένια µε ενσωµατωµένα στρώµατα χαλκού για την ολοκλήρωση των αντιστάσεων θέρµανσης, ίδιος όγκος του δείγµατος και ίδιο πρωτόκολλο PCR. Η απόδοση ποσοτικοποιείται σύµφωνα µε την ενίσχυση (πολλαπλασιασµό) του DNA, την κατανάλωση ενέργειας και το συνολικό χρόνο λειτουργίας. Οι υπολογισµοί δείχνουν ότι η αποτελεσµατικότητα σε ενίσχυση του DΝΑ είναι σχεδόν η ίδια και στις δύο διατάξεις. Ωστόσο, η διάταξη ΣΘ απαιτεί (2-4 φορές) χαµηλότερη κατανάλωση ενέργειας. Σχετικά µε την ταχύτητα, ο συνολικός χρόνος που απαιτείται στη διάταξη ΣΘ είναι λίγο µεγαλύτερος από εκείνον της διάταξης ΣΡ. Τόσο η χαµηλή κατανάλωση ενέργειας, όσο και η εγγενής ευελιξία για υλοποίηση διαφορετικών πρωτοκόλλων για την PCR υποδεικνύουν µια ελκυστική δυνατότητα για χρήση διατάξεων ΣΘ που κατασκευάζονται σε εύκαµπτα λεπτά υποστρώµατα µε ολοκληρωµένες αντιστάσεις θέρµανσης. 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (Polymerase chain reaction, PCR) [1] µπορεί να δηµιουργήσει αντίγραφα τµηµάτων του δεσοξυριβονουκλεϊκού οξέος (DNA) υποβάλλοντάς το σε µια διαδικασία θερµικών κύκλων. Μία τυπική PCR περιλαµβάνει την αποδιάταξη (denaturation) του δίκλωνου DNA στους 95 o C, την πρόσδεση (annealing) των εκκινητών στους 55 o C και την επιµήκυνση (extension) των αλληλουχιών συνδεδεµένων εκκινητών στους 72 o C. Κάθε θερµικός κύκλος µπορεί να διπλασιάσει την ποσότητα του DNA και εντός 20-35 κύκλων µπορεί να παραχθούν εκατοµµύρια αντίγραφα του DNA. Η εξέλιξη της µικροτεχνολογίας επέτρεψε την αντικατάσταση των συµβατικών διατάξεων υλοποίησης της PCR από µικροδιατάξεις. Αυτές µπορούν να ενσωµατωθούν σε µικροεργαστήρια σε ψηφίδα (Lab-On-Chip) και µειώνουν το χρόνο για την ολοκλήρωση της αντίδρασης, το κόστος κατασκευής και λειτουργίας, καθώς και το απαιτούµενο µέγεθος δείγµατος. Οι βασικές κατηγορίες µικροδιατάξεων για PCR είναι αυτές της συνεχούς ροής (ΣΡ, continuous flow) και οι µικροδιατάξεις στατικού θαλάµου (ΣΘ, static chamber). Η λειτουργία των µικροδιατάξεων ΣΘ οµοιάζει µε αυτή των συµβατικών εργαστηριακών θερµοκυκλοποιητών (thermocyclers) όπου το δείγµα DNA είναι στατικό σε ένα θάλαµο και υποβάλλεται στο θερµικό κύκλο του πρωτοκόλλου της PCR [2, 3]. Οι πρώτες µικροδιατάξεις ΣΡ που εµφανίστηκαν ήταν σταθερού βρόγχου [4, 5] όπου το δείγµα µετακινείται µεταξύ σταθερών θερµοκρασιακών ζωνών ώστε να επιτευχθεί η απαραίτητη θερµική ανακύκλωση. Ο δεύτερος τύπος µικροδιατάξεων ΣΡ είναι αυτός του κλειστού βρόγχου [6], όπου το δείγµα ανακυκλοφορεί µεταξύ θερµοκρασιακών ζωνών. Ένα µειονέκτηµα των πρώτων µικροδιατάξεων ΣΘ σε σχέση µε τις µικροδιατάξεις ΣΡ ήταν ο υψηλότερος χρόνος για την ολοκλήρωση των θερµικών κύκλων της PCR και η υψηλότερη κατανάλωση ενέργειας: Στις µικροδιατάξεις ΣΘ και το δείγµα του DNA αλλά και η ίδια η διάταξη υποβάλλονται σε θερµικό κύκλο. Λόγω θερµικής αδράνειας οι θερµικοί κύκλοι διαρκούσαν περισσότερο στις µικροδιατάξεις ΣΘ και οδηγούσαν σε µεγαλύτερη κατανάλωση ενέργειας [7, 8]. Ωστόσο, η χρήση εύκαµπτων πολυµερικών υµενίων για την κατασκευή µικροδιατάξεων για PCR [5] και η εξέλιξη των θερµικών στοιχείων από εξωτερικά σε ολοκληρωµένα, και τα δύο αποτέλεσµα της µεταφοράς της τεχνολογίας εύκαµπτων τυπωµένων κυκλωµάτων (flexible printed circuit technology [5, 9]) στην κατασκευή τους, επιτρέπει τη µείωση της θερµικής µάζας των µικροδιατάξεων ΣΘ και µπορεί να αυξήσει τους ρυθµούς θέρµανσης/ψύξης [10]. Τόσο η λεπτοµερής σύγκριση µεταξύ διατάξεων ΣΘ και ΣΡ, όσο και η αξιολόγηση της νέας, στην κατασκευή µικρορευστονικών διατάξεων, τεχνολογίας εύκαµπτων τυπωµένων κυκλωµάτων είναι θέµατα που δεν έχουν µελετηθεί στη βιβλιογραφία. Σκοπός της εργασίας είναι η λεπτοµερής και άµεση σύγκριση µικροδιατάξεων (οι οποίες στο εξής θα καλούνται απλά διατάξεις) ΣΡ και ΣΘ µε προδιαγραφές από την τεχνολογία εύκαµπτων τυπωµένων κυκλωµάτων σε όρους κατανάλωσης ενέργειας, διάρκειας λειτουργίας και ενίσχυσης του DNA, µέσω υπολογιστικής µελέτης. Η υπολογιστική µελέτη πραγµατοποιείται µε λεπτοµερές τριδιάστατο (3δ) µαθηµατικό πρότυπο (µοντέλο) και για τις δύο διατάξεις, το οποίο συνδυάζει εξισώσεις συνέχειας, διατήρησης ορµής, διατήρησης της µάζας των συστατικών, µεταφοράς θερµότητας, παραγωγής θερµότητας µέσω του φαινοµένου

Joule καθώς και ενός µοντέλου ελεγκτή θερµοκρασίας (ρεύµατος) που υλοποιεί το πρωτόκολλο θερµοκρασίας για την PCR (στη διάταξη ΣΘ). Αν και στη βιβλιογραφία υπάρχουν εργασίες µε µοντέλα διαφορετικής διαστατικότητας και προσοµοίωση διατάξεων ΣΘ [2, 3, 11] ή ΣΡ [1, 5, 12-14], κανένα δεν είναι τόσο λεπτοµερές όσο αυτό που χρησιµοποιείται στην παρούσα εργασία. Το υπόλοιπο της εργασίας είναι διαρθρωµένο ως εξής: Στην ενότητα 2 παρουσιάζονται οι γεωµετρίες των διατάξεων µpcr. Η ενότητα 3 περιλαµβάνει το µαθηµατικό πρότυπο. Στην ενότητα 4 συζητούνται τα αποτελέσµατα της προσοµοίωσης για τις διατάξεις ΣΡ και ΣΘ. Η τελευταία ενότητα συνοψίζει τα συµπεράσµατα. 2 ΙΑΤΑΞΕΙΣ ΣΥΝΕΧΟΥΣ ΡΟΗΣ ΚΑΙ ΣΤΑΤΙΚΟΥ ΘΑΛΑΜΟΥ ΣΕ ΕΥΚΑΜΠΤΑ ΠΟΛΥΜΕΡΙΚΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ Η γεωµετρία της διάταξης ΣΡ παρουσιάζεται στο Σχήµα 1α: Ειδικότερα παρουσιάζεται ένα τµήµα της διάταξης όπου λαµβάνουν χώρα 10 θερµικοί κύκλοι. Το βάθος του µικροκαναλιού σχήµατος µαιάνδρου είναι 50 µm και το πλάτος του είναι 200 µm στην ζώνη αποδιάταξης και πρόσδεσης εκκινητών, ενώ είναι 400 µm στη ζώνη επιµήκυνσης. Σχήµα 1. (α) 10 µοναδιαίες κυψελίδες (10 θερµικοί κύκλοι) της διάταξης ΣΡ. (β) Η διάταξη ΣΘ που περιέχει τον ίδιο όγκο ρευστού µε τις 10 κυψελίδες της διάταξης ΣΡ. Οι µοναδιαίες κυψελίδες των διατάξεων (γ) ΣΡ και (δ) ΣΘ που χρησιµοποιήθηκαν στην προσοµοίωση. Όλες οι διαστάσεις είναι σε mm. (ε) ιατοµή των διατάξεων, όπου φαίνεται η στοίβα των υλικών (διαστάσεις σε µm). Η γεωµετρία της διάταξης ΣΘ παρουσιάζεται στο Σχήµα 1β. Ένας θάλαµος βρίσκεται πάνω από τις θερµικές αντιστάσεις. Το υγρό παραµένει στατικό στο θάλαµο και οι θερµικές αντιστάσεις, οι οποίες ελέγχονται από ελεγκτή, παρέχουν το επιθυµητό προφίλ θερµοκρασίας συναρτήσει του χρόνου, εφαρµόζοντας το επιθυµητό πρωτόκολλο PCR. Η στοίβα των υλικών και για τις δυο διατάξεις παρουσιάζεται στο Σχήµα 1ε και βασίζεται σε επιχαλκωµένο υπόστρωµα πολυϊµιδίου (polyimide, PI) [5]. Τα µικροκανάλια έχουν δηµιουργηθεί πάνω στο στρώµα PI και οι µαιανδρικού σχήµατος θερµικές αντιστάσεις στο λεπτό (~20 µm) στρώµα χαλκού. Το στρώµα σφράγισης αποτελείται από ένα ευαίσθητο στην πίεση συγκολλητικό στρώµα σιλικόνης (50 µm) προσκολληµένο σε στρώµα (50 µm) πολυαιθυλενίου (polyethylene, ΡΕ). 3 ΜΑΘΗΜΑΤΙΚΟ ΜΟΝΤΕΛΟ Οι υπολογισµοί εκτελούνται στη µοναδιαία κυψελίδα των διατάξεων. Στη µοναδιαία κυψελίδα της διάταξης ΣΡ (Σχήµα 1γ), λαµβάνει χώρα ένας θερµικός κύκλος, ενώ στη µοναδιαία κυψελίδα της διάταξης ΣΘ (Σχήµα 1δ), είναι υπό µελέτη µια λωρίδα του συνόλου της γεωµετρίας, περιλαµβάνοντας µια στροφή της θερµικής αντίστασης.

3.1 ΟΙ ΕΞΙΣΩΣΕΙΣ ΤΟΥ ΜΟΝΤΕΛΟΥ ΓΙΑ ΤΙΣ ΙΑΤΑΞΕΙΣ µpcr Το µοντέλο που χρησιµοποιήθηκε για την προσοµοίωση της διάταξης ΣΡ αποτελείται από την εξίσωση συνέχειας και την εξίσωση διατήρησης της ορµής ρ + ( ρu ) = 0 t (1) u T 2 ρ + ρ ( u ) u= pi+ µ ( + ( ) ) µ ( ) I + ρg t u u u 3 (2) όπου u, ρ, µ, και p είναι το διάνυσµα της ταχύτητας, η πυκνότητα, το δυναµικό ιξώδες, και η πίεση του ρευστού, αντίστοιχα. Το g είναι η επιτάχυνση της βαρύτητας. Περιλαµβάνει επίσης την εξίσωση διατήρησης µάζας των συστατικών, Ci + ( Di Ci) + u Ci = R (3) i t όπου D i, C i και R i είναι ο συντελεστής διάχυσης, η συγκέντρωση και ο ρυθµός παραγωγής του συστατικού i, π.χ. το δίκλωνο DNA ή οι εκκινητές. Ο ρυθµός παραγωγής καθορίζεται από την κινητική της αντίδρασης (βλ. Ενότητα 3.4). Το µοντέλο ολοκληρώνεται από την εξίσωση µεταφοράς θερµότητας στα στερεά στρώµατα και στο ρευστό T ρc + p ρ C pu T = ( k T) + Q (4) t όπου T, k, και C p είναι η θερµοκρασία, η θερµική αγωγιµότητα και η θερµοχωρητικότητα των επιπέδων ή του ρευστού. Η ταχύτητα u στην Εξ. (4) είναι µηδέν για όλα τα χωρία, εκτός του ρευστού. Το Q είναι ο ρυθµός παραγωγής θερµότητας στο θερµικό στοιχείο (αντίσταση) (i=1,2,3 και s). Οι δείκτες 1, 2, και 3 αντιστοιχούν στις τρεις θερµικές αντιστάσεις της διάταξης ΣΡ: διαφορετικός ρυθµός παραγωγής θερµότητας απαιτείται σε κάθε θερµικό στοιχείο για να επιτευχθεί η επιθυµητή θερµοκρασία (95 o C, 55 o C ή 72 o C) σε κάθε ζώνη. Ο δείκτης s αντιστοιχεί στη θερµική αντίσταση της διάταξης ΣΘ. Η θερµότητα που παράγεται από τις θερµικές αντιστάσεις προέρχεται από τη ροή ρεύµατος και οι ρυθµοί παραγωγής θερµότητας προέρχονται από το φαινόµενο θέρµανσης Joule, δηλαδή Q = J E (5) όπου J και E είναι η πυκνότητα του ρεύµατος και το ηλεκτρικό πεδίο στη θερµική αντίσταση : Συνδέονται µε την εξίσωση J =σe (6) και υπολογίζονται από την εξίσωση διατήρησης ρεύµατος, J = 0 (7) το σ είναι η ηλεκτρική αγωγιµότητα της θερµικής αντίστασης: Όλες οι θερµικές αντιστάσεις προέρχονται από χαλκό, εποµένως ο δείκτης αφαιρείται. Κατά τη διάρκεια της λειτουργίας των διατάξεων ΣΘ όλες οι µεταβλητές (π.χ. η θερµοκρασία, οι συγκεντρώσεις και τα ρεύµατα) µεταβάλλονται µε το χρόνο, ενώ για τη διάταξη ΣΡ παραµένουν σταθερές. Εποµένως, οι Εξ. (3-7) λύνονται σε µόνιµη κατάσταση για τη διάταξη ΣΡ και σε µεταβατική κατάσταση για τη διάταξη ΣΘ. Η αριθµητική επίλυση γίνεται µε τη µέθοδο των πεπερασµένων στοιχείων και υλοποιείται µε τον εµπορικό κώδικα COMSOL (COMSOL ΑΒ, Σουηδία). 3.2 ΣΥΝΟΡΙΑΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΚΑΙ Ι ΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΥΛΙΚΩΝ Θεωρούνται συνθήκες µη ολίσθησης για την ταχύτητα και µηδενική παράγωγος για τη συγκέντρωση στα τοιχώµατα των µικροκαναλιών. Θεωρούνται πλήρως ανεπτυγµένα παραβολικά προφίλ στην είσοδο των

µικροκαναλιών, ενώ στην έξοδο τους θεωρούνται µηδενικές παράγωγοι για την ταχύτητα και τη συγκέντρωση κατά τη διεύθυνση της ροής. Σε όλες τις εξωτερικές επιφάνειες των µοναδιαίων κυψελίδων θεωρείται διάδοση και µεταφορά θερµότητας µέσω ακτινοβολίας. Επειδή οι υπολογισµοί πραγµατοποιούνται σε µία µοναδιαία κυψελίδα, εφαρµόζονται περιοδικές συνθήκες στα αντίστοιχα σύνορα. Στη µοναδιαία κυψελίδα της διάταξης ΣΡ λαµβάνει χώρα µόνο ένας θερµικός κύκλος: Συνεπώς, προκειµένου να υπολογιστούν οι συγκεντρώσεις των συστατικών στον 2ο, 3ο, κ.λπ. κύκλο, εφαρµόζονται τα προφίλ συγκέντρωσης της εξόδου του κύκλου v στην είσοδο του κύκλου ν+1. Αναφορικά µε το µοντέλο θέρµανσης Joule, εφαρµόζεται οµοιόµορφη πυκνότητα ρεύµατος στην «είσοδο» του θερµικού στοιχείου, ενώ η «έξοδος» είναι γειωµένη. Οι πυκνότητες ρεύµατος στην «είσοδο» των θερµικών στοιχείων στη διάταξη ΣΡ ορίζονται τέτοιες ώστε οι µέσες θερµοκρασίες στις ζώνες PCR να είναι ίσες µε τις προκαθορισµένες θερµοκρασίες του πρωτοκόλλου της PCR (95 o C, 55 o C και 72 o C). Η πυκνότητα ρεύµατος στην «είσοδο» της θερµικής αντίστασης στη διάταξη ΣΘ προέρχεται από έναν ελεγκτή (ρεύµατος) θερµοκρασίας ο οποίος περιγράφεται στην ενότητα 3.3. Ηλεκτρική µόνωση εφαρµόζεται σε όλα τα σύνορα των θερµικών αντιστάσεων. Η πυκνότητα και το δυναµικό ιξώδες του δείγµατος DNA θεωρούνται ίσα µε εκείνα του νερού. Και τα δυο είναι συνάρτηση της θερµοκρασίας και προέρχονται από τη βάση δεδοµένων του COSMOL. Η τιµή του συντελεστή µεταφοράς θερµότητας θεωρείται ίση µε 5 και 10 W / (m 2 K). Η θερµοχωρητικότητα, η πυκνότητα, η θερµική αγωγιµότητα και ο συντελεστής θερµικής εκποµπής επιφάνειας των υλικών στη στοίβα φαίνονται στον Πίνακα 1. Πίνακας 1 Ιδιότητες των υλικών. Η θερµοκρασία είναι σε K. Υλικό Θερµοχωρητικότητα Πυκνότητα Συντελεστής θερµικής [J/(kgK)] (kg/m 3 ) αγωγιµότητας [W/(mK)] Χαλκός 358+0.09623384*T 8960 401 0.03 Kapton 1090 1420 0.1200 0.78 PDMS 1430 983 0.1511 0.96 PE 2400 950 0.4450 0.92 Συντελεστής θερµικής εκποµπής της επιφάνειας Οι ιδιότητες του στρώµατος ΡΙ (Σχήµα 1ε) είναι εκείνες του εµπορικού Kapton. Για τις ιδιότητες του ευαίσθητου στην πίεση συγκολλητικού σιλικόνης θεωρούνται αυτές της πολυδιµεθυλοσιλοξάνης (PDMS). Η ηλεκτρική αγωγιµότητα του χαλκού, δηλαδή του υλικού των θερµικών αντιστάσεων, προέρχεται από τον τύπο σ= ρ 1 [ 1 + α( T T )] 0 0, (8) όπου ρ 0 (1.68 10-8 Ωm) είναι η ειδική αντίσταση σε θερµοκρασία ίση µε T 0 (293.15 K) και a είναι ο θερµικός συντελεστής αντίστασης της αντίστασης (0.00386 K -1 ) [15]. Η θερµοχωρητικότητα και η θερµική αγωγιµότητα του νερού είναι συναρτήσεις της θερµοκρασίας και προέρχονται από τη βάση δεδοµένων του COSMOL. 3.3 ΤΟ ΡΕΥΜΑ ΣΤΙΣ ΘΕΡΜΙΚΕΣ ΑΝΤΙΣΤΑΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΗ ΙΑΤΑΞΗ ΣΘ: ΑΝΑ ΡΑΣΗ ΕΛΕΓΧΟΥ ΤΗΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ Ένα τυπικό ηλεκτρονικό κύκλωµα που χρησιµοποιείται για τον έλεγχο της θερµοκρασίας είναι ο αναλογικόςολοκληρωτικός-παραγωγικός ελεγκτής ρεύµατος (Proportional-Integral-Derivative, PID) [16]. Το λογικό διάγραµµα που αναπαριστά τη λειτουργία του φαίνεται στο Σχήµα 2. Η είσοδος του κυκλώµατος είναι η επιθυµητή θερµοκρασία του ρευστού (δείγµα PCR). Ο ελεγκτής θερµοκρασίας PID πραγµατοποιεί την αφαίρεση της επιθυµητής θερµοκρασίας και της τρέχουσας µέσης τιµής της θερµοκρασίας του ρευστού, εξάγοντας το σφάλµα. Το σφάλµα αυτό, το ολοκλήρωµα του, και η παράγωγός του πολλαπλασιάζονται µε έναν αναλογικό (K p), ολοκληρωτικό (K I), και παραγωγικό (K D) συντελεστή. Το άθροισµα αυτών των πολλαπλασιασµών καθορίζει την είσοδο ρεύµατος στη διάταξη ΣΘ, γνωστό και ως σύστηµα στα συστήµατα αυτοµατισµού. Αυτή η διαδικασία επαναλαµβάνεται µε µια προκαθορισµένη περίοδο δειγµατοληψίας, µέχρι να σταθεροποιηθεί το ρεύµα στην είσοδο του συστήµατος. Στην παρούσα εργασία, το σύστηµα είναι το µοντέλο που έχει περιγραφεί στις ενότητες 3.1 και 3.2, και η λειτουργία του ελεγκτή θερµοκρασίας πραγµατοποιείται από την εξίσωση t d J( t) = K e( t) + K e( t) dτ + K e( t) (9) dt P I D 0

όπου το J είναι η οµοιόµορφη πυκνότητα ρεύµατος που εφαρµόζεται στην «είσοδο» των θερµικών στοιχείων. Τα K P, K I και K D υπολογίζονται µε µια διαδικασία επαναλαµβανόµενων δοκιµών (manual tuning) ώστε να επιτευχθούν οι βέλτιστες τιµές που οδηγούν σε γρήγορο και ακριβές αυτόµατο έλεγχο του συστήµατος. Σχήµα 2. Λογικό διάγραµµα ελεγκτή θερµοκρασία PID, συνδεδεµένο µε ένα σύστηµα δηλαδή τη διάταξη ΣΘ Για τη λειτουργία του ελεγκτή αναπτύσσεται κώδικας Matlab. Οι υπολογισµοί αυτοί επαναλαµβάνονται µε περίοδο δειγµατοληψίας 100 ms µέχρι η θερµοκρασία του ρευστού να φτάσει τα προκαθορισµένα επίπεδα θερµοκρασίας του πρωτόκολλου της PCR. H σύζευξη του ελεγκτή θερµοκρασίας µε το µοντέλο της διάταξης γίνεται µόνο για την διάταξη ΣΘ: Στη διάταξη ΣΡ τα τρία θερµικά στοιχεία φτάνουν στις επιθυµητές θερµοκρασίες µόνο µια φορά. 3.4 ΧΗΜΙΚΗ ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΤΗΣ PCR Η κινητική των αντιδράσεων που χρησιµοποιείται στην εργασία αυτή περιγράφεται λεπτοµερώς στην εργασία του Hunicke-Smith [17]. + k 1 2 1 2 { A S + P S P + kd k A S P S S Denaturation S1S2 S1+ S2, Annealing, Extension + kd ka S PS 2+ P1 PS 1 2 ka ke 1 2 1 2 ke 1 2 S1S2 Πίνακας 2. Αρχικές συγκεντρώσεις και συντελεστές διάχυσης των συστατικών του µίγµατος PCR [14]. Είδη S 1 & S 2 P 1 & P 2 S 1P 2 & P 1S 2 S 1S 2 Αρχική συγκέντρωση [mol/m 3 ] 0 3 10-7 0 5.71 10-12 Συντελεστής διάχυσης [m 2 /s] 10-10 10-9 10-10 10-10 Tο S 1S 2 αναπαριστά το δίκλωνο του DNA (dsdna), το S 1 και S 2 τα µονόκλωνα του, τα P 1 και P 2 τους ευθείς και αντίστροφους εκκινητές, και τα S 1P 2 και P 1S 2 το σύµπλεγµα εκκινητή-µονόκλωνου DNA. Ο Πίνακας 2 περιέχει τους συντελεστές διάχυσης όλων των συστατικών [14]. Οι σταθερές ρυθµού των αντιδράσεων προέρχονται από τις εργασίες του Hunicke-Smith [17] και Wang et al. [14]. 4 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Για µια αντικειµενική σύγκριση όσον αφορά την κατανάλωση ενέργειας, τον απαιτούµενο χρόνο και την αποτελεσµατικότητα της ενίσχυσης του DNA, οι υπολογισµοί εκτελούνται κάτω από τις ακόλουθες προϋποθέσεις: α) Η ίδια στοίβα υλικών θεωρείται και για τις δύο διατάξεις (Σχήµα 1ε). β) Τα δείγµατα PCR που πρόκειται να ενισχυθούν έχουν τον ίδιο όγκο, 5.3 µl, και τις ίδιες αρχικές συγκεντρώσεις (Πίνακας 2). γ) Η ίδια κινητική, τα ίδια πρωτόκολλα PCR και ο ίδιος αριθµός κύκλων θεωρούνται και για τις δύο διατάξεις. Για να επιταχυνθούν οι υπολογισµοί, οι συγκρίσεις γίνονται για 10 θερµικούς κύκλους, το οποίο είναι αρκετό για την εξαγωγή ασφαλών συµπερασµάτων. Ο χρόνος που απαιτείται για κάθε διάταξη περιλαµβάνει όχι µόνο το χρόνο για την ενίσχυση ενός δείγµατος DNA όγκου 5.3 µl, αλλά επίσης και το χρόνο που απαιτείται για την άντληση του δείγµατος προς και από τις διατάξεις. Η ενέργεια που απαιτείται για την άντληση δεν λαµβάνεται υπόψη. Ούτε ο χρόνος ούτε η ενέργεια που απαιτείται για την προθέρµανση και την τελική επιµήκυνση του µίγµατος της PCR λαµβάνονται υπόψη. Τέλος, τόσο στη µελέτη της διάταξης ΣΡ όσο και της ΣΘ, θεωρούνται δύο τιµές για το συντελεστή µεταφοράς θερµότητας, 5 και 10 W/(m 2 K), προκειµένου να ελεγχθεί η ευαισθησία των υπολογισµών στις απώλειες θερµότητας προς το περιβάλλον. 4.1 ΙΑΤΑΞΗ ΣΥΝΕΧΟΥΣ ΡΟΗΣ Η µοναδιαία κυψελίδα της διάταξης ΣΡ, που παρουσιάζεται στο Σχήµα 1γ, περιέχει όγκο ρευστού 0.53 µl, έτσι, 10 θερµικοί κύκλοι αντιστοιχούν σε συνολικό όγκο ρευστού 5.3 µl. Για µια λύση ανεξάρτητη του πλέγµατος, για την ταχύτητα, την πίεση και τη θερµοκρασία [Εξ. (1-2), και (4-9)], απαιτούνται σχεδόν 1 εκατοµµύριο στοιχεία, ενώ απαιτούνται περίπου 280 χιλιάδες στοιχεία για τις εξισώσεις διατήρησης µάζας των συστατικών [Εξ. (3)]. Στο Σχήµα 3 φαίνονται τα αποτελέσµατα των υπολογισµών όταν η µέση ταχύτητα του ρευστού στην είσοδο είναι 3 mm/s. Για αυτή την ταχύτητα στην είσοδο, το πρωτόκολλο της PCR είναι 3s:4.2s:6.2s (χρόνος στη ζώνη

αποδιάταξης, πρόσδεσης εκκινητών και επιµήκυνσης, αντίστοιχα). Η θερµοκρασία στο µέσο ύψος του µικροκαναλιού φαίνεται στο Σχήµα 3α. Παρατηρείται αµελητέα θερµική επιρροή µεταξύ των ζωνών και οµοιοµορφία της θερµοκρασίας σε κάθε ζώνη. Η συγκέντρωση του dsdna στο µέσο ύψος του µικροκαναλιού φαίνεται στο Σχήµα 3β. Είναι προφανές ότι όταν το µίγµα της PCR εισέρχεται στην ζώνη αποδιάταξης, η συγκέντρωση του dsdna µειώνεται, ενώ αυξάνει στη ζώνη επιµήκυνσης. Η ενίσχυση του DNA φαίνεται στο Σχήµα 3γ. Ορίζεται ως ο λόγος του µέσου όρου της συγκέντρωσης dsdna στην έξοδο ενός θερµικού κύκλου προς την αρχική συγκέντρωση dsdna. Η ενίσχυση DNA βρέθηκε να είναι περίπου 2 9.33 =645 [h=5w/(m 2 K)], ενώ η ιδανική είναι 2 10. Η ενίσχυση του DNA σύµφωνα µε ένα απλό µοντέλο [17] ακολουθεί τον κανόνα (1+λ) n, όπου n είναι ο αριθµός των κύκλων και λ είναι η απόδοση της PCR, µε 0<λ<1. Σύµφωνα µε αυτή τη θεώρηση, το λ υπολογίζεται 0.909. Η απαιτούµενη διάρκεια για την ενίσχυση ενός δείγµατος 5.3 µl σε διάταξη 10 κύκλων είναι ίση περίπου µε 353 s. Η τιµή αυτή προέρχεται από τον πολλαπλασιασµό του χρόνου που απαιτείται για 1 κύκλο [0.53 µl / (παροχή = 1.8µl / min)] επί 20 (10 2 κύκλους, ο επιπλέον πολλαπλασιασµός µε 2 λαµβάνει υπόψη το χρόνο που απαιτείται για να έχει ολοκληρωθεί η ενίσχυση όλου του όγκου των 5.3 µl). Η συνολική κατανάλωση ενέργειας για 10 κύκλους είναι το άθροισµα των ρυθµών παραγωγής θερµότητας στις θερµικές αντιστάσεις πολλαπλασιασµένων µε το συνολικό χρόνο που απαιτείται και υπολογίζεται περίπου 253 J. Οι ίδιοι υπολογισµοί εκτελούνται α) για αυξηµένη ταχύτητα εισόδου (5 mm/s) προκειµένου να παρατηρηθεί η επίδραση της µειωµένης οµοιοµορφίας θερµοκρασίας στην απόδοση της διάταξης σε διαφορετικό πρωτόκολλο (1.8s:2.5S:3.7s) και β) για αυξηµένο συντελεστή µεταφοράς θερµότητας, h, ίσο µε 10 W / (m 2 K). Τα αποτελέσµατα παρουσιάζονται στα συγκριτικά της ενότητας 4.3. Σχήµα 3. (α) Η θερµοκρασία ρευστού/στερεού (K) και (β) η συγκέντρωση dsdna (10-12 mol/m 3 ) στο µέσο ύψος του µικροκαναλιού µιας µοναδιαίας κυψελίδας: Τα αποτελέσµατα για τη συγκέντρωση του dsdna αναφέρονται στο δεύτερο θερµικό κύκλο. (γ) Ο λογάριθµος της ενίσχυσης του DNA, log 2(<[dsDNA]>/[dsDNA] 0) σε σχέση µε τον αριθµό των θερµικών κύκλων. Το <[dsdna]> είναι η µέση συγκέντρωση dsdna στην έξοδο του θερµικού κύκλου [ταχύτητα εισόδου 3 mm/s, h=5 W/(m 2 K)]. 4.2 ΙΑΤΑΞΗ ΣΤΑΤΙΚΟΥ ΘΑΛΑΜΟΥ Η µοναδιαία κυψελίδα της διάταξης ΣΘ (Σχήµα 1δ), έχει όγκο ρευστού 0.6 µl και εποµένως 8.83 µοναδιαίες κυψελίδες είναι απαραίτητες για συνολικό όγκο ρευστού 5.3 µl, ίδιο µε αυτό της διάταξης ΣΡ 10 θερµικών κύκλων. Μια λύση ανεξάρτητη από το πλέγµα της γεωµετρίας διάταξης ΣΘ απαιτεί σχεδόν 10 χιλιάδες στοιχεία. Το Σχήµα 4α δείχνει τη µέση θερµοκρασία του µίγµατος PCR και τη διακύµανση της µέσης συγκέντρωσης dsdna σε σχέση µε το χρόνο για τρεις θερµικούς κύκλους. Η συγκέντρωση του dsdna µεγιστοποιείται κατά τη διάρκεια της επιµήκυνσης και ελαχιστοποιείται κατά τη διάρκεια της αποδιάταξης. Οι µεταβάσεις από τη µία ζώνη στην άλλη δεν είναι απότοµες και οδηγούνται από την καµπύλη ρεύµατος, προερχόµενη από τον ελεγκτή θερµοκρασίας (Σχήµα 4β). Η κατανάλωση ισχύος ακολουθεί την καµπύλη ρεύµατος, όπως αναµενόταν. Η κατανάλωση ενέργειας υπολογίζεται από την ολοκλήρωση της καµπύλης ισχύος στο χρόνο: Για 10 κύκλους, υπολογίζεται περίπου 69 J [3s:4.2s:6.2s, h = 5 W / (m 2 K)]. Σχήµα 4. (α) Θερµοκρασία ρευστού και συγκέντρωση dsdna. (β) Ρεύµα για 3 κύκλους PCR στη διάταξη ΣΘ. Για t=0 το ρεύµα είναι 2.2 A [3s:4.2s:6.2s, h=5 W/(m 2 K)]. (γ) Λογάριθµος της ενίσχυσης DNA

[log 2(<[dsDNA]>/[dsDNA] 0)] στο τέλος κάθε κύκλου PCR [3s:4.2s:6.2s, h=5 W/(m 2 K)]. To <[dsdna]> είναι η µέση συγκέντρωση dsdna στο τέλος κάθε θερµικού κύκλου. Ο συνολικός χρόνος που απαιτείται για την ενίσχυση του DNA και την ανάκτηση του τελικού προϊόντος DΝΑ βρέθηκε να είναι περίπου 463 s συν το χρόνο που απαιτείται για την άντληση του δείγµατος DNA εντός και εκτός του θαλάµου: Ο τελευταίος όρος είναι δύο φορές ο λόγος του συνολικού όγκου των 5.3 µl µε την παροχή που χρησιµοποιείται για την άντληση. Εάν ληφθεί υπόψη µια ρεαλιστική παροχή, δηλαδή 5 µl / min, ο συνολικός χρόνος είναι περίπου 590 s. Το Σχήµα 4γ δείχνει την ενίσχυση του DNA στο τέλος κάθε θερµικού κύκλου. Η ενίσχυση του DNA µετά από 10 κύκλους είναι περίπου 2 9.36 = 657. Ως εκ τούτου, η απόδοση της αντίδρασης PCR, λ, είναι 0.913. Οι ίδιοι υπολογισµοί εκτελούνται α) για διαφορετικό πρωτόκολλο (1.8s:2.5S:3.7s) και β) για αυξηµένο συντελεστή µεταφοράς θερµότητας, h, ίσο µε 10 W/(m 2 K) και τα αποτελέσµατα παρουσιάζονται στα συγκριτικά της ενότητας 4.3. 4.3 ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΤΩΝ ΙΑΤΑΞΕΩΝ ΜPCR ΣΡ ΚΑΙ ΣΘ Τα αποτελέσµατα της σύγκρισης των διατάξεων ΣΡ και ΣΘ απεικονίζονται στο Σχήµα 5 για δύο διαφορετικά πρωτόκολλα PCR και δύο διαφορετικούς ρυθµούς απώλειας θερµότητας στο περιβάλλον που αντιστοιχούν σε h ίσο µε 5 και 10 W/(m 2 K). Παρατηρείται ότι ο βαθµός της ενίσχυσης του DNA για το πρώτο πρωτόκολλο (3s:4.2s:6.2s) είναι σχεδόν ο ίδιος και για τις δύο διατάξεις (Σχήµα 5α.). Παρ' όλα αυτά, για το ταχύτερο πρωτόκολλο (1.8s:2.5s:3.7s), η διαφορά στην ενίσχυση του DNA µεταξύ των δύο διατάξεων είναι υψηλή: Για τη διάταξη ΣΡ, δεδοµένης της χειρότερης οµοιοµορφίας θερµοκρασίας σε σχέση µε αυτή της διάταξης ΣΘ, η ενίσχυση είναι 2 8.23 = 300, ενώ για τη διάταξη ΣΘ είναι 2 8.77 = 436: Ωστόσο, πρέπει να σηµειωθεί ότι το ταχύτερο πρωτόκολλο µειώνει την αποτελεσµατικότητα της ενίσχυσης και για τις δύο διατάξεις λόγω του µειωµένου συνολικού χρόνου αντίδρασης. Ακόµη και χωρίς να ληφθεί υπόψη ο συνολικός χρόνος που απαιτείται για την άντληση του δείγµατος DNA µέσα και έξω από τη διάταξη ΣΘ, ο χρόνος που απαιτείται για τη διάταξη ΣΡ είναι µικρότερος από εκείνο της διάταξης ΣΘ λόγω του µεγαλύτερου χρόνου καθυστερήσεων που απαιτείται για τη µετάβαση από τη µία θερµοκρασία στην άλλη (Σχήµα 5β). Η υστέρηση αυτή ενισχύεται από το χαµηλό φυσικό ρυθµό απώλειας θερµότητας κατά τη µετάβαση από τη θερµοκρασία αποδιάταξης (95 ο C) σε αυτή της επιµήκυνσης (55 o C). Τέλος, η κατανάλωση ενέργειας της διάταξης ΣΘ είναι σηµαντικά χαµηλότερη, από 2 έως 4 φορές, σε σύγκριση µε την διάταξη ΣΡ για όλες τις περιπτώσεις που µελετήθηκαν (Σχήµα 5γ). Αυτό µπορεί να αποδοθεί στις µικρότερες απώλειες θερµότητας προς το περιβάλλον για τη διάταξη ΣΡ: Η περιοχή σε επαφή µε τον περιβάλλοντα χώρο είναι σχεδόν 4.5 φορές µεγαλύτερη για της διάταξη ΣΡ σε σύγκριση µε τη διάταξη ΣΘ. Η συνεχής απώλεια θερµότητας κατά τη διάρκεια της λειτουργίας της διάταξης ΣΡ υπερβαίνει την ενέργεια που απαιτείται για τη θερµική ανακύκλωση ολόκληρης της διάταξης ΣΘ (υπόστρωµα και µίγµα της PCR). Σχήµα 5. (α) Ενίσχυση DNA, (β) διάρκεια λειτουργίας και (γ) κατανάλωση ενέργειας για 10 κύκλους για διαφορετικά πρωτόκολλα (3s:4.2s:6.2s ή 1.8s:2.5s:3.7s), συντελεστές µεταφοράς θερµότητας [h=5 ή 10 W/(m 2 K)] και τύπους διάταξης (ΣΡ ή ΣΘ). Λόγω του πολύ λεπτού υποστρώµατος (50 µm), η διάταξη ΣΘ έχει µικρή θερµική µάζα και η απόσταση µεταξύ των ολοκληρωµένων θερµικών αντιστάσεων και του δείγµατος DNA είναι µικρή: Tόσο η µικρή θερµική µάζα όσο και η µικρή απόσταση επιτρέπουν τη γρήγορη θερµική ισορροπία στη διάταξη ΣΘ σε σύγκριση µε διατάξεις που πραγµατοποιούνται σε παχύτερα υποστρώµατα. Όσο το πάχος υποστρώµατος αυξάνεται, η κατανάλωση ενέργειας αυξάνεται για τις δύο διατάξεις. Ωστόσο, η αύξηση είναι πιο έντονη για τη διάταξη ΣΘ. Υπολογίστηκε ότι για πάχος υποστρώµατος 1000 µm, η κατανάλωση ενέργειας για τη διάταξη ΣΘ υπερβαίνει εκείνη της διάταξης ΣΡ. Καθώς αυξάνεται το πάχος του υποστρώµατος, η αύξηση της κατανάλωσης ενέργειας για τις διατάξεις ΣΡ οφείλεται στην αναπόφευκτη αύξηση της θερµοκρασίας στις ολοκληρωµένες θερµικές αντιστάσεις έτσι ώστε να επιτευχθεί η επιθυµητή θερµοκρασία στο δείγµα του DNA. Στις διατάξεις ΣΘ, καθώς αυξάνεται το πάχος του υποστρώµατος, η απόκριση του συστήµατος είναι βραδύτερη. Έτσι, ο χρόνος που απαιτείται για ένα θερµικό κύκλο, άρα και η κατανάλωση ενέργειας, αυξάνεται. Στις διατάξεις ΣΡ απαιτείται σταθερή κατανάλωση ρεύµατος έτσι ώστε να διατηρηθούν οι επιθυµητές θερµοκρασίες (95 o C, 72 o C και 55 o C)

σε κάθε ζώνη σε όλη τη διάρκεια της PCR. 5 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ύο διατάξεις υλοποίησης της PCR, µία διάταξη στατικού θαλάµου και µια διάταξη συνεχούς ροής, που κατασκευάζονται σε εύκαµπτα λεπτά υποστρώµατα µε ολοκληρωµένες θερµικές αντιστάσεις αξιολογούνται µέσω υπολογιστικής µελέτης. Τα κριτήρια αξιολόγησης είναι η κατανάλωση ενέργειας, η απόδοση της ενίσχυσης του DNA και ο συνολικός χρόνος για την PCR. Το µαθηµατικό πρότυπο συνδυάζει εξισώσεις συνέχειας, διατήρησης ορµής, διατήρησης µάζας των συστατικών, µεταφοράς θερµότητας, παραγωγής θερµότητας µέσω του φαινοµένου Joule καθώς και µοντέλου ελεγκτή θερµοκρασίας που υλοποιεί το πρωτόκολλο θερµοκρασίας για την PCR. Μελετήθηκε η ενίσχυση δείγµατος DNA 5.3 µl σύµφωνα µε δύο πρωτόκολλα (3s:4.2s:6.2s και 1.8s:2.5s:3.7s) για 10 κύκλους. Οι προδιαγραφές σχετικά µε τη στοίβα των υλικών είναι ίδιες και για τις δύο διατάξεις και προέρχονται από την τεχνολογία των εύκαµπτων τυπωµένων κυκλωµάτων που χρησιµοποιούνται για την κατασκευή των διατάξεων. Οι υπολογισµοί δείχνουν ότι οι διατάξεις στατικού θαλάµου που κατασκευάζονται πάνω σε εύκαµπτα λεπτά υποστρώµατα µε ολοκληρωµένες θερµικές αντιστάσεις µπορεί να είναι προτιµότερες σε σχέση µε τις αντίστοιχες διατάξεις συνεχούς ροής. Η υπεροχή τους αφορά κυρίως την κατανάλωση ενέργειας και οφείλεται στη χρήση εύκαµπτων λεπτών πολυµερικών υποστρωµάτων µε ολοκληρωµένες θερµικές αντιστάσεις: Η µικρότερη θερµική µάζα και η µικρότερη απόσταση των θερµικών αντιστάσεων από το δείγµα του DNA επιτρέπει γρήγορους ρυθµούς θέρµανσης του δείγµατος σε σύγκριση µε τις συµβατικές διατάξεις θερµοκυκλοποιητών και τις διατάξεις επί παχύτερων υποστρωµάτων. Η χαµηλή ενεργειακή κατανάλωση µαζί µε την ευελιξία υλοποίησης διαφορετικών πρωτοκόλλων PCR συνιστούν ελκυστικές προοπτικές για τις διατάξεις στατικού θαλάµου επί λεπτών υποστρωµάτων µε ολοκληρωµένες θερµικές αντιστάσεις. ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η εργασία αυτή υποστηρίζεται εν µέρει από το πρόγραµµα της ΕΕ (FP7-ICT-2011.3.2) LOVE-FOOD: Love wave fully integrated Lab-on-Chip platform for food pathogen detection (Grant agreement no: 317742) και το έργο GSRT SYNERGASIA Converging Lamb wave sensors with microtechnologies towards an integrated Lab-on-chip for clinical diagnostics-lambsense. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1]. Kumar S., Thorsen T., and Das S. K., Proc. Conf. ASME 2008, Heat Transfer Summer Conference collocated with the Fluids Engineering, Energy Sustainability, and 3rd Energy Nanotechnology Conferences, Jacksonville, Florida, USA (2008), p.323. [2]. Ibrahim O., Jones B., Hassab M., and Op de Beeck M., Numer Heat Tr A - Appl. 65:1069 (2014). [3]. Shen K., Chen X., Guo M., and Cheng J., Sensor Actuat B - Chem. 105:251 (2005). [4]. Kopp M. U., Mello A. J. d., and Manz A., Science. 280:1046 (1998). [5]. Moschou D., Vourdas N., Kokkoris G., Papadakis G., Parthenios J., Chatzandroulis S., et al., Sensor Actuat B - Chem. 199:470 (2014). [6]. Lok K. S., Lee P. P. F., Kwok Y. C., and Nguyen N. T., Microchim Acta. 177:111 (2012). [7]. Zhang Y. and Ozdemir P., Anal. Chim. Acta. 638:115 (2009). [8]. Becker H., Hlawatsch N., Klemm R., Moche C., Hansen-Hagge T., and Gartner C., Proc. Conf. Microfluidics, BioMEMS, and Medical Microsystems XII, San Francisco, California, United States (2014), p.89760z [9]. Papadopoulos V. E., Kefala I. N., Kaprou G., Kokkoris G., Moschou D., Papadakis G., et al., Microelectron Eng. 124:42 (2014). [10]. Ahmad F. and Hashsham S. A., Anal Chim Acta. 733:1 (2012). [11]. Amasia M., Kang S.-W., Baneree D., and Madou M., Biomicrofluidics. 7:014106 (2013). [12]. Chen P.-C., Fan W., Hoo T.-K., Chan L. C. Z., and Wang Z., Chem Eng Res Des. 90:591 (2012). [13]. Cao Q., Kim M.-C., and Klapperich C., Biotechnol. J. 6:177 (2011). [14]. Wang Y., Pant K., Grover J., and Sundaram S., Nanotech. 3:456 (2007). [15]. Perry R. H., Green D. W., and Maloney J. O., "Perry's chemical engineer's handbook on CD-ROM": McGraw-Hill, 1999 [16]. Jeng J. C., Tseng W. L., and Chiu M. S., Chem Eng Res Des. 92:545 (2014). [17]. Hunicke-Smith S. P., "PCR and cycle sequencing reactions: a new device and engineering model," Stanford University, 1997.