Αντιγόνα & Ανοσοσφαιρίνες Ε. Παρασκευά Αναπλ. Καθηγήτρια Κυτταρικής Φυσιολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Παν. Θεσσαλίας 12.10.2015
Ανοσολογικά χαρακτηριστικά των αντιγόνων I Τα αντιγόνα είναι ουσίες ικανές να επάγουν ειδική ανοσιακή απάντηση (ανοσογόνα) ü Ανοσογονικότητα (immunogenicity) ικανότητα επαγωγής ανοσιακής απάντησης (χυμικής και/ή κυτταρικής) όταν εισέρχονται στον οργανισμό Η ανοσογονικότητα εξαρτάται από Ø το ίδιο το αντιγόνο Ø τις βιολογικές συνθήκες του συστήματος Ιδιότητα του «ξένου» Mοριακό βάρος Χημική δομή Δυνατότητα αποδόμησης από τα ένζυμα των μακροφάγων Γενετικοί παράγοντες Η δόση & η οδός χορήγησης 1
Ανοσολογικά χαρακτηριστικά των αντιγόνων II ü Αντιγονικότητα (anngenicity) ικανότητα ειδικής σύνδεσης με τα τελικά προϊόντα της ανοσιακής απάντησης, ανεξάρτητα από ανοσογονικότητα Μόρια του ανοσιακού συστήματος που χρησιμοποιούνται για την ειδική αναγνώριση αντιγόνων: v Ανοσοσφαιρίνες v Μόρια του MHC v Υποδοχείς των Τ λεμφοκυττάρων (TcR) ü Αλλεργιογονικότητα (allerogenicity) ικανότητα επαγωγής αλλεργικών αντιδράσεων ü Ικανότητα επαγωγής ανοσιακής ανοχής (toloerogenicity) ιδιότητα των αντιγόνων να καταστέλλουν την ειδική ανοσιακή απάντηση 2
Αντιγονικός καθοριστής (anngenic determinant) ή επίτοπος Η περιοχή του μορίου του αντιγόνου που συνδέεται με αντισώματα ή υποδοχείς στην επιφάνεια των λεμφοκυττάρων Διαφορετικοί επίτοποι Όμοιοι επίτοποι Πολυσθενές αντιγόνο Οι επίτοποι που αναγνωρίζονται από τα Β- λεμφοκύτταρα -αμινοξέα της επιφάνειας πρωτεϊνών -απαρτίζονται από συνεχόμενα και μη συνεχόμενα αμινοξέα της πρωτεϊνικής αλληλουχίας -είναι δυνατό να σχηματιστούν μετά από φωσφορυλλίωση ή πρωτεόλυση --ορισμένοι επίτοποι επιτυγχάνουν να είναι ανοσογονικοί κάποιοι επίτοποι ενός αντιγόνου επάγουν ισχυρότερη ανοσιακή απόκριση από τους υπόλοιπους του ίδιου μορίου: ανοσοεπικρατικοί (immunodominant) 3
Ανοσοσφαιρίνες Μόρια του ανοσιακού συστήματος που χρησιμοποιούνται για την ειδική αναγνώριση αντιγόνων: v Ανοσοσφαιρίνες v Μόρια του MHC v Υποδοχείς των Τ λεμφοκυττάρων (TcR) 4
Οι ανοσοσφαιρίνες αναγνωρίζουν μεγάλο εύρος αντιγονικών δομών διακρίνουν διαφορετικά αντιγόνα συνδέονται με τα αντιγόνα με μεγάλη ισχύ Ø Παράγονται από τα Β λεμφοκύτταρα Ø Μεμβρανικές και διαλυτές πρωτεΐνες Ø Εντοπίζονται ü στην κυτταροπλασματική μεμβράνη & σε συνδεόμενα με αυτή οργανίδια ü στο πλάσμα & στο διάμεσο υγρό των ιστών ü στην επιφάνεια ανοσοδραστικών κυττάρων που έχουν υποδοχείς για αυτές ü σε ορισμένες εκκρίσεις 5
Η μοριακή δομή των ανοσοσφαιρινών Κοινή δομική μονάδα 2 ελαφρές αλυσίδες (light chains, L) 2 βαριές αλυσίδες (heavy chains, H) H 2 L 2 Δύο όμοιες θέσεις σύνδεσης αντιγόνου Ισότυποι αλυσίδων L: κ, λ H: γ, α, μ, δ, ε Ισότυποι ανοσοσφαιρινών: IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) IgA (IgA1, IgA2) IgM IgD IgE ιδιότητες αντισωμάτων κάθε τάξης 6
Οι αλυσίδες των ανοσοσφαιρινών αποτελούνται από επαναλαμβανόμενα τμήματα Ομόλογα τμήματα μήκους 100-110 aa (πεδία) Μεταβλητή περιοχή-v (αμινοτελικά πεδία): ποικιλομορφία στην πρωτοταγή αμινοξική αλληλουχία Σταθερές περιοχές- C όμοια αμινοξική αλληλουχία για κάθε ισότυπο μία στις L τρεις (C H 1-3) στις γ, α, δ H αλυσίδες τέσσσερις (C H 1-4) στις μ,ε H αλυσίδες IgG Περιοχή μεταστροφής: σύνδεση V με C- περιοχές Αρθρωτή περιοχή: εύκαμπτη περιοχή μεταξύ των πεδίων C H 1 και C H 2 7
Υπερμεταβλητές Περιοχές Τρεις μικρότερες περιοχές 10aa στην μεταβλητή περιοχή Θέση σύνδεσης του αντιγόνου Η ακριβής αμινοξική αλληλουχία των έξι υπερμεταβλητών περιοχών είναι ο κυριότερος από τους παράγοντες που καθορίζουν την ειδικότητα των αντισωμάτων για συγκεκριμένα αντιγόνα 8
9
Πολυμερή Ανοσοσφαιρινών IgM IgA 10
Λειτουργικά τμήματα ανοσοσφαιρινών Κατά την πρωτεολυτική διάσπαση της IgG προκύπτουν: Fab τμήμα: διατηρεί την ικανότητα σύνδεσης με το αντιγόνο Fc τμήμα: μεσολαβεί τις περισσότερες από τις ανοσοδραστικές λειτουργίες υπεύθυνο για τις ιδιότητες αντισωμάτων κάθε τάξης 11
Η σύνδεση αντισώματος-αντιγόνου Α. μπορεί να προκαλέσει ü συγκόλληση ü καθίζηση ü εξουδετέρωση ü λύση (άμεση επίδραση) εξουδετερωτικά αντισώματα Βιολογική δράση των Αντισωμάτων ή Β. εκδηλώνεται μέσω της κινητοποίησης άλλων ανοσοδραστικών συστημάτων ειδικά για κάθε τάξη και υποτάξη των ανοσοσφαιρινών υπεύθυνα είναι τα Fc-τμήματα των αντισωμάτων (ενεργοποίηση της κλασικής οδού του συμπληρώματος, αλληλεπίδραση με μεμβρανικούς Fc- υποδοχείς) 12
Οι κυριότερες λειτουργίες των πέντε τάξεων ανοσοσφαιρινών IgM IgG IgA IgΕ Η πρώτη ανοσοσφαιρίνη που παράγεται κατά την πρωτογενή ανοσιακή απάντηση Έχει μικρή χημική συγγένεια, αλλά μεγάλη συνάφεια με τα πολυσθενή αντιγόνα Ενεργοποιεί την κλασική οδό του συμπληρώματος Η κύρια ανοσοσφαιρίνη του ορού Η μόνη που διέρχεται τον πλακούντα Ενεργοποιεί την κλασική οδό του συμπληρώματος Η κύρια ανοσοσφαιρίνη των εκκρίσεων Κινητοποιεί φλεγμονώδεις αντιδράσεις, μέσω ειδικών υποδοχέων των σιτευτικών κυττάρων και των βασεόφιλων. Ενεργοποιεί ανοσοδραστικούς μηχανισμούς έναντι των εντερικών παρασίτων IgD Ασαφής ρόλος, μεμβρανικός υποδοχέας για την αναγνώριση αντιγόνου από τα Β κύτταρα 13
IgG Οι IgG μέσω της πρόσδεσης στους υποδοχείς τους Fc γ R ü μεσολαβούν στη φαγοκυττάρωση ανοσοσυμπλεγμάτων και οψονινοποιημένων με IgG σωματίων. ü διευκολύνουν την προσκόλληση των αντιγονικών σωματών στη μεμβράνη των φαγοκυττάρων 14
IgΕ Τα σιτευτικά κύτταρα και τα βασεόφιλα εκφράζουν υψηλής συγγένειας Fc ε RI Αντίδραση άμεσης υπερευαισθησίας ü Σύνδεση Fc ε RI με IgΕ (απουσία αντιγόνου) ü Συνάθροιση Fc ε RI και IgΕ παρουσία ειδικού αντιγόνου ü Απελευθέρωση μεσολαβητών φλεγμονής (ισταμίνη) από τα αποθηκευτικά κοκκία των σιτευτικών κυττάρων και βασεόφιλων ü Σύνθεση λιπιδικής προέλευσης μεσολαβητών και κυτταροκινών IgE movie 15
Εκκριτική IgΑ Τοπική ανοσία των βλενογόνων: Τα επιθηλιακά κύτταρα των οργάνων που καλύπτονται από βλενογόνους (έντερο, σιελογόνοι αδένες, βρόγχοι ) εκφράζουν FcR για διμερή IgA (Fc α R- εκκριτική πρωτεΐνη) Έκκριση της IgA Σύνδεση Fc α R με τη διμερή IgA στη βασική επιφάνεια των επιθηλιακών κυττάρων Ενδοκύτοση του συμπλόκου Fc α R - IgA Μεταφορά διαμέσου του επιθηλιακού κυττάρου με κυστίδια Απελευθέρωση στον αυλό Προηγείται: διάσπαση του μορίου της εκκριτικής πρωτεϊνης & το εκκριτικό τμήμα της παραμένει συνδεδεμένο με το διμερές IgA που απελευθερώνεται 16
Δράση της εκκριτικής IgA Καθήλωση των αντιγόνων στο βλεννογόνο και αποδόμηση από πρωτεάσες πριν εισέλθουν στα επιθηλιακά κύτταρα Ανοσιακός αποκλεισμός ( αποκλεισμός αντιγόνων από τη συστηματική κυκλοφορία και πρόληψη βλαπτικών ανοσιακών μηχανισμών) Η IgA συντίθεται σχεδόν αποκλειστικά από πλασματοκύτταρα στα οζίδια των βλεννογόνων Η εκκριτική πρωτεΐνη συντίθεται στα επιθηλιακά κύτταρα ανεξάρτητα από την παρουσία IgA Η περίσσεια της εκκριτικής πρωτεΐνης εκκρίνεται με τη μορφή ελεύθερων μορίων 17
Νεογνική ανοσία Η ανάπτυξη του ανοσιακού συστήματος του νεογνού είναι ατελής Το μητρικό γάλα παρέχει στο νεογνό χυμικούς και κυτταρικούς παράγοντες Εκατοστιαίο ποσοστό συγκέντρωσης ενηλίκου Γέννηση Μητρική IgG Ηλικία (µήνες) IgA: παράγεται από Β-κύτταρα που μεταναστεύουν στο μαστό η έκκριση μεσολαβείται από την εκκριτική πρωτεΐνη των επιθηλιακών κυττάρων του αδένα μεταφέρεται στο έντερο του νεογνού δρα μέσω ανοσιακού αποκλεισμού IgG: υψηλά επίπεδα μητρικών IgG πριν από τη γέννηση πέφτουν μετά τη γέννηση (3 μήνες) παραγωγή από το βρέφος 18
Ετερογένεια των Αντισωμάτων Τουλάχιστον 10 5 ανοσοσφαιρινικά μόρια μοναδικής αντιγονικής ειδικότητας Η τεράστια ετερογένεια των αντισωμάτων είναι αποτέλεσμα: v της μοριακής δομής των ανοσοσφαιρινών v της δομής των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών v της ικανότητας των Β-λεμφοκυττάρων να σχηματίζουν και να τροποποιούν τα γονίδια αυτά αναδιατάσσοντας το χρωμοσωμικό τους DNA The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1987 was awarded to Susumu Tonegawa "for his discovery of the gene1c principle for genera1on of an1body diversity". 19
Μοριακή δομή των ανοσοσφαιρινών Η αντιγονική ειδικότητα των αντισωμάτων καθορίζεται από την αμινοξική αληλλουχία των V περιοχών των H και L αλυσίδων. Ο συνδυασμός των H με τις L αλυσίδες αποτελεί το πρώτο επίπεδο που εξασφαλίζει τον μεγάλο αριθμό θέσεων σύνδεσης του αντιγόνου 20
Τα γονίδια των ελαφρών αλυσίδων κ- αλυσίδες (χρωμόσωμα 2) Μη λεμφικά κύτταρα σταθερό πεδίο: 1 εξόνιο Cκ Μεταβλητό πεδίο: 2 τμήματα μεταβλητό Vκ (περίπου 100) συνδετικό Jκ (5) Στα ενταγμένα κύτταρα της Β-σειράς: -επιλογή και σύντηξη ενός Vκ και ενός Jκ τμήματος Μεταγραφή Συρραφή Μετάφραση λ-αλυσίδες (χρωμόσωμα 22) 6-9 Cλ εξόνια καθένα συνορεύει με ένα Jλ τμήμα 21
Μηχανισμός αναδιάταξης του γονιδίου των κ-αλυσίδων Οι αναδιατάξεις επισυμβαίνουν σε συγκεκριμένες περιοχές (ανασυνδυαστικές αλληλουχίες) Ανάλογα με τον προσανατολισμό των V τμημάτων με τα υπόλοιπα τμήματα -εξάλειψη -αναστροφή Τα υπεύθυνα αναδιατακτικά ένζυμα -υπάρχουν μόνο στα Β και Τ λεμφοκύτταρα, -είναι ενεργά μόνο κατά τα πρώιμα στάδια της διαφοροποίησής τους 22
Τα γονίδια των βαριών αλυσίδων Μία περιοχή στο χρωμόσωμα 14 Οι αλληλουχίες των C περιοχών διατάσσονται σε 1 αντίγραφο καθεμία Επιπλέον : τμήμα ετερογένειας (D H ), 2-3 αμινοξέα 2 αναδιατάξεις Μετά την αναδιάταξη το εξόνιο V/D/J μεταγράφεται μαζί με τα γειτονικά C μ & C δ εξόνια Τα εξόνια των άλλων ισοτύπων των βαριών αλυσίδων δεν μεταγράφονται Συρραφή Μετάφραση IgM ή IgD 23
Ισοτυπική μεταστροφή των βαριών αλυσίδων Για την μεταγραφή των σταθερών τμημάτων γ, ε και α απαιτείται διαφορετική αναδιάταξη: ισοτυπική μεταστροφή Η ισοτυπική μεταστροφή δεν επηρεάζει την αντιγονική ιδιότητα του αντισώματος Μεταβάλλεται η βιολογική δράση Μη αναστρέψιμη διαδικασία Η επιλογή ενός νέου C Η ισότυπου επηρεάζεται από κυτταροκίνες και άλλους παράγοντες που δρουν στα Β-λεμφοκύτταρα 24
Αναδιατάξεις των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών και οντογένεση των Β-κυττάρων Αρχικά στάδια ωρίμανσης των Β-λεμφοκυττάρων Ακολουθούν αυστηρή σειρά ü αναδιάταξη των γονιδίων των βαριών αλυσίδωνταυτόχρονα και στα δύο χρωμοσώματα ü επίτευξη λειτουργικού γονιδίου ü παραγωγή μ αλυσίδων- παραμένουν στο κυτταρόπλασμα ü αναστολή περαιτέρω αναδιατάξεων στα γονίδια των βαρίων αλυσίδων ü αναδιατάξεις των ελαφρών αλυσίδων ü σχηματισμός κ- ή λ- λειτουργικού γονιδίου ü παραγωγή ελαφρών αλυσίδων ü αναστολή αναδιατάξεων ü έκφραση στη μεμβράνη μορίων ανοσοσφαιρίνης (Βκύτταρο) Αλληλικός αποκλεισμός- κλωνικός περιορισμός- ισοτυπική μεταστροφή 25
Σφάλματα στην αναδιάταξη των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών Ανάπτυξη λευχαιμιών και λεμφωμάτων Λέμφωμα Burki μετάθεση του πρωτο-ογκογονιδίου c-myc στον τόπο των βαριών αλυσίδων μετάθεση t(8,14) στα γονίδια των ελαφρών αλυσίδων (2 ή 22) Λεμφοζιδιακό λέμφωμα το πρωτο-ογκογονίδιο bcl-2 μετατίθεται στον τόπο των βαριών αλυσίδων μετάθεση t(14,18) 26
Πολυκλωνικά Αντισώματα Ανοσοποίηση: η παραγωγή ειδικών αντισωμάτων σε πειραματόζωα μετά από ένεση του αντίστοιχου αντιγόνου Ο ορός που περιέχει τα ειδικά αντισώματα σε μεγάλη συγκέντρωση ονομάζεται αντιορός Τα αντιγόνα έχουν περισσότερους από ένα επιτόπους παράγεται ετερογενές μείγμα αντισωμάτων (πολυκλωνικό αντίσωμα) κάθε αντίσωμα στρέφεται εναντίον ενός από τους επιτόπους Διαφορετικά αντιγόνα έχουν κοινούς επιτόπους διασταυρούμενη αντίδραση Πολυκλωνικό αντίσωμα που δημιουργείται έναντι ενός αντιγόνου μπορεί να αντιδρά και με άλλο αντιγόνο που έχει κοινούς επιτόπους 27
Μονοκλωνικά αντισώματα The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1984 was awarded jointly to Niels K. Jerne, Georges J.F. Köhler and César Milstein "for theories concerning the specificity in development and control of the immune system and the discovery of the principle for produc1on of monoclonal an1bodies". 28
Μονοκλωνικά αντισώματα Στη φύση ομοιογενή αντισώματα παράγονται από μυελωματικά κύτταρα Για την παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων χρησιμοποιούνται υβριδώματα: προέρχονται από σύντηξη v ενός Β-κυττάρου που παράγει αντισώματα v ενός κυττάρου από όγκο (μυέλωμα) που πολ/ζεται αέναα σε φυσιολογικό θρεπτικό υλικό δεν πολ/ζεται σε θρεπτικό υλικό επιλογής Επιλογή κλώνου Παρασκευή μεγάλης ποσότητας μονοκλωνικού αντισώματος monoclonal Ab movie.mov Τα τελευταία χρόνια τα μονοκλωνικά αντισώματα είναι δυνατόν να παρασκευαστούν με γενετικές 29 τεχνικές
Χρήση των μονοκλωνικών αντισωμάτων ü Αναγνώριση μεμβρανικών δεικτών ü Ανοσοδιάγνωση ü Διάγνωση & θεραπεία όγκων ü Θεραπεία άλλων ασθενειών ü Λειτουργική ανάλυση των μεμβρανικών μορίων και των μορίων που εκκρίνονται από τα κύτταρα 30
-Αντιγόνα & Ανοσοσφαιρίνες Vander Φυσιολογία του Ανθρώπου Κεφ. 20, Μέρος Α: Ανοσολογία Υποδοχείς των Β Λεμφοκυττάρων σελ. 920 "Ganong's Ιατρική Φυσιολογία Κεφ. 3: Ανοσία Λοίμωξη και Φλεγμονή Ανοσοσφαιρίνες σελ. 105-106 Η γενετική βάση της ποικιλομορφίας του ανοσολογικού συστήματος σελ. 106-107 31
http://highered.mheducation.com/olc/dl/120060/ravenanimation.html http://highered.mheducation.com/olc/dl/120110/micro43.swf http://highered.mheducation.com/olc/dl/120110/micro38.swf 32