Αναδρομική μελέτη περιστατικών θρομβοφιλίας και ποσοστά παθολογικών ευρημάτων

ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΔΗΜΟΚΡΑΤΙΑ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΟ ΙΔΡΥΜΑ ΑΘΗΝΑΣ Σχολή Επαγγελμάτων Υγείας και Πρόνοιας Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων Αιμοδοσία - Τμήμα Αιμόστασης ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Αναδρομική μελέτη περιστατικών θρομβοφιλίας και ποσοστά παθολογικών ευρημάτων THESIS Retrospective study of thrombophilic cases and abnormal findings percentages ΟΝΟΜΑ ΦΟΙΤΗΤΡΙΑΣ/NAME OF STUDENT Μπάκα Ιωάννα Ελένη 11057 Ioanna Eleni Savvas Baka ΟΝΟΜΑ ΕΙΣΗΓΗΤΗ κ. ΕΠΙΒΛΕΠΟΝΤΑ/NAME OF SUPERVISOR Παύλου Ευθυμία Pavlou Efthimia ΑΘΗΝΑ/ATHENS

Αναδρομική μελέτη περιστατικών θρομβοφιλίας και ποσοστά παθολογικών ευρημάτων i

1 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ... II 2 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ... 1 3 ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 2 4 ABSTRACT... 4 5 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... 6 5.1 ΑΙΜΟΣΤΑΣΗ... 6 5.1.1 Εισαγωγή στην αιμόσταση... 6 5.1.2 Πρωτογενής αιμόσταση... 7 5.1.3 Δευτερογενής αιμόσταση... 10 5.1.4 Ινωδόλυση... 13 5.1.5 Παθολογία της αιμόστασης... 15 5.2 ΘΡΟΜΒΟΦΙΛΙΑ... 15 5.2.1 Ορισμός Εισαγωγή στη θρομβοφιλία... 15 5.2.2 Αίτια θρομβοφιλίας... 16 5.2.2.1 Κληρονομική θρομβοφιλία... 16 5.2.2.1.1 Ανεπάρκεια πρωτεΐνης C... 18 5.2.2.1.2 Ανεπάρκεια πρωτεΐνης S... 19 5.2.2.1.3 Ανεπάρκεια αντιθρομβίνης ΙΙΙ... 21 5.2.2.1.4 Μετάλλαξη προθρομβίνης (G 20210A)... 22 5.2.2.1.5 Μετάλλαξη παράγοντα V (Μετάλλαξη στο G 1691A: παράγοντας V-Leiden) και αντίσταση στην ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C... 23 5.2.2.1.6 Αυξημένα επίπεδα παραγόντων VIII, ΙX, XΙ... 25 5.2.2.1.7 Ομόζυγη Υπερομοκυστεϊναιμία (ανεπάρκεια β-συνθετάσης της κυσταθειόνης) και ομόζυγη C 677T μετάλλαξη 5,10-Μεθυλενοτετραϋδροφυλλικής αναγωγάσης (MTHFR)... 27 5.2.2.1.8 Ανεπάρκεια πλασμινογόνου... 28 5.2.2.1.9 Αυξημένος αναστολέας ινωδόλυσης (PAI)... 30 5.2.2.2 Επίκτητη θρομβοφιλία... 30 5.2.2.2.1 Ηλικία... 31 5.2.2.2.2 Χειρουργική επέμβαση και Τραύμα... 31 5.2.2.2.3 Στάση... 32 5.2.2.2.4 Ταξίδια μεγάλων αποστάσεων... 32 5.2.2.2.5 Καρκίνος... 33 5.2.2.2.6 Από του στόματος αντισυλληπτικά χάπια... 33 5.2.2.2.7 Κύηση και λοχεία... 34 5.2.2.2.8 Αντιφωσφολιπιδικά αντισώματα... 34 5.3 ΘΡΟΜΒΟΕΜΒΟΛΙΚΗ ΝΟΣΟΣ... 34 6 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... 36 6.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 36 6.2 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ... 36 6.3 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΘΡΟΜΒΟΦΙΛΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ... 38 ii

6.3.1 Παράγοντας V-Leiden... 38 6.3.2 Προθρομβίνη G20210A... 40 6.3.3 Πρωτεΐνη S... 40 6.3.4 Πρωτεΐνης C... 42 6.3.5 Ανεπάρκεια αντιθρομβίνης... 43 6.3.6 Μετρήσεις παραγόντων VIII και XII... 45 6.3.6.1 Παράγοντας VIII... 45 6.3.6.2 Παράγοντας XII... 46 6.3.7 Υπερομοκυστεϊναιμία/μετάλλαξη MTHFR... 46 6.3.8 Ανεπάρκεια πλασμινογόνου... 48 6.3.9 Αυξημένος αναστολέας ινωδόλυσης PAI-1 (Plasminogen activator inhibitor- 1)...... 48 6.3.10 Δυσινωδογοναιμία... 49 6.3.11 Αντιφωσφολιπιδικό Σύνδρομο (APS)... 50 6.4 ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΕΡΙΣΤΑΤΙΚΩΝ... ΣΦΑΛΜΑ! ΔΕΝ ΕΧΕΙ ΟΡΙΣΤΕΙ ΣΕΛΙΔΟΔΕΙΚΤΗΣ. 6.5 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ... 57 7 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 59 iii

2 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ H πτυχιακή εργασία εκπονήθηκε στο τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων του Τεχνολογικού Εκπαιδευτικού Ιδρύματος Αθηνών σε συνεργασία με το εργαστήριο Αιμοδοσίας Αιμόστασης του Γ.Ν.Α. Ιπποκράτειο, όπου πραγματοποιήθηκε και η πρακτική μου άσκηση, κατά την χρονική περίοδο 2016-2017. Θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους εκείνους που με βοήθησαν στη επιτυχή ολοκληρώσω της πτυχιακής μου εργασίας. Ευχαριστώ όλο το προσωπικό και ιδιαίτερα την Παναγιώτα Χαραλάμπους, την Αρετή Γιαννιώτη και τη Μαρία Σιουμάλα για την υπομονή και την καθοδήγηση τους στις εργαστηριακές τεχνικές κατά την εκπαίδευση μου στο Γ.Ν.Α. Ιπποκράτειο. Επίσης θέλω να ευχαριστήσω τους συμφοιτητές μου για την στήριξη τους και την βιβλιοθηκονόμο του Γ.Ν.Α. Ιπποκρατείου, Ειρήνη Δελήκουρα για την απεριόριστη βοήθεια καθ όλη την διάρκεια της εκπόνησης στην ανεύρεση βιβλιογραφίας. Τέλος ευχαριστώ θερμά την κυρία Παύλου Έφη για την αμέριστη βοήθειά της, την καθοδήγηση, την εμπιστοσύνη και την ευκαιρία που μου έδωσε να εξειδικευτώ στον τομέα της Αιμόστασης. 1

3 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Ως αιμόσταση χαρακτηρίζουμε τη φυσιολογική διαδικασία κατά την οποία σταματάει η αιμορραγία στο σημείο του τραυματισμού, διατηρώντας παράλληλα την κανονική ροή του αίματος στο υπόλοιπο κυκλοφορικό σύστημα. Η παύση της απώλειας αίματος επιτυγχάνετε με τη δημιουργία του αιμοστατικού θρόμβου. Το ενδοθήλιο των αιμοφόρων αγγείων καλύπτεται από μια αντιπηκτική επιφάνεια η οποία χρησιμεύει στη διατήρηση της υγρής κατάστασης του αίματος. Ωστόσο σε παθολογικές καταστάσεις ο μηχανισμός σχηματισμού του αιμοστατικού θρόμβου μπορεί να ενεργοποιηθεί χωρίς να προϋπάρχει κάποιος τραυματισμός. Σύμφωνα με την τριάδα του Virchow οι τρεις κύριες ανωμαλίες που οδηγούν σε θρόμβωση είναι ο ενδοθηλιακός τραυματισμός, η στάση του αίματος και η υπερπηκτικότητα. Η θρομβοφιλία ή υπερπηκτικότητα είναι η αυξημένη τάση πρόκλησης θρόμβου και χαρακτηρίζεται από κλινική τάση θρόμβωσης ή μοριακή ανωμαλία της αιμόστασης. ΣΚΟΠΟΣ: Η παρούσα εργασία αποσκοπεί στην μελέτη περιστατικών με θρομβοφιλία και τη σύγκριση των παθολογικών ευρημάτων με τη κλινική τους εικόνα. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Στο ειδικό μέρος της εργασίας μετρήθηκαν αρχικά οι κλασικές δοκιμασίες της πήξης (PT/INR/aPTT/FIB) και τα αιμοπετάλια. Στη συνέχεια μετρήθηκαν η πρωτεϊνη C, η πρωτεϊνη S antigen free και η δραστικότητα της πρωτεϊνης S, πλασμινόνο, αντιθρομβίνη ΙΙΙ, ομοκυστεϊνη, αντιπυκτικά λύκου, αντικαρδιολιπινικά αντισώματα, antiβ2 και APCR-R. Τέλος, έγινε μοριακός έλεχγος για τους πολυμορφισμούς FV Leiden, FII 20210, MTHFR 677 και MTHFR 1298. 2

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Στο ειδικό μέρος της εργασίας αναλύθηκαν 51 περιστατικά θρομβοφιλικού ελέγχου με τη χρήση του Microsoft Excel με κοινή κατανομή δειγμάτων ως προς το φύλο. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε συσχέτιση μεταξύ των προδιαθεσικών παραγόντων και τα κλινικά ευρήματα αλλά και τον τρόπο κατανομής των παθολογικών ευρημάτων των προδιαθεσικών παραγόντων στον πληθυσμό. Τα δείγματα και οι μάρτυρες λήφθηκαν και επεξεργάστηκαν στο Γ.Ν.Α. Ιπποκράτειο. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της έρευνας, υπάρχει συσχετισμός των παθολογικών αποτελεσμάτων με συγκεκριμένα κλινικά ευρηήματα. Βέβαια θα πρέπει να πραγματοποιηθούν περεταίρω μελέτες με μεγαλύτερο πληθυσμό δειγμάτων και περισσότερους περιορισμούς στις μεταβλητές ώστε να αυξηθεί η αξιοπιστία των αποτελεσμάτων της στατιστικής ανάλυσης. 3

4 ABSTRACT BACKGROUND: Hemostasis characterizes the physiological process in which bleeding stops at the point of injury while maintaining normal blood flow to the rest of the circulatory system. Stopping blood loss is achieved by creating the haemostatic thrombus. The endothelium of the blood vessels is covered by an anticoagulant surface that serves to maintain the fluid state of the blood. However, in pathological conditions, the hemostatic thrombus formation mechanism can be activated without the presence injury.according to Virchow's triad the three major abnormalities leading to thrombosis are: endothelial injury, blood stasis and hypercoagulability. Thrombophilia or hypercoagulation is the increased thrombus tendency and is characterized by a clinical thrombosis tendency or a molecular disorder of haemostasis. AIM: The objective of the present thesis aims at the study of cases with thrombophilia and the comparison of the abnormal rates with their clinical picture. MATERIALS AND METHODS: In the research the standard laboratory clotting tests were analyzed first (PT/INR/aPTT/FIB) and platelets and later protein C, protein S antigen free and activity of the S protein, plasminogen, antithrombin III, homocysteine, lupus anticoagulants, anti-cardiolipin antibodies, antiβ2 and APCR-R were measured. Finally, molecular examinations were performed for the polymorphisms FV Leiden, FII 20210, MTHFR 677 and MTHFR 1298. RESULTS: In the research, 51 cases of thrombophilic control were analyzed using Microsoft Excel with a common distribution of gender samples. Statistical analysis of the results showed a correlation between predisposing 4

factors and clinical findings but also how the pathological findings of predisposing factors were distributed to the population. Samples and controls were received and processed in Hippocratio General Hospital of Athens. CONCLUSIONS: According to the results of the research, there is a correlation of the pathological results with specific clinical findings. Of course, further studies should be carried out with a larger sample population and more restrictions on the variables to increase the reliability of the results of the statistical analysis. 5

5 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 5.1 Αιμόσταση 5.1.1 Εισαγωγή στην αιμόσταση Αιμόσταση είναι η φυσιολογική διαδικασία κατά την οποία σταματάει η αιμορραγία στο σημείο του τραυματισμού, διατηρώντας παράλληλα την κανονική ροή του αίματος στο υπόλοιπο κυκλοφορικό σύστημα. Η παύση της απώλειας αίματος επιτυγχάνετε με τη δημιουργία του αιμοστατικού θρόμβου. Το ενδοθήλιο των αιμοφόρων αγγείων καλύπτεται από μια αντιπηκτική επιφάνεια η οποία χρησιμεύει στη διατήρηση της υγρής κατάστασης του αίματος. Σε περίπτωση όμως τραυματισμού του αγγείου, τα συστατικά αυτά του ενδοθηλίου εκτίθενται στο αίμα. Πολλά από αυτά τα συστατικά ενεργοποιούν τις δύο κύριες διαδικασίες της αιμόστασης για το σχηματισμό του αιματικού θρόμβου, αποτελούμενος κυρίως από αιμοπετάλια και ινώδες. Η διαδικασία αυτή ρυθμίζετε αυστηρά ώστε να ενεργοποιήτε μέσα σε δευτερόλεπτα από τη στιγμή του τραυματισμού, αλλά ταυτόχρονα να παραμήνει εντοπισμένη στο σημείο της βλάβης [1] [2]. Η αιμόσταση χωρίζετε σε δύο κύριες συνιστώσες. Η πρωτογενής αιμόσταση αναφέρετε στα συσσωματώματα των αιμοπεταλίων και τους αιμοπεταλιακούς θρόμβους. Τα αιμοπετάλια ενεργοποιούνται μέσω μιας πολύπλευρης διαδικασίας με αποτέλεσμα να προσκολλώνται στο σημείο της βλάβης, σφραγίζοντας το τραύμα. Η δευτερογενής αιμόσταση αναφέρετε στην εναπόθεση αδιάλυτου ινώδους που παράγεται από τον πρωτεολυτικό καταρράκτη της πήξης. Το αδιάλυτο αυτό ινώδες σχηματίζει ένα πλέγμα που ενσωματώνεται πάνω και γύρω από τον αιμοπεταλιακό θρόμβο και χρησιμεύει στην ενίσχυση και σταθεροποίηση το θρόμβου. Οι δύο αυτές διαδικασίες συμβαίνουν ταυτόχρονα και είναι αλληλένδετες. Σημαντικό ρόλο στην αιμόσταση παίζει και η οδός της ινωδόλυσης. Κάθε φορά που η 6

διαδικασία αυτή απορυθμίζεται, μπορεί να συμβεί παθολογικός σχηματισμός θρόμβου ή αιμορραγία [1] [2]. Διάφοροι αντιπηκτικοί μηχανισμοί ρυθμίζουν και ελέγχουν αυτά τα συτήματα ώστε να διατηρείται η ρευστότητα του αίματος σε απουσία τραυματισμού. Η ισορροπία ανάμεσα στο προπηκτικό και αντιπηκτικό σύστημα είναι ζωτικής σημασίας για τη σωστή αιμόσταση και την αποφυγή παθολογικής αιμορραγίας ή θρόμβωσης [1] [2]. 5.1.2 Πρωτογενής αιμόσταση Τα αιμοπετάλια είναι μικρά απύρηνα κυτταρικά θραύσματα τα οποία παράγονται από τα μεγακαρυοκύτταρα (μεγάλα εξειδικευμένα πολυπλοειδή κύτταρα που προέρχονται από το μυελό των οστών). Τα αιμοπετάλια ανεβρίσκονται στα 150 400*10 6 /ml αίματος και κυκλοφορούν για περίπου δέκα ημέρες. Σε ένα υγιές αιμοφόρο αγγείο και υπό κανονική αιματική ροή, τα αιμοπετάλια δεν προσκολλώνται σε επιφάνειες και δεν κάνουν συσσωματώματα μεταξύ τους. Ωστόσο σε περίπτωση τραυματισμού τα αιμοπετάλια εκτίθενται στο ενδοθήλιο, αρχίζοντας έτσι η ενεργοποίση και προσκόλλησή τους [1] [2]. Σε αυτές τις αλληλεπιδράσεις συγκόλλησης εμπλέκονται πολλαπλοί υποδοχείς επιφανείας των αιμοπεταλίων οι οποίοι στοχεύονται από πολλαπλές πρωτεΐνες συγκόλλησης. Το κλειδί για τους υποδοχείς αυτούς είναι η συγκολλητική αλληλεπίδραση που λαμβάνει χώρα μόνο σε περίπτωση τραυματισμού του αιμοφόρου αγγείου [1] [3]. Ο υποδοχέας GPIb-IX-V συνδέεται ειδικά με τον ακινητοποιημένο παράγοντα von Willebrand (vwf) μέσω μιας αλληλεπίδρασης μεταξύ του GPIα και της Α1 περιοχής του vwf. Ο vwf είναι μια μεγάλη πολυμερής πρωτεΐνη η οποία εκκρίνεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα μεγακαρυοκύτταρα και ανεβρίσκεται πάντα σε διαλυτή κατάζσταση στο πλάσμα και σε 7

ακινητοποιημένη κατάσταση στο ενδοθήλιο. Παρ όλα αυτά, η διαλυτή μορφή του vwf στην κυκλοφορία δεν συνδέεται με υψηλή συνάφεια με την GPIbα. Η υψηλής συγγένειας αλληλεπίδραση μπορεί να εξαρτάται από την υψηλή διατμητική τάση που ασκείται στον ακινητοποιημένο παράγοντα vwf από το αίμα, ακόμη κι αν αυτός ο vwf είναι ακινητοποιμένος στο ενδοθήλιο ή σε άλλα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια [4] [5] [6]. Ο GPVI υποδοχέας είναι συστατικά ενεργός, αλλά το μέσο σύνδεσής του είναι το κολλαγόνο,το οποίο βρίσκεται στο ενδοθήλιο με αποτέλεσμα να εκτίθεται στο αίμα μόνο σε περίπτωση τραυματισμού. Οι GPVI και GPIb-IX-V είναι κρίσιμοι τόσο στην πρόσφυση των αιμοπεταλίων στο σημείο τραυματισμού του ενδοθηλίου όσο και στην επακόλουθη ενεργοποίησή τους [7] [8]. Η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων είναι κρίσιμη για τη συσσωμάτωσή τους. Συγκεκριμένα οι ιντεγκτίνες αiibβ3, α2β1 και της ανβ3 είναι φυσιολογικά επιφανειακοί παράγοντες των αιμοπεταλίων σε ανενεργό μορφή, κατά την ενεργοποίηση όμως των αιμοπεταλίων επάγονται σε μια διαμορφωτική μετάβαση που τους εκθέτει σε θέσεις πρόσδεσης. Η αiibβ3 είναι ο σημαντικότερος από τους υποδοχείς αυτούς, καθώς ανεβρίσκεται σε μεγαλύτερη πυκνότητα στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων. Επίσης δεσμεύεται με πολλαπλούς προσδέτες οι οποίοι προωθούν την σύνδεση μεταξύ των αιμοπεταλίων, δηλαδή τη συσσωμάτωσή τους. Οι προσδέτες αυτοί είναι το ινωδογόνο, ο vwf, το κολλαγόνο, η ινονεκτίνη και η βιτρονεκτίνη. Οι α2β1, ανβ3, α5β1 και α6β1 παίζουν μικρότερο ρόλο, συνδεόμενοι κυρίως με το κολλαγόνο, τη βιτρονεκτίνη, την ινωδονεκτίνη και τη λαμινίνη αντίστοιχα, αν και έχουν ταυτοποιηθεί κι άλλοι προσδέτες για κάθε μία από αυτές. Στα αδρανή αιμοπετάλια όλες οι ιντεγκρίνες διατηρούνται ανενεργές [9] [10] [3] [11] [12] [13]. 8

Η ανατροφοδότηση (feedback) της ενεργοποίσης των αιμοπεταλίων που βρίσκοντε κοντά σε ένα νέο σημείο τραυματισμού είναι ζωτικής σημασίας για την περαιτέρω συσσώρευση και διάδοση του αιμοπεταλιακού θρόμβου. Η ενεργοποίηση αυτή προκαλείται κυρίως από αγωνιστές που εκλείονται από τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια που δρουν σε ζεύγη υποδοχέων πρωτεϊνών G. Από τα πυκνά κοκκία των αιμοπεταλίων απελευθερώνεται ADP και συνδέεται με τους υποδοχείς Ρ2Υ1 και P2Y12. Η Α2 θρομβοξάνη συντίθεται de novo από τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια και δεσμεύεται κυρίως από τον υποδοχέα της θρομβοξάνης και σε μικρότερο βαθμό από άλλους υποδοχείς, πάνω στα αιμοπετάλια. Από τα πυκνά αιμοπεταλιακά κοκκία εκκρίνεται επίσης η σεροτονίνη η οποία συμβάλλει στην ενεργοποίησή τους [14] [15]. Άλλος ένας κρίσιμος μηχανισμός της ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων που συνδέει τη δευτερογενή αιμόσταση με τη λειτουργία των αιμοπεταλίων είναι η ενεργοποίηση από τη θρομβίνη. Η θρομβίνη είναι η τελική πρωτεάση σερίνης του καταρράκτη της πήξης. Η θρομβίνη διασπά δύο υποδοχείς πρωτεασικής ενεργοποίησης (PARs) στα ανθρώπινα αιμοπετάλια, τους PAR1 και PAR4. Οι υποδοχείς αυτοί είναι επίσης συζευγμένοι με G πρωτεΐνη, έτσι η διάσπαση από τη θρομβίνη έχει ως αποτέλεσμα της έκθεση ενός νέου Ν-άκρου που χρησιμεύει ως προσδέτης για την ενεργοποίηση του υποδοχέα. Όλοι αυτοί οι υποδοχείς όταν προσδένονται εκκινούν τα κυτταρικά μονοπάτια σηματοδότησης, το οποίο έχει ως αποτέλεσμα την έκκριση των κοκκίων των αιμοπεταλίων, την ενεργοποίηση των ιντεγκρινών αλλά και την αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού των αιμοπεταλίων [16] [17]. Συνοπτικά λοιπόν, η προσκόλληση των αιμοπεταλίων αρχίζει με την πρόσδεση της GPIbα στον ακινητοποιημένο vwf και την σύνδεση της GPVI με το κολλαγόνο, το οποίο εκτίθεται στο αίμα λόγω της ενδοθηλιακής βλάβης. Τα αιμοπετάλια αυτά μαζί με άλλα αιμοπετάλια που βρίσκονται κοντά στο σημείο της βλάβης ενεργοποιούνται, και η προσκόλληση και η συσσωμάτωση 9

ενισχύεται και επεκτείνεται μέσω των συνδέσεων μεταξύ των αιμοπεταλίων αλλά και των συνδέσεων μεταξύ της ιντεγκρίνης αiibβ3 και του ινωδωγόνου, του VWF, της ινονεκτίνη και της βιτρονεκτίνη καθώς και μεταξύ της σύνδεσης της ανβ3 με την βιτρονεκτίνη ή θρομβοσπονδίνη, ενώ η αλληλεπίδραση της α5β1-φιμπρονεκτίνης με την α6β1-λαμινίνη ίσως παίξει απίσης κάποιο ρόλο. Επιπλέον, η πρόσδεση στο υποενδοθηλιακό κολλαγόνο ενισχύεται από την αλληλεπίδραση μεταξύ της ιντεγκρίνης α2β1 και του κολλαγόνου. Ο αιμοπεταλιακός θρόμβος σταθεροποιείται επίσης από την εναπόθεση του αδιάλυτου ινώδους που παράγεται από τον καταρράκτη της πήξης [16] [17]. 5.1.3 Δευτερογενής αιμόσταση Η δευτερογενής αιμόσταση συνίσταται από την αλληλουχία των πρωτεασών της σερίνης και καταλήγει στη διάσπαση του διαλυτού ινωδογόνου από τη 10

θρομβίνη. Από τη διάσπαση της θρομβίνης παράγεται το αδιάλυτο ινώδες το οποίο σχηματίζει πλέγμα ινώδους με σταυροειδείς δεσμούς στο σημείο του τραυματισμού. Η δημιουργία του ινώδους γίνεται παράλληλα με την συσσώρευση των αιμοπεταλίων. Σε άθικτα και υγιή αιμοφόρα αγγεία ο καταρράκτης αυτός δεν ενεργοποιείται, ενώ την ενεργοποίησή του αποτρέπουν και διάφοροι αντιπηκτικοί μηχανισμοί. Αυτοί περιλαμβάνουν την παρουσία της θρομβομοντουλίνης και τις πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης στο αγγειακό ενδοθήλιο. Η θρομβομοντουλίνη είναι ένας συμπαράγοντας που μετατρέπει τη θρομβίνει από προπηκτική σε αντιπηκτική διεγείροντας την ενεργοποίηση της αντιπηκτικής πρωτεάσης σερίνης πρωτεΐνη C. Οι πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης διεγείρουν την ενεργοποίηση του αναστολέα της πρωτεάσης της σερίνης (ή σερπίνης) αντιθρομβίνης, η οποία απενεργοποιεί τη θρομβίνη και τον παράγοντα Χα [18] [19] [20] [21]. Όταν το αγγειακό σύστημα τραυματίζεται, το αίμα εκτίθεται στους εξωαγγειακούς ιστούς, οι οποίοι είναι πλούσιοι σε ιστικό παράγοντα (TF), έναν συμπαράγοντα της πρωτεάσης σερίνης, τον παράγοντα VIIa. Το σύμπλοκο ιστικού παράγοντα και παράγοντα VIIa ενεργοποιεί τον παράγοντα Χ και τον παράγοντα ΙΧ. Αυτή η οδός ενεργοποίησης έχει ονομαστεί ιστορικά ως εξωγενής οδός της πήξης. Ο παράγοντας ΙΧα επίσης ενεργοποιεί τον παράγοντα Χ, παρουσία του συμπράγοντά του VIIIa. Ο παράγοντας Χα, επίσης παρουσία του συμπαράγοντα Va, τότε ενεργοποιεί την προθρομβίνη ώστε να παραχθεί η θρομβίνη [22] [23]. Η θρομβίνη είναι η κεντρική πρωτεάση σερίνης στον καταρράκτη της πήξης και εκτελεί διάφορες κρίσιμες αντιδράσεις. Η θρομβίνει διασπά το ινωδογόνο για τη δημιουργία αδιάλυτου ινώδους και ενεργοποιεί τα αιμοπετάλια μέσω της διάσπασης των PAR1 και PAR4. Επίσης είναι υπεύθυνη για τη θετική ανατροφοδότηση της πήξης του αίματος, η οποία είναι κρίσιμη στη διάδοση του θρόμβου. Η θρομβίνη ενεργοποιεί τον παράγοντα ΧΙ, ο οποίος στη 11

συνέχεια ενεργοποιεί τον παράγοντα ΙΧ και η θρομβίνη ενεργοποιεί τους συμπαράγοντες VIII και V. Η διαδικασία αυτή έχει ιστορικά ονομαστεί ως ενδογενής δρόμος της πήξης [16] [24] [25]. Το ενημερωμένο, βασισμένο σε κύτταρα, μοντέλο της αιμόστασης εστιάζει στο γεγονός ότι οι αντιδράσεις αυτές ελέγχονται από τον εντοπισμό τους στις διάφορες κυτταρικές επιφάνειες. Η διαδικασία της πήξης ξεκινάει με τον ιστικό παράγοντα (εξωγενής οδός), μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη που ανεβρίσκεται σε ινοβλάστες και άλλους εξωαγγειακούς ιστούς. Ο παράγοντας Xa που παράγεται εδώ σχηματίζει ένα σύμπλοκο προθρομβίνης στις επιφάνειες αυτές, σε επέρκεια τέτοια ώστε να δημιουργηθεί μια μικρή μόνο ποσότητα θρομβίνης. Στη συνέχεια, η πήξη ενισχύεται και εξαπλώνεται, μέσω της θετικής ανάδρασης που εμφανίζεται στη επιφάνεια των αιμοπεταλίων, τα οποία ενεργοποιούνται κοντά στο σημείο του τραυματισμού μέσω της θρομβίνης και της προσκόλληση στα εξωκυττάρια συστατικά. Έτσι, σχηματίζονται τα δραστικά σύμπλοκα της πήξης στην επιφάνεια των ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων, μέσω αυτού του θετικού κύκλου ανάδρασης [26]. Η θρομβίνη επίσης παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση στην τελική ρύθμιση του καταρράκτη της πήξης μέσω της δέσμευσής της στην θρομβομοντουλίνη στα ενδοθηλιακά κύτταρα και στην ενεργοποίηση της πρωτεΐνης C (APC). Το ενεργοποιημένο αντιπηκτικό σύμπλοκο της πρωτεΐνης C είναι σημαντικό για την ρύθμιση της τελικής αλληλουχίας στον καταρράκτη της πήξης. Η APC διασπά και αδρανοποιεί τους προπηκτικούς συμπαράγοντες VIIa και Va. Η αντίδραση αυτή απαιτεί επίσης ένα συμπαράγοντα, την πρωτεΐνη S. Επιπλέον, ο παράγοντας V παρέχει λειτουργία αντιπηκτικού ως συμπαράγοντας της APC και της πρωτεΐνης S στην αδρανοποίηση του παράγοντα VIII και του παράγοντα Va. Αυτά τα σύμπλοκα μεταξύ πρωτεασών και συμπαραγόντων (προπηκτικών και αντιπηκτικών) σχηματίζονται επί των αρνητικά φορτισμένες μεμβρανικές επιφάνειες, που 12

παρέχονται από τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια. Ο εντοπισμός αυτός των αντιδράσεων του καταρράκτη της πήξης είναι κρίσιμος για τον περιορισμό της πήξης του αίματος στη θέση της βλάβης [20] [27] [28] [29] [30] [31] [32]. Ο καταρράκτης της πήξης ρύθμιζετα προς τα κάτω και από την αδρανοποίηση όλων των πρωτεασών σερίνης με τη χρήση των αναστολέων των πρωτεασών σερίνης. Οι περισσότεροι από αυτούς τους αναστολείς ανήκουν κυρίως στην οικογένεια, αναστολέων, σερπίνης. Η αντιθρομβίνη είναι αναμφισβήτητα ο σημαντικότερος από αυτούς, καθώς αναστέλλει τη θρομβίνη και τον παράγοντα Xa, όπως και τον ΙΧa και ΧΙa παρουσία ηπαρίνης ή θειικής ηπαράνης. Άλλες σερπίνες που παίζουν ρόλο στην πήξη περιλαμβάνουν ηπαρινικό συμπαράγοντα II (αναστολέας της θρομβίνης), αναστολέα της πρωτεάσης των Ζ-εξαρτώμενων πρωτεϊνών (αναστολέας του παράγοντα Χα), αναστολέα της πρωτεΐνης C (αναστολέας της APC) και C1- αναστολέα (αναστολέας του παράγοντα ΧΙα). Δύο μη σερπινικοί αναστολείς, ο αναστολές της οδού του ιστικού παράγοντα και η α-2-μακροσφαιρίνη παίζουν απίσης σημαντικό ρόλο στην αναστολή του παράγοντα Χα και της θρομβίνης αντίστοιχα [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42]. 5.1.4 Ινωδόλυση Ο ρόλος του ινωδολυτικού συστήματος είναι η διάλυση των θρόμβων του αίματος κατά τη διαδικασία της επούλωσης των τραυμάτων και την πρόληψη σχηματισμού θρόμβων σε υγιή αιμοφόρα αγγεία. Το ινωδολυτικό σύστημα αποτελείται κυρίως από τρεις πρωτεάσες σερίνης που υπάρχουν ως ζυμογόνα (π.χ. προένζυμα) στο αίμα. Η πλασμίνη διασπά το ινωδογόνο σε διαλυτά προϊόντα. Παράγεται από την ενεργοποίση του πλασμινογόνου η οποία γίνεται από τον ιστικό ενεργοποιητή (tpa) που παράγεται στα ενδοθηλιακά αγγειακά κύτταρα, τον ενεργοποιητή τύπου ουροκινάσης (upa) που παράγεται από τα νεφρικά κύτταρα και από πλασματικούς ενεργοποιητές (όπως η καλλικρεΐνη, οι παράγοντες ΧΙ, ΧΙΙ και το υψηλού μοριακού βάρους 13

κινινογόνο - HMWK). Ο tpa και το πλασμινογόνο ενώνονται στην επιφάνεια ενός θρόμβου ινώδους, με τον οποίο συνδέονται και οι δύο. Στη συνέχεια ο tpa ενεργοποιεί το πλασμινογόνο, το οποία διασπά το ινώδες και το ινωδογόνο παράγοντας μονομερή Ε και διμερή D, και μονομερή D και E αντίστοιχα, ενώ παράλληλα αδρανοποιεί τους παράγοντες V, VIII και XIII. Ο upa ενεργοποιεί το πλασμινογόνο παρουσία του υποδοχέα υρα, ο οποίος απαντάται σε διάφορους κυτταρικούς τύπους [33]. Η διαδικασία της ινωδόλυσης σταματάει με τους ανασταλτές, οι οποίοι χωρίζονται στους αναστολείς ενεργοποίησης του πλασμινογόνου και στους αδρανοποιητές του ενεργοποιημένου ενζύμου, δηλαδή της πλασμίνης. Οι ανασταλτές ενεγοποίησης του πλασμινογόνου είναι ο ανασταλτής-1 του πλασμινογόνου (ΡΑΙ-1), που παράγεται από το αγγειακό ενδοθήλιο και το ήπαρ και αδρανοποιεί τον tpa, και ο ανασταλτής-2 του πλασμινογόνου (ΡΑΙ- 2), ο οποίος παράγεται στον πλακούντα και αδρανοποιεί πρωτίστως την ουροκινάση και στη συνέχεια τον tpa. Η α2 αντιπλασμίνη, η οποία συντίθεται στο ήπαρ, θεωρείται ο κύριος ανασταλτής της πλασμίνης [2] [43]. 14

5.1.5 Παθολογία της αιμόστασης Η φυσιολογική αιμόσταση είναι μια συνάρτηση της ισορροπίας μεταξύ του προπηκτικού συστήματος (αιμοπετάλια, καταρράκτης της πήξης) και του αντιπηκτικού συστήματος (APC, πρωτεΐνη S, ινωδόλυση, σερπίνες). Εάν η αιμόσταση είναι εκτός ισορροπίας λόγω κάποιας έλλειψης στα συστήματα αυτά, τότε το αποτέλεσμα μπορεί να είναι είτε θρόμβωση είτε αιμορραγία. Οι διαταραχές αυτές είναι κοινά και προκλητικά ιατρικά προβλήματα. 5.2 Θρομβοφιλία 5.2.1 Ορισμός Εισαγωγή στη θρομβοφιλία Η θρομβοφιλία ή υπερπηκτικότητα είναι η αυξημένη τάση πρόκλησης θρόμβου και χαρακτηρίζεται από κλινική τάση θρόμβωσης ή μοριακή ανωμαλία της αιμόστασης. Η κληρονομική θρομβοφιλία μπορεί να οφείλεται σε ανεπάρκεια αντιθρομβίνης, πρωτεΐνης C ή πρωτεΐνης S. Άλλες μοριακές ανωμαλίες έχουν επίσης περιγραφεί: αντίσταση ενεργοποιημένης πρωτεΐνης C λόγω παράγοντα V Leiden, G 20210 Α πολυμορφισμός στο γονίδιο της προθρομβίνης, αυξημένα επίπεδα παράγοντα VIII στο πλάσμα ή υπερομοκυστεϊναιμία. Η επίκτητη θρομβοφιλία συνδέεται συχνά με το αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο που χαρακτηρίζεται από θρόμβωση και την παρουσία αντιπηκτικών λύκου ή αντιφωσφολιπιδικά αντισώματα. Σε ορισμένες περιπτώσεις, δεν βρίσκεται μοριακή ανωμαλία παρ ότι παρατηρούντε επαναλαμβανόμενες θρομβώσεις σε ασθενή και την οικογένειά του / της. Η κατάσταση αυτή μπορεί να θεωρηθεί και ως κλινική θρομβοφιλία. Σύμφωνα με την τριάδα του Virchow οι τρεις κύριες ανωμαλίες που οδηγούν σε θρόμβωση είναι ο ενδοθηλιακός τραυματισμός, η στάση του αίματος και η υπερπηκτικότητα [44] [45]. 15

5.2.2 Αίτια θρομβοφιλίας Η θρομβοφιλία είναι μία κληρονομική ή επίκτητη προδιάθεση για θρόμβωση. Δεν είναι ασθένεια, αλλά σχετίζεται με ασθένειες (π.χ. καρκίνος), έκθεση σε φάρμακα (π.χ. p.o. λήψη αντισυλληπτικών) ή καταστάσεις (π.χ. εγκυμοσύνη ή επιλόχεια θρομβοφιλία). Αλλιώς η θρομβοφιλία μπορεί να είναι κληρονομική. Η θρομβοτική προδιάθεση μπορεί να προκύψει από γενετικούς παράγοντες, που αποκτήθηκαν από αλλαγές στο μηχανισμό της πήξης ή από αλληλεπίδραση μεταξύ γενετικών και επίκτητων παραγόντων [46] [47]. 5.2.2.1 Κληρονομική θρομβοφιλία Η κληρονομική θρομβοφιλία εμφανίζεται όταν ένας κληρονομικός παράγοντας (π.χ. ανεπάρκεια αντιθρομβίνης ή πρωτεΐνης C) απαιτεί την αλληλεπίδραση με κληρονικά ή επίκτητα συστατικά πριν την έναρξη μια 16

κλινικής διαταραχής. Μια ομόζυγη ανωμαλία ή ο συνδυασμός δύο ή περισσότερων ετερόζυγων ανώμαλων παραγόντων μπορεί να ο0δηγήσει σε κλινικά εμφανείς θρομβοτικές διαταραχές σε νεαρή ηλικία. Ωστόσο τα ηπιότερα ετερόζυγα χαρακτηριστικά, όταν υπάρχουν μόνα τους, συνήθων ανακαλύπτονται από εργαστηριακή διερεύνηση. Τις κληρονομικές θρομβοφιλικές διαταραχές μπορούμαι να τις κατάξουμε σε δύο κατηγορίες: Μείωση των αναστολέων της πήξης o Ανεπάρκεια πρωτεΐνης C o Ανεπάρκεια πρωτεΐνης S o Ανεπάρκεια αντιθρομβίνης ΙΙΙ Αύξηση των παραγόντων της πήξης ή της λειτουργίας τους o Μετάλλαξη προθρομβίνης (G 20210 A) o Μετάλλαξη παράγοντα V (Μετάλλαξη στο G 1691 A: παράγοντας V-Leiden) o Αντίσταση στην ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C o Αυξημένα επίπεδα παραγόντων VIII, XI, XI o 5,10-Μεθυλενοτετραϋδροφυλλική αναγωγάση (MTHFR ομόζυγη C 677 T μετάλλαξη) o Αυξημένη λιποπρωτεΐνη (α) ( Lp(a)) o Δυσινωδογοναιμία Επίσης υπάρχουν κι άλλες διαταραχές που δεν κατατάσονται στις δύο παραπάνω κατηγορίες: o Ανεπάρκεια πλασμινογόνου o Ομόζυγη Υπερομοκυστεϊναιμία (ανεπάρκεια β-συνθετάσης της κυσταθειόνης) o Αυξημένος αναστολέας ινωδόλυσης 17

Η πρώτη κατηγορία έχει αυξημένο κίνδυνο για εμφάνιση θρόμβωσης, αλλά η δεύτερη κατηγορία ανιχνεύθηκε σε πενταπλάσιους ασθενείς με υποψία θρομβοφιλίας. Ιστορικά είναι γνωστό ότι το πρώτο επεισόδιο εν τω βάθει θρόμβωσης (DVT) συνδέεται με τη δεύτερη κατηγορία, παρ όλα αυτά δεν αποτελεί παράγοντα επαναλαμβανόμενων θρομβωτικών επεισοδίων [47] [48] [49] [50]. 5.2.2.1.1 Ανεπάρκεια πρωτεΐνης C Η πρωτεΐνη C αδρανοποιεί τους ενεργοποιημένους παράγοντες Va και VIIa, μαζί με τον συμπαράγοντα πρωτεΐνη S. Η σχέση της με τη φλεβική θρόμβωση αναφέρθηκε πρώτη φορά το 1981. Η ανεπάρκεια της πρωτεΐνης C παρατηρείτε σε 0,2% του φυσιολογικού πληθυσμού και 2,5-6% των ασθενών με φλεβική θρόμβωση. Σε ασθενείς με φλεβική θρόμβωση, τα επίπεδα της πρωτεΐνης C θα είναι στο 50% του φυσιολογικού, ενώ η πλειοψηφεία των ασθενών θα έχουν ένα θρομβωτικό επεισόδιο από την ηλικία των 60 ετών. Σε πλήρη απουσία της πρωτεΐνης C, σε νεογνά αναπτύσσεται μια κατάσταση γνωστή ως κεραυνοβόλος πορφύρα και γίνεται μοιραία εάν δεν διορθωθεί έγκαιρα με την έγχυση πρωτεΐνης C [48] [51] [52]. Η ανεπάρκεια πρωτεΐνης C κληρονομείται με αυτοσωματικό κυρίαρχο τρόπο και συνδέεται με την οικογενή φλεβική θρόμβωση. Το γονίδιο για την πρωτεΐνη C βρίσκεται στο χρωμόσωμα 2 (2q13-14) και φαίνεται να σχετίζεται στενά με το γονίδιο του παράγοντα IX. Δύο κύριοι υποτύποι ετερόζυγης ανεπάρκειας πρωτεΐνης C (Τύπου Ι και Τύπου II) έχουν οριοθετηθεί χρησιμοποιώντας ανοσολογικές και λειτουργικές δοκιμασίες. Πάνω από 160 διαφορετικές γονιδιακές ανωμαλίες έχουν συσχετιστεί με τους δύο αυτούς υποτύπους [47] [53] [54] [55]. Η κύρια επίδραση της ενεργοποιημένης πρωτεΐνης C (APC) είναι να αδρανοποιήσει τους παράγοντες της πήξεως Va και VIIIa, οι οποίοι είναι απαραίτητοι για την αποτελεσματική παραγωγή θρομβίνης και ενεργοποίηση 18

του παράγοντα Χ. Το ανασταλτικό αποτέλεσμα της APC ενισχύεται σημαντικά από την πρωτεΐνη S, η οποία εξαρτάται από την βιταμίνη Κ [46] [47]. Η ανεπάρκεια Τύπου Ι είναι και η πιο συνηθισμένη. Οι περισσότεροι ασθενείς είναι ετερόζυγοι, με μειωμένη συγκέντρωση πρωτεΐνης C στο πλάσμα κατά περίπου 50% του φυσιολογικού στις αναδολογικές και λειτουργικές δοκιμασίες. Πάνω από τις μισές τις μεταλλάξεις που έχουν εντοπιστεί μέχρι στιγμής είναι παρανοηματικές και μη νοηματικές μεταλλάξεις. Υπάρχει σημαντική φαινοτυπική διακύμανση μεταξύ των ασθενών με ετερόζυγη ανεπάρκεια πρωτεΐνης C Τύπου Ι. Παρόμοιες μεταλλάξεις έχουν βρεθεί μεταξύ των συμπτωματικών και ασυμπτωματικών ατόμων. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι η φύση της βλάβης του γονιδίου της πρωτεΐνης C μόνη της δεν εξηγεί τη φαινοτυπική διακύμανση [47] [56]. Στην ανεπάρκεια Τύπου ΙΙ οι ασθενείς έχουν φυσιολογικά επίπεδα αντιγόνων πρωτεΐνης C πλάσματος με μειωμένη λειτουργική δραστηριότητα. Μια ποικιλία διαφορετικών σημειακών μεταλλάξεων που επηρεάζουν τη λειτουργία της πρωτεΐνης έχουν ταυτοποιηθεί σε αυτή τη διαταραχή [47] [55]. 5.2.2.1.2 Ανεπάρκεια πρωτεΐνης S Η κυκλοφορεί σε δεσμευμένη και μη δεσμευμένη μορφή. Αυτή η ανεπάρκεια παρατηρήθηκε το 1984. Η μη δεσμευμένη μορφή της πρωτεΐνη S είναι 20%. Ανεπάρκεια πρωτεΐνης S παρατηρείται στο 1,35% των ασθενών με φλεβική θρόμβωση. Μόνο το ένα τρίτο των ασθενών με ανεπάρκεια πρωτεΐνης S θα εμφανίσει φλεβική θρόμβωση από την ηλικία των 60 ετών. Η κεραυνοβόλος πορφύρα και η νέκρωση του δέρματος είναι επίσης γνωστές σε ασθενείς με ανεπάρκεια πρωτεΐνης S [47] [57] [58]. Η πρωτεΐνη S λειτουργεί ως συμπαράγοντας για την ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C. Η ονομασία της προέρχεται από το Σηάτλ, όπου και απομονώθηκε αρχικά. Υπάρχουν δύο ομόλογα γονίδια για την πρωτεΐνη S, τα 19

PROS1 και PROS2, τα οποία έχουν χαρτογραφηθεί στο χρωμόσωμα 3. Το 2000, οι Gandrille et al εντόπισαν 15 σημειακές μεταλλάξεις και 3 πολυμορφισμούς μεταξύ 19 Γάλλων ασθενείς. Και οι πέντε μεταλλάξεις που περιγράφονται αρχικά σε αυτούς τους ασθενείς ήταν παρανοηματικές μεταλλάξεις (missense mutations) βρίσκονται στο Ν-τελικό άκρο του μορίου πρωτεΐνης S, η οποία περιλαμβάνει τις περιοχές που αλληλεπιδρούν με την ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C. Από τότε έχουν ταυτοποιηθεί μεταλλάξεις στο 70% των εξεταζόμενων για ανεπάρκειας πρωτεΐνης S και έχει δημοσιευθεί μια βάση δεδομένων με τις γνωστές μεταλλάξεις του γονιδίου της πρωτεΐνη S [47] [59] [60] [61]. Με βάση τις συνολικές συγκεντρώσεις αντιγόνου πρωτεΐνης S, τις συγκεντρώσεις ελεύθερης πρωτεΐνης S, και τη λειτουργική δραστικότητα της πρωτεΐνης S έχουν καθοριστεί τρεις φαινότυποι για την ανεπάρκεια της πρωτεΐνης S [47]. Ο Τύπος Ι είναι ο συχνότερος τύπος ανεπάρκειας για την πρωτεΐνη S ο οποίος συνδέεται με το μειωμένο επίπεδο του συνολικού αντιγόνου S (περίπου 50% του φυσιολογικού) και σημειώνονται μειώσεις στο ελεύθερο αντιγόνο της πρωτεΐνης S και στη λειτουργική δραστικότητα της πρωτεΐνης S [47] [62]. Ο Τύπος ΙΙ χαρακτηρίζεται από φυσιολογικά επίπεδα ολικής και ελεύθερης πρωτεΐνης S, αλλά μειωμένη λειτουργική δραστικότητα της πρωτεΐνης S [47] [61]. Ο Τύπος ΙΙΙ είναι γνωστός και ως Τύπος Iia. Χαρακτηρίζεται από ολικό αντιγόνο πρωτεΐνης S εντός των φυσιολογικών ορίων, επιλεκτικά μειωμένα επίπεδα ελεύθερης πρωτεΐνης S και λιγότερο από περίπου 40 τοις εκατό του φυσιολογικού λειτουργική δραστικότητα της πρωτεΐνης S [47] [63]. 20

Μια μελέτη από τον Zoller το 1995 σε 327 σουηδικές οικογένειες έδειξε ότι ο τύπος Ι και ο τύπος III είναι φαινοτυπικά παραλλαγές της ίδιας γενετικής ασθένειας [47] [63]. 5.2.2.1.3 Ανεπάρκεια αντιθρομβίνης ΙΙΙ Η ανεπάρκεια αντιθρομβίνης ΙΙΙ είναι η πρώτη συγγενής θρομβοφιλία που περιγράφηκε. Το 1965, ο Egeberg περιέγραψε μια οικογένεια με μειωμένα επίπεδα αντιθρομβίνης και υποτροπιάζοντα επεισόδια φλεβικής θρόμβωσης. Η αντιθρομβίνη δεσμεύει ομοιοπολικά και αδρανοποιεί την θρομβίνη και τους παράγοντες Xa, IXa, XΙa και XIIa. Η ανεπάρκεια αντιθρομβίνης είναι σπάνια (0.2%), αλλά σε ασθενείς που παρουσιάζουν φλεβική θρομβοεμβολή μπορεί να στάσει σε επίπεδα 0,5 έως 7,5%. Περίπου 50-60% των ασθενών με ανεπάρκεια αντιθρομβίνης αναπτύσει φλεβικικό θρομβωτικό επεισόδιο πριν από την ηλικία των 60 ετών [47] [63] [64]. Η ανεπάρκεια αντιθρομβίνης είναι μια ετερογενής διαταραχή. Συνήθως κληρονομείται με αυτοσωματικό κυρίαρχο τρόπο, επηρεάζοντας έτσι και τα δύο φύλα εξίσου. Η πρώτη βάση δεδομένων για τις μεταλλάξεις των γονιδίων αντιθρομβίνης δημοσιεύθηκε το 1991 και στη συνέχεια υπέστη διάφορες αναθεωρήσεις καθώς περιγράφονται νεότερες μεταλλάξεις. Υπάρχουν διαφορετικοί υπότυποι ανάλογα με την κάθε ανεπάρκεια [47]. Η ανεπάρκειας Τύπου Ι είναι συνήθως το αποτέλεσμα της μειωμένης σύνθεσης των βιολογικά φυσιολογικών μορίων του αναστολέα πρωτεάσης. Σε αυτές τις περιπτώσεις, τόσο η αντιγονική όσο και η λειτουργική ενεργότητα της αντιθρομβίνης στο αίμα μειώνονται. Οι τιμές μειώνονται κατά περίπου 50% στους ετεροζυγότες. Η βάση δεδομένων της αντιθρομβίνης του 1997 περιλαμβάνονται 80 διακριτές μεταλλάξεις σε ασθενείς με ανεπάρκεια Τύπου Ι. Η βάση δεδομένων δείχνει ότι η μοριακή βάση για η διαταραχή αυτή είναι συνήθως μία μικρή εξάλειψη ή παρεμβολή (λιγότερο από 22 ζεύγη βάσεων) ή 21

μία διαγραφή ενός σημαντικού τμήματος του γονιδίου της αντιθρομβίνης [47] [65] [66]. Η ανεπάρκεια αντιθρομβίνης Τύπου ΙΙ εμφανίζεται με ένα διακριτό μοριακό ελλάτωμα εντός της πρωτεΐνης. Ενώ η ανοσολογική δραστικότητα της αντιθρομβίνης είναι φυσιολογική σε αυτήν την έλλειψη, η λειτουργική δράση της αντιθρομβίνης πλάσματος μειώνεται σημαντικά οδηγώντας σε κίνδυνο θρόμβωσης [47]. Ο Τύπος ΙΙΙ χαρακτηρίζεται από την φυσιλογικά λειτουργικά και αντιγονικά επίπεδα αντιθρομβίνης, αλλά μειωμένη αλληλεπίδραση μεταξύ αντιθρομβίνης και ηπαρίνης. Αρκετά μόρια αντιθρομβίνης έχουν εντοπιστεί με ανωμαλίες στη θέση πρόσδερσης της ηπαρίνης, με αποτέλεσμα την μειωση της δραστικότητας της ηπαρίνης. Αυτές οι παραλλαγε ς έχουν μεταλλάξεις στο αμινο-τελικό άκρο του μορίου [47] [67]. 5.2.2.1.4 Μετάλλαξη προθρομβίνης (G 20210 A) Η μετάλλαξη αυτή περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1996 από τον Poort και τους συνεργάτες του ως παραλλαγή ενός αμινοξέος στην 3' αμετάφραστη περιοχή του γονιδίου που κωδικοποιεί την προθρομβίνη. Η προθρομβίνη (παράγοντας II) είναι η πρόδρομη ουσία της θρομβίνης, το τελικό προϊόν του καταρράκτη της πήξης. Η προθρομβίνη παίρνει μέρος σε προπηκτικές, αντιπηκτικές και αντι-ινωδολυτικές δραστηριότητες και έτσι μια διαταραχή που περιλαμβάνει την προθρομβίνη έχει ως αποτέλεσμα πολλαπλές ανισορροπίες στην αιμόσταση [47] [68] [64]. Μια έκθεση που δημοσιεύθηκε το 1996, με βάση 28 οικογένειες από τις Κάτω Χώρες με την καθιερωμένη φλεβική θρομβοεμβολή εντόπισε υποκατάσταση γουανίνης προς αδενίνη στο νουκλεοτίδιο 20210 στην 3 'αμετάφραστη περιοχή του γονιδίου της προθρομβίνης. Συνδετικές μελέτες που πραγματοποιήθηκαν σε 397 άτομα από 21 ισπανικές οικογένειες έχουν δώσει 22

περαιτέρω αποδείξεις ότι το σημείο (G20210) στο γονίδιο της προθρομβίνης επηρεάζει τα επίπεδα δραστηριότητας της προθρομβίνης και την ευαισθησία στην θρόμβωση [47] [69]. Επίσης έχει βρεθεί ότι το 18% των ασθενών με φλεβική θρόμβωση και το 1% των υγιών ατόμων είχαν μια μετάλλαξη στη βάση 20210 του γονιδίου της προθρομβίνης. Τα περισσότερα από τα άτομα με τη διαταραχή αυτή δεν είχαν επαρουσιάσει επεισόδιο φλεβικής θρόμβωσης μέχρι την ηλικία των 50 ετών. Παρατήρησαν ότι το 12% των ετερόζυγων για τον παράγοντα V Leiden ήταν επίσης ετερόζυγοι και για τον παράγοντα II G20210A, ενώ το 23% των ασθενών με ετεροζυγωτία για τον παράγοντα II G20210A ήταν επίσης ετερόζυγοι και για τον παράγοντα V Leiden. Οι τιμές αυτές είναι κατά πολύ υψηλότερες από τις αναλογίες για τον παράγοντα V Leiden 4,9 (4.1 5.9) και την μετάλλαξη του παράγοντα II G20210A 3,8 (3.0 4.9) ως μεμονομένες μεταλλάξεις [48] [70]. 5.2.2.1.5 Μετάλλαξη παράγοντα V (Μετάλλαξη στο G 1691 A: παράγοντας V- Leiden) και αντίσταση στην ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C Το 1994, οι Bertina et al περιέγραψαν για πρώτη φορά ένα ελάττωμα στο γονίδιο του παράγοντα V που τον καθιστά λιγότερο ευάλωτο στην αδρανοποίηση από την ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C (APC). Τον επόμενο χρόνο, ο Καλαφάτης και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι ο μηχανισμός της αδρανοποίησης του δεσμευμένου στη μεμβράνη παράγοντα Va είναι ένα προκανονισμένο γεγονός. Ο παράγοντας Va διασπάται διαδοχικά σε Arg506 και σε Arg306 και Arg679 από την ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C. Πρότειναν ότι η διάσπαση του πεπτιδικού δεσμού στο Arg506 διευκολύνει την έκθεση των επόμενων θέσεων διάσπασης στο Arg306 και Arg679 [48] [71]. Την ίδια περίοδο, οι Shen, Dahlback et al έδειξαν ότι ο παράγοντας V είναι επίσης ένας συμπαράγοντας στην αδρανοποίηση του παράγοντα Vllla από την APC. Διαπιστώθηκε επίσης ότι το αλληλόμορφο του παράγοντα V ήταν 23

ανθεκτικό στην πρωτεολυτική δράση της πρωτεΐνης C. Περίπου 5% των υγιών ατόμων βορειοευρωπαϊκής καταγωγή και 10% των ασθενών με φλεβική θρόμβωση βρέθηκαν θετικοί στον παράγοντα V Leiden, όπως προέκυωε στο 30-50% των ερευνών που έγιναν σε ασθενείς με θρομβοφιλία. Αλλά λέγεται ότι είναι σπάνια σε άτομα αφρικανικής και ασιατικής καταγωγής. Ο παράγοντα V Leiden καθε εαυτόν είναι ένας παράγοντας χαμηλού κινδύνου για φλεβική θρόμβωση. Όταν οι άνθρωποι με παράγοντα V Leiden συμπλήρωσαν το 65ο έτος της ηλικίας τους, μόνο το 6% από αυτούς είχε εκδηλώσει κάποιον θρομβωτικό επεισόδιο. Αυτοί οι ασθενείς γίνονται υποψήφια μέλη της ομάδας υψηλού κινδύνου για ανάπτυξη φλεβικής θρόμβωσης κατά τη διάρκεια περιεγχειρητικών και μετεπεμβατικών περιόδων [47] [48]. Η κατανόηση της αδρανοποίησης του παράγοντα V ακολουθήθηκε σχεδόν αμέσως από αναφορές σχετικά με το πώς η ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C στο πλάσμα των ασθενών απέτυχε να παρατείνει το χρόνο ενεργοποιημένης μερικής θρομβοπλαστίνης, εξ ου και ο όρος «αντίσταση στην ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C» που αναπτύχθηκε [48]. Περαιτέρω μελέτες έχουν δείξει ότι οι περισσότεροι ασθενείς με αντίσταση στην ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C έχουν ένα αλληλόμορφο του παράγοντα V που είναι ανθεκτικό στην πρωτεολυτική δράση της πρωτεΐνης C. Μια μεταλλαγή ( από γουανίνη σε αδενίνη) στο νουκλεοτίδιο 1691 (G 1691) έχει ως αποτέλεσμα την αντικατάσταση της αργινίνης από γλουταμίνη. Το προϊόν αυτού του γονιδίου, που ονομάζεται παράγοντας V Leiden, γνωστός και ως παράγοντας V Q506 ή Arg506Gln, έχει πάρει το όνομά του από την Ολλανδική πόλη στην οποία εντοπίστηκε για πρώτη φορά. Ο παράγοντας V Leiden είναι μια παραλλαγή του φυσιολογικού γονιδίου και δεν παρουσιάζει ευαισθησία διάσπασης από την ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C στη θέση 506. Η συνέπεια αυτού είναι μια κατάσταση υπερπηκτικότητας καθώς περισσότερος 24

παράγοντας Va είναι διαθέσιμος εντός του συμπλόκου προθρομβινάσης, αυξάνοντας έτσι την παραγωγή θρομβίνης. Πιστεύεται επίσης ότι ο παράγοντας V είναι ένας συμπαράγοντας, μαζί με την πρωτεΐνη S, στην υποστήριξη της ενεργοποιημένης πρωτεΐνης C στην αποικοδόμηση των παραγόντων Va και VIIIa. Έτσι, η έλλειψη αυτού του προϊόντος διάσπασης μειώνει την αντιπηκτική δράση της ενεργοποιημένης πρωτεΐνης C [48]. Αρκετές μεταλλάξεις στο υπόλειμμα Arg306 του παράγοντα V έχουν περιγραφεί σε ασθενείς με ιστορικό θρόμβωσης. Αυτές περιλαμβάνουν την αντικατάσταση της Arg306 με θρεονίνη (παράγοντας V Cambridge) ή με γλυκίνη (στο Χονγκ Κονγκ). Περιστασιακά, έχουν περιγραφεί ασθενείς οι οποίοι έχουν ετερόζυγη αντίσταση στην ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C που οφείλεται σε μετάλλαξη του παράγοντα V Leiden και ανεπάρκεια παράγοντα V Τύπου Ι. Το πλάσμα των ατόμων αυτών εκδηλώνει σοβαρή αντίσταση στην APC σε δοκιμασίες χρόνου ενεργοποιημένης μερικής θρομβοπλαστίνης, παρόμοια με αυτή που παρατηρείται σε ασθενείς με ομόζυγο παράγοντα V Leiden. Αυτοί οι ασθενείς φαίνεται να είναι πιο επιρρεπείς θρόμβωση από συγγενείς τους οι οποίοι είναι ετερόζυγοι μόνο για τον παράγοντα V Leiden, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο κλινικός φαινότυπος είναι παρόμοιος με αυτό των ασθενών οι οποίοι είναι ομόζυγοι για τον παράγοντα V Leiden [48]. 5.2.2.1.6 Αυξημένα επίπεδα παραγόντων VIII, ΙX, XΙ Οι ασθενείς με ιστορικό φλεβικής θρόμβωσης εμφανίζουν αυξημένα επίπεδα παραγόντων VIII, IX, και XI. Δεν είναι όμως σαφές πώς τα αυξημένα επίπεδα των παραγόντων πήξης μπορεί να αυξήσουν τον κίνδυνο για θρόμβωσης. Αυτές οι αυξήσεις των παραγόντων της πήξεως μπορεί να είναι πολύ ασθενείς παράγοντες κινδύνου για θρόμβωση, με κάθε 0,1-1,0 U/L που αυξάνεται ο παράγοντας VIII c, ο κίνδυνος φλεβικής θρόμβωσης θα αυξηθεί κατά 10%. Όταν υπάρχει συνδυασμός αυτών των μεταλλάξεων, τότε υπάρχει 25

αυξημένος κίνδυνος εμφάνισης θρόμβωσης κατά τη διάρκεια της παιδικής ηλικίας. [47] [48] Η πηκτική δράση του αυξημένου παράγοντα VIII στο πλάσμα (VIII: C) έχει γίνει πλέον αποδεκτή ως ανεξάρτητος δείκτης για τον αυξημένο κίνδυνο θρόμβωσης. Σε μία μελέτη που έγινε σε πληθυσμό στην Ολλανδία από τον Koster και τους συνεργάτες του το 1995, τα άτομα με αυξημένο παράγοντα VIII:C πάνω από το 150% της φυσιολογικής τιμής είχαν προσαρμοσμένη αναλογία πιθανοτήτων 4,8 (ratio) για εκδήλωση φλεβικής θρόμβωσης για πρώτη φορά σε σύγκριση με τα άτομα που είχαν επίπεδα κάτω από 100%. Τόσο σε αυτήν όσο και σε μια αγγλική μελέτη που συμμετείχαν 46 ασθενείς που παραπέμφθηκαν για την αξιολόγηση ανεξήγητης θρόμβωσης, η συχνότητα εμφάνισης αυξημένων παράγοντα VIII:C επίπεδα ήταν περίπου 25% [47] [48]. Στην παρπάνω παράγραφο περιγράφηκε η επικινδυνότητα για εν τω βάθη θρόμβωση σχετικά με τα αυξημένα επίπεδα του παράγοντα VIII (> 150 IU / dl) στο πλάσμα. Ο παράγοντας VIII είναι ο συμπαράγοντας του ενεργοποιημένου παράγοντα ΙΧα για την ενεργοποίηση του παράγοντα Χ και ως εκ τούτου, έχει προταθεί ότι τα αυξημένα επίπεδα του παράγοντα IX μπορεί με τη σειρά τους να αυξήσουν τον κίνδυνο θρόμβωσης. Ο παράγοντας IX είναι μια πρωτεάση σερίνης που υπάρχει στην κυκλοφορία και εξυπηρετεί ως ουσιώδες συστατικό της οδού πήξης του αίματος, και εμφανίζεται να αυξάνει με την ηλικία στους ανθρώπους. Σε μελέτη που έγινε το 2000 σε 426 ασθενείς ως τμήμα της μεγαλύτερου μεγέθους μελέτης «Leiden Thrombophilia Study» από τους van Hylckama Vlieg και συνεργάτες βρέθηκε 2 έως 3 φορές αυξημένος κίνδυνος για τα άτομα που έχουν επίπεδα του παράγοντα IX πάνω από 129 U / dl σε σύγκριση με τα άτομα που έχουν τα επίπεδα του παράγοντα ΙΧ κάτω από το ανώτατο όριο. Μετά τον αποκλεισμό των ατόμων με γνωστές γενετικές διαταραχές βρέθηκε μια 26

αναλογία πιθανοτήτων 2,5. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι σε αυξημένα επίπεδα του παράγοντα ΙΧ είναι ένας κοινός παράγοντας κινδύνου για θρόμβωση μεταξύ του ολλανδικού πληθυσμού [47] [48]. Ο παράγοντα XI, είναι συστατικό της ενδογενούς οδού της πήξης, συμβάλλει στην δημιουργία της θρομβίνης, η οποία εμπλέκεται τόσο στον σχηματισμό ινώδους όσο και στην προστασία έναντι της ινωδόλυσης. Κοιτάζοντας τα γενετικά δεδομένα από την «Leiden Thrombophilia Study» με έδρα την Ολλανδία, χρησιμοποιώντας 474 περιπτώσεις και 474 ελέγχους, συγκρίθηκαν ασθενείς που είχαν επίπεδα παράγοντα XI πάνω από το 90ο εκατοστημόριο με αυτούς που είχαν επίπεδα κάτω από το επίπεδο αυτό. Η πιθανότητες ηλικείας και φύλλου για εν τω βάθει φλεβική θρόμβωση βρέθηκε 2,2 (95% CI: 1.5-3.2). Όπως και με τον παράγοντα VIII, αυτή η μελέτη προτείνει ότι ο βαθμός αύξησης του παράγοντα XI συσχετίζεται με τον κίνδυνο φλεβικής θρόμβωσης [47] [48]. 5.2.2.1.7 Ομόζυγη Υπερομοκυστεϊναιμία (ανεπάρκεια β-συνθετάσης της κυσταθειόνης) και ομόζυγη C 677 T μετάλλαξη 5,10- Μεθυλενοτετραϋδροφυλλικής αναγωγάσης (MTHFR) Η ομοκυστεΐνη είναι ένα σουλφυδρυλικό αμινοξύ που παράγεται από τη μεταβολική μετατροπή της μεθειονίνης. Υπάρχουν δύο κύριες μεταβολικές οδοί που εμπλέκονται στον περαιτέρω μεταβολισμό της ομοκυστεΐνη. Η κύρια οδός περιλαμβάνει την επαναμεθυλίωσή της σε μεθειόνη. Σε αυτό το μονοπάτι η ομοκυστεΐνη δέχεται μία ομάδα μεθυλίου συνήθως από μεθυλοτετραϋδροφολικό, μια αντίδραση που καταλύεται από την μεθυλενοτετραϋδροφολικού αναγωγάσης (MTHFR). Η βιταμίνη Β-12 είναι ένας συμπαράγοντας σε αυτή την αντίδραση. Η δεύτερη μεταβολική οδός περιλαμβάνει τη μετατροπή της ομοκυστεΐνης σε κυσταθειονίνη η οποία καταλύεται από το ένζυμο β-συνθετάσης της κυσταθειόνης με συμπαράγοντα τη βιταμίνη Β-6 (φωσφορική πυριδοξάλη). [64] 27

Ελαττώματα σε οποιαδήποτε από αυτές τις μεταβολικές οδούς, συνδέονται με συσσώρευση της ομοκυστεΐνης στο αίμα. Τα φυσιολογικά επίπεδα κυμαίνονται από 5 έως 16 umol. Ανωμαλίες αυτών των ενζύμων ή ελλείψεις των συμπαραγόντων συνδέονται με συσσώρευση αυτού του συστατικού στο αίμα και αγγειακή βλάβη. Μία ιδιαίτερα διαδεδομένη μετάλλαξη σχετίζεται με τη θερμοασταθή παραλλαγή του ενζύμου MTHFR. Τα άτομα που είναι ομοζυγώτες για τη διαταραχή αυτή διαταραχή έχουν αυξημένα επίπεδα ομοκυστεΐνης. Η συχνότητα του γονιδίου είναι πολύ υψηλή στο γενικό πληθυσμό και έχει συνδεθεί με την αυξημένη προδιάθεση για υπερομοκυστεϊναιμία και φλεβική ή αρτηριακή θρόμβωση. [64] 5.2.2.1.8 Ανεπάρκεια πλασμινογόνου Το πλασμινογόνο είναι μια πρωτεΐνη που είναι παρόν στο αίμα ως αδρανής πρόδρομος της πλασμίνης, μιας πολυδύναμης πρωτεάσης της σερίνης. Το πλασμινογόνο μετατρέπεται σε πλασμίνη με διάσπαση του πεπτιδικού δεσμού Arg561-Val562 από τον 1 από τους 2 ενεργοποιητές, tpa ή uρα. Η ίδια η πλασμίνη μπορεί να διασπάσει το καρβοξυ-τελικό άκρο του πλασμινογόνου ή της πλασμίνης στο σημείο Lys77-Lys78, με αποτέλεσμα την αυξημένη συγγένεια του Lys-πλασμινογόνου ή πλασμίνης με το ινώδες. Η ενεργοποίηση του πλασμινογόνου από το tpa είναι η κύρια οδός που οδηγεί στην λύση των θρόμβων ινώδους, ενώ η ενεργοποίηση του πλασμινογόνου από υρα είναι υπεύθυνη για διαμεσολάβηση ενεργοποίησης του πλασμινογόνου σε συνδυασμό με τις κυτταρικές επιφάνειες και φαίνεται να κινεί τις περισσότερες από τις μη ινωδολυτικές δραστηριότητες της πλασμίνης. [72] Το 1978, οι Aoki και συνεργάτες περιέγραψαν έναν ασθενή ο οποίος φάνηκε να έχει ετερόζυγη ανεπάρκεια πλασμινογόνου και κληρονομική θρομβοφιλία. Έπειτα από την έκθεση αυτή, αναφέρθηκε ένας μεγάλος αριθμός μεμονωμένων περιπτώσεων ή μικρές σειρές περιπτώσεων ετερόζυγη 28

ανεπάρκειας πλασμινογόνου. Πολλές από αυτές τις υποθέσεις αποκαλύφθηκαν κατά τη διάρκεια της αξιολόγησης ρουτίνας των ασθενών που εμφανίστηκαν με υποτροπιάζουσα θρόμβωση. Με βάση αυτές τις εκθέσεις, η αξιολόγηση του πλασμινογόνου περιλήφθηκε σε μια σειρά από μελέτες που αξιολόγησαν την επίπτωση των αιμοστατικών ανωμαλιών μεταξύ των ασθενών που παρουσιάστηκαν με θρομβοεμβολή. Αυτές οι μελέτες υποδεικνύουν ότι η ανεπάρκεια του πλασμινογόνου λαμβάνει χώρα σε 0,5% έως 2,0% των ασθενών με ιστορικό θρόμβωσης, με συχνότητα παρόμοια με εκείνη της ανεπάρκειας αντιθρομβίνης στους ίδιους πληθυσμούς. [72] [73] Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι μία συνέργια μεταξύ 2 ή περισσότερων ελαττωμάτων που σχετίζονται με τη θρομβοφιλία ενισχύει τον κίνδυνο θρόμβωσης. Η ταυτόχρονη επίδραση ετερόζυγης ανεπάρκεια πλασμινογόνου και παράγοντα V Leiden έχει αξιολογηθεί σε έναν μικρό αριθμό οικογενειών. Τα δεδομένα από αυτές τις οικογένειες δεν δείχνουν αυξημένο κίνδυνο θρόμβωσης σε ασθενείς με συνδυασμένη ανεπάρκεια του πλασμινογόνου και παράγοντα V Leiden. Οι παρατηρήσεις αυτές προσθέτουν 29

περαιτέρω υποστήριξη για την έλλειψη θρομβογένεσης με ετερόζυγη ανεπάρκεια πλασμινογόνου. [72] 5.2.2.1.9 Αυξημένος αναστολέας ινωδόλυσης (PAI) Ο ΡΑΙ-1 (Plasminogen activator inhibitor τύπου 1) αναστέλλει τον ιστικό ενεργοποιητή πλασμινογόνου tpa. Τα υψηλά επίπεδα του ΡΑΙ-1 μπορεί να σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο αρτηριακής θρόμβωσης που οφείλεται στην αναστολή της ινωδόλυσης. Συνολικά, τα διαθέσιμα στοιχεία για τη σχέση μεταξύ ΡΑΙ-1 και του κίνδυνου θρόμβωσης είναι αντικρουόμενα. Το 1996, οι Schulman και Wiman μελέτησαν πάνω από 900 σουηδούς ασθενείς, πάνω από 6 μήνες μετά το πρώτο τους θρομβωτικό επεισόδιο και διαπίστωσαν ότι τα αυξημένα επίπεδα του ΡΑΙ-1 συσχετίζονται με τον κίνδυνο υποτροπής. Χρησιμοποιώντας ένα επίπεδο αποκοπής 300 U/mL, 18% των ασθενών με υποτροπή είχαν υψηλότερο επίπεδο σε σύγκριση με το 12% σε χαμηλότερο επίπεδο (Ρ = 0,045). [47] Το 2001, οι Crowther και συνεργάτες εκτέλεσαν μια μελέτησαν 303 καναδούς ασθενείς με πρώτο επεισόδιο φλεβικής θρομβοεμβολής. Διεξήγαγαν ινωδολυτικές δοκιμές και παρακολούθησαν τους ασθενείς για 3 έτη για την περίπτωση υποτροπής. Δεν υπήρχε σαφής διαφορά στα επίπεδα ΡΑΙ-1 στο πλάσμα σε ασθενείς που έκαναν υποτροπή από αυτούς πουδεν έκαναν. Δεν παρατηρήθηκε διαφορά στα επίπεδα μεταξύ των ατόμων που είχαν ιδιοπαθή θρόμβωση σε σύγκριση με εκείνους των οποίων η θρόμβωση σχετιζόταν με άλλο παράγοντα κινδύνου. [47] 5.2.2.2 Επίκτητη θρομβοφιλία Κλινικές συνθήκες όπως το υπεριξώδες, η φλεβική στάση, η παχυσαρκία, μετεγχειρητική κατάσταση, η γήρανση, το τραύμα, η εγκυμοσύνη, οι μυελουπερπλαστικές διαταραχές, ο καρκίνος, τα από του στόματος αντισυλληπτικά, το νεφρωσικό σύνδρομο, η παροξυσμική νυκτερινή αιμοσφαιρινουρία, η συνδεόμενη με θρόμβωση ηπαρίνη, οσακχαρώδης 30

διαβήτης, η θρομβωτική θρομβοπενική πορφύρα, το αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο, η αγγειίτιδα, και υπερομοκυστεϊναιμία έχουν αναγνωριστεί ως παράγοντες κινδύνου για θρόμβωση. Αυτοί οι επίκτητοι παράγοντες κινδύνου για θρομβοφιλία μπορεί να προκαλέσουν για λίγες ημέρες και μήνες ή για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα σε ορισμένες ειδικές περιπτώσεις, αύξηση θρομβωτικής τάση. [48] 5.2.2.2.1 Ηλικία Η φλεβική θρόμβωση εξαρτάται σημαντικά από την ηλικία. Είναι εξαιρετικά ασυνήθιστη στην παιδική ηλικία (1 στις 100.000/έτος) και αυξάνει σε σχεδόν 1%/έτος στην τρίτη ηλικία. Η συχνότητα είναι χίλιες φορές υψηλότερη στην πολύ γηραιούς σε σχέση με τους πολύ νέους. Δεν είναι σαφές γιατί η ηλικία είναι ένας ισχυρός παράγοντας κινδύνου για θρόμβωση. Θα μπορούσε να οφείλεται σε μειωμένη κινητικότητα, μειωμένο μυϊκό τόνο, γήρανση των φλεβών και των βαλβίδων και την απόκτηση των ασθενειών που ενισχύουν τον κίνδυνο. [48] 5.2.2.2.2 Χειρουργική επέμβαση και Τραύμα Το 50% των ασθενών μπορεί να αναπτύξει θρόμβωση ύστερα από μείζονες χειρουργικές επεμβάσεις. Τα περιστατικά φλεβικής θρόμβωσης είναι υψηλά σε πολλαπλά τραύματα, στον τραυματισμό της σπονδυλικής στήλης και της κεφαλής, της πυέλου, του μηριαίου και στα κατάγματα κνημιαίου. Η θρομβοπροφύλαξη μειώνει αυτές τις επιπτώσεις. Διαπιστώθηκε ότι το 18% των ασθενών φλεβικής θρόμβωσης εμφανίζει στο ιστορικό του κάποιας μορφή χειρουργική επέμβαση πριν από την ανάπτυξη της φλεβικής θρόμβωσης. Αυτό σημαίνει ότι η χειρουργική επέμβαση αυξάνει τον κίνδυνο της θρόμβωσης κατά έξι φορές. Όταν αναλύθηκαν 4.000 ασθενείς με την πρώτη φλεβική θρόμβωση, υπήρξε μια τετραπλάσια αύξηση στη συμπτωματική θρόμβωση μετά από ορθοπεδική και μείζονα μη ορθοπεδική χειρουργική επέμβαση. [48] 31

5.2.2.2.3 Στάση Η στάσης είναι μια σημαντική αιτία της φλεβικής θρόμβωσης σε όλες τις περιστάσεις, όπως η παραμονή στο κρεβάτι, τα γύψινα εκμαγεία, τα μεγάλα ταξίδια και η παράλυση όπου η στάση είναι γνωστό ότι δρα ως παράγοντας κινδύνου για θρόμβωση. Η στάση σε καθιστή θέση προσδίδει μεγαλύτερο κίνδυνο από ότι στις άλλες θέσεις. Κατά τη διάρκεια του Δευτέρου Παγκοσμίου Πολέμου στο Λονδίνο, υπήρξε μια εξαπλάσια αύξηση σε πνευμονική εμβολή λίγο μετά τις αεροπορικές επιδρομές καθώς οι άνθρωποι κάθονταν στις ξαπλώστρες στο υπόγειο. Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι η συχνότητα εμφάνισης μειώθηκε μετά την αλλαγή από ξαπλώστρες σε κουκέτες. Νέοι άνθρωποι που κάθονται κοντά στον υπολογιστή για περισσότερες από 12 ώρες την ημέρα, εμφανίζουν μεγάλο κίνδυνο ανάπτυξης DVT, και ονομάζεται "e-θρόμβωση." [48] 5.2.2.2.4 Ταξίδια μεγάλων αποστάσεων Οι πρώτες εκθέσεις για φλεβική θρόμβωση μετά από αεροπορικά ταξίδια μεγάλων αποστάσεων σημειώθηκαν το 1954. Το 1986, μια μελέτη που διεξήχθη στο αεροδρόμιο του Heathrow έδειξε ότι η αίθουσα αφίξεων είχε περισσότερους θανάτους από πνευμονική εμβολή από την αίθουσα αναχωρήσεων ( εξαπλάσιος σχετικός κίνδυνος). Ομοίως, σε μια άλλη μελέτη από το αεροδρόμιο CDG του Παρισιού βρέθηκε 50πλάσια διαφορά στον κίνδυνο μεταξύ των πτήσεων λιγότερο από 2500 χιλιόμετρα και σε αυτά άνω των 10.000 χιλιομέτρων. Μια μελέτη έδειξε ότι τα πρόσφατα αεροπορικά ταξίδια διπλασίαζαν τον κίνδυνο θρόμβωσης και ήταν πάνω από 14φορες αυξημένος σε εκείνους με θρομβοφιλία ή οι γυναίκες που χρησιμοποιούσαν από του στόματος αντισυλληπτικά χάπια (OCPs). Τα ταξίδια σχετίστηκαν με τριπλάσια αύξηση της DVT χωρίς μεγάλη διαφορά στην τρόπο μετακίνησης. [48] 32

5.2.2.2.5 Καρκίνος Η επαναλαμβανόμενη μεταναστευτική θρομβοφλεβίτιδα είναι γνωστό ότι σχετίζεται με κρυφό καρκίνο. Ορισμένοι καρκίνοι παράγουν προπηκτική κατάσταση λόγω της έκκρισης χυμικών παραγόντων, συμπίεση των φλεβών, λιγότερη κινητικότητα και κεντρικών φλεβικών καθετήρων. Περίπου το 10% των ασθενών με κεντρικό φλεβικό καθετήρα αναπτύσσουν συμπτωματική φλεβική θρόμβωση του άνω άκρου. Ο κίνδυνος θρόμβωσης σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα είναι 20 φορές υψηλότερος από το γενικό πληθυσμό. Σε μια σουηδική μελέτη, 19% των ασθενών με φλεβική θρόμβωση είχε μια γνωστή κακοήθεια κατά τη στιγμή της διάγνωσης, ένα επιπλέον 5% διαγνώσθηκε με καρκίνο στο ακόλουθο έτος. Η παρουσία μακρινών μεταστάσεων οδήγησε σε περαιτέρω 20πλάσια αύξηση του κινδύνου θρόμβωσης. Ο συνδυασμός του παράγοντα V Leiden και της γονιδιακής μετάλλαξης του παράγοντα II με τον καρκίνο αυξάνει τον κίνδυνο θρόμβωσης περισσότερο από 12 φορές. [48] 5.2.2.2.6 Από του στόματος αντισυλληπτικά χάπια Το 1959, τα OCPs εισήλθαν στην αγορά και η πρώτη πνευμονική εμβολή σημειώθηκε σε μια νοσοκόμα χρησιμοποιώντας OCPs για την ενδομητρίωση. Αυξάνανε τον κίνδυνο θρόμβωσης δύο έως πέντε φορές. Η δόση οιστρογόνων σε χάπι έχει μειωθεί στα 50-30 μg. Ο απόλυτος κίνδυνος θρόμβωσης σε νεαρές γυναίκες αναπαραγωγικής ηλικίας είναι λιγότερο από 1 ανά 10.000/έτος. Το 1995, υπήρξαν αναφορές που μετρούσαν τον κίνδυνο φλεβικής θρόμβωσης διπλάσιο με τα OCPs τρίτης γενιάς (30 / 10.000 ανά έτος). Οι παχύσαρκοι, οι ηλικιωμένοι και οι θρομβοφιλικοί διατρέχουν μεγαλύτερο κίνδυνο θρόμβωσης με τη χρήση OCPs. Η συγγενής θρομβοφιλία σε συνδυασμό με OCPs μπορεί να αυξήσει σημαντικά τον κίνδυνο θρόμβωσης (> 15 έως 30 φορές). [48] 33

5.2.2.2.7 Κύηση και λοχεία Και στις δύο αυτές φυσιολογικές καταστάσεις, υπάρχει αυξημένος κίνδυνος θρόμβωσης. Αν υπάρχουν και άλλοι επίκτητοι ή κληρονομικοί παράγοντες κινδύνου, η συχνότητα εμφάνισης θρόμβωσης είναι υψηλή. Σε μια μελέτη από τη Σκωτία, 62 φλεβικά θρομβοεμβολικά επεισόδια σημειώθηκαν σε 72.000 τοκετούς. Ο κίνδυνος φλεβικής θρόμβωσης είναι περίπου 1 θρομβωτικό επεισόδιο ανά 1.000 τοκετούς, τουλάχιστον 10-πλάσια αύξηση σε σύγκριση με τις μη έγκυες γυναίκες. Σε μια μελέτη της Σκωτίας, το 12% των γυναικών είχαν ανεπάρκεια αντιθρομβίνης και έτσι αυξανόταν ο κίνδυνος θρόμβωσης. [48] 5.2.2.2.8 Αντιφωσφολιπιδικά αντισώματα Σε θρομβοφιλική μελέτη με ασθενείς με πρωτοεμφανιζόμενο DVT, στο 3.1% των ασθενών και στο 0,9% της ομάδας ελέγχου παρατηρήθηκε ένα αντιπηκτικό λύκου. Τα αντι-β2 GP1 αντισώματα σχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο θρόμβωσης. Οι κληρονομικές και επίκτητες θρομβοφιλικές συνθήκες μπορούν να συνυπάρχουν στον ίδιο ασθενή. Οι ασθενείς με μη διαγνωσμένο καρκίνο που παρουσιάζουν φλεβική θρομβοεμβολή (VTE) μπορεί επίσης να είναι και φορείς θρομβοφιλικών πολυμορφισμών όπως μετάλλαξη του παράγοντα V Leiden ή παραλλαγή της προθρομβίνης. [48] 5.3 Θρομβοεμβολική Νόσος Η φλεβική θρομβοεμβολή (VTE), που περιλαμβάνει την εν τω βάθει φλεβική θρόμβωση (DVT) και/ή πνευμονική εμβολή (ΡΕ), είναι μια συχνή, σοβαρή, δυνητικά θανατηφόρα, αλλά αντιμετωπίσιμη, και οξεία νόσος. Η συχνότητά της στις αναπτυγμένες χώρες είναι υψηλή και επηρεάζουν από 1 έως 2 ανά 1.000 άτομα ανά έτος. Η VTE είναι η τρίτη πιο συχνή καρδιαγγειακή νόσος, μετά από το έμφραγμα του μυοκαρδίου και το εγκεφαλικό επεισόδιο. Ενώ η VTE είναι οξεία ασθένεια, μπορεί να έχει μεταβλητά αποτελέσματα σε πρώιμες και όψιμες φάσεις μετά την αρχική παρουσίαση. Μετά από ένα 34

πρώτο επεισόδιο, η φλεβική θρομβοεμβολή έχει επαναληψημότητα. Αν και η τρέχουσα πρότυπη θεραπεία, η οποία βασίζεται στην άμεση αντιπηκτική αγωγή με ηπαρίνη ή παράγωγα που ακολουθούνται από ανταγωνιστές της βιταμίνης Κ (VKAs), είναι πολύ αποτελεσματική, τα υποτροπιάζοντα επεισόδια VTE ή η επέκταση της νόσου εμφανίζονται σε ένα καθόλου αμελητέο τμήμα των ασθενών ( 4% μετά από DVT), ακόμη και με την παρουσία επαρκούς θεραπείας. Επιπλέον, το όφελος της αντιπηκτικής αγωγής χάνεται μετά τη διακοπή. [74] Οι VTE έχουν επίσης μακροπρόθεσμες, κλινικά σημαντικές συνέπειες. Ένα μακροπρόθεσμο και συχνό αποτέλεσμα της DVT είναι η εμφάνιση του μεταθρομβωτικού συνδρόμου (PTS), μια κατάσταση που επηρεάζει σημαντικά τη νοσηρότητα και την ποιότητα ζωής των ασθενών και οδηγεί σε υψηλό κοινωνικό κόστος. Σε μία ομάδα ασθενών με DVT που παρακολουθήθηκε για δύο χρόνια, ήπια, μέτρια ή σοβαρά σημεία PTS ανιχνεύθηκαν σε 30%, 10%, και 3% αντίστοιχα. Η χρόνια θρομβοεμβολική πνευμονική υπέρταση ανιχνεύθηκε στο 3,8% των ασθενών, δύο χρόνια μετά το οξύ επεισόδιο πνευμονικής εμβολής. [74] 35

6 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 6.1 Εισαγωγή Παρότι ο κληρονομικός παράγοντας αποτελεί ένα μόνιμο και σοβαρό βαθμό κινδύνου, δεν είναι απαραίτητο να υπάρχουν κλινικές εκδηλώσεις. Συνήθως για την εκδήλωση συγκεκριμένης συμπτβματολογίας συνυπάρχει με ένα ή παραπάνω επίκτητα αίτια (π.χ. κύηση και ετεροζυγωτία Leiden). Η πληθώρα των περιπτώσεων αφορά θρομβώσεις σε μέρη όπως το μεσεντέριο, νεφρικά και ηπατικά αγγεία, φλέβες του εγκεφάλου και του οφθαλμού. Για το λόγο αυτό η εργαστηριακή τους διερεύνηση αποτελεί μια ιδιαίτερα δύσκολη διαδικασία που προϋποθέτει ιδιαίτερη εξειδίκευση και κατάρτιση [75]. 6.2 Εργαστηριακές Μέθοδοι Στο σημείο αυτό θα προσπαθήσω να αναλύσω και να επεξηγήσω τους έργαστηριακούς ελέγχους που γίνονται για τον εκάστοτε παράγοντα κινδύνου. Πηξιολογικές μέθοδοι (end point-clotting assays): Προστίθεται θρομβογόνος ουσία και καταγράφεται ο χρόνος σχηματισμού ινώδους το οποίο συνήθως ανιχνεύεται θολωσιμετρικά. Αυτές οι μέθοδοι έχουν σαν τελικό σημείο τη δημιουργία ινώδους. Χρωμογονικές μέθοδοι (chromogenic assays): Χρησιμοποιούνται χρωμογόνα υποστρώματα (ολιγοπεπτίδια, συνθετικά αμίδια ) τα οποία μιμούνται τη συμπεριφορά της προς μέτρηση ουσίας (συνήθως ένζυμα) και φέρουν στο καρβοξυλικό τους άκρο χρωμογόνο ουσία, η οποία παράγει και το προς ανίχνευση χρώμα που μετράται φασματομετρικά. Ανοσολογικές μέθοδοι (immunological assays): Ως βάση έχουν τη σύνδεση αντιγόνου-αντισώματος. Μετράται και καταγράφεται η αύξηση της απορρόφησης (ή μείωση της διαπερατότητας) του φωτός που οφείλεται στη δημιουργία αυτού του συμπλέγματος. Οι πιο συχνές 36

ανοσολογικές μέθοδοι που εφαρμόζονται στον εργαστηριακό έλεγχο της θρομβοφιλίας είναι: o Συγκολλητινοαντιδράσεις (agglutination assays): με εναιωρήματα φυσικών αντιγόνων σε μορφή σωματιδίων latex επενδυμένων με αντιγόνα όπου το αντίσωμα προκαλεί τη συγκόλληση αυτών. o Ανοσονεφελομετρία (immunonephelometry assay): μετράται η σκέδαση του φωτός που προσπίπτει πάνω στο σύμπλοκο αντιγόνου-αντισώματος. Το αντίσωμα συνήθως προστίθεται στη μέθοδο σε περίσσεια προκειμένου να συνδεθεί με όλο το διαθέσιμο αντιγόνο (ουσία προς μέτρηση) και η ένταση του σκεδαζόμενου φωτός αποτελεί συνάρτηση της συγκέντρωσης της προς ανίχνευση παραμέτρου. o Ανοσοθολωσιμετρία (immunoturbidity assay): Η διερχόμενη δέσμη φωτός υφίσταται θόλωση λόγω του σχηματιζόμενου ανοσοσυμπλέγματος. Η θόλωση αυτή καταγράφεται φωτομετρικά. Μέθοδοι μοριακής βιολογίας: Η διασημότερη μέθοδος για την ανίχνευση μεταλλάξεων είναι η PCR (Polymerase Chain Reaction), στην οποία με την χρήση κατάλληλων ανιχνευτών (probes) πραγματοποιείται αντιγραφή της προς διερεύνηση περιοχής και έτσι διευκολύνεται η αναγνώρισή της. Έπειτα με περιοριστικά ένζυμα και ηλεκτροφόρηση αποκόβεται το γονίδιο που μας ενδιαφέρει και τα θραύσματα που προκύπτουν απομονώνονται σε γέλη αγαρόζης [75] [76] [77]. 37

6.3 Εργαστηριακή διερεύνηση θρομβοφιλικών παραγόντων 6.3.1 Παράγοντας V-Leiden Αρχικά εφαρμόζεται η βιολογική μέθοδος: Είναι πηξιολογική μέθοδος βασισμένη στον χρόνο ενεργοποιημένης μερικής θρομβοπλαστίνης (APTT). Η επιλεκτικότητα στη μετάλλαξη V:Q 506 ή άλλες μεταλλάξεις του γονιδίου του Παράγοντα V που καθιστούν την πρωτεΐνη μη απενεργοποιούμενη από την Ενεργοποιημένη Πρωτεΐνη C (ΑΡC) αυξάνεται με κανονικοποίηση των συγκεντρώσεων άλλων πρωτεϊνών του πλάσματος που συμμετέχουν στον σχηματισμό και έλεγχο της θρομβίνης. Προσδιορίζοντας την αντίσταση στην APC, με βάση τον APTΤ παρουσία περίσσειας Factor V Reagent Plasma, αυξάνεται σημαντικά η ευαισθησία και ειδικότητα για τη μετάλλαξη V:Q 506 [78] [79] [77]. Το δείγμα προαραιώνεται με Factor V Reagent Plasma και επωάζεται με αντιδραστήριο APTT για σταθερό χρόνο. Η πήξη αρχίζει με την προσθήκη CaCl 2 σε απουσία και παρουσία APC και μετράται ο χρόνος σχηματισμού θρόμβου. Έπειτα υπολογίζεται ο λόγος των μετρήσεων αυτών [79] [80] [77]. APCR= Για ακόμη μεγαλύτερη ακρίβεια υπολογίζεται και το αντίστοιχο πηλίκο για φυσιολογικό πλάσμα και το τελικό αποτέλεσμα προκύπτει με τη μορφή κανονικοποιημένου λόγου (normalized ratio-nr): NR= / Το μειονέκτημα αυτής της τροποποίησης της μεθόδου είναι ότι δεν είναι ευαίσθητη στις επίκτητες μορφές της αντίστασης στην APC. Φυσιολογικές τιμές της μεθόδου θεωρούνται NR=2.0-2.6 [79] [80] [77]. 38

Επίσης υπάρχει μέθοδος η οποία βασίζεται στον APTT αλλά δεν δίνει αποτελέσματα σε λόγο αλλά σε sec. Στη μέθοδο αυτή η πήξη του αραιωμένου δείγματος (με FV Deficient plasma) πραγματοποιείται υπο την παρουσία πλάσματος με έλλειψη παράγοντα V και δηλητηρίου Crotalus viridis helleri (κροταλίας). Το δηλητήριο αυτό δρά ως ενεργοποιητής του παράγοντα X, ενεργοποιεί την πήξη σε αυτό το επίπεδο και καταργεί την αλληλεπίδραση των παραγόντων που βρίσκονται ψηλότερα στον καταρράκτη της πήξης. Η παράταση του χρόνου πήξης ενός φυσιολογικού πλάσματος υπό την παρουσία ενεργοποιημένης πρωτεϊνης C προκύπτει από την ικανότητά της να αδρανοποιεί τον ενεργοποιημένο παράγοντα V του πλάσματος που εξετάστηκε. Φυσιολογικές τιμές της μεθόδου θεωρούνται >120 sec [79] [80] [77]. Τα δείγματα των ασθενών που βρίσκονται υπό αντιπηκτική αγωγή (κουμαρινικά ή ηπαρίνη), ή που παρουσιάζουν αντιφωσφολιπιδικά αντισώματα, ή με υψηλά επίπεδα παράγοντα II ή VIII δεν είναι κατάλληλα για μέτρηση. Για την περίπτωση της ηπαρίνης μπορεί να προστεθεί στο δείγμα θειϊκή πρωταμίνη που θα εξουδετερώσει την ποσότητα της ηπαρίνης. Όσον αφορά την παρουσία αντιπηκτικών λύκων συνιστάται η αύξηση της αραίωσης ώστε να αποδυναμωθει ο παρεμβαίνων παράγοντας [79] [80] [77]. Σε περίπτωση θετικού αποτελέσματος γίνεται επιβεβαίωση με τη μοριακή μέθοδο. Χρησιμοποιείται η μέθοδος PCR. Η συγκεκριμένη δοκιμασία που περιγράφεται παρακάτω βασίζεται στην τεχνολογία των DNA strips και χωρίζεται σε 3 στάδια: απομόνωση DNA πολλαπλασιασμός (amplification) με τη χρήση επισημασμένων με βιοτίνη ανιχνευτές (biotinylated primers) ανάστροφο υβριδισμό (reverse hybridization). 39

Η διαδικασία υβριδισμού περιλαμβάνει τα εξής στάδια: χημική αποδόμηση των προϊόντων πολλαπλασιασμού υβριδισμός των προϊόντων μονής έλικας επισημασμένων με βιοτίνη σε ανιχνευτές που είναι προσκολλημένοι σε μεμβράνες ισχυρό πλύσιμο προσθήκη συμπλόκου στρεπταβιντίνης/αλκαλικής φωσφατάσης χρώση με τη βοήθεια αλκαλικής φωσφατάσης [78] [77] 6.3.2 Προθρομβίνη G20210A Για τον έλεγχο του πολυμορφισμού του γονιδίου της προθρομβίνης FII G20210A χρησιμοποιείται η μοριακή μέθοδος PCR. Συγκεκριμένα εξάγεται DNA σε ποσότητα 100 ng και χρησιμοποιείται ζεύγος primers PT1 και PT2. Το περιοριστικό ένζυμο που χρησιμοποιείται είναι το Hind III. Παρουσία του πολυμορφισμού κόβει το προϊόν της PCR σε δυο θραύσματα μεγέθους 118bp και 24 bp ενώ σε φυσιολογικά δείγματα αφήνει το προϊόν αυτούσιο (142bp). Εναλλακτικά μπορεί να χρησιμοποιηθεί μέθοδος βασισμένη σε DNA Strips,όπως αυτή αναφέρθηκε για τον παράγοντα V-Leiden [79] [80] [77]. 6.3.3 Πρωτεΐνη S Η διερεύνηση για την ανεπάρκεια της πρωτεΐνης S περιλαμβάνει τόσο τη μέτρηση της ελεύθερης όσο και της ολικής μορφής της, ωστόσο η ελεύθερη θεωρείται πιο αξιόπιστος διαγνωστικός δείκτης [79] [80] [81] [77]. Η λειτουργικότητα της ελεύθερης πρωτεΐνης S υπολογίζεται με ανοσοθολωσιμετρική μέθοδο ανίχνευσης. Η παρουσία της ελεύθερης πρωτεΐνης S προσδιορίζεται με τη μέτρηση της αύξησης της θολερότητας που παράγεται από τη συγκόλληση δύο αντιδραστηρίων latex. Καθαρό C4BP προσροφημένο στο πρώτο αντιδραστήριο latex αντιδρά με την ελεύθερη πρωτεΐνη S του δείγματος παρουσία ιόντων Ca 2+. Η ελεύθερη πρωτεΐνης S που προσκολλάται στο C4BP latex ενεργοποιεί την συγκόλληση με το δεύτερο αντιδραστήριο latex, το οποίο έχει ευαισθητοποιηθεί με μονοκλωνικό 40

αντίσωμα έναντι της ανθρώπινης πρωτεΐνης S. Ο βαθμός της συγκόλλησης είναι ανάλογος της συγκέντρωσης της ελεύθερης πρωτεΐνης S του δείγματος. Φυσιολογικές τιμές θεωρούνται για τους άντρες μεταξύ 74-145% και για τις γυναίκες μεταξύ 54-124% [79] [80] [82] [81]. Η αντιγονικότητα της ελεύθερης πρωτεΐνης S υπολογίζεται με πηξιολογική μέθοδο. Η ενεργή δραστικότητα της πρωτεΐνης S προσδιορίζεται μετρώντας την επιμήκυνση του χρόνου προθρομβίνης παρουσία βόειας θρομβοπλαστίνης, ιόντων ασβεστίου και ενεργοποιημένης πρωτεΐνης C. Η ενεργότητα της πρωτεΐνης S είναι ανάλογη της αύξησης του PT σε ένα πλάσμα ενδεές σε πρωτεΐνη S του οποίου αραιωμένο δείγμα έχει προστεθεί. Η ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C δημιουργείται από την ενεργότητα του πτωχού σε πρωτεΐνη S πλάσματος με Protac. Φυσιολογικές τιμές θεωρούνται μεταξύ 62-145% [79] [80] [82] [81]. Η αντιγονικότητα της ολικής πρωτεΐνης S υπολογίζεται με ποσοτικό προσδιορισμό της ελεύθερης πρωτεΐνης S με τη μέθοδο ELISA τύπου sandwich που ενός σταδίου. Αρχικά η μικροπλάκα επιστρώνεται με μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-total protein S. Το δεύτερο μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της ολικής πρωτεΐνης S συζευγμένο με υπεροξειδάση προστίθεται ταυτόχρονα με το υπό εξέταση δείγμα. Η ολική πρωτεΐνη S δεσμεύεται ταυτόχρονα από το πρώτο μονοκλωνικό αντίσωμα καθώς και από το συζευγμένο (δεύτερο) μονοκλωνικό αντίσωμα, για αυτό και η αντίδραση λέγεται sandwich ενός σταδίου. Στη συνέχεια η συζευγμένη υπεροξειδάση αποκόπτεται με τη δράση της πάνω σε κατάλληλο υπόστρωμα παρουσία υπεροξειδίου του υδρογόνου. Η αντίδραση τερματίζεται με την προσθήκη ισχυρού οξέος και η ένταση του παραγόμενου χρώματος είναι άμεση συνάρτηση της συγκέντρωσης της ολικής πρωτεΐνης S στο εξεταζόμενο δείγμα [79] [80] [82] [81]. Σε περιπτώσεις που οι παρπάνω μέθοδοι δώσουν οριακά παθολογικές τιμές και απαιτείται επιβεβαίωση της χρησιμοποιήται μοριακή μέθοδος. 41

Γενικά αποφεύγεται η μέτρηση ασθενών κατά τη διάρκεια θρομβοεμβολικού επειδοδίου καθώς λόγω της κατανάλωσής της παρατηρούνται ψευδώς χαμηλές τιμές. Εάν ο ασθενής λαμβάνει κουμαρινικά θα πρέπει αυτά να διακόπτονται και να χορηγούνται για λίγες ημέρες Ηπαρίνες Χαμηλού Μοριακού Βάρους (ΗΧΜΒ) [79] [80] [81]. 6.3.4 Πρωτεΐνης C Χρησιμοποιήται χρωμογονική μέθοδος μέτρησης της λειτουργικότητας της πρωτεΐνης η οποία πραγματοποιείται σε δύο στάδια: Επώαση του πλάσματος με ενεργοποιητή της πρωτεΐνης C (Agkistodon C. Contortix) Ποσοτική μέτρηση της πρωτεΐνης C με συνθετικό χρωμογονικό υπόστρωμα. Η παραγόμενη p-na μετράται κινητικά στα 405 nm και είναι ευθέως ανάλογη της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης C στο εξεταστέο δείγμα [79] [80] [82]. Επίσης έχουν αναπτυχθεί δοκιμασίες που ελέγχουν όλο το μηχανισμό της αντιπηκτικής οδού της πρωτεΐνης C (global Protein C assays). Ενδεικτικά αναφέρεται παρακάτω η αρχή μεθόδου μιας τέτοιας δοκιμασίας. Πρόκειται για μία αυτοματοποιημένη χρωμογονική δοκιμασία για την αξιολόγηση της λειτουργίας της αντιπηκτικής οδού μέσω της πρωτεΐνης C σε ανθρώπινο πλάσμα με κιτρικό. Η δοκιμασία χρησιμοποιείται επικουρικά για τη διάγνωση θρομβοφιλικών ανωμαλιών, όπως σε ανεπάρκειες πρωτεΐνης S (PS) και πρωτεΐνη C (PC), παράγοντα V Leiden (FVL) και αντιπηκτικά λύκου (LA) [79] [80] [82] [83]. Με τη δοκιμασία αυτή καθορίζεται η δυσλειτουργία της αντιπηκτικής οδού της πρωτεΐνης C, μετρώντας την ενδογενή δραστικότητα της πρωτεΐνης C στο πλάσμα του ασθενούς, ως ποσοστό αναστολής της πρωτεΐνης C με βάση το Protac (PiCi%) [79] [82] [83]. 42

Κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας, το δείγμα πλάσματος αραιώνεται με το Diluent και εξετάζεται ως δύο ξεχωριστές ισοποσότητες.η μία ισοποσότητα επωάζεται με το Activator A (με Protac) και η άλλη ισοποσότητα επωάζεται με Activator B (χωρίς Protac).Η παραγωγή θρομβίνης και στις δύο ισοποσότητες, εκκινείται με την προσθήκη της θρομβοπλαστίνης. Η δραστικότητα της θρομβίνης προσδιορίζεται ποσοτικά μετά την πρόσθεση χρωμογονικού υποστρώματος, με αύξηση της οπτικής πυκνότητας στα 405nm.Το τελικό αποτέλεσμα της δοκιμασίας, υπολογίζεται ως PiCi%= 100 Προσδιορίζεται τιμή κατωφλίου και δείγματα με τιμές κάτω του κατωφλίου είναι παθολογικά είτε για την πρωτεΐνη C, πρωτεΐνη S ή για την αντίσταση στην ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C και τα αντιπηκτικά λύκου [79] [82] [83]. Σε περίπτωση που οι παραπάνω μέθοδοι δώσουν οριακά παθολογικές τιμές και επομένως απαιτείται επιβεβαίωση της διάγνωσης είναι ιδιαίτερα χρήσιμη η μοριακή διάγνωση. Παρομοίως με την περίπτωση της πρωτεΐνης S θα πρέπει να αποφεύγεται η μέτρηση σε ασθενείς κατά τη διάρκεια του θρομβοεμβολικού επειδοδίου καθώς λόγω της κατανάλωσης της παρατηρούνται ψευδώς χαμηλές τιμές. Εάν ο ασθενής λαμβάνει κουμαρινικά θα πρέπει αυτά να διακόπτονται και να χορηγούνται για λίγες ημέρες Ηπαρίνες Χαμηλού Μοριακού Βάρους (ΗΧΜΒ) [79] [80] [83]. 6.3.5 Ανεπάρκεια αντιθρομβίνης Για την εργαστηριακή διερεύνηση της ανεπάρκειας προθρομβίνης μετράται τόσο η δραστικότητα όσο και η αντιγονικότητα της αντιθρομβίνης. Η μέτρηση της λειτουργικότητας γίνεται με χρωμογονική και πηξιολογική μέθοδο, ωστόσο στην πράξη συνήθως προτιμάται η χρωμογονική η οποία βασίζεται στην ακόλουθη μεθοδολογία: Επώαση του πλάσματος με περίσσεια θρομβίνης παρουσία ηπαρίνης. 43

Η εναπομείνουσα ποσότητα της θρομβίνης μετράται μέσω της αμιδολυτικής δράσης στο χρωμογενές υπόστρωμα και με την απελευθέρωση της p-na στα 405 nm [84] [79] [85]. Αφού η ποσότητα της θρομβίνης που εξουδετερώνεται στο 1ο στάδιο είναι ανάλογη της ποσότητας της αντιθρομβίνης στο πλάσμα του ασθενούς προκύπτει ότι η εναπομείνουσα ποσότητα της θρομβίνης στο 2ο στάδιο είναι αντιστρόφως ανάλογη της ποσότητας της αντιθρομβίνης. Φυσιολογικές τιμές θεωρούνται 80-120 % [84] [79] [85]. Μετρήσεις που πραγματοποιούνται κατά τη διάρκεια οξέος θρομβοεμβολικού επεισοδίου δεν θεωρούνται αξιόπιστες καθώς λόγω της κατανάλωσης της αντιθρομβίνης τα επίπεδα της εμφανίζονται ψευδώς χαμηλά. Για αυτό το λόγο προτείνεται η μέτρηση των επιπέδων 2-3 εβδομάδες μετά το επεισόδιο και μετά το τέλος της ηπαρινοθεραπείας ή των κουμαρινικών. Σε περίπτωση που επιβάλλεται να γίνει μέτρηση σε ασθενή που λαμβάνει ηπαρίνη, μπορεί αυτή να εξουδετερωθεί με τη προσθήκη θειϊκής πρωταμίνης. Φυσιολογικές τιμές θεωρούνται από 80-120 %. Οι ετεροζυγώτες παρουσιάζουν τιμές <65% ή σε κάποιες περιπτώσεις μεταξύ 65-75% [84] [79] [85]. Σε περιπτώσεις που οι παραπάνω μέθοδοι δώσουν οριακά παθολογικές τιμές και επομένως απαιτείται επιβεβαίωση της διάγνωσης γίνεται ανάλυση του DNA με τη μέθοδο DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) [84] [79] [85]. 44

6.3.6 Μετρήσεις παραγόντων VIII και XII 6.3.6.1 Παράγοντας VIII Υπάρχουν τρεις μέθοδοι εργαστηριακής εκτίμησης των επιπέδων του παράγοντα VIII: 1. Πηξιολογική μέθοδος ενός σταδίου: Προστίθεται στις αραιώσεις του δείγματος, φυσιολογικό πλάσμα ενδεές σε παράγοντα VIII (<1%). Αυτό διορθώνει τυχόν ελλείψεις σε άλλους παράγοντες του δείγματος και στη συνέχεια αντιδραστήριο APTT και με την προσθήκη CaCl 2 καταγράφεται ο χρόνος σχηματισμού του θρόμβου. 2. Πηξιολογική μέθοδος δύο σταδίων: Προστίθεται αρχικά στις αραιώσεις του δείγματος αντιδραστήριο APTT και ιόντα Ca ++ και γίνεται επώαση στου 37 C. Στη συνέχεια προστίθεται φυσιολογικό πλάσμα ενδεές σε παράγοντα VIII και ιόντα Ca ++ και καταγράφεται ο χρόνος πήξης. 3. Χρωμογονική μέθοδος: Παρουσία ασβεστίου και φωσφολιπιδίων,ο παράγων X ενεργοποιείται σε παράγοντα Xa από τον παράγοντα IXa. Αυτή η παραγωγή υποκινείται ισχυρά από τον παράγοντα VIII, ο οποίος μπορεί να θεωρηθεί ως συμπαράγοντας σ αυτή την αντίδραση. Με τη χρησιμοποίηση βέλτιστης ποσότητας Ca 2+ και φωσφολιπιδίων και με περίσσεια παραγόντων IXa και X, ο ρυθμός της ενεργοποίησης του παράγοντα X εξαρτάται αποκλειστικά από την ποσότητα του παράγοντα VIII. Ο παράγοντας Xa υδρολύει το κατάλληλο χρωμογονικό υπόστρωμα με συνέπεια την απελευθέρωση της χρωμογονικής ομάδας, pna (παρανιτροαναλίνη). Το χρώμα κατόπιν μετράται φωτομετρικά στα 405 nm. Ο παραγόμενος παράγοντας Xa και ως αποτέλεσμα η ένταση του χρώματος είναι ανάλογα προς την δραστικότητα του παράγοντα VIII στο δείγμα. [79] [77] Στην πράξη εφαρμόζεται συνήθως η πηξιολογική μέθοδος του ενός σταδίου καθώς είναι πιο απλή και οικονομική, ενώ η αντίστοιχη των δυο σημείων αν 45

και παρακάμπτει το πρόβλημα της ενεργοποίησης του παράγοντα κατά την αιμοληψία, είναι στην πράξη ασύμφορη και περίπλοκη. Η χρωμογονική μέθοδος θεωρείται η πιο αξιόπιστη από τις τρεις. Φυσιολογικές τιμές: 50-150% [79] [77]. 6.3.6.2 Παράγοντας XII Η ενεργότητα του παράγοντα XII σε πλάσμα ασθενούς προσδιορίζεται με την εξέταση ενός τροποποιημένου ενεργού χρόνου μερικής θρομβοπλαστίνης (APTT). Το πλάσμα του ασθενούς αραιώνεται και προστίθεται σε πλάσμα ενδεές σε παράγοντα XII. Η διόρθωση του χρόνου πήξης του ενδεούς πλάσματος είναι ανάλογος της συγκέντρωσης (% ενεργότητα) αυτού του παράγοντα, στο πλάσμα του ασθενούς, παρεμβαλλόμενη από την καμπύλη βαθμονόμησης.φυσιολογικές τιμές: 50-150% [79] [77] 6.3.7 Υπερομοκυστεϊναιμία/μετάλλαξη MTHFR Τα επίπεδα της ολικής ομοκυστεΐνης (thcy) μετρώνται συνήθως με τις παρακάτω μεθόδους: Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC-High Performance Liquid Chromatography) Μικρο-ELISA Πολωμένος ανοσοφθορισμός (FPIA-Fluorescence polarization immunoassay) Τριχοειδή ηλεκτροφόρηση (CE-Capillary Electrophoresis). Μέθοδοι latex Οι προαναφερθέντες μέθοδοι εφαρμόζονται είτε σε δείγματα ασθενών σε ορό, ή πλάσμα με EDTA ή πλάσμα με ηπαρίνη [86] [87] [77]. Θα αναπτυχθεί σύντομα η μέθοδος FPIA που χρησιμοποιείται και πιο συχνά, η οποία πραγματοποιείται στα ακόλουθα στάδια: 46

Αναγωγή μίγματος ομοκυστείνης, δισουλφιδικών, και δεσμευμένων μορφών ομοκυστεΐνης προκειμένου να δημιουργηθεί η ελεύθερη ομοκυστεΐνη. Ενζυματική μετατροπή της ελεύθερης ομοκυστεΐνης σε S-αδενοσυλ-Lομοκυστεΐνη (SAH) από την SAH υδρολάση (SAHH) παρουσία περίσσειας αδενοσίνης. Προστίθενται αντι-sah μονοκλωνικό αντίσωμα καθώς και σεσημασμένος φθορίζων ιχνηθέτης ο οποίος συναγωνίζεται με την SAH παρούσα στο δείγμα για τις θέσεις στο μόριο του μονοκλωνικού αντισώματος. Μετράται η ένταση του πολωμένου φωτός φθορισμού, η οποία είναι αντιστρόφως ανάλογη της συγκέντρωσης της HCY στο δείγμα [86] [87]. Η FPIA είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη μέθοδος, με υψηλή αξιοπιστία και επαναληπτικότητα (CV<5%) [86] [87] [77]. Ειδικότερα για τις μεθόδους Latex, αυτές έχουν την ίδια αρχή με την FPIA, με τη διαφορά ότι στο τελευταίο στάδιο προστίθενται αντι-sah αντισώματα προσκολλημένα σε μικροσωματίδια πολυστερένιου καθώς και συζευγμένο- SAC. Η SAH παρούσα στο πλάσμα συναγωνίζεται με το συζευγμένο SAC (S- Adenosyl-Cysteine) για να προσκολληθούν πάνω στα αντισώματα. Απουσία SAH στο πλάσμα πραγματοποιείται συγκόλληση μεταξύ συζευγμένου- SAC και αντι-sah αντισωμάτων, ενώ παρουσία SAH δεν πραγματοποιείται συγκόλληση. Ο βαθμός συγκόλλησης είναι αντιστρόφως ανάλογος της συγκέντρωσης της ολικής ομοκυστεΐνης στο δείγμα και καθορίζεται μετρώντας τη μείωση της έντασης του διερχόμενου φωτός εξαιτίας των συσσωμάτων. Μέχρι πρόσφατα αυτή η μέθοδος μπορούσε να εφαρμοστεί μόνο σε ορό ή πλάσμα με EDTA ή ηπαρίνη. Πλέον εφαρμόζεται και σε πλάσμα με κιτρικό με πολύ καλά αποτελέσματα. Οι φυσιολογικές τιμές υπολογίζονται στα 5-15 μmol/l [86] [87] [77]. 47

Γιατο μοριακό έλεγχο χρησιμοποιείται η μέθοδος PCR για την ανίχνευση των πολυμορφισμών MTHFR C677T (αντικατάσταση της κυτοσίνης από θυμίνη στη θέση 677 του γονιδίου που κωδικοποιεί το ένζυμο) και A1298C (πιο σπάνια). Η μέθοδος είναι παρόμοια με αυτή που περιγράφηκε για τον FV- Leiden [86] [87] [77]. 6.3.8 Ανεπάρκεια πλασμινογόνου Συνήθως προτιμάται η μέτρηση της λειτουργικότητας με χρωμογονική μέθοδο, η οποία πραγματοποιείται σε δύο στάδια: Προστίθεται περίσσεια στρεπτοκινάσης στο υπό εξέταση δείγμα. Η στρεπτοκινάση δημιουργεί σύμπλοκο με το πλασμινογόνο το οποίο έχει παρόμοια δράση με την πλασμίνη Η ποσότητα του συμπλέγματος μετράται στα 405 nm με την απελευθέρωση της p-na [79] [77]. H μέθοδος δεν είναι ευαίσθητη στην παρουσία αναστολέων στο πλάσμα. Φυσιολογικές τιμές θεωρούνται 72-127% [79] [77]. 6.3.9 Αυξημένος αναστολέας ινωδόλυσης PAI-1 (Plasminogen activator inhibitor-1) Κατα την εργαστηριακή διερεύνηση του PAI-1 υπολογίζεται τόσο η αντιγονικότητα όσο και η λειτουργικότητα. Υπάρχουν αμιδολυτικές (χρωμογόνες) και ανοσοενζυμικές (ELISA) μέθοδοι και για τις δυο παραμέτρους. Συνήθως η μέτρηση της λειτουργικότητας γίνεται με χρωμογονική μέθοδο η οποία πραγματοποιείται σε τρία στάδια: Επώαση αναραίωτου πλάσματος ασθενούς με μια σταθερή και γνωστή ποσότητα ουροκινάσης 48

Η εναπομείνασα ποσότητα ουροκινάσης δρα στο προστιθέμενο πλασμινογόνο παρουσία αναστολέων α2-αντιπλασμίνης και α2- μακροσφαιρίνης και παράγεται πλασμίνη Καθορισμός της αμιδολυτικής δράσης της παραγόμενης πλασμίνης (από την απελευθέρωση της p-na στα 405 nm) στο χρωμογενές υπόστρωμα [88] [77]. H ποσότητα της παραγόμενης πλασμίνης είναι αντιστρόφως ανάλογη με τα επίπεδα του PAI-1 στο εξεταζόμενο δείγμα. Φυσιολογικές τιμές θεωρούνται < 10 U/mL [88] [77]. Η κύρια μέθοδο εργαστηριακής διερεύνησης του PAI-1 είναι μοριακή και γίνεται με τη μέθοδο PCR όπως αυτή περιγράφτηκε για τον FV-Leiden [88] [77]. 6.3.10 Δυσινωδογοναιμία Για την εργαστηριακή διερεύνηση της δυσινωδογοναιμίας χρησιμοποιούνται οι ακόλουθες πηξιολογικές μέθοδοι: Χρόνος θρομβίνης: το ινωδογόνο του δείγματος μετατρέπεται σε ινική με την προσθήκη καθαρής βόειας θρομβίνης και μετράται ο χρόνος που απαιτείται για τον σχηματισμό θρόμβου. Φυσιολογικές τιμές: 11-18 sec. Χρόνος ρεπτιλάσης: Η ρεπτιλάση μετατρέπει το ινωδογόνο σε ινώδες με την απελευθέρωση του ινωδοπεπτιδίου Α από την αλυσίδα Αα ενώ αφήνει ανεπηρέαστη την αλυσίδα Ββ. Παρουσία προκαθορισμένης ποσότητας ρεπτιλάσης ένα φυσιολογικό πλάσμα θα πήξει σε συγκεκριμένο και σταθερό χρόνο. Σε αντίθεση με τη θρομβίνη, η ρεπτιλάση δεν επηρεάζεται από ηπαρίνη, αναστολείς της θρομβίνης (ιρουδίνη), ηπαρινοειδή. Για αυτό το λόγο θεωρείται κατάλληλη για την 49

εκτίμηση του σχηματισμού ινώδους σε ηπαρινισμένα δείγματα. Φυσιολογικές τιμές: <20 sec [79] [77]. 6.3.11 Αντιφωσφολιπιδικό Σύνδρομο (APS) Στην πρώτη γραμμή διερεύνησης επιλέγεται η μέτρηση του APTT με αντιδραστήριο ευαίσθητο στα αντιπηκτικά λύκου όπως π.χ. αντιδραστήριο που έχει ως ενεργοποιητή πυρίτιο και συνθετικά φωσφολιπίδια ή εκχύλισμα εγκεφαλικού ιστού κουνελιού ως πηγή φωσφολιπιδίων. Σε περίπτωση που υπάρχει παράταση με αυτή τη μέθοδο γίνεται περαιτέρω διερεύνηση με πιο ειδικές δοκιμασίες [89] [90]. 1. Αντιπηκτικά λύκου (LA) Έχουν αναπτυχθεί διάφορες ειδικές μέθοδοι για τον προσδιορισμό των LA που βασίζονται στον PT και στον APTT. Ενδεικτικά αναφέρονται οι εξής: o Kaolin Clotting Time (KCT)ή Silica Clotting Time (SCT) o Dilute Prothrombin Test (dpt) o Pletelet Neutralization procedure (PNP) o Dilute Russel s Viper Venom Time (drvvt) o Textarin to ecarin ratio (T/E ratio) [91] [92] [92] H πιο συχνή μέθοδο είναι η drvvt κατά την οποία δηλητήριο οχιάς Russell ενεργοποιεί τον παράγοντα X παρουσία ασβεστίου, που πυροδοτεί τον καταρράκτη της πήξης από τον παράγοντα Χ και κάτω και εξαλείφει την επίδραση των παραγόντων πήξης που ενεργοποιούνται πριν από τον X. Συνεπώς η δοκιμασία αυτή δεν επηρεάζεται από τις ανωμαλίες του παράγοντα επαφής και από ελλείψεις ή ανασταλτές των παραγόντων VIII και IX [91] [92]. 50

H διαδικασία πραγματοποιείται σε δύο στάδια: Κατατοπιστικό (screening) όπου χρησιμοποιείται αντιδραστήριο με χαμηλή συγκέντρωση φωσφολιπιδίων, γεγονός που παρατείνει το χρόνο πήξης Επιβεβαιωτικό(confirmatory) όπου χρησιμοποιείται αντιδραστήριο με υψηλή συγκέντρωση φωσφολιπιδίων που εξουδετερώνουν τα LA και επομένως ο χρόνος πήξης βραχύνεται [91] [92]. Το τελικό αποτέλεσμα εκφράζεται σε Ratio Screen: Ratio Screen= Αν το Ratio Screen>1.2 τότε υπάρχει υποψία παρουσίας LA.Πραγματοποιείται και το Ratio Confirm: Ratio Confirm= Και στο τέλος υπολογίζεται το normalized Ratio (κανονικοποιημένος λόγος): Normalized Ratio = Φυσιολογικές τιμές θεωρούνται μεταξύ 0.8-1.2 (Normalized ratio-νr). Εάν ΝR=1.2-1.5 τότε υπάρχει μέτρια παρουσία LA Εάν ΝR=1.5-1.8 τότε υπάρχει ισχυρή παρουσία LA 2. Αντικαρδιολιπίνες (ACA) Για τον προσδιορισμό των ACA χρησιμοποιείται ημιποσοτική μέθοδος ELISΑ που ανιχνεύει ACA τύπου IgG και IgM. Σε μια μικροπλάκα που έχει επικαλυφθεί με υψηλά αμιγή βόεια καρδιολιπίνη προστίθεται μέχρι κορεσμού β2-γλυκοπρωτείνη που αποτελεί συμπαράγοντα για τη σύνδεση των ACA. Με 51

αυτό τον τρόπο η μέθοδος δεν εξαρτάται από την ενδογενή ποσότητα της β2- γλυκοπρωτείνης στο εξεταζόμενο δείγμα. Στη συνέχεια προστίθενται αραιώσεις του δείγματος και των controls και επωάζονται. Εάν υπάρχουν στο δείγμα αντι-καρδιολιπίνες αυτές θα σχηματίσουν σύμπλοκο αντιγόνουαντισώματος. Κατόπιν τα προστιθέμενα αντί-ανθρώπινα IgG, και IgM αντισώματα αίγας συζευγμένα με υπεροξειδάση αγριοραπανίδας συνδέονται με αυτά τα σύμπλοκα. To συζευγμένο ένζυμο (υπεροξειδάση) αποκαλύπτεται με τη δράση του πάνω σε υπόστρωμα παρουσία υπεροξειδίου του υδρογόνου. Η αντίδραση τερματίζεται με την προσθήκη ισχυρού οξέος και η ένταση του παραγόμενου χρώματος είναι ευθέως ανάλογη μα τη συγκέντρωση των ACA [89] [90]. 3. Αντισώματα έναντι της β2-γλυκοπρωτεΐνης Ι (β2-gpi). Για τον προσδιορισμό των IgM και IgG αντισωμάτων έναντι της β2-gpi χρησιμοποιείται ημι-ποσοτική μέθοδος ELISA. Σε μια μικροπλάκα που έχει επικαλυφθεί με υψηλά αμιγής ανθρώπεια β2-γλυκοπρωτεΐνη Ι προστίθενται αραιώσεις του δείγματος και των controls και ακολουθεί επώαση. Εάν υπάρχουν στο δείγμα αντι-β2-gpi αντισώματα αυτές θα σχηματίσουν σύμπλοκο αντιγόνου-αντισώματος. Κατόπιν τα προστιθέμενα αντί-ανθρώπινα IgG, και IgM αντισώματα αίγας συζευγμένα με υπεροξειδάση αγριοραπανίδας συνδέονται με αυτά τα σύμπλοκα. To συζευγμένο ένζυμο (υπεροξειδάση) αποκαλύπτεται με τη δράση του πάνω σε υπόστρωμα παρουσία υπεροξειδίου του υδρογόνου. Η αντίδραση τερματίζεται με την προσθήκη ισχυρού οξέος και η ένταση του παραγόμενου χρώματος είναι ευθέως ανάλογη με τη συγκέντρωση των αντι-β2-gpi αντισωμάτων [89] [90]. Παράταση στον PT και APTT, παρατηρείται και σε περίπτωση αναστολέα έναντι παράγοντα πήξης ή σε περίπτωση ανεπάρκειας σε παράγοντα. Καθώς είναι σημαντικό να υπάρξει σαφής διαχωρισμός μεταξύ αυτών των καταστάσεων προτείνεται να γίνεται ανάμιξη με pool αναφοράς σε αναλογία 52

1:1 και να μετρώνται οι χρόνοι PT και APTT τόσο άμεσα όσο και μετά από 2ωρη επώαση στους 37 C [89] [90]. Εάν διορθωθεί η παράταση τόσο άμεσα όσο και μετά τη 2ωρη επώαση τότε υπάρχει ανεπάρκεια παράγοντα Εάν δεν διορθωθεί ούτε άμεσα ούτε μετά από τη 2ωρη επώαση τότε υπάρχει ένδειξη LA Εάν διορθωθεί άμεσα αλλά όχι μετά τη 2ωρη επώαση τότε υπάρχει αναστολέας έναντι παράγοντα πήξης [80] [90]. 6.4 Ποσοστά παθολογικών ευρημάτων Κατά την παρούσα εργασία μελετήθηκαν 50 περιστατικά θρομβοφιλίας τα οποία και θα αναλύσουμε παρακάτω. Στο επόμενο διάγραμμα βλέπουμε τα συνολικά ποσοστά των παθολογικών τιμών των δειγμάτων ανα εξέταση: 60 50 40 30 20 10 0 15,6 15,6 ΠΟΣΟΣΤΑ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΩΝ ΤΙΜΩΝ ΣΤΟ ΣΥΝΟΛΟ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ (ΑΝΑ ΕΞΕΤΑΣΗ) 29,4 33,3 11,7 5,8 3,9 3,9 1,9 7,8 41,17 7,8 3,9 1,9 7,8 5,8 37,25 54,9 7,8 53

Στο επόμενο διάγραμμα βλέπουμε τα ποσοστά των παθολογικών τιμών στα δείγματα με ηπατοπάθειες: Στη συνέχεια φαίνονται τα ποσοστά των παθολογικών τιμών στα δείγματα με στεφανιαία νόσο: ΣΤΕΦΑΝΙΑΙΑ ΝΟΣΟΣ ΠΟΣΟΣΤΑ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΩΝ ΤΙΜΩΝ ΑΝΑ ΕΞΕΤΑΣΗ 80,0 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 0,0 14,3 42,9 57,1 14,3 0,0 14,3 14,3 0,0 0,0 0,0 71,4 14,3 0,0 0,0 14,3 42,9 42,9 0,0 54

Παρακάτω φαίνονται τα ποσοστά των παθολογικών τιμών στα δείγματα με θρόμβωση: Στο επόμενο διάγραμμα βλέπουμε τα ποσοστά των παθολογικών τιμών στα δείγματα με εμφάνιση εγκεφαλικών επισοδείων: 55

Στο παρακάτω διάγραμμα βλέπουμε τα ποσοστά των παθολογικών τιμών στα δείγματα με ιστορικό μίας ή περισσότερων αποβολών: Στο παρακάτω διάγραμμα βλέπουμε τα ποσοστά των παθολογικών τιμών στα δείγματα με ιστορικό πνευμονική εμβολής: 56

Στο παρακάτω διάγραμμα βλέπουμε τα ποσοστά των παθολογικών τιμών στα δείγματα στα οποία έγινε προληπτική διερεύνηση για λήψη αντισυλληπτικών φαρμάκων: 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 33,3 ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΓΙΑ ΛΗΨΗ ΑΝΤΙΣΥΛΛΗΠΤΙΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΠΟΣΟΣΤΑ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΩΝ ΤΙΜΩΝ ΑΝΑ ΕΞΕΤΑΣΗ 0,0 33,3 0,0 0,0 0,0 33,3 33,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 33,3 0,0 0,0 66,7 33,3 6.5 Συμπεράσματα Από τα αποτελέσματα της έρευνας φαίνεται να υπάρχει συσχετισμός των παθολογικών αποτελεσμάτων του PT με Budd-Chiary, θρόμβωση και αποβολές, του aptt με Budd-Chiary, στεφανιαία νόσο, θρόμβωση και εγκεφαλικό επεισόδιο, του ινωδογόνου και των D.Dimers με όλες τις παθήσεις, των αιμοπεταλίων με στεφανιαία νόσο, θρόμβωση και πνευμονική εμβολή, της πρωτεϊνης C με Budd-Chiary και θρόμβωση, της πρωτεϊνης S free με Budd-Chiary και στεφανιαία νόσο ενώ της πρωτεϊνης S clot μόνο με στεφανιαία νόσο, της αντιθρομβίνης ΙΙΙ με Budd-Chiary, του πλασμινογόνου με Budd-Chiary και θρόμβωση, της ομοκυστεϊνης με όλες τις ασθένεις πλην της στεφανιαίας νόσου, των αντιπηκτικών λύκου με Budd-Chiary, στεφανιαία νόσο, εγκεφαλικό επεισόδιο και πνευμονική εμβολή, των αντικαρδιολιπινικών αντισωμάτων με Budd-Chiary και στεφανιαία νόσο και των antiβ2 με Budd- Chiary. 57