ΤΓΚΡΙΣΙΚΗ ΜΕΛΕΣΗ ΤΠΟΨΗΦΙΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΑΦΟΡΑ ΓΙΑ ΣΗΝ ΠΡΟΣΤΠΟΠΟΙΗΗ ΣΗ ΕΚΦΡΑΗ mrna ΜΕ REAL-TIME RT-PCR Ε ΤΓΙΕ ΚΑΙ ΦΛΕΓΜΑΙΝΟΝ ΠΑΧΤ ΕΝΣΕΡΟ

ΤΓΚΡΙΣΙΚΗ ΜΕΛΕΣΗ ΤΠΟΨΗΦΙΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΝΑΦΟΡΑ ΓΙΑ ΣΗΝ ΠΡΟΣΤΠΟΠΟΙΗΗ ΣΗ ΕΚΦΡΑΗ mrna ΜΕ REAL-TIME RT-PCR Ε ΤΓΙΕ ΚΑΙ ΦΛΕΓΜΑΙΝΟΝ ΠΑΧΤ ΕΝΣΕΡΟ Μπάμιασ Γ. 1, Γοφκοσ Δ. 1, 2, Λαοφδθ E. 1, Γκίηθσ M. 1, Σιακαβζλλασ Σ.Η. 1, Δαΐκοσ Γ. Λ. 1,2 Λαδάσ Σ. Δ. 1 1 Α Προπαιδευτικι Πακολογικι Κλινικι 2 Ερευνθτικό Εργαςτιριο Λοιμώξεων, Λαϊκό Νοςοκομείο, Ιατρικι Σχολι Πανεπιςτιμιου Ακθνών

Ειςαγωγι Μελζτθ ζκφραςθσ mrna γονιδίων-ςτόχων ςτον εντερικό βλεννογόνο ςθμαντικι για τον κακοριςμό του ανοςοφαινότυπου. Προτυποποίθςθ τθσ ζκφραςθσ με βάςθ τθν ζκφραςθ γονιδίων αναφοράσ Επικυμθτι θ ςτακερι ζκφραςθ του γονιδίου αναφοράσ ςε φυςιολογικζσ και πακολογικζσ καταςτάςεισ Διαφορζσ ζκφραςθσ μεταξφ ιςτϊν Απουςία ςυγκριτικισ μελζτθσ γονιδίων αναφοράσ για τον εντερικό βλεννογόνο

κοπόσ τθσ μελζτθσ φγκριςθ υποψθφίων γονιδίων αναφοράσ (housekeeping genes) για τον προςδιοριςμό ζκφραςθσ mrna ςτον βλεννογόνο του παχζοσ εντζρου ςε φυςιολογικζσ ςυνκικεσ και ςε φλεγμονϊδεισ καταςτάςεισ Επιλογι γονιδίων με τθ βζλτιςτθ απόδοςθ

Μεκοδολογία Αςκενείσ 6 αςκενείσ με ενεργό Ελκϊδθ Κολίτιδα 6 αςκενείσ με ενεργό νόςο Crohn παχζοσ εντζρου 4 αςκενείσ με άλλα φλεγμονϊδθ νοςιματα παχζοσ εντζρου 10 υγιείσ μάρτυρεσ (αρνθτικι screening κολονοςκόπθςθ) Τλικό Ενδοςκόπθςθ κατωτζρου Πεπτικοφ Λιψθ ενδοςκοπικϊν βιοψιϊν με λαβίδα τφπου Jumbo

Μεκοδολογία Απομόνωςθ RNA Ομογενοποίθςθ ιςτοφ (Rotor stator) Απομόνωςθ ολικοφ RNA (Ambion, Pure Link RNA Mini Kit) Μζτρθςθ ςυγκζντρωςθσ RNA Ποιοτικόσ ζλεγχοσ RNA Επϊαςθ με DNAse

Ποιοτικόσ Ζλεγχοσ RNA ζλεγχοσ ακεραιότθτασ ζλεγχοσ κακαρότθτασ 28s 18s (-) μάρτυρεσ RNA not treated RNA treated (+) μάρτυρεσ

Μεκοδολογία χεδιαςμόσ εκκινθτϊν (Primer Design) Λογιςμικά ςχεδιαςμοφ primers (BLAST, primer3) Κριτιρια επιλογισ Μζγεκοσ 18-27bp Ποςοςτό GC βάςεων 40%-60% Θερμοκραςία αποδόμθςθσ (Tm) 60 0 C ( 5 0 C μεταξφ ηευγϊν) Επαλικευςθ αλλθλουχίασ μζςω BLAST, PCR και ανάλυςθσ αλλθλουχίασ βάςεων (DNA sequencing) Μζγεκοσ τμιματοσ ενίςχυςθσ 100-250bp Αποφυγι ετεροδιμερϊν, χαμθλισ πολυπλοκότθτασ περιοχϊν DNA, αναντιςτοιχίασ DNA primer Intron spanning or exon to exon junction Αποφυγι ςθμειακϊν μεταλλάξεων (SNPs)

Real-time RT-PCR φνκεςθ ςυμπλθρωματικοφ DNA (cdna) (Roche,Transcriptor High Fidelity cdna synthesis kit) 500 ng RNA υνκικεσ Real-Time PCR Μεκοδολογία 1:10 αραίωςθ, για δθμιουργία καμπφλθσ αναφοράσ 5 ςθμείων εισ τριπλοφν 95 0 C for 3 95 0 C for 15 65 0 C for 60 x 40

Μεκοδολογία Επιλογι υποψθφίων γονιδίων αναφοράσ (reference genes)

Μεκοδολογία Κριτιρια απόδοςθσ υποψθφίων γονιδίων αναφοράσ 1. Αποτελεςματικότθτα ενίςχυςθσ qpcr 90-110% 2. υντελεςτισ προςδιοριςμοφ (R 2 ) 99% 3. τακερι απόκλιςθ (SD) μεταξφ των ατομικϊν threshold cycles (Ct) των δειγμάτων <1 4. Μθ ςτατιςτικά ςθμαντικι διαφορά μεταξφ φυςιολογικϊν μαρτφρων και δειγμάτων από φλεγμονϊδθ νοςιματα

Αποτελζςματα Όλα τα γονίδια που εξετάςκθκαν εμφάνιςαν RT- PCR Efficiency 90-110% και R 2 99%

GAPDH ACTB B2M PPIA RPLP0 POLR2A RPS9 GUSB ABL1 HPRT1 Standard deviation 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Αποτελζςματα Γονίδια με ςτακερι απόκλιςθ (SD) μεγαλφτερθ από 1 Cycle threshold (Ct) κεωρικθκαν ακατάλλθλα για γονίδια αναφοράσ

GAPDH ACTB B2M PPIA RPLP0 GAPDH GAPDH GAPDH ACTB ACTB ACTB B2M B2M B2M PPIA PPIA PPIA RPLP0 RPLP0 RPLP0 POLR2A POLR2A POLR2A RPS9 GUSB ABL1 HPRT1 RPS9 RPS9 RPS9 GUSB GUSB GUSB ABL1 ABL1 ABL1 HPRT1 HPRT1 HPRT1 Tc P=0.0012 P=0.048 P=0.014 P=0.38 P=0.0012 P=0.17 P=0.013 P=0.77 P=0.19 P=0.048 Αποτελζςματα Γονίδια με ςτατιςτικά ςθμαντικι διαφορά μεταξφ υγιοφσ και πάςχοντοσ βλεννογόνου κεωρικθκαν ακατάλλθλα για γονίδια αναφοράσ 30 25 20

Αποτελζςματα Σελικι ταξινόμθςθ υποψιφιων γονιδίων με βάςθ τθν απόδοςθ τουσ Δεν πλθροφν τα κριτιρια Πλθροφν τα κριτιρια* GAPDH BACT B2M RPS9 PPIA POLR2A RPLPO GUSB ABL1 HPRT1 Επιβεβαίωςθ με μθχανζσ προτυποποίθςθσ 1. BestKeeper: Pfaffl MW, Tichopad A, Prgomet C, Neuvians TP. 2004. Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper--Excel-based tool using pair-wise correlations. Biotechnology letters 26:509-515. 2. NormFinder: Andersen CL, Jensen JL, Orntoft TF. 2004. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-pcr data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer research 64:5245-5250. 3. Genorm: Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F. 2002. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome biology 3:RESEARCH0034. 4. The comparative delta-ct method: Silver N, Best S, Jiang J, Thein SL. 2006. Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-time PCR. BMC molecular biology 7:33.

Relative expression of TNF- mrna ( ct) GAPDH BACT B2M GAPDH/BACT GAPDH/B2M BACT/B2M GAPDH/BACT/B2M RPLPO GUSB ABL1 RPLPO/GUSB RPLPO/ABL1 GUSB/ABL1 RPLPO/GUSB/ABL1 Αποτελζςματα Η επιλογι του κατάλλθλου γονιδίου αναφοράσ οδθγεί ςε βελτίωςθ του υπολογιςμοφ διαφοράσ ζκφραςθσ του γονιδίου ςτόχου μεταξφ υγιοφσ και πάςχοντοσ εντερικοφ βλεννογόνου 12 SUBOPTIMAL PERFORMING GENES OPTIMAL PERFORMING GENES 9 6 3 P<0.05 0

υμπεράςματα θμαντικζσ διαφορζσ μεταξφ γονιδίων αναφοράσ Μζτρια απόδοςθ ευρζωσ χρθςιμοποιοφμενων γονιδίων τθν παροφςα μελζτθ τα ακόλουκα γονίδια είχαν τθν καλφτερθ απόδοςθ: RPLPO, GUSB, ABL1, and HPRT1

υμπεράςματα Ανάγκθ ομοιογζνειασ μεκοδολογίασ Ανάγκθ επιλογισ γονιδίων με βζλτιςτθ απόδοςθ Ανάγκθ προτυποποίθςθσ τθσ μεκοδολογίασ ανά εργαςτιριο