CAPITOLUL 1 BIOTEHNOLOGIILE: ISTORIC. PROCESE ŞI PRODUSE BIOTEHNOLOGICE

CAPITOLUL 1 BIOTEHNOLOGIILE: ISTORIC. PROCESE ŞI PRODUSE BIOTEHNOLOGICE 1.1 Definiţia biotehnologiei; evoluţia în timp a biotehnologiei ca ştiinţă tehnică Descoperirile spectaculoase din domeniile biologiei, biochimiei, microbiologiei, geneticii, enzimologiei, precum şi necesitatea aplicării acestor cunoştinţe în practică au condus la apariţia unei noi ştiinţe denumită generic biotehnologie. Caracterul interdisciplinar al biotehnologiei a creat încă de la început probleme privind definirea şi localizarea ei ca ştiinţă de sine stătătoare. Dintre toate definiţiile aceea dată biotehnologiei de către Federaţia Europeană de Biologie (1978), pare a fi satisfăcătoare: "Utilizarea integrată a biochimiei, microbiologiei şi ingineriei în scopul obţinerii unei aplicaţii tehnologice (industriale), cu ajutorul microorganismelor, culturilor de celule şi a părţilor componente a acestora". Simplificând, se poate spune că biotehnologia presupune "utilizarea organismelor sau a produselor derivate de la acestea în scopuri comerciale." In esenţă, principalul scop al biotehnologiei este obţinerea de produse sau servicii utile activităţii umane, cu ajutorul organismelor vii. Procesul de bază în biotehnologie este proces biologic, după cum procesul de bază în tehnologia chimică este procesul chimic. În tabelul 1.1 poate fi urmărită natura produselor comerciale obţinute pe cale biotehnologică utilizînd diferite tipuri de celule. Produse majore obţinute pe cale biotehnologică Tabelul 1.1 Produse de fermentaţie Tipul de organism utilizat Producţie anuală(în lume)kg/an Solvenţi organici Etanol(nu pentru băuturi) Acetonă/butanol Biomasă Culturi starter şi drojdii pentru industria alimentară şi agricultură Proteine monocelulare Acizi organici Acid citric Acid gluconic Acid lactic Acid itaconic Sacharomyces cerevisiae Clostridium acetobutylicum Bacterii lactice sau drojdii de panificaţie Pseudomonas methylotrophus sau Candida utilis Aspergillus niger Aspergillus niger Lactobacillus delbrueckii Aspergillus itaconicus 2 10 10 2 10 6 5 10 8 0.5-1 10 8 2-3 10 8 5 10 7 2 10 7 1

Aminoacizi Acid L-Glutamic L-Lysină L-Fenilalanină L-Arginină Alţi aminoacizi Transformări microbiene Steroizi D-Sorbitol la L-sorboză (în producţia de vitamina C) Polizaharide extracelulare Xanthan Dextran Xanthonomas campestris Leuconostoc mesenteroides 5 10 6 Nucleotide 5 - Guanosin monofosfat Brevibacterium ammoniagenes 1 10 5 Enzime Proteaze α-amilaze Glucoamilaze Glucozizomerază Pectinaze Renina Vitamine Bacillus spp. Bacillus amyloliquefaciens Aspergillus niger Bacillus coagulans Aspergillus niger Mucor miehei sau drojdii recombinanta 6 10 5 4 10 5 4 10 5 1 10 5 1 10 4 1 10 4 B12 Propionibacterium shermanii 1 10 4 Ribovlavina Eremothecium ashbyii Alcaloide Ergot Claviceps paspali 5 10 3 Pigmenti β-carotene Blakeslea trispora 60 Vaccinuri împotriva: -difteriei -tetanosului -pertussisului (tusea convulsivă) -virusului poliomielitei -rubeolei, etc Corynebacterium diphtheriae Clostridium tetani Bordetella pertussis Virusuri active atenuate cultivate in vitro <50 Proteine terapeutice Insulina; Hormonul uman de creştere Eritropoietina; Factorul VIII-C; Interferonul-α2, etc Insecticide Spori bacterieni Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum Corynebacterium spp. Bacterii, drojdii sau cellule mamaliene recombinate Bacillus thuringienis 3 10 8 3 10 7 2 10 6 2 10 6 1 10 6 Rhizopus arrhizus Acetobacter suboxydans 4 10 7 <20 2

Spori de fungi Antibiotice Peniciline Cefalosporine Tetracicline Antibiotice macrolide Antibiotice polipeptide Antibiotice aminoglicoside Antibiotice aromatice Hirsutella Thompsonii Penicillinum chrysogenum Cephalosporium acremonium Streptomyces aureofaciens Streptomyces erythreus Bacillus brevis Streptomyces griseus Penicillium griseofulvum 3-4 10 7 1 10 7 1 10 7 Anticorpi monoclonali Celule de tip Hybridoma <20 2 10 6 1 10 6 1.2. Dezvoltarea industriei biotehnologice; rolul cercetării fundamentale în biotehnologie Cunoaşterea ştiinţifică şi strategia de dezvoltare economică actuală se bazează pe o nouă abordare a fenomenelor, acestea conducând la o adevărată revoluţie biotehnologică. Se apreciază că în viitor cea mai mare parte a industriei se va baza pe procedee de fermentaţie, inginerie biochimică, biologie moleculară, aceasta din urmă imprimând un salt tehnologic corespunzător. Pe aceste baze, industria biotehnologică va lua un avânt considerabil. Ingineria genetică este considerată a fi tehnica ideală capabilă să amelioreze cantitativ şi calitativ capacitatea de biosinteză a celulelor de microorganisme, animale sau vegetale, în scopul obţinerii unor produse utile. Natura interdisciplinară a biotehnologiei este evidentă dacă se ţine seama de etapele unui proces biotehnologic complet. Dacă se ia ca exemplu obţinerea unui produs nou prin tehnologia ADN-recombinant, cum ar fi insulina, hormonul de creştere sau interferonul, atunci de la idee până la obţinerea unui produs comercial se parcurg o serie întreagă de faze care implică cunoştinţe aparţinând unor domenii ştiinţifice foarte diferite. Prima treaptă de dezvoltare a bioprocesului se referă la manipularea genetică a organismului gazdă; în acest caz, gena de interes este clonată într-o gazdă specifică (de ex. Escherichia coli) și se stabiliesc o serie de parametrii, cum ar fistabilitatea tulpinii recombinate şi nivelul de expresie al produsului dorit. După clonare, caracteristicile de creştere şi producţie a celulelor trebuie măsurate în funcţie de condiţiile de cultivare, ceea ce necesită aplicarea tehnicilor de cultivare obişnuite în microbiologie în vederea stabilirii parametrilor optimi: compoziţia mediului, ph, temperatură, concentraţie de oxigen dizolvat astfel încît productivitatea în produsul urmărit să fie maximă. Se porneşte prin cultivarea microorganismului la scara mică, în flacoane agitate de 250 ml până la un litru capacitate. Performanţele organismului sunt descrise prin calcularea ratei de creştere, productivitatea specifică, randamentul în produs finit. După cunoaşterea condiţiilor de cultivare în laborator se porneşte procesul de ridicare la scară pilot şi industrial. 1. Prima treaptă poate fi un bioreactor de 1, 2 sau 5 l echipat cu instrumente de măsură şi control al temperaturii, ph, concentraţie oxigen dizolvat, viteză de agitare. Culturile pot fi monitorizate mai bine în bioreactor decât în flacoane agitate. Se pot culege mult 3

mai multe informaţii referitoare la necesarul de oxigen al microorganismului sau la caracteristicile de spumare ale mediului sau alţi parametrii. De asemenea pot fi identificate limitările impuse de tipul bioreactorului.de exemplu, dacă acesta nu poate asigura necesarul de oxigen, celulele sunt înfometate. În mod similar, dacă agitarea mediului de cultură nu este adecvată, aceasta poate conduce la spargerea celulelor şi devierea procesului de cultivare. In bioreactor se stabilesc condiţiile pentru o anumită activitate a celulelor. In această fază se calculează diferiţi parametrii cum ar fi:coeficienţii de transfer de masă, timpul de agitare, viteza de dizolvare a oxigenului, puterea de agitare şi mulţi alţii. Aici se decide dacă cultura de celule poate fi operată cel mai bine în sistem "batch", semi-continuu sau continuu. De asemenea pot fi încercate diferite tipuri de bioreactor. Se realizează de asemenea un calcul economic de fezabilitate. 2. Următoarea treaptă de ridicare la scară este aceea de bioreactor pilot. În această fază se implică specialistii instruiţi în ingineria bioproceselor şi în ridicarea la scară industrială a acestora. In prezent se construiesc vase de 100-1000 l după specificaţiile prototipului de laborator. Scopul fazei pilot este acela de a examina raspunsul celulelor cultivate la o scară mai mare. În această treaptă de operare, rezultatele pot fi mai bune sau mai scăzute faţă de cele obţinute în bioreactorul laborator. În funcţie de aceste rezultate se hotărăşte dacă se trece la producţia industrială sau nu. Această parte a procesului tehnologic aparţine în întregime ingineriei bioproceselor: se proiectează atât bioreactorul industrial cât şi facilităţile auxiliare: echipamente de sterilizare aer şi mediu, generator de abur, utilaje necesare preparării mediilor de cultură, sistem de apa de racire, aparatura de automatizare şi control. O importanţă deosebita se acorda faptului ca instalaţia trebuie să asigure conditii aseptice pe întreg fluxul de productie. 3. O parte importantă a unui proces biotehnologic o constituie faza de recuperare a produsului din mediul de producţie şi anume izolarea si purificarea acestuia pâna la produsul finit. Această fază este adesea foarte dificilă pentru produsele rezultate prin tehnologia ADN recombinant, astfel încât costurile reprezintă 80-90% din costul total al bioprocesului. Procedeul aplicat pentru izolare şi purificare depinde de natura produsului şi cuprinde metode fizice, chimice, biologice. Multe metode încercate în laborator şi care au dat rezultate bune, nu pot fi aplicate la scara industrială. În această fază, biochimiştii, inginerii chimişti, tehnologii au o contribuţie importantă în recuperarea şi purificarea substanţei active. Procedeele elaborate includ: filtrări,centrifugări pentru separarea celulelor de lichid, metode mecanice de distrugere a membranei celulare, dacă produsul este intracelular, extracţii cu solventi, metode cromatografice, separări prin membrane, cristalizări şi uscări.toate aceste procedee sunt testate mai întâi la scara mică şi apoi la scară pilot şi industrial. Dupa ce produsul a fost purificat până la standardele cerute de normele internaţionale, acesta poate fi ambalat şi vândut. In cazul produselor farmaceutice noi este necesară şi testarea eficacităţii acestora, mai întâi pe animale şi apoi pe oameni. Pentru produsele uz alimentar sunt cerute alte teste specifice. 4

Pentru toate produsele obţinute pe cale biotehnologică se cer avize oficiale conforme cu standardele existente pentru fiecare tip de produs. Din acest exemplu se poate vedea că într-un bioproces sunt implicate multe discipline diferite atât tehnice cât şi discipline fundamentale. Specialiştii din domeniul biotehnologiei se confruntă în mod constant cu probleme aparţinând domeniilor: biologie, chimie, fizică, inginerie şi uneori medicină. 1.3.Aplicaţii ale biotehnologiei în medicină, agricultură, industria alimentară, industria farmaceutică Sfera domeniilor de aplicabilitate a biotehnologiilor este foarte mare, dată fiind varietatea proceselor biotehnologice. Principalele direcţii de dezvoltare a biotehnologiilor moderne sunt determinate în primul rând de descoperirile recente din domeniul biologiei moleculare dar şi de cerinţele societăţii faţă de anumite aspecte cu care se confruntă în prezent: criza energetică, epuizarea rezervelor de hrană de pe planetă, probleme ecologice şi de bioremediere. Încercând o clasificare a diferitelor tipuri de biotehnologii, în funcţie de domeniul în care se aplică sau tipul de celule utilizate, observăm că este greu să realizăm o delimitare. Orice manipulare a viului în folosul societăţii, înseamnă biotehnologie. Indiferent dacă aceasta se realizează la nivel laborator avănd un caracter de cercetare fundamentală sau se realizează la nivel industrial având un caracter aplicativ, scopul final şi în general tehnicile sunt asemănătoare şi incluse în aceeaşi sferă largă a biotehnologiei. 1. În funcţie de tipul de celule cu care se lucrează, deosebim: biotehnologii : microbiene, vegetale şi animale. 2. În funcţie de domeniul în care îşi găsesc aplicaţii produsele obţinute pe cale biotehnologică deosebim: Biotehnologii industriale (acestea cuprinzând biotehnologii farmaceutice, alimentare şi biotehnologii de depoluare). Biotehnologii agricole (care cuprind două mari domenii: biotehnologii vegetale şi biotehnologii în zootehnie) Biotehnologii medical-veterinare Biotehnologiile industriale cuprind procedee de obtinere a unor produse de larg interes,la nivel industrial,utilizând microorganisme sau enzime.în categoria biotehnologiilor farmaceutice intră: producerea de biomasă proteică biosinteza antibioticelor producţia de acizi organici producţia de aminoacizi, enzime, obţinerea de probiotice, hormoni, vitamine, polizaharide. În funcţie de gradul de puritate, produsele obţinute pot fi utilizate atât pentru consumul uman cât şi animal. 5

Biotehnologiile alimentare cuprind procedee industriale de prelucrare a legumelor şi fructelor, a laptelui şi produselor lactate, a cărnii, vizând în general aspectele fermentative ce stau la baza obținerii acestora. În cadrul biotehnologiilor de depoluare a mediului sunt incluse toate metodele şi tehnicile de epurare biologică a apelor uzate sau poluate, a aerului sau ale solurilor degradate, extracţia de minereuri cu ajutorul microorganismelor sau metodele de bioremediere cu ajutorul plantelor sau microorganismelor. Biotehnologiile agricole vizează un domeniu larg de aplicare și presupun atât utilizarea aspectelor tradiționale de ameliorare a plantelor și animalelor cât și cele moderne, bazate pe manipularea genetică controlată a informației genetice a celulelor vegetale (biotehnologii vegetale) sau a celor animale (biotehnologii animale cu aplicații în zootehnie sau medical veterinare). Biotehnologiile vegetale vizează utilizarea culturilor celulare vegetale precum și a tehnicilor de inginerie genetică în scopul obținerii de noi soiuri cu rezistenţă la atacul agenților patogeni, tolerante/rezistente la factori de mediu defavorabili, la implementarea de sisteme simbiotice la diferite specii de plante, multiplicarea speciilor horticole şi obţinerea de noi hibrizi cu proprietăți îmbunătățite etc. Biotehnologiile din domeniul zootehniei se referă în special la nutriţia animală, creşterea rezistenţei animalelor la atacul factorilor patogeni, biotehnici de reproducţie artificială şi de predeterminare a sexului la animale, conservarea resurselor genetice animale. Biotehnologiile medical veterinare au ca scop, în principal, crearea unor sisteme de diagnostic rapid şi eficient a maladiilor sau dereglărilor funcţionale la animale sau la om, producerea unor sisteme biologice de combatere a bolilor (anticorpi monoclonali, vaccinuri, agenți de biocontrol), realizarea de studii în vederea clarificării mecanismelor implicate în producerea unor procese patologice sau în rezistența la diverse boli etc. Saltul ştiinţific înregistrat în fiecare din domeniile biotehnologiei enunţate mai sus nu ar fi fost posibil fară aplicarea tehnicilor noi de biologie moleculară, legate de transferul de gene şi clonarea moleculară pentru obţinerea unor noi tipuri de celule si organisme; astfel este posibilă obţinerea de linii celulare noi cu proprietăți utile pentru medicină, agricultură, zootehnie, industria alimentară. Incorporarea unor gene dorite, utile, conduce la obţinerea unor produse noi de interes medical sau industrial. CAPITOLUL 2 ETAPELE UNUI PROCES BIOTEHNOLOGIC Elaborarea şi industrializarea unei tehnologii de biosinteză presupune parcurgerea mai multor faze ce pornesc de la cercetările la nivel de laborator, urmate apoi de cele de la nivelul pilotului și, în final, la nivel industrial. Aceste cercetări permit transpunerea procedeului de biosinteză de la o fază la alta, cu optimizarea factorilor implicați în derularea fiecărei faze în parte. 6

2.1. Faza de laborator Cercetările de obţinere a unui produs prin biosinteză încep cu lucrări de laborator care constau în: izolarea și selecția oragismelor (microorganismelor) de interes; întrețierea tulpinilor cu proprietățile dorite; realizarea culturilor inocul. Izolarea şi selecţia unui mare număr de microorganisme cunoscute din literatura de specialitate ca producători ai compusului ce urmează a fi biosintetizat. Tehnicile utilizate în acest scop sunt specifice pentru fiecare microorganism, cele mai multe referindu-se la tehnica diluţiilor şi tehnica granulelor de sol. Microorganismele sunt preluate din diferite habitate cultivate pe medii solide sau lichide, astfel încât să fie posibilă punerea în evidenţă a unor caracteristici fiziologice. În prima etapă se urmăreşte realizarea unei culturi pure prin tehnici microbiologice specifice (epuizarea ansei, diluţii succesive), după care se stabileşte o metodă de triere (screening) adecvată scopului urmărit. De obicei, microorganismele sunt cultivate pe plăci Petri, pe medii solidificate cu agaragar. In cazul în care se urmărește selectarea unor microorganisme producătoare a unui anumit tip de enzimă se realizează teste de identificare care pot fi calitative sau cantitative. În cazul enzimelor se aplică de obicei metode de identificare calitativă prin includerea substratului specific în mediul solid pe care se cultivă microorganismele (de ex.amidon în cazul amilazelor, caseină în cazul proteazelor, celuloză în cazul celulazelor). După dezvoltarea coloniilor izolate, enzimele difuzează în gelul de agar-agar, atacând substratul inclus în mediu şi astfel zona respectivă poate fi vizualizată, în cazul în care devine transparentă sau cu un reactiv specific. In cazul altor enzime la care nu se poate aplica un test calitativ, coloniile izolate se cultivă pe medii specifice după care se utilează fie lichidul de biosinteză fie extracte din culturile respective. Produsele respective sunt prelucrate în scopul dozării cantitative prin metode spectrofotometrice, fluorescenţă, titrimetrice, polarimetrice. În urma acestor teste se reţin numai câteva tulpini care au dat cele mai bune rezultate în ceea ce priveşte biosinteza enzimei. Întreţinerea tulpinilor producătoare. După faza de izolare şi selecţie, tulpinile producătoare se supun unor teste de caracterizare după criterii morfologice, biochimice, fiziologice, imunologice sau toxicologice; tulpina astfel caracterizată se înregistrează într-o colecţie de microorganisme, în vederea protejării sale și a utilizării ulterioare. Tinând cont că scopul este de a obține un anumit produs la nivel industria este necesar ca nivelul biosintezei să fie ridicat; de aceea se optimizează parametrii de biosinteză sau tulpina microbiană de interes este supusă unor teste de ameliorare prin metode clasice (mutageneză) sau moleculare (inginerie genetică). Conservarea microorganismelor de interes, atât tulpinile parentale, cât şi tulpinile modificate genetic (mutante sau recombinate) se face prin metode speciale, așa cum sunt liofilizarea şi conservarea în azot lichid. Tulpinile din colecţie utilizate în lucrările de biosinteză curente se păstrează sub diferite forme şi formează aşa numita cultură stoc de la care se porneşte procesul de biosinteză. Cultura stoc este păstrată la frigider, pe mediu agarizat, în tuburi. Pentru prepararea unei culturi inocul de laborator, se porneşte de la o astfel de cultură vegetativă. 7

Cultura inocul. Inoculul reprezintă o cultură microbiană în curs de multiplicare pe un substrat nutritiv corespunzător şi în anumite condiţii de dezvoltare (ph, temperatură, agitare, aerare) specifice. Inoculul constituie materialul de însămânţare al mediului de biosinteză propriu zis, din etapa următoare. Transferul culturii inocul în mediul de biosinteză se realizează în condiţii aseptice, după o perioadă de dezvoltare bine stabilită (vârstă, cantitate, aspect microscopic). 2.2. Faza de staţie pilot Faza de biosinteză propriu-zisă se realizează în echipamente speciale, numite bioreactoare, care pot avea diferite capacităţi (10 l, 100 l, 1 m 3, 10 m 3, 100 m 3 ), alegerea unuia sau a altuia depinzând de scopul cercetărilor. Faza de biosinteză este precedată de operaţii de sterilizare a aparaturii utilizate şi a mediului de cultură stabilit ca fiind optim la nivel de laborator. Începutul fazei de biosinteză este considerat momentul transferului culturii inocul în mediul de cultură sterilizat şi răcit la temperatura de cultivare a microorganismului producător. Când raportul între capacitatea de inocul şi cantitatea de mediu de fermentaţie (numit raport de inoculare) nu permite pregătirea culturii inocul în laborator este necesară introducerea unei trepte intermediare de cultivare, numite cultura intermediar. În faza de staţie pilot tehnologia elaborată la nivel de laborator este verificată şi optimizată pe instalaţii de biosinteză de capacitate medie (pilot). Pe baza datelor de cercetare obţinute la nivel pilot se elaborează aşa numitul proces tehnologic pilot după care urmează o fază de experimentare industrială şi apoi producţia propriu zisă probusului urmărit (enzimă, antibiotic etc). Datele furnizate de tehnologia pilot elaborată, constituie elemente de proiectare pentru instalaţiile industriale. 2.3 Medii de cultură utilizate în procesel biotehnologice În procesele biotehnologice, mediile de cultură sunt constituite din suporturi nutritive sterilizate care permit dezvoltarea şi studiul unui microorganism în afara nişei ecologice naturale. Compoziţia mediilor de cultură are o mare importanţă asupra reproductibilităţii şi eficienţei tehnologiei respective. În funcţie de consistenţă, compoziţie, scopul utilizării, mediile de cultură se clasifică astfel: după consistenţă: o medii lichide o medii solide o medii semisolide; după compoziţie: o medii naturale, care conţin elemente nutritive, de origine vegetălă sau animală; 8

o medii sintetice care conţin numai compuşi cu structură chimică cunoscută care pot fi dozaţi; după tipul respirator al microorganismelor cultivate se deosebesc: o medii pentru microorganisme aerobe o medii pentru microorganisme anaerobe; după scaopul şi frecvenţa întrebuinţării deosebim: o medii de uz curent; o medii speciale utilizate în general în studiile de izolare a microorganismelor la nivel de laborator. Acestea pot fi la răndul lor: elective, selective, de îmbogăţire, de conservare, de identificare; după faza de biosinteză la care este utilizat mediul de cultură poate fi mediu laborator, pilot sau mediu de cultură industrial; după destinaţia finală a culturii dezvoltate mediile pot fi: o medii pentru cultura inocul; o medii pentru cultura de regim numite şi medii de fermentaţie sau medii de biosinteză. În biotehnologie se utilizează în mod curent mediile naturale având la bază subproduse agroalimentare, cumr ar fi: şrot de floarea soarelui, de soia, făină de porumb, tărâţe de grâu, extractul de porumb. Aceste medii conţin în general elemente nutritive necesare dezvoltării microorganismelor, la care se adaugă de obicei cantităţi mici de săruri minerale. Mediile naturale sunt în general mai ieftine dar prezintă dezavantajul variabilităţii compoziţiei, ceea ce nu permite o standardizare corespunzătoare şi în consecinţă nu permite reproducerea procesului de biosinteză cu un randament constant. Spre deosebire de mediile naturale, mediile sintetice sunt perfect reproductibile la scară industrială. Un mediu de cultură utilizat pentru dezvoltarea microorganismelor trebuie să conţină întodeauna: sursa de carbon (în general glucide: glucoză,amidon, lactoză, zaharoză, etc.) sursa de azot care poate fi organic (aminoacizi, proteine,uree), sau anorganic (NH3, (NH4)2SO4, etc. ) sursa de fosfor (H3PO4, (NH4)3PO4, KH2PO4, etc) oligoelemente: K (din KCl sau K2HPO4); Mg ( din MgSO4); Fe (din FeCl3) factori de creştere: aminoacizi, proteine, vitamine, coenzime. Compoziţia mediului nutritiv specific pentru un microorganism se stabileşte în laborator, prin cultivarea acestuia, alegându-se astfel, în funcţie de scopul urmărit, mediul optim de cultivare. Uneori, pentru creşterea randamentului în faza de biosinteză, se adaugă la mediu precursori care sunt substanţe având porţiuni structurale ale moleculei produsului de biosinteză. În procesele de biosinteză, sursa principală de energie o constituie sursa de carbon, respectiv glucidele. În procesele catabolice, prin oxidarea biochimică a glucozei se eliberează o mare cantitate de energie, din care o parte este înmagazinată în compuşii macroergici (ATP), iar restul este preluat de mediul de cultură cu ajutorul sistemelor de termostatare ale bioreactoarelor. 9

Sursa de carbon furnizează de asemenea necesarul de oxigen şi hidrogen necesar dezvoltării microorganismului. De exemplu, mediile de cultură utilizate în producţia de enzime trebuie să conţină elementele esenţiale: carbon, azot, sulf, oxigen, fosfor, magneziu, calciu şi numeroase alte elemente în cantităţi foarte mici (urme): fier, cupru, cobalt, zinc, mangan, molibden - care sunt necesare funcţiilor celulare de bază. De cele mai multe ori este însă nevoie să se utilizeze un mediu de producere a enzimei cât mai ieftin şi posibil de reprodus o perioadă cât mai lungă de timp. Aceasta conduce la utilizarea unor substrate cât mai ieftine şi mai accesibile în conjunctura economică respectivă; înlocuirea unui component din compoziţia mediului nutritiv conduce la variaţii în randamentul de producere al enzimei, astfel încât studiul aprofundat al influenţei diferitelor componente ale mediului de cultură asupra biosintezei enzimei, constituie un element important al cercetărilor în domeniul producţiei de enzime. Sursa de carbon utilizată în compoziţia mediilor de cultură pentru enzime este suplinită în mod obişnuit de glucide de o anumită puritate sau de un material natural conţinând un amestec de glucide. Astfel, melasa de sfeclă sau de trestie este folosită în multe cazuri drept sursă de zaharoză. Alte surse de carbon utilizate în producţia de enzime: siropul de glucoză, amidonul de porumb sau de cartofi, hidrolizatul de amidon de cereale (grâu, orez, porumb) sunt în mod frecvent folosite ca surse de glucoză, zerul ca sursă de lactoză. Sursa de azot poate fi reprezentată în diferite forme de surse anorganice, cum ar fi: amoniacul, sărurile de amoniu sau amestecuri complexe de tipul extractului de drojdie, a celui de porumb, peptonă, făină de soia sau distilate solubile. Fosforul, sulful şi cationii esenţiali sunt, în general, supliniţi de sărurile anorganice. Uneori se adaugă elemente specifice în cantităţi mici, dar de obicei acestea sunt aduse de apă sau de alte componente ale mediului. Dintre factorii de creştere, tiamina şi biotina sunt necesare pentru creşterea microorganismelor. 2.4. Influenţa factorilor de mediu asupra cresterii microorganismelor Creşterea microorganismelor într-un bioreactor este influenţată de o serie de factori de mediu, dintre care cei mai importanţi sunt: concentraţia substratului calitatea şi cantitatea inoculului temperatura ph-ul mediului de biosinteză agitarea concentraţia O2-ului dizolvat 2.4.1. Influenţa concentraţiei substratului asupra procesului de biosinteză Celula microbiană, datorită volumului ei redus, este extrem de sensibilă la variaţiile parametrilor procesului de biosinteză, în special la variaţiile concentraţiei de substrat. Mărirea 10

concentraţiei de substrat în mediul de cultură poate conduce la sporirea numărului de celule microbiene, dar numai până la anumite limite, multiplicarea acestora fiind încetinită, de procese de inhibiţie care au loc la nivelul celulei. Acţiunea unui inhibitor asupra celulei microbiene se poate exercita prin: modificarea potenţialului chimic al substratului, intermediarilor metabolici sau a produsului finit; modificarea permeabilităţii peretelui celular şi reducerea transportului substanţelor nutritive; modificarea activităţii enzimelor implicate in procesul metabolic; disocierea agregatelor metabolice; modificarea parametrilor funcţionali ai celulei microbiene (capacitatea de multiplicare, mobilitatea, biosinteza unor metaboliţi). Mecanismele prin care se realizează inhibiţia sunt: reacţie chimică cu una sau mai multe componente celulare; adsorbţia sau complexarea unor enzime sau coenzime; intervenţia în secvenţe a reacţiilor biochimice; intervenţia în disocierea complexelor enzimatice; modificarea parametrilor fizico-chimici ai mediului de biosinteză (ph, tărie ionică, constantă dielectrică, capacitate de solvatare); intervenţia în funcţiile celulare de control. Datorită acestor fenomene concentraţiile mari de substrat inhibă dezvoltarea microorganismelor într-un anumit grad ajungând chiar la inhibiţie totală, motiv pentru care, pentru un sistem de biosinteză se stabileşte concentraţia optimă a substratului atât în momentul iniţial cât şi pe parcurs. De exemplu, pentru foarte multe bacterii concentraţia de 10-15% în sursă de C (glucoză, zaharoză) este inhibitoare, ele dezvoltându-se bine la valori ale sursei de carbon sub 10%. Acesta este motivul pentru care în soluţii foarte concentrate de zahăr (de exemplu dulceţuri, siropuri) microorganismele în general nu se dezvoltă, acestea putând fi conservate pe o lungă perioadă de timp. 2.4.2. Influenţa dimensiunii inoculului Calitatea şi cantitatea inoculului joacă un rol important pentru obţinerea unor metaboliţi cu randamente dorite de biosinteză. Cel mai adesea se utilizează o cantitate mare de inocul pentru a determina o declanşare rapidă a dezvoltării culturii concomitent cu reducerea riscului de contaminare. In majoritatea cazurilor este necesar ca dimensiunea inoculului să se situeze între 3 10% din volumul total al culturii. Pentru fiecare tehnologie în parte se stabileşte aşa numitul raport optim de inoculare care defineşte dimensiunile optime ale inoculului. Pentru asigurarea unei productivităţi şi măsurarea densităţii inoculului se extrag probe din cultura aflată într-un anumit stadiu de evoluţie optim pentru obţinerea unei producţii maxime a 11

metabolitului dorit şi se determină parametrii specifici (numărul de germeni pe unitatea de volum, sau conţinutul în biomasă uscată raportată la unitatea de volum). Efectele determinate de mărimea şi vârsta inoculului sunt specifice pentru diferite microorganisme. De exemplu, la bacterii, mărimea inoculului la bacterii are influenţă pronunţată asupra stadiilor ulterioare ale culturii, determinând diferite stări fiziologice ale celulelor în funcţie de care variază capacitatea de biosinteză a metabolitului dorit. Când se utilizează o cantitate mare de inocul, se micşorează faza de lag datorită formării şi acumulării unor metaboliţi intermediari esenţiali care pot difuza în celule şi în mediul de cultură mai rapid decăt în cazul utilizării unui inocul mic. Uneori însă, cantităţile mari de inocul determină apariţia unui fenomen de autoinhibiţie datorat sensibilităţii celulelor bacteriene faţă de unii produşi metabolici intermediari. Pe de altă parte, când mărimea inoculului este însă prea mică, faza de lag poate fi prelungită la infinit şi aceasta nu poate conduce la o dezvoltare normală a culturii de microorganisme. S-a observat că în cazul bacteriilor, pentru iniţierea dezvoltării unui inocul este necesară prezenţa în mediul de cultură a unei concentraţii critice de metale grele. De exemplu pentru un inocul de Bacillus subtilis este necesară prezenţa în mediul de cultură a unei concentraţii minime de mangan, în vederea iniţierii dezvoltării. Aceste cercetări subliniază importanţa ionilor metalelor grele pentru faza de lag la bacterii. În cazul levurilor cantitatea de inocul poate influenţa de asemenea durata fazei de lag sau stadiile ulterioare de dezvoltare, similar cu cele descrise în cazul bacteriilor. În cazul fungilor, importanţa standardizării inoculului vegetativ este hotărâtoare: pentru obţinerea unui ritm rapid de dezvoltare este necesar să se utilizeze un inocul sub formă de suspensie de spori. De asemenea poate să apară fenomenul de autoinhibiţie sau autostimulare a germinării sporilor datorită prezenţei unor substanţe produse în timpul germinării sau în fazele ulterioare. In cazul fungilor cantitatea de inocul influenţează mărimea şi forma miceliului precum şi randamentul în metaboliţi. Raportul de inoculare trebuie să fie stabilit astfel încât cantitatea de miceliu dezvoltat ulterior să nu fie prea mare în detrimentul secreţiei metabolitului dorit. O dezvoltare abundentă a masei miceliene conduce în acelaşi timp la un consum mare de sursă de carbon, cultura fiind astfel ineficientă. 2.4.3. Efectul temperaturii asupra creşterii microorganismelor producătoare de enzime Temperatura mediului în care are loc procesul de biosinteză este un factor extrem de important pentru dezvoltarea și activitatea microorganismelor. Temperatura este un factor care acţionează în mod direct asupra microorganismelor, diferenţa între temperatura mediului înconjurător şi cea din interiorul celulei trebuind să fie nulă. Pentru un proces de biosinteză industrial, temperatura poate fi considerată unul dintre parametrii fizici cei mai importanţi care este implicat profund, prin efectele sale în optimizarea procesului. Variaţiile temperaturii au efect asupra randamentului de transformare a substratului în produsul dorit, asupra cerinţelor nutritive ale microorganismului şi compoziţiei biomasei obţinute precum şi asupra vitezei de creştere microbiană. În funcţie de domeniul de temperatură în care 12

microorganismele, ating viteza maximă de creştere, acestea se clasifică în : criofile, mezofile şi termofile. Microorganismele industriale sunt în general mezofile, astfel încât acest domeniu este plasat în intervalul 25 35 C. Efectul temperaturii asupra creşterii microorganismelor se explică prin faptul că aceasta afectează multe procese metabolice din celulă precum şi compoziţia biomasei în proteine şi lipide, conţinutul în ARN al celulei. Este posibil ca structura lipidică a membranei celulare să se modifice continuu în funcţie de variaţiile de temperatură, astfel încât membrana să-şi menţină funcţia reglatoare. 2.4.4. Efectul ph-ului asupra creşterii microorganismelor Valoarea ph-ului este, alături de temperatură, un parametru important în procesele de biosinteză. Influenţa valorii ph-ului asupra dezvoltării culturilor microbiene se poate urmări în câteva direcţii: In general microorganismele au un domeniu optim de ph pentru dezvoltare, în care viteza specifică de creştere atinge valoarea maximă. De exemplu, pentru anumite specii de drojdii domeniul optim de ph se situează între valorile de ph 4 şi 5. Există însă şi specii de drojdii care cresc la valori de ph în jur de 2 sau, dimpotrivă, la valori ridicate ale phului în jur de 8 (de exemplu drojdiile din genul Rhodotorula folosite pentru biosinteza fenilalaninei). Cultivarea microorganismelor la valori scăzute ale ph-ului (ph 3 4) prezintă avantajul unui risc mai scăzut de contaminare, ceea ce este apreciat în mod deosebit în cazul unei cultivări industriale. Efectul valorii ph-ului asupra randamentului de conversie a substratului la un anumit produs. Formarea produsului dorit în urma procesului de biosinteză poate să fie legată de desfăşurarea bioprocesului într-un domeniu foarte strict de ph. În timpul dezvoltării unei culturi microbiene apar deviaţii ale ph-ului de la valoarea considerată optimă care pot avea urmări nedorite asupra procesului de biosinteză. Aceste modificări se pot datora fie consumării unui nutrient (consumarea sursei de carbon sau consumarea sursei de azot, fie producerii unui acid organic de către microorganism). Pentru corectarea ph-ului la valoarea prescrisă se adaugă diverse substanţe chimice (acizi sau baze) alese în funcţie de mai mulţi factori.; în cazul în care valoarea ph-ului este sub cea prescrisă, se pot folosi, pentru corecţie, soluţii de NaOH sau KOH în funcţie de compoziţia chimică a mediului şi de necesarul în ionii de Na + şi K + al microorganismului; în acelaşi scop este mult răspândită utilizarea amoniacului gazos sau soluţie. În situaţia în care valoarea ph-ului este peste cea recomandată se poate adăuga acid clorhidric, acid sulfuric sau acid azotic în funcţie de caracteristicile microorganismului (ionul Cl să nu inhibe creşterea), de compoziţia chimică a mediului (adăugarea de acid sulfuric ar putea conduce la formarea unor săruri greu solubile) precum şi de materialul de construcţie al vaselor de reacţie şi al bioreactoarelor (probleme de coroziune). 13

Prin efectul de disociere a acizilor şi bazelor, ph-ul acţionează asupra caracteristicilor suprafeţei celulei, modificând proprietăţile ei de aderare la diferite materiale (sticlă, metale) precum şi cele de floculare. 2.4.5. Concentraţia de oxigen dizolvat În culturile aerobe, este esenţial să se realizeze dizolvarea în mediu a întregii cantităţi de oxigen necesare microorganismului în orice moment al fermentaţiei, prevăzându-se în general un oarecare exces faţă de nevoi. De aceea se urmăreşte în general obţinerea unor aerări cât mai eficiente, transferul de oxigen din faza gazoasă în faza lichidă (mediul de fermentaţie) având loc cu viteze mari. În cazul în care procesul de biosinteză se desfăşoară în laborator la flacoane agitate, aerarea depinde de următorii parametrii: viteza de rotaţie sau translaţie a agitatorului, mărimea flacoanelor Erlenmayer, volumul de mediu de cultură din flacon, creşterea turbulenţei prin şicane. Eficienţa aerării unui mediu de cultură este reflectată de concentraţia de oxigen dizolvat. Alegerea parametrilor sistemului de aerare este determinată de necesitatea furnizării unei cantităţi de oxigen suficientă pentru a asigura o valoare maximă a activităţii metabolice în reactoarele de biosinteză; în acest caz, un anumit microorganism şi un anumit mediu de cultură se caracterizează printr-o rată de utilizare a oxigenului specifică. Pentru conducerea unui proces este esenţială cunoaşterea exactă a modului de variaţie în timp a necesarului de oxigen şi a ratei consumului de oxigen. Rata consumului de oxigen sporeşte rapid până la o valoare maximă încă din primele stadii ale procesului de biosinteză, scăzând apoi. Valoarea maximă a ratei de consum a oxigenului coincide de obicei cu momentul atingerii unei concentraţii ridicate de celule microbiene. Necesarul de oxigen al culturii este influenţat de mediul de biosinteză utilizat (de sursa de carbon. De exemplu, la fungii din genul Penicillium, necesarul de oxigen este dublu la utilizarea glucozei ca sursă de carbon faţă de zaharoză. Alţi factori care influenţează transferul de O2 sunt : Agenţii tensioactivi din mediul de cultură determină o micşorare a coeficienţilor de transfer; Densitatea celulară: la concentraţii ridicate vâscozitatea mediului creşte iar eficienţa sistemului de aerare scade, bulele tinzând să circule prin canale preferenţiale, cu rezistenţă redusă la înaintare ; Sistemul de agitare al bioreactorului influenţează sensibil concentraţia oxigenului dizolvat: o agitare eficientă a mediului de cultură conduce la o dispersie corespunzătoare a bulelor de aer şi deci la mărirea coeficientului de transfer a oxigenului; Echipamentul de aerare utilizat permite obţinerea unei dispersii uniforme a bulelor de aer; Suprapresiunea favorizează mărimea concentraţie de oxigen în mediul de cultură: în general procesele biotehnologice sunt conduse la suprapresiuni cuprinse între 0,5 1 atm (în scopul micşorării riscului de infecţie). 14

CAPITOLUL 3 PRELUCRAREA MEDIILOR DE CULTURA IN SCOPUL IZOLARII SI PURIFICARII PRODUSELOR DE BIOSINTEZA Înainte de a fi purificate, substanţele organice obţinute pe cale biotehnologică sunt izolate din lichidul de cultură (dacă sunt extracelulare) sau din biomasă (dacă sunt intracelulare) într-o formă parţial purificată aplicînd metode de separare general valabile pentru toate produsele de biosinteză. Prelucrarea primară a mediilor de biosinteză cuprinde o serie de operaţii cum ar fi: filtrarea, centrifugarea, decantarea, concentrarea fazei lichide, dezagregarea celulelor, extracţia, uscarea, atomizarea, precum și procese mai specifice de tipul precipitării cu solvenţi sau cu săruri anorganice, purificării şi concentrării prin ultrafiltrare. Echipamentele industriale implicate sunt complexe şi specifice. Schema de flux variază de la un preparat la altul, în funcţie de tehnologie. Separarea produselor din lichidul rezultat din fermentaţie, constituie o problemă dificilă, indiferent de procedeul aplicat. Dificultăţile provin din faptul că produsele biologic active obţinute în general prin biosinteză sunt substanţe termolabile, ceea ce impune evitarea degradării sau modificării chimice a acestora. Pentru a alege cea mai adecvată metodă de separare a produselor biosintetizate, este necesar să se cunoască proprietăţile fizico chimice a acestora şi anume: Solubilitatea : o în apă sau în soluţii diluate de săruri ; o în solvenţi polari (metanol, etanol, acetonă) ; o în solvenţi slab polari (cloroform, hidrocarburi) ; Stabilitatea în soluţie : o în funcţie de ph ; o efectul temperaturii ; o efectul soluţiilor tampon ; o efectul solvenţilor organici ; Stabilitatea în stare solidă în funcţie de temperatură precum şi efectul umidităţii asupra produsului ; Proprietăţi fizice : o dializabilitate prin membrane ; o adsorbţia pe suprafeţe solide ; o migrarea în câmp electric ; o sedimentarea în ultracentrifuge ; Proprietăţi chimice : o stabilitatea faţă de diverse enzime ; o stabilitatea la acţiunea unor agenţi chimici. Pentru separarea produsului din mediile de biosinteză se aplică în general următoarele metode: extracţia cu solvenţi organici; separarea pe schimbători de ioni; cromatografie; adsorbţia. In industria de biosinteză există însă metode de prelucrare integrală a mediului de cultură prin aplicarea diferitelor metode de uscare, produsul rezultat fiind utilizat ca atare. Acest mod de prelucrare a mediilor de biosinteză este mult aplicat în tehnologia aditivilor furajeri (conţinînd aminoacizi, enzime, vitamine). 15

3.1. Filtrarea mediilor de biosinteză Faţă de filtrarea substanţelor chimice, filtrarea mediilor de biosinteză ridică adesea probleme datorită compoziţiei chimice deosebit de complexe a mediilor şi apariţia materialului biologic (bacterii, fungi) care complică fenomenul. Operaţia de filtrare a mediilor de biosinteză este adeseori uşurată prin utilizarea adjuvanţilor de filtrare care formează în cursul operaţiei straturi microporoase micşorînd diametrul aparent al porilor şi implicit mărind eficienţa de colectare prin reţinerea unor particule de diametru mai scăzut. Utilizarea lor industrială conduce la mărirea vitezei de filtrare şi reducerea consumurilor de materiale. O variantă a operaţiei de filtrare mult utilizată în biotehnologie este filtrarea sterilizantă. La prelucrarea suspensiilor se execută întâi o prefiltrare grosieră, urmată de filtrarea sterilizantă propriu zisă. Pentru filtrarea sterilizantă se montează în filtru plăcile (din acetat de celuloză, azbest sau polimeri sintetici) cu diametru redus al porilor, executând apoi în mod normal operaţia de filtrare. 3.2. Dezagregarea celulelor de microorganisme Când substanţele biologic active care interesează şi care s-au format în cursul procesului de biosinteză sunt intracelulare este necesară distrugerea membranei celulare semipermeabile şi a peretelui protector în vederea recuperării componentelor respective. Această operaţie se realizează prin procedee de dezagregare. După natura agentului de dezagregare utilizat, procedeele de dezagregare ale celulelor microbiene se clasifică în : - procedee mecanice - procedee fizice nemecanice - procedee chimice - procedee enzimatice. Procedeele mecanice cuprind dezagregarea celulelor în mori coloidale sau în mori vibratoare, menţinând un anumit raport de recirculare, până la dezagregarea totală a celulelor microbiene; în timpul operaţiilor de dezagregare mecanică are loc o creştere a temperaturii materialului biologic. Evitarea acestui fenomen şi menţinerea sistemului la o temperatură acceptabilă se efectuează prin circulaţia unui agent de răcire prin mantaua aparatului. Dezagregarea celulelor de microorganisme prin procedee fizice nemecanice se poate efectua prin decomprimare rapidă, prin îngheţare lentă (datorită sporirii volumului apei la trecerea în stare solidă) sau prin şoc osmotic. Un procedeu deosebit de eficace este aplicarea de vibraţii ultrasonice suspensiei de celule. Vibraţiile cu frecvenţe de cca. 20.000 Hz determină dezintegrarea celulelor microbiene. Dezagregarea celulelor microbiene prin procedee chimice cuprinde distrugerea componentelor lipoproteice ale membranei celulare prin acţiunea detergenţilor cationici sau anionici sau a solvenţilor organici, determinând trecerea în faza lichidă a unora din componentele biologic active. Dezagregarea celulelor microbiene poate fi efectuată şi prin tratarea acestora cu diferite preparate enzimatice. Astfel, liza celulelor bacteriene poate fi indusă prin atacul enzimatic specific al legăturilor α-1,4 dintre moleculele de N-acetilglucozamină şi acidul N-acetilmuramic. Dezintegrarea biologică enzimatică este una din cele mai vechi metode de obţinere a omogenatelor celulare. Cel mai cunoscut exemplu este cel al descompunerii autolitice a drojdiei de bere uscată la 30 C, timp de 2 3 zile. Dezintegrarea celulelor de Micrococcus lysodeikticus poate fi realizată cu suc pancreatic; distrugerea ţesutului muscular poate fi produsă cu enzime 16

proteolitice izolate din Bacillus subtilis, iar dezintegrarea biologică a E.coli poate fi realizată cu bacteriofagi litici. 3.3. Concentrarea mediilor de biosinteză a enzimelor Mediile de biosinteză se concentrează prin operaţii specifice industriei chimice, cu deosebirea că este necesară protejarea lichidelor biologice datorită permeabilităţii acestora. Se utilizează adeseori evaporarea în vacuum care permite efectuarea operaţiei la temperaturi relativ scăzute (25 50 C). In ultimul timp se practică cu succes procedeele de concentrare atermică, ultrafiltrarea şi osmoza inversă. Concentrarea prin ultrafiltrare. Ultrafiltrarea reprezintă procesul de separare a componentelor unei soluţii datorită diferenţelor de volum molecular cu ajutorul unei membrane. Ultrafiltrarea este un procedeu de separare şi purificare a substanţelor biologic active, având următoarele avantaje: permite efectuarea concentrării la temperaturi scăzute micşorând fenomenele de autodigerare şi pierderile în activitate prin denaturarea termică. nu necesită modificări de fază (evaporări, condensări). nu utilizează substanţe chimice. permite purificarea soluţiilor biologic active prin îndepărtarea unor componente cu volum molecular inferior. Cercetările privind introducerea proceselor cu membrane, urmăresc în general, stabilirea posibilităţilor de utilizare eficientă a unor tipuri de membrane la concentrarea şi purificarea produselor biologic active, în cadrul elaborării tehnologiilor de obţinere a acestora. Dintre aplicaţiile ultrafiltrării, cele din domeniul biotehnologiei ocupă un loc major, metoda fiind utilizată ades la concentrarea şi purificarea enzimelor de origine microbiană. De exemplu, în procesul de izolare şi purificare a enzimelor, una din etape o constituie demineralizarea soluţiei enzimatice; această operaţie are loc în paralel cu concentrarea prin ultrafiltrare întrucît ionii anorganici avînd volum mic trec prin membrana de ultrafiltrare; astfel, aplicarea metodei de concentrare prin ultrafiltrare a soluţiilor enzimatice conduce la eliminarea operaţiei de dializă, efectuată în mod obişnuit într-un flux de purificare. Uscarea prin atomizare a mediilor de fermentaţie cu activitate enzimatică. Uscarea prin pulverizare se foloseşte pentru materialele care în faza iniţială sunt lichide (soluţii, suspensii, paste subţiri). Acestea, în vederea uscării sunt pulverizate în particule de dimensiuni mici. Prin pulverizare la dimensiuni mici se înţelege obţinerea unei suspensii de lichid constituită din particule de dimensiuni între 2 şi 200 m. Dat fiind dimensiunile particulelor, operaţia a fost denumită şi atomizare; în uscătoarele cu pulverizare, uscarea are loc foarte repede, astfel încât, materialul nu are timp să se încălzească peste limita admisibilă şi temperatura lui este apropiată de temperatura de evaporare a lichidului. Materialul uscat se obţine sub formă de pulbere şi nu este necesară o mărunţire ulterioară. Metoda este aplicată în general în condiţionarea enzimelor de mare tonaj, utilizate în hrana animalelor ca aditivi furajeri (proteaze, amilaze, celulaze) şi se realizează prin atomizarea integrală a mediului de cultură fără o altă purificare. 17