ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΜΑΚΡΟΦΑΓΑ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Διευθυντής: Καθηγητής Γ. Ο. Δημητρακόπουλος ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΚΛΙΝΙΚΕΣ-ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΕΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ Pseudomonas aeruginosa ΣΤΗ ΜΕΤΑΔΟΣΗ ΤΟΥ ΣΗΜΑΤΟΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΜΑΚΡΟΦΑΓΑ ΛΑΓΟΥΜΙΝΤΖΗΣ Σ. ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΤΡΑ 2004 1

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Διευθυντής: Καθηγητής Γ. Ο. Δημητρακόπουλος ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΚΛΙΝΙΚΕΣ-ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΕΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ Pseudomonas aeruginosa ΣΤΗ ΜΕΤΑΔΟΣΗ ΤΟΥ ΣΗΜΑΤΟΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΜΑΚΡΟΦΑΓΑ ΛΑΓΟΥΜΙΝΤΖΗΣ Σ. ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΤΡΑ 2004 2

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθηγ. Δημητρακόπουλος Γεώργιος Επιβλέπων Καθηγητής Επίκ. Καθηγ. Παληογιάννη Φωτεινή Μέλος Συμβουλευτικής Επιτροπής Αναπλ. Καθηγ. Μουζάκη Αθανασία Μέλος Συμβουλευτικής Επιτροπής ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Καθηγ. Δημητρακόπουλος Γεώργιος Επιβλέπων Καθηγητής Επίκ. Καθηγ. Παληογιάννη Φωτεινή Μέλος Συμβουλευτικής Επιτροπής Αναπλ. Καθηγ. Μουζάκη Αθανασία Μέλος Συμβουλευτικής Επιτροπής Καθηγ. Βαγενάκης Απόστολος Μέλος Εξεταστικής Επιτροπής Καθηγ. Παπαβασιλείου Αθανάσιος Μέλος Εξεταστικής Επιτροπής Καθηγ. Αναστασίου Ευάγγελος Μέλος Εξεταστικής Επιτροπής Επίκ. Καθηγ. Χριστοφίδου Μυρτώ Μέλος Εξεταστικής Επιτροπής 3

Αφιερώνεται, στην οικογένειά μου 4

ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ Oι συντομογραφίες που χρησιμοποιήθηκαν είναι από τη διεθνή βιβλιογραφία, ενώ σε παρένθεση αναγράφεται η ελληνική απόδοσή τους (όπου αποδίδεται). AP: Alkaline Phosphatase (αλκαλική φωσφατάση) AP-1: Activator Protein-1 AcetylcoA: Acetyl coenzyme A (ακετυλο-συνένζυμο Α) ATF-2: Activation of Transcription Factor-2 BCA: Bicichoninic Acid BSA: Bovine Serum Albumin (Αλβουμίνη ορού βοός) CD14: Cluster of Differentiation 14 (Σύμπλεγμα Διαφοροποίησης 14) CREB: cyclic AMP Response Element Binding Protein DNA: Deoxy-Ribonucleic Acid (Δεσόξυριβονουκλεϊκό οξύ) ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Ενζυμική Ανοσοπροσροφητική Μέθοδος προσδιορισμού) EMSA: Electrophoretic Mobility Shift Assay (Μέθοδος Μετατόπισης της Ηλεκτροφορητικής Κινητικότητας) ER: Endoplasmic Reticulum (ενδοθηλιακό δίκτυο) Erk: Extracellular signal-regulated Kinases (Κινάση ελεγχόμενη από εξωτερικό μήνυμα) GLP: glycolipoprotein (γλυκολιποπρωτεΐνη) GM-CSF: Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor GPI: Glycosylphosphatidylinositol (γλυκοσυλφωσφατιδυλοϊνοσιτόλη) HRP: Horse Radish Peroxidase (υπεροξειδάση αγριοραπανίδας) 5

IFN: Interferon (Ιντερφερόνη) IgG: Immunoglobulin G (Ανοσοσφαιρίνη τάξεως γ) IL : Interleukin (Ιντερλευκίνη) IκΒ: Inhibitor κβ (αναστολέας κβ) JAK: Janus kinases JNK: Jun N-Terminal Kinases KDO: Κετο-Δεοξυ-Οκτανικό οξύ LBP: LPS Binding Protein LPS: Lipopolysaccharide (Λιποπολυσακχαρίτης) LUC: Luciferase (λουσιφεράση) MAPK : Mitogen Activated Protein Kinases (Κινάσες που ενεργοποιούνται από μιτογόνο) MDF: Macrophage Deactivating Factor MHC: Major Histocompatibility Complex (Μείζον Σύστημα Ιστοσυμβατότητας) MPS: Mononuclear Phagocyte System mrna: Messenger RNA (Αγγελιοφόρο Ριβονουκλεϊκό Οξύ) MyD88: Myeloid Differentiation Factor 88 NF-κB : Nuclear Factor-κB (Πυρηνικός Παράγοντας-κΒ) NK: Natural Killer (Φονικά κύτταρα) NO: Nitric Oxide (Νιτρικό Οξύ) PAMP: Pathogen Associated Molecular Patterns PBL: Peripheral Blood Leukocyte (Λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος) PBMC: Peripheral Blood Mononuclear Cells (Μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος) PBS: Phosphate Buffer Saline (Ρυθμιστικό Διάλυμα Φωσφορικών) 6

PCR: Polymerase Chain Reaction (Αλυσιδωτή Αντίδραση της Πολυμεράσης) PGE2: Prostaglandin E2 (Προσταγλαδινη Ε2) PKA: Protein kinase A (Πρωτεϊνική Κινάση Α) PKC: Protein kinase C (Πρωτεϊνική Κινάση C) PMA: Phorbol Myristate Acetate PMSF: Phenyl-Methyl-Sulphonyl-Fluoride PNK: Polynucleotide Kinase (πολυνουκλεοτιδική κινάση) PRR: Pattern Recognition Receptors (Υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων) RHD: Rel Homology Domain RLU: Relative Light Units RNA: Ribonucleic Acid (ριβοζονουκλεϊκό Οξύ) SDS: Sodium-Dodecyl-Sulphate SDS-PAGE: SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis STAT: Signal Transuding Activators of Transcription TBS: Tris-Buffered Saline TGF: Transforming Growth Factor TLR: Toll-Like Receptors (Toll υποδοχείς) TNFR: TNF Receptor (Υποδοχέας του TNF) TNF-α: Tumor Necrosis Factor-α (Παράγοντας Νεκρώσεως Όγκου-α) TRAF6: TNF-α Receptor associated factor 6 TRE: TPA-Response Element U.V.: Ultra Violet (radiation) (Υπεριώδης Ακτινοβολία) UTR : Untranslated Region (Αμετάφραστη περιοχή) ΘΔ50: Μέση Θανατηφόρος Δόση ΘΜΒΣ: Θυγατρικό μη Βλεννώδες Στέλεχος 7

Μ.Β.: Μοριακό Βάρος ΜΒΣ: Μητρικό Βλεννώδες Στέλεχος 8

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ...5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ...9 ΠΡΟΛΟΓΟΣ...13 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ...15 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1... 15 1.1. Γενικά περί Pseudomonas aeruginosa... 15 1.2. Λοιμώξεις που προκαλεί η P. aeruginosa...18 1.3. Λοιμογόνοι παράγοντες και παθογένεια των λοιμώξεων της P. aeruginosa..20 1.3.1. Εξωκυττάριοι λοιμογόνοι παράγοντες... 21 1.3.1.1. Εξωτοξίνη Α... 21 1.3.1.2. Εξωένζυμο S...22 1.3.1.3. Πρωτεάσες...22 1.3.1.4. Χρωστικές... 23 1.3.1.5. Αιμολυτικοί παράγοντες...23 1.3.1.6. Λευκοκτονίνη... 24 1.3.2. Κυτταρικοί λοιμογόνοι παράγοντες...24 1.3.2.1. Λιποπολυσακχαρίτης (LPS)... 24 1.3.2.2. Πορίνες... 27 1.3.2.3. Γλυκολιποπρωτεΐνη (GLP) Εξωκυττάριου πολυσακχαρίτη (Slime)...28 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2... 32 2.1. Ανοσοποιητικό σύστημα (Innate & Adaptive Immune System)...32 2.2. Πρωτογενή-Δευτερογενή Λεμφοποιητικά Όργανα...34 2.3. Κύτταρα του Ανοσολογικού Συστήματος...35 2.3.1. Τ-λεμφοκύτταρα...35 2.3.2. B-λεμφοκύτταρα...36 2.3.3. Μονοκύτταρα-Μακροφάγα... 37 2.3.3.1. Λειτουργίες μονοπύρηνων-μακροφάγων... 39 2.4. Κυτταροκίνες... 41 2.4.1. Χαρακτηριστικά της δράσης των κυτταροκινών...42 2.4.2. Παράγοντας Νεκρώσεως Όγκου-α (TNF-α)... 43 2.4.3. Λειτουργίες του TNF-α... 46 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3... 48 3.1. Ενεργοποίηση Μακροφάγων...48 3.2. Υποδοχείς επιφανείας μακροφάγων που ενέχονται στην αναγνώριση μικροβιακών παραγόντων...51 3.2.1. Υποδοχέας CD14...51 3.2.1.1. Συνδέτες του CD14... 52 3.2.2. Toll-υποδοχείς (TLR s: Toll-Like Receptors)...54 3.2.2.1. Toll-Like Receptor 2 (TLR2)... 57 3.2.2.2. Toll-Like Receptor 4 (TLR4)... 58 3.2.2.3. Ενδοκυττάρια Σηματοδότηση των TLR s... 58 3.3. Mitogen-Activated Protein kinases (MAP κινάσες)... 60 3.3.1. Extracellular-signal Regulated Kinase (ERK s)...61 9

3.3.2. p38 κινάση...62 3.3.3. C-jun N-terminal Kinase (JNK)... 64 3.4. Μεταγραφικοί Παράγοντες... 66 3.4.1. Πυρηνικός παράγοντας-κβ (Nuclear Factor κb: NF-κB)... 66 3.4.2. Activator Protein-1 (AP-1)... 69 3.5. Σηπτικό Σοκ (Σύνδρομο τοξικής καταπληξίας)...72 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ...76 1. ΥΛΙΚΑ... 76 2. ΜΕΘΟΔΟΙ...79 2.1. ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ-ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ...79 2.1.1. Στελέχη-Καλλιέργειες... 79 2.1.2. Μέθοδος παραλαβής εξωκυττάριου πολυσακχαρίτη Slime-GLP... 80 2.2. ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΚΑΙ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΑΝΘΡΩΠΙΝΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ... 82 2.2.1 Διαλύματα... 82 2.2.2. Καλλιέργεια ανθρώπινων μονοκυτταρικών σειρών... 83 2.2.3. Απομόνωση ανθρώπινων μονοκυττάρων από περιφερικό αίμα με Histopaque-1077...84 2.2.4. Απομόνωση μονοκυττάρων με προσκόλληση σε φιάλες καλλιέργειας. 85 2.2.5. Μέτρηση κυττάρων-προσδιορισμός βιωσιμότητας...86 2.2.6. Διέγερση κυττάρων... 86 2.2.7. Προσδιορισμός πρωτεϊνικού παράγοντα νεκρώσεως όγκου-α (TNF-α) σε υπερκείμενα ανθρωπίνων μονοκυτταρικών καλλιεργειών...87 2.2.8. Κατάψυξη κυττάρων... 87 2.2.9. Απόψυξη κυττάρων... 88 2.3. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ...88 2.3.1. Κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα... 88 2.3.2. Πυρηνικά εκχυλίσματα...89 2.4. ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ... 90 2.4.1. Μεθοδολογία Smith για προσδιορισμό πρωτεϊνών σε κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα... 90 2.4.2. Μεθοδολογία Bradford για προσδιορισμό πυρηνικών πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων... 91 2.5. ΑΝΑΛΥΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ... 92 2.5.1 Γενικές αρχές ηλεκτροφόρησης... 92 2.5.2. Ηλεκτροφόρηση με αποδιατακτικούς παράγοντες (SDS-PAGE: Polyacrylamide gel electrophoresis)...93 2.5.3. Χρώση πρωτεϊνών ακινητοποιημένων σε ακρυλαμίδη με Coomassie Brilliant Blue R250...97 2.6. ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΑΚΙΝΗΤΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΣΕ ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΜΕ ΧΗΜΕΙΟΦΩΤΑΥΓΕΙΑ... 98 2.6.1. Μεταφορά (Western Blotting)...98 2.6.2. Χρώση νιτροκυτταρίνης με διάλυμα Ponceau-S για έλεγχο επιτυχούς μεταφοράς πρωτεϊνών... 101 2.6.3. Ανίχνευση πρωτεϊνών με αντισώματα (Immunodetection)...102 2.6.4. Προσδιορισμός ενεργότητας p38 κινάσης in vitro...103 2.7. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΝΟΥΚΛΕΪΚΩΝ ΟΞΕΩΝ... 105 2.7.1 Απομόνωση ολικού RNA από ανθρώπινα μονοκύτταρα... 105 2.7.2. Έλεγχος ποιότητας RNA με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης... 106 10

2.8. ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ mrna ΤΟΥ TNF-α ΜΕ ELISA...106 2.8.1 Υβριδοποίηση TNF-α ανιχνευτή σε μικροπλάκα (ELISA)... 106 2.9. ΕΛΕΓΧΟΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ IN VITRO ΚΑΙ IN VIVO...108 2.9.1 IN VITRO:... 109 2.9.1.1 Σήμανση του 5 άκρου των ολιγονουκλεοτιδικών αλληλουχιών DNA (5 end labeling)... 109 2.9.1.2. Έλεγχος δέσμευσης πυρηνικών πρωτεϊνών σε τμήματα DNA που αντιστοιχούν σε θέσεις δέσμευσης μεταγραφικών παραγόντων (Electrophoretic Mobility Shift Assay-EMSA)... 110 2.9.2. IN VIVO:... 112 2.9.2.1 Μετασχηματισμός στελέχους E. coli με ανασυνδυασμένο πλασμίδιο (transformation)...112 2.9.2.2 Καλλιέργεια/Πολλαπλασιασμός των μετασχηματισμένων κυττάρων... 114 2.9.2.3. Ανασυνδυασμένο Πλασμιδιακό DNA-Απομόνωση πλασμιδιακού DNA... 115 2.9.2.3.1. Ανασυνδυασμένα πλασμίδια... 115 2.9.2.3.2. Απομόνωση πλασμιδίων με στήλες καθαρισμού... 115 2.9.2.3.3. Έλεγχος προϊόντων καθαρισμού πλασμιδίων... 116 2.9.2.4. Διαμόλυνση μονοκυττάρων με ηλεκτροδιάτρηση για ενσωμάτωση πλασμιδιακού DNA (Transfection by electroporation)... 116 2.9.2.4.1. Έλεγχος ενσωμάτωσης πλασμιδίων... 119 2.9.2.4.2. Έλεγχος δραστικότητας NF-κΒ και AP-1 in vivo: Μελέτη ενζυμικής δραστικότητας λουσιφεράσης... 119 2.10. ΜΕΛΕΤΗ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑΣ...120 2.10.1. Πειράματα αναστολής της δράσης των Toll-υποδοχέων... 120 3. ΣΥΣΚΕΥΕΣ...122 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ...123 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1... 124 1.1. Σύγκριση του LPS και Slime-GLP της P. aeruginosa στην ικανότητα να διεγείρουν την παραγωγή TNF-α από ανθρώπινα μονοκύτταρα... 124 1.2. Σύγκριση της Slime-GLP και LPS της P. aeruginosa με ολόκληρο το ζωντανό βακτήριο στην ικανότητα διέγερσης παραγωγής TNF-α πρωτεΐνης από ανθρώπινα μονοκύτταρα... 126 1.3. Κινητική της παραγωγής TNF-α πρωτεΐνης με Slime-GLP και LPS της P. aeruginosa...127 1.4. Σύγκριση της παραγωγής TNF-α πρωτεΐνης από ζωντανά ή αδρανοποιημένα με θέρμανση P. aeruginosa βακτήρια...129 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2... 131 2.1. Η Slime-GLP επάγει την παραγωγή αγγελιοφόρου μηνύματος RNA (mrna) για τον TNF-α σε ανθρώπινα μονοκύτταρα... 131 2.2. Η Slime-GLP επάγει την ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ in vitro σε ανθρώπινα μονοκύτταρα... 134 2.3. Η Slime-GLP επάγει τον σχηματισμό του ετεροδιμερούς p50/p65 του NF-κΒ σε ανθρώπινα μονοκύτταρα... 137 2.4. Η Slime-GLP επάγει την ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα AP-1 in vitro σε ανθρώπινα μακροφάγα... 139 2.5. Η Slime-GLP ενεργοποιεί in vivo τη μεταγραφική δραστικότητα του NF-κΒ σε διαμολυσμένα με το αντίστοιχο πλασμίδιο THP-1 κύτταρα...141 11

2.6. Η Slime-GLP ενεργοποιεί in vivo τη μεταγραφική δραστικότητα του AP-1 σε διαμολυσμένα με το αντίστοιχο πλασμίδιο THP-1 κύτταρα...143 2.7. Συμμετοχή των MAP κινασών στο σηματοδοτικό μονοπάτι της ενεργοποίηση του TNF-α από ανθρώπινα μονοκύτταρα...144 2.8. Διαφορετική ενεργοποίηση των MAP κινασών από το Slime-GLP και τον LPS P. aeruginosa σε ανθρώπινα μονοκύτταρα...145 2.8.1. Ενεργοποίηση της p38:... 146 α) Western Blotting:... 146 β) Kinase assay... 147 2.8.2. Ενεργοποίηση της p42/44 (Erk1,2):... 148 2.8.3. Ενεργοποίηση της JNK:...149 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3... 151 3.1. Μελέτη της μετάδοσης του σήματος ενεργοποίησης μέσω των TLR2 και TLR4 σε ανθρώπινα μονοκύτταρα... 151 3.2. Συμβολή των TLR2 και TLR4 στην ενεργοποίηση των MAP κινασών μέσω Slime-GLP ή LPS της P. aeruginosa...153 ΣΥΖΗΤΗΣΗ...156 ΓΕΝΙΚΑ... 156 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1... 158 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2... 161 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3... 165 ΠΕΡΙΛΗΨΗ-ABSTRACT...169 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...175 ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ...192 ΞΕΝΕΣ ΓΛΩΣΣΕΣ... 197 12

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Τις τελευταίες δεκαετίες η Pseudomonas aeruginosa αποτελεί σημαντικό παράγοντα λοιμώξεων για διάφορες ομάδες ασθενών. Ο τρόπος με τον οποίο ασκεί την παθογόνο δράση της, παρά τις εκτενείς μελέτες, δεν έχει μέχρι σήμερα πλήρως διαλευκανθεί. Διάφορα κυτταρικά στοιχεία και παράγωγα του μικροβίου έχουν ενοχοποιηθεί για την παθογόνο δράση της. Μεταξύ αυτών, μεγάλη σημασία για την παθογένεια των λοιμώξεων που προκαλεί, φαίνεται να έχει η εξωκυττάρια ουσία (Slime), η οποία παράγεται από όλα τα στελέχη P. aeruginosa και αποτελεί χαρακτηριστική ιδιότητα του είδους. Διάφορες ομάδες ερευνητών ασχολήθηκαν εκτενώς με την απομόνωση και το χαρακτηρισμό της εξωκυττάριας ουσίας με σκοπό την βιοχημική ταυτοποίηση του/των λοιμογόνων παραγόντων του Slime. Από το Εργαστήριο Μικροβιολογίας του Ιατρικού Τμήματος του Πανεπιστημίου Πατρών έχουν προηγηθεί στο παρελθόν δυο Διδακτορικές διατριβές με θέμα τον χαρακτηρισμό του Slime (Αναστασίου 1986), αλλά και τη συγκριτική μελέτη της γλυκολιποπρωτεΐνης (GLP) του Slime με τον λιποπολυσακχαρίτη (LPS) της P. aeruginosa (Χριστοφίδου 1989), οι οποίες έχουν θέσει τις βάσεις για την μελέτη της παθογένειας της P. aeruginosa. Το γεγονός αυτό αποτέλεσε και τη αφορμή της εκπόνησης της παρούσας διατριβής. Η εργασία αυτή ολοκληρώθηκε στο σύνολό της στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας του Ιατρικού Τμήματος του Πανεπιστημίου Πατρών. Η οικονομική κάλυψη της εργασίας έγινε με πιστώσεις του εργαστηρίου και από το ερευνητικό πρόγραμμα βασικής έρευνας «Κ. Καραθεοδωρή» της Επιτροπής Ερευνών του Πανεπιστημίου Πατρών (ερευνητικό πρόγραμμα 2457/2000). Στη διάρκεια της εκπόνησης αυτής της διατριβής δέχθηκα την συμπαράσταση πολλών ανθρώπων που ο καθένας με τον τρόπο του συνέβαλλε στην ολοκλήρωση αυτής της διατριβής. Από την παρούσα θέση θα ήθελα να εκφράσω τις ιδιαίτερες ευχαριστίες μου αλλά και την βαθιά μου ευγνωμοσύνη στους Δασκάλους μου, τον Καθηγητή κ. Γεώργιο Δημητρακόπουλο και την Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Φωτεινή Παληογιάννη για την ανάθεση του θέματος αυτής της διατριβής, την άρτια επιστημονική τους καθοδήγηση αλλά και την ουσιαστική συμβολή τους στην ολοκλήρωση και συγγραφή 13

αυτής της διατριβής. Η συμβολή τους ήταν αδιάκοπη και πολύπλευρη και αποτέλεσε για μένα γνώμονα για την περάτωσή της. Την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Αθανασία Μουζάκη ευχαριστώ θερμά για την ουσιαστική συμβολή της στη συγγραφή της διατριβής μου. Οι παρατηρήσεις της και τα σχόλιά της ήταν πολύτιμα για τη άρτια ολοκλήρωση του παρόντος. Τα μέλη της Εξεταστικής επιτροπής ευχαριστώ θερμά για το επιστημονικό ενδιαφέρον και τη θετική αντιμετώπιση της παρούσας διατριβής. Επίσης οφείλω να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα μέλη ΔΕΠ, ΕΔΤΠ, ερευνητές και συνεργάτες του Εργαστηρίου Μικροβιολογίας για το ευχάριστο και εποικοδομητικό κλίμα συνεργασίας που είχα μαζί τους κατά τη διάρκεια της ολοκλήρωσης των πειραμάτων αυτής της διατριβής. Τη Γραμματέα του Εργαστηρίου Μικροβιολογίας κ. Κωνσταντίνα Μητροκόντη ευχαριστώ ιδιαίτερα για την επιμέλεια και δακτυλογράφηση του Γενικού μέρους της διατριβής μου. Τέλος στην οικογένειά μου, οφείλω τα πλείστα για την διαρκή ενθάρρυνση, υπομονή και συμπαράστασή της σε όλους τους τομείς, χωρίς την οποία θα ήταν αδύνατη η ολοκλήρωση της διατριβής μου. 14

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 1.1. Γενικά περί Pseudomonas aeruginosa Η Pseudomonas aeruginosa (ψευδομονάδα) ανήκει στην οικογένεια Pseudo monadaceae και περιλαμβάνει πολλά είδη, από τα οποία τα περισσότερα ζουν ελεύθερα στο χώμα, το νερό, τη θάλασσα, κτλ. Ορισμένα είδη προκαλούν νόσο σε φυτά, ζώα αλλά και στον άνθρωπο. Επίσης υπάρχουν είδη ψυχρόφιλων ψευδομονάδων που αναπτύσσονται και πολλαπλασιάζονται σε αλλοιωμένα τρόφιμα διατηρούμενα στο ψυγείο. Το συχνότερο είδος ψευδομονάδας που προκαλεί νόσο στον άνθρωπο είναι η Pseudomonas Σπανιότερα aeruginosa. είδη που ενοχοποιούνται για λοιμώξεις στον άνθρωπο και αυτά είναι στην ομάδα των Fluorescent μαζί με την P. aeruginosa, η P. fluorescens, η P. putida, στην ομάδα των Pseudomallei, η P. mallei, η P. cepacia και άλλα είδη. Η P. aeruginosa είναι ευκαιριακό παθογόνο βακτήριο και προκαλεί λοιμώξεις σε Εικόνα 1: Απεικόνιση κυττάρων P. aeruginosa. (www.cellsalive.com) θερμόαιμα και ψυχρόαιμα, σπονδυλωτά, υδρόβια και μη ζώα, έντομα και φυτά. Ο μικροοργανισμός απομονώθηκε για πρώτη φορά από τον Gessard το 1882 και χαρακτηρίσθηκε ως παθογόνο βακτήριο από τον Charrin το 1890. Κατά καιρούς ο μικροοργανισμός έχει λάβει διάφορες ονομασίες. 15

Εικόνα 2: Φωτογραφία από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο κυττάρων P. aeruginosa σε επιθηλιακά κύτταρα τραχείας ποντικού. (www.ftns.wau.nl/micr/edu) Η P. aeruginosa (Pseudomonas: ψευδής μονάς, aeruginosa: πρασινάδα χαλκού), είναι ένα Gram αρνητικό, μη σπορογόνο, μη ελυτροφόρο βακτηρίδιο μήκους 1.5-5 μm και διαμέτρου 0.5-1 μm. Τα κύτταρά της διατάσσονται μεμονωμένα, σε ζεύγη ή σε μικρές αλυσίδες. Είναι κινητό βακτήριο και αυστηρά αερόβιο δηλ. χρησιμοποιεί το O2 ως τελικό δέκτη ηλεκτρονίων. Σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να χρησιμοποιήσει τα νιτρικά ως εναλλακτικό δέκτη ηλεκτρονίων και με τον τρόπο αυτό να αναπτύσσεται αναερόβια. Το 90% περίπου των στελεχών φέρουν μια πολική βλεφαρίδα. Καλλιεργείται εύκολα στα κοινά θρεπτικά υλικά με άριστη θερμοκρασία αναπτύξεως στους 37oC. Είναι το μόνο είδος του γένους που αναπτύσσεται στους 42oC και αυτή η ιδιότητα χρησιμοποιείται για το χαρακτηρισμό του είδους. Όλα τα στελέχη παράγουν καταλάση και οξειδάση. Δε ζυμώνει τη γλυκόζη, ενώ τη διασπά οξειδωτικά, χωρίς παραγωγή αερίου, επειδή περιέχει υψηλές συγκεντρώσεις κυττοχρωματικής οξειδάσης, Δε διασπά τη λακτόζη ή τη μαλτόζη, ενώ δεν παράγει H2S. Οι τροφικές απαιτήσεις του βακτηρίου είναι ελάχιστες, ενώ είναι δυνατό να χρησιμοποιήσει το ατμοσφαιρικό CO2 ως μόνη πηγή άνθρακα και το αμμώνιο ως πηγή αζώτου. Επιζεί στο χλωριωμένο νερό, στα απολυμαντικά, σε φάρμακα και αποστειρωμένα διαλύματα όπως το απεσταγμένο νερό, οφθαλμικά διαλύματα κ.α. Πολύ καλύτερα αναπτύσσεται σε υγρό και θερμό περιβάλλον και έτσι το νοσοκομειακό περιβάλλον παρέχει απεριόριστες μικροοργανισμού. 16 εστίες αναπτύξεως του

Η P. aeruginosa παράγει διάφορες χρωστικές ουσίες όπως πυοκυανίνη, πυορουμπίνη, πυομελανίνη, και φθορεσεΐνη. Περισσότερα από το 50% των στελεχών P. aeruginosa παράγουν μια υδατοδιαλυτή χρωστική, την πυοκυανίνη που έχει χρώμα κυανοπράσινο και χαρακτηρίζει τα στελέχη της P. aeruginosa χωρίς να χρειάζονται περισσότερες βιοχημικές δοκιμασίες για την τυποποίησή τους. Εικόνα 3: Καλλιέργεια P. aeruginosa σε τρυβλίο McConkey. Παραγωγή πυοκυανίνης. (www.students.washington.edu/chenamos/medtechpics) Όταν η P. aeruginosa καλλιεργείται σε στερεά θρεπτικά υλικά μπορεί να δώσει ποικίλους τύπους αποικιών. Οι αποικίες μπορεί να είναι επίπεδες ή κυρτές με κυματώδη ή διαβρωμένη περιφέρεια, διαμέτρου 1-5 mm. Στο αιματούχο άγαρ πολλά στελέχη προκαλούν β-αιμόλυση. Στο McConkey άγαρ παρατηρούνται άχρωμες αποικίες διότι το βακτηρίδιο δε διασπά τη λακτόζη. Τα τρυβλία με στελέχη P. aeruginosa που παράγουν πυοκυανίνη αποκτούν πράσινο σκούρο σχετικά χρώμα και μια ευχάριστη μυρωδιά φρούτου ή τσαγιού βουνού. Ένας άλλος τύπος αποικιών εμφανίζεται κυρίως σε στελέχη που απομονώνονται από τα πτύελα ασθενών με ινοκυστική νόσο του παγκρέατος. Οι αποικίες είναι σχετικά μεγάλες και πολύ βλεννώδεις και είναι δύσκολη η παραλαβή μεμονωμένων αποικιών. Μετά από συνεχείς ανακαλλιέργειες παρατηρείται ελάττωση της ικανότητας παραγωγής βλέννης ή και απώλεια αυτής, με αποτέλεσμα την παραγωγή μακροσκοπικά μη βλεννωδών αποικιών των καλούμενων revertant (Govan 1975). Τα διάφορα επιδημιολογικές στελέχη μελέτες με P. aeruginosa οροτυπία, μπορεί λυσιτυπία, να ταξινομηθούν πυοσινοτυπία ή με για το αντιβιόγραμμα. Σήμερα η ορολογική τυποποίηση γίνεται με 17 ειδικούς αντιορούς, έναντι του σωματικού αντιγόνου, σύμφωνα με το I.A.T.S. ( International Antigenic Typing System) (Pier και Thomus 1982). 17

Η απομόνωση της P. aeruginosa προ τεσσαρακονταετίας ήταν σπάνια και θεωρείτο μη σημαντική. Αφότου όμως άρχισε η χορήγηση των ευρέως φάσματος αντιβιοτικών, των ανοσοκατασταλτικών και κυτταροτοξικών φαρμάκων, η P. aeruginosa ανεδείχθη σε σημαντικότατο και σοβαρότατο παράγοντα νοσοκομειακών λοιμώξεων. Έτσι, ενοχοποιείται για ευκαιριακές λοιμώξεις σε ειδικές ομάδες ασθενών όπως, ανοσοκατασταλμένα άτομα, άτομα με κακοήθεις όγκους, με εκτεταμένα εγκαύματα ή χειρουργικές επεμβάσεις, με κακοήθεις νεοπλασίες του αιμοποιητικού ιστού, όπως λευχαιμίες, λεμφώματα, σε άτομα που υφίστανται μεταμοσχεύσεις, σε διαβητικά άτομα, νεογνά και άτομα που πάσχουν από ινοκυστική νόσο του παγκρέατος (Cross et al 1983). Ο μικροοργανισμός σπάνια προκαλεί λοιμώξεις σε υγιή άτομα παρά το γεγονός ότι 5-10% των ατόμων αποικίζονται με το βακτήριο στο δέρμα και τα κόπρανα. Οι λοιμώξεις που προκαλεί η P. aeruginosa είναι σοβαρές και επικίνδυνες διότι αφενός μεν προκαλεί νόσο σε άτομα ήδη επιβεβαρυμένα από άλλα νοσήματα, αφετέρου δε γιατί εμφανίζει ανθεκτικότητα στα περισσότερα αντιβιοτικά. Μετά την εγκατάσταση μικροβιαιμίας από P. aeruginosa η θνητότητα ανέρχεται στο 70% των περιπτώσεων (Δημητρακόπουλος 1982). 1.2. Λοιμώξεις που προκαλεί η P. aeruginosa Η P. aeruginosa αποτελεί τον αιτιολογικό παράγοντα του 3-6% των εξωνοσοκομειακών λοιμώξεων. Αντίθετα, όπως προαναφέρθηκε, ευθύνεται για ευκαιριακές λοιμώξεις σε διάφορες ομάδες ασθενών που νοσηλεύονται στο νοσοκομείο. Οι λοιμώξεις που προκαλεί είναι: α) Ουρολοιμώξεις: Σε νοσοκομειακούς ασθενείς μετά από καθετηριασμό, κυστεοσκόπηση ή χειρουργικές επεμβάσεις του ουροποιητικού η P. aeruginosa μπορεί να προκαλέσει ουρολοίμωξη. Αποτελεί το αίτιο του 8.5% των ενδονοσοκομειακών ουρολοιμώξεων. β) Λοιμώξεις εγκαυμάτων: Παρατηρείται εξωγενής αποικισμός του εγκαύματος προερχόμενος από το νοσοκομειακό περιβάλλον. Ο αποικισμός αυτός ανάλογα με τη βαρύτητα και την έκταση του εγκαύματος, τη γενική κατάσταση του ασθενούς και τα θεραπευτικά μέτρα που θα ληφθούν μπορεί να εξελιχθεί σε διαπύηση του εγκαύματος, με βαθιές βλάβες του δέρματος, με συχνό επακόλουθο τη βακτηριαιμία και το θάνατο. 18

γ) Δερματικές λοιμώξεις: Η P. aeruginosa μπορεί να προκαλέσει από κηλιδώδεις μέχρι και φλυκταινώδεις βλάβες του δέρματος, όπως επίσης και θυλακίτιδα (Khabbaz 1983, Gustafson 1983). Επίσης, μετά από κολύμβηση σε δεξαμενές η P. aeruginosa μπορεί να προκαλέσει δερματικές λοιμώξεις όπως εξωτερική ωτίτιδα (Swimmer s ear). Γενικότερα μπορεί να προκαλέσει και άλλες λοιμώξεις του δέρματος, όπως κυτταρίτιδα, χρόνια παρονυχία, πυοδερματίτιδα, λοιμώξεις των πτυχών του δακτύλου του ποδιού και αιμορραγική νέκρωση του δέρματος που καλείται γαγγραινώδες έκθυμα (ecthyma gangrenosum). δ) Λοιμώξεις του οφθαλμού: Προκαλείται επιπεφυκίτιδα και δακρυοκυστίτιδα. Αυτές παρατηρούνται σπάνια και μετά από χειρουργικές επεμβάσεις του οφθαλμού. Πιο συχνές είναι οι λοιμώξεις της επιμόλυνσης τραυμάτων του κερατοειδούς. Η P. aeruginosa αποτελεί το περισσότερο καταστρεπτικό βακτήριο του κερατοειδούς. ε) Λοιμώξεις Κ.Ν.Σ.-Αναπνευστικού: Μπορεί να προκαλέσει πρωτοπαθή ή δευτεροπαθή μηνιγγίτιδα. Επίσης, προκαλεί λοιμώξεις του αναπνευστικού σε νοσοκομειακούς ασθενείς, μετά τη χρήση μολυσμένων αναπνευστήρων. Οι λοιμώξεις αυτές μπορεί να καταλήξουν σε βαρειά νεκρωτική πνευμονία με θνητότητα μέχρι και 80%. στ) Οστεομυελίτιδα: Παρατηρείται κυρίως σε τοξικομανείς, σε ασθενείς που είναι σε αιματοδιάλυση και σε καθετηριασμούς της υποκλειδίου φλέβας. Συνηθέστερη εντόπιση είναι οι σπόνδυλοι. ζ) Ενδοκαρδίτιδα: Η θνητότητα ανέρχεται στο 70% των περιπτώσεων. η) Σηπτική αρθρίτιδα: Η P. aeruginosa αποτελεί το αίτιο σε ποσοστό 10% των αρθρίτιδων από Gram αρνητικά βακτήρια. Η θεραπεία είναι δύσκολη. θ) Διαρροϊκό σύνδρομο: Προσβάλλονται κυρίως τα νεογνά. ι) Ινοκυστική νόσος: Το βακτήριο ανιχνεύεται στο αναπνευστικό σύστημα ατόμων που πάσχουν από ινοκυστική νόσο του παγκρέατος. Πάνω από το 90% των στελεχών που απομονώνονται από τα πτύελα τέτοιων ασθενών είναι βλεννώδη. Τα στελέχη αυτά εκριζώνονται πολύ δύσκολα, ενώ είναι ανθεκτικά στη φαγοκυττάρωση από ουδετερόφιλα. Η απόκτηση του βλεννώδους χαρακτήρα σχετίζεται άμεσα με τη σοβαρότητα της νόσου. Η χημική ανάλυση του πολυσακχαρίτη όλων των βλεννωδών στελεχών (αλγινικό) έδειξε ότι αποτελείται κυρίως από D-μαννουρονικό οξύ και κάποιες ποσότητες L-γουλουρονικού οξέος (Pier et al 1983). Ανεξάρτητα από το σημείο 19

αποικισμού του μικροβίου, ο πολυσακχαρίτης που απομονώνεται από όλα τα στελέχη P. aeruginosa (Anastasiou et al 1987) αποτελείται από D-μαννουρονικό το οποίο είναι συνδεδεμένο στις θέσεις β,1-4 με L-γουλουρονικό οξύ. Οι πολυσακχαρίτες που παραλαμβάνονται από διάφορα βλεννώδη στελέχη είναι σχεδόν όμοιοι μεταξύ τους, διαφέρουν μόνο στο λόγο του μαννουρονικού οξέος προς το γουλουρονικό και στο βαθμό ακετυλίωσης που είναι ανάλογος της περιεκτικότητας σε μαννουρονικό οξύ. Ο ρόλος του αλγινικού στη παθογένεια των λοιμώξεων από το βακτήριο σε ασθενείς με ινοκυστική νόσο δεν είναι πλήρως κατανοητός μέχρι σήμερα. Ίσως η παραγωγή του να σχετίζεται με την καλύτερη προσαρμογή και επιβίωση του μικροβίου στο βρογχοπνευμονικό περιβάλλον αυτών των ασθενών. 1.3. Λοιμογόνοι παράγοντες και παθογένεια των λοιμώξεων της P. aeruginosa Ο τρόπος με τον οποίο η P. aeruginosa ασκεί την παθογόνο δράση της είναι πολύπλοκος και δεν έχει ακόμα πλήρως αποσαφηνιστεί. Πολλοί κυτταρικοί παράγοντες του μικροβίου αλλά και εξωκυττάρια προϊόντα έχουν κατά καιρούς ενοχοποιηθεί. Για παράδειγμα, διάφορες τοξίνες και ένζυμα που παράγονται και εκκρίνονται από το βακτήριο, όπως η αλκαλική πρωτεάση, η ελαστάση, η αιμολυσίνη, η φωσφολιπάση C, το εξωένζυμο S, η εξωτοξίνη Α, οι διάφορες χρωστικές κ.α. Το κυτταρικό τοίχωμα της P. aeruginosa, όπως και άλλα Gram αρνητικά βακτηρίδια, αποτελείται από την εξωτερική μεμβράνη, μια στοιβάδα πεπτιδογλυκάνης και την εσωτερική κυτταροπλασματική μεμβράνη. Ο λιποπολυσακχαρίτης (LPS), οι φίμπριες, ο εξωκυττάριος πολυσακχαρίτης (slime), και ο βλεννώδης πολυσακχαρίτης (αλγινικό οξύ) είναι μερικοί από τους λοιμογόνους παράγοντες της P. aeruginosa. Στο κεφάλαιο αυτό θα δοθεί ιδιαίτερη έμφαση στο λιποπολυσακχαρίτη και στον εξωκυττάριο πολυσακχαρίτη τα οποία αποτέλεσαν και το αντικείμενο μελέτης αυτής της διατριβής. 20

Πίνακας 1. Λοιμογόνοι Παράγοντες της P. aeruginosa Κατηγορία-Παράγοντες Βιολογικό αποτέλεσμα Εξωκυττάριοι: Εξωτοξίνη-Α Κυτταρική λύση, τοξικότητα μακροφάγα Λύση κυττάρων, Πρωτεάσες ελάττωση Διήθηση μηχανισμών στα ιστών, ενεργοποίησης Φωσφολιπάση συμπληρώματος Καταστροφή πνευμονικού επιφανειακού Χρωστικές παράγοντα Αντιβακτηριακές ιδιότητες Κυτταρικοί: Λιπίδιο-Α Λιποπολυσακχαρίτης LPS Φίμπριες Φαινόμενα τοξικότητας Αντιφαγοκυτταρικές ιδιότητες Προσκολλητικότητα σε επιθηλιακά Εξωκυττάριος πολυσακχαρίτης Slime κύτταρα Φαινόμενα ενδοτοξίνης, τοξικότητα στα Βλεννώδης πολυσακχαρίτης ουδετερόφιλα Αντιφαγοκυτταρικές ιδιότητες, ελάττωση μηχανισμών καθάρσεως των πνευμόνων Πίνακας 1: Τα στοιχεία του πίνακα προέρχονται από τον Bodey και συνεργάτες, 1983. 1.3.1. Εξωκυττάριοι λοιμογόνοι παράγοντες 1.3.1.1. Εξωτοξίνη Α Τα περισσότερα στελέχη της P. aeruginosa παράγουν αρκετές εξωκυττάριες τοξίνες. Η σπουδαιότερη από αυτές είναι η εξωτοξίνη Α (Liu et al 1974). Πρόκειται για μία θερμοευαίσθητη πρωτεΐνη που έχει αποτελέσει αντικείμενο εκτενούς μελέτης από πολλούς ερευνητές (Hirakata et al 1999 και Staugas et al 1992) και παράγεται από το ~90% των κλινικά απομονωθέντων στελεχών P. aeruginosa. Προκαλεί την αναστολή της πρωτεϊνοσύνθεσης των ευκαρυωτικών κυττάρων με ίδιο μηχανισμό όπως και η διφθεριτική τοξίνη. Η τοξίνη εισέρχεται στο κύτταρο από τους πόρους λιπιδικής σύστασης (Zolwan και Wisnieski 1985). 21

Εικόνα 4: Τριτοταγής δομή της Exotoxin A. (www.aplha1.stanford.edu/exotoxin) Έχει αναφερθεί ότι η εξωτοξίνη Α είναι κυτταροτοξική in vitro σε καλλιέργειες ευκαρυωτικών κυττάρων. Σε χαμηλές συγκεντρώσεις της τάξης των 30ng/ml προκαλεί μορφολογικές μεταβολές σε καλλιέργειες ανθρώπινων μακροφάγων (Pollack και Anderson 1978). Η τοξίνη έχει αντιγονική ικανότητα και αντισώματα ανιχνεύονται σε υγιή άτομα που δεν αναφέρουν λοίμωξη από το βακτήριο. 1.3.1.2. Εξωένζυμο S Το εξωένζυμο S είναι ένα εξωκυττάριο προϊόν της P. aeruginosa πρωτεϊνικής φύσης (Mody et al 1995). Έχει παρόμοια δράση με αυτή της εξωτοξίνης A όμως είναι θερμοανθεκτική. Παρόλο που φαίνεται να έχουν παρόμοια ενζυμική δράση, εν τούτοις διαφέρουν ως προς τις φυσικές και βιοχημικές ιδιότητες. Το εξωένζυμο S περιέχει μεγάλα ποσά γλουταμινικού οξέος, προλίνης, λευκίνης, τυροσίνης και άλλων αμινοξέων. Το εξωένζυμο S χορηγούμενο ενδοτραχειακά σε επίμυες προκαλεί εκτεταμένες βλάβες του πνεύμονα. 1.3.1.3. Πρωτεάσες Τα πιο πολλά στελέχη P. aeruginosa παράγουν 3 εξωκυττάριες πρωτεάσες. Αυτές είναι η ελαστάση (πρωτεάση ΙΙ), η αλκαλική πρωτεάση (πρωτεάση ΙΙΙ) και η πρωτεάση Ι. 22

Εικόνα 5: Τριτοταγής δομή της ελαστάσης (πρωτεάση ΙΙ). www.alpha1.stanford.edu/elastase Τα ένζυμα αυτά είναι τοξικά σε διάφορους ιστούς και είναι ικανά να αποικοδομούν πρωτεΐνες του πλάσματος, όπως παράγοντες πήξεως και συμπληρώματος. Ο ρόλος των πρωτεασών έχει επισημανθεί στην παθογένεια της κερατίτιδας και της πνευμονίας. Οι πρωτεάσες της P. aeruginosa αποικοδομούν το κολλαγόνο, το κύριο συστατικό του συνδετικού ιστού. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα την ανεύρεση εκτεταμένων νεκρώσεων με μικροαποστήματα και καταστροφή των αγγείων με αιμορραγικές βλάβες στα ιστολογικά παρασκευάσματα. 1.3.1.4. Χρωστικές Οι χρωστικές που παράγονται από το βακτήριο και ιδιαίτερα οι φαιναζίνες ενοχοποιούνται άμεσα ή έμμεσα στην παθογένεια διαφόρων λοιμώξεων. Η πυοκυανίνη και η φθορεσεΐνη αναστέλλουν την ανάπτυξη άλλων βακτηρίων και έτσι διευκολύνεται η ανάπτυξη της P. aeruginosa. 1.3.1.5. Αιμολυτικοί παράγοντες Η P. aeruginosa παράγει 2 αιμολυσίνες. Η πρώτη, η φωσφολιπάση C, είναι μια θερμοευαίσθητη αιμολυσίνη που συμβάλλει σημαντικά στην παθογένεια της πνευμονίας. Η δεύτερη και θερμοανθεκτική αιμολυσίνη είναι γλυκολιπιδικής φύσης 23

και έχει βρεθεί ότι δεν είναι τόσο τοξική αλλά ενισχύει τη δράση της φωσφολιπάσης C. 1.3.1.6. Λευκοκτονίνη Το 1976 ο Scharmann και οι συνεργάτες του περιέγραψαν τη λευκοκτονίνη. Είναι μία ουσία πρωτεϊνικής φύσης η οποία έχει κυτταροτοξική δράση σε πολυμορφοπύρηνα βοδιού και ανθρώπου. Το 1979 ο Lutz καθάρισε καλύτερα αυτή την πρωτεΐνη και τη μετονόμασε σε κυτταροτοξίνη, διότι σε in vivo και in vitro μελέτες του διαπίστωσε ότι η πρωτεΐνη αυτή είναι τοξική για όλα τα ευκαρυωτικά κύτταρα, πλην των αιμοπεταλίων και των ερυθροκυττάρων ορισμένων ειδών θηλαστικών. 1.3.2. Κυτταρικοί λοιμογόνοι παράγοντες Το κυτταρικό τοίχωμα της P. aeruginosa παρουσιάζει την τυπική δομή των Gram αρνητικών βακτηρίων. Δηλαδή αποτελείται εκ των έσω προς τα έξω, από την κυτταροπλασματική μεμβράνη, το στρώμα της πεπτιδογλυκάνης, τη λιποπρωτεΐνη του Braun και την εξωτερική μεμβράνη. Η εξωτερική μεμβράνη αποτελείται από φωσφολιπίδια, πρωτεΐνες και λιποπολυσακχαρίτες. Ο χώρος που περιλαμβάνεται μεταξύ της κυτταροπλασματικής μεμβράνης και της εξωτερικής μεμβράνης καλείται περιπλασμικός χώρος, μέσα στον οποίο Χαρακτηριστική ιδιότητα του είδους ανευρίσκονται διάφορα ένζυμα. αποτελεί η παραγωγή εξωκυττάριου πολυσακχαρίτη που βρίσκεται χαλαρά συνδεδεμένος με το κυτταρικό τοίχωμα σε αντίθεση με άλλα βακτήρια στα οποία σχηματίζεται σαφές έλυτρο. 1.3.2.1. Λιποπολυσακχαρίτης (LPS) Ο λιποπολυσακχαρίτης (LPS) είναι μέρος του κυτταρικού τοιχώματος των Gram αρνητικών βακτηρίων και συγκεκριμένα αποτελεί το εξωκυττάριο στοιχείο του κυτταρικού περιβλήματος. Ο LPS της P. aeruginosa περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1937 και αναλύθηκε το 1958. Μέχρι σήμερα έχουν γίνει πάρα πολλές μελέτες για το λιποπολυσακχαρίτη των Gram αρνητικών βακτηρίων (Goldberg και Pier 1996). Έχει βρεθεί ότι η βασική αρχιτεκτονική δομή του LPS της P. aeruginosa είναι ίδια με εκείνη του LPS των εντεροβακτηριδίων (Wilkinson 1983). Γενικά, ο LPS αποτελείται από ένα κεντρικό πολυσακχαρίτη (core polysaccharide) που συνδέεται με ένα 24

σύμπλοκο λιπίδιο (λιπίδιο Α) και ειδικές πλευρικές αλυσίδες από επαναλαμβανόμενες μονάδες ολιγοσακχαριτών που καθορίζουν την ορολογική ειδικότητα του στελέχους. Τα 3 τμήματα αυτά του LPS συνδέονται μεταξύ τους με ομοιοπολικούς δεσμούς. Εικόνα 6: Σχηματική δομή του λιποπολυσακχαρίτη (LPS) Gram αρνητικών βακτηρίων. Φαίνονται οι δομές του λιπιδίου Α, του core πολυσακχαρίτη και οι Οπλευρικές αλυσίδες. (www.endosate.co.kr/lab.html) Ο κεντρικός πολυσακχαρίτης αποτελείται από τμήμα εξοζών, τμήμα επτοζών και το 2-κέτο-3-δεόξυ-οκτανικό οξύ (KDO). Οι μακριές πλευρικές αλυσίδες αποτελούνται από διάφορα σάκχαρα με διαφορετική κάθε φορά διάταξη. Οι πλευρικές αλυσίδες αποτελούν το σωματικό πολυσακχαρίτη Ο (σωματικό αντιγόνο Ο) και ονομάζονται Ο-ειδικές πλευρικές αλυσίδες. Τα στελέχη που φέρουν πλευρικές αλυσίδες εμφανίζουν αποικίες S (Smooth), ενώ τα στελέχη που έχουν χάσει τις πλευρικές αλυσίδες και φέρουν μόνο το κεντρικό πολυσακχαρίτη σχηματίζουν αποικίες R (Rough). Το λιπίδιο Α είναι το υδρόφοβο τμήμα του LPS και βρίσκεται μέσα στην εξωτερική μεμβράνη. Ο σκελετός του αποτελείται από 2 μόρια γλυκοζαμίνης συνδεδεμένα μεταξύ τους με β-1,6 γλυκοσιδικό δεσμό (Gmeimer at al 1969). Δύο υδροξυλομάδες του δισακχαρίτη είναι εστερικά συνδεδεμένες με φωσφορικές ομάδες στις θέσεις 1, 4. Οι άλλες υδροξυλομάδες του δισακχαρίτη και οι αμινομάδες ενώνονται με 5-6 μακριές αλυσίδες 2 ή 3 υδρόξυ λιπαρών οξέων, μοναδικών στο LPS 25

των Gram (-) βακτηρίων (Darveau και Hancock 1983). Ο τύπος και η θέση των λιπαρών οξέων ποικίλει μεταξύ των βακτηριακών ειδών (Hitchcock et al 1986). Τα κύρια λιπαρά οξέα είναι πέντε: α) δωδεκανικό, β) εξαδεκανικό, γ) 3-υδρόξυ δεκανικό, δ) 2-υδροξυδωδεκανικό και ε) 3-υδροξυδωδεκανικό. Τα λιπαρά οξέα είναι β-α- υδρόξυ και άκυλο λιπαρά οξέα. Το β-υδροξυμυριστικό οξύ είναι λιπαρό οξύ με C14, υπάρχει πάντα στο λιπίδιο Α και είναι μοναδικό στη φύση. Άλλα λιπαρά οξέα στο λιπίδιο Α είναι το λαουρομυριστικό, το μυριστιξυμυριστικό. Αν και υπάρχουν κάποιες διαφορές, ο σκελετός του λιπιδίου Α της P. aeruginosa έχει την ίδια γενική αρχιτεκτονική με αυτή του LPS των εντεροβακτηριοειδών (Kropinski at al 1982), (Wilkinson 1983). Το λιπίδιο Α συνδέεται με ομοιοπολικό δεσμό με τον κεντρικό ολιγοσακχαρίτη (core). Ο δεσμός είναι κετοσιδικός μεταξύ του ενός μορίου της γλυκοζαμίνης του λιπιδίου Α και του KDO του core. Τα σάκχαρα που συνιστούν τον κεντρικό ολιγοσακχαρίτη είναι η D-γλυκόζη, η D-γαλακτόζη, η D-γλυκοζαμίνη, η L-γλυκερομαννόζη και το 2-κέτο-3-δεόξυ οκτανικό (KDO) με το οποίο συνδέεται ο κεντρικός ολιγοσακχαρίτης στο λιπίδιο-a (Δημητρακόπουλος 1975). Η δομή του κεντρικού ολγοσακχαρίτη είναι ίδια στα στελέχη συγκεκριμένου βακτηριακού είδους. Στην P. aeruginosa ο κεντρικός ολιγοσακχαρίτης αποτελείται από το KDO, την Lγλυκερο-D-μαννοεπτόζη, φωσφορικές ομάδες και φωσφορυλαιθανολαμίνη. Τα υπόλοιπα σάκχαρα είναι: ραμνόζη, γλυκόζη, γαλακτοζαμίνη και αλανίνη (Assoynanyi και Meadow 1980). Οι ειδικές πλευρικές αλυσίδες της P. aeruginosa είναι πλούσιες σε αμινοσάκχαρα. Τα πιο συχνά ουδέτερα σάκχαρα είναι η L-ραμνόζη, η D-γλυκόζη, η ξυλόζη, και η ριβόζη. Οι ακόλουθες ουσίες επίσης έχουν βρεθεί σε διάφορους ορότυπους ως βασικά στοιχεία των πλευρικών αλυσίδων: γλυκοζαμίνη, γαλακτοζαμίνη, φουκοζαμίνη, 2-αμινο-2-δεοξυγλουκουρονικό οξύ. Η βιοσύνθεση του LPS ξεκινά από το λιπίδιο Α, προστίθεται το core τμήμα και στη συνέχεια οι μακριές πλευρικές αλυσίδες. Ο LPS χορηγούμενος σε πειραματόζωα αλλά και στον άνθρωπο προκαλεί πληθώρα παθοφυσιολογικών καταστάσεων, όπως πυρετό, φαινόμενο Shwartzman, διαταραχές του μεταβολισμού, λευκοκυττάρωση, λευκοπενία, υπόταση, κυκλοφορική ανεπάρκεια (shock) ακόμα και θάνατο. Λόγω της θέσης που κατέχει στο κυτταρικό τοίχωμα των Gram αρνητικών βακτηρίων και των τοξικών του συνεπειών ονομάζεται και ενδοτοξίνη. 26

Η ενδοτοξίνη ή LPS είναι το κύριο επιφανειακό αντιγόνο των Gram αρνητικών βακτηρίων (Rietchel et al 1987), αναστέλλει τη δράση του συμπληρώματος, ασκεί μιτογόνο δράση στα Β-λεμφοκύτταρα, ενώ δεν φαίνεται να επιδρά στα Τ-λεμφοκύτταρα. Επίσης, έχει βρεθεί ότι δρα στο σύστημα των Μονοπυρήνων-Μακροφάγων και προκαλεί την ενεργοποίηση τους καθώς και την παραγωγή πολλών χημειοτακτικών παραγόντων και/ή κυτταροκινών. Τέλος, η ενδοτοξίνη ενεργοποιεί το συμπλήρωμα και με τις 2 οδούς ενεργοποίησής του (Morisson 1983). Το μέρος του LPS που είναι υπεύθυνο για τα τοξικά αποτελέσματα είναι το λιπίδιο Α (Rietchel et al 1987). Ο LPS της P. aeruginosa φαίνεται ότι δεν παίζει τον ίδιο σημαντικό ρόλο στην εμφάνιση τοξικών φαινομένων όπως συμβαίνει με τον LPS των ενετεροβακτηριοειδών. Αυτό μπορεί εν μέρει να οφείλεται στις διαφορές της χημικής σύστασης του λιπιδίου Α της P. aeruginosa (Bodey et al 1983). Γενικά η ανοσία έναντι της P. aeruginosa είναι χυμική κυρίως και έχει σχέση με την παραγωγή αντισωμάτων για τον LPS καθώς επίσης και για την τοξίνη Α. Εμβόλια πολυδύναμα με LPS έχουν περιορισμένη εφαρμογή μόνο σε εγκαυματίες (Holder 1988). Επειδή τα εμβόλια αυτά προκαλούν διάφορες τοξικές αντιδράσεις όταν χορηγούνται στον άνθρωπο, δοκιμάζονται εμβόλια λιγότερο τοξικά με τη χρησιμοποίηση άλλων στοιχείων του κυτταρικού τοιχώματος και του εξωκυττάριου πολυσακχαρίτη της P. aeruginosa. 1.3.2.2. Πορίνες Η εξωτερική μεμβράνη των Gram αρνητικών βακτηρίων είναι μια διπλοστοιβάδα φωσφολιπιδίων, που φέρει μόρια λιποπολυσακχαριτών και ένα σύστημα πρωτεϊνών. Η εξωτερική μεμβράνη αφενός μεν δεν αφήνει να μετακινηθούν οι πρωτεΐνες του περιπλασμικού χώρου, αφετέρου δε προφυλάσσει το βακτηριακό κύτταρο από διάφορους παράγοντες βλαπτικούς π.χ. ένζυμα υδρολυτικά. Δρα επίσης, ως ηθμός και αφήνει μόνο μικρού Μ.Β. υδρόφιλες ουσίες να εισέλθουν ενώ μεγαλύτερες ουσίες όπως για παράδειγμα τα αντιβιοτικά διέρχονται δυσκολότερα. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τα Gram αρνητικά βακτήρια να εμφανίζουν μεγαλύτερη αντοχή σε πολλά αντιβιοτικά από ότι τα Gram θετικά βακτήρια. Η ιδιότητα της εξωτερικής μεμβράνης να δρα προστατευτικά αποκλείοντας τη διέλευση βλαβερών για το βακτήριο μορίων, οφείλεται στο σύστημα των πρωτεϊνών της, τις ονομαζόμενες πορίνες. 27

Εικόνα 7: Σχηματική δομή του κυτταρικού τοιχώματος Gram αρνητικού βακτηρίου. (www.cat.cc.md.us/toll/u1fig10b.html) Οι πορίνες σχηματίζουν διαμεμβρανικούς πόρους, *γεμάτους νερό, και θέτουν έναν ουδό μοριακού βάρους αποκλείοντας τη διακίνηση μορίων με μοριακό βάρος μεγαλύτερο του ουδού (cut off). Οι περισσότερες πορίνες διαθέτουν εκτός του μοριακού μεγέθους και μικρή χημική εκλεκτικότητα, ιοντική ή ηλεκτρικού φορτίου. Οι πορίνες συνδέονται με ιοντικούς ή υδρόφοβους δεσμούς με τον LPS και την υποκείμενη πεπτιδογλυκάνη (Nikaido και Vocara 1985). Η σύνθεση των πορινών επηρεάζεται από γενετικούς και περιβαλλοντικούς παράγοντες. Στην εξωτερική μεμβράνη βρίσκονται συνήθως στην τριμερή τους μορφή. Είναι σταθερές στη μετουσίωση με SDS, ενώ σε θερμοκρασία >60οC μετατρέπονται σε μη λειτουργικές μονομερείς μορφές. Ο ρόλος των πορινών στη διαπερατότητα της εξωτερικής μεμβράνης έχει αποδειχθεί με τη μελέτη μεταλλακτικών στελεχών στερούμενων πορινών, σε σχέση με τα αντίστοιχα μητρικά στελέχη. 1.3.2.3. Γλυκολιποπρωτεΐνη (GLP) Εξωκυττάριου πολυσακχαρίτη (Slime) Η παραγωγή του Slime ή εξωκυττάριας βλεννώδους ουσίας από την P. aeruginosa αποτελεί χαρακτηριστική ιδιότητα του είδους. Το 1951 ο Haynes παρατήρησε ότι καλλιέργεια P. aeruginosa σε ζωμό γινόταν παχύρρευστη μετά από 28

λίγες ημέρες. Η ιδιότητα αυτή οφείλεται στην εξωκυττάρια βλεννώδη ουσία που παράγεται από το βακτήριο, και συνδέεται χαλαρά με το μικροβιακό κύτταρο χωρίς να σχηματίζει έλυτρο. Ο όρος slime χρησιμοποιείται στη βιβλιογραφία και για την εξωκυττάρια βλεννώδη ουσία μακροσκοπικά βλεννωδών στελεχών P. aeruginosa. Τα στελέχη αυτά απομονώνονται κυρίως από πτύελα ατόμων με ινοκυστική νόσο του παγκρέατος μετά από χρόνιο αποικισμό. Ο όρος εξωκυττάριος πολυσακχαρίτης είναι απλουστευμένος γιατί στην πραγματικότητα αναφέρεται όχι σε ένα συγκεκριμένο πολυσακχαρίτη, αλλά σε ένα σύνολο εξωκυττάριων ουσιών. Παρά το γεγονός ότι η έρευνα για τη χημική σύσταση του slime είναι εκτεταμένη (Bartel et al 1970, Evans et al 1973, Dimitracopoulos et al 1974, Arsenis et al 1986), η πλήρης δομή του είναι μη αποσαφηνισμένη. Στο παρελθόν, ανάλογα με τη μεθοδολογία απομόνωσης του Slime πολλοί ερευνητές έπαιρναν διαφορετικής χημικής σύστασης προϊόν P. aeruginosa. Το 1954 οι Eagon και Randles αναφέρουν ότι ο εξωκυττάριος πολυσακχαρίτης αποτελείται από μαννόζη. Το 1961 ο Liu και οι συνεργάτες του αναφέρουν ότι το slime είναι πολύ τοξικό προϊόν του βακτηρίου και έχει αντιγονική δράση. Επίσης, παρατηρούν ότι ενεργητική ανοσοποίηση πειραματόζωων με slime τα προφυλάσσει από λοίμωξη από το ίδιο στέλεχος όχι όμως και από άλλα στελέχη. Το 1970-1973 η ομάδα του Bartell, Orr και Chudio εφαρμόζει ενιαία μέθοδο παραλαβής του slime και παραλαμβάνουν σχετικά καθαρό προϊόν της ίδιας πάντοτε χημικής σύστασης με βασικά στοιχεία υδατάνθρακες, πρωτεΐνες και λίπη. Ο Sensakovic σε συνεργασία με τον Bartell βελτιώνουν την ήδη υπάρχουσα αυτή μεθοδολογία και σε μία συγκριτική μελέτη με τον ομόλογο LPS, αναφέρουν ότι το Slime περιέχει 1% λίπη, 14% πρωτεΐνη, ενώ αντίθετα ο LPS περιέχει 21% λίπη και 1% πρωτεΐνη. Η περιεκτικότητα του LPS σε επτόζες και KDO είναι μεγαλύτερη από αυτή του Slime. Όσον αφορά τις βιολογικές ιδιότητες του Slime (Bartell 1983) αναφέρουν ότι είναι πιο τοξικό από αυτό του LPS όταν χορηγείται ενδοπεριτοναϊκά σε ποντίκια. Επίσης, το Slime έχει αντιφαγοκυτταρική ικανότητα σε αντίθεση με τον LPS. Το 1974, η ίδια ερευνητική ομάδα (Sensakovic και Bartell) συνεχίζοντας την μελέτη των ιδιοτήτων του Slime παρατηρούν ότι η ενδοπεριτοναϊκή χορήγησή του σε ποντίκια προκαλεί τοξικά φαινόμενα, λευκοπενία και τελικά το θάνατο των πειραματοζώων. Τα ίδια ακριβώς φαινόμενα παρατηρούνται και μετά από 29

ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση ζωντανών κυττάρων P. aeruginosa. Είναι σημαντικής αξίας η παρατήρηση των Bartell και Sensacovic ότι η προηγούμενη ενεργητική και παθητική ανοσοποίηση των πειραματόζωων με Slime ή ειδικό αντιορό αντίστοιχα, προστατεύει τα πειραματόζωα από τα τοξικά φαινόμενα και το θάνατο, όταν χορηγείται ενδοπεριτοναϊκά θανατηφόρος δόση ζωντανών κυττάρων P. aeruginosa. Με βάση τις έρευνες και τα αποτελέσματα των Sensacovic και Bartell, ένα χρόνο αργότερα, το 1975, ο Δημητρακόπουλος σε συγκριτική μελέτη πέντε στελεχών P. aeruginosa ως προς τη χημική σύσταση αλλά και τις βιολογικές ιδιότητες του εξωκυττάριου πολυσακχαρίτη, καταλήγει στα ακόλουθα συμπεράσματα: α) Ο εξωκυττάριος πολυσακχαρίτης (Slime), αποτελείται βασικά από τα ίδια συστατικά που είναι κυρίως υδατάνθρακες, πρωτεΐνες και λίπη. Οι διαφορές αφορούν την ποσοτική αναλογία των κύριων συστατικών ανάμεσα στα διαφορετικά στελέχη P. aeruginosa. β) Ο όρος γλυκολιποπρωτεΐνη (glycolipoprotein-glp), χρησιμοποιείται για να χαρακτηρίσει αυτό το προϊόν που παραλαμβάνεται με προτυπωμένη διαδικασία εξαγωγής. γ) Οι υδατάνθρακες που περιέχει το slime είναι: εξόζες, επτόζες, ουρονικό οξύ, αμινοσάκχαρα και 2-κετο-3-δεοξυοκτονικό οξύ. Από τις εξόζες ανιχνεύονται η ραμνόζη, η μαννόζη, η γαλακτόζη, και η γλυκόζη και από τα αμινοσάκχαρα η γλυκοζαμίνη και η γαλακτοζαμίνη. δ) Η πειραματική λοίμωξη ποντικιών με ζωντανά κύτταρα στελεχών P. aeruginosa, ανεξάρτητα του ανοσοτύπου στον οποίο ανήκουν, προκαλούν τοξικά φαινόμενα όπως διαρροϊκές κενώσεις, λήθαργο, σπασμούς, λευκοπενία και τελικά θάνατο. Οι ιδιότητες αυτές οφείλονται στο λιπιδικό στοιχείο του εξωκυττάριου πολυσακχαρίτη. ε) Η χορήγηση εξωκυττάριου πολυσακχαρίτη (Slime) προκαλεί τα ίδια ακριβώς συμπτώματα. στ) Η μέση θανατηφόρος δόση (ΘΔ50) του slime για τα ποντίκια είναι 2550μg/g ποντικιού ανάλογα με το στέλεχος που εξετάζεται. Η in vivo παραγωγή Slime (Dimitracopoulos et al 1974), η πρόκληση των ίδιων τοξικών φαινομένων με τα ζωντανά κύτταρα P. aeruginosa (Dimitracopoulos 1979), και η in vitro αντιφαγοκυτταρική ικανότητα (Dimitracopoulos 1980) αποτελούν σαφείς ενδείξεις ότι το Slime είναι σημαντικός τοξικός παράγοντας του βακτηρίου που παίζει ενεργό ρόλο στην παθογένεια της λοίμωξης. 30

Επίσης, η Koepp και οι συνεργάτες της το 1984 μελετώντας το ρόλο του πολυσακχαριδικού στοιχείου της GLP σε σχέση με τις τοξικές ιδιότητες της γλυκολιποπρωτεΐνης, μετά από σειρές πειραμάτων κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι το πολυσακχαριδικό στοιχείο είναι απαραίτητο για την πλήρη έκφραση των τοξικών ιδιοτήτων της GLP που αποδίδονται στο λιπιδικό της στοιχείο. Επίσης, συμπεραίνουν ότι η μαννόζη αποτελεί τον κύριο επαγωγέα, ενώ η γλυκόζη και η ραμνόζη συνεισφέρουν στην παραπάνω ιδιότητα. Το πρωτεϊνικό στοιχείο της GLP φαίνεται ότι δεν έχει βιολογική δράση (Koepp et al 1981). Η απομόνωση μακροσκοπικά βλεννώδους στελέχους P. aeruginosa από αιματοκαλλιέργεια έγινε για πρώτη φορά το 1986 (Anastassiou et al 1986). Από το στέλεχος αυτό απομονώθηκε η εξωκυττάρια ουσία και το κύριο συστατικό της παρελήφθη σε καθαρή μορφή και χαρακτηρίσθηκε ως αλγινικό υψηλού μοριακού βάρους, ανάλογο του αλγινικού που χαρακτηρίζει την εξωκυττάρια ουσία βλεννωδών στελεχών που απομονώνονται από τα πτύελα ασθενών με ινοκυστική νόσο του παγκρέατος. Από το μητρικό βλεννώδες στέλεχος (Μ.Β.Σ.) παρελήφθη θυγατρικό μη βλεννώδες στέλεχος (Θ.Μ.Β.Σ.) μετά από συνεχείς in vitro ανακαλλιέργειες σε στερεά θρεπτικά υλικά. Από αυτό παρελήφθη η εξωκυττάρια ουσία που αποτελείτο από 16% ουρονικά, 48% υδατάνθρακες, 11% πρωτεΐνες και 2% λίπη. Από τη γενική χημική ανάλυση και τον έλεγχο της μιτογόνου δράσης φαίνεται ότι η εξωκυττάρια ουσία του Θ.Μ.Β.Σ. είναι ανάλογη της GLP του slime. 31

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 2.1. Ανοσοποιητικό σύστημα (Innate & Adaptive Immune System) Ο όρος ανοσία (immunity) έχει προέλθει από το λατινικό όρο immunitas, ο οποίος αναφερόταν στο προνόμιο Ρωμαίων αξιωματούχων να εξαιρούνται ποινικών διώξεων κατά την άσκηση καθηκόντων τους. Κυριολεκτικά, ανοσία σημαίνει προφύλαξη από νοσήματα-ασθένειες και πιο συγκεκριμένα από λοιμώδη νοσήματα. Το σύνολο των μορίων και/ή των κυττάρων που παίζουν ρόλο στην ανοσία (αλλά και τις νεοπλασίες και την απόπτωση) απαρτίζουν το ανοσοποιητικό σύστημα, η δε συγχρονισμένη και κατευθυνόμενη αντίδραση αυτών κατά την είσοδο-εισβολή μικροοργανισμών λέγεται ανοσολογική απόκριση. Το ανοσοποιητικό σύστημα είναι χαρακτηριστικό μόνο των σπονδυλωτών ζωικών οργανισμών. Η εξέλιξή του έχει ως απώτερο σκοπό την προστασία του μεγαλοοργανισμού από την εισβολή μικροοργανισμών που πιθανά θα τον βλάψουν. Ο ανθρώπινος οργανισμός έχει αναπτύξει και εξελίξει διάφορους και πολύπλοκους μηχανισμούς άμυνας για να προστατευθεί έναντι των μικροβίων. Ενδεικτικά, διάφοροι ανατομικοί φραγμοί (π.χ. δέρμα), φαγοκύτταρα, φυσικά φονικά κύτταρα και διάφορα άλλα κύτταρα ή μόρια παίζουν ενεργό ρόλο στην άμυνα του οργανισμού σε τυχόν παθογόνους παράγοντες. Η συστηματική ανοσολογική απόκριση του ξενιστή διακρίνεται στη φυσική ή μη ειδική ανοσία και την επίκτητη ή ειδική ανοσία. Η κύρια διαφορά ανάμεσα σε αυτές τις δύο φάσεις της ανοσολογικής απόκρισης έγκειται κυρίως στο χρόνο ενάρξεώς της και στα κύτταρα-μόρια κλειδιά που χρησιμοποιούνται για την αναγνώριση των ξένων εισβολέων. Επίσης, σημαντική διαφορά ανάμεσα στα δύο είδη ανοσίας του ανθρώπου είναι η ειδικότητα και η «μνήμη» που χαρακτηρίζει την επίκτητη ανοσία (Abbas 2000). Οι δράσεις της ειδικής-επίκτητης ανοσίας ασκούνται από ειδικά κύτταρα εκ των οποίων τα κυριότερα είναι τα Τ- και Β-λεμφοκύτταρα. Τα Β-λεμφοκύτταρα είναι αυτά που παράγουν αντισώματα, ενώ τα Τ-λεμφοκύτταρα είναι υπεύθυνα για την εκδήλωση της κυτταρικής ανοσολογικής απόκρισης με πιο προφανή την κυτταροτοξική δράση αλλά και εν γένει τη ρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης. 32

Οι μηχανισμοί της μη ειδικήςφυσικής ανοσίας δεν εμφανίζουν Εικόνα 9: Φωτογραφία από απλό μικροσκόπιο ειδικότητα μονοκυττάρου (μωβ) ανάμεσα σε ερυθρά. και (www.ac-versailles.fr/bangimages/monocyte.html) φάσματος δυνητικών παθογόνων παραγόντων. δρουν έναντι ευρέος Στους μηχανισμούς αυτούς περιλαμβάνονται: α) Το δέρμα και οι βλεννογόνοι που δρουν ως ανατομικοί-μηχανικοί φραγμοί, β) η λυσοζύμη που λύει βακτηριακά κύτταρα, γ) οι διάφορες βλεννώδεις εκκρίσεις, δ) Ο μηχανισμός του συμπληρώματος που όταν ενεργοποιείται προκαλεί την καταστροφή των βακτηρίων, ε) η φαγοκυττάρωση που επιτελείται από εξειδικευμένα κύτταρα του αίματος, στ) τα φονικά κύτταρα (ΝΚ) που ενεργοποιούνται από τις ιντερφερόνες α και β και η δράση τους στρέφεται κυρίως έναντι καρκινικών κυττάρων και κυττάρων μολυσμένων με ιούς, κ.α. Η φυσική ανοσία με βάση την εξέλιξη των ειδών, προϋπήρχε της επίκτητης και κάποιες μορφές της φαίνεται να υπάρχουν σε όλους τους πολυκυτταρικούς οργανισμούς. Η αναγνώριση παθογόνων δομών-μικροβίων από τους μηχανισμούς της φυσικής ανοσίας βασίζεται στην ύπαρξη ενός περιορισμένου αριθμού υποδοχέων στην επιφάνεια κυττάρων της φυσικής ανοσίας (π.χ. μακροφάγα), των οποίων η έκφραση και η ειδικότητα είναι γενετικά προκαθορισμένη. Οι υποδοχείς των κυττάρων της φυσικής ανοσίας έχουν εξελιχθεί με τη διαδικασία της φυσικής επιλογής κατά την εξέλιξη των ειδών. Η ειδικότητα που εμφανίζουν είναι σχετικά περιορισμένη σε σχέση με αυτή των υποδοχέων της επίκτητης ανοσίας, και ο ρόλος τους δε βασίζεται στο να δύνανται να αναγνωρίζουν ή να διακρίνουν μεταξύ κάθε πιθανού παθογόνου, αλλά αντίθετα να μπορούν να διακρίνουν μερικές κοινές δομές που υπάρχουν σε μια μεγάλη ομάδα μικροβίων. 33

Αυτές οι δομές καλούνται Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMP s), και οι υποδοχείς της φυσικής ανοσίας Pattern-Recognition Receptors (PRR s). Παραδείγματα PAMP s είναι ο LPS των Gram αρνητικών βακτηρίων, οι πεπτιδογλυκάνες, τα λιποτειχοϊκά οξέα, το βακτηριακό DNA κ.α. Ορισμένοι και πιο σημαντικοί PRR s είναι οι Toll-υποδοχείς, το CD14 στην επιφάνεια των μονοκυττάρων, ο υποδοχέας της μαννόζης κ.α. 2.2. Πρωτογενή-Δευτερογενή Λεμφοποιητικά Όργανα Τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος προκειμένου να είναι πιο αποτελεσματικά στις λειτουργίες τους, είναι οργανωμένα σε διάφορα όργανα τα οποία καλούνται λεμφικά όργανα. Τα λεμφικά όργανα διαχωρίζονται σε πρωτογενή και δευτερογενή. Στα πρωτογενή λεμφικά όργανα γίνεται η διαφοροποίηση των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος και αυτά είναι: ο θύμος αδένας και ο μυελός των οστών. Στα δευτερογενή λεμφικά όργανα πραγματοποιούνται οι ειδικές ανοσολογικές αντιδράσεις και σε αυτά περιλαμβάνονται: α) οι λεμφαδένες, β) ο σπλήνας, γ) οι λεμφικοί ιστοί που εντοπίζονται στους βλεννογόνους (Mucosalassociated Lymphoid tissues) στους οποίους περιλαμβάνονται: οι αμυγδαλές, οι αδενοειδείς εκβλαστήσεις, η σκωληκοειδής απόφυση και οι παϋέρειες πλάκες του λεπτού εντέρου, ο λεμφικός ιστός που εντοπίζεται στα βρογχιόλια (Bronchialassociated lymphoid tissues) (Janeway και Travers 1999). Ο θύμος αδένας θεωρείται ίσως το σπουδαιότερο λεμφικό όργανο αφού σε αυτόν γίνεται η ωρίμανση των Τ-λεμφοκυττάρων. Στο μικροπεριβάλλον του θύμου αδένα και κάτω από την επίδραση διαλυτών παραγόντων και μορίων επιφανείας, ωριμάζουν τα Τ-λεμφοκύτταρα τα οποία εκφράζουν τους αντίστοιχους επιφανειακούς δείκτες που τα διακρίνουν σε διαφορετικούς λειτουργικά υποπληθυσμούς και εξέρχονται στην περιφερική κυκλοφορία όπου και θα κατανεμηθούν στα διάφορα άλλα λεμφικά όργανα. Σημαντική επίσης λειτουργία του θύμου αδένα είναι η καταστροφή κυττάρων των οποίων ο/οι υποδοχείς αναγνωρίζουν αντιγόνα-δομές του ίδιου του οργανισμού («ίδια» αντιγόνα). Αυτή η ιδιότητα του θύμου αδένα αποτρέπει σε ένα βαθμό την εμφάνιση αυτοάνοσων νοσημάτων. Από τον ερυθρό μυελό των οστών προέρχονται όλα τα κύτταρα του ανοσολογικού συστήματος, τα ερυθρά αιμοσφαίρια και τα αιμοπετάλια. 34