Μοριακή ταυτοποίηση επιλεγμένων κλώνων φυτών ρίγανης για την αντιμετώπιση παθογόνων ψαριών και ζωοπλαγκτόν.

Μοριακή ταυτοποίηση επιλεγμένων κλώνων φυτών ρίγανης για την αντιμετώπιση παθογόνων ψαριών και ζωοπλαγκτόν. Μιχάλης Κ. Στεφανάκης, Γιώργος Τσικαλάς, Ελευθέριος Τουλουπάκης, Λαζανάκη Μαρία, Χαράλαμπος Ε. Κατερινόπουλος Τμήμα Χημείας, Πανεπιστημιο Κρήτης, Βούτες, Ηράκλειο 71003, Κρήτη, Ελλάδα Παύλος Μακρίδης, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών, Πανεπιστημιούπολη Ρίο, Πάτρα, 26500, Ελλάδα Δημήτριος Ζαραγκότας, Δημήτριος Μπακρατσάς, Ηλίας Αναστασόπουλος Τμήμα Τεχνολόγων Γεωπόνων, ΤΕΙ Θεσσαλίας, Λάρισα 41110, Ελλάδα Χαρίκλεια Παπαϊωάννου, Βασίλειος Παπασωτηρόπουλος, Τμήμα Τεχνολόγων Γεωπόνων, ΤΕΙ Δυτικής Ελλάδας Αμαλιάδα 27200, Ελλάδα Περίληψη- Δείγματα ελαίου φυτών ρίγανης επιλέχθηκαν για απολύμανση τροχόζωων Brachionus plicatilis απο βακτηριακά στελέχη του γένους Vibrio. Ακολούθησε μοριακή ταυτοποίηση των επιλεγμένων κλώνων ρίγανης με ανάλυση μοριακών δεικτών SSR. Με βάση την ανάλυση αυτή, οι γενότυποι των κλώνων ρίγανης ομαδοποιήθηκαν σε τρεις κύριες ομάδες. Για ορισμένους από τους γενοτύπους αυτούς επιχειρήθηκε η συσχέτιση των αποτελεσμάτων των χημειοτυπικών αναλύσεων με αυτά από την ανάλυση μοριακής ποικιλότητας, όπου προέκυψαν παρόμοιες ομαδοποιήσεις. Λέξεις κλειδιά μοριακή ανάλυση; Origanum; SSR; Vibrio; Brachionus plicatilis; υδατοκαλλιέργειες ΕΙΣΑΓΩΓΗ Στην Ελλάδα η ρίγανη αυτοφύεται σε διάφορες περιοχές, ενώ τα τελευταία χρόνια έχει αρχίσει η συστηματική καλλιέργειά της με στόχο την εμπορική εκμετάλλευσή της. Η ύπαρξη διαφορετικών ειδών, κυριότερα των οποίων είναι τα Origanum vulgare και Origanum οnites, ο μεγάλος αριθμός υποειδών, αλλά και οι διαφορετικοί οικότυποι αποδεικνύουν τη μεγάλη γενετική ποικιλότητα, που έχει ως αποτέλεσμα τη διαφοροποίηση των φυτών, τόσο μορφολογικά όσο και ως προς διάφορες βιοχημικές τους ιδιότητές [1]. Φυτά ρίγανης έχει αποδειχθεί ότι έχουν υψηλή περιεκτικότητα σε φαινολικά [2], γεγονός που σχετίζεται με τη δραστικότητα του ελαίου τους έναντι διαφόρων φυτικών και ζωικών παθογόνων βακτηρίων [3]. Σε μελέτες για την ελληνική ρίγανη περισσότερα από 30 ενεργά συστατικά έχουν εντοπιστεί, συμπεριλαμβανομένων του ροσμαρινικού οξέως, της θυμόλης και της καρβακρόλης [4]. Διάφορες μελέτες αποδεικνύουν τις αντιμικροβιακές ιδιότητες του ελαίου της ρίγανης [5], [6]. Στην αγορά, υπάρχει ήδη ένα προϊόν, με βάση το έλαιο της ρίγανης, το οποίο χρησιμοποιείται κατά γαστρεντερικών παθογόνων, που σκοτώνει τους μικροοργανισμούς όταν έρχεται σε επαφή με αυτούς, εντός του εντέρου γαρίδων ή ψαριών [7]. Νεότερα ερευνητικά δεδομένα απέδειξαν ότι τα αιθέρια έλαια συγκεκριμένων φυτών ρίγανης μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την μείωση της δράσης των βακτηριακών στελεχών του γένους Vibrio και στην απολύμανση ζωοπλαγκτονικών οργανισμών τροχόζωων Brachionus plicatilis, που χρησιμοποιούνται ως ζωντανή τροφή σε ψάρια [8], [9]. Ο σκοπός της παρούσας μοριακής ανάλυσης ήταν διττός. Αφενός να εκτιμηθεί η γενετική ποικιλότητα ενός ετερόκλητου πληθυσμού δειγμάτων ρίγανης και αφετέρου να ταυτοποιηθούν, μοριακά, επιλεγμένα δείγματα, που έδειξαν μέγιστη αντιβατηριακή δράση έναντι στελεχών της ομάδας Vibrio, για την απολύμανση ζωοπλαγκτονικών οργανισμών. Επίσης στη παρούσα μελέτη επιχειρήθηκε να συσχετισθούν τα αποτελέσματα των χημικών αναλύσεων με εκείνα των μοριακών αναλύσεων, των συγκεκριμένων δειγμάτων ρίγανης που έχουν μεγάλο ενδιαφέρον για απολύμανση των ζωοπλαγκτονικών οργανισμών και πιο συγκεκριμένα τροχοζώων του είδους Brachionus plicatilis. Για τις μοριακές αναλύσεις επιλέχθηκαν οι πυρηνικές μικροδορυφορικές αλληλουχίες (microsatellites), αλλιώς γνωστές και ως SSR, (Simple Sequence Repeats) κυρίως λόγω των ιδιοτήτων που εμφανίζουν όπως πχ υψηλός μεταλλακτικός ρυθμός και ποικιλότητα ακόμα και μεταξύ ποικιλιών-πληθυσμών του ιδίου είδους, καθώς και συνυπερέχων τρόπο κληρονόμησης. Οι ιδιότητες αυτές καθιστούν τους μικροδορυφορικούς δείκτες ιδανικό μοριακό εργαλείο για τη διερεύνηση της γενετικής ποικιλότητας και 65

την ανάλυση της γενετικής δομής στα φυτά τόσο σε διαειδικό όσο και σε ενδοειδικό επίπεδο. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Συλλογή σπόρων ρίγανης Σπόροι ρίγανης συλλέχθηκαν από τη Νάξο (O. onites), το Πήλιο (O. vulgare), της Σίσες Ηρακλείου Κρήτης (O. vulgare), τα Άγραφα (O. vulgare), τη Ζαχάρω Ηλείας (O. vulgare), την Πέρδικα Θεσπρωτίας (O. vulgare) μαζί με ένα δείγμα (O. vulgare) του εμπορίου καθώς και ένα δείγμα (O. marjoram) επίσης του εμπορίου. Οι σπόροι παρουσίαζαν ποικιλομορφία ως προς το σχήμα τους, που ήταν περίπου σφαιρικό, αλλά κυρίως ως προς το χρώμα τους. Επίσης συγκεκριμένοι γενότυποι ήταν πολύ παραγωγικοί σε σπόρο, ενω άλλη είχαν μικρή απόδοση. Απομόνωση DNA Στα φυτά της ρίγανης η αυξημένη συγκέντρωση δευτερογενών μεταβολιτών (πολυφαινολικών ενώσεων κλπ) δυσχεραίνει την εξαγωγή DNA υψηλής καθαρότητας και κατά συνέπεια παρεμποδίζει τις επακόλουθες μοριακές αναλύσεις. Για το λόγο αυτό αρχικά χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide) (Doyle and Doyle 1990) με μικρές τροποποιήσεις καθώς και μέθοδος απομόνωσης DNA που βασίζεται σε τυποποιημένη εμπορική συσκευασία (kit) (Macherey-Nagel). Η απομόνωση DNA πραγματοποιήθηκε από 30 mg ιστού νεαρού φύλλου ο οποίος λειοτριβήθηκε σε υγρό άζωτο. Η καθαρότητα και η ποσότητα του DNA που απομονώθηκε ελέγχθηκε τόσο με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης, όσο και φωτομετρικά (OD 260/280 nm και 260/230 nm). αγαρόζης 2% (Sigma). Οι ζώνες που προέκυψαν απεικονίστηκαν με το σύστημα απεικόνισης GelDocEZ (BioRad). Τα μοριακά βάρη των ζωνών υπολογίστηκαν συγκρίνοντας μάρτυρες DNA γνωστού μήκους 100-bp και 1- kb (New England Biolabs). Στη συνέχεια προκειμένου να μην υπάρξουν αναστολείς στα επόμενα στάδια της αλληλούχησης και γενοτύπησης των δειγμάτων απομακρύνθηκαν τα υπολείμματα των αντιδράσεων PCR (περίσσεια εκκινητών, άλατα MgCl 2, dntps κλπ με την βοήθεια της εμπορικής συσκευασίας PCR clean up kit (Macherey-Nagel). Αντιδράσεις PCR Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για να μελετηθούν οι επιλεχθέντες μικροδορυφορικοί δείκτες περιγράφονται από τους Novak et al. (2008). Πρόκειται περί μικροδορυφορικών επαναλήψεων που ανιχνεύονται σε εκφραζόμενες DNA αλληλουχίες (ESTs), οι οποίες ενισχύονται από τους παρακάτω εκκινητές όπως φαίνονται μαζί με τα μοτίβα επαναλήψεων στην εικόνα 1. Οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν σε ένα μείγμα 15 μl που περιείχε: γονιδιωματικό DNA, 1x ρυθμιστικό διάλυμα PCR (KapaTaq), 1.5 mm MgCl 2, 0.6 μm από κάθε εκκινητή, 100 μμ από κάθε dntp και 0.6 U θερμοσταθερή DNA πολυμέραση (KapaTaq). Οι αντιδράσεις έγιναν σε θερμικό κυκλοποιητή MJ Research PTC-100 υπό τις ακόλουθες συνθήκες: ένα αρχικό στάδιο αποδιάταξης στους 95 C για 15 λεπτά ακολουθούμενο από 35 κύκλους: i) αποδιάταξης του DNA στους 95 C για 1 λεπτό, ii) υβριδισμού των εκκινητών στη μήτρα DNA στους 59 C για 1 λεπτό και iii) επέκτασης των νουκλεοτιδικών αλυσίδων στους 72 C για 2 λεπτά δευτερόλεπτα. Το πρόγραμμα τελείωσε με ένα τελευταίο βήμα επέκτασης των αλυσίδων DNA στους 72 C για 9 λεπτά. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση στα 110V σε πήκτωμα Εικ.1: Εκκινητές για την ενίσχυση με PCR καθώς και μοτίβα επανάληψης των μικροδορυφορικών δεικτών που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη. Αλληλούχηση και γενοτύπηση των δειγμάτων Αρχικά αλληλουχήσαμε ορισμένα από τα δείγματα, ώστε να εξετάσουμε κατά πόσον οι εκκινητές ενισχύουν πράγματι μικροδορυφορικές αλληλουχίες και ποιο είναι το ακριβές μοτίβο επανάληψης στο νουκλεοτιδικό επίπεδο. Για το σκοπό αυτό επιλέξαμε 3 δείγματα κλώνων ρίγανης τα οποία μετά την ενίσχυση με PCR αλληλουχήθηκαν χρησιμοποιώντας το ζεύγος εκκινητών OR09. Η αλληλούχιση έγινε από την εταιρεία VBC Biotech (Austria) χρησιμοποιώντας τη συσκευή αλληλούχησης ABI 3730XL (Applied Biosystems). Οι αλληλουχήσεις έγιναν και προς τις δύο κατευθύνσεις χρησιμοποιώντας δηλαδή τόσο τον πρόσθιο (forward) όσο και τον οπίσθιο (reverse) εκκινητή, ώστε να μην έχουμε απώλεια διαβάσματος βάσεων. Η ενοποίηση και η ευθυγράμμιση των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών έγινε χρησιμοποιώντας το υπολογιστικό πακέτο προγραμμάτων BioEdit. 66

H γενοτύπηση των δειγμάτων έγινε χρησιμοποιώντας εκκινητές σημασμένους με ειδικές χρωστικές φθορισμού (FAM, HEX, ROX, TAMRA). Η ηλεκτροφόρηση των θραυσμάτων μετά από τις αντιδράσεις PCR έγινε στη συσκευή αλληλούχησης ΑΒΙ 3500 (Applied Biosystems) και ο καθορισμός του μεγέθους τους δηλαδή η διάκριση των διαφορετικών αλληλομόρφων κάθε μικροδορυφορικού γενετικού τόπου πραγματοποιήθηκε με το υπολογιστικό πρόγραμμα STRand 2.4.59. Εικ. 3: PCR αντιδράσεις συγκεριμένων δειγματων φυτών ρίγανης μετά από αντίδρασεις PCR με τους εκκινητές OR09, OR10, OR12. Μετά την αλληλούχηση επιλεγμένων δειγμάτων πήραμε ενδεικτικά τα εξής αποτελέσματα (Εικόνα 4). Στατιστική Ανάλυση Για τον υπολογισμό του αριθμού των αλληλομόρφων ανά γενετικό τόπο, του δείκτη ποικιλότητας του Shannon (Ι), ο οποίος μάλιστα δεν προϋποθέτει ισορροπία του πληθυσμού κατά Hardy-Weinberg (Lewontin 1972) και των συντελεστών γενετικής απόστασης (Nei 1972) χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα POPGENE 1.31. Η ανάλυση κύριων συντεταγμένων (PCoA) πραγματοποιήθηκε με το πρόγραμμα Genalex 6.5.. Οι τιμές των συντελεστών γενετικής απόστασης κατά Nei (1972) χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή δενδρογράμματος UPGMA με το πρόγραμμα TFPGA ver. 1.3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Με βάση τα προκαταρκτικά αποτελέσματα επιλέχθηκε για τη συνέχεια ως μέθοδος απομόνωσης DNA το κιτ Macherey- Nagel (Εικόνα 2) αφού μας έδινε τα καλύτερα αποτελέσματα ως προς την καθαρότητα και την ακεραιότητα του απομονωθέντος DNA. Εικόνα 4: Νουκλεοτιδική αλληλουχία του μικροδορυφορικού δείκτη OR09 σε άτομο ρίγανης. Στη συνέχεια αφού έγινε η ενοποίηση και ευθυγραμμίση (alignment) των αλληλουχιών DNA που προέκυψαν τόσο με τον πρόσθιο όσο και με τον οπίσθιο εκκινητή χρησιμοποιώντας το υπολογιστικό πακέτο προγραμμάτων BioEdit, προέκυψαν οι πλήρεις αλληλουχίες που εμφανίζονται στην επόμενη εικόνα. Εικ. 2: Ηλεκτροφόρηση δείγματων DNA ρίγανης (Macherey- Nagel) σε πήκτωμα αγαρόζης. Οι δειγματοληπτικές αντιδράσεις PCR χρησιμοποιώντας ορισμένα δείγματα ρίγανης και ζεύγη εκκινητών έδωσαν τα αναμενόμενα αποτελέσματα ως προς το μέγεθος και τον αριθμό των ζωνών όπως φαίνεται στην επόμενη εικόνα. Εικ. 5: Σύγκριση της πλήρους αλληλουχίας του μικροδορυφορικού δείκτη OR09 σε τρία δείγματα φυτών ρίγανης. Όπως παρατηρούμε στην εικόνα 5 δεν υπάρχουν διαφορές σε νουκλεοτιδικό επίπεδο μεταξύ των τριών ατόμων για το μικροδορυφορικό δείκτη OR09. Επίσης το μοτίβο επανάληψης προσομοιάζει με την εργασία των Novak et al. (2008). Η γενοτύπηση των δειγμάτων με βάση τα δώδεκα ζεύγη μικροδορυφορικών εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα έρευνα αποκάλυψε την ύπαρξη διαφορετικών 67

αλληλομόρφων σε κάθε γενετικό τόπο. Στις επόμενες εικόνες παρατίθενται οι γενότυποι που προέκυψαν για ορισμένους μικροδορυφορικούς δείκτες σε συγκεκριμένα άτομα: επιτρέπουν το πλήρη διαχωρισμό τους και την απόλυτη ταυτοποίησή τους. Ο αριθμός των αλληλομόρφων ανά γενετικό τόπο και ο δείκτης ποικιλότητας του Shannon (Ι) παρουσιάζονται στον επόμενο πίνακα. Εικ. 6: Ομοζυγωτικό άτομο του δείγματος 1 ως προς το αλληλόμορφο 144 του εκκινητή OR09. Οι συντελεστές γενετικής απόστασης κυμαίνονται από 0 (μεταξύ 12 και 16) έως 1,79 (μεταξύ των δειγμάτων 11 και 15 με το δείγμα 24). Εικ. 7: Ετεροζυγωτικό άτομο του δείγματος 17 ως προς τα αλληλόμορφα 115 και 117 του εκκινητή OR12. Οι γενότυποι όλων των ατόμων σε όλους τους γενετικούς τόπους εμφανίζονται στον επόμενο πίνακα: Πίνακας: Συντελεστές γενετικής απόστασης D κατά Nei (1972). Η ανάλυση κυρίων συντεταγμένων (PCoA) έδειξε ότι τα δείγματα που αναλύθηκαν ομαδοποιούνται κυρίως σε τρεις μεγάλες ομάδες. Η μία περιλαμβάνει τρία δείγματα O. onites, στα δεξιά της Εικόνας 8, ενώ η μεγάλη ομάδα αριστερά της ίδιας εικόνας περιλαμβάνει δείγματα O. vulgare. Τέλος η μικρότερη ομάδα, περιλαμβάνει δείγματα O. vulgare και O. marjoram. Είναι εμφανές ότι εκτός από τα άτομα 12 και 16 τα οποία εμφανίζουν τον ίδιο γενότυπο και δεν μπορούν να διακριθούν στα υπόλοιπα υπάρχουν αρκετοί διαγνωστικοί δείκτες που 68

2013, όπου αναφέρονται οι κωδικοί 3,4,5,6,7 και 8, οι οποίοι αντιστοιχούν στους 15,22,12,19,25 και 20 της παρούσας εργασίας). Αντίστοιχη ομαδοποίηση προκύπτει για τους γενότυπους αυτούς και με βάση τους μοριακούς δείκτες SSR Εικ. 8 Ανάλυση κυρίων συντεταγμένων PCoA με βάση τους μοριακούς δείκτες Παρόμοια ομαδοποίηση εμφανίζεται και στο δενδρογράμμα UPGMA με βάση το συντελεστή γενετικής απόστασης του Nei (1972). Εικ. 11:. Aνάλυση κυρίων συντεταγμένων (PCoA) με βάση τη χρήση δεικτών SSR. Με βάση τη γενοτυπική σύσταση είναι εύκολο να διακριθούν οι γενότυποι αυτοί μεταξύ τους καθώς έχουν προκύψει αρκετοί διαγνωστικοί δείκτες με διακριτά διαγνωστικά πρότυπα που τους διαχωρίζουν. Για να πραγματοποιηθεί όμως απόλυτη διάκριση με το σύνολο των δειγμάτων που αναλύθηκαν θα χρειαστεί να αναλυθούν περισσότεροι ή και διαφορετικού τύπου μοριακοί δείκτες οι οποίοι ενισχύουν αλληλουχίες με μεγαλύτερη ποικιλότητα σε πιο εκτεταμένες περιοχές του γονιδιώματος. Ει.κ 9: Δενδρόγραμμα UPGMA με βάση το συντελεστή γενετικής απόστασης κατά Nei (1972). Στη συνέχεια έγινε ανάλυση κυρίων συντεταγμένων (PCoA) τόσο με βάση τη σύσταση του ριγανελαίου όσο και με βάση τα αποτελέσματα της μοριακής ανάλυσης με δείκτες SSR σε συγκεκριμένους γενοτύπους που παρουσίαζαν μεγάλο ενδιαφέρον από πλευράς χημικής σύστασης και αντιμικροβιακών ιδιοτήτων του ριγανέλαιου. Η ανάλυση PCoA με βαση τα χημειοτυπικά χαρακτηριστικά επίσης έδειξε ότι οι γενότυποι ομαδοποιούνται κυρίως σε τρεις ομάδες. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Δεδομένα που παρουσιάστηκαν σε προηγούμενες αναφορές της ερευνητικής μας ομάδας, αποδεικνύουν ότι ριγανέλαιο απο τα δείγματα 1, 15 και 20 μπορεί να μειώσει τη δράση βακτηριακών στελεχών της ομάδας Vibrio και επομένως να χρησιμοποιηθεί στην απολύμανση τροχοζώων Brachionus plicatilis που χρησιμοποιούνται ως ζωντανή τροφή σε ψάρια [8], [9]. Στη παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε μοριακή αναλυση 25 γενοτύπων ρίγανης με χρήση μικροδορυφορικών DNA δεικτών (SSRs). Με βάση αυτοί οι γενότυποι ομαδοποιήθηκαν σε τρεις κύριες ομάδες και προέκυψαν αρκετοί διαγνωστικοί δείκτες οι οποίοι διαχωρίζουν τα δέιγματα αυτά μεταξύ τους. Για ορισμένους από τους γενοτύπους αυτούς συσχετίσθηκαν οι χημειοτυπικές αναλύσεις με την ανάλυση μοριακών δεικτών και προέκυψαν παρόμοιες ομαδοποιήσεις. Χρειάζονται περισσότερες αναλύσεις προκειμένου να βρεθούν μοναδικά DNA προφίλ για τη ταυτοποίηση των συγκεκριμένων δειγμάτων που παρουσιάζουν μεγαλύτερο ενδιαφέρον. Εικ. 10: Aνάλυση κυρίων συντεταγμένων (PCoA) με βάση τη σύσταση του ριγανελαίου (προσαρμογή απο Stefanakis et al ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ 69

H παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο - ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) Ερευνητικό Χρηματοδοτούμενο Έργο: ΑΡΧΙΜΗΔΗΣ ΙΙΙ. Επένδυση στην κοινωνία της γνώσης μέσω του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταμείου. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ [1] Vokou D. et. al. (1993). Geographic Variation of Greek Oregano (Origanum vulgare ssp. hirtum) Essential Oils. Biochemical Systematics and Ecology, 21:287-295. [2] Kokkini, S. et. al. (1993). The Hybrid Origanum intercedens from the Island of Nisyros (SE Greece) and its Parental Taxa; Comparative Study of Essential Oils and Distribution. Biochemica/Systematics and Ecology, 21: 397-403. [3] Sivropoulou A. et. al. (1996) Antimicrobial and Cytotoxic Activities of Origanum Essential Oils. J. Agric. Food Chem. 44:1202-1205 [4] Kokkini, S. et. al. (2004). Essential Oil Composition of Greek (Origanumvulgare ssp. hirtum) and Turkish (0. onites) Oregano :a Tool for Their Distinction. J. Essent. Oil Res., 16:334-338. [5] Burt SA and Reinders RD. (2003). Antibacterial activity of selected plant essential oils against Escherichia coli O157:H7. Lett Appl Microbiol. 36:162-7. [6] Dorman HJ and Deans SG (2000).Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils. J Appl Microbiol.88:308-16. [7] Claire Yew, Y.C. (2008). Improving aquaculture production through better health and disease prevention the natural way. Feed technology update. Vo.3. Iss.1 [8] Stefanakis M.K, Touloupakis E., Anastassopoulos E., Ghanotakis D., Katerinopoulos H.E., Makridis P. (2013). Antibacterial activity of essential oils from plants of the genus Origanum. Food Control 34:539-546. [9] Stefanakis, M. K., Anastasopoulos, E., Katerinopoulos, H. E., & Makridis, P. (2014). Use of essential oils extracted from three Origanum species for disinfection of cultured rotifers (Brachionus plicatilis). Aquaculture Research, 45(11), 1861-1866. [10] Doyle JJ, Doyle JL (1990) Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12: 13-15 [11] Novak, J., Lukas, B., Bolzer, K., Grausgruber-Gröger, S., & Degenhardt, J. (2008). Identification and characterization of simple sequence repeat markers from a glandular origanum vulgare expressed sequence tag. Molecular Ecology Resources, 8(3), 599-601. [12] Nei M. Interspecific gene differences and evolutionary time estimated from electrophoretic data on protein identity. Amer. Naturalist 105:385-98, 1971. 70